CN110208346A - 用于ccn1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种用于CCN1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用。方法包括:将(Nf@Ru)溶液与GCE的表面接触,获得Nf@Ru/GCE;然后在氯金酸溶液中进行电沉积,获得AuNPs/Nf@Ru/GCE;将AuNPs/Nf@Ru/GCE与修饰有巯基的ssDNA接触,得到ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE。本发明的检测灵敏度可达到0.00502pg/mL,动态范围为0.00001‑100ng/mL。

Description

用于CCN1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种用于CCN1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
CCN1是一种分泌性蛋白,正常健康人群外周血中蛋白浓度约为0-200ng/L。研究表明,外周血中CCN1浓度的检测可能在前列腺癌、系统性红斑狼疮、直肠癌、肾脏损伤等疾病的诊断、疗效监测及预后判断方面具有价值。我们在国际杂志上首次报道,CCN1蛋白在急性髓系白血病中表达明显增高,并能够影响急性髓系白血病细胞的生物学性状以及对抗白血病药物的敏感性,CCN1蛋白检测可能在急性髓系白血病的诊断和治疗监测中有重要应用价值。
在成分复杂的血液样本中,对于低浓度的蛋白生物标志物的检测,要求检测方法在低浓度水平具备极好的再现性。目前蛋白生物标志物检测方法主要有,酶联免疫吸收试验、蛋白电泳、质谱分析、(surface plasmon resonance)、质量敏感蛋白芯片(Mass-sensing BioCD protein array)、表面增强拉曼光谱(surface enhanced Ramanspectroscopy,SERS)、浊度分析、电化学分析及荧光方法等。这些方法都基于免疫抗原-抗体反应。临床研究中血清中生物标志物,如CCN1蛋白检测仅有检测性能表现欠佳的酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent assay,ELISA)方法,包被的抗体差异较大且包被过程对抗原、抗体反应影响较大,导致非特异性反应发生,特别是ELISA方法对于样本中的低浓度蛋白检测的敏感性较差,这些使其在临床中的定量应用价值受到限制。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,在电化学发光方法的基础上,提供一种生物传感器及其制备方法,以及该生物传感器在CCN1蛋白的电化学发光检测中的应用,从而克服了现有技术在低CCN1浓度蛋白检测时敏感性较差的缺陷。
为了实现上述目的,第一方面,本发明提供了一种生物传感器的制备方法,该方法包括:
(1)将二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液与玻碳电极的表面进行第一接触,获得第一接触产物Nf@Ru/GCE;
(2)将所述Nf@Ru/GCE在氯金酸溶液中进行电沉积,以在所述Nf@Ru/GCE的表面上修饰纳米金颗粒,获得电沉积产物AuNPs/Nf@Ru/GCE;
(3)将所述AuNPs/Nf@Ru/GCE与修饰有巯基的ssDNA进行第二接触,以形成金硫键,从而将ssDNA固载在所述AuNPs/Nf@Ru/GCE表面,得到第二接触产物ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE;
其中,所述ssDNA中修饰有巯基的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面,本发明提供了如上所述的方法制备的生物传感器。
第三方面,本发明提供了如上所述的生物传感器非治疗目的地在CCN1蛋白的电化学发光检测中的应用。
第四方面,本发明提供了一种CCN1蛋白的电化学发光检测试剂盒,该试剂盒含有如上所述的生物传感器。
第五方面,本发明提供了一种CCN1蛋白的电化学发光检测试剂盒,该试剂盒含有:玻碳电极、二价的羧基联吡啶钌、萘酚、氯金酸、修饰有巯基的ssDNA、链霉亲和素的磁珠、三丙胺、CCN1融合纯化蛋白、CCN1捕获抗体、CCN1检测抗体、生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链、以及SEQ IDNO.3所示的Fc修饰的引物和SEQ ID NO.4所示的引物;
其中,所述ssDNA中修饰有巯基的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第六方面,本发明提供了一种非治疗目的地CCN1蛋白的电化学发光检测检测方法,该方法包括:
(1)制备生物素标记的CCN1蛋白捕获抗体CAb-biotin,以及SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链和CCN1蛋白检测抗体的偶联物DAb-Initiator I;
(2)制备CCN1融合纯化蛋白、CAb-biotin、DAb-Initiator I和链霉亲和素的磁珠的结合物DAb-Initiator I/CCN1/CAb-biotin/SA@MB,然后将所述结合物与SEQ ID NO.3所示的Fc修饰的H1引物和SEQ ID NO.4所示的H2引物进行接触,以使得SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链被Fc-H1-H2双链DNA所置换,得到置换产物;
(3)将获得的置换产物加入到权利要求5所述的生物传感器上进行电化学发光检测。
本发明在电化学发光方法的基础上,解决了低浓度CCN1蛋白检测信号性能及化学发光磁微粒导致检测系统不稳定的关键问题,达到信号放大和促进检测系统稳定性的研究目的(灵敏度可达到0.00502pg/mL,动态范围为0.00001-100ng/mL),以期解决临床检测中蛋白标志物低浓度水平临床价值应用及研究的关键问题,并为评价CCN1蛋白浓度检测在临床诊疗中的作用研究打下基础。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为生物传感器不同制备阶段的循环伏安(Cyclic Voltammetry,CV)图;
(a)GCE;(b)Nf@Ru/GCE;(c)AuNPs/Nf@Ru/GCE;(d)ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE;(e)HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE;(f)Fc-H1-H2/HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE。
图2为生物传感器不同制备阶段的电化学阻抗谱(Electrochemical ImpedanceSpectroscopy,EIS)图;
(a)GCE;(b)Nf@Ru/GCE;(c)AuNPs/Nf@Ru/GCE;(d)ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE;(e)HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE;(f)Fc-H1-H2/HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE。
图3为不同浓度CCN1蛋白通过电化学发光生物传感器的检测信号图和校准曲线图;
A.不同浓度电化学信号图,(a-i):0.01、0.1、1、10、100、500、1,000、10,000、100,000pg/mL;B.校准曲线。
图4为不同浓度CCN1蛋白通过间接免疫荧光的检测信号与浓度的线形关系图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在没有相反说明的情况下,本发明所使用的原料物质或生成的物质和其简称具有如表1所示的对应关系,在文中可以互换使用。
表1
第一方面,本发明提供了一种生物传感器的制备方法,该方法包括:
(1)将二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液与玻碳电极的表面进行第一接触,获得第一接触产物Nf@Ru/GCE;
(2)将所述Nf@Ru/GCE在氯金酸溶液中进行电沉积,以在所述Nf@Ru/GCE的表面上修饰纳米金颗粒,获得电沉积产物AuNPs/Nf@Ru/GCE;
(3)将所述AuNPs/Nf@Ru/GCE与修饰有巯基的ssDNA进行第二接触,以形成金硫键,从而将ssDNA固载在所述AuNPs/Nf@Ru/GCE表面,得到第二接触产物ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE;
其中,所述ssDNA中修饰有巯基的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(5’-GCCCAA ACA CGA TTG TCA CAC TTT TTT TTT TT-SH-3’)所示。
根据本发明,所述GCE可以为本领域常规使用的各种GCE,优选的,所述GCE的直径为2-4mm,例如,可以为2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm以及任意两个点值之间所组成的范围内的值。
根据本发明,为了获得更加稳定且检测更加灵敏和精准的生物传感器,优选的,在将所述玻碳电极与二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液接触之前,该方法还包括对所述电极进行镜面抛光,以获得镜状表面。其中,所述镜面抛光的方法可以为本领域常规使用的各种方法,优选的,使用三氧化二铝抛光粉末对玻碳电极的表面进行镜面抛光,具体的:将抛光布保持平整(含抛光底座),上面撒上适量的三氧化二铝粉末(直径0.05-0.3微米)和蒸馏水,混合成糊状,手握电极,使电极垂直于抛光布,对电极需要打磨面以画圈的方式进行充分打磨抛光,注意力度,打磨后冲洗(优选在双蒸馏水和乙醇中交替冲洗)干净,滴水滴检验成水珠,进行铁氰化钾检验合格后待用。
优选的,将二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液以滴加的方式加入到所述镜状表面进行第一接触。
根据本发明,步骤(1)中,二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液可以通过将二价的羧基联吡啶钌溶解于萘酚溶液中获得。其中,所述二价的羧基联吡啶钌和萘酚均可商购获得。所述萘酚溶液中萘酚的浓度可以为3-8重量%,例如,可以为3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%。所述二价的羧基联吡啶钌在萘酚溶液中的浓度可以为0.1-1mM,例如,可以为0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM。
其中,GCE上加入的(Nf@Ru)溶液的量可以在较宽的范围内进行变动,而为了获得性能更加的生物传感器,优选的,相对于直径的玻碳电极,所述(Nf@Ru)溶液的加入量为2-5μL,例如,可以为2μL、2.5μL、3μL、3.5μL、4μL、4.5μL、5μL。
根据本发明,所述第一接触可以使得(Nf@Ru)溶液物理吸附在GCE的表面,从而得到具有较高稳定信号的Nf@Ru/GCE。优选的,所述第一接触的条件包括:温度为35-40℃,时间为2.5-3.5小时。
根据本发明,步骤(2)中,可以通过将Nf@Ru/GCE浸泡在氯金酸溶液中进行电沉积,从而将纳米金颗粒沉积到Nf@Ru/GCE表面,获得AuNPs/Nf@Ru/GCE。所述电沉积的条件可以在较宽的范围内进行变动,优选的,为了获得性能更加的生物传感器,所述电沉积的条件包括:电压为-0.1至-0.3V,时间为5-15s。
其中,所述氯金酸溶液优选为四水氯金酸溶液,其中,所述四水氯金酸的浓度选择不受特别限制,优选的,相对于每毫升的四水氯金酸溶液,所述四水氯金酸的含量为8-12mg。
根据本发明,步骤(3)中,所述修饰有巯基的ssDNA与AuNPs/Nf@Ru/GCE的接触可以形成金硫键,从而可以将ssDNA固载到AuNPs/Nf@Ru/GCE的表面,得到ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE。其中,所述第二接触的条件优选在低温下进行,优选的,所述第二接触的条件包括:温度为2-6℃,时间为8-15小时。
其中,固载到AuNPs/Nf@Ru/GCE上的修饰有巯基的ssDNA的量可以在较宽的范围内进行选择,优选的,相对于直径为3mm的GCE电极,以修饰有巯基的ssDNA浓度为1μM计,所述ssDNA的用量可以为4-10μL。
根据本发明,为了进一步避免在使用所制备的生物传感器时的非特异性吸附,优选的,该方法还包括:将ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE在1-己硫醇中进行第三接触,得到第三接触产物HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE。其中,所述第三接触优选在低温的条件下进行,优选的,所述孵育的温度为2-6℃,时间为30-50min。
其中,所述1-己硫醇的用量可以在较宽的范围内进行选择,优选的,相对于直径为3mm的GCE电极,以1-己硫醇浓度为1mM计,所述1-己硫醇的用量为2-8μL。
根据本发明,所述第二接触产物ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE和第三接触产物HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE均可作为本发明的生物传感器。
第二方面,本发明提供了如上所述的方法制备的生物传感器。
第三方面,本发明提供了如上所述的方法制备的生物传感器非治疗目的地在CCN1蛋白的电化学发光检测中的应用。
其中,所述非治疗目的,例如,可以是CCN1蛋白与疾病之间关系的基础研究。
第四方面,本发明提供了一种CCN1蛋白的电化学发光检测试剂盒,该试剂盒含有如上所述的生物传感器。
根据本发明,本发明所制备的生物传感器可以结合链置换扩增技术用于CCN1的超灵敏检测,在该情况下,所述试剂盒还含有链霉亲和素的磁珠、三丙胺、CCN1融合纯化蛋白、CCN1捕获抗体、CCN1检测抗体、生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、SEQ ID NO.2(5’-HOOC-TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG A-3’)所示的羧基修饰的引发链、以及SEQ ID NO.3(5’-Fc-TGG AGT GTG ACA ATC GTG TTT GGG CTT ATC AGACTG ATG TTG ACG ATT GTC ACA CTC CAT CAA CAT CAG TC-3’)所示的Fc修饰的引物和SEQID NO.4(5’-AGA CTG ATG TTG ATG GAG TGT GAC AAT CGT CAA CAT CAG TCT GAT AA-3’)所示的引物。
根据本发明,所述试剂盒中可以含有已经制备好的如上所述的生物传感器,也可以含有用于制备如上所述的生物传感器的各原料,然后按照如上的所述的生物传感器的制备方法进行生物传感器的制备。
因此,第五方面,本发明还提供了一种CCN1蛋白的电化学发光检测试剂盒,该试剂盒含有:玻碳电极、二价的羧基联吡啶钌、萘酚、氯金酸、修饰有巯基的ssDNA、链霉亲和素的磁珠、三丙胺、CCN1融合纯化蛋白、CCN1捕获抗体、CCN1检测抗体、生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、ssDNA、SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链、以及SEQ ID NO.3所示的Fc修饰的引物和SEQ ID NO.4所示的引物;
其中,所述ssDNA中修饰有巯基的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的,所述试剂盒还含有三氧化二铝抛光粉末。
优选的,所述试剂盒还含1-己硫醇HT。
根据本发明第四方面和第五方面的试剂盒,其还含有各种用于相应反应的缓冲液,例如,PBS缓冲液、TE缓冲液等,本领域技术人员可以根据实际情况进行选择性的添加。
根据本发明,使用本发明的生物传感器并辅以链置换扩增技术用于CCN1的超灵敏检测CCN1蛋白的原理为:与正常免疫分析不同的是,首先通过夹心免疫分析将目标CCN1蛋白转化为寡核苷酸(也即,SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链),而寡核苷酸引发了有效的链置换扩增,生成带有二茂铁(ferrocene,Fc)的粘端的大量DNA双链(具体的,Fc-H1先与Initiator I结合,H2置换了Initiator I并与Fc-H1结合),其可固定在本发明的生物传感器的电极表面,产生与目标CCN1蛋白浓度相关的明显猝灭的电致化学发光信号,然后通过检测该信号则可以获得CCN1蛋白的浓度。
由此,第六方面,本发明还提供了一种非治疗目的地CCN1蛋白的电化学发光检测检测方法,该方法包括:
(1)制备生物素标记的CCN1蛋白捕获抗体CAb-biotin,以及SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链和CCN1蛋白检测抗体的偶联物DAb-Initiator I;
(2)制备CCN1融合纯化蛋白、CAb-biotin、DAb-Initiator I和链霉亲和素的磁珠的结合物DAb-Initiator I/CCN1/CAb-biotin/SA@MB,然后将所述结合物与SEQ ID NO.3所示的Fc修饰的H1引物和SEQ ID NO.4所示的H2引物进行接触,以使得SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链被Fc-H1-H2双链DNA所置换,得到置换产物;
(3)将获得的置换产物加入到权利要求5所述的生物传感器上进行电化学发光检测。
步骤(1)
根据本发明,由于抗体本身是有功能的蛋白质,其化学结构含有游离羧基和氨基,因此可用于各种化学物质的修饰或标记。生物素(NHS-biotin)与蛋白质的伯胺基(-NH2)可进行有效反应,因此可用于标记CCN1蛋白捕获抗体。具体的,CAb-biotin的制备方法可以包括:在缓冲液中,将NHS-biotin与CCN1蛋白捕获抗体混合,接触反应,反应结束后,将反应完全的CAb-biotin通过滤膜进行分离纯化,最后将纯化后的产物溶解于缓冲液,低温储存备用。
其中,所述接触反应的条件可以包括:温度为35-40℃,时间为1.5-2.5小时。
根据本发明,用于标记CCN1蛋白捕获抗体的生物素的用量可以在较宽的范围内进行选择,例如,相对于1μg的CCN1蛋白捕获抗体,以10mmol/L计的生物素的用量可以为8-12μL。
根据本发明,所述膜过滤优选为超滤膜过滤。
优选的,所述缓冲液为PBS缓冲液。
EDC/NHS系统作为一种广泛应用的生物标记的策略,可以激活羧基,催化羧基与胺基之间的缩合反应,基于相似的反应机理,本发明通过SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链I(Initiator I)与CCN1蛋白检测抗体上的氨基之间的生物共轭法制备了DAb-InitiatorI。具体的,SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链与N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺混合并接触反应,促进核酸链上羧基的活化,然后加入CCN1蛋白检测抗体和N-羟基琥珀酰亚胺继续反应,将反应完全的产物通过滤膜进行分离纯化,最后将纯化后的产物溶解于缓冲液得到DAb-Initiator I。
其中,相对于1μg的CCN1蛋白检测抗体,各物质的用量可以在较宽的范围内进行选择,以1mM浓度计的Initiator I的用量优选为80-120μL,以40mM浓度计的EDC的用量优选为80-120μL,以10mM浓度计的NHS的用量优选为80-120μL。
其中,所述接触反应的条件可以包括:温度为2-6℃,时间为1.5-2.5小时。
其中,所述继续反应的条件可以包括:温度为2-6℃,时间为8-15小时。
根据本发明,所述膜过滤优选为超滤膜过滤。
优选的,所述缓冲液为PBS缓冲液。
步骤(2)
根据本发明,所述结合物的制备方法可以包括:
将CAb-biotin与链霉亲和素的磁珠接触反应,得到CAb-biotin/SA@MB;其中,该接触反应的条件可以包括:温度为35-40℃,时间为1.5-2.5小时。
将CAb-biotin/SA@MB与CCN1融合纯化蛋白接触反应,得到CCN1/CAb-biotin/SA@MB;其中,该接触反应的条件可以包括:温度为35-40℃,时间为1.5-2.5小时。
将CCN1/CAb-biotin/SA@MB与DAb-Initiator I接触反应,得到DAb-Initiator I/CCN1/CAb-biotin/SA@MB;其中,该接触反应的条件可以包括:温度为35-40℃,时间为1.5-2.5小时。
优选的,将所述结合物与以及SEQ ID NO.3所示的Fc修饰的H1引物和SEQ ID NO.4所示的H2引物进行接触的条件为35-40℃,时间为100-150min。该接触可以促进目标诱导的链置换循环放大反应,具体的,Fc-H1先与Initiator I结合,H2置换了Initiator I并与Fc-H1结合,得到大量的Fc-H1-H2双链DNA,(在接触反应之前,Fc修饰的H1引物和H2引物均以发夹结构的状态存在,只有在Initiator I优先结合Fc-H1并打开发夹时,H2才能够去置换Initiator I,当Fc-H1是发夹结构时,H2是不能结合上去的。)也即DAb-(Fc-H1-H2双链DNA)/CCN1/CAb-biotin/SA@MB。所述双链DNA(DAb-(Fc-H1-H2双链DNA)/CCN1/CAb-biotin/SA@MB)可以通过磁力架对链霉亲和素的磁珠的强大吸引力对磁珠进行回收而获得。
根据本发明,回收得到的双链DNA可以通过滴加到本发明制备的所述生物传感器表面在35-40℃的条件下孵育80-150分钟,然后浸入含有三丙胺作为共反应试剂的缓冲液中进行电化学发光检测。
优选的,所述缓冲液为PBS缓冲液。
根据本发明,所述电化学发光检测可以通过光电倍增管(PMT)进行,其电压被可以设定在750-850V,电位范围为-0.5V到1.5V。
其中,在工作电极上(阳极)加一定的电压能量的作用下,二价的羧基联吡啶钌[Ru(dcbpy)3 2+]释放电子发生氧化反应而成为三价的羧基联吡啶钌[Ru(dcbpy)3 3+],同时,TPRA也释放电子发生氧化反应而成为阳离子激发态TPRA+,并迅速自发脱去一个质子而形成激发态三丙胺,这样,在反应体系中同时存在具有强氧化性的三价的羧基联吡啶钌[Ru(dcbpy)3 3+]和具有强还原性的激发态三丙胺。化学发光过程:具有强氧化性的三价的羧基联吡啶钌[Ru(dcbpy)3 3+]和具有强还原性的激发态三丙胺发生氧化还原反应,结果使三价的羧基联吡啶钌[Ru(dcbpy)3 3+]还原成激发态的二价的羧基联吡啶钌[Ru(dcbpy)3 2+],其能量来源于三价的羧基联吡啶钌[Ru(dcbpy)3 3+]与激发态三丙胺之间的电势差,激发态[Ru(dcbpy)3 2+]以荧光机制衰变并以释放出一个波长为620nm光子的方式释放能量,而成为基态的[Ru(dcbpy)3 2+]。循环过程:上述化学发光过程后,反应体系中仍存在二价的羧基联吡啶钌[Ru(dcbpy)3 2+]和三丙胺(TPRA),使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以继续进行,这样,整个反应过程可以循环进行。通过上述的循环过程,测定信号不断的放大,从而使检测灵敏度大大提高。
根据本发明,所述CCN1蛋白、CCN1蛋白捕获抗体、CCN1蛋白检测抗体可以为本领域公知的各种CCN1蛋白、CCN1蛋白捕获抗体、CCN1蛋白检测抗体,均可通过商购获得,例如,CCN1蛋白可以购自武汉三鹰生物技术有限公司,CCN1蛋白捕获抗体可以购自武汉三鹰生物技术有限公司,CCN1蛋白检测抗体可以购自艾博抗上海贸易有限公司。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
试剂 厂家
链霉亲和素的磁珠 美国Sigma公司
三丙胺 美国Sigma公司
萘酚 美国Sigma公司
氯金酸 美国Sigma公司
1-己硫醇 美国Sigma公司
N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺 百灵威化学技术有限公司
N-羟基琥珀酰亚胺 百灵威化学技术有限公司
生物素 艾博抗上海贸易有限公司
二价的羧基联吡啶钌 纳凯科技有限公司
SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链 上海生工生物工程技术有限公司
SEQ ID NO.3所示的二茂铁修饰的引物(Fc-H1) 上海生工生物工程技术有限公司
其他DNA链 上海生工生物工程技术有限公司
实施例1
本实施例用于说明本发明的生物传感器的制备
(1)将抛光布保持平整(含抛光底座),上面撒上适量0.3或者0.05微米(两种粒径)的三氧化二铝粉末和蒸馏水,混合成糊状,手握电极GCE(直径),使电极垂直于抛光布,对电极需要打磨面以画圈的方式进行充分打磨抛光,注意力度,打磨后在双蒸馏水和乙醇中交替冲洗干净,滴水滴检验成水珠,进行铁氰化钾检验合格后待用。
(2)将3μL的Nafion@Ru(dcbpy)3 2+(Nf@Ru)溶液(Ru(dcbpy)3 2+溶于5%的Nafion中得到,浓度1mM)滴到光滑的GCE表面,在37℃保持3小时,Nf@Ru通过物理吸附在GCE表面,以获得具有较高稳定信号的Nf@Ru/GCE。
(3)将Nf@Ru/GCE浸入HAuCl4·4H2O溶液(10mg/mL)中在-0.2V电压下进行电沉积10s,将纳米金颗粒AuNPs修饰到Nf@Ru/GCE表面,得到AuNPs/Nf@Ru/GCE。
(4)将AuNPs/Nf@Ru/GCE与7μL的ssDNA(1μΜ,修饰有巯基的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)在4℃的冰箱中过夜孵育形成金硫键,使得ssDNA被固载到AuNPs/Nf@Ru/GCE表面,形成ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE。
(5)用5μL HT(1mM)将ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE在4℃孵育40分钟,以避免检测过程中的非特异性吸附。得到生物传感器,即HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE。
测试例1
本测试例用于说明对CCN1蛋白的检测
(1)CAb-biotin与DAb-Initiator I的制备
在0.5mL的PBS缓冲液中,将10μL NHS-biotin(10mmol/L)与3μL CCN1蛋白的捕获抗体(50μg/150μL)混合,在37℃的条件下反2小时。将反应完全的CAb-biotin通过超滤膜进行分离纯化,最后溶解于1mL的PBS中并储存在4℃的冰箱中供下一步使用。
将Initiator I(100μL,1mM,SEQ ID NO.2)与EDC(40mM)100μL混合在4℃下连续搅拌2小时,促进核酸链上羧基的活化。然后加入5μL DAb(200μg/mL)和100μL NHS(10mM),并用PBS稀释至1mL,并在4℃隔夜连续搅拌,得到大量的DAb-Initiator I,同样用超滤膜分离纯化得到DAb-Initiator I,最后溶解于1mL的PBS中并储存在4℃的冰箱中供下一步使用。
(2)免疫夹心法和链置换循环的结合
CCN1-biotin与SA@MB在37℃反应2h得到CAb-biotin/SA@MB。再通过抗原和抗体之间的特殊识别效应,CCN1蛋白能够与捕获抗体CAb在37℃结合2h,从而形成CCN1/CAb-biotin/SA@MB。同理下一步在CCN1/CAb-biotin/SA@MB上在37℃反应2h结合检测抗体DAb,得到DAb-Initiator I/CCN1/CAb-biotin/SA@MB。用1μM的Fc-H1(SEQ ID NO.3)和H2(SEQID NO.4)在37℃下孵育120分钟,在此过程中Fc-H1先与Initiator I结合,H2置换再Initiator I并与Fc-H1结合,也即,Fc-H1-H2双链DNA置换了Initiator I。最后通过磁力架对磁珠的强大吸引力对磁珠进行回收,得到了含有大量的Fc-H1-H2双链DNA的置换产物。
(3)检测过程
MPI-A型电致化学发光分析仪(西安瑞迈电子科学技术有限公司),光电倍增管高压800V,扫描电位-0.5至1.5V,扫描速率100mV/s。
将7μL的置换产物(Fc-H1-H2双链DNA浓度对应不同浓度的CCN1)分别滴入备用的生物传感器HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE表面,在37℃的条件下孵化120分钟。在此之后,将所得的生物传感器浸入2mL的0.1M PBS(TPRA作为共反应试剂),进行电化学发光检测。光电倍增管(PMT)的电压被设定在800V,电位范围为-0.5V-1.5V。
测试例2
本测试例用于说明本发明制备的生物传感器的电化学性能
使用CHI760E型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)对本发明制备的生物传感器进行循环伏安(CV)、电化学阻抗光谱(EIS)和电化学沉积测试。其中,循环伏安图(CyclicVoltammetry,CV)和电化学阻抗谱(Electrochemical Impedance Spectroscopy,EIS)都是研究生物传感器制造的电极界面特性的电化学方法。
具体的,CV测量在0.1M PBS(pH.7.4)中进行,其中含有5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-,范围为-0.2V至0.6V,扫描率为100mV s-1,用于验证修饰步骤感应界面。结果如图1所示,从图1可以看出,在光面的GCE(曲线a)上观察到一对典型的可逆Redox峰。在用Nf@Ru化合物修饰后,由于Nf层阻碍电子转移,Redox峰值电流(曲线b)急剧下降。然后,由于金纳米能促进电子转移和提高电极表面的电导率,峰值电流明显增加(曲线c)。当ssDNA成功固载在电极上时,观察到峰值电流下降(曲线d)。峰值电流在用HT封闭后持续下降(曲线e)。最后,当通过杂交反应将CCN1靶蛋白(0.1ng/mL)循环转化后的Fc-H1-H2引入电极表面时,得到了进一步降低的Redox峰值电流(曲线f)。
EIS根据电子传递电阻抗的变化来监测修饰过程,结果如图2所示,与奈奎斯特图较高部分的半圆形直径相对应。用裸CCE获得了约80Ω的初始极值(曲线a)。当Nf@Ru化合物在电极表面吸附后,得到了一个大约450Ω(曲线b)的明显增大的阻抗。然后,在电极上电沉积AuNPs,由于其优良导电性能,得到了一个急剧下降的阻抗(曲线c,Ret≈20Ω)。通过金硫键在电极上包覆了捕获探针ssDNA,电极表面阻抗增加到约50Ω(曲线d)。此外,当修饰电极与HT孵化时,由于HT阻断了界面电子转移,所以阻抗增加(曲线e,Ret≈200Ω)。当Fc-H1-H2DNA与ssDNA杂交时,其阻抗增加到约400Ω(曲线f)。
根据CV和EIS的这些结果,可以得出结论,生物传感器是成功构建的。
测试例3
本测试例用于说明本发明的生物传感器的检测限和灵敏度
为了验证本发明生物传感器在CCN1检测中的性能,按照测试例1的方法将所述生物传感器分别用于0.01、0.1、1、10、100、500、1,000、10,000、100,000pg/mL的CCN1蛋白浓度的测定,相应的数据如图3所示。由图3A可以看出,随着位于生物传感器表面的Fc-H1-H2的增加,ECL信号强度降低,且在0.01pg/mL到100,000pg/mL之间的CCN1蛋白浓度呈线性关系(图3B)。ECL信号的线性方程为I=-1038.1lgc+1861.3,相关系数为-0.9914,检测极限为0.00502pg/mL,动态范围为0.00001-100ng/mL,表明该生物传感器可用于癌症早期诊断和转移监测的CCN1的定量检测。
对比例
本对比例用于说明现有的检测CCN1蛋白的方法
通过间接免疫荧光测定法检测CCN1蛋白,得到所研究的ECL检测性能更好。
在该检测过程中,捕获抗体,CCN1蛋白和检测抗体可以有效地组合以形成特异性双抗体夹心复合物。此外,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠抗体与DAb结合形成免疫复合物,通过检测免疫复合物的荧光强度来推断CCN1蛋白的浓度。通过荧光分析仪只能检测到五种浓度(1pg/mL,0.01ng/mL,0.1ng/mL,0.01mg/mL,1mg/mL)的目标CCN1蛋白(结果如图4所示)。
由以上可以看,间接免疫荧光测定没有达到一个比较宽的线性范围和较低检测限,对比本申请所制备的ECL生物传感器可以更好的实现较高的灵敏度并获得更好的性能。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 重庆市人民医院
<120> 用于CCN1蛋白的电化学发光检测的生物传感器及其制备方法和应用
<141> 2019-06-20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> ssDNA中修饰有巯基的一条链(A Chain Modified with Sulfhydryl Groupsin ssDNA)
<220>
<221> misc_feature
<223> 3'端修饰有巯基SH
<400> 1
gcccaaacac gattgtcaca cttttttttt tt 32
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 羧基修饰的引发链(Carboxyl Modified Initiation Chain)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5’端修饰有羧基COOH-
<400> 2
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 3
<211> 71
<212> DNA
<213> Fc修饰的引物Fc-H1(Fc Modified Primer Fc-H1)
<220>
<221> misc_feature
<223> 5'端修饰有二茂铁Fc
<400> 3
tggagtgtga caatcgtgtt tgggcttatc agactgatgt tgacgattgt cacactccat 60
caacatcagt c 71
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> H2引物(H2 primer)
<400> 4
agactgatgt tgatggagtg tgacaatcgt caacatcagt ctgataa 47

Claims (10)

1.一种生物传感器的制备方法,其特征在于,该方法包括:
(1)将二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液与玻碳电极的表面进行第一接触,获得第一接触产物Nf@Ru/GCE;
(2)将所述Nf@Ru/GCE在氯金酸溶液中进行电沉积,以在所述Nf@Ru/GCE的表面上修饰纳米金颗粒,获得电沉积产物AuNPs/Nf@Ru/GCE;
(3)将所述AuNPs/Nf@Ru/GCE与修饰有巯基的ssDNA进行第二接触,以形成金硫键,从而将ssDNA固载在所述AuNPs/Nf@Ru/GCE表面,得到第二接触产物ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE;
其中,所述ssDNA中修饰有巯基的一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,在将所述玻碳电极与二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液接触之前,该方法还包括对所述玻碳电极进行镜面抛光,获得镜状表面;其中,将二价的羧基联吡啶钌的萘酚溶液滴加到所述镜状表面进行第一接触;
优选的,使用三氧化二铝抛光粉末对所述玻碳电极进行镜面抛光。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述第一接触的条件包括:温度为35-40℃,时间为2.5-3.5小时;和/或
所述电沉积的条件包括:电压为0.1-0.3V,时间为5-15s;和/或
所述第二接触的条件包括:温度为2-6℃,时间为8-15小时。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法,其中,该方法还包括:将ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE在1-己硫醇中进行第三接触,得到第三接触产物HT/ssDNA/AuNPs/Nf@Ru/GCE;
优选的,所述第三接触的温度为2-6℃,时间为30-50min。
5.权利要求1-4中任意一项所述的方法制备的生物传感器。
6.权利要求5所述的生物传感器非治疗目的地在CCN1蛋白的电化学发光检测中的应用。
7.一种CCN1蛋白的电化学发光检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有权利要求5所述的生物传感器;
优选的,该试剂盒还含有:链霉亲和素的磁珠、三丙胺、CCN1融合纯化蛋白、CCN1捕获抗体、CCN1检测抗体、生物素、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链、以及SEQ ID NO.3所示的Fc修饰的引物和SEQ IDNO.4所示的引物。
8.一种非治疗目的地CCN1蛋白的电化学发光检测检测方法,其特征在于,该方法包括:
(1)制备生物素标记的CCN1蛋白捕获抗体CAb-biotin,以及SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链和CCN1蛋白检测抗体的偶联物DAb-Initiator I;
(2)制备CCN1融合纯化蛋白、CAb-biotin、DAb-Initiator I和链霉亲和素的磁珠的结合物DAb-Initiator I/CCN1/CAb-biotin/SA@MB,然后将所述结合物与SEQ ID NO.3所示的Fc修饰的H1引物和SEQ ID NO.4所示的H2引物进行接触,以使得SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链被Fc-H1-H2双链DNA所置换,得到置换产物;
(3)将所述置换产物加入到权利要求5所述的生物传感器上进行电化学发光检测。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,步骤(1)中,CAb-biotin的制备方法包括:将生物素与CCN1蛋白捕获抗体混合并接触反应,将反应后的产物通过滤膜进行分离纯化,最后将纯化产物溶解于缓冲液得到CAb-biotin;和/或
DAb-Initiator I的制备方法包括:将SEQ ID NO.2所示的羧基修饰的引发链与N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺混合并接触反应,以活化所述引发链上的羧基,然后加入CCN1蛋白检测抗体和N-羟基琥珀酰亚胺继续反应,将反应完全的产物通过滤膜进行分离纯化,最后将纯化产物溶解于缓冲液得到DAb-Initiator I。
10.根据权利要求8所述的方法,其中,步骤(2)中,所述结合物的制备方法包括:
将CAb-biotin与链霉亲和素的磁珠接触反应,得到CAb-biotin/SA@MB;
将CAb-biotin/SA@MB与CCN1融合纯化蛋白接触反应,得到CCN1/CAb-biotin/SA@MB;
将CCN1/CAb-biotin/SA@MB与DAb-Initiator I接触反应,得到DAb-Initiator I/CCN1/CAb-biotin/SA@MB;
优选的,步骤(3)中,所述电化学发光检测的方法包括将:将所述置换产物加入到所述生物传感器表面,在35-40℃的条件下孵育80-150分钟,然后浸入含有三丙胺作为共反应试剂的缓冲液中进行电化学发光检测。
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