CN111744021B - 肺部基因递送体系及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肺部基因递送体系及其制备方法与应用,具有高效克服粘液层和细胞膜屏障的能力;RBP与顺式‑乌头酸酐制备得到RC,将聚合物溶液与核酸溶液混合孵育,再加入RC溶液,孵育,得到肺部基因递送体系。将RCDsT纳米复合物用于治疗ALI疾病,肺气道内注射RCDsT纳米复合物后,可有效穿透粘液层,被细胞有效地摄取,从而实现针对ALI的siTNF‑α与RBP的联合抗炎治疗。简而言之,这项工作提供了解决粘液渗透和细胞摄取之间矛盾的另一种方法,为通过肺气道内直接给药的方式治疗ALI提供了一种能够实现短肽/siRNA共递送的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因荷载和短肽递送领域,具体涉及高效克服粘液层和细胞膜屏障的肺部基因递送体系RCDsT的制备方法与应用,并用于治疗急性肺损伤。
背景技术
利用肺气道给药治疗ALI的策略中由于存在粘液层屏障,传统基因递送体系在满足高转染效率的同时往往无法实现高效的粘液层渗透。现有技术CN102178957A公开了一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统,该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料,包裹干扰目标致病基因的siRNA制成,还公开了上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法;其公开的给药系统可用于运送干扰目标致病基因的siRNA,以发挥RNA干扰作用,抑制致病基因复制,能够在活体内运送siRNA靶向肺呼吸道上皮,是以沉默靶基因为目的发挥相应药效作用的非病毒运送系统。
除细胞膜屏障外,在ALI中进行肺气道内给药后,粘液层对阳离子聚合物介导siRNA的递送体系提出了新的挑战。粘液由杯状上皮细胞分泌,可以快速清除外源物质。此外,粘液层由粘蛋白单体组成,粘蛋白单体通过二硫键相互交联形成网状结构。由于网状结构的孔径大小约为200 ~ 300 nm,大于300 nm的纳米复合物容易被粘液阻塞并迅速清除。因此,粘液层作为除细胞膜外的另一个生物屏障,对肺气道内给药方式递送基因的纳米复合物设置了时间和尺寸上的要求。在粘液渗透的过程中,纳米复合物会与粘液脂质,细胞碎片以及粘蛋白发生相互作用,而粘蛋白由于高度糖基化而带负电。因此,能够有效介导细胞膜渗透的带正电荷的纳米复合物被粘蛋白通过静电吸附困在粘液层中,从而导致体内的抗炎作用减弱。现有技术常用的克服粘液层屏障方法主要为对递送载体的表面进行PEG化修饰,通过减小基因递送体系与粘蛋白之间的相互作用提高其渗透粘液层的水平;然而PEG化修饰后的递送体系也会减小其被细胞摄取的水平,从而无法实现高效的基因转染。现有技术常用的基因递送方法主要为病毒载体和非病毒载体,其中病毒载体存在免疫原性等安全隐患,非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等效率低;尤其是现有载体在满足高转染效率的同时往往无法实现高效的粘液层渗透。
发明内容
本发明的目的是提供一种肺部基因递送体系RCDsT,用于实现TNF-α siRNA(siTNF-α)和RBP的共递送。本发明的RC/DPLL/siTNF-α(RCDsT)三元复合物能够快速地渗透粘液层;当到达炎症部位的微酸环境中,RC包衣从纳米复合物表面脱落,RBP可以阻断NF-κB的信号通路,实现抗炎的功效;暴露的DPLL/siTNF-α(DsT)二元复合物被巨噬细胞高效摄取并沉默TNF-α的表达,与胞外释放的RBP共同实现急性肺损伤的联合抗炎治疗。
本发明采用如下技术方案:
肺部基因递送体系,所述肺部基因递送体系内层为装载药物的聚合物,外层为负电物质;所述负电物质包括负电聚合物、负电短肽。
本发明中,所述负电短肽由RBP改性得到;所述RBP的氨基酸序列为KLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEC;肺部基因递送体系RCDsT,其制备方法包括以下步骤,包括以下步骤:将聚合物溶液与核酸溶液混合孵育,再加入RC溶液,孵育,得到肺部基因递送体系RCDsT。
负电物质在制备肺部基因递送体系中的应用;所述负电物质包括负电聚合物、负电短肽;进一步的,RC或者RBP在制备肺部基因递送体系中的应用。
肺部基因递送体系RCDsT在制备肺气道给药治疗肺损伤药物中的应用。
本发明中,所述RC由RBP与顺式-乌头酸酐制备得到;所述RBP的氨基酸序列为KLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEC。
本发明中,聚合物的制备方法包括如下步骤,将G3-PAMAM溶液滴加入zLL-NCA溶液中,反应制备PzLL;再将PzLL溶于氢溴酸/醋酸、TFA的混合溶液,反应得到聚合物DPLL。
上述反应步骤以及原料结构式如下:
本发明中,药物为核酸药物,比如核酸为siTNF-α。
本发明中,负电物质、聚合物、核酸药物的质量比为(35~45)∶(4~6)∶1。
本发明中,孵育为37℃孵育20~40分钟;优选的,孵育前,涡旋处理,比如涡旋3~6秒。
本发明中,聚合物溶液、核酸溶液、负电物质溶液中,溶剂为DEPC水,优选的,DEPC水的pH为 7.3~7.5,优选的,pH为 7.4。
上述肺部基因递送体系RCDsT,其制备方法可以为,将siTNF-α和DPLL分别溶于DEPC水中(pH 7.4),浓度分别为0.1 mg/mL和0.5 mg/mL,将RC溶于DEPC水中(pH 7.4),浓度为10 mg/mL;再将DPLL溶液加入到siTNF-α溶液中,涡旋5 s,37 ℃下孵育30 min;再添加RC溶液,涡旋5 s,37 ℃下孵育30 min,得到RCDsT纳米药物。
本发明的主要优势在于:
本发明首次公开了三元纳米复合物,粒径为200 nm,zeta电势为-13 mV,实现了纳米颗粒快速渗透粘液层,并保证了高效的基因转染;通过使用RC、siTNF-α作为药物和DPLL作为阳离子基因载体来构建RCDsT纳米复合物用于治疗ALI疾病,肺气道内注射RCDsT纳米复合物后,RCDsT纳米复合物可通过静电排斥力有效穿透粘液层,当它到达深处的巨噬细胞时,RC活化,具有抗炎功能,RC外壳剥落后,带有siTNF-α的内部DsT二元纳米复合物被细胞有效地摄取,从而实现针对ALI的siTNF-α与RBP的联合抗炎治疗。简而言之,这项工作提供了解决粘液渗透和细胞摄取之间矛盾的另一种方法,为通过肺气道内直接给药的方式治疗ALI提供了一种能够实现短肽/siRNA共递送的新方法。
附图说明
附图用来对本发明进行进一步说明,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为实施例一的DPLL在不同质量比下荷载siTNF-α的凝胶电泳图(a)和DLS表征(b),c)DsT(w/w = 5/1)纳米复合物的透射电镜图,RC在不同质量比下包裹DsT(w/w = 5/1)纳米复合物的凝胶电泳图(d)和DLS表征(e),f)RCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物的透射电镜扫描图;
图2为实施例一的RCDsT纳米复合物在pH 7.4和6.8条件下的zeta电位表征(a,n =3)和FRET表征(b);
图3为实施例二的荧光光谱分析法(a)和流式细胞术分析法(b,c)表征在pH 7.4和6.8条件下RAW 264.7细胞对含FAM-siRNA的RGDsT纳米复合物和RCDsT纳米复合物的摄取水平,剂量为0.2 μg siRNA/孔(n = 3);
图4为实施例二的明场下RAW 264.7细胞与含FAM-siRNA以及Cy5-RC(或Cy5-RG)的RCDsT纳米复合物和RGDsT纳米复合物共孵育4 h后的CLSM图,比例尺为5 μm;
图5为实施例二的RAW 264.7细胞与含FAM-siRNA的RCDsT纳米复合物在pH 6.8的条件下共孵育2和4 h后的CLSM图,细胞核和内涵体/溶酶体分别用Hoechst 33258和Lysotracker Red染色,比例尺为5 μm;
图6为实施例二的DsT纳米复合物和RCDsT纳米复合物在不同DPLL浓度下对RAW264.7细胞的毒性,剂量为0.1 μg siTNF-α/孔(n = 3);
图7为实施例二的在pH 6.8的条件下,LPS诱导的RAW 264.7细胞与不同纳米复合物共孵育后TNF-α mRNA的表达水平(a)以及TNF-α蛋白的表达水平(b,n = 3);
图8为实施例二的在pH 7.4或6.8的条件下,LPS诱导的RAW 264.7细胞与不同纳米复合物共孵育后的TNF-α蛋白水平(n = 3);
图9为实施例三的含Cy3-siRNA的DsT纳米复合物和RCDsT纳米复合物在痰液中运动的模拟示意图(a),均方位移的定量分析(b)以及有效扩散率的正态分布(c);
图10为实施例三的含Cy3-siRNA的DsT纳米复合物和RCDsT纳米复合物与不同浓度的粘蛋白溶液形成沉淀的百分比(n = 3)。Cy3-siRNA的总用量为100%;
图11为实施例三的含Cy3-siRNA的DsT纳米复合物和RCDsT纳米复合物与Calu-3细胞孵育6 h后,Cy3-siRNA穿透Calu-3细胞单层的速率并用P app表示(n = 3);
图12为实施例三的通过肺气道给药后的含Cy3-siRNA的DsT纳米复合物和RCDsT纳米复合物在肺部上皮组织中的分布情况,细胞核用DAPI染色,比例尺为25 μm;
图13为实施例四的(a)real-time PCR定量分析肺组织中TNF-α mRNA的表达量(n= 6)。ELISA表征肺组织中TNF-α(b)和IL-6(c)的表达量(n = 6)。d)Western blot表征肺组织中TNF-α的表达量;
图14为实施例四的肺组织中MPO的活性水平(n = 6);
图15为实施例四的ELISA表征盥洗液中TNF-α(a)和IL-6(b)的表达水平。盥洗液中细胞总数(c)和蛋白质含量(d)(n = 6);
图16为实施例四的(a)肺部干/湿重的比例(n = 6)。动脉血中pH(b),氧分压(c)和二氧化碳分压(d)的指标(n = 6)。e)肺组织的H&E图,比例尺为200 μm;
图17为 RBP,RC在pH 7.4和6.8条件下的MALDI-TOF表征(a),RG在pH 7.4和6.8条件下的MALDI-TOF表征(b)。
图18为PLL的核磁表征。
图19为PLL-CA的核磁表征。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
实验药品、细胞、动物
TNF-α siRNA(siTNF-α)、杂序的siRNA(siNC)以及相关引物均购买于西格玛奥德里奇贸易有限公司(中国); RBP购买于淘普多肽生物科技有限公司(中国);乙二胺为核,氨基作为末端的第三代的树枝状高分子PAMAM(威海晨源化学,中国,G3-PAMAM);BCA试剂盒(Alfa,中国);DMEM 培养基(Gibico,美国);胎牛血清(Gibico,美国);LPS(西格玛奥德里奇贸易有限公司,中国);TNF-α小鼠单克隆抗体、GAPDH小鼠单克隆抗体(Abcam,中国);HRP山羊抗鼠IgG(碧云天,中国);SYBR@Premix Ex(TaKaRa,日本);PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa,日本);TNF-α ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒(Thermo,美国);MPO试剂盒(建成生物,中国)。小鼠巨噬细胞RAW 264.7和人肺腺癌细胞Calu-3均购买于美国ATCC细胞库,并培养于含10% FBS的DMEM。雄性Balb/c小鼠(~20 g)购买于上海斯莱克实验动物有限公司。所有实验方案均经过苏州大学动物保护和使用委员会和苏州大学实验动物中心批准。
实验仪器
KG-201C微量移液器(Eppendorf,德国);BS124S电子天平(Sartorius,德国);C-MAGH37搅拌器(IKA,德国);RV10旋转蒸发仪(IKA,德国);FDU-2100冷冻干燥机(EYELA,日本);Micro 21R离心机(Thermo,美国);400 MR核磁共振仪(NMR,Bruke,德国);MALDI-TOF(Bruker Daltonics,美国);FEI T20透射电子显微镜(FEI,美国);KS型电泳仪(Thermo,美国);JS-680B凝胶成像仪(GE,美国);Nano ZS90(Malvern,英国);CO2培养箱(Thermo,美国);Thermo VF多功能酶标仪(Thermo,美国);Bio-rad多功能酶标仪(Bio-rad,美国);倒置显微镜(Olympus,日本);TCS SP5共聚焦显微镜(Leica,德国);LSM 800共聚焦显微镜(Zeiss,德国);FACS型流式细胞仪(BD,美国);CM1860冰冻切片机(Leica,美国);荧光定量PCR(Bio-rad,美国);血气分析仪(Radiometer,中国)。
统计学分析遵循Student’ t-test。实验组与对照组之间的显著性差异定义为:*p< 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。
实施例一
将siTNF-α和DPLL分别溶于DEPC水中(pH 7.4),浓度分别为0.1 mg/mL和0.5 mg/mL。再将DPLL溶液以不同比例(DPLL/siTNF-α = 0.5/1,1/1,2/1,5/1,10/1和20/1,w/w)加入到siTNF-α溶液中,涡旋5 s,37 ℃下孵育30 min,得到DsT溶液。对于RCDsT三元纳米复合物,将RC溶于DEPC水中(pH 7.4),浓度为10 mg/mL,以不同比例(RC/siTNF-α = 1/1,2/1,5/1,10/1,20/1,30/1和40/1,w/w)添加到制备好的DsT溶液中(DPLL/siTNF-α = 5/1,w/w)中,涡旋5 s,37 ℃下孵育30 min,得到RCDsT三元纳米复合物。
对比例
将siTNF-α和DPLL分别溶于DEPC水中(pH 7.4),浓度分别为0.1 mg/mL和0.5 mg/mL。再将DPLL溶液以(DPLL/siTNF-α = 5/1, w/w)加入到siTNF-α溶液中,涡旋5 s,37 ℃下孵育30 min,得到DsT溶液。对于RGDsT三元纳米复合物,将RG溶于DEPC水中(pH 7.4),浓度为10 mg/mL,以(RG/siTNF-α = 40/1,w/w)添加到制备好的DsT溶液中(DPLL/siTNF-α = 5/1,w/w)中,涡旋5 s,37 ℃下孵育30 min,得到RGDsT三元纳米复合物。
其余的纳米复合物的制备方法参考上段,更换对应物质,不改变用量比例等参数,得到如表3.4的纳米复合物。
为了评估两种纳米复合物的基因包载能力,将新鲜制备的纳米复合物(20 μL,siTNF-α的质量为0.4 μg)与Loading Buffer(4 μL,6 ×)混合均匀后加入2%琼脂糖凝胶的上样孔中,90 V电压下电泳20 min。通过TECNAI G2透射电子显微镜和Zetasizer NanoZS90检测各样品的粒径和电位。参见图1,琼脂糖凝胶电泳和动态光散射实验的数据表明,当DPLL/siTNF-α质量比≥ 2时,DPLL能够很好地包载siTNF-α;当DPLL/siTNF-α质量比≥ 5时,其粒径可以保持在150 nm左右;随着DPLL/siTNF-α质量比的不断增加,DsT的表面电势不断增大,当质量比为20时,DsT二元复合物的表面电势约为19.4 mV(a~c);对于RCDsT三元复合物而言,随着RC/siTNF-α质量比的不断增大,其粒径可以保持在200 nm左右,当RC/siTNF-α质量比达到40时,RCDsT三元复合物的表面电势约为-13.0 mV;此外,琼脂糖凝胶电泳实验的数据表明,RC的加入不会将siTNF-α从DsT二元复合物中置换出来(d~f)。
制备RCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物后,在不同pH条件下(7.4和6.8,分别用HCl溶液(1 M)和NaOH溶液(1 M)将RCDsT纳米复合物溶液的pH分别调节至6.8和7.4)孵育不同时间后,用Zetasizer Nano ZS90检测RCDsT的zeta电位。利用荧光共振能量转移(FRET)实验检测RCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物由弱酸引起的解离过程,其中供体荧光分子为Cy3-siRNA(λ ex/λ em = 550/570 nm),受体荧光分子为Cy5-RC(λ ex/λ em = 650/670 nm)。分别用HCl溶液(1 M)和NaOH溶液(1 M)将RCDsT纳米复合物溶液的pH分别调节至6.8和7.4。在550 nm和750 nm之间读取荧光光谱,激发波长为543 nm。在不同时间点分别评估了RCDsT纳米复合物在pH 7.4和6.8条件下的表面电势,如图2 a所示,起初,RCDsT纳米复合物的表面电势在pH 7.4和6.8的条件下均为负值。然而,在弱酸环境中RCDsT纳米复合物的表面电势随时间推移有明显的增加,并在20 min内变为正值,而在pH 7.4的条件下,RCDsT纳米复合物的表面电势能在1 h内保持负值。该结果表明RCDsT纳米复合物在弱酸性环境下具有快速反转电荷的能力。除此之外,利用FRET测定法来检测由Cy3-siRNA和Cy5-RC组成的RCDsT纳米复合物在弱酸条件下的解离情况。如图2 b所示,在pH 7.4时Cy5的荧光强度明显高于其在pH 6.8时的荧光强度,而在pH 6.8时有明显的Cy3荧光恢复。这一结果表明,在pH 7.4的条件下,Cy3和Cy5荧光对的间距足够小引发了FRET现象;而在pH 6.8的条件下,RC脱落导致RCDsT纳米复合物发生解离,从而无法引发FRET现象,印证了RCDsT纳米复合物在弱酸条件下具有反转电荷的能力。
实施例二
将RAW 264.7细胞接种至96孔板里,密度为2 × 104/孔,并用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。无血清新鲜培养基(pH 6.8或7.4)中,按0.2 μgsiRNA/孔的浓度加入含FAM-siRNA的RGDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物和RCDsT(w/w/w =40/5/1)纳米复合物。37 ℃下继续孵育4 h,用含肝素钠(20 U/mL)的PBS润洗3次,RIPA裂解液(100 µL/孔)裂解。分别用酶标仪(λ ex/λ em = 492/518 nm)和BCA试剂盒测定FAM-siRNA以及蛋白含量。细胞摄取效率用μg FAM-siRNA/mg protein来表示。
将RAW 264.7细胞接种至6孔板里,密度为4 × 105/孔,并用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。无血清新鲜培养基(pH 6.8或7.4)中,按2 μgsiRNA/孔的浓度加入含FAM-siRNA的RGDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物和RCDsT(w/w/w =40/5/1)纳米复合物。37 ℃下继续孵育4 h,用含肝素钠(20 U/mL)的PBS润洗3次收集细胞,流式细胞仪检测,未经纳米复合物处理的细胞作为空白对照组。基因沉默的效率与纳米复合物的细胞摄取及细胞动力学水平密切相关。因此通过流式细胞仪和荧光光谱仪定量检测RCDsT纳米复合物和RGDsT纳米复合物在pH 6.8和7.4条件下的细胞摄取量。两个实验结果一致且显示,pH 6.8条件下RCDsT纳米复合物被RAW 264.7细胞摄取的水平是pH 7.4条件下的5倍,而RGDsT纳米复合物在pH 7.4和6.8的条件下显示出相似的细胞摄取水平(图3 a-c)。结果表明,弱酸环境可以促使RC发生电荷反转并脱落,从而有助于siRNA被细胞摄取。
利用共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)观察RCDsT纳米复合物解离过程与DsT纳米复合物逃离内涵体/溶酶体情况。将RAW 264.7细胞接种至CLSM专用的小皿里,密度为1 × 104/孔,并用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。无血清新鲜培养基(pH 6.8或7.4)中,按0.5 μg siRNA/孔的浓度加入含FAM-siRNA及Cy5-RC的RCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物,含FAM-siRNA及Cy5-RG的RGDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物作为对照。37 ℃下孵育1 h,PBS润洗3次,明场下显微镜观察。CLSM直观地探究了RCDsT纳米复合物在细胞外弱酸响应的解离过程。如图4 a-b所示,当包含FAM-siRNA和Cy5-RC的RGDsT纳米复合物在pH 6.8的条件下与RAW 264.7细胞共孵育4 h后,FAM-siRNA的绿色荧光扩散到细胞质中,而Cy5-RC的红色荧光仍然位于细胞膜上。其他分组中,FAM-siRNA的绿色荧光和Cy5-RC(或Cy5-RG)的红色荧光在细胞膜上重叠。这些结果表明,弱酸环境可以促使RC发生电荷反转并脱落,从而有助于siRNA被细胞摄取,其他分组没有发生电荷反转现象,三元复合物保持完整,难以被细胞有效摄取。
利用CLSM观察DsT纳米复合物逃离内涵体/溶酶体情况。将RAW 264.7细胞接种至CLSM专用的小皿里,密度为1 × 104/孔,并用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。无血清新鲜培养基(pH 6.8)中,按0.5 μg siRNA/孔的浓度加入含FAM-siRNA的RCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物。37 ℃下孵育2和4 h,PBS润洗3次,Hoechst 33258(5 µg/mL)和Lysotracker Red(200 nM)先后染30 min和1 h,显微镜观察。通过CLSM进一步观察DsT二元纳米复合物被RAW 264.7细胞摄取后逃离内涵体/溶酶体的过程。如图5所示,细胞与RCDsT纳米复合物共孵育4 h 后,FAM-siRNA绿色荧光与内涵体/溶酶体红色荧光(Lysotracker Red)的共定位率由89.1%降至7.3%,说明两者有效分离且siRNA主要分布于细胞质中。这一结果表明DsT二元纳米复合物可以有效地逃离内涵体/溶酶体,将siRNA迅速地递送到细胞质内。
将RAW 264.7细胞接种至96孔板里,密度为2 × 104/孔,并用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。无血清新鲜培养基(pH 6.8)中,按0.1 μg siTNF-α/孔的浓度加入不同DPLL含量的RCDsT(RC/siTNF-α = 40/1,w/w)纳米复合物和DsT纳米复合物。37 ℃下孵育4 h后更换成新鲜的培养基继续孵育20 h并用MTT法检测各组细胞存活率。对RCDsT纳米复合物和DsT纳米复合物的生物相容性进行了评估。如图6所示,当两者与RAW264.7细胞共孵育20 h后,在DPLL浓度高达40 μg/mL时细胞存活率仍能维持在90%左右,表明DPLL具有良好的生物相容性,且RC的包裹有助于生物相容性的提高。
将RAW 264.7细胞接种至96孔板里,密度为2 × 104/孔,并用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。无血清新鲜培养基(pH 6.8)中,按0.1 μg siTNF-α/孔的浓度加入RGDsC(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物,RCDsC(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物,DsT(w/w = 5/1)纳米复合物和RCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物。37 ℃下孵育4 h后更换成新鲜的培养基继续孵育20 h。LPS(7.5 ng/mL)刺激5 h后,按ELISA试剂盒的使用说明测定细胞培养基中TNF-α的含量。其中以仅被LPS刺激而未经纳米复合物处理的细胞培养基中TNF-α细胞因子的含量为100%,计算各组沉默效率。利用real-time PCR实验检测TNF-αmRNA的基因沉默效率。按照同样的方法,在LPS刺激5 h 后,用Trizol试剂(1 mL)将细胞中的RNA提取出来,按PrimeScript RT试剂盒的使用说明将提取出来的RNA合成cDNA并按SYBRPremix Ex Taq试剂盒的使用说明检测合成的cDNA含量。其中以仅被LPS刺激而未经纳米复合物处理的细胞培养基中TNF-α mRNA的含量为100%,计算各组基因沉默效率。RCDsT纳米复合物在LPS诱导的RAW 264.7细胞中联合抗炎疗效及电荷反转能力对其抗炎疗效的影响,将在基因和蛋白层面进行充分研究。如图7 a所示,real-time PCR数据表明RCDsT纳米复合物的TNF-α mRNA沉默效率约为70%,优于RCDsC纳米复合物单一的RBP抗炎疗效(~20%)和DsT纳米复合物单一的siTNF-α抗炎疗效(~50%)。类似的结果在ELISA实验中得到验证,RCDsT纳米复合物能够有效地抑制TNF-α细胞因子的分泌(~75%),明显优于其余分组(图7 b)。这些结果表明,RCDsT纳米复合物能够有效地发挥RBP和siTNF-α在细胞内的抗炎效果,起到联合抗炎治疗的目的。
为了探究pH响应性对纳米复合物基因沉默效率的影响,将RAW 264.7细胞接种至96孔板里,密度为2 × 104/孔,并用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养24h。无血清新鲜培养基(pH 6.8或7.4)中,按0.1 μg siTNF-α/孔的浓度加入RGDsC(w/w/w =40/5/1)纳米复合物,RCDsC(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物,PCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物,RGDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物和RCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物。37 ℃下孵育4 h后更换成新鲜的培养基继续孵育20 h。LPS(7.5 ng/mL)刺激5 h后,按ELISA试剂盒的使用说明测定细胞培养基中TNF-α的含量,利用相同的方法计算各组沉默效率。利用ELISA评估了电荷反转能力对不同纳米复合物在LPS诱导的RAW 264.7细胞中抗炎效果的影响。如图8所示,RCDsC纳米复合物在pH 6.8的条件下的沉默效率约为20%,优于RGDsC(pH6.8和pH 7.4)和RCDsC(pH 7.4);PCDsT纳米复合物在pH 6.8的条件下的沉默效率约为50%,优于RGDsT(pH 6.8和pH 7.4)和PCDsT(pH 7.4),体现了具有电荷反转能力的纳米复合物能够提高其被细胞的摄取水平,从而介导了更高效的基因沉默。
实施例三
将含Cy3-siRNA的DsT(w/w = 5/1,2 μg Cy3-siRNA,20 μL)纳米复合物和RCDsT(w/w/w = 40/5/1,2 μg Cy3-siRNA,20 μL)纳米复合物分别与囊性纤维化患者痰液(3%,w/w,200 μL)充分混合,37 ℃下孵育30 min。随后将样品转移到CLSM专用的小皿中,显微镜观察,记录各组纳米粒子的布朗运动情况,记录时长为20 s,数据分析软件为Imaris。通过多粒子追踪技术(MPT)观察DsT纳米复合物和RCDsT纳米复合物在痰液中的布朗运动情况。如图9 a所示, DsT纳米复合物的布朗运动在痰液中受到严重阻碍,而RCDsT纳米复合物的布朗运动更为剧烈。均方位移(<MSD>)定量地表明,在粒子运动时间为10 s时,RCDsT粒子的<MSD>约为DsT粒子的1000倍(图9b)。此外,对视野中超过100个粒子进行分析,RCDsT粒子的有效扩散率(Deff)均高于DsT粒子的有效扩散率,排除了结果的特殊性(图9 c)。
将含Cy3-siRNA的DsT(w/w = 5/1,2 μg Cy3-siRNA,20 μL)纳米复合物和RCDsT(w/w/w = 40/5/1,2 μg Cy3-siRNA,20 μL)纳米复合物分别与不同浓度的粘蛋白溶液(0.1%,0.3%,0.5%,w/v,2 mL)充分混合,37 ℃下孵育30 min。1200 rpm的转速下离心2min,弃上清,PBS润洗2次,NaOH溶液(5 M,200 μL)处理沉淀10 min。酶标仪检测各组沉淀中的荧光强度(λ ex/λ em = 550/565 nm),其中以总Cy3-siRNA的荧光强度为100%,计算各组沉淀中的相对荧光强度。通过粘蛋白吸附实验探究了两者布朗运动能力差异的机理。如图10所示,在不同浓度的粘蛋白溶液中,RCDsT纳米复合物与粘蛋白发生聚沉的数量约占总数的30% ~ 45%,明显低于DsT纳米复合物(75% ~ 90%)。这一结果表明本发明中的三元复合物减少了纳米复合物被粘蛋白的吸附,最终提高了纳米复合物在粘液层中的渗透能力。
将Calu-3细胞接种至Transwells专用的小皿里(小皿底面积0.33 cm2,孔径3.0 μm,Corning,NY),密度为5 × 105/孔,并用含10% FBS的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞接种后的第4天弃去小皿上室培养基,同时在培育过程中将下室培养基及时更换成新鲜培养基,以此构建空气界面培育模型(AIC)。利用电阻仪测定上下室之间的跨上皮电阻值(TEER),当TEER值达到700 Ω•cm2(通常在14天之内)时,将含Cy3-siRNA的DsT(w/w =5/1,6 μg Cy3-siRNA,20 μL)纳米复合物和RCDsT(w/w/w = 40/5/1,6 μg Cy3-siRNA,20 μL)纳米复合物分别与含1% BSA的汉克平衡盐缓冲液(HBSS,200 μL)充分混合并加入至小皿上室中,同时在小皿下室中加入HBSS缓冲液(500 μL)。37 ℃下孵育6 h后,测定下室HBSS缓冲液中Cy3-siRNA的荧光强度,纳米复合物的粘液渗透能力用表观渗透系数(P app)表示,公式为P app = Q/Act,其中Q表示渗透的Cy3-siRNA(ng),A表示细胞单层的面积(cm2),c表示上室Cy3-siRNA的初始浓度(ng /cm3),t表示转运时间(s)。利用Calu-3细胞构建AIC模型,这一模型能够用于体外评估纳米复合物渗透粘液层的能力。纳米复合物的粘液层渗透能力可用P app表示。如图所示11,RCDsT纳米复合物的P app是DsT纳米复合物的7倍,表明RCDsT纳米复合物的跨粘液和跨上皮细胞的效率更高。
雄性Balb/c小鼠(~20 g)腹腔内注射戊巴比妥钠溶液(1%,w/v,150 μL),待小鼠完全麻醉后,将其固定在板上,用手术剪刀逐层剪开颈部皮肤,暴露气管,用注射器向气管内注射LPS溶液(1 mg/mL,50 μL),以此诱导ALI模型。诱导2 h后,按同样的方法分别注射含Cy3-siRNA的DsT(w/w = 5/1,10 μL)纳米复合物和RCDsT(w/w/w = 40/5/1,10 μL)纳米复合物,剂量为150 μg Cy3-siRNA/kg。给药1 h后将小鼠处死并收集肺组织,石蜡切片(10-μm)并将肺组织用含有5% BSA的PBS封闭1 h,室温下DAPI染色(用于细胞核染色)10 min,然后通过CLSM观察。通过CLSM实验,在LPS诱导的小鼠肺组织的主气管部位观察了DsT纳米复合物和RCDsT纳米复合物的粘液层渗透能力。如图12所示,DsT纳米复合物的Cy3-siRNA的红色荧光主要分布在杯状上皮细胞处,表明DsT纳米复合物被粘蛋白捕获于粘液层中难以渗透。相反,大多数RCDsT纳米复合物跨过了杯状上皮细胞,并分布在肺组织的较深区域。这些结果共同证实了RCDsT纳米复合物优异的粘液层渗透能力,为小鼠体内的抗炎治疗提供了保障。
实施例四
将雄性Balb/c小鼠(~20 g)随机分为七组,每组六只,按实施例三的方法诱导ALI模型。诱导2 h之后,按同样的方法注射PBS,DsT(w/w = 5/1)纳米复合物,PCDsT(w/w/w =40/5/1)纳米复合物,RCDsC(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物,RCDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物和RGDsT(w/w/w = 40/5/1)纳米复合物,剂量为150 μg siRNA/kg。其中未经LPS诱导且未经纳米复合物治疗的正常小鼠作为对照。给药22 h后收集肺组织,并进行所有测定。
(1)通过real-time PCR分析TNF-α mRNA表达水平。用Trizol试剂(1 mL)将获得的肺组织匀浆以收集所有RNA,并按照PrimeScript RT和SYBR Premix Ex Taq试剂盒的使用说明检测各组小鼠肺组织中TNF-α mRNA的含量。其中以PBS组的含量为100%,计算各组TNF-α mRNA沉默效率。
(2)通过ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6细胞因子的表达水平。用含有蛋白酶抑制剂的1 × 蛋白裂解液将肺组织匀浆,13000 rpm下离心10 min获得上清液。按照ELISA试剂盒的使用说明检测各组小鼠肺组织中TNF-α和IL-6细胞因子的含量。
(3)通过Western blot分析TNF-α细胞因子的表达水平。用含有蛋白酶抑制剂的1× 蛋白裂解液将获得的肺组织匀浆,13000 rpm下离心10 min获得上清液。BCA试剂盒统一各组蛋白总含量后,每组取样品(100 μg)加入10%十二烷基硫酸纳-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶的上样孔中,电泳后将蛋白质转移到PVDF膜上。含5% BSA的TBS封闭1 h,4 ℃下孵育一抗过夜。TBST充分洗涤后,二抗孵育1 h,最后用增强化学发光仪(Amersham PharmaciaBiotech)检测各组小鼠肺组织中TNF-α的含量。其中一抗为TNF-α小鼠单抗溶液(1:1000稀释,Abcam),二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG抗体溶液(1:500 稀释,Beyotime),内参蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
(4)小鼠处死前用生理盐水(1 mL)盥洗肺部,反复3次,并收集盥洗液,回收率约为70%。13000 rpm下离心10 min获得上清液。按照ELISA试剂盒的使用说明检测各组盥洗液中TNF-α和IL-6细胞因子的含量。按照BCA试剂盒的使用说明检测各组盥洗液中蛋白质含量。再利用PBS将所得盥洗液中的细胞重悬,并于显微镜下计数。
(5)给药22 h后收集肺组织,用含蛋白酶抑制剂的1 × 蛋白裂解液将肺组织匀浆,13000 rpm下离心10 min获得上清液。按照MPO试剂盒的使用说明检测各组小鼠肺组织中MPO的活性。
(6)将取出的肺组织置于铝箔纸上,滤纸吸去表面水分后称重,记为“湿重”;随后将肺组织置于80 ℃烘箱内烘烤72 h以充分除去肺组织内水分,称重记为“干重”。“湿重”与“干重”的比值即为肺组织湿/干重比。
(7)小鼠处死前从颈部取动脉血(1 mL),血气分析仪测定动脉血中氧气和二氧化碳分压及酸碱度。
(8)取出肺组织后将其浸泡在5%的福尔马林溶液中,石蜡切片(8-μm)后脱蜡,苏木素染色5 min,1%盐酸酒精分化,碱水返蓝20 s,尹红染色20 s,脱水,中性树胶封固,显微镜观察。
通过real-time PCR测定了LPS诱导的小鼠经过不同纳米复合物治疗后,肺组织中TNF-α mRNA的表达水平。如图13 a所示,PCDsT纳米复合物的基因沉默效率约为59%,优于DsT纳米复合物的基因沉默效率(~32%),与RGDsT纳米复合物的沉默效率(~47%)相比,RCDsT纳米复合物基因沉默效率(~80%)的优势主要得益于高效的细胞摄取水平。与此同时,RCDsT纳米复合物优于RCDsC纳米复合物单一的RBP抗炎疗效(~22%)和PCDsT纳米复合物单一的siTNF-α抗炎疗效(~59%)。这些结果证实了RCDsT纳米复合物具有优异的粘液层/细胞膜双重渗透能力,同时能联合递送RBP及siTNF-α,实现针对ALI的联合抗炎治疗。类似的结果通过ELISA和Western blot实验在蛋白层面得到了验证(图13b-d)。
髓过氧化物酶(MPO)是嗜中性粒细胞的功能指标,与中性粒细胞募集的程度相关,因此MPO的抑制将有益于改善炎症的级联反应。如图14所示,小鼠经LPS诱导后肺组织中MPO的活力约为200 U/L,RCDsT纳米复合物治疗后MPO活力值下降到约60 U/L,明显优于其他分组。
对灌洗液中的两种促炎性细胞因子(TNF-α和IL-6),蛋白质和细胞数量进行了全面的评估,以更好地评估ALI小鼠在经过纳米复合物治疗之后的肺组织恢复情况。如图15a-d所示,所有这些指标在LPS诱导后均显着增加,但在RCDsT纳米复合物处理后均显著降低。这些结果共同证明,由于RCDsT 纳米复合物能有效渗透粘液层,因此能够在气管内给药后实现有效的基因沉默,最终达到针对ALI的联合抗炎治疗。
评估了多种纳米复合物恢复肺部通气功能的能力。肺水肿是ALI的一个重要特征,可以通过湿/干重比表征水肿严重程度。通气障碍是ALI的另一致命后果,包括氧分压降低,二氧化碳分压升高和血液酸化。这些病理症状在LPS诱导的小鼠中清晰可见(图16 a-d),表明炎症引起的肺功能丧失和动脉氧合受损。但是,在RCDsT纳米复合物治疗后,肺组织的湿/干重比,pH,氧分压和二氧化碳分压等肺部指标几乎完全恢复到正常小鼠的水平,证明了RCDsT纳米复合物在恢复肺功能方面的能力。
使用H&E染色观察,从组织学角度进一步观察发现,经过RCDsT纳米复合物治疗后,ALI小鼠肺组织的间质性水肿,肺泡壁增厚和肺泡结构破坏等病理学变化均明显减轻(图16e)。
合成例
上述实施例涉及的物质合成如下。
合成N(ε)-benzyloxycarbonyl-L-lysine-N-carboxyanhydride单体(zLL-NCA)。将H-Lys(Z)-OH(0.84 g, 0.15 mol)和三光气(0.40 g, 0.10 mol)溶于THF(50 mL)中,50°C下搅拌直至溶液澄清。真空抽干溶剂后得到白色粉末,-20 °C下于乙酸乙酯/正己烷(v/v= 1/10)混合溶液中重结晶3次,得到zLL-NCA(1.06 g,产率86%)。
zLL-NCA的核磁(CDCl3,δ,ppm):7.33(m,5H,phenyl group),6.85(s,1H,-NH-),5.09(m,2H,-NHCOOCH 2 -),4.27(t,1H,-OCOCHCH2-),3.19(m,2H,-CH2CH2CH 2 NH-),1.37-2.00(m,6H,-NHCH2CH 2 CH2CH2-,-NHCH2CH2CH 2 CH2-和-NHCH2CH2CH2CH 2 -)。
DPLL的合成与表征
在手套箱中,将zLL-NCA(720 mg,2.35 mmol)溶于DMF(50 mL)中,将溶于DMF的G3-PAMAM溶液(20 mg/mL,250 μL,0.024 mmol)逐滴加入,室温下搅拌3 d。冰乙醚(60 mL)沉降、离心、抽真空后得到白色粉末。将得到的白色粉末溶于氢溴酸/醋酸(v/v = 2/1,4 mL)和TFA(200 mL)的混合溶液,室温下搅拌4 h。冰乙醚(60 mL)沉降、去离子水透析(MWCO =1000 Da)、冻干后得到白色粉末的DPLL(0.56 g,产率78%)。
DPLL的核磁(D2O,δ,ppm):4.28(t,1H,-COCHCH2-),2.98(m,2H,NH2CH 2 CH 2 CH2CH2-),1.42-1.76(m,6H,NH2CH2CH 2 CH2CH2-,NH2CH2CH2CH 2 CH2-和NH2CH2CH2CH2CH 2 -)。
RC和RG的合成
用NaOH溶液(1 M)将RBP溶液(20 mg/mL,2 mL,0.015 mmol赖氨酸残基)的pH调节至8.5。缓慢滴加顺式-乌头酸酐溶液(cis-aconitic anhydride,23.4 mg/mL,2 mL,RBP中赖氨酸残基的2个当量),并保持pH值,室温下搅拌12 h。NaOH溶液(pH 8-9)透析12 h(MWCO= 1000 Da),冻干后获得黄色粉末状的RC。将顺式-乌头酸酐溶液替换成戊二酸酐溶液(glutaric anhydride,17.1 mg/mL,2 mL,RBP中赖氨酸残基的2个当量),按相同的实验方法制备RG,并用作对照组。
参见图17 ,MALDI-TOF数据显示RC的分子量在pH 7.4的条件下为5378,5534,5690,5846和6002,表明每个RBP分子上成功接上7~11个顺式-乌头酸酐小分子,平均接枝率约为60%。与此类似的,RG的平均接枝率约为80%。
PLL的合成
在手套箱中,将zLL-NCA(720 mg,2.37 mmol)溶解在DMF(5 mL)中,将溶于DMF的六甲基二硅氮烷溶液(HMDS,0.1 mol/L,240 μL,0.024 mmol)逐滴加入,室温下搅拌3 d。冰乙醚(60 mL)沉降、离心、抽真空后得到白色粉末。将得到的白色粉末(630 mg)溶于氢溴酸/醋酸(v/v = 2/1,4 mL)和TFA(200 mL)的混合溶液,室温下搅拌4 h。冰乙醚(60 mL)沉降、去离子水透析(MWCO = 1000 Da)、冻干后得到白色固体poly-L-lysine(PLL,590 mg,产率82%)。
不具生物活性的电荷反转材料PLL-CA的合成
用NaOH溶液(1 M)将PLL溶液(10 mg/mL,2 mL,0.14 mmol)的pH调节至8.5。缓慢滴加顺式-乌头酸酐溶液(22 mg/mL,2 mL,0.28 mmol),并保持pH值。将混合物于室温下搅拌12 h。NaOH溶液(pH 8-9)透析12 h(MWCO = 1000 Da),冻干后获得白色粉末状的PLL-cis-aconitic amide(PLL-CA)。
本发明提供的肺部基因递送体系RCDsT保证纳米颗粒尺寸合适,减少纳米颗粒与粘蛋白的相互作用或屏蔽纳米颗粒表面的正电荷,从而保证纳米颗粒能够快速地渗透粘液层,因此具有高效克服粘液层和细胞膜屏障的能力,解决了现有技术存在的问题。在本发明中,利用三元复合纳米药物实现了纳米颗粒快速渗透粘液层,并保证了高效的基因转染,用于治疗ALI疾病。肺气道内注射RCDsT纳米复合物后,RCDsT纳米复合物可有效穿透粘液层,当它到达深处的巨噬细胞时,RC具有抗炎功能,外壳剥落后,带有siTNF-α的内部DsT二元纳米复合物被细胞有效地摄取,从而实现针对ALI的siTNF-α与RBP的联合抗炎治疗。简而言之,这项工作提供了解决粘液渗透和细胞摄取之间矛盾的另一种方法,为通过肺气道内直接给药的方式治疗ALI提供了一种能够实现短肽/siRNA共递送的新方法。
Claims (4)
1.肺部基因递送体系,其特征在于,所述肺部基因递送体系内层为装载药物的聚合物,外层为负电物质;聚合物的制备方法包括如下步骤,将G3-PAMAM溶液滴加入zLL-NCA溶液中,反应制备PzLL;再将PzLL溶于氢溴酸/醋酸、TFA的混合溶液,反应得到聚合物;所述负电物质由RBP与顺式-乌头酸酐制备得到;所述药物为核酸药物;所述RBP的氨基酸序列为KLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEC;负电物质、聚合物、核酸药物的质量比为(35~45)∶(4~6)∶1。
2.根据权利要求1所述肺部基因递送体系,其特征在于,核酸为TNF-α siRNA。
3.根据权利要求1所述肺部基因递送体系,其特征在于,聚合物溶液、药物溶液、负电物质溶液中,溶剂为pH为 7.3~7.5的DEPC水。
4.权利要求1所述肺部基因递送体系在制备肺气道给药治疗肺损伤药物中的应用。
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Hou et al. | Partially PEGylated dendrimer-entrapped gold nanoparticles: A promising nanoplatform for highly efficient DNA and siRNA delivery | |
Ma et al. | Oral nanotherapeutics based on Antheraea pernyi silk fibroin for synergistic treatment of ulcerative colitis | |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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