CN114479090A - 一种氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氟化聚乙二醇‑聚乙烯亚胺化合物及其制备方法和应用。该化合物由一端为氨基且另一端为羧基的聚乙二醇衍生物（即氨基‑聚乙二醇‑羧基）为桥连，其氨基端与七氟丁酰基偶联，羧基端与聚乙烯亚胺偶联得到。本发明所述的氟化聚乙二醇‑聚乙烯亚胺化合物细胞毒性低，采用氟化聚乙二醇‑聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒作为核酸转染载体，细胞摄取效率显著提高，并且在磁场作用下转染效率可进一步提高。

Description

一种氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体为一种氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗是一种将外源性核酸导入目的细胞并发挥其生物学效应从而达到治疗目的的方法，为治疗遗传性的先天疾病和后天获得性疾病提供了一条新途径。在恶性肿瘤、家族性遗传病和心血管疾病等疾病的治疗方面，相比于传统疗法，基因治疗有望从根源上修正引起疾病的异常基因。基因治疗的研究和应用中，普遍采用的核酸分子有如：质粒、信使RNA(mRNA)、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)和双链RNA(dsRNA)等。其中，小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)主要参与RNA干扰现象，可以用于调节基因的表达。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是在真核生物中普遍存在的一种生物学现象，在进化过程中高度保守。具体是指由双链RNA(例如miRNA、piRNA或siRNA等)介导的，在特定酶参与下，mRNA发生高效特异性降解，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象。正确运用RNAi技术可以特异性降低甚至关闭靶基因表达，这一特点使得该技术在生物医药领域被广泛应用，特别是其中有大量成果已经用于临床前研究或临床试验，并已有少量产品进入临床应用。

但是，外源性核酸难以直接被靶细胞摄取，需要依靠核酸递送载体完成细胞转染后才能发挥生物学效应，因此制备出能够携带功能核酸片段的载体，是转染技术应用的关键环节。核酸载体主要分为病毒载体以及非病毒载体。病毒载体主要包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等，优点在于转染效率较高，但具有较高的免疫原性、核酸装载能力比较有限、大批量制备困难还有价格偏高等缺点，且存在较大的生物安全风险。非病毒载体具有成本低廉、制备简单、可修饰位点多等优点，但其缺点主要是转染效率较低、具有较高的细胞毒性等。目前已有许多商品化的非病毒载体，例如聚乙烯亚胺、Lipo2000、Lipo3000等。其中，聚乙烯亚胺(PEI)是现有技术常用的阳离子转染载体，分为直链型和支链型，可以与核酸分子自组装形成纳米颗粒，具有转染效率较高，含较多伯氨基可进一步化学修饰等优点；但由于PEI分子具有高正电性，在转染过程中易引发强烈的细胞毒性，生物相容性仍不理想。

为了解决聚乙烯亚胺的生物相容性问题，现有技术普遍采用聚乙二醇对其进行化学修饰。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)具有水溶性、柔顺性、无毒、免疫原性低和生物可降解等优点，在生物医学材料、药物领域有着广泛应用。纳米颗粒表面的PEG可以提供较大的空间位阻，提高纳米颗粒在生理环境下的稳定性，同时降低单核巨噬细胞系统的识别和摄取，延长纳米颗粒的体内循环时间。但是，现有技术表明，纳米颗粒的PEG化(PEGylation)产生了相应的缺点，例如PEG分子链的空间位阻作用抑制靶细胞对纳米颗粒的摄取，尤其是PEG修饰密度越高，细胞摄取率越低；再者，PEG化纳米载体被细胞摄取后的“内含体逃逸”(Endosomal escape)效率有所降低，导致其负载的核酸或蛋白类分子难以发挥生物学效应，这一系列负面作用被称为“PEG困境”。

现有技术中已有一些技术方法用于解决“PEG困境”。例如，可以利用腙键、席夫碱键或者二硫键等化学键连接PEG和纳米颗粒，在一定的环境下使得PEG可从纳米颗粒表面脱离，但无论是可断裂还是不可断裂的PEG修饰，仍会影响纳米颗粒的细胞摄取效率，且可断裂化学键能否如预期一样在有效的时间内、一定条件下使纳米颗粒脱PEG化依旧是技术上的难题。利用多肽或者抗体修饰在PEG化纳米颗粒表面可以利用受体介导的内吞作用提高细胞对纳米颗粒的摄取效率，还可以具备靶向性，但是可能存在脱靶效应，且多肽或抗体成本高昂，保存条件较为严苛，大规模应用仍存在困难。当下，如何解决“PEG困境”仍是前沿的研究重点。

现有技术中，含氟药物在市售药物中占有相当比例。引入氟原子或含氟基团的优势在于，可以调节药物的理化特性，提高药物的生物利用度，增强配体与靶标的相互结合能力，或者通过阻断易代谢位点进而提高药物代谢稳定性等。单氟原子取代基通常表现为弱疏水性，而当碳原子上有两个氟原子取代时，由于加和作用，则呈现出强疏水性。特别的，引入氟原子或含氟基团后可增强药物分子的亲脂性，使得含氟化合物在生物体内对膜、组织的穿透能力增加，从而提高了含氟化合物在生物体内的吸收和递送效率。

现有技术表明，磁性纳米颗粒可广泛应用于生物医药领域，例如：核酸提取、细胞分离、磁共振成像等。现有技术中，已有利用聚乙烯亚胺、聚赖氨酸等阳离子聚合物包覆磁性纳米颗粒构建磁性核酸载体的报道，这类磁性核酸载体相比单独的阳离子聚合物，其核酸递送效率显著提高。但是氟化的阳离子聚合物能否结合磁性纳米颗粒用于构建在生理环境下稳定的核酸载体仍不明确。此外，现有技术表明，纳米颗粒在组织穿透、细胞摄取以及代谢等方面有别于传统的药物分子，对磁性核酸载体表面结合的高分子聚合物进行氟化修饰能否提高载体细胞摄取效率或核酸递送效率目前尚不明确。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题在于提供了一种新型阳离子聚合物并利用该聚合物制备磁性核酸转染载体，具体是利用氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆四氧化三铁磁性纳米颗粒构建新型核酸纳米载体，用于核酸转染。这种阳离子聚合物的细胞毒性较低，生物相容性较好，并且该聚合物结合磁性纳米颗粒构建的载体易于被细胞摄取，还具备磁响应性，可利用磁场进一步提高核酸的转染效率。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺化合物，所述氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺化合物采用七氟丁酸酐与氨基-聚乙二醇-羧基反应制备氟化聚乙二醇-羧基，再与聚乙烯亚胺通过酰胺键连接得到。

该氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺化合物以一端为氨基且另一端为羧基的聚乙二醇衍生物为桥连，氨基端化学连接七氟丁酰基，羧基端化学连接聚乙烯亚胺。具体为采用七氟丁酸酐(分子式：C₈O₃F₁₄)与氨基-聚乙二醇-羧基(分子式：NH₂-PEG-COOH)为原料，利用七氟丁酸酐与氨基反应制备氟化聚乙二醇-羧基，再与聚乙烯亚胺通过酰胺键连接，得到氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺(F-PEG-PEI)。

本发明还提供了所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备方法，包括以下步骤：

(1)将七氟丁酸酐和氨基-聚乙二醇-羧基混溶于甲醇中，在催化剂存在的条件下进行化学反应，得到氟化聚乙二醇-羧基；

(2)将氟化聚乙二醇-羧基溶于水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺用于活化羧基反应得到混合溶液；

(3)反应结束后将上述混合溶液逐滴加入与氟化聚乙二醇-羧基等摩尔量的聚乙烯亚胺水溶液中，偶联得到氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺。

其中，所述七氟丁酸酐∶氨基-聚乙二醇-羧基＝1∶2～2∶1，反应条件为室温下搅拌反应24-72小时，透析纯化的方法为纯水透析3～6天，截留分子量为800～1000，过滤纯化的方法为孔径220～450nm滤膜过滤。

其中，所述氟化聚乙二醇-羧基与聚乙烯亚胺的摩尔比为1∶1～5∶1，反应条件为室温下搅拌反应12～48小时，透析纯化的方法为纯水透析3～6天，截留分子量为5000～8000，过滤纯化的方法为孔径220～450nm滤膜过滤。

其中，作为优选地，所述氨基-聚乙二醇-羧基中的聚乙二醇的平均分子量为2000～5000，最优为2000。

其中，作为优选地，聚乙烯亚胺的平均分子量为10000～25000，最优为25000。

本发明内容还包括含有所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的核酸递送载体。

其中，所述核酸递送载体为氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒。

本发明利用上述方法制备得到的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺(F-PEG-PEI)与二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒(DMSA@MNP)结合，得到氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒(F-PEG-PEI@MNP)。

本发明还提供了所述的核酸递送载体的制备方法，包括以下步骤：取二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒与氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺溶于水中，反应条件为室温下超声振荡搅拌反应，反应结束后将产物超滤纯化3～6次，超滤管截留分子量为100k～300k。

其中，所述四氧化三铁磁性纳米颗粒中的Fe和氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的质量比为1∶2～1∶10。

本发明还提供了所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺、所述的核酸递送系统在制备基因治疗药物中的应用。

优选的，先将七氟丁酸酐与氨基-聚乙二醇-羧基溶于甲醇中，投料摩尔比为七氟丁酸酐∶氨基-聚乙二醇-羧基＝1∶2，再向混合溶液中加入三乙胺催化，于室温下发生取代反应，得到氟化聚乙二醇-羧基，反应时间为24～72小时，最优为48小时。

优选的，七氟丁酸酐与氨基-聚乙二醇-羧基的投料摩尔比为1∶2。

优选的，所述氟化聚乙二醇-羧基的纯化方法为透析、过滤、干燥，其中透析方法为纯水透析3～6天，透析截留分子量为1000，过滤方法为孔径220～450nm滤膜过滤，干燥方法为真空干燥或冷冻干燥。

优选的，所述氟化聚乙二醇-羧基与聚乙烯亚胺的摩尔比例为1∶1。

优选的，所述氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的纯化方法为透析、过滤、干燥，其中透析方法为纯水透析3～6天，透析截留分子量为5000～8000，过滤方法为孔径220～450nm滤膜过滤，干燥方法为真空干燥或冷冻干燥。

本发明还提供了利用上述氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺结合的磁性纳米颗粒转染siRNA进入细胞的方法。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

(1)本发明提供的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物，相比现有技术的支链聚乙烯亚胺和甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺，细胞毒性显著降低。

(2)本发明提供的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒，在生理环境下具有良好的稳定性。

(3)本发明提供的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒，细胞摄取效率显著高于现有技术甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒，即本发明提供的技术方案可以有效解决现有技术中纳米颗粒表面的聚乙二醇导致细胞摄取率低的弊端。

(4)利用本发明提供的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒所具备的磁响应性，可以显著高效地转染核酸进入细胞。

附图说明

图1是氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备流程示意图与分子结构图。

图2是聚合物的红外光谱图；(a)氨基-聚乙二醇-羧基(NH₂-PEG-COOH)；(b)氟化聚乙二醇-羧基(F-PEG-COOH)；(c)氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺(F-PEG-PEI)。

图3是¹⁹FNMR谱图：(a)氟化聚乙二醇-羧基；(b)氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺。

图4(a)氟化聚乙二醇-羧基的EDS谱图及部分元素含量统计表；(b)是二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒透射电镜图；(c)是氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺结合的四氧化三铁磁性纳米颗粒(F-PEG-PEI@MNP)透射电镜图；(d)F-PEG-PEI@MNP中氟元素的面分布；(e)F-PEG-PEI@MNP中铁元素的面分布。

图5(a)是二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒(DMSA@MNP)与氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的四氧化三铁磁性纳米颗粒(F-PEG-PEI@MNP)的水动力尺寸测试结果；(b)是DMSA@MNP与F-PEG-PEI@MNP的ζ电位测试结果；(c)是四种阳离子聚合物包覆的四氧化三铁在水或模拟体液中的粒径变化。

图6是对PEI、mPEG-PEI、F-PEG-PEI三种阳离子聚合物的CCK8法细胞毒性测试结果，直方图下方表格为所对应的数值。

图7(a)是共聚焦显微镜观察Hela细胞摄取绿色荧光标记的F-PEG-PEI@MNP结果；(b)是共聚焦显微镜观察Hela细胞摄取绿色荧光标记的甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺结合的四氧化三铁磁性纳米颗粒(mPEG-PEI@MNP)；(c)是对上述两组共聚焦显微镜拍摄图片的绿色荧光进行定量。

图8为流式细胞术分别检测F-PEG-PEI@MNP与Lipo3000转染Hela细胞的效率，转染采用的siRNA为绿色荧光标记的siRNA阴性对照(FAM-siRNANC)。

具体实施方式

以下结合实施例及附图对本发明进行详细的描述，但不限于实施例公开的内容。

实施例1氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备

采用的原料为市售分析纯七氟丁酸酐、甲醇与市售聚乙二醇的衍生物氨基-聚乙二醇-羧基，分子量25000的聚乙烯亚胺采购自Sigma公司。

称取七氟丁酸酐与氨基-聚乙二醇-羧基(聚乙二醇的平均分子量为2000)溶于10ml甲醇中，投料摩尔比为七氟丁酸酐∶氨基-聚乙二醇-羧基＝100μmol∶200μmol，再向混合溶液中加入100μl三乙胺催化，于室温下反应48小时，之后将反应溶液纯水透析3～6天，透析截留分子量为1000。透析结束后采用孔径220nm滤膜过滤1次，干燥方法为真空干燥48小时。产物通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、¹⁹F核磁共振谱、扫描电子显微镜能谱仪进行分析。

如图2(a)与图2(b)所示红外光谱图，谱图(b)中1656.4cm^-1处的吸收峰相比谱图(a)增强；谱图(b)1656.4cm^-1处的吸收峰归属于酰胺-C＝O伸缩振动，谱图(a)1651.3cm^-1处的较弱吸收峰归属于NH₂面内弯曲振动。

如图3(a)所示核磁共振谱，谱峰δ₁＝-121.72ppm归属于与七氟丁酰基上的α碳原子相连的氟原子，δ₂＝-128.35ppm归属于与β碳原子相连的氟原子，δ₃＝-82.18ppm归属于与γ碳原子相连的氟原子。

如图4(a)所示，氟化聚乙二醇的F、O、C三种元素的原子数比例为F∶O∶C＝1∶7.288∶15.25，与理论计算值F∶O∶C＝1∶6.92∶13.70基本相符。

综合上述图2(a)(b)红外光谱图、图3(a)核磁共振谱图记忆图4(a)能谱图，可以说明七氟丁酸酐与氨基-聚乙二醇-羧基上的氨基发生酰化反应，得到氟化聚乙二醇-羧基。

称取100mg氟化聚乙二醇-羧基溶于50mL水中，加入2倍摩尔量(氟化聚乙二醇-羧基的2倍)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2倍摩尔量(氟化聚乙二醇-羧基的2倍)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应2小时，随后加入与氟化聚乙二醇-羧基等摩尔量的聚乙烯亚胺，室温下搅拌反应48小时。之后将反应溶液纯水透析3天，透析截留分子量5000，透析结束后采用孔径220nm滤膜过滤1次，干燥方法为真空干燥48小时。产物通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、¹⁹F核磁共振谱进行分析。

如图2(c)所示红外光谱图，在约3400-3250cm^-1处的宽吸收带归属于聚乙烯亚胺上伯胺、仲胺的N-H伸缩振动叠加的吸收峰，2946.6cm^-1处吸收峰归属于-CH₂-不对称伸缩振动；2826.9cm^-1处吸收峰归属于-CH₂-对称伸缩振动。

如图3(b)所示核磁共振谱，谱峰δ₁’＝-118.66ppm归属于与七氟丁酰基上的α碳原子相连的氟原子，δ₂’＝-128.13ppm归属于与β碳原子相连的氟原子，δ₃’＝-82.29ppm归属于与γ碳原子相连的氟原子。

图2(c)与图3(b)的结果表明氟化聚乙二醇羧基与聚乙烯亚胺反应生成氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺。

实施例2二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备

称取0.7g(2mmol)的乙酰丙酮铁(Fe(acac)₃)加入100ml的斜口三颈瓶中，然后向瓶中加入20ml二苄醚，先后按照3mmol∶7mmol的比例加入油酸和油胺，再向三颈瓶中通入氮气，另一端连接冷凝管，冷凝回流反应溶液。反应体系以3.3℃/min的升温速度，经过1h从常温升温至220℃，并在220℃停留60min。然后仍以3.3℃/min的速度经过30min升温至290℃，在290℃下停留30min后结束反应。待反应体系自然冷却至室温后，向体系中加入无水乙醇，磁分离5分钟去除上清重复3次，制得的磁性纳米颗粒保存于正己烷中。

取上述制备的磁性纳米颗粒(该磁性纳米颗粒含有800mg Fe)溶于100ml正己烷，再称取400mg二巯基丁二酸(DMSA)溶于200ml丙酮，混合上述二溶液后，在60℃水浴500rpm电动搅拌下冷凝回流反应4小时。反应结束后，加入超纯水萃取产物，磁分离5分钟产物并弃去上清。超纯水洗涤沉淀，磁分离5分钟弃上清，重复3次。反应产物溶于50ml超纯水，加入500μl四甲基氢氧化铵，超声震荡30min。反应液加入截留分子量8000的透析袋透析48h，最后采用220nm孔径的滤膜过滤，制得二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒(DMSA@MNP)。

上述方法采用的乙酰丙酮铁、二苄醚、油酸、油胺、正己烷、丙酮、无水乙醇、二巯基丁二酸、四甲基氢氧化铵、氮气均为市售分析纯。

制备得到的二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒(DMSA@MNP)通过透射电子显微镜(TEM)、粒度电位仪进行表征。

如图4(b)所示透射电子显微镜图，四氧化三铁磁性纳米颗粒的尺寸为11-12nm。

如图5(a)所示动态光散射测得DMSA@MNP的平均水动力尺寸为17.27±0.32nm。

如图5(b)所示测得DMSA@MNP的平均ζ电位为-45.57mV。

实施例3氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺结合的四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备以及在模拟生理环境下颗粒的稳定性测试

(一)氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺结合的四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备

取实施例2制备的二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒(DMSA@MNP，含有5mg Fe)与20mg氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺溶于40ml水中，超声振荡并500rpm搅拌反应1小时，之后将分散液超滤纯化3次，超滤离心管截留分子量为100k，制备得到的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺结合的四氧化三铁磁性纳米颗粒(F-PEG-PEI@MNP)通过透射电子显微镜(TEM)和粒度电位仪进行表征。

如图4(c)透射电子显微镜图所示，F-PEG-PEI@MNP中的磁性纳米颗粒与DMSA@MNP相符，F-PEG-PEI结合在单个磁性纳米颗粒表面，且不改变DMSA@MNP的形貌。

如图4(d)(e)所示，透射电子显微镜能谱仪面扫描F-PEG-PEI@MNP，测得氟元素与铁元素的分布图，可观察到氟元素与铁元素的空间分布具有高度相关性。

如图5(a)所示动态光散射测得F-PEG-PEI@MNP的平均水动力尺寸为93.29±7.31nm。

如图5(b)所示测得F-PEG-PEI@MNP的平均ζ电位为+56.77mV。

综合图4与图5结果，证明氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺与四氧化三铁磁性纳米颗粒结合。

(二)包覆不同阳离子聚合物的磁性纳米颗粒在模拟生理环境下的稳定性比较：

模拟体液的配置：取0.5g牛血白蛋白(BSA)溶于100mlpH7.4的PBS缓冲液，超声震荡至完全溶解，制备得到含0.5％BSA的PBS缓冲液，即模拟体液。

分别采用下列四种阳离子聚合物包覆磁性纳米颗粒：氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺(F-PEG-PEI)、甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺(mPEG-PEI，分子量2000-25000)、七氟丁酰基修饰的聚乙烯亚胺(F-PEI，PEI分子量25000)、聚乙烯亚胺(PEI，分子量25000)。

阳离子聚合物包覆的磁性纳米颗粒制备方法：取二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒(DMSA@MNP，含有5mg Fe)，分别取含有15mg聚乙烯亚胺的上述四种阳离子聚合物溶于水中，超声振荡并500rpm搅拌反应1小时，之后将分散液超滤纯化3次，超滤离心管截留分子量为100k，分别制备得到F-PEG-PEI@MNP、mPEG-PEI@MNP、F-PEI@MNP、PEI@MNP。

分别取50μg(以Fe的质量计算)上述四种磁性纳米颗粒(F-PEG-PEI@MNP、mPEG-PEI@MNP、F-PEI@MNP、PEI@MNP)，加入1ml水或模拟体液，37℃静置一小时后，采用Malvern(英国马尔文公司)ZS40粒度电位仪分别测得平均水动力尺寸。

测得的粒径变化结果如图5(c)所示，F-PEG-PEI@MNP与mPEG-PEI@MNP两种颗粒在模拟体液中测得的粒径相比水溶液略微增大；而F-PEI@MNP与PEI@MNP在模拟体液中发生聚集，产生絮状沉淀，取上清液测得平均粒径分别增大约28.4倍与20.5倍。上述结果表明，表面结合聚乙二醇的技术方法可显著提高纳米颗粒在生理环境的稳定性，即相比现有技术制备的氟化聚乙烯亚胺或聚乙烯亚胺，本发明提供的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒可在生理环境下保持稳定性。

实施例4 CCK8法测定细胞相对存活率

CCK8试剂盒与L929小鼠成纤维细胞均采购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

平均分子量25000的分支状聚乙烯亚胺(PEI_25k)采购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich)，货号：408727。

甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺(mPEG_2k-PEI_25k，平均分子量聚乙二醇为2000-聚乙烯亚胺为25000)采购自西安瑞禧生物科技有限公司，货号：R-PL1255-X。

氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺(F-PEG-PEI)为实施例1制备得到。

待测样品为平均分子量25000的分支状聚乙烯亚胺(PEI_25k)、甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺(mPEG-PEI，平均分子量聚乙二醇为2000-聚乙烯亚胺为25000)、氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺(F-PEG-PEI)。

取传代后培养至对数生长期的L929细胞，用含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化3～4分钟，终止消化后1000rpm离心5分钟，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液重悬细胞，细胞计数并接种96孔细胞培养板，每孔接种细胞数为1×10⁴个，完全培养液体积为每孔100μl，随后将细胞培养板放置于细胞培养箱，培养条件为37℃，5％CO₂，过夜培养。

次日，取出过夜培养的细胞，PBS洗涤2次，每孔更换新的完全培养基，分别加入1.5μg、1.25μg、1.0μg、0.75μg、0.5μg(以聚乙烯亚胺的质量计)待测样品，每个浓度设定6个复孔，培养体系的总体积均为100μl，之后继续培养48小时，培养环境不变。48小时后向各孔中加入10μl CCK-8溶液，37℃下孵育4小时后，酶标仪在450nm波长处检测OD值。

各组细胞的存活率按照以下公式计算：

细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100；

As＝实验孔吸光度(含有细胞，培养基，CCK-8和受试化合物的孔的吸光度)；

Ab＝空白孔吸光度(含有培养基和CCK-8的孔的吸光度)；

Ac＝对照孔吸光度(含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度)。

如图6所示，当PEI的浓度为1.25μg/100μl时，F-PEG-PEI组的细胞存活率大于80％，略高于PEI_25k组或mPEG_2k-PEI_25k组在PEI浓度为0.75μg/100μl时的细胞存活率，即可表明F-PEG-PEI的细胞毒性显著小于PEI_25k或mPEG_2k-PEI_25k。

实施例5细胞摄取实验

Hela人宫颈癌细胞系由东南大学医学院提供。

激光共聚焦显微镜型号为尼康C2激光共聚焦显微镜。

LysoTracker溶酶体红色荧光探针购自碧云天生物技术有限公司。

异硫氰酸荧光素(偶联级，90％)购自上海源叶生物科技有限公司。

胎牛血清购自美国Thermo Fisher Scientific公司，品牌为Gbico。

DMEM高糖培养液购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

0.25％胰蛋白酶消化液购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

Hoechst33342细胞核蓝色荧光染料购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

绿色荧光标记的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒(F-PEG-PEI@MNP)和绿色荧光标记的甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒(mPEG-PEI@MNP)采用如下方法制备：(1)取实施例3制备得到的F-PEG-PEI@MNP或mPEG-PEI@MNP，加入异硫氰酸荧光素(FITC)，FITC的投料量与PEI的摩尔比为FITC∶PEI＝5∶1；(2)室温下避光搅拌反应2小时，随后将反应液避光存放24小时；(3)采用截留分子量为100kDA的超滤离心管纯化产物，重复3次。

细胞培养与接种方法：

取对数生长期的Hela细胞培养于25T细胞培养瓶中，采用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5％CO₂环境下培养。在细胞密度60％-80％时，弃去培养液，PBS润洗2次，弃去PBS并加入1ml的0.25％胰蛋白酶，于37℃消化3-4分钟，随后加入3ml含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，150g离心5分钟后收集细胞，用2ml含10％胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数后接种于直径35mm、厚度0.17mm的玻底培养皿，每个培养皿接种5×10⁵个细胞，培养体系总体积为2ml。

观察纳米颗粒被细胞摄取的方法：

上述培养皿中的细胞于37℃5％CO₂环境下培养24小时后，分别向培养皿中加入含有10μg Fe的绿色荧光标记的F-PEG-PEI@MNP或mPEG-PEI@MNP，于37℃、5％CO₂环境下培养2小时后，弃去培养液，1×PBS润洗2次，弃去PBS，加入1ml含LysoTracker溶酶体红色荧光探针的DMEM培养液，以及500μl的Hoechst33342细胞核蓝色荧光染料，于37℃、5％CO₂环境下培养10-20分钟后，弃去染液，用1×PBS润洗3次，放置于共聚焦显微镜下观察，蓝色荧光的激发波长为405nm，绿色荧光的激发波长为488nm，红色荧光的激发波长为562nm。

细胞摄取纳米颗粒的结果如图7所示，呈蓝色荧光的为细胞核，呈绿色荧光的为纳米颗粒，呈红色荧光的为内含体或溶酶体。图7(a)中，Hela细胞培养基中加入绿色荧光标记的F-PEG-PEI@MNP培养2小时后，几乎全部的纳米颗粒都分布于细胞质，且部分纳米颗粒与内含体或溶酶体共定位，另有一部分颗粒已从内含体或溶酶体逃逸，进入细胞质基质中。图7(b)中，Hela细胞培养基中加入绿色荧光标记的mPEG-PEI@MNP培养2小时后，绝大多数纳米颗粒吸附于细胞膜上，且在细胞内几乎无分布；该结果可归因于PEI上的阳离子与带负电荷的细胞膜的静电吸附作用，以及纳米颗粒表面存在的PEG导致细胞摄取效率降低。

采用尼康NIS-Elements AR 5.20.00 64bit软件对上述两组实验图片中的绿色荧光进行相对定量。结果如图7(c)所示，F-PEG-PEI@MNP组细胞内的绿色荧光占整体绿色荧光强度值的80.73％，而mPEG-PEI@MNP组细胞内的绿色荧光仅占整体绿色荧光强度值的35.95％。

根据图7的结果，氟化聚乙二醇聚乙烯亚胺结合的磁性纳米颗粒具有较高的细胞摄取效率，对比甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺结合的磁性纳米颗粒，细胞摄取效率显著提高，且可以实现内含体或溶酶体逃逸。因此，本发明通过氟化的方法可以有效解决“PEG困境”问题。

实施例6细胞转染

绿色荧光标记的siRNA阴性对照(siRNA NC)购自上海吉玛基因股份有限公司，双链序列如下：

(5’至3’)UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

(3’至5’)TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA

磁转染试剂采用实施例二制备的F-PEG-PEI@MNP。

Opti-MEM培养液以及Lipofectamine 3000转染试剂采购自美国Thermo FisherScientific公司。

取对数生长期的Hela细胞培养于25T细胞培养瓶中，采用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，于37℃、5％CO₂环境下培养。在细胞汇合度约80％时，弃去培养液，用3ml的1×PBS润洗2次，弃去PBS并加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化液，于37℃消化3-4分钟，随后加入3ml含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，150g离心5min，之后弃上清收集细胞，用2ml含10％胎牛血清的Opti-MEM培养液重悬细胞，计数后接种于24孔细胞培养板中，每孔接种2×10⁵个细胞，每孔培养液为500μl，于37℃、5％CO₂环境下培养至细胞密度为60-80％时进行转染。

磁转染采用下列步骤：

(1)每个培养孔更换新鲜的500μl含10％胎牛血清的Opti-MEM培养液。

(2)取0.5μg绿色荧光标记的siRNA阴性对照(siRNA NC)溶于10μl的DEPC水，再分别加入0.25μg、0.5μg、0.75μg、1.0μg的磁转染试剂(F-PEG-PEI@MNP，以Fe的含量计算，下同)，室温下避光孵育10-15分钟得到转染载体/siRNA复合物。

(3)将上述转染载体/siRNA复合物加入细胞培养液中，轻轻摇匀。

(4)将细胞培养板的底部紧贴磁板(平均磁场强度≥200mT)，37℃孵育10-20分钟。

(5)撤去磁板，细胞继续于37℃、5％CO₂环境下培养4-16小时后检测转染效率。

Lipofectamine 3000(简称“Lipo”，下同)转染步骤参考其说明书，如下：

(1)每个培养孔更换新鲜的500μl含10％胎牛血清的Opti-MEM培养液。

(2)取0.5μg的siRNANC溶于25μl的Opti-MEM培养液。

(3)取1.5μl的Lipo溶于25μl的Opti-MEM培养液。

(4)混合(2)(3)的溶液，移液器轻轻吹打混匀，室温下孵育10-15分钟。

(5)将(4)中Lipo/siRNA混合溶液加入细胞培养液中，轻轻摇匀。

(6)细胞继续于37℃、5％CO₂环境下培养4-16小时后检测转染效率。

七、流式细胞术测定细胞转染效率

将磁转染和Lipo转染siRNANC的细胞继续培养12小时后，每个培养孔加入300μl的0.25％胰蛋白酶消化液，放置于37℃消化3-4分钟，随后加入600μl含10％胎牛血清的Opti-MEM培养液终止消化，将上述细胞悬液收集至1.5mlEP管中，150g离心5min后弃上清收集细胞沉淀，用1ml PBS重悬细胞，再次150g离心5min后弃上清收集细胞，用1ml PBS重悬细胞，用流式细胞术检测转染效率。绿色荧光的激发波长为488nm，流式细胞仪检测通道为波长530nm，测得的结果如图8所示。

图8(a)为转染效率，即成功转染的细胞占总细胞数量的百分比。F-PEG-PEI@MNP磁转染试剂的用量分别为0.25μg、0.5μg、0.75μg、1.0μg(以Fe的含量计算，下同)；Lipo的用量为1.5μl。其中，磁转染试剂用量为0.25μg时的转染效率为79.44％，与Lipo组73.51％的转染效率接近；磁转染试剂用量为0.5μg-1.0μg时的转染效率均＞90％，显著高于Lipo组73.51％的转染效率。

图8(b)为流式细胞术测得的各组细胞的相对荧光强度。

相对荧光强度RFI的计算方法为将实验组的平均荧光强度MFI_e除以转染试剂对照组(只加入转染试剂，无siRNA)的平均荧光强度MFI_c，即：RFI＝MFI_e/MFI_c。

如图8(b)所示，磁转染试剂用量为0.25μg时的相对荧光强度为22.60，与Lipo组22.13的相对荧光强度无明显差异；磁转染试剂用量为0.5μg-1.0μg时的相对荧光强度均显著高于Lipo组的相对荧光强度。

从经济性和细胞活性考虑，F-PEG-PEI@MNP磁转染试剂用量宜为0.5μg-0.75μg，在本实施例采用的条件下，其转染效率显著高于现有主流产品Lipofectamine 3000。

上述结果表明，F-PEG-PEI包覆的磁性纳米颗粒可作为一种高效的核酸递送系统。

本发明提供的F-PEG-PEI还可用于结合其他纳米颗粒或微球，例如金纳米颗粒、银纳米颗粒、碳量子点、磁性微球等。

Claims (10)

1.一种氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺化合物，其特征在于，所述氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺化合物采用七氟丁酸酐与氨基-聚乙二醇-羧基反应制备氟化聚乙二醇-羧基，再与聚乙烯亚胺通过酰胺键连接得到。

2.权利要求1所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将七氟丁酸酐和氨基-聚乙二醇-羧基混溶于甲醇中，在催化剂存在的条件下进行化学反应，纯化后得到氟化聚乙二醇-羧基；

（2）将氟化聚乙二醇-羧基溶于水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺用于活化羧基反应得到混合溶液；

（3）反应结束后将上述混合溶液逐滴加入聚乙烯亚胺水溶液中，偶联得到氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺。

3.根据权利要求2所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述七氟丁酸酐：氨基-聚乙二醇-羧基的摩尔比为=1:2～2:1，反应条件为室温下搅拌反应24-72小时，透析纯化的方法为采用纯水透析3～6天，截留分子量为800～1000，过滤纯化的方法为采用孔径220～450nm滤膜过滤产物溶液。

4.根据权利要求2所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述氟化聚乙二醇-羧基与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1～5:1，反应条件为室温下搅拌反应12～48小时，透析纯化的方法为纯水透析3～6天，截留分子量为5000～8000，过滤纯化的方法为孔径220～450nm滤膜过滤产物溶液。

5.根据权利要求2所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备方法，其特征在于，所述氨基-聚乙二醇-羧基中的聚乙二醇的平均分子量为2000～5000，所述聚乙烯亚胺的平均分子量为10000～25000。

6.含有权利要求1所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的核酸递送载体。

7.根据权利要求6所述的核酸递送载体，其特征在于，所述核酸递送载体为氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺包覆的磁性纳米颗粒，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒。

8.权利要求6或7所述的核酸递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒与氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺溶于水中，反应条件为室温下超声振荡搅拌反应，反应结束后将产物超滤纯化3～6次，超滤管截留分子量为100k～300k。

9.根据权利要求8所述的核酸递送载体的制备方法，其特征在于，所述四氧化三铁纳米颗粒含有的铁的质量与氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺的质量比为1：2～1：10。

10.权利要求1所述的氟化聚乙二醇-聚乙烯亚胺、权利要求6所述的核酸递送载体在制备基因治疗药物中的应用。

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