CN108614111A - 一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌o157:h7的免疫层析检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7(E.coli O157:H7)的免疫层析检测方法，以活性染料为染色剂制备彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs，在体系中通过羧基乙基硅烷三醇钠盐将羧基修饰到colored SiNPs表面，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl‑modified colored SiNPs；在carboxyl‑modified colored SiNPs表面固定鼠抗E.coli O157:H7的单克隆标记抗体mAb1制备免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs‑mAb1；将鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2包被至NC膜的检测线，羊抗鼠IgG包被至质控线；用预先混合致病菌样品和colored SiNPs‑mAb1的方法，将生成的复合物一起滴至试纸条的加样孔，在T线与mAb2形成三明治夹心结构，实现对E.coli O157:H7的快速检测。本发明方法具有良好的检测灵敏度和特异性，简单省时，过程环保经济，具有巨大的应用前景。

Description

一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌 O157:H7的免疫层析检测方法
技术领域
本发明涉及免疫层析检测技术，尤其涉及一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法。
背景技术
大肠埃希氏菌O157H7(E.coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic escherichia coli,EHEC)的主要血清型，能够导致腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症和血栓形成的血小板减少性紫癜等病。该菌的流行暴发大多与食用被该菌污染的食物有关，其他污染途径还有饮用水和空气。从1982年发现E.coli O157:H7后，在世界各地陆续有中毒事件发生，对人类的健康造成威胁。因此，建立快速、简单、特异性强的检测方法对于E.coli O157:H7的防控具有重要意义。
根据GB/T 4789.36-2016，对E.coli O157:H7的检验方法主要有两种。国标法具有准确的检测结果，但其中的常规培养法和免疫磁珠捕获法其步骤都包括增菌、分离和检验，过程繁琐，耗时长。近年来，多种快速检测技术均有研究报道，如PCR技术、基因芯片技术、电化学免疫传感器、荧光免疫技术和ELISA等各有其优点和不足，研究更便捷的新型检测方法是发展趋势，比如免疫层析技术。
胶体金免疫层析技术现已广泛应用于多种检测领域，是一种适用于现场初筛的常用方法。在基于纳米材料的免疫层析技术中，信号放大，即降低检出限是关键技术环节，直接影响检测效果。因此，随着纳米材料制备技术的发展，免疫层析技术领域出现了乳胶颗粒、荧光二氧化硅微球、量子点、碳纳米材料、磁性微球、上转换纳米颗粒、脂质体和酶等纳米标记物，以及直接以荧光素作为标记物对E.coli O157:H7进行快速检测。荧光纳米材料需要特殊仪器，而脂质体和酶等信号标记物价格昂贵，这些缺陷限制了它们在快速检测中的广泛应用。目前为止，最常用的标记物仍然是AuNPs，但AuNPs易受酸碱、温度和盐浓度的影响，且颜色单一，限制了其在多重检测中的应用；此外，AuNPs颗粒与生物大分子的结合过程在液相中稳定性较差，容易出现聚集。因此，筛选出一种耐各种环境、颜色丰富，能用于多重检测的纳米标记物对于免疫层析技术的发展具有一定推动作用。
基于前期研究中用新方法合成得到的颜色丰富且鲜艳、稳定性和分散性好的彩色二氧化硅纳米微球(colored SiNPs)，尝试将其作为一类免疫层析纳米标记物，构建一种新型免疫层析双抗体夹心法检测技术，实现对食源性致病菌E.coli O157:H7的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备彩色二氧化硅纳米微球：在水溶液中加入二氧化硅纳米微球、有机染料和硅烷偶联剂，通过硅烷偶联剂将有机染料一步反应连接到二氧化硅纳米微球上，制得彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs；
(2)在体系中通过羧基乙基硅烷三醇钠盐将羧基修饰到彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs的表面，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modifiedcolored SiNPs；
(3)在羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNP表面进行抗体偶联：通过碳二亚胺化学法在羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNP表面固定鼠抗E.coli O157:H7单克隆标记抗体mAb1，制备免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1；
(4)免疫层析试纸条的组装：试纸条由样品垫、释放垫、NC膜、吸水纸组成，将鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2喷涂于NC膜的检测线，将羊抗鼠IgG喷涂于质控线，将喷好的NC膜贴于PVC底板，依次将吸水纸、释放垫和样品垫组装至PVC底板，完成试纸条的组装；
(5)将待测样品和步骤(3)制备的免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1混合后滴至试纸条的加样孔，在检测线与mAb2形成三明治夹心结构，实现对E.coliO157:H7的快速检测。
进一步地，所述步骤(2)具体为：
取25mL烧杯，分别取10mL乙醇、815μL纯水、100μL氨水、200μLTEOS，形成体系于磁力搅拌状态下预水解30min；
取2.5mL浓度为1mg/mL的彩色二氧化硅纳米微球，倒入预水解好的体系中；反应12h后，直接在上述体系中加入25μL羧基乙基硅烷三醇钠盐25wt.％的水溶液(Carboxyethylsilanetriol sodium salt 25wt％in water，CES)，继续反应24h；
反应结束后，通过离心、乙醇和水洗涤数次，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNPs，保存于纯水中备用。
进一步地，所述步骤(3)具体为：
取羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球分散至1mL浓度为50mM、pH 6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES)中，离心洗涤1次后重悬至1mLMES；
称量1mg EDC和1.5mg NHS加入羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球的MES悬浮液，室温活化15min；
反应结束后用PB(PB，Phosphate Buffer)洗涤2次，重悬至1mL PB中，加入30μg鼠抗E.coli O157单克隆标记抗体mAb1，室温下摇床孵育2.5h；孵育结束后，离心并分散至含2％BSA的PB溶液中，放在4℃冰箱中孵育12小时，封闭未反应完的位点，离心后重悬至含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS中，4℃冰箱保存备用。
进一步地，所述步骤(4)中，试纸条的样品垫和释放垫均由玻璃纤维膜构成，将玻璃纤维膜置于处理液浸泡30min后取出，37℃鼓风干燥箱过夜干燥，置于自封袋加干燥剂保存备用；所述处理液为含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA、0.5％吐温-20、1％PVP的0.01M的PBS；
将1.2mg/mL的鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2喷涂于NC膜的检测线(T线)，将1.0mg/mL的羊抗鼠IgG喷涂于NC膜的质控线(C线)，喷涂速度均为1μL/cm；将喷好的NC膜贴于PVC底板，依次将吸水纸、释放垫和样品垫组装至PVC底板，切成4mm宽的试纸条，将试纸条组装在塑料卡槽内，置于锡箔袋加干燥剂，室温密封保存备用。
进一步地，所述步骤(5)中，取35μL待测样品与35μL洗液于96板孔等体积混合，加入10μL免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1搅拌均匀，所述洗液为含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS；将上述混合物一起滴至试纸条的样品孔内，反应15min之后观察并记录结果。
本发明的有益效果是：本发明方法基于彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs为标记物。以活性染料为染色剂制备colored SiNPs，在体系中通过羧基乙基硅烷三醇钠盐将羧基修饰到colored SiNPs的表面，得到得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNPs；通过碳二亚胺化学法在carboxyl-modified coloredSiNPs表面固定鼠抗E.coli O157:H7的单克隆标记抗体mAb1制备免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1；将鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2包被至硝酸纤维素膜(NC膜)的检测线(T线)，羊抗鼠IgG包被至质控线(C线)；用预先混合致病菌样品和colored SiNPs-mAb1的方法，将生成的复合物一起滴至试纸条的加样孔，在T线与mAb2形成三明治夹心结构，实现对E.coli O157:H7的快速检测。本发明检测方法具有良好的检测灵敏度和特异性，简单省时，过程环保经济，在E.coli O157:H7检测领域有着巨大的应用前景。
附图说明
图1中(A)为抗体修饰core-shell red SiNPs的制备步骤；(B)为基于core-shellred SiNPs的免疫层析双抗体夹心法检测E.coli O157:H7原理图；
图2中(a)为core-shell red SiNPs扫描电镜图；(b)为core-shell red SiNPs-mAb1扫描电镜图，(c)为core-shell red SiNPs和core-shell red SiNPs-mAb1的粒径分布曲线；
图3为Core-shell red SiNPs-ICA的灵敏度检测图；
图4为Core-shell red SiNPs-ICA对牛奶(a)和猪肉(b)两种样品中E.coli O157:H7的检测图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
本发明提供的一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备彩色二氧化硅纳米微球：在水溶液中加入二氧化硅纳米微球、有机染料和硅烷偶联剂，通过硅烷偶联剂将有机染料一步反应连接到二氧化硅纳米微球上，制得彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs；
(2)在体系中通过羧基乙基硅烷三醇钠盐将羧基修饰到彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs的表面，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modifiedcolored SiNPs；
(3)在羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNP表面进行抗体偶联：通过碳二亚胺化学法在羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNP表面固定鼠抗E.coli O157:H7单克隆标记抗体mAb1，制备免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1；
(4)免疫层析试纸条的组装：试纸条由样品垫、释放垫、NC膜、吸水纸组成，将鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2喷涂于NC膜的检测线，将羊抗鼠IgG喷涂于质控线，将喷好的NC膜贴于PVC底板，依次将吸水纸、释放垫和样品垫组装至PVC底板，完成试纸条的组装；
(5)将待测样品和步骤(3)制备的免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1混合后滴至试纸条的加样孔，在检测线与mAb2形成三明治夹心结构，实现对E.coliO157:H7的快速检测。
进一步地，所述步骤(1)中：
优选的加入顺序为：首先将二氧化硅纳米微球分散在水溶液中，其次将硅烷偶联剂加入到二氧化硅和水的混合液中，最后加入有机染料水溶液，反应时间为0.5～5h。
所述二氧化硅纳米微球和水的质量比为1：(10～1000)，二氧化硅纳米微球、有机染料和硅烷偶联剂的质量比为1：(0.0001～5)：(0.005～2)。
上述比例最优范围是二氧化硅纳米微球和水的质量比为1:(100～500)，二氧化硅纳米微球、有机染料和硅烷偶联剂的质量比为1：(0.001～0.5)：(0.05～1)。
在彩色二氧化硅纳米微球表面包覆二氧化硅壳，制得壳层保护的彩色二氧化硅纳米微球，包覆方法具体为：乙醇、水、氨水、TEOS按比例混合，形成均匀体系混合液，反应20～40min，再加入体积为混合液总体积的1/6～1/3的由彩色二氧化硅纳米微球和乙醇组成的混合悬浊液，反应8～24h，结束后离心、清洗，完成包覆；所述混合液中，乙醇作为溶剂，水、氨水和TEOS作为反应试剂，乙醇：水：氨水：TEOS体积比为(8～11)：1：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)，所述混合悬浊液中彩色二氧化硅纳米微球和乙醇的质量体积比为1g：25～250mL。
所述有机染料选自酸性染料、直接染料、活性染料、中性染料、还原染料中的一种或多种。所述硅烷偶联剂选自所述硅烷偶联剂选自APTES、2APTMS、3APTMS中的一种或多种。
进一步地，所述步骤(2)具体为：
取25mL烧杯，分别取10mL乙醇、815μL纯水、100μL氨水、200μLTEOS，形成体系于磁力搅拌状态下预水解30min；
取2.5mL浓度为1mg/mL的彩色二氧化硅纳米微球，倒入预水解好的体系中；反应12h后，直接在上述体系中加入25μL羧基乙基硅烷三醇钠盐25wt.％的水溶液(Carboxyethylsilanetriol sodium salt 25wt％in water，CES)，继续反应24h；
反应结束后，通过离心、乙醇和水洗涤数次，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNPs，保存于纯水中备用。
进一步地，所述步骤(3)具体为：
取羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球分散至1mL浓度为50mM、pH 6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES)中，离心洗涤1次后重悬至1mLMES；
称量1mg EDC和1.5mg NHS加入羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球的MES悬浮液，室温活化15min；
反应结束后用PB(PB，Phosphate Buffer)洗涤2次，重悬至1mL PB中，加入30μg鼠抗E.coli O157单克隆标记抗体mAb1，室温下摇床孵育2.5h；孵育结束后，离心并分散至含2％BSA的PB溶液中，放在4℃冰箱中孵育12小时，封闭未反应完的位点，离心后重悬至含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS中，4℃冰箱保存备用。
进一步地，所述步骤(4)中，试纸条的样品垫和释放垫均由玻璃纤维膜构成，将玻璃纤维膜置于处理液浸泡30min后取出，37℃鼓风干燥箱过夜干燥，置于自封袋加干燥剂保存备用；所述处理液为含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA、0.5％吐温-20、1％PVP的0.01M的PBS；
将1.2mg/mL的鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2喷涂于NC膜的检测线(T线)，将1.0mg/mL的羊抗鼠IgG喷涂于NC膜的质控线(C线)，喷涂速度均为1μL/cm；将喷好的NC膜贴于PVC底板，依次将吸水纸、释放垫和样品垫组装至PVC底板，切成4mm宽的试纸条，将试纸条组装在塑料卡槽内，置于锡箔袋加干燥剂，室温密封保存备用。
进一步地，所述步骤(5)中，取35μL待测样品与35μL洗液于96板孔等体积混合，加入10μL免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1搅拌均匀，所述洗液为含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS；将上述混合物一起滴至试纸条的样品孔内，反应15min之后观察并记录结果。
以下实施例提供了一种以红色二氧化硅纳米微球core-shell red SiNPs作为标记物的E.coli O157:H7免疫层析检测方法，此方法可用于牛奶和猪肉等实际样品中E.coliO157:H7的快速检测。
1.Core-shell red SiNPs表面羧基修饰
取25mL烧杯，分别取10mL乙醇、815μL纯水、100μL氨水、200μL TEOS，形成体系于磁力搅拌状态下预水解30min。取2.5mL红色二氧化硅纳米微球(1mg/mL)，倒入预水解好的反应体系中。反应12h后，直接在上述体系中加入25μL羧基乙基硅烷三醇钠盐，wt25％.水溶液(Carboxyethylsilanetriol sodium salt 25wt％in water，CES)，继续反应24h。反应结束后，通过离心、乙醇和水洗涤数次，得到羧基改性的core-shell redSiNPs(carboxyl-modified core-shell red SiNPs)，保存于纯水中备用。
2.在羧基改性的Core-shell red SiNPs表面进行抗体偶联，制备core-shell redSiNPs-mAb1
取1mg羧基改性的core-shell red SiNPs分散至1mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES)(50mM,pH 6.0)，离心洗涤1次后重悬至1mL MES。称量1mg EDC和1.5mg NHS加入羧基改性的core-shell red SiNPs的MES悬浮液，室温活化15min。反应结束后用PB(PB，Phosphate Buffer)洗涤2次，重悬至PB中，加入鼠抗E.coliO157单克隆标记抗体(mAb1)30μg，室温下摇床孵育2.5h。孵育结束后，离心并分散至含2％BSA的PB溶液中，封闭未反应完的位点，离心后重悬至含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS中，4℃冰箱保存备用。
3.Core-shell red SiNPs免疫层析试纸条的组装
本方法中的试纸条主要由4部分组成：样品垫、释放垫、NC膜、吸水纸，其中释放垫替代了普通试纸条中的结合垫。样品垫和释放垫均由玻璃纤维膜构成，将玻璃纤维膜置于处理液(0.01M PBS，含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA、0.5％吐温-20、1％PVP)浸泡30min后取出，37℃鼓风干燥箱过夜干燥，置于自封袋干燥剂保存备用。将鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体(mAb2，1.2mg/mL)喷涂于NC膜的检测线(T线)，将羊抗鼠IgG(1.0mg/mL)喷涂于质控线(C线)，喷涂速度均为1μL/cm。将喷好的NC膜贴于PVC底板，依次将吸水垫、释放垫和样品垫组装至PVC底板，切成4mm宽的试纸条，将试纸条组装在塑料卡槽内，置于锡箔袋加干燥剂，室温密封保存备用。
4.检测过程
洗液配方为含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS。取35μL待测样品与35μL洗液于96板孔等体积混合，加入10μL core-shell red SiNPs-mAb1搅拌均匀。然后将上述混合物一起滴至试纸条的样品孔内，反应15min之后观察并记录结果，每个浓度至少检测3次。
在优化条件下，对PBS中E.coli O157:H7的检测灵敏度为4.5×105CFU/mL，对鲜奶和猪肉等加标样品中E.coli O157:H7的检测灵敏度均为4.5×106CFU/mL；用该方法检测另外6种细菌，通过肉眼观测无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。
图1中(A)为抗体修饰core-shell red SiNPs的制备步骤；(B)为基于core-shellred SiNPs的免疫层析双抗体夹心法检测E.coli O157:H7原理图；
图2中(a)为core-shell red SiNPs扫描电镜图；(b)为core-shell red SiNPs-mAb1扫描电镜图，(c)为core-shell red SiNPs和core-shell red SiNPs-mAb1的粒径分布曲线(插图：core-shell red SiNPs(上)和core-shell red SiNPs-mAb1(下)免疫层析C线捕获检测结果)；
图3为Core-shell red SiNPs-ICA的灵敏度检测，从左到右所检测E.coli O157:H7的浓度分别为：4.5×108CFU/mL，4.5×107CFU/mL，4.5×106CFU/mL，4.5×105CFU/mL，4.5×104CFU/mL，4.5×103CFU/mL，4.5×100CFU/mL；
图4为Core-shell red SiNPs-ICA对牛奶(a)和猪肉(b)两种样品中E.coli O157:H7的检测，从左到右所检测E.coli O157:H7的浓度分别为：4.5×108CFU/mL，4.5×107CFU/mL，4.5×106CFU/mL，4.5×105CFU/mL，4.5×104CFU/mL，PBS为阴性对照。
从图中可以看出，本发明检测方法具有良好的检测灵敏度和特异性。

Claims (5)

1.一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，其特征在于，该方法包括：
(1)制备彩色二氧化硅纳米微球：在水溶液中加入二氧化硅纳米微球、有机染料和硅烷偶联剂，通过硅烷偶联剂将有机染料一步反应连接到二氧化硅纳米微球上，制得彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs；
(2)在体系中通过羧基乙基硅烷三醇钠盐将羧基修饰到彩色二氧化硅纳米微球colored SiNPs的表面，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modifiedcolored SiNPs；
(3)在羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNP表面进行抗体偶联：通过碳二亚胺化学法在羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modifiedcolored SiNP表面固定鼠抗E.coli O157:H7单克隆标记抗体mAb1，制备免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1；
(4)免疫层析试纸条的组装：试纸条由样品垫、释放垫、NC膜、吸水纸组成，将鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2喷涂于NC膜的检测线，将羊抗鼠IgG喷涂于质控线，将喷好的NC膜贴于PVC底板，依次将吸水纸、释放垫和样品垫组装至PVC底板，完成试纸条的组装；
(5)将待测样品和步骤(3)制备的免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1混合后滴至试纸条的加样孔，在检测线与mAb2形成三明治夹心结构，实现对大肠埃希氏菌O157:H7的快速检测。
2.根据权利要求1所述的一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：
取25mL烧杯，分别取10mL乙醇、815μL纯水、100μL氨水、200μLTEOS，形成体系于磁力搅拌状态下预水解30min；
取2.5mL浓度为1mg/mL的彩色二氧化硅纳米微球，倒入预水解好的体系中；反应12h后，直接在上述体系中加入25μL羧基乙基硅烷三醇钠盐25wt.％的水溶液(Carboxyethylsilanetriol sodium salt 25wt％in water，CES)，继续反应24h；
反应结束后，通过离心、乙醇和水洗涤数次，得到羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球carboxyl-modified colored SiNPs，保存于纯水中备用。
3.根据权利要求1所述的一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：
取羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球分散至1mL浓度为50mM、pH 6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES)中，离心洗涤1次后重悬至1mL MES；
称量1mg EDC和1.5mg NHS加入羧基改性的彩色二氧化硅纳米微球的MES悬浮液，室温活化15min；
反应结束后用PB洗涤2次，重悬至1mL PB中，加入30μg鼠抗E.coli O157单克隆标记抗体mAb1，室温下摇床孵育2.5h；孵育结束后，离心并分散至含2％BSA的PB溶液中，放在4℃冰箱中孵育12小时，封闭未反应完的位点，离心后重悬至含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS中，4℃冰箱保存备用。
4.根据权利要求1所述的一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中，试纸条的样品垫和释放垫均由玻璃纤维膜构成，将玻璃纤维膜置于处理液浸泡30min后取出，37℃鼓风干燥箱过夜干燥，置于自封袋加干燥剂保存备用；所述处理液为含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA、0.5％吐温-20、1％PVP的0.01M的PBS；
将1.2mg/mL的鼠抗E.coli O157:H7单克隆捕获抗体mAb2喷涂于NC膜的检测线，将1.0mg/mL的羊抗鼠IgG喷涂于NC膜的质控线，喷涂速度均为1μL/cm；将喷好的NC膜贴于PVC底板，依次将吸水纸、释放垫和样品垫组装至PVC底板，切成4mm宽的试纸条，将试纸条组装在塑料卡槽内，置于锡箔袋加干燥剂，室温密封保存备用。
5.根据权利要求1所述的一种彩色二氧化硅纳米微球作为标记物的大肠埃希氏菌O157:H7的免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中，取35μL待测样品与35μL洗液于96板孔等体积混合，加入10μL免疫核壳型二氧化硅纳米颗粒colored SiNPs-mAb1搅拌均匀，所述洗液为含3％蔗糖、1％海藻糖、1％BSA的PBS；将上述混合物一起滴至试纸条的样品孔内，反应15min之后观察并记录结果。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109324181A (zh) * 2018-10-22 2019-02-12 河北特温特生物科技发展有限公司 一种免疫层析用封闭剂组合物、用途、及免疫层析试剂盒的制备方法
CN112462054A (zh) * 2019-09-06 2021-03-09 齐鲁工业大学 一种定量检测大肠杆菌o157:h7的方法
CN113013019A (zh) * 2021-02-03 2021-06-22 沈发明 一种硅片表面基化处理方法
CN113238047A (zh) * 2021-05-10 2021-08-10 深圳市光明区疾病预防控制中心 一种快速检测大肠杆菌o157:h7的石墨烯量子点免疫层析试纸条
CN113801646A (zh) * 2020-06-15 2021-12-17 中国石油天然气股份有限公司 酸性气体驱自适应增稠纳米颗粒及其制备方法与应用
CN114632434A (zh) * 2022-03-21 2022-06-17 哈尔滨工业大学 一种纳米SiO2粉体-糖溶液的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101464464A (zh) * 2008-02-29 2009-06-24 无锡中德伯尔生物技术有限公司 检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法
CN104058414A (zh) * 2013-03-18 2014-09-24 窦文超 彩色二氧化硅微球
CN104422760A (zh) * 2013-09-05 2015-03-18 窦文超 免疫彩色二氧化硅微球
CN105137060A (zh) * 2015-08-12 2015-12-09 杨磊 免疫彩色二氧化硅微球的制备方法、彩色试纸及制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101464464A (zh) * 2008-02-29 2009-06-24 无锡中德伯尔生物技术有限公司 检测食源性致病微生物的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法
CN104058414A (zh) * 2013-03-18 2014-09-24 窦文超 彩色二氧化硅微球
CN104422760A (zh) * 2013-09-05 2015-03-18 窦文超 免疫彩色二氧化硅微球
CN105137060A (zh) * 2015-08-12 2015-12-09 杨磊 免疫彩色二氧化硅微球的制备方法、彩色试纸及制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNJIE ZHU ET AL: "Immunochromatographic assay using brightly colored silica nanoparticles as visible label for point-of-care detection of clenbuterol", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109324181A (zh) * 2018-10-22 2019-02-12 河北特温特生物科技发展有限公司 一种免疫层析用封闭剂组合物、用途、及免疫层析试剂盒的制备方法
CN109324181B (zh) * 2018-10-22 2021-10-08 河北特温特生物科技发展有限公司 一种免疫层析用封闭剂组合物、用途、及免疫层析试剂盒的制备方法
CN112462054A (zh) * 2019-09-06 2021-03-09 齐鲁工业大学 一种定量检测大肠杆菌o157:h7的方法
CN112462054B (zh) * 2019-09-06 2023-06-23 齐鲁工业大学 一种定量检测大肠杆菌o157:h7的方法
CN113801646A (zh) * 2020-06-15 2021-12-17 中国石油天然气股份有限公司 酸性气体驱自适应增稠纳米颗粒及其制备方法与应用
CN113801646B (zh) * 2020-06-15 2023-01-10 中国石油天然气股份有限公司 酸性气体驱自适应增稠纳米颗粒及其制备方法与应用
CN113013019A (zh) * 2021-02-03 2021-06-22 沈发明 一种硅片表面基化处理方法
CN113238047A (zh) * 2021-05-10 2021-08-10 深圳市光明区疾病预防控制中心 一种快速检测大肠杆菌o157:h7的石墨烯量子点免疫层析试纸条
CN114632434A (zh) * 2022-03-21 2022-06-17 哈尔滨工业大学 一种纳米SiO2粉体-糖溶液的制备方法
CN114632434B (zh) * 2022-03-21 2023-01-24 哈尔滨工业大学 一种纳米SiO2粉体-糖溶液的制备方法

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