CN112462054A - 一种定量检测大肠杆菌o157:h7的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括以下步骤：（1）制备检测线包被大肠杆菌O157:H7抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；（3）检测大肠杆菌O157:H7含量。通过引入“磁聚焦”策略和包埋L‑半胱氨酸的脂质体，大幅提升了免疫层析试纸条的灵敏度，解决了其灵敏度低的瓶颈问题，或使用的金磁纳米颗粒既用于在样品预处理步骤中富集大肠杆菌O157:H7，又在随后的免疫层析检测中用于构建信号探针，减少了操作步骤，降低了成本。本发明的试纸条检测限低、特异性好、成本低廉、检测时间短。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法。
背景技术
大肠杆菌O157:H7，是威胁人类健康的主要病原菌之一。由于其广泛存在于水和土壤中，由其引发的疾病往往人群数量多，分布广，给食品安全和人们健康带来巨大的威胁。因此，食品中大肠杆菌O157:H7的检测具有非常重要的意义。
目前常用的检测食源性致病菌的方法主要有平板计数法、聚合酶链锁反应法、环介导等温扩增法、酶联免疫吸附测定法、免疫磁性纳米颗粒分离法、荧光免疫分析法、颜色传感器等。这些检测方法通常需要对样品进行分离、纯化培养、富集，步骤繁多、实验周期长，致使整个检测过程费时费力，不能满足现场快速高通量检验的需要。
免疫层析是近年来兴起的一种新型快速检测技术。凭借其简单易用、低成本、检测快速等优势，免疫层析技术迅速得到了人们的接受和认可。随着检测技术的进步，免疫层析已经从最初的定性检测，发展到现在的半定量、定量检测。多个检测指标也可以集成在单个试纸条内，只需一次即可完成多个目标物的检测。然而，传统的基于胶体金的免疫层析技术存在灵敏度低的缺陷，极大限制了其应用的广度和商业化的可能性。因此，采用新策略克服免疫层析技术灵敏度低的瓶颈问题，对于拓展其应用范围，提高其实用性就变得尤为必要。
检测区域所能够捕获的目标物数量不足是导致传统胶体金免疫层析技术检测方法灵敏度低的关键原因。针对这一问题，目前国内外学者主要从“使检测区域的信号更容易读取”和“使检测区域能够捕获的目标物更多”两个大的方面开展研究工作。然而，目前开发出的新型免疫层析技术要么需要改变原有试纸条的构造，要么需要额外的设备或试剂，操作步骤繁琐，与免疫层析技术简捷性的优势不符，均不同程度上违背了现实生产生活中设计采用免疫层析方法的初衷。
发明内容
方法1：为了解决这一阻碍免疫层析技术应用的瓶颈，本发明中，我们从“使检测区域能够捕获的目标物更多”的角度出发，通过将经典采用的胶体金置换为磁性纳米颗粒，采用外加磁场降低其在硝基纤维膜上的移动速率的方式克服了免疫层析技术灵敏度低的缺陷。该策略把磁性纳米颗粒的高选择性、可富集性及流速可控性与免疫层析技术高通量、快速、简捷的优势相结合，大幅提高了检测灵敏度。
方法2：首先采用免疫磁性纳米颗粒富集样品溶液中的目标菌，从而达到增强最终检测灵敏度的目的。在免疫层析过程进行前，首先采用修饰大肠杆菌O157:H7抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒与样品溶液混合，富集样品中的大肠杆菌O157:H7。随后在外加磁场条件下，将结合大肠杆菌O157:H7的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒与上清液分离，并重新溶解在PBS溶液中并将溶液用于免疫层析检测。
此外，我们从“使检测区域的信号更容易读取”的角度出发，通过引入负载辅助信号放大因子的脂质体，将传统免疫层析方法中目标物与检测信号1:1的比例关系改变为1:n，进一步提高了免疫层析技术的灵敏度。
本发明涉及的方法的基本原理如下：不同于经典胶体金免疫层析法，本发明提出的基于“磁聚焦”策略的双模式免疫层析法使用Fe3O4@AuNPs纳米颗粒与负载辅助信号放大因子（HRP）的脂质体的复合物（脂质体-Fe3O4@AuNPs）代替了胶体金纳米颗粒，并在试纸条检测区域下方放置一块小磁铁。将大肠杆菌O157:H7抗体和羊抗鼠IgG固定在硝基纤维膜的特定区域分别形成检测线和质控线。将样品溶液与修饰大肠杆菌O157:H7抗体的Fe3O4@AuNPs和脂质体混合，滴加到样品垫上时，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当移动到结合垫时，基于抗原抗体间的免疫反应，修饰抗体脂质体-Fe3O4@AuNPs将与样品中含有的大肠杆菌O157:H7结合，形成脂质体-Fe3O4@AuNPs-抗体-目标菌复合物。样品继续在硝基纤维膜上继续流动，当复合物流动至检测线区域时，由于磁场的作用，有磁性的脂质体-Fe3O4@AuNPs会使得流速明显减缓，这样固定在硝基纤维膜上的抗体即可有更长的时间与脂质体-Fe3O4@AuNPs-抗体-目标菌复合物结合形成“三明治”夹心结构。而没有结合大肠杆菌O157:H7的复合物则继续向前移动，在质控线处与二抗结合。由于反应时间的延长，相应地，与未施加磁场的免疫层析方法相比，就会有更多的目标物被固定在检测区域的抗体所捕获。因此，最终的检测结果明显更好，即检测限更低、灵敏度更高。如果样品中的大肠杆菌O157:H7浓度较高，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越多，会显示出脂质体-Fe3O4@AuNPs复合物的颜色。相反，如果样品中的大肠杆菌O157:H7浓度较低，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越少，则不会显示出脂质体-Fe3O4@AuNPs复合物的颜色。层析过程结束后，加入TMB和H2O2溶液，利用TMB-HRP间的催化氧化反应产生大量蓝色信号增强检测信号，以检测出样品中低浓度的大肠杆菌O157:H7。
方法1：本发明通过引入“磁聚焦”策略和脂质体升了免疫层析方法的灵敏度，检测限低至10cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的2500倍。本发明为食品体系中致病菌和有毒有害化学组分的快速现场检测指明了新方向。
优选地，在本方法中所述的磁铁的磁场强度为150mT-500mT。金磁纳米颗粒（Fe3O4@AuNPs）直径为30-100nm。
方法2：
本发明通过引入样品富集预处理、“磁聚焦”策略和脂质，大幅提升了免疫层析方法的灵敏度，检测限低至1cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的25000倍。本发明为食品体系中致病菌和有毒有害化学组分的快速现场检测指明了新方向。
优选地，在本方法中所述的磁铁的磁场强度为100mT-500mT。所采用的金磁纳米颗粒（Fe3O4@@AuNPs）直径在30-100nm的范围内。
有益效果
该发明中所使用的金磁纳米颗粒（Fe3O4@Au）既用于在样品预处理步骤中富集大肠杆菌O157:H7，又在随后的免疫层析检测中用于构建信号探针，减少了操作步骤，降低了成本。本发明方法2的试纸条检测限低（1cfu/mL）、特异性好、成本低廉、检测时间短。
通过引入“磁聚焦”策略和包埋信号分子的脂质体，大幅提升了免疫层析试纸条的灵敏度，解决了其灵敏度低的瓶颈问题。本发明方法1的试纸条检测限低（10cfu/mL）。此外，该类型试纸条不需要任何额外设备即可实现对目标物的快速灵敏检测，能够满足现场快速检测的需求，适用于液体样品中致病菌及各种有毒有害物质的检测，极具实用价值。
附图说明
图1 用于新型免疫层析检测的模具；
图2大肠杆菌O157:H7浓度范围为25-105 cfu/mL时基于采集的颜色数据建立的标曲；
图3大肠杆菌O157:H7浓度范围为10-105 cfu/mL时基于采集的颜色数据建立的标曲。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
（1）金磁纳米颗粒的制备及修饰：
（2）脂质体的制备：将300μL 10mg/mL 的L-α-磷脂酰胆碱溶液与80μL 3mg/mL 的结合生物素的磷酸乙醇胺溶液和50μL 4mg/mL 的胆固醇溶液充分搅拌混合，减压蒸馏以除去氯仿。然后，加入100μL 100μg/mL的 HRP溶液涡旋混合2分钟。最后，经14 kDa透析袋透析得到所需的脂质体。
（3）硝基纤维膜的处理：将0.25μg大肠杆菌O157:H7多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水垫,组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测大肠杆菌O157:H7的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；
（5）外加磁场的施加：将其应用于样品中大肠杆菌O157:H7的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为150mT的小磁铁（图1）；
（6）标准曲线的建立：向不含大肠杆菌O157:H7的饮用水溶液中添加菌液，使其浓度分别为25 cfu/mL，102 cfu/mL，103 cfu/mL，104 cfu/mL和105 cfu/mL。将100μL含有致病菌的饮用水溶液与5μL Fe3O4@AuNPs溶液、1μL 1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合，室温下反应10分钟。然后缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子。最后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红）对样品中的大肠杆菌O157:H7含量进行定量，建立标准曲线（图2）。
（7）样品的检测：首先将100μL含有致病菌的样品溶液与5μL Fe3O4@AuNPs溶液、1μL1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合，室温下反应10分钟。然后缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。样品溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子。最后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红），基于已建立的标曲，对样品中的大肠杆菌O157:H7含量进行定量。
对比例1
其他条件不变，去除实施例1中的第（5）步骤中外加磁场的施加：将其应用于样品中大肠杆菌O157:H7的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为150mT的小磁铁。
检测的结果（表1）：
如表1所示，施加磁场的新型免疫层析试纸条检测灵敏度明显优于未施加磁场试纸条。此外，施加磁场的新型免疫层析试纸条的检测结果与传统的平板计数法检测所得结果无显著差异，展示出该新型检测方法的实用性。
实施例2
一种检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括以下步骤：
（1）金磁纳米颗粒的制备及修饰：
（2）脂质体的制备：将300μL 10mg/mL 的L-α-磷脂酰胆碱溶液与80μL 3mg/mL 的结合生物素的磷酸乙醇胺溶液和50μL 4mg/mL 的胆固醇溶液充分搅拌混合，减压蒸馏以除去氯仿。然后，加入100μL上述制备的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液涡旋混合2分钟。最后，经14kDa透析袋透析得到所需的脂质体。
（3）硝基纤维膜的处理：将0.25μg大肠杆菌O157:H7多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水垫,组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测大肠杆菌O157:H7的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；
（5）外加磁场的施加：将其应用于样品中大肠杆菌O157:H7的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为150mT的小磁铁；
（6）标准曲线的建立：向不含大肠杆菌O157:H7的饮用水中添加菌液，使其浓度分别为10 cfu/mL，102 cfu/mL，103 cfu/mL，104 cfu/mL和105 cfu/mL。将10μL修饰大肠杆菌O157:H7抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液加入到饮用水样品溶液中，充分反应30分钟，富集样品中存在的大肠杆菌O157:H7，然后在外加磁场条件下，分离出结合大肠杆菌O157:H7的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在100μL含有0.5%（w/v）酪蛋白的 PBS溶液中。将100 μL经过预处理的PBS溶液与1μL 1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合，室温下反应10分钟。然后缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子。最后，在检测区域加入30μLTMB与H2O2的混合溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红）对样品中的大肠杆菌O157:H7含量进行定量，建立标准曲线（图3）。
（7）样品的检测：首先将10μL修饰大肠杆菌O157:H7抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液加入到饮用水样品溶液中，充分反应30分钟，富集样品中存在的大肠杆菌O157:H7，然后在外加磁场条件下，分离出结合大肠杆菌O157:H7的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在100μL含有0.5%（w/v）酪蛋白的 PBS溶液中。将100 μL PBS溶液与1μL 1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合，室温下反应10分钟。然后缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子。最后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液。反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像。采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像（红），基于已建立的标曲，对样品中的大肠杆菌O157:H7含量进行定量。
对比例2
其他条件不变，去除实施例2中的第（5）外加磁场的施加：将其应用于样品中大肠杆菌O157:H7的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为150mT的小磁铁。
检测的结果（表2）：
如表2所示，施加磁场的新型免疫层析试纸条检测灵敏度明显优于未施加磁场试纸条。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备检测线包被大肠杆菌O157:H7抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；
（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；
（3）金磁纳米颗粒Fe3O4@AuNPs表面修饰大肠杆菌O157:H7抗体，采用反相蒸发法制备负载辣根过氧化物酶（HRP）的脂质体，将样品溶液与Fe3O4@AuNPs溶液、脂质体和亲和素溶液充分混合，室温下反应，然后滴加到试纸条层析后，加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液，最后在试纸条检测区域加入金纳米颗粒溶液，检测大肠杆菌O157:H7含量；
或者将样品富集预处理：将修饰大肠杆菌O157:H7抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液加入到样品溶液中充分反应，富集样品中存在的大肠杆菌O157:H7，然后在外加磁场条件下，分离出结合大肠杆菌O157:H7的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在PBS溶液中；金磁纳米颗粒Fe3O4@AuNPs表面修饰大肠杆菌O157:H7抗体；制备脂质体：采用反相蒸发法制备负载辣根过氧化物酶的脂质体；利用金磁纳米颗粒和脂质体，检测预处理的样品中的大肠杆菌O157:H7含量。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述的磁铁的磁场强度为100mT-500mT。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述的试纸条包括衬板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上，所述硝酸纤维素膜上划有一条检测线和一条质控线；所述检测线包被大肠杆菌O157:H7抗体；所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
4.根据权利要求3所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：
（1）金磁纳米颗粒的制备：合成磁性纳米颗粒Fe3O4，在其表面包被金壳，得到Fe3O4@AuNPs纳米颗粒，在Fe3O4@AuNPs表面修饰大肠杆菌O157:H7抗体；
（2）硝基纤维膜的处理：将大肠杆菌O157:H7抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（3）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测大肠杆菌O157:H7的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
5.根据权利要3所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，大肠杆菌O157:H7单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：首先将100μL含有致病菌的样品溶液与5μL Fe3O4@AuNPs溶液、1μL 1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合，室温下反应10分钟，然后缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min，样品溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，最后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液，反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像，采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像对样品中的大肠杆菌O157:H7含量进行定量。
7.根据权利要求1-5之一所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：首先将100μL样品富集预处理的溶液与5μL Fe3O4@AuNPs溶液、1μL1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合，室温下反应10分钟，然后缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min，样品溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，最后，在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液，反应5分钟后，滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，使用相机拍照，保存图像，采用Image-Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图，选择效果最好的灰度图像对样品中的大肠杆菌O157:H7含量进行定量。
8.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，脂质体直径为30-100nm，Fe3O4@AuNPs直径为30-100nm。
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Address after: 250399 No. 3501 University Road, Changqing District, Jinan City, Shandong Province Patentee after: Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences) Country or region after: China Address before: 250399 No. 3501 University Road, Changqing District, Jinan City, Shandong Province Patentee before: Qilu University of Technology Country or region before: China |