CN105734043A - 多分选细胞分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从细胞样本富集靶细胞的方法，其特征在于：a)将所述样本与细胞聚集剂，具有0.1pg至5000pg铁含量的连接到第一抗原识别部分的第一磁性颗粒，以及具有0.05fg至100fg铁含量和连接到第二抗原识别部分的第二磁性颗粒接触，以得到混合物a)；b)将第一磁场梯度应用到混合物a)，由此移除与连接到所述第一磁性颗粒的所述第一抗原识别部分结合的细胞，以得到混合物b)，并且得到包括与所述细胞聚集剂结合的混合物a)的细胞的聚集物；c)将第二磁场梯度应用于所述混合物b)，由此固定与连接到所述第二磁性颗粒的所述第二抗原识别部分结合的细胞；d)将所述固定的细胞作为靶细胞从所述第二磁场梯度回收。

Description

多分选细胞分离方法
发明背景
本发明涉及从样本分离靶细胞的方法，即通过经聚集和第一磁性细胞分选排除非靶细胞，接着通过第二磁性细胞分选步骤富集靶细胞。
细胞分离方法在科学和临床实验室中被广泛推广，用于研究、诊断、或临床应用。大多数这些方法被限制于仅小量细胞。对于从大量非靶细胞分离细胞，磁性细胞分选或密度梯度离心是已经建立的技术。
一种特别具有挑战性的分离方法是从全血中分离细胞，例如从全血中分离T细胞。为此，在分离或纯化靶细胞之前必须将红细胞排出。例如通过密度梯度离心可进行红细胞的清除；例如通过多功能抗体、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、或聚氧乙烯和随后的离心进行外周血单核细胞(PBMC)样本制备、红细胞裂解、或聚集。在靶细胞分离之前排出红细胞的方法例如被公开于EP2597153A1中。
在清除红细胞或另外不期需的细胞之后，需要采用接续的分离靶细胞的工艺步骤。这些方法在本领域和使用中是长期已知的，例如对细胞表面抗原具有亲和性的单克隆抗体，如在US5840502、US5648223、US5646004、US5474687或US7316932中所公开的。
例如，在WO00/73794或US7160723中描述了将多功能抗体或多聚物用作聚集剂。所公开的技术包括使包含有核细胞和红血细胞的样本与聚集剂接触，通过离心移除聚集的红血细胞，和利用识别期需的细胞的抗体进一步纯化有核细胞(例如通过磁性细胞分选法)。这些方法的缺点在于具有几个包括耗时且费力的离心步骤的工艺步骤。
WO2013/076070教导通过聚集和磁性细胞分选来排除多个非靶细胞以得到不受排除混合物影响的细胞悬浮液。虽然用该方法得到的细胞是“未被触及的”，但纯度相当低，这是因为仅进行阴性选择方法。用WO2013/076070的方法不可能得到特定的、纯靶细胞亚群。在WO01/17687A1和WO96/31776A1中公开了利用磁性细胞分选的相似方法。
发明概述
因此本发明的目的在于提供一种快速和简单的方法，用于从生物样本如全血中除去不期需的细胞和分离特定靶细胞。
出乎意料地发现，有可能通过在一个步骤中孵育样本和后续的磁分离步骤来富集靶细胞，所述磁分离步骤没有中间的后处理，通过使用具有不同直径的磁性颗粒实施。
发明目的
本发明的目的在于一种从细胞样本富集靶细胞的方法，其通过至少以下步骤表征：
a)将所述样本与细胞聚集剂，具有0.1pg至5000pg铁含量的，连接到第一抗原识别部分的第一磁性颗粒，以及具有0.05fg至100fg铁含量并连接到第二抗原识别部分的第二磁性颗粒接触，以得到混合物a)；
b)对混合物a)应用第一磁场梯度，由此移除与连接到第一磁性颗粒的第一抗原识别部分结合的细胞，以得到混合物b)，并且得到包括与所述细胞聚集剂结合的混合物a)的细胞的聚集物；
c)对混合物b)应用第二磁场梯度，由此固定与连接到第二磁性颗粒的第二抗原识别部分结合的细胞；
d)从第二磁场梯度回收固定的细胞作为靶细胞。
在本发明的一个变体中，将包含与细胞聚集剂结合的混合物a)的细胞和-由于第一磁场梯度-与连接到第一磁性颗粒的第一抗原识别部分结合的细胞的聚集物与混合物b)分离。
换句话说，混合物b)由不与细胞聚集剂和/或第一抗原识别部分/第一磁性颗粒结合的细胞的悬浮液组成。
附图简述
图1示意性示出本发明的方法。
图2示出用本发明方法对调节性T细胞的富集。
图3示出用本发明方法对造血干细胞(HSC)的富集。
图4示出未根据本发明对调节性T细胞的富集。
图5示出未根据本发明富集CD8阳性NK细胞的结果。
图6示出根据本发明方法富集CD8阳性NK细胞的结果。
详细说明
可例如通过过滤、沉降、和/或离心从包含与细胞聚集剂结合的混合物a)的细胞的聚集物分离混合物b)。
沉降意指1×g的重力沉降，其在包含待处理样本的容器处于闲置状态(idlestate)，即无摇动或离心时发生，允许聚集的细胞沉降到容器底部。离心例如在1-20×g执行。在另一实施方案中，混合物a)被引导到具有适当网格尺寸的过滤系统的上面。优选，让聚集物在第一磁场梯度中作为沉降物沉降，同时移除与第一抗原识别部分/第一磁场颗粒结合的细胞，并得到作为混合物b)的上清液。
术语“抗原识别部分”指直接针对细胞内或细胞外表达的抗原的抗体或片段化的任何类型的抗体。该术语涉及完整无损的抗体或片段化的抗体衍生物，例如Fab、Fab、F(a’b)2、sdAb、scFv、di-scFv，其通过重细程序合成，包括含有这些类型的分子的共价和非共价缀合物。
图1示意性示出具有如下工艺步骤的本发明的方法：
(a)示出将异质细胞样本与i)红血细胞聚集剂；ii)连接到第一类型抗原识别部分的第一类型磁性颗粒(小颗粒)；和iii)连接到第二类型抗原识别部分的第二类型磁性颗粒(大颗粒)一起孵育。
(b)混合物对第一磁场梯度的暴露移除与连接到第一类型磁性颗粒的第一抗原识别部分结合的细胞。
同时，与细胞聚集剂结合的细胞形成不需要的细胞的沉降物。收集上清液以得到混合物b)。
(c)通过将柱安置在MACS分离器中的混合物b)对第二磁场梯度的暴露固定与连接到第二类型磁性颗粒的第二类型抗原识别部分结合的靶细胞。
(d)从第二磁场梯度回收固定的靶细胞。
本发明使用例如磁源生成的磁场梯度，例如，通过永久磁铁或电磁铁生成的磁场梯度。任何类型和形式的磁铁可用于本发明，如由德国MiltenyiBiotecGmbH市售可得的MACSxpress分离器、MACSiMAG分离器、或QuadroMACSTM分离器。
术语“磁性颗粒”指铁磁、超顺磁、或顺磁固相，例如胶体颗粒、微球、纳米颗粒、或珠。所述颗粒可在悬浮液中或呈冻干状态使用。
磁性颗粒的磁性取决于所述颗粒中的铁含量，其化学上以如磁铁矿、或磁赤铁矿等氧化铁的形式存在。1000或更大因子的铁含量差异允许通过低磁场梯度将具高铁含量的第一磁性颗粒与仅受高磁场梯度影响的具低铁含量的第二磁性颗粒分离。
第一磁性颗粒优选地含有每颗粒0.5pg-500pg、更优选地1pg-50pg的铁。作为第一磁性颗粒，可使用MACSiBead颗粒，其可例如通过标准磁铁，如MACSiMAG分离器(MiltenyiBiotec)保留。例如，具有3.5μm直径的MACSiBeads颗粒含有干重3％-10％w/w的铁。
第二磁性颗粒含有优选每颗粒0.1fg至50fg、更优选0.1fg至10fg的铁。作为第二磁性颗粒，可使用MicroBead颗粒，其可例如通过标准磁铁与磁性分离柱组合保留，如QuadroMACSTM分离器与从MiltenyiBiotec可获得的LS柱组合。使用的MicroBead颗粒可具有50-100nm的直径，颗粒含有干重30％-60％w/w的铁。
可通过直径在铁含量之外或代替铁含量表征本发明使用的第一和第二磁性颗粒。第一磁性颗粒呈现1-5μm、优选地2.5-3.5μm的平均直径。在本发明的优选实施方案中，第一磁性颗粒的尺寸应该尽可能为单分散性的，例如，直径的cv小于15％，优选地小于10％。第二磁性颗粒可具有10-250nm的平均直径，优选30-150nm，其直径的cv例如小于60％，优选小于30％。
术语“细胞样本”指具有呈不同量的不同表型或亚群的细胞悬浮液或混合物，例如在全血、外周血、白细胞分离法(leukapheresis)、血沉棕黄层、脐带血和骨髓中共有(common)的细胞。所述细胞样本例如包含红细胞、血小板和白细胞，如T细胞、调节性T细胞、B-细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞，粒细胞和/或造血干细胞。
术语“细胞聚集剂”指本领域已知的任何化合物，其激发细胞聚集，例如细胞样本内红细胞的细胞聚集。例如，可从全血和通过某些试剂聚集红细胞以形成沉降，以便能够移走上清液。例如，将全血与细胞聚集剂接触激发红细胞和一些血小板，即凝血细胞的聚集物形成，导致这些不期需的细胞群的沉降。该沉降过程通过第一磁性颗粒进一步加强。
用于本发明的细胞聚集剂优选为蛋白质如纤维蛋白原和免疫球蛋白或含有羟基的多聚物如葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
在本发明的方法中，第二磁场梯度可高于第一磁场梯度或必须增大磁力。这可通过应用更高的第二磁场或者使用与第一磁性颗粒相比具有更高磁性材料含量的第二磁性颗粒实现。
通过应用第一磁性梯度，几乎全部与第一磁性颗粒结合的细胞(即85-99％)都被保持在磁铁上，而几乎全部与小得多的第二磁性颗粒结合的细胞(即85-99％)都被保留在混合物b)中。
第一和第二磁场梯度通过让铁磁性分离工具上的混合物b)和混合物c)进入第一和第二磁场来优选应用。所述铁磁性分离工具在磁性细胞分离的领域中是已知的，且例如为装有磁性物质的管，所述磁性物质例如颗粒、网眼、非织造纤维。有可能通过在相同磁场中使用不同铁磁性分离工具来将第二磁场梯度调节为高于第一磁场梯度。
第一和第二磁性颗粒被连接到至少一种抗原识别部分，所述抗原识别部分分别与非靶细胞和靶细胞上的至少一种抗原结合。抗原识别部分可为单和/或多特异性的。优选地，第一和/或第二磁性颗粒被连接到多个不同第一抗原识别部分。有可能将用于本发明的磁性颗粒连接到一种或多种、如2、3、4、6、8、10、或12种不同抗原识别部分。
在本发明的一种实施方案中，细胞聚集剂为HPMC-15，和颗粒特异性通过各自的抗原-识别部分定义。第一和/或第二抗原-识别部分可选自针对某些细胞表面标志物的抗体，所述细胞表面标志物包括例如CD1c、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD23、CD25、CD27、CD34、CD36、CD38、CD43、CD45、CD45RO、CD45RA、CD56、CD61、CD123、CD127、CD133、CD193、CD235a、CD335、CD304、抗Fc_ε、T细胞受体α/β、T细胞受体γ/δ、抗生物素、抗IgE、抗HLA-DR、以及它们的组合。
作为用于富集靶细胞的第二磁性颗粒，使用例如带有抗CD8；抗CD25或抗CD34抗体的抗体缀合颗粒。因此，在步骤d)中，呈递这些抗体的抗原的细胞可作为靶细胞回收。
在移除与细胞聚集剂结合的细胞和与连接到第一磁性颗粒的第一抗原识别部分结合的细胞之后，得到混合物或细胞悬浮液b)，其基本上不含第一颗粒和排除了不期需的大部分细胞。
在步骤c)中，将第二磁性梯度应用于由此获得的混合物b)。与第一磁性梯度相反，第二磁性梯度保留与小得多的第二磁性颗粒结合的细胞，并因此将靶细胞与不期需的细胞分离。
本发明方法的步骤d)通过移除固定的细胞优选实施，例如通过从磁性梯度中移除铁磁性分离工具并用缓冲溶液从铁磁性分离工具洗脱细胞。
本发明进一步的目的在于提供组合物，其用于从细胞样本，如外周血、脐带血和/或骨髓分离、富集和/或回收治疗上、诊断上或科学上有价值的细胞。
本发明的组合物包括细胞聚集剂；连接到第一抗原识别部分的具有1-5μm平均直径的第一磁性颗粒；和连接到第二抗原识别部分的具有10-250nm平均直径的第二磁性颗粒。
所提及的细胞分离组分适于作为试剂盒提供。各个试剂盒包含用本文描述的方法进行从含细胞样本分离期需的细胞所需要的组分。
试剂盒的必要组分为本文提及的细胞聚集剂和第一和第二磁性颗粒。所述颗粒可以是在试剂盒中可得的，例如在液体、缓冲液中或呈冻干的形式且可用于分离调节性T细胞、CD8阳性NK细胞和/或造血干细胞。
磁性颗粒(干燥物质)的铁含量的确定可通过以下进行：用酸(例如磷酸)降解氧化铁，和通过分析工具定量溶解的铁离子，例如使用用于铁测试的MerckSpectroquant检测试剂盒光度法确定有色络合物。可通过颗粒计数器或用Neubauer室采用显微镜法确定珠悬浮液的颗粒计数。相同珠悬浮液中的质量浓度可通过以下确定：通过洗涤将确定体积的珠悬浮液的珠材料转移到水中，通过干燥除去所述水并称量固体残留物。在已知干燥珠材料的质量浓度和已知所述干燥珠材料的铁含量的情况下，知道珠悬浮液的颗粒数可计算颗粒的铁含量。例如，具有44.5mg/ml干重珠、1.36×109个颗粒/mg和在干燥珠材料中4.61％w/w的铁含量的MACSiBead的每颗粒包含1.51pg的铁。
颗粒计数并非直接得到，而是根据AaronB.Kantor、IanGibbons、StefanMiltenyi、和JürgenSchmitz在“细胞分离方法和应用(CellSeparationMethodsandApplications)”Ed.DietherRecktenwald，AndreasRadbruch，MarcelDekker，NewYork，1998p.153-171)中所述，通过假定为球形，并使用通过DLS测量得到的流体动力学直径和2.5mg/mL的颗粒密度计算单个颗粒的重量而估算。例如，具有100nm的尺寸，10mg/mL的干重，以及在干燥珠材料中40％w/w的铁含量的Microbead的每颗粒包含0.53fg的铁。
实施例
用不同工艺参数制造磁珠，生成不同尺寸的颗粒。颗粒尺寸通过BeckmanCoulterDelsaNano和CoulterCounterZ2仪器表征。在实施例中，第一磁性颗粒称为“大磁性颗粒”，其具有3.5μm的直径和1.51pg的铁含量，和第二磁性颗粒称为“小磁性颗粒”，其具有0.3μm的直径和14.3fg的铁含量(如果未另外说明)。大磁性颗粒自MiltenyiBiotecGmbH市售可得，例如“anti-BiotinMACSiBeads”。小磁性颗粒自MiltenyiBiotecGmbH市售可得，例如“CD25MicroBeads”。
实施例1：分离调节性T细胞
大磁性颗粒被缀合到识别CD8、CD14、CD15、CD19、CD123、CD127的抗体。小磁性颗粒被缀合到识别CD25的抗体。抗体珠缀合物对人类全血滴定并确定最佳浓度。
将磁珠抗体缀合物与15mL的HPMC0.75％HPMC15存储溶液按先前确定的量合并成混合物。将混合物加到30mL人类全血中，混合，在MACSmixTMTube旋转仪(MiltenyiBiotecGmbH)中孵育10分钟和在分离器(MiltenyiBiotecGmbH)中放置15分钟。通过使用LS-Column和QuadroMACSTM分离器(MiltenyiBiotecGmbH)用MACS-技术直接进一步处理上清液。不需要的细胞通过该柱。磁性标记的细胞会通过坚定地将活塞压入柱中而冲洗出来。利用荧光物缀合抗体的组合在MACSquantAnalyzer流式细胞仪(MiltenyiBiotec)上可分析分离的调节性T细胞。
图2示出，根据实施例1，通过利用本发明的组合的标记策略可很快速地，在45min内，富集纯度约91％的调节性T细胞。
实施例2：分离造血干细胞(HSC)
大磁性颗粒被缀合到识别CD61的抗体，小磁性颗粒被缀合到识别CD34的抗体。抗体珠缀合物对人类全血滴定并确定最佳浓度。
将磁珠抗体缀合物与4mL的HPMC0.75％HPMC15存储溶液按先前确定的量合并成混合物。将混合物加到8mL人类全血中，混合，在MACSmixTMTube旋转仪(MiltenyiBiotecGmbH)中孵育10分钟和在分离器(MiltenyiBiotecGmbH)中放置15分钟。通过使用LS-Column和QuadroMACSTM分离器(MiltenyiBiotecGmbH)，接着第二MS-Column利用MACS-技术直接进一步处理上清液。不需要的细胞通过该柱。磁性标记的细胞会通过坚定地将活塞压入柱中而冲洗出来。利用荧光物缀合抗体的组合在MACSquantAnalyzer流式细胞仪(MiltenyiBiotec)上可分析分离的HSC。
图3示出，根据实施例2，通过利用本发明的组合标记策略可很快速地，在50min内，直接从全血富集纯度约67％的HCS。
对比实施例1：没有红细胞聚集剂的调节性T细胞的分离
大磁性颗粒被缀合到识别CD8、CD14、CD15、CD19的抗体，小磁性颗粒被缀合到识别CD25的抗体。抗体珠缀合物对人类全血滴定并确定最佳浓度。
在有或没有4mL的HPMC0.75％HPMC15存储溶液的情况下将磁珠抗体缀合物按先前确定的具有4.5mL终体积的量合并成为混合物。将混合物加到8mL人类全血中，混合，在MACSmixTMTube旋转仪(MiltenyiBiotecGmbH)中孵育10分钟和在分离器(MiltenyiBiotecGmbH)中放置15分钟。通过使用LS-Column和QuadroMACSTM分离器(MiltenyiBiotecGmbH)利用MACS-技术直接进一步处理上清液。不需要的细胞通过该柱。磁性标记的细胞会通过坚定地将活塞压入柱中而冲洗出来。利用荧光物缀合抗体的组合在MACSquantAnalyzer流式细胞仪(MiltenyiBiotec)上可分析分离的调节性T细胞。
图4示出，根据对比实旋例1(没有HPMC15)，得到调节性T细胞，纯度和回收分别为42％和6.9E+04。
在有HPMC15的情况下重复对比实施例1，可获得调节性T细胞，纯度为90％和回收为2.1E+05。
实施例3：带有连续磁性标记的CD8阳性NK细胞的分离
将具有3μm和300nm的大磁性颗粒分离，缀合到识别CD3、CD4、CD14、CD15、CD19、CD36、CD61、CD123、CD193、IgE、和TCRab的抗体。将小磁性颗粒缀合到识别CD8的抗体。抗体珠缀合物对人类全血滴定并确定最佳浓度。
将大磁珠抗体缀合物按先前确定的量合并成混合物。将混合物与同4mL0.75％HPMC15存储溶液组合的8mL人类全血一起孵育。将混合物混合并在MACSmixTMTube旋转仪(MiltenyiBioteeGmbH)中孵育10分钟和在分离器(MiltenyiBiotecGmbH)中放置15分钟。然后通过移液入新管中将上清液从聚集物中移出。
将小磁性颗粒加入分离的NK细胞，混合，孵育10分钟。通过MS-Column和OctoMACSTM分离器(MiltenyiBiotecGmbH)利用MACS-技术处理细胞。不需要的细胞通过该柱。磁性标记的细胞会通过坚定地将活塞压入柱中而冲洗出来。利用荧光物缀合抗体的组合在MACSquantAnalyzer流式细胞仪(MiltenyiBiotec)上可分析分离的CD8阳性NK细胞。
对比实施例3
除了使用300nm直径的磁性颗粒代替3μm直径的“大磁性颗粒”之外，相同地重复实施例3。
在实施例3中，可得到具有约93％的高纯度的CD8阳性NK细胞。如对比实施例3所示，通过使用300nm直径的磁性颗粒代替3μm直径的大磁性颗粒，纯度被减小到73％。
图5示出实施例3和对比实施例3的在无任何非磁性预富集的情况下直接从全血分离的CD8阳性NK细胞。通过使用300nm直径的磁性颗粒，因在第一次磁性富集期间不能保留的标记至非NK细胞的磁性颗粒所致，阳性部分显示27％的不需要的细胞(图5，左侧)。如图5右侧所示，通过使用本发明的标记的3μm直径的大磁性颗粒，在第一磁性步骤期间非NK细胞可几乎完全保留。
因此，使用本发明的方法，通过使用3μm直径的大磁性颗粒在第二分离步骤之后可达到明显更高纯度的CD8阳性NK细胞。
实施例4：带同步磁性标记的CD8阳性NK细胞的分离
将3μm的大磁性颗粒分离，缀合到识别CD3、CD4、CD14、CD15、CD19、CD36、CD61、CD123、CD193、IgE、和TCRab的抗体。小磁性颗粒被缀合到识别CD8的抗体。抗体珠缀合物对人类全血滴定并确定最佳浓度。
将大和小磁珠抗体缀合物按先前确定量合并成混合物。将混合物与同2mL0.75％HPMC15的存储溶液组合的4mL人类全血一起孵育。将混合物混合并在MACSmixTMTube旋转仪(MiltenyiBiotecGmbH)中孵育10分钟和在分离器(MiltenyiBiotecGmbH)中放置15分钟。然后通过使用LS-Column和QuadroMACSTM分离器(MiltenyiBiotecGmbH)利用MACS-技术直接进一步处理上清液。不需要的细胞通过该柱。磁性标记的细胞会通过坚定地将活塞压入柱中而冲洗出来。
对比实施例4
除了使用300nm直径的磁性颗粒代替3μm直径的“大磁性颗粒”之外，相同地重复实施例4。
在实施例4中，可通过使用大磁性颗粒获得纯度约80％的CD8阳性NK细胞。如对比实施例4所示，通过使用300nm直径的磁性颗粒代替3μm直径的大磁性颗粒，纯度被减小到6.7％。
图6示出实施例4和对比实施例4的在无任何预富集的情况下直接从全血分离的CD8阳性NK细胞。通过使用300nm直径的磁性颗粒代替“大磁性颗粒”，因在第一磁性富集期间不能保留的标记至非NK细胞的磁性颗粒所致，阳性部分显示93％的不需要的细胞(图6，左侧)。如图6右侧所示，标记至非NK-细胞的3μm直径的大磁性颗粒可在第一磁性步骤期间几乎完全保留。
因此，使用本发明的方法，通过使用3μm直径的大磁性颗粒在第二分离步骤之后可达到明显更高纯度的CD8阳性NK细胞。

Claims (13)

1.一种从细胞样本富集靶细胞的方法，其特征在于：
a)将所述样本与细胞聚集剂，具有0.1pg-5000pg铁含量的连接到第一抗原识别部分的第一磁性颗粒，以及具有0.05fg至100fg铁含量和连接到第二抗原识别部分的第二磁性颗粒接触，以得到混合物a)；
b)将第一磁场梯度应用到混合物a)，由此移除与连接到所述第一磁性颗粒的第一抗原识别部分结合的细胞，以得到混合物b)，并且得到包括与所述细胞聚集剂结合的混合物a)的细胞的聚集物；
c)将第二磁场梯度应用于所述混合物b)，由此固定与连接到所述第二磁性颗粒的第二抗原识别部分结合的细胞；
d)将所述固定的细胞作为靶细胞从所述第二磁场梯度回收。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将包含与所述细胞聚集剂结合的所述混合物a)的细胞的聚集物与混合物b)分离。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第二磁场梯度高于所述第一磁场梯度。
4.根据权利要求1-3其中任意一项所述的方法，其特征在于，通过使铁磁性分离工具上的混合物b)和混合物c)进入第一和第二磁场来应用所述第一和第二磁场梯度。
5.根据权利要求1-4其中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一磁性颗粒具有小于15％的直径cv。
6.根据权利要求1-5其中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞聚集剂选自蛋白质如纤维蛋白原和免疫球蛋白、葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
7.根据权利要求1-6其中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一磁性颗粒被连接到多个不同第一抗原识别部分。
8.根据权利要求1-7其中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第二磁性颗粒被连接到多个不同第二抗原识别部分。
9.根据权利要求1-8其中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一和/或第二抗原识别部分为针对以下抗原的抗体，所述抗原选自CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD19、CD34、CD36、CD61、CD123、CD193、CD235a、抗IgE和抗TCRab。
10.根据权利要求1-9其中任意一项所述的方法，其中所述细胞样本为全血、血沉棕黄层或外周血的样本。
11.根据权利要求1-10其中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一磁性颗粒具有1-5μm的平均直径。
12.根据权利要求1-11其中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第二磁性颗粒具有10-250nm的平均直径。
13.根据权利要求1-12其中任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞聚集剂聚集红细胞。
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