CN101294955A - 作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法属于纳米材料和生物技术领域。该方法有以下步骤:(1)用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的PEG;(2)把连有叶酸的PEG修饰到树枝状分子PAMAM表面;(3)通过配体交换的方法把量子点表面的油溶性配体取代下来,从而制备了水溶性的量子点。本发明使得量子点可以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞,从而可以作为荧光探针用于细胞学研究;同时,把PAMAM和PEG修饰到量子点表面可以很大程度地提高量子点的稳定性;而且PAMAM和PEG都有很好的生物相容性和很小的毒性,使其在生物学上的应用提供了可行性。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料和生物技术领域;涉及的是连有叶酸的树枝状聚酰胺-胺包覆油溶性量子点的制备方法,制备一种水溶性的、用作特异性识别肿瘤细胞的探针分子。
背景技术:
量子点是指半导体纳米微晶,主要是II-VI族或III-IV族元素组成的纳米粒子。由于其量子尺寸效应而具有奇特的性质,包括荧光发射波长可控、激发波谱宽而连续、荧光强、光稳定好、耐光漂白、能实现一元激发多元发射的同时多色标等独特性能,可弥补现有有机荧光染料的不足,甚至在某些情况下可替代有机荧光染料。量子点的独特性能将有利于其在医学实验和临床检测上的应用,相比传统荧光试剂在生物分析方面有着巨大的优势。
目前,量子点在生物医学研究中的应用越来越受到重视。最主要是作为生物荧光探针标记物。但现在通常使用的量子点表面都被大量有机溶剂分子TOPO/TOP,ODA等包覆而呈疏水性,而生物大分子或者药物一般是溶解或分散在水溶剂中的,所以必须进行水溶性改进。目前报道的量子点(QDs)的修饰方法大致可以分为以下几种:(1)通过双功能分子连接改性。主要是利用Zn、Cd等II族原子与硫原子之间有效的键合作用,用带有巯基的双功能分子,如巯基羧酸类、二硫苏糖醇(DTT)、硫代胆碱等取代QDs表面的有机分子,以使其从疏水性转变为亲水性,然后通过另一端的功能基团可以与生物大分子连接,这种方法简单、重复性好,但由于使用的是小分子作为连接物,修饰以后原有的有机分子对量子点的保护和稳定性得不到有效的替代,所以稳定性不好,荧光性质也大大减弱。(2)通过在QDs表面包覆硅或硅烷等进行修饰。修饰后的量子点稳定性、水溶性以及进一步连接的可操作性都比较理想,但是修饰过程极为烦琐、周期长、重复性无法保证。(3)将聚合物直接包埋入聚合物的空腔或形成的疏水腔。由于采用这类方法量子点表面的有机分子没有损失,所以其性能基本不受影响。但是,这种方法包覆的量子点的粒径较大,不利于在生物方面的应用。(4)通过双亲性高分子与量子点表面的烷基链疏水作用实现包裹,由于这种方法也未破坏量子点表面的有机分子,其光学性质也基本不受影响,但使用大量的有机溶剂,过程复杂,纯化困难。
肿瘤是危害全人类的头号疾病。肿瘤的早期诊断、早期治疗和靶向治疗是人们一直关注和研究的内容。申请号为200610098270.6的发明专利公开了一种特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法,该方法包括以下步骤组成:(1)CdS量子点的制备;(2)选择带有巯基的小分子化合物对量子点进行表面改性;(3)量子点表面功能化修饰:经过上步对量子点的表面进行改性之后,加入NHS及EDC的DMSO溶液使体系中形成一种活性比较高的中间体,可以和随后加入的叶酸上的氨基反应。由于用含有巯基的小分子修饰量子点的表面,改善了水溶性。再通过一种有效的方法将叶酸和量子点连接起来,使得这些荧光量子点可以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞,从而可以用作荧光探针用于细胞生物学研究。该方法提高了量子点的特异性靶向功能。但是,选用巯基小分子化合物对量子点进行了表面改性,小分子不能有效的保护量子点;此外,量子点表面的巯基在光照的条件下,很容易生成二硫化物,二硫化物不能与量子点表面相作用,从而会从量子点表面脱落下来。因此,用巯基小分子化合物对量子点进行了表面改性,量子点的稳定性会较差。
发明内容:
本发明的目的在于提供了采用连有叶酸的聚酰胺-胺树枝状分子对油溶性量子点进行包覆的方法,制备了一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化的量子点,以提高量子点的特异性靶向功能,尽可能地降低非特异性染色的强度,适应了细胞生物学研究的需要。
聚酰胺-胺(PAMAM)是一种纳米级树枝状聚合物,PAMAM树枝状大分子是近年来合成并迅速发展的一类新型聚合物。该聚合物与传统的聚合物相比,可在纳米水平上严格控制设计分子大小、结构和表面基团,因而具有精确的分子结构、致密的球状外形、单分散性、极好的水溶性、粒径较小等。本发明用其来包覆量子点,可以取代量子点表面的油溶性配体,使量子点转变为水溶性的。同时由于PAMAM有很好的生物相溶性,还可以增加量子点的生物相容性,而且得到的量子点的粒径也会很小。
本发明的一种用作特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的制备方法,应用于制备检测细胞膜上表达有高水平叶酸受体的肿瘤细胞,其制备有以下步骤:
(1)用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的聚二乙醇(PEG)。
(2)把连有叶酸的PEG修饰到树枝状分子表面。
(3)通过配体交换的方法把量子点表面的油溶性配体取代下来,从而制备了水溶性的量子点。
具体的技术方案如下:
一种作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法,其特征在于,有聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成、表面连有氨基的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸的合成、功能性量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)制备的过程:
所述的聚乙二醇-叶酸的合成,是用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的聚二乙醇(PEG),合成出一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇;
所述的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸的合成,是将聚酰胺-胺溶解在水或甲醇中;在冰盐浴的条件下,按聚酰胺-胺和叶酸的摩尔比为1∶1~128,将聚酰胺-胺溶液滴加一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇中,滴加完毕撤掉冰盐浴,室温反应4~48小时得到中间产物。再在冰盐浴的条件下,按聚酰胺-胺和乙二胺的摩尔比为1∶2~32,直接将中间产物滴加到乙二胺中,滴加完毕撤掉冰盐浴,室温反应4~48小时;除去溶剂得到浅黄色固体,经过透析处理得到表面连有氨基的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸;
所述的功能性量子点制备,是将表面连有油溶性配体的量子点溶解在氯仿或甲苯中,中间产物溶解在甲醇或水中,将两种溶液混合,用四甲基氢氧化胺控制pH值在6~12之间,在40~80℃反应2~10小时,冷却至室温后,用乙酸乙酯或丙酮洗后,得到的固体溶解在水中,过滤除去溶剂后得到目标产物(QDs-PAMAM-PEG-FA)。
聚酰胺-胺(PAMAM)由0代至10代,其分子直径在1nm至13nm之间,属于纳米尺度的分子。本发明所述的聚酰胺-胺可以是2.5~6.5代的树枝状聚合物。在树枝状分子-聚乙二醇-叶酸的合成中,PAMAM应当透析提纯后使用。
所述的聚乙二醇-叶酸的合成,可以采用一步法或者多步法。
一步法聚乙二醇-叶酸合成的具体过程是,将等摩尔的叶酸和两侧为氨基的聚乙二醇溶解在二甲亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中,然后加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的N,N’-二环己基碳酰亚胺(DCC),和与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的三乙胺或吡啶,室温反应3~24小时;混合溶液经离心后,上清液用PH=6~12的缓冲溶液透析,再用去离子水透析;除去溶剂后,得到浅黄色固体,即为一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇(NH2-PEG-FA)。
一步法的叶酸与两侧为氨基的PEG的反应式如下:
多步法聚乙二醇-叶酸合成的具体过程是,(1)将等摩尔量的两侧为氨基的聚乙二醇和二碳酸二叔丁酯溶解在甲醇中,然后向其中滴加三乙胺或吡啶,回流搅拌8~20小时,冷却至室温,旋蒸,除去溶剂;再用二氯甲烷溶解,在-10℃~20℃下,用体积比为1∶1~5的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到白色粉末;(2)将上述白色粉末产物与过量的叶酸溶解在二甲亚砜(DMSO)中,然后向其中逐滴加入过量的三乙胺和DCC,40~90℃反应8~20小时,冷却至室温,用乙醚沉淀,过滤,得到的产物用再用少量二氯甲烷溶解后,在-10℃~20℃下,用体积比为1∶2的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末;(3)将上述浅黄色粉末产物溶解在过量的三氟乙酸和二氯甲烷,或者盐酸和水中,室温搅拌3~24小时,除去溶剂后得到固体重新溶解在二氯甲烷中,在-10℃~20℃下,用体积比为1∶1~5的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末状的一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇(NH2-PEG-FA)。
多步法的叶酸与两侧为氨基的PEG的反应式如下:
本发明所述的量子点包括II-VI和III-V的量子点以及它们组成的核-壳结构的量子点,是表面连有三苯基膦(TOPO)或十六胺或十八胺的CdS、ZnS、HgS、GdSe、ZnSe、HgSe、GdTe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)2、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CuSe、CdSe/HgTe、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdTe/HgS、InAs/InP、InAs/CdSe、InAs/ZnSe或Fe3O4磁性纳米粒子。
本发明的方法制备的功能化量子点应用于检测细胞膜上表达有高水平叶酸受体的肿瘤细胞。通过这种有效的方法将叶酸和量子点连接起来,使得这些量子点可以特异性地识别表达有高水平叶酸受体的癌细胞,从而可以作为荧光探针用于细胞学研究。同时,把树枝状PAMAM和PEG修饰到量子点表面,树枝状PAMAM由于较大的空间位阻可以很大程度地提高量子点的稳定性,而且树枝状PAMAM和PEG都有很好的生物相容性和很小的毒性,使其在生物学上的应用提供了可行性。
与现有的制备用作特异性识别肿瘤细胞的功能化量子点的方法相比,采用水溶性的PAMAM树枝状分子来取代油溶性的量子点,由于树枝状分子的空间位阻会阻止O2等小分子进入量子点表面,从而使量子点更稳定。这种方法制备的水溶性量子点产物具有非常优异的荧光性质,基本维持了原有油溶性量子点的光学性质,水溶液的稳定性长达数月。本制备方法,可以取代油溶性表面的油溶性配体,在量子点表面形成比较致密的水溶性高分子层,能更好的保护量子点,避免环境介质渗入而造成量子点的发光性能的破坏(如光降解、光漂白以及Cd离子的渗出而产生毒性)。
这种制备方法使量子点的稳定性、水溶性以及生物相容性得到提高的同时,还把叶酸修饰到量子点表面,作为量子点表面靶向功能分子。叶酸是肿瘤细胞中代谢旺盛的主要原料之一,它与肿瘤细胞膜表面的叶酸受体特异性地结合而进入细胞参与细胞代谢,肿瘤细胞的细胞膜表面的叶酸受体水平远远高于正常细胞。故叶酸受体以作为许多治疗肿瘤的药物的靶向功能受体分子。本发明把叶酸成功地修饰到了量子点表面,使得量子点其具有特异性识别叶酸受体的功能。所得的产物可以广泛用于生物标记、细胞成像、肿瘤靶向和显影等生物分析领域。用本方法制备的具有靶向功能的水溶性的量子点粒径为纳米级,且粒径分布较窄。
具体实施方式:
实施例1:聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成1
将等摩尔的叶酸和两侧为氨基的聚乙二醇溶解在DMSO中,然后加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的N,N’-二环己基碳酰亚胺(DCC),和加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的三乙胺,室温反应3小时。混合溶液经离心后,上清液用pH=6的缓冲溶液透析,再用去离子水透析。除去溶剂后,得到浅黄色固体。
实施例2:聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成2
将等摩尔的叶酸和两侧为氨基的聚乙二醇溶解在DMSO中,然后加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的N,N’-二环己基碳酰亚胺(DCC),和加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的三乙胺,室温反应6小时。混合溶液经离心后,上清液用pH=9的缓冲溶液透析,再用去离子水透析。除去溶剂后,得到浅黄色固体。
实施例3:聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成3
将等摩尔的叶酸和两侧为氨基的聚乙二醇溶解在DFM中,然后加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的N,N’-二环己基碳酰亚胺(DCC),和加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的三乙胺,室温反应9小时。混合溶液经离心后,上清液用pH=10的缓冲溶液透析,再用去离子水透析。除去溶剂后,得到浅黄色固体。
实施例4:聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成4
将等摩尔的叶酸和两侧为氨基的聚乙二醇溶解在DMSO中,然后加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的N,N’-二环己基碳酰亚胺(DCC),和加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的三乙胺,室温反应24小时。混合溶液经离心后,上清液用pH=12的缓冲溶液透析,再用去离子水透析。除去溶剂后,得到浅黄色固体。
实施例5:聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成5
(1)将等摩尔量的两侧为氨基的聚乙二醇和二碳酸二叔丁酯溶解在甲醇中,然后向其中滴加三乙胺,回流搅拌过夜,冷却至室温后,旋蒸,除去溶剂。再用少量二氯甲烷溶解后,在低温下,用体积比1∶2的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到白色粉末。(2)将上述产物与过量的叶酸溶解在DMSO中,然后向其中逐滴加入过量的三乙胺和DCC,90℃反应过夜,冷却至室温,用乙醚沉淀后,过滤,得到的产物用再用少量二氯甲烷溶解后,在低温下,用1∶2的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末。(3)将(2)中产物溶解在过量的三氟乙酸和二氯甲烷中,室温搅拌3小时,除去溶剂后得到得到固体重新溶解在少量的二氯甲烷中,在低温下,用体积比1∶2的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末,即为目标产物聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)。
实施例6:聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成6
(1)将等摩尔量的两侧为氨基的聚乙二醇和二碳酸二叔丁酯溶解在甲醇中,然后向其中滴加吡啶,回流搅拌过夜,冷却至室温后,旋蒸,除去溶剂。再用少量二氯甲烷溶解后,在低温下,用体积比1∶5的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到白色粉末。(2)将上述产物与过量的叶酸溶解在DMSO中,然后向其中逐滴加入过量的三乙胺和DCC,40℃反应过夜,冷却至室温,用乙醚沉淀后,过滤,得到的产物用再用少量二氯甲烷溶解后,在低温下,用1∶5的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末。(3)将(2)中产物溶解在过量的盐酸和水中,室温搅拌3小时,除去溶剂后得到得到固体重新溶解在少量的二氯甲烷中,在低温下,用体积比1∶5的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末,即为目标产物聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)。
实施例7:聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)的合成7
(1)将等摩尔量的两侧为氨基的聚乙二醇和二碳酸二叔丁酯溶解在甲醇中,然后向其中滴加三乙胺,回流搅拌过夜,冷却至室温后,旋蒸,除去溶剂。再用少量二氯甲烷溶解后,在低温下,用体积比1∶1的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到白色粉末。(2)将上述产物与过量的叶酸溶解在DMSO中,然后向其中逐滴加入过量的三乙胺和DCC,70℃反应过夜,冷却至室温,用乙醚沉淀后,过滤,得到的产物用再用少量二氯甲烷溶解后,在低温下,用体积比1∶1的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末。(3)将(2)中产物溶解在过量的三氟乙酸和二氯甲烷中,室温搅拌24小时,除去溶剂后得到得到固体重新溶解在少量的二氯甲烷中,在低温下,用体积比1∶1的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末,即为目标产物聚乙二醇-叶酸(NH2-PEG-FA)。
实施例8:树枝状分子的合成1
树枝状分子PAMAM的合成采用发散法,即分子由核心部分开始向外生长。根据树木分枝的规律将预先制备好的单体按发射状的顺序、分支的枝梢再分枝,依次重复组合起来。以乙二胺为起始物,在甲醇或水中通过与过量的甲基丙烯酸甲酯发生麦克尔加成反应,得到0.5代的树枝状PAMAM分子,然后用0.5代的树枝状PAMAM与过量的乙二胺发生氨解反应,得到1.0代的树枝状PAMAM,重复以上两步反应,就可以得到更高代数的树枝状分子。
实施例9:树枝状分子的合成2
树枝状分子PAMAM的合成采用收敛法,即采用将预先合成好的树枝状低聚物依次连接在核心分子上的合成策略。该种方法与上面提到的发散法正好相反,其合成步骤是先合成一个一个的小分支,然后这些小分支两两相连,发展成较大的“枝”,最后两个(或多个)对称的大“枝”连在一起形成树枝状大分子。
实施例10:树枝状分子-聚乙二醇-叶酸(PAMAM-PEG-FA)的合成1
将2.5代树枝状PAMAM溶解在甲醇中,在冰盐浴的条件下,按PAMAM和叶酸的摩尔比为1∶1,将PAMAM逐滴加入NH2-PEG-FA中,滴加完毕后,撤掉冰盐浴,室温反应4小时,得到PAMAM-PEG-FA。不经过出料处理,按PAMAM和乙二胺的摩尔比为1∶2,在冰盐浴的条件下,直接将PAMAM-PEG-FA逐滴加入到乙二胺中,滴加完毕后,撤掉冰盐浴,室温反应4小时,反应完全后,除去溶剂得到浅黄色固体,经过透析处理后,得到产物表面连有氨基的PAMAM-PEG-FA。
实施例11:树枝状分子-聚乙二醇-叶酸(PAMAM-PEG-FA)的合成2
将4.5代树枝状PAMAM经过透析提纯后,溶解在水中,在冰盐浴的条件下,按PAMAM和叶酸的摩尔比为1∶32,将PAMAM逐滴加入NH2-PEG-FA中,滴加完毕后,撤掉冰盐浴,室温反应24小时,得到PAMAM-PEG-FA。不经过出料处理,按PAMAM和乙二胺的摩尔比为1∶8,在冰盐浴的条件下,直接将PAMAM-PEG-FA逐滴加入到乙二胺中,滴加完毕后,撤掉冰盐浴,室温反应24小时,反应完全后,除去溶剂得到浅黄色固体,经过透析处理后,得到产物表面连有氨基的PAMAM-PEG-FA。
实施例12:树枝状分子-聚乙二醇-叶酸(PAMAM-PEG-FA)的合成3
将6.5代树枝状PAMAM经过透析提纯后,溶解在水中,在冰盐浴的条件下,按PAMAM和叶酸的摩尔比为1∶128,将PAMAM逐滴加入NH2-PEG-FA中,滴加完毕后,撤掉冰盐浴,室温反应48小时,得到PAMAM-PEG-FA。不经过出料处理,按PAMAM和乙二胺的摩尔比为1∶32,在冰盐浴的条件下,直接将PAMAM-PEG-FA逐滴加入到乙二胺中,滴加完毕后,撤掉冰盐浴,室温反应48小时,反应完全后,除去溶剂得到浅黄色固体,经过透析处理后,得到产物表面连有氨基的PAMAM-PEG-FA。
实施例13:功能性量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)的制备1
将表面连有TOPO的CdSe油溶性量子点溶解在氯仿中,PAMAM-PEG-FA溶解在水中,将两种溶液混合,用四甲基氢氧化胺控制pH=6,在60℃反应2小时,冷却至室温后,用乙酸乙酯洗后,得到的固体溶解在水中,过滤,除去溶剂后得到目标产物QDs-PAMAM-PEG-FA。
实施例14:功能性量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)的制备2
将表面连有十八胺的CdSe/ZnS油溶性量子点溶解在甲苯中,PAMAM-PEG-FA溶解在甲醇中,将两种溶液混合,用四甲基氢氧化胺控制pH=12,在80℃反应4小时,冷却至室温后,用乙酸乙酯洗后,得到的固体溶解在水中,过滤,除去溶剂后得到产物QDs-PAMAM-PEG-FA。
实施例15:功能性量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)的制备3
将表面连有十八胺的CdSe/CdS油溶性量子点溶解在氯仿中,PAMAM-PEG-FA溶解在甲醇中,将两种溶液混合,用四甲基氢氧化胺控制pH=10,在40℃反应4小时以上,冷却至室温后,用乙酸乙酯洗后,得到的固体溶解在水中,过滤,除去溶剂后得到产物QDs-PAMAM-PEG-FA。
实施例16:功能性量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)的制备4
将表面连有十六胺的ZnS/CdS油溶性量子点溶解在甲苯中,PAMAM-PEG-FA溶解在水中,将两种溶液混合,用四甲基氢氧化胺控制pH=9,在70℃反应10小时,冷却至室温后,用丙酮洗后,得到的固体溶解在水中,过滤,除去溶剂后得到产物QDs-PAMAM-PEG-FA。
实施例17:功能性量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)的制备5
用其它表面连有TOPO(三苯基膦)或十六胺或十八胺的CdS,ZnS,HgS,GdSe,ZnSe,HgSe,GdTe,ZnTe,ZnO,PbSe,HgTe,CaAs,InP,InAs,InCaAs,CdS/ZnS,CdS/Ag2S,CdS/PbS,CdS/Cd(OH)2,CdS/HgS,CdS/HgS/CdS,ZnS/CdS,ZnS/CdS/ZnS,ZnS/HgS/ZnS/CdS,CdSe/CdS,CdSe/ZnS,CdSe/ZnSe,CdSe/CuSe,CdSe/HgTe,CdSe/HgSe,CdSe/HgSe/CdSe,CdTe/HgS,InAs/InP,InAs/CdSe,InAs/ZnSe或Fe3O4磁性纳米粒子,替代实施例13~16中的表面连有TOPO的CdSe油溶性量子点、表面连有十八胺的CdSe/ZnS油溶性量子点、表面连有十八胺的CdSe/CdS油溶性量子点或表面连有十六胺的ZnS/CdS油溶性量子点,均可得到目标产物QDs-PAMAM-PEG-FA。
实施例18:功能性量子点(QDs-PAMAM-PEG-FA)对细胞的培养
利用常规的细胞培养方法,选择HeLa细胞等表达有高水平叶酸受体(FR)的肿瘤细胞与量子点共同培养,然后用激光共聚显微镜观测,证明了肿瘤细胞对量子点的特异性吸收。
Claims (5)
1、一种作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法,其特征在于,有聚乙二醇-叶酸的合成、表面连有氨基的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸的合成、功能性量子点制备的过程:
所述的聚乙二醇-叶酸的合成,是用生物相容的叶酸来修饰两侧为氨基的聚二乙醇(PEG),合成出一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇;
所述的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸的合成,是将聚酰胺-胺溶解在水或甲醇中;在冰盐浴的条件下,按聚酰胺-胺和叶酸的摩尔比为1∶1~128,将聚酰胺-胺溶液滴入一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇中,滴加完毕撤掉冰盐浴,室温反应4~48小时得到中间产物;再在冰盐浴的条件下,按聚酰胺-胺和乙二胺的摩尔比为1∶2~32,直接将中间产物滴加到乙二胺中,滴加完毕撤掉冰盐浴,室温反应4~48小时;除去溶剂得到浅黄色固体,经过透析处理得到表面连有氨基的树枝状分子-聚乙二醇-叶酸;
所述的功能性量子点制备,是将表面连有油溶性配体的量子点溶解在氯仿或甲苯中,中间产物溶解在甲醇或水中,将两种溶液混合,用四甲基氢氧化胺控制pH值在6~12之间,在40~80℃反应2~10小时,冷却至室温后,用乙酸乙酯或丙酮洗后,得到的固体溶解在水中,过滤除去溶剂后得到目标产物。
2、按照权利要求1所述的作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法,其特征在于,所述的聚乙二醇-叶酸的合成,是将等摩尔的叶酸和两侧为氨基的聚乙二醇溶解在二甲亚砜或二甲基甲酰胺中,然后加入与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的N,N’-二环己基碳酰亚胺,和与聚乙二醇-叶酸等摩尔量的三乙胺或吡啶,室温反应3~24小时;混合溶液经离心后,上清液用PH=6~12的缓冲溶液透析,再用去离子水透析;除去溶剂后,得到浅黄色固体,即为一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇。
3、按照权利要求1所述的作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法,其特征在于,所述的聚乙二醇-叶酸的合成是,(1)将等摩尔量的两侧为氨基的聚乙二醇和二碳酸二叔丁酯溶解在甲醇中,然后向其中滴加三乙胺或吡啶,回流搅拌8~20小时,冷却至室温,旋蒸,除去溶剂;再用二氯甲烷溶解,在-10℃~20℃下,用体积比为1∶1~5的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到白色粉末;(2)将上述白色粉末产物与过量的叶酸溶解在二甲亚砜中,然后向其中逐滴加入过量的三乙胺和N,N’-二环己基碳酰亚胺,40~90℃反应8~20小时,冷却至室温,用乙醚沉淀,过滤,得到的产物用再用少量二氯甲烷溶解后,在-10℃~20℃下,用体积比为1∶2的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末;(3)将上述浅黄色粉末产物溶解在过量的三氟乙酸和二氯甲烷,或者盐酸和水中,室温搅拌3~24小时,除去溶剂后得到固体重新溶解在二氯甲烷中,在-10℃~20℃下,用体积比为1∶1~5的乙醚∶己烷混合溶剂沉淀,过滤,得到浅黄色粉末状的一侧为氨基另一侧为叶酸的聚乙二醇。
4、按照权利要求1或2或3所述的作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法,其特征在于,所述的聚酰胺-胺是2.5~6.5代的树枝状聚合物。
5、按照权利要求1或2或3所述的作为特异性识别肿瘤细胞的探针分子的制备方法,其特征在于,所述的聚酰胺-胺(PAMAM)是2.5~6.5代的树枝状聚合物;所述的量子点包括II-VI和III-V的量子点以及它们组成的核-壳结构的量子点,具体是表面连有TOPO或十六胺或十八胺的CdS、ZnS、HgS、GdSe、ZnSe、HgSe、GdTe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)2、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CuSe、CdSe/HgTe、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdTe/HgS、InAs/InP、InAs/CdSe、InAs/ZnSe或Fe3O4磁性纳米粒子。
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