CN105301258A - 一种热加工食品中蛋清含量的检测方法 - Google Patents

一种热加工食品中蛋清含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种热加工食品中蛋清含量的检测方法。本发明包被的抗原为高纯度的热处理的卵清蛋白，以已知蛋清添加量的鱼糜制品提取物或热处理的高纯度卵清蛋白为标准品，建立抑制性ELISA法；对鱼糜制品和鱼糜制品外的热加工食品中的蛋清含量进行准确检测。本发明的方法灵敏、简单，准确；是有效的检测热加工食品中蛋清含量的方法，具有重要的现实意义。

Description

一种热加工食品中蛋清含量的检测方法
技术领域
本发明涉及食品检测方法，尤其涉及一种热加工食品中蛋清含量的检测方法。
背景技术
我国是水产品生产和加工大国，在2012年我国鱼糜制品产量达到了117万吨。为了提高鱼糜制品的口感，在实际生产过程中，部分企业会通过大量添加蛋清等非鱼肉成分，以提高制品的弹性。作为八大类致敏食物之一，鸡蛋在热处理后仍具有强的致敏性。现在虽然有一些针对疫苗中残留蛋清成分的检测方法的报道，但由于鱼糜制品在制备过程中的特殊加工工艺，使蛋清中的蛋白组分结构发生了变化，已报道的方法并不能在鱼糜制品检测中得到有效应用，因此，亟需开发一种有效准确的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确，有效的检测热加工食品中蛋清含量的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种热加工食品中蛋清含量的检测方法，其特征在于，步骤为，
将卵清蛋白抗原于95℃加热15min后配成浓度为200ng/孔，进行96孔板的包被，进行第一次孵育，37℃，2h；
TBST洗涤后，再用含5重量%脱脂奶的TBST缓冲液封闭1h，每孔加入200μL封闭液；
将稀释后的热加工食品、不同浓度的标准品和等体积的抗卵清蛋白单克隆抗体各50uL分别进行预孵育，37℃，1h，再分别加入上述封闭好的96孔板，100uL/孔，37℃孵育1h，再加入100μL辣根过氧化物酶标记的抗小鼠HRP-IgG为二抗37℃反应50min后，每孔加入100μL四甲基联苯胺作为显色剂，37℃反应30min，每孔加50μLH2SO4终止反应，测定OD450。根据公式y=0.25+0.74/(1+x/1.33)1.55进行计算，其中x为样品吸光值与空白对照吸光值的比值；根据y值判断热加工食品中蛋清的含量；
所述稀释后的热加工食品是将热加工食品溶于10倍体积含8mol/L尿素及0.1mmol/LDTT的20mmol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液，再分别用20mmol/LpH7.4的PBS缓冲液进行稀释，使其测定的OD值位于标准曲线线性区域内。
进一步，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于Tris-HCl缓冲液中搅拌，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用Tris-HCl缓冲液流洗后，再用含有0-0.1mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
进一步，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于4倍体积20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中，4℃搅拌2-4h，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液流洗后，用含有0-0.1mol/LNaCl的20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm第一个洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
进一步，所述热加工食品包括鱼糜制品和除鱼糜制品外的热加工食品。
进一步，所述根据y值判断热加工食品中蛋清的含量为：
当检测对象为鱼糜制品时，热加工食品中蛋清的含量等于y值乘以样品稀释倍数；
当检测对象为鱼糜制品以外的热加工食品时，热加工食品中蛋清的含量等于y值乘以系数20再乘以样品稀释倍数。
进一步，所述标准品的制备方法为，将纯化的卵清蛋白溶于20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中得到0、0.01、0.04、0.16、0.64、2.5、10ug/mL卵清蛋白含量的标准品溶液，分别于80-100℃加热15-30min，即为检测除鱼糜制品外的热加工食品的标准品。
进一步，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于4倍体积20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中，4℃搅拌2-4h，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液流洗后，用含有0-0.1mol/LNaCl的20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm第一个洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
进一步，所述标准品的制备方法为，制备蛋清重量含量分别为0、0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的鱼糜制品，再分别溶于10倍体积含8mol/L尿素及0.1mmol/LDTT的20mmol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液，最后分别用20mmol/LPBS，pH7.4的缓冲液稀释10倍体积即为检测鱼糜制品标准品。
本发明的技术方案中，包被的抗原为高纯度的热处理的卵清蛋白，以已知蛋清添加量的鱼糜制品提取物或热处理的高纯度卵清蛋白为标准品，建立抑制性ELISA法。
本发明的实施例对市售8种鱼糜制品进行了检测试验，其中4种标示了含有蛋清成分，另外4种在包装上的成分表中未见有蛋清的标示。实施例结果显示，在8种鱼糜制品中均添加了蛋清成分，添加量在0.2-3%不等。本发明所实施的实施例，充分说明了本发明的方法灵敏、简单，准确；具有重要的现实意义。
附图说明
图1是鱼糜制品中蛋清含量检测的标准曲线图。
图2是不同温度处理对卵清蛋白抗体结合能力的影响图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的描述中，“第一”、“第二”、“第三”等为指代或描述方便，不能理解为有顺序关系或者有相对重要性指示，除非另有说明，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：鱼糜制品中大豆蛋白检测方法的建立
（1）卵清蛋白抗原的制备
将35g蛋清于140mL20mmol/L的Tris-HCl，pH7.5缓冲液中，4℃搅拌3h，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用20mmol/L的Tris-HCl，pH7.5缓冲液流洗后，用含有0-0.1mol/LNaCl的20mmol/L的Tris-HCl，pH7.5缓冲液进行洗脱，收集第一个洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳分析，显示为单一条带，分子量约为45kDa，表明获得高纯度的卵清蛋白即为卵清蛋白抗原。
（2）鱼糜制品检测标准品的制备
制备蛋清重量含量分别为0、0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的鱼糜制品：分别称取10g剁碎的鱼糜样品，溶于100mL含8mol/L尿素及0.1mmol/LDTT的20mmol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液，再分别用20mmol/LPBS（pH7.4）的缓冲液稀释10倍即为鱼糜制品检测标准品。
（3）抑制性ELISA法的建立
将步骤（1）制备的卵清蛋白抗原进行95℃加热15min，配成浓度为200ng/孔，进行96孔板的包被，37℃，2h；TBST洗涤5次后，用含5重量体积%脱脂奶的TBST缓冲液封闭1h；取不同浓度的鱼糜制品检测标准品各50μL，分别与等体积抗卵清蛋白单克隆抗体37℃预孵育1h；再分别加入封闭后的96孔板37℃反应1h，再分别加入100μL辣根过氧化物酶标记的抗小鼠HRP-IgG为二抗37℃反应50min后，每孔加入100μL四甲基联苯胺作为显色剂，37℃反应30min，每孔加50μLH2SO4终止反应，测定OD450。建立的标准曲线如图1所示。
（4）验证
利用建立的抑制性ELISA法对自制的含蛋清重量分别为0.3%、1.0%、3.0%的鱼糜制品进行回收率分析。即分别称取10g剁碎的鱼糜样品，溶于100mL含8mol/L尿素及0.1mmol/LDTT的20mmol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液，再分别用20mmol/LPBS（pH7.4）的缓冲液稀释10倍后进行检测，每个样品做4个重复，回收率介于90.1%到112.2%之间，说明建立的检测方法具有较高的准确度。
实施例2：不同温度处理下卵清蛋白抗体结合能力对比试验
本实施例的方法步骤同实施例1，只是卵清蛋白标准品经过不同的热处理：未经过热处理的（即0℃），70℃，80℃，90℃，100℃。
结果见图2。从图2可以看出，当卵清蛋白标准品没有预先进行热处理时，几乎完全没有任何竞争力，当热处理温度低于80℃时，与包被抗原的竞争力仍然较弱，导致检测灵敏度较低。当热处理温度为80-100℃时，可显著提高其与抗体的结合能力。
实施例3：市售鱼糜制品中卵清蛋白的检测
A公司4种鱼糜制品：仿墨鱼丸、爆汁小鱼丸、闽南脆丸、鱼豆腐，均在包装袋上标示添加了蛋清，但未标明添加量；B公司4种鱼糜制品：仿蟹肉棒、爆汁小鱼丸、闽南脆丸、鱼豆腐，在包装袋上的成分表中均没有标示蛋清。
检测方法见实施例1的抑制性ELISA法。结果
根据公式y=0.25+0.74/(1+x/1.33)1.55，鱼糜制品中蛋清的含量等于y值乘以样品稀释倍数。
检测结果显示，在8种鱼糜制品中均添加了蛋清成分，添加量在0.2-3%不等。A公司4种鱼糜制品：仿墨鱼丸、爆汁小鱼丸、闽南脆丸、鱼豆腐的蛋清重量添加量分别约为1%、2%、1.5%和1%；B公司4种鱼糜制品：仿蟹肉棒、爆汁小鱼丸、闽南脆丸、鱼豆腐的蛋清添加量分别约为3%、2%、3%和0.2%。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种热加工食品中蛋清含量的检测方法，其特征在于，步骤为，
将卵清蛋白抗原于95℃加热15min后配成浓度为200ng/孔，进行96孔板的包被，进行第一次孵育，37℃，2h；
TBST洗涤后，再用含5重量%脱脂奶的TBST缓冲液封闭1h，每孔加入200μL封闭液；
将稀释后的热加工食品或不同浓度的标准品和等体积的抗卵清蛋白单克隆抗体各50uL分别进行预孵育，37℃，1h，再分别加入上述封闭好的96孔板，100uL/孔，37℃孵育1h，再加入100μL辣根过氧化物酶标记的抗小鼠HRP-IgG为二抗37℃反应50min后，每孔加入100μL四甲基联苯胺作为显色剂，37℃反应30min，每孔加50μLH2SO4终止反应，测定OD450；根据公式y=0.25+0.74/(1+x/1.33)1.55进行计算，其中x为样品吸光值与空白对照吸光值的比值；根据y值判断热加工食品中蛋清的含量；
所述稀释后的热加工食品是将热加工食品溶于10倍体积含8mol/L尿素及0.1mmol/LDTT的20mmol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液，再分别用20mmol/LpH7.4的PBS缓冲液进行稀释，使其测定的OD值位于标准曲线线性区域内。
2.权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于Tris-HCl缓冲液中搅拌，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用Tris-HCl缓冲液流洗后，再用含有0-0.1mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
3.权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于4倍体积20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中，4℃搅拌2-4h，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液流洗后，用含有0-0.1mol/LNaCl的20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm第一个洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
4.权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述热加工食品包括鱼糜制品和除鱼糜制品外的热加工食品。
5.权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述根据y值判断热加工食品中蛋清的含量为：
当检测对象为鱼糜制品时，热加工食品中蛋清的含量等于y值乘以样品稀释倍数；
当检测对象为鱼糜制品以外的热加工食品时，热加工食品中蛋清的含量等于y值乘以系数20再乘以样品稀释倍数。
6.权利要求4或5所述检测方法，其特征在于，所述标准品的制备方法为，将纯化的卵清蛋白溶于20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中得到0、0.01、0.04、0.16、0.64、2.5、10ug/mL卵清蛋白含量的标准品溶液，分别于80-100℃加热15-30min，即为检测除鱼糜制品外的热加工食品的标准品。
7.权利要求6所述检测方法，其特征在于，所述卵清蛋白抗原的制备方法为，将蛋清于4倍体积20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中，4℃搅拌2-4h，离心得到的上清上样于DEAE-Sepharose离子交换柱，用20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液流洗后，用含有0-0.1mol/LNaCl的20mmol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集280nm第一个洗脱峰，即为卵清蛋白抗原。
8.权利要求4或5所述检测方法，其特征在于，所述标准品的制备方法为，制备蛋清重量含量分别为0、0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的鱼糜制品，再分别溶于10倍体积含8mol/L尿素及0.1mmol/LDTT的20mmol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液，最后分别用20mmol/LPBS，pH7.4的缓冲液稀释10倍体积即为检测鱼糜制品标准品。
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