CN101053573A - 针对反义vegf寡核苷酸的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制细胞异常增殖或血管发生的组合物和方法。更具体地，本发明提供了能抑制癌细胞增殖或血管发生或其组合的VEGF反义寡核苷酸。本发明还提供了筛选和预后分析，以及包含VEGF反义寡核苷酸的试剂盒。

Description

针对反义VEGF寡核苷酸的方法和组合物
本申请是2001年1月19日提交的题为“针对反义VEGF寡核苷酸的方法和组合物”的中国专利申请01806795.6的分案申请。
1.发明领域
本发明涉及抑制血管发生和致瘤细胞的生长。本发明特别涉及血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸，其抑制VEGF的表达，及涉及应用这些反义寡核苷酸抑制癌细胞生长或血管发生的方法。
2.发明背景
VEGF首先是作为一种分子揭示的，其是一种分泌蛋白，能介导许多生物学进程。例如，VEGF在体外诱导内皮细胞的生长，及诱导内皮细胞的迁移；VEGF在模型系统中诱导新血管形成，如在小鸡绒毛尿囊膜和大鼠或兔角膜无血管区；而且VEGF在模型系统中诱导现有血管的通透性，如豚鼠皮肤血管。近来发现许多肿瘤细胞产生VEGF，而且这种分泌蛋白诱导局部血管产生更多的血管网(即血管发生)，以支持肿瘤生长和转移。
另外，抑制VEGF功能示出降低在免疫缺陷的小鼠中移植的肿瘤的生长潜力。
VEGF通过关联的酪氨酸激酶受体Flt-1/VEGFR-1和Flk-1/KDR/VEGFR-2发挥作用。Flt-1是一种中度亲和性受体，Flk-1/KDR是一种低亲和性受体。这两种受体的表达均使VEGF的同源二聚体与靶细胞高亲和性结合。然而内皮细胞增殖的信号转导只通过Flk-1/KDR发生。VEGF与其关联受体flt-1/VEGFR-1，fik-1/KDR/VEGFR-2和神经菌毛蛋白-1高亲和性结合(de Vries，C.等，(1992)科学255，989-91；Terman，B.I.等，(1992)Biochem Biophys ResCommun 187，1579-86；Soker，S.等，(1998)细胞92，735-45)。VEGFR-2与有丝分裂信号相关(Waltenberger，J.等，(1994)生物化学杂志269，26988-95)，而VEGFR-1参与细胞迁移(Barleon，B.等，(1996)血液87，3336-43；Clauss，M.等，(1996)生物化学杂志271，17629-34；Wang，D.等，(2000)生物化学杂志275，15905-15911)。诱导VEGFR-2在非内皮细胞类型的细胞系中表达与VEGF介导的促有丝分裂应答不相关(Takahashi，T.& Shibuya，M.(1997)Oneogenel4，2079-89)，这提示只有内皮细胞可以将促有丝分裂的VEGF信号运送到细胞核。
VEGF有4种不同的剪接变体。VEGF165和VEGF121是分泌蛋白。近来已经阐述了VEGF家族的4个其它成员。这些包括VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和胎盘衍生的生长因子(P1GF).P1GF与VEGF具有47％同源性，并与Flt-1结合为同源二聚体，或与VEGF结合为异源二聚体。VEGF-B是一个具有167个氨基酸的分泌蛋白，而且与VEGF和P1GF具有43％和30％同源性。也称为VEGF相关蛋白(VRP)的VEGF-C与VEGF和P1GF具有32％和27％同源性。其与Flt-4结合为同源二聚体，与Flk-1/KDR结合为VEGF异源二聚体。
VEGF也可以通过一些因子加以调节，包括组织缺氧(注意到在肿瘤深部由于缺氧VEGF表达提高)，细胞因子如IL-1和IL-6，激活一些致癌基因(Ras，Raf，Src)和丧失功能的p53突变及VonHippel Lindau基因(Enholm，B.等，(1997)致癌基因14，2475-83；Okajima，E.& Thorgeirsson，U.P.(2000)Biochem Biophys ResCommun 270，108-11；Mukhopadhyay，D.等，(1995)癌症研究55，6161-5；Mukhopadhyay，D.等，(1995)自然375，577-81；Rak，J.等，(1995)癌症研究55，4575-80；Siemeister，G.等，(1996)癌症研究56，2299-301)。
肿瘤或血清VEGF水平提高在许多情况中预示存活力低(Moriyama，M.等，(1997)Oral Oncol 33，369-74；Maeda，K.等，(1999)癌症86，566-71；Maeda，K.等，(1996)癌症77，858-63；Linderholm，B.等，(2000)Int J Cancer 89，51-62；Li，X.M.等，(1999)J Exp ClinCancer Res 18，511-7；Hida，Y.等(1999)，抗癌研究19，2257-60；Fine，B.A.等(2000)Gynecol Oncol 76，33-9；Aguayo，A.等(1999)血液94，3717-21；Crew，J.P.等(1997)癌症研究57，5281-5；El-Assal，O.N.等(1998)Hepatology 27，1554-62，Paradis，V.等(2000)Virchows Arch 436，351-6；Smith，B.D.等，J Clin Oncol 18，2046-52)。
血管发生是对局部刺激应答而从现有血管中萌发新血管的过程。主要包括释放血管生成因子，激活金属蛋白酶以破坏胞外基质，随后再重新塑造。VEGF在血管形成中是起决定作用的，例如在剔除小鼠中只丧失一个等位基因，导致胚胎死亡(Ferrara，N.等(1996)，自然380，439-42；Carmeliet，P.等(1996)，自然380，435-9)。同样，也论证了VEGF受体是在小鼠中通过基因剔除形成血管所必需的(Fong，G.H.等(1995)，自然376，66-70；Shalaby，F.等(1995)，自然376，62-6)。在肿瘤进展和转移中转变为血管发生表型是至关重要的(idler，I.J.& Ellis，L.M.(1994)，细胞79，185-8)。VEGF是几乎所有人体肿瘤中的关键因素(Dvorak，H.F.等(1995)，Am J Pathol 146，1029-39；Senger，D.R.等(1993)癌症转移Revl2，303-24)。VEGF受体在肿瘤血管内皮细胞中的高表达还证明了VEGF在肿瘤血管发生中的重要性(Chan，A.S.等(1998)Am J Surg Pathol 22，816-26；Leung，S.Y.等(1997)Am J Surg Pathol 21，941-50)。
VEGF在血管发生和致瘤性增殖中发挥作用的结果是非常需要能抑制VEGF的制剂。能抑制血管发生和/或致瘤性增殖的制剂，在治疗癌症或任何其它包含病理性血管发生或异常细胞增殖的疾病中具有巨大作用。
3.发明概述
本发明涉及抑制癌细胞或血管发生或其组合的组合物和方法。本发明特别涉及VEGF反义寡核苷酸及使用这种VEGF反义寡核苷酸抑制癌细胞增殖或血管发生或其组合的方法。本发明还涉及筛选和预测分析以及包含VEGF反义寡核苷酸的试剂盒。
本发明的一方面是提供了VEGF反义寡核苷酸和修饰的VEGF反义寡核苷酸，其抑制VEGF表达。
本发明的另一方面是提供了VEGF反义寡核苷酸和修饰的VEGF反义寡核苷酸，其抑制癌细胞增殖和/或血管发生。
本发明的再一方面是提供了使用这种VEGF反义寡核苷酸和修饰的VEGF反义寡核苷酸抑制VEGF表达的方法。
本发明的又一方面是提供了VEGF反义寡核苷酸和修饰的VEGF反义寡核苷酸，抑制癌细胞增殖和/或血管发生的方法。
本发明的另一方面是提供了一种在个体中抑制VEGF表达的方法，这是通过为其单独或与一或多种其它制剂组合施用VEGF反义寡核苷酸或修饰的VEGF反义寡核苷酸进行。
本发明的再一方面是提供了一种在个体中抑制血管发生或癌细胞增殖的方法，这是通过为其单独或与一或多种其它制剂组合施用VEGF反义寡核苷酸或修饰的VEGF反义寡核苷酸进行。
本发明的另一方面是提供了所述方法中使用的药物组合物。本发明的再一方面是提供了一种筛选VEGF的新抑制剂的方法，这种方法是使用呈现自泌VEGF生长活性的细胞(例如产生和利用VEGF为其自身生长的细胞系，如一些KS细胞系，卵巢细胞系，黑素瘤细胞系)。
本发明的另一方面是提供了一种针对患有表现为病理性血管发生的疾病和/或癌细胞增殖的个体的预后分析，这种分析是通过评价疾病组织中肿瘤的VEGF受体情况而预测的。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒或药物输送系统，其包含所述方法中使用的组合物。
4.附图简述
图1示出当与其它类型细胞如成纤维细胞，内皮细胞和血管平滑肌细胞相比时，KS细胞产生高水平的VEGF mRNA和蛋白质。(A)将等量的细胞用于提取总RNA，并对VEGF进行Northern印迹分析。另外，通过探查β-肌动蛋白(一种持家基因)的膜评价RNA的相对数量。(B)将等量的细胞生长于25cm2的培养瓶中，在24小时后收集上清，并通过ELISA测定VEGF水平。
图2例证了VEGF家族成员在KS和其它肿瘤细胞系中的表达。在KS细胞系中观测到VEGF表达，而在B细胞(23-2)和成纤维细胞系(T1)中无表达。VEGF成员的RT-PCR产物见于琼脂糖凝胶上。Kaposi′s肉瘤细胞系KSY-1和细胞系KS 6-3表达VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，和胎盘生长因子(P1GF)，相反，B淋巴瘤(23-2)和成纤维细胞(T1)细胞系不表达这些基因。
图3(A)示出KS细胞系和原发KS肿瘤表达VEGF受体(Flk-1/KDR and Flt-1)。对一些其它细胞系包括T细胞系，B细胞系和成纤维细胞系进行测试，无一具有任何VEGF受体表达迹象。正常的人内皮细胞(HUVEC)如所期望的作为阳性对照。将KS细胞和对照细胞生长于75cm2的培养瓶中直至接近铺满。将总细胞RNA溶解于硫氰酸胍中，合成cDNA。使用这两种VEGF受体的各个特异性引物对，扩增mRNA转录物并将产物在琼脂糖凝胶上解离。(B)通过表明在相同细胞系中持家基因(β-肌动蛋白)的水平证实mRNA的完整性。
图4表明Flt 4(VEGF-C受体)在KS，其它细胞系，及在来自同一患者的皮肤和KS皮损样品中的表达。这个图示出在琼脂糖凝胶上的RT-PCR产物。Kaposi′s肉瘤细胞系KSY1，KS6-3表达P1GF和Flt-4。相反，B淋巴瘤(23-2)和成纤维细胞(T1)细胞系不表达P1GF和Flt-4。相似的，Flt-4由KS肿瘤皮损表达，而来自同一患者的皮肤组织不表达其。
图5(A)示出许多类型的肿瘤包括结肠肿瘤(HT-29)，乳腺肿瘤(ZR-75)，胰腺肿瘤(panc)，卵巢肿瘤(ova-3)，和黑素瘤(A-375)表达VEGF-A和VEGF-C(图5A)，而其它VEGF家族成员的表达是不均一的(图5A和5B)。
图6示出VEGF对KS肿瘤细胞而言是一种自泌生长因子。将等量的细胞铺板并用不同浓度的AS1/Veglin-1(SEQ ID NO：1)，AS-3/Veglin-3(SEQ ID NO：2)或混杂的寡核苷酸(SEQ ID NO：30)处理。细胞数以一式三份实验的中间值表示。(B)示出用AS1/Veglin-1(SEQID NO：1)，AS-3/Veglin-3(SEQ ID NO：2)或混杂的寡核苷酸(SEQ IDNO：30)在一些不同类型的细胞进行的相同实验，包括KS细胞(KSC-10，KS-59)，人大动脉平滑肌细胞(AoSM)，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，成纤维细胞(T1)，B淋巴瘤细胞(23-1)，T淋巴瘤细胞系(HUT-78)。图6E示出外源性重组的VEGF对HUVEC或KS细胞增殖的作用。在第1天和第3天将重组的VEGF(R & D Systems，Minneapolis，MN)加入细胞中，并在第5天计数细胞。结果是一式三份实验的中间值。HUVEC示出细胞增殖以剂量依赖性提高，而KS细胞的应答明显生硬，可能是由于内源性产生的配体占据VEGF受体所致。图6F示出在KS细胞中通过AS-1/Veglin-1(SEQ ID NO：1)或AS-3/Veglin-3(SEQ ID NO：2)抑制内源性VEGF产生，使细胞对外源性VEGF敏感。将KS细胞用各种浓度SEQ ID NO：1或2单独处理，或用SEQ ID NO：1或2组合VEGF进行处理。结果是一式三份实验的中间值。
图7例证了VEGF反义寡核苷酸的特异性。将KS细胞用各种浓度的AS-1/Veglin-1(SEQ ID NO：1)(A)，AS-3/Veglin-3(SEQ ID NO：2)(B)，或混杂的寡核苷酸(SEQ ID NO：30)(C)处理。对VEGFmRNA(上部)或β-肌动蛋白(下部)进行RT-PCR。将经过各种扩增循环后(25-41次)的PCR产物在琼脂糖凝胶上解离。图7D示出AS-3/Veglin-3(SEQ ID NO：2)而不是混杂的寡核苷酸降低VEGF产生，而且这种作用是月龄依赖性的。将等量的KS细胞一式三份铺板于孔中，并用寡核苷酸处理。收集上清并通过ELISA(R & DSystems，Minneapolis，MN)分析VEGF水平。图7E示出在两种不同的卵巢癌细胞系中用所述寡核苷酸进行的细胞增殖试验(均用混杂的(SEQ ID NO：30)和反义寡核苷酸AS-1(SEQ ID NO：1)和AS-3(SEQ ID NO：2)进行试验)。这两种反义寡核苷酸均抑制卵巢癌细胞系的生长(Hey上组，Hoc-7下组)，而混杂的寡核苷酸无此作用。在黑素瘤细胞系中可以见到相似结果(图7F)，526在上组，A375在下组。这些细胞系因此表达VEGF受体并利用VEGF的自泌生长活性。
图8示出Veglin-1(SEQ ID NO：1)和Veglin-3(SEQ ID NO：2)在体内是活性的，以抑制KS肿瘤生长。将携带KS移植体的免疫缺陷小鼠用Veglin-1(SEQ ID NO：1)或Veglin-3(SEQ ID NO：2)或混杂的寡核苷酸处理，将每只小鼠在移植肿瘤后的第一天开始每天经腹膜内给予所述寡核苷酸，共5天。然后使肿瘤生长共14天。测定肿瘤大小。然后将动物处死并切除肿瘤进行再次测定。
图9例证了脂质体包被的Veglin-1(SEQ ID NO：1)和Veglin-3(SEQ ID NO：2)的作用。我们先前已经示出脂质体包被的药物比未包被的药物可以将更多量的药物输送至KS肿瘤细胞中。因此我们将混杂的寡核苷酸和Veglin-3(SEQ ID NO：2)用脂质体中包被，并处理在24孔平板中等密度种植的KS细胞。在第5天计数细胞，结果是一式三份试验的平均值±SE。脂质体包被的Veglin-3(SEQ ID NO：2)在比所需游离Veglin-3(SEQ ID NO：2)低50倍的剂量，使KS细胞生长抑制50％(IC50)。
图10示出VEGF是KS细胞存活的必需因子。用Veglin-1(SEQ IDNO：1)或Veglin-3(SEQ ID NO：2)阻断VEGF产生导致KS细胞中细胞死亡。将KS细胞以等密度种植于75cm2培养瓶中，血清饥饿24小时，并用Veglin-1(SEQ ID NO：1)或Veglin-3(SEQ ID NO：2)或混杂的寡核苷酸(SEQ ID NO：30)处理，通过检测小DNA片段的释放测定细胞死亡(一种称为细胞程序死亡的特异方法)。提取DNA并在琼脂糖凝胶上进行大小分级分离。
图11(A)例证了Flk-1和Flt-4抗体(单独及组合)对KS Y1细胞增殖的作用。Flk-1和Flt-4抗体购自Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA。将KS细胞以等密度铺板，并在第1天和第3天用各种浓度的抗体处理。在第5天计数细胞。结果是一式三份试验的中间值。图11(B)表明VEGF受体抗体(破坏VEGF自泌途径)诱导KS细胞的程序死亡。将KS细胞用各种浓度的VEGFR-2(Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)抗体处理48小时。将处理的细胞用荧光素缀合的膜联蛋白V和碘化丙锭，在室温在黑暗中温育15分钟，并通过流式细胞计量术分析。经历细胞程序死亡的细胞只用膜联蛋白V FITC实际染色。如上所示程序死亡的细胞示出细胞群移动到X轴的右侧。
图12例证了通过抗VEGFR2(Flk-1)抗体抑制KS肿瘤生长。将KS Y-1细胞(5×106)皮下接种于Balb/C Nu+/Nu+无胸腺小鼠的下背部。在肿瘤生长3天后，对一组4个小鼠每天腹膜内注射200μg Flk-1抗体共6天，并对4个小鼠的对照组只注射稀释剂。一周测定两次肿瘤体积共两周。
图13示出AS-3(SEQ ID NO：1)在体内对人黑素瘤细胞的作用。将人黑素瘤细胞皮下接种在Balb/C Nu+/Nu+无胸腺小鼠的下背部。测定接受混杂的寡核苷酸(SEQ ID NO：30)或反义寡核苷酸(SEQID NO：2)的对照鼠的肿瘤大小。
图14示出表1中用*表示的选择的反义寡核苷酸相对于VEGF-A基因序列的位置。*相对于表1中列出的那些寡核苷酸。各个SEQ IDNOS在括号左侧。括号右侧的数字是表示与反义分子互补的VEGF-165同种型序列。基因序列号根据Leung等(1989)所述进行，其中在翻译起始位点开始编号。排列对比了VEGF-A，-C和-D的序列，3/3匹配以黑体表示，2/3匹配以下划线表示。
图15示出VEGFR-2/KDR/flk-1和VEGFR-1/flt-1在各种肿瘤细胞系中的表达。图15(A)，将KS Y-1，M21，Hey，U937，HL-60和HuT78细胞用FITC标记的VEGFR-2抗体用所述方法温育，并通过流式细胞计量术分析。图15(B)，对Hoc-7卵巢癌细胞和A375黑素瘤细胞用VEGFR-1和VEGFR-2进行免疫细胞化学染色。就Hoc-7而言，褐色是信号，就A375而言，深红色是信号。在这两种情况中使用同种型特异性对照物没有信号，表明免疫染色的特异性。
图16示出VEGF翻译寡核苷酸特异性抑制VEGF。图16(A)，AS-3和突变体AS-ODNs对KS Y-1细胞在体外存活力的作用。将细胞以1×104个细胞/孔种植于24孔平板中，并在第1天和第3天用ODNs处理。在第5天通过MTT分析细胞存活力。结果是一式四份样品的平均值。图16(B)，AS-3和突变体AS-ODNs对VEGF和IL-8生产的作用。为进行这些实验，将细胞在2％FCS中培养。将细胞用各种浓度的寡核苷酸在0小时和16小时处理。在24小时收集上清，并使用ELISA试剂盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)分析VEGF和IL-8。结果是双份实验的中间值±SE。图16(C)，荧光素标记的ODNs在体外由KS Y-1细胞吸收。暴露于没有阳离子脂质或其它可通透剂的AS-3m，AS-3m突变体1和AS-3m突变体2(1μM)的KS Y-1细胞的相差和荧光素信号覆盖图。对照组是未处理的(无荧光的AS-ODN)。在每个样品中均有被AS-ODN吸收的细胞(绿色)和未吸收的细胞。细胞数示出在每个样品中荧光信号表现相似。当使用黑素瘤细胞系(M21)和卵巢细胞系(Hey)进行重复实验时，见到相同结果。结果因此非限于一个细胞系。
图17示出混合骨架寡核苷酸的VEGF反义寡核苷酸。图17(A)混合的骨架寡核苷酸的图式。示出的是人VEGF基因序列和互补的AS-3m序列。修饰的碱基的化学结构如下所示。图17(B)，VEGF家族成员的相应区域对比。最突出的碱基表示VEGF-B，-C，-D或P1GF和VEGF之间相同性。在这个区域中基因之间的同源性不高。图17(C)互补于AS-3m的人和小鼠VEGF基因的序列对比。在此所示小鼠序列是由Claffey及同事报道的序列的第288-308核苷酸(Claffey，K.P.等(1992)，生物化学杂志267，16317-2257)。相同性通过突出模块表示。
图18示出混合骨架的反义AS-3m抑制VEGF mRNA和蛋白质产生。图18(A)，从用各种浓度AS-3m处理的KS Y-1细胞中分离总RNA(NT＝未处理)。将总RNA逆转录以产生cDNA。将反应混合物等分以5次循环间隔除去，以提供半定量分析。基因特异性引物是针对VEGF，VEGF-B和P1GF的。对条带强度进行定量并示于图右侧。通过扩增β-肌动蛋白证实样品中RNA的完整性。图18(B)，AS-3m在两个肿瘤原性细胞系中对VEGF蛋白生产的作用，将人黑素瘤细胞系M21(左侧)和人卵巢癌细胞系Hey(右侧)用1-10μM范围浓度的VEGF反义AS-3m和混杂的MBO处理。在第48小时收集上清，并通过ELISA对VEGF蛋白定量。结果是两个单独的双份实验的平均值±标准误差。
图19示出混合的骨架反义AS-3m在体外抑制细胞增殖。将细胞以1×104个细胞/孔种植于24孔平板中，并在第1天和第3天用AS-3m(1，5，10μM)处理。图19(A)，在第5天通过MTT分析细胞存活力。结果是一式四份样品的平均值±SD。在混杂的ODN的任何细胞系中(右侧)没有明显的胞毒性示出AS-3 ODN的特异性。图19(B)，rhVEGF废除VEGF反义寡核苷酸的作用。将细胞系M21和Hey如上种植，并在第1天和第3天单独用1，5，10μM的AS-3或与rhVEGF(10ng/ml)组合处理。在72小时后测定细胞存活力。在这两个细胞系中AS-3抑制细胞增殖(黑色柱)可以通过存在VEGF(白色柱)而逆转，其对细胞的生长没有任何可评估作用(阴影柱)。数据是一式四份进行的两个实验的平均值±标准误差。
图20示出混合的骨架VEGF反义寡核苷酸在体内对肿瘤生长的作用。肿瘤异种移植物是通过在Balb/C/Nu+/NU+无胸腺小鼠的下背部皮下接种细胞系始发的，如方法章节中所述。图20(A)，在移植KSY-1(左侧)和M21(右侧)之后，口服施用AS-3m，混杂的(S)VEGF寡核苷酸和稀释剂(PBS)。剂量为10mg/kg/天，共14天。图20(B)，用AS-3m组合化疗(紫杉酚)处理建立5天的M21肿瘤异种移植物。从第5天开始每天经腹膜内注射AS-3m或PBS。在第5天和第12天腹膜内注射2.5mg/kg的紫杉酚。左侧实验组示出对单独的AS-3m剂量依赖性应答。右侧实验组示出组合处理的结果。一周测定三次肿瘤体积。最后的肿瘤称重在每个图中生长曲线的右侧示出。将小鼠在实验完成后处死。数据是每个小组中6只小鼠的平均值±标准误差。还使用了移植在无胸腺小鼠中的人卵巢癌细胞系(Hey)进行了实验。使肿瘤建立5天，之后用AS-3m开始处理，每天腹膜内注射10mg/kg。处理的小鼠的肿瘤体积(6只小鼠)比对照小鼠(6只)的肿瘤体积减小80％以上。
图21：用VEGF-AS3m处理的同位移植前列腺肿瘤的组织学和免疫细胞化学。H & E染色的PC3同位移植肿瘤切片的显微照片。图21(A)：上组示出前列腺和PC-3人前列腺肿瘤细胞在腺体内的生长。只用稀释剂(PBS)处理的对照小鼠示出大的肿瘤(*)，通过免疫细胞(箭头所指)密集的核染色(在低能量下)和在较高能量下肿瘤中的高有丝分裂率示出。VEGF-AS3处理的小鼠示出在前列腺内的小肿瘤结节(箭头所指)，表明在较高能量下免疫细胞的浸润。下面的方格示出用S100对树状细胞，NK1.1对NK细胞，Mac3对激活的巨噬细胞，穿孔素，粒酶B和IP-10的免疫染色。取自VEGF-AS3m处理的小鼠的肿瘤组织示出树状细胞，NK细胞和巨噬细胞的浸润。穿孔素，粒酶B和IP-10的表达在免疫细胞浸润区域最强，而在对照组中只见到IP-10表达。
5.发明详述
定义
术语“应答”是指肿瘤进展停止和/或肿瘤大小降低。例如，KS损伤进展停止。
术语“部分应答”是指肿瘤大小或荷载降低大约50％。例如，在KS中大约50％以上的损伤的完全平整持续4周或更长时间。
VEGF拮抗剂如VEGF反义寡核苷酸的“治疗有效量”，是指计算的在肿瘤中(如果应用于肿瘤)或血浆中(如果系统施用)达到和保持治疗效力水平的数量，以抑制癌细胞增殖和/或血管发生。例如，治疗量应足以抑制大约50％以上癌细胞在体外增殖，如KS细胞。当然，治疗剂量随着每种VEGF拮抗剂在抑制癌细胞在体外生长的能力，及VEGF拮抗剂在肿瘤组织和/或血浆中的清除和代谢率而变化。
术语“IC50”是指一种物质的浓度，其足以将测试参数(如细胞生长，肿瘤体积，VEGF蛋白表达等)抑制大约50％。
术语“拮抗剂”是指一种化合物，其阻止靶分子的合成，或结合靶分子的细胞受体，或是一种阻断靶分子功能的制剂。
术语“反义寡核苷酸”是指多核苷酸序列，其调节基因的表达。通常地，互补于基因转录产物(例如mRNA)的核酸序列称为是“反义”的，而具有与转录物相同序列的或产生转录物的核酸序列称为是“有义”的。所述反义化合物优选调节基因或蛋白质表达或削弱蛋白质功能。
术语“多核苷酸序列”是指一段核苷酸残基序列。本发明的多核苷酸组合物包括RNA，cDNA，基因组DNA，合成形式的聚合物和混合的聚合物的有义和反义链，而且可以是化学或生物化学修饰的，或可以含有非天然的或衍生的核苷酸残基，这易于为本领域技术人员所理解。这种修饰包括例如标记，甲基化，用类似物取代一或多个天然发生核苷酸，核苷酸内部修饰如无电荷键(例如甲基磷酸盐，磷酸三酯，磷酸酰胺，氨基甲酸盐等)，带电荷键(例如硫代磷酸酯，硫代二磷酸酯等)，未定组分(例如多肽)，嵌入剂(例如口丫啶，补骨酯素等)，鳌合剂，烷化剂，和修饰的连接(例如α端基异构氨基酸等)。还包括合成的分子，其模拟多核苷酸通过氢键和其它化学反应结合指定序列的能力。本领域已知这种分子，包括例如肽键取代分子骨架中的磷酸键。
术语“混杂的寡核苷酸”是指构建的匹配所述核酸含量的一种核酸序列，但不是一种特异性寡核苷酸序列。
术语“疾病或功能失调”是指包含细胞异常增殖的多种疾病，例如血管内皮细胞异常增殖。这种疾病包括但非限于增殖性视网膜病变(是血管增殖导致视力丧失的眼科疾病)，黄斑变性，胶原血管病，皮肤病如牛皮癣和天疱疮，糖尿病视网膜病变，良性肿瘤和癌症及癌前病变(如癌前病变细胞)。
术语“癌症”包括许多疾病，特征在于多种细胞非适当地增殖。例如包括但非限于卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，黑素瘤，Kaposi’s肉瘤，肺癌，结肠癌，肾癌，脑癌，肉瘤，宫颈癌，头部和颈部癌，脑肿瘤，如成神经胶质瘤(gliablastoma)，血管化的恶性肿瘤。
术语“个体‘是指任何动物，优选是哺乳动物，优选人。本发明也涵盖了兽医用途。
本发明一般性涉及施用VEGF反义寡核苷酸抑制癌细胞增殖或血管发生或这二者的组合物和方法。本发明证实了多种癌症(例如Kaposi’s肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌或黑素瘤)表现为自泌VEGF活性，而且施用VEGF特异性反义寡核苷酸抑制癌细胞增殖和肿瘤生长。本发明还提供了筛选和预测/诊断试验方法，以及包含VEGF反义寡核苷酸的试剂盒。
反义寡核苷酸
如本文所述，本发明提供了许多寡核苷酸序列，其特异性抑制VEGF蛋白的合成，并因此能阻断癌细胞增殖或肿瘤生长。在一个优选的实施方案中，这些寡核苷酸包括Veglin-1(AS-1)，其具有以下序列SEQ ID NO：1：5′-AGA CAG CAG AAA GTT CAT GGT-3′，及Veglin-3(AS-3)，其具有序列SEQ ID NO：2：5′-TGG CTT GAAGAT GTA CTC GAT-3′。在另一个优选的实施方案中，本发明的反义寡核苷酸具有序列SEQ ID NOS：9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，20，21，28和29。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸序列是经过各种方式修饰的，如混合骨架寡核苷酸，其既包含脱氧核苷酸又包含核糖核苷酸。例如Veglin-3(AS-3)(SEQ ID NO：2)可以是合成为混合骨架寡核苷酸(AS-3m)，具有以下序列：5′-UGGCTTGAAGATGTACTCGAU-3′(SEQ ID NO：34)。在混合的骨架中，黑体代表2’O-甲基核糖核苷酸。反义寡核苷酸还可以包含这种序列的截短的片段。也可以包括这些寡核苷酸的功能等价物。
通过靶VEGF多核苷酸的公布的核酸序列(例如Ferrara等，(1991)酶学方法198：391-405；Tischer等(1991)，生物化学杂志266：11947-540)，本领域技术人员可以不用进行过度试验，就可以鉴别其它抑制VEGF表达的反义核酸序列。例如，选择其它特异性定向人VEGF核酸的序列，可以基于其被RNAse H裂解的能力，或取代揭示的来自编码VEGF的核酸或其一部分的反义寡核苷酸结合的能力。这些寡核苷酸优选长度为至少大约14个核苷酸，更优选长度为15-28个核苷酸，最常用的是15-25个核苷酸。
这些寡核苷酸可以通过本领域已知方法制备，如亚磷酰胺或H-膦酸酯化学方法，这种方法可以手工或通过自动合成仪进行，如Uhlmann等所述(Chem.Rev.(1990)90：534-583)。所述寡核苷酸可以包含核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，或二者组合。
修饰的反义核酸序列也可以用于主题应用方法中。本发明的寡核苷酸也可以以多种方式修饰而不影响其与VEGF mRNA杂交的能力。所述反义寡核苷酸可以在序列中的任何位点修饰，例如寡核苷酸可以是全长序列修饰的，和/或在5’位或3’位和/或在选择的核苷酸修饰。优选的修饰包括但非限于促进核酸序列进入细胞的修饰，或保护核酸序列免受环境(例如核酸内切酶)影响的修饰。
另外，寡核苷酸可以修饰为在一个核苷酸的5’末端和另一个核苷酸的3’末端之间含有不同的膦酸二酯核苷酸间连键，其中5’核苷酸磷酸二酯键已经用任何数目的化学基团置换。这种化学基团例如包括膦酸烷基酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代磷酸烷基酯，氨基磷酸酯，磷酸酯，氨基甲酸盐，乙酰胺，羧甲基酯，碳酸盐，甲基磷酸酯，硼烷磷酸酯，α端基异构磷酸二酯和磷酸三酯。对糖组分的的其它修饰可包括N3′膦酸酯，2’O烷基RNA，和吗啉代亚磷酰胺。在一个优选的实施方案中，所述磷酸二酯键已经用硫代磷酸酯替换。具有这些键的寡核苷酸可以根据已知方法制备(见例如Uhlmann等(1990)Chem.Rev.90：543-583)。术语寡核苷酸还涵盖了具有完全独特骨架结构的异源聚合物，如聚酰胺核酸(Nielsen，P.E.(1999).Curr.Opin.Struct.Biol.9：353-7.)。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸修饰为由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成，其中一个核苷酸的5’末端和另一个核苷酸的3’末端共价连接，产生混合骨架寡核苷酸(例如美国专利Nos.：5652355；5264423，5652356，5591721所述)。混合骨架寡核苷酸可以是各种长度的，优选长度至少为大约14个核苷酸，更优选长度为15-28个核苷酸，最常用的是长度为15-25个核苷酸。混合骨架寡核苷酸可以是任意组合的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。例如，混合骨架寡核苷酸可以是在核糖核苷酸(例如大约2-4个)的两侧均包含一段连续的脱氧核苷酸序列(例如大约14-8个)。磷酸二酯键可以用任何数目的化学基团置换，例如用硫代磷酸酯置换。例如Veglin-3(AS-3)(SEQ ID NO：2)可以是合成为具有以下序列的混合骨架寡核苷酸(AS-3m)：5′-UGGCTTGAAGATGTACTCGAU-3′(SEQ IDNO：34)。本发明也涵盖了是5′-UGGCTTGAAGATGTACTCGAU-3′(SEQ ID No：34)的功能等价物的修饰的寡核苷酸。
本领域熟知制备这些和其它修饰的寡核苷酸的方法(参见Agrawal等(1992)，生物技术趋势10：152-158)。所述反义核酸序列可以在序列中的任何位点修饰，例如对核酸序列全长修饰，和/或在5’位置和/或3’位置进行修饰。例如，核苷酸可以使用已知方法共价连接，如氨基磷酸酯，H-膦酸酯化学方法，或甲基氨基磷酸酯化学方法(见例如Uhlmann等(1990)，Chem.Rev.90：543-584；Agrawal等(1987)，Tetrahedron Lett.28：(31)：3539-3542)；Caruthers等(1987)酶学方法154：287-313；美国专利No.5149798所述)。寡聚的硫代磷酸酯类似物可以使用本领域熟知的方法制备，如甲氧氨基磷酸酯方法(见例如Agrawal等(1988)，美国科学院院报85：7079-7083)或H-膦酸酯方法(见例如Froehler(1986)Tetrahedron Lett.27：5575-5578)。也可以使用Bergo等(J.Chromatog.(1992)559：35-42)所述的合成方法。本发明的寡核苷酸也可以具有修饰的糖，包括在2’位置悬垂的组分，和修饰的核碱基，包括propynyl修饰的碱基，以及具有适当特异性的其它非天然碱基。
优选的实施方案包括但非限于促进核酸序列进入癌细胞的修饰，或保护核酸序列免受细胞环境影响的修饰。这种修饰包括但非限于用硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，氨基磷酸酯，磷酸乙三酯，丁酰胺，piperazidate或morpholidate键取代磷酸二酯键，以增强所述核酸序列对核酶的抗性，用酰胺键置换核苷酸之间的磷酸酯键(例如肽核酸，其是附着于假肽骨架的核碱基)，掺入非天然发生的碱基，部分掺入或沿着核酸序列全长掺入(例如美国专利Nos.5,192,236；5,977,343；5,948,901；5,977,341所述，在此将其并入参考)，以增强对核酶的抗性或改良胞内吸收，或者在核酸序列中掺入疏水性取代物如胆固醇或芳香环或聚合物，以易于通过细胞膜(例如美国专利Nos.5,192,236；5,977,343；5,948,901；5,977,341所述，在此将其并入参考)。
通常地，是所述反义寡核苷酸的功能等价物的序列能抑制VEGF，这在以下的分析中加以论证。例如使用Kaposi′s肉瘤细胞系KSY-1(ATCC，#CRL-11448)，在细胞增殖中确定的反义寡核苷酸的IC50浓度在大约0.5-5.0μM之间，或在大约1.0-2.5μM之间，或在大约1.5-2.0μM之间，最优选少于或大约等于1.5μM(见实施例9和表1)。优选地，这种寡核苷酸衍生自261-281位编码区(Leung等，(1989)科学246：1306-1309)。修饰的反义寡核苷酸的特别优选的功能等价物是不用操纵(例如使用阳离子脂质，通透剂)而位于细胞核内。
所述反义核酸序列可以多种方式和通过与许多细胞产物相互作用而削弱基因的活性。例如包括但非限于由RNAse H催化的水解作用，形成三螺旋结构，与前信使RNA的内含子-外显子的接点相互作用，与胞质中的信使RNA杂交产生由RNAas H酶降解的RNA-DNA复合物，或通过阻断核糖体-mRNA复合物的形成及因此阻断翻译，或者产生自VEGF反义寡核苷酸的反义肽或蛋白质，抑制VEGF功能或调节其活性。
筛选试验
本发明还包括一种筛选试验，以确定一种候选试剂如VEGF反义寡核苷酸的治疗潜力，使用呈现自泌VEGF生长活性的细胞(例如产生和利用VEGF为其自身生长的细胞系，如KS细胞系，卵巢细胞系，黑素瘤细胞系)。可以使用各种参数以确定候选试剂的治疗潜力。例如包括但非限于抑制VEGF RNA蛋白，抑制VEGF活性，或抑制细胞增殖。本发明的筛选试验因此非常易于选择临床使用的抑制剂或组合治疗方法(例如临床试验)。本文所用术语抑制包括还原，降低或消失。
VEGF表达，活性或细胞增殖的抑制是候选试剂具有治疗潜力的标志。术语抑制包括VEGF表达，活性或细胞增殖的还原，降低，减弱或消失。确定候选试剂治疗潜力以抑制癌细胞增殖或血管发生的方法，可以包括：(i)将呈现自泌生长活性的细胞与至少一种候选试剂接触，及(ii)测定VEGF的表达和活性水平，或细胞生长水平，其中VEGF表达或细胞生长抑制表示所述候选试剂具有治疗潜力。VEGF表达或细胞生长抑制不仅表明候选试剂的治疗潜力，而且还表示可用于体内治疗的候选试剂的剂量范围。为确定VEGF水平是否是由候选试剂改变的，将细胞不暴露于候选试剂或任何其他适当对照物进行对比。
VEGF表达水平可以通过常规方法测定。例如VEGF RNA的表达水平可以通过Northern印迹分析，聚合酶链反应等测定(见例如Sambrook等编辑(1989)，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，Plainview，纽约；Ausubel等编辑(1987)，分子生物学通用方法，JohnWiley and Sons，纽约)。另外，VEGF蛋白的水平可以通过常规方法测定，包括但非限于Western印迹分析或ELISA(见例如Sambrook等编辑(1989)，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，Plainview，纽约；Ausubel等编辑(1987)，分子生物学通用方法，John Wiley andSons，纽约)。VEGF的活性可以通过本领域熟知的方法测定，例如利用VEGF中和抗体作对比。细胞增殖试验或细胞存活力试验也是本领域熟知的(Masood等(1997)，PNAS：94：979-984)。细胞增殖试验例如可见于实施例9。
细胞
任何呈现VEGF自泌生长因子活性的细胞(例如对本发明的VEGF反义抑制剂敏感的那些细胞系)，均可以用于筛选试验中。优选的细胞系是哺乳动物癌细胞，最优选的是人体癌细胞。可以使用的癌细胞系非限制性地例如包括Kaposi肉瘤细胞系，黑素瘤细胞系，胰腺癌细胞系，前列腺癌细胞系和卵巢癌细胞系。或者，用于这种方法中的细胞是原始培养的(例如从组织活检或尸检样品中培养的)。本领域技术人员熟知维持原始细胞培养物或培养的细胞系的方法。所需的细胞系通常是可以商购的(例如KSY-1(ATCC，#CRL-11448)。
为增强筛选使用的灵敏性，可以将细胞用包含编码VEGF受体的核酸序列的一种构建体转化，以产生表达较高水平VEGF受体的细胞。编码VEGF受体的核酸序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段，优选使用的编码序列足以影响VEGF受体活性。本领域已知VEGF的序列。适用于表达VEGF受体的载体是使用常规方法构建的(见例如Sambrook等编辑(1989)，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，Plainview，纽约；Ausubel等编辑(1987)，分子生物学通用方法，John Wiley and Sons，纽约)，或者是可以商购的。用表达构建体转化细胞的方法包括但非限于微注射，电穿孔，转导，转染，脂染磷酸钙颗粒轰击介导的基因转移，或直接注射核酸序列或其他本领域技术人员熟知的方法(见例如Sambrook等编辑(1989)，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，Plainview，纽约)。关于各种转化哺乳动物细胞的方法见Keown等，1990，酶学方法185：527-537所述)。本领域技术人员意识到就应用本发明的反义寡核苷酸而言，载体不是必需的。可以通过各种方法将反义寡核苷酸导入细胞中，优选癌细胞中，所述方法包括但非限于脂质体或脂染(Thierry，A.R.等(1993)，Biochem Biophys Res Commun 190：952-960；Steward，A.J.等(1996)，Biochem Pharm 51：461-469)和磷酸钙方法。
候选试剂
适于在有关应用方法中分析的候选试剂，可以是来自例如化学，营养学或生物学原料的任何形式的分子。所述候选试剂可以天然发生或合成产生的。例如，候选试剂可以涵盖多种化学类别，尽管典型地它们是有机分子，优选是具有分子量高于50少于2500道尔顿的小有机化合物。这种分子可包含与蛋白质或核酸结构性相互作用必需的功能基团。例如，化学制剂可以是新的未测试的化合物，兴奋剂，拮抗剂或已知治疗剂的修饰物。
所述制剂也可以在生物分子中发现，包括但非限于肽，糖，脂肪酸，抗体，类固醇，嘌呤，嘧啶，缀合毒素的细胞因子，其衍生物或结构类似物，或产生的模拟生物应答修饰剂作用的分子。来自营养物原料的制剂包括但非限于植物或动物原料提取物。优选的制剂包括反义寡核苷酸或抗体。
所述制剂可以得自多种原料，包括合成的或天然化合物的文库。或者，细菌，真菌，植物和动物提取物形式的天然化合物文库，是可以商购的或是易于产生的，天然或合成产生的文库或化合物易于通过常规化学，物理或生物化学方法形式，并可以用于产生组合的文库。已知的药学制剂可以进行随机或直接化学修饰，如酰化，烷化，酯化，酰胺化等，以产生结构类似物。
是VEGF拮抗剂的候选试剂可以通过各种方式抑制异常细胞增殖。例如，拮抗剂可以能抑制VEGF产生，或干扰VEGF与其关连受体结合，或干扰VEGF的生物学作用。也可以使用例如包括但非限于抗VEGF的抗体或其受体(例如(Flk-1/KDR和Flt-1)，结合VEGF离开细胞的可溶形式的VEGF受体，或抑制VEGF的信号进入细胞的制剂如蛋白激酶抑制剂等。
抗体
本发明还提供了多克隆和/或单克隆抗体，包括其片段和免疫学结合等价物，其能特异性结合特定基因的多核苷酸序列及其片段，以及其相应基因产物和片段。所述抗体的治疗潜力可以在本文所述的筛选方法中评价。通常地，本领域熟知制备多克隆和单克隆抗体以及能产生所需抗体的杂交瘤的方法(Campbell，1984；Kohler和Milstein，1975)。这些方法包括例如trioma方法和人体B细胞杂交瘤方法(Kozbor，1983；Cole，1985)。
可以用免疫原性组合物免疫接种已知产生抗体的任何动物(小鼠，兔等)。本领域熟知免疫接种方法，包括皮下或腹膜内注射所述免疫原。本领域技术人员意识到用于免疫接种的由本发明的核酸编码的蛋白质的数量，基于免疫接种的动物，免疫原的抗原性和注射位置而变化。用作免疫原的蛋白质可以是修饰的或在佐剂中施用一提高其抗原性。本领域熟知提高抗原性的方法，包括但非限于将所述抗原与异源蛋白质(如球蛋白，β-半乳糖苷酶，KLH等)偶联，或在免疫接种期间将其包含于佐剂中。
针对单克隆抗体，取免疫动物的脾细胞，与骨髓瘤细胞如SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞融合，使其成为产生杂交瘤细胞的单克隆抗体。可以使用本领域熟知的任一种方法鉴别产生具有所需特性的抗体的杂交瘤细胞。这些方法包括用酶联免疫吸附测定(ELISA)，western印迹分析，或放射自显影术(RIA)(Lutz，1988)筛选杂交瘤。将分泌所需抗体的杂交瘤克隆，并可以使用本领域已知方法测定免疫球蛋白类别和亚类(Campbell，1984)。
所述产生单链抗体的方法(美国专利No.4,946,778)可以适用于产生本发明蛋白质的单链抗体。针对多克隆抗体，从免疫动物中分离含有抗体的抗血清，并使用上述的一种方法筛选具有所需特异性抗体的存在情况。
在本发明中，上述抗体以标记的形式使用以可以进行检测。抗体可以例如通过使用放射性同位素，亲和标记(如生物素，抗生物素蛋白等)，酶标记(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)，荧光标记(如荧光素或罗丹明等)，顺磁性原子等碱性标记。本领域熟知完成这种标记的步骤，例如见Sternberger，1970；Bayer，1979；Engval，1972；Goding，1976。然后本发明的标记抗体可以用于体外，体内和原位分析，以鉴别表达相应多肽片段的细胞或组织。优选的免疫分析是本领域已知的各种类型的ELISA和RIA(Garvey，1977)。所述抗体自身也可以直接用于治疗或作为诊断试剂。
预后分析
本发明还提供了一种预后分析，可以预后患有包含异常细胞增殖(例如癌症)或血管发生的疾病的患者。这个预后方法包括：(i)从患有包含异常细胞增殖(例如癌症)或血管发生的疾病的患者中分离一种生物学样品；(ii)评价所述样品的自分泌VEGF活性，VEGF和VEGF受体在所述样品上的表达，其中自分泌活性是所述患者预后不好的标示。自分泌VEGF活性，VEGF和VEGF受体的表达，可以如实施例所述确定。
在这个分析中可以使用的生物学样品包括但非限于活检组织(例如用针抽吸的皮肤样品等)，初级培养物，或病理标本。这个预后方法可用于患有包含异常细胞增殖(例如癌症)或血管发生的疾病的患者。例如，所述疾病可以是Karposi′s肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌或黑素瘤。这个分析提供的信息为医生提供了其它治疗参数，用于选择针对患者的治疗方案。
动物模型系统
所述反义寡核苷酸可以首先在动物模型中评价。确定所述组合物和治疗方法的安全性，是通过观察对治疗动物的一般状况(体重变化，发热，食欲情况等)的治疗作用，监测一般性毒性，电解质，肾和肝功能，血液学参数和功能测定进行的。病理学变化可以在尸检的基础上进行。
可以使用任何基于动物的模型系统(例如重组和非重组的)，确定VEGF反义寡核苷酸的体内效力，及提供有效的剂量范围。例如，通过在KS，黑素瘤和前列腺和卵巢癌的小鼠模型中进行体内实验，证实本发明的反义寡核苷酸用于治疗各种癌症的能力(见实施例1和15)。对植入免疫缺陷小鼠的肿瘤只短期治疗，并在另外一些时期研究肿瘤的生长情况。所述反义寡核苷酸在体内阻断肿瘤生长。
疾病
VEGF反义寡核苷酸或其等价物可以用于抑制异常细胞增殖。所述VEGF反义寡核苷酸因此在许多疾病中具有治疗用途，所述疾病包括但非限于包含细胞异常增殖的疾病，如细胞如血管内皮异常增殖(例如病理性血管发生或新血管化)。这种疾病包括但非限于增殖性视网膜病变(血管增殖导致视力丧失的眼部疾病)，黄斑变性，胶原血管病变，皮肤病如牛皮癣，天疱疮，糖尿病视网膜病变，癌症和癌前病变。可以通过施用所述反义寡核苷酸治疗的癌症例如包括但非限于卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，黑素瘤，Kaposi’s肉瘤，肺癌，结肠癌，肾癌，脑癌或肉瘤。
为个体施用所述反义寡核苷酸可以改善，减轻或消除细胞的异常增殖。因此，例如，在患有癌症的个体中，治疗性施用一或多种所述反义寡核苷酸可以削弱或减轻癌症或促进癌症衰退。本发明还涵盖了在出现临床迹象之前，为个体施用反义寡核苷酸。这种个体包括但非限于具有家族性疾病史如癌症的个体，携带缺失性基因突变的个体或具有疾病再发危险的个体。
以下提供的是可以用所述组合物和方法治疗的非限制性癌症实例。
Kaposi′s肉瘤
KS细胞表达VEGF家族的所有成员，以及VEGF和VEGF-C(Flt-4)的受体。Kaposi′s肉瘤(KS)是在HIV-1感染的患者中最常见的肿瘤(Lifson等，1990；Reynolds，P.等，1993)。KS通过连累皮肤和内脏器官导致明显的发病率和死亡率。虽然未知病原学因素(如果有的话)，但是已经获得了关于调节肿瘤细胞生长的基本知识(Reynolds等，1993)。Kaposi′s肉瘤最通常以皮肤损害形式出现(Lifson等，1990)。其次这种基本最常累及粘膜(口腔粘膜)，发生在上腭和牙龈，并可导致牙齿脱落，疼痛和溃疡。KS通常累及淋巴结。然而，由于缺乏常规的淋巴结活检组织，因此未知精确的发生次数。
通常发生内脏累及(将近50％)，尤其是进展性疾病患者(Laine，L.等，1987)。进展性胃肠道(GI)KS可以导致肠下垂，腹泻，出血，肠梗阻及死亡。累及肺部是常见的，而且明显的肺部KS发生率为接近20％(Laine等，1987；Gill，P.S.等，1989)。症状可以是无症状到干咳，劳力性呼吸困难，咳血，和胸痛。肺功能研究示出不同程度的缺氧。具有肺部症状KS的患者的存活时间少于6个月(Gill等，1989)。皮肤，肺和胃肠道是这种疾病的常见病位，几乎每个器官均可被KS累及，包括肝，脾，胰腺，网膜，心，心包等。
已经广泛进行了阐述KS起源细胞的表型研究。KS纺锤状细胞表达间充质细胞的表型特点，并呈现内皮细胞，血管平滑肌细胞和皮肤树状细胞的一些标记。呈现的内皮细胞标记包括Ulex europeaus凝集素-1(UEA-1)，CD34，EN-4，和PAL-E。在人体脐静脉内皮细胞(HUVEC)，AIDS-KS细胞和转分化的HUVEC中一些因子标记的表达，是通过组织化学和RT-PCR信使分析IL-6，IL-8，GM-CSF，TGF-P等的表达而证实的。
分离AIDS-KS纺锤状细胞可以确定由肿瘤细胞分泌的因子，及其对肿瘤细胞自身的作用。IL-1β和IL-6均是由肿瘤细胞产生的。另外，通过阻断其与关连受体(IL-1受体拮抗剂，可溶的IL-1受体)的结合，或通过反义寡核苷酸抑制基因表达(针对IL-6)，而抑制其作用可以抑制肿瘤细胞生长。更重要地，IL-1和IL-6均诱导VEGF表达。因此这些因子的内源性产生部分与KS细胞高水平产生VEGF相关。
KS的特点是血管结构异常及增强增殖。针对在体外增强内皮细胞增殖和迁移的能力，已经分离了各种各样的血管发生因子。对AIDS-KS细胞进行的分析表明了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮细胞生长因子的表达。(VEGF)。后者是一种分泌分子，具有诱导毛细血管通透性的能力，这是AIDS-KS亚单位的一个显著特点。抑制VEGF表达在KS中具有治疗效力。另外，分离VEGF家族的一些成员揭示VEGF功能有丰余和调制。因此可以推测单独抑制VEGF可以作为治疗方案抑制肿瘤生长，而抑制这个家族的一些或全部成员可以是更有效的。
处理AIDS相关的Kaposi′s肉瘤只是治标。局部的KS可以用局部治疗方法处理，包括放射治疗。放疗产生局部毒性并具有累及剂量限制毒性。表面处理局部疾病的其他选项包括冷冻疗法，光力学治疗，内损毁性长春花碱，内损毁性硬化剂，所有这些均产生局部毒性或色素沉着，其有时比损毁更严重。具有疼痛，水肿和溃疡等局部并发症的进展性KS和有内脏症状的KS，需要产生快速应答的治疗。全身性胞毒性化疗是产生快速应答的唯一治疗形式。然而，应答的发生次数依赖于制剂，剂量和时间。对治疗的应答在25％-50％以上。最活性的制剂包括长春花生物碱(长春花新碱，长春花碱)，表鬼臼毒吡喃葡糖苷，anthracyclines和博来霉素。组合治疗比单一制剂治疗更有效。然而，由于累积毒性，多数胞毒剂不能长时期施用。用胞毒性化疗进行治疗是治标方处理，而且几乎所有的患者在中止治疗的几周内复发。
体外研究已经示出KS细胞高水平表达VEGF。另外，VEGF受体(Flt-1和KDR)示出在KS细胞系中表达。另外，将VEGF加入KS细胞中示出增强KS细胞生长，虽然没有在内皮细胞中见到的结果明显。这些发现首次示出KS细胞表达功能VEGF受体，而且VEGF作为KS的生长因子。这首次表明了任何类型肿瘤细胞均使用VEGF为其自身生长。在VEGF在KS细胞中的表达使用新的反义寡核苷酸(Veglin-1(SEQ ID NO：1)和Veglin-3(SEQ ID NO：2))阻断后，论证了VEGF的作用。这些发现表明在正常条件下，由肿瘤细胞产生的VEGF结合VEGF受体并保持细胞增殖。另外示出由新的反义寡核苷酸(例如SEQ ID NOS：1和2)阻断VEGF产生导致细胞死亡，表明VEGF不仅是肿瘤细胞生长所需的，也是KS细胞存活所需的。这些发现然后在原始肿瘤组织中证实，其示出VEGF和VEGF受体在肿瘤中表达，而正常相邻组织活检未示出VEGF或VEGF受体的表达。
本发明还提供了在治疗剂量抑制VEGF而治疗Kaposi′s肉瘤的复发。特别地，本发明表明KS可以减轻，而且肿瘤生长和播散可以使用特异性VEGF抑制剂(反义寡核苷酸)阻断。本发明还阐述了非肠道施用在脂质体中包被的反义VEGF抑制剂。
卵巢癌
卵巢癌可以分成3中主要实体：上皮癌，生殖细胞肿瘤和基质癌。大约90％的卵巢癌是上皮癌，绝大多数是在绝经期后的妇女中诊断的(Parker等，1996)。卵巢上皮癌通常只是在这种疾病的晚期阶段检测的(III或IV期)。卵巢癌的肿瘤进展的常规途径是通过腹膜扩散，而且腹部液体中中有或无恶性肿瘤细胞经常发生腹水的进展性积聚。已经报道卵巢癌表达VEGF mRNA和VEGF蛋白(Abu-Jaedeh等，1996；Yamamoto S.等，1997)。已知VEGF是由各种上皮源的固体肿瘤产生的，并认为参与微血管的血管发生。在近来的研究中，Yamamoto及其同事发现强VEGF表达在卵巢癌的肿瘤进展中起重要作用(Yamamoto S.等，1997)。
胰腺癌
胰腺癌是导致死于癌症的第五位因素。在检测时期，胰腺癌通常播散超过手术治疗。另外，其他治疗如放疗或化疗的作用有限。患有胰腺癌的患者绝大多数在诊断后3-6月内死亡。因此其他治疗方案包括抑制VEGF是有应用价值的。
黑素瘤
恶性黑素瘤属于影响范围和死亡率逐年提高的少数几个癌症之一。恶性黑素瘤可以认为是细胞分化和增殖失调。正常成人黑素细胞源自黑素细胞前体，其在达到最终细胞分化阶段之前经历一系列分化过程(Houghton等，1982；Houghton等，1987)。
许多生长因子如EGF(Singletary等，1987)，NGF(Puma等，1983)，TGF(Derynk R等，1987)，PDGF(Westermark等，1986)和FGF(Moscateli等，1986)，已经示出在体外调节黑素瘤的生物学活性，而且还认为在动物模型中对肿瘤转化和进展有作用。这些生长因子的临床重要性还未确定。VEGF和VEGF实体表达已经在两个黑素瘤细胞系(WW94和SW1614)中检测到，但关于人体组织的数据还未获得。
前列腺癌
前列腺癌在50岁以上的男性中是最常见的癌症形式，这种疾病在手术或放疗失败后没有其他的治疗方法。这种肿瘤是由睾丸激素及其代谢物调节的。在肿瘤组织中VEGF水平提高。睾丸激素诱导VEGF表达并因此可以通过诱导VEGF而部分调节前列腺癌。因此可以特别单独抑制VEGF或与其他治疗方法组合使用。
有效量
施用于需要治疗的个体的所述反义寡核苷酸或其功能等价物的有效量或治疗有效量，可以通过各种方式确定。例如，施用的反义寡核苷酸可以基于其抑制培养的癌细胞生长的效力加以选择，对所述癌细胞而言，VEGF是一种自泌生长因子。这种细胞系例如包括但非限于Kaposi′s肉瘤细胞系和卵巢癌，影响癌，前列腺癌，和黑素瘤细胞系。例如，所述寡核苷酸在IC50浓度能抑制Kaposi′s肉瘤细胞增殖，所述浓度在大约0.1-100μM，或在大约0.2-50μM，最优选在大约0.5-2.5μM或大约1-5μM，或大约1.5-2.0μM之间，更优选的是少于大约1.5微摩尔(μM)。测定能抑制Kaposi’s肉瘤细胞系增殖的所述反义寡核苷酸的浓度的方法，见于施用KS细胞的实施例3和9中所述方法。
除了抑制培养细胞如Kaposi’s细胞之外，反义寡核苷酸的有效浓度可以通过各种方法确定。这种分析可以校准相当于例如表1提供的数据。其他可以使用的适当分析是确定所述反义寡核苷酸对细胞中mRNA水平的作用，如实施例10所述。在一个实施方案中，反义寡核苷酸能降低一或多种形式VEGF的mRNA水平，降低1.5或更多倍。在另一个实施方案中，所述反义寡核苷酸能降低两或多种形式VEGF的mRNA水平，降低大约二倍或更多。
例如，可以使用的适当有效剂量的一般范围是大约0.5-10μM之间的血清浓度。每天的剂量可以是以单一剂量施用，或分为几部分在一天的不同小时施用。最初，需要较高剂量而且当获得最佳初始应答时，可以随着时间流逝而降低。例如，治疗可以持续几天，几周或几年，或者可以间隔一段时间再进行处理。所用剂量可以根据个体接受的其他治疗而修改。然而，所述治疗方法非限制所述反义寡核苷酸或其功能等价物的特定浓度或范围，并且可以每个治疗的个体及使用的每种衍生物而变化。
本领域技术人员意识到施用剂量需要个体化，以达到为给定的个体提供最大作用。本领域技术人员进一步意识到施用于治疗个体的剂量可以根据个体年龄，疾病的程度和阶段，及对治疗疗程的反应而变化。本领域技术人员通过本文所述方法可以得知评价确定治疗个体的正确剂量的临床参数。评价剂量确定的临床参数包括但非限于肿瘤大小，用于临床测试特定恶性肿瘤的肿瘤标记物水平改变。基于这些参数，治疗人员可以确定用于给定个体的反义寡核苷酸或其功能等价物的治疗有效量。这种治疗可以根据需要随时施用，并可以由治疗人员根据需要判断持续时间。
虽然包含所述反义寡核苷酸或其功能等价物的组合物以纯化或基本纯化方式施用是可能的，但是优选是以药物组合物，配方或制品形式的。
药物组合物
本发明的配方既用于兽类又用于人体，其包含上述一或多种反义寡核苷酸或其功能等价物，和一或多种药物适当载体，及任选的其他活性剂或治疗成分。所述载体必须是“适当的”是指与配方中的其他成分相容及对其受体无害。所述载体的特性依赖于施用途径。除了所述一或多种反义寡核苷酸和载体之外，这种组合物还可以含有稀释剂，充填剂，盐，缓冲液，稳定剂，增溶剂，和本领域已知的其它物质。这种配方可以通过药学领域熟知的任何方法制备。
本发明的药物组合物也可以含有其它活性因子和/或活性剂，其加强抑制VEGF表达或降低新血管化。例如，合成的寡核苷酸组合(其中每一种针对VEGF mRNA的不同区域)，可以用于本发明的药物组合物中。本发明的药物组合物还可以进一步含有其它活性剂如核苷酸类似物如叠氮胸苷，二脱氧胞苷，二脱氧肌苷等或紫杉醇或Raloxifene等。这种其它的因子和/或制剂可以包含于所述药物组合物中，以与本发明的合成的寡核苷酸产生协同作用，或者使由本发明的合成的寡核苷酸引起的副作用最小化。相反，本发明的合成的寡核苷酸可以包含于特定的抗VEGF或抗新血管化因子和/或制剂的配方中，以使抗VEGF因子和/或制剂的副作用最小化。或者，本发明所述的方法和组合物可以用作辅助治疗。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物可以是脂质体形式，其中本发明的合成的寡核苷酸除了其它药物适当的载体之外，还与两亲性制剂如脂质组合，其以水溶液中的微囊，不溶的单层，液体结晶，或薄层等的积聚体形式存在。脂质体配方的适当脂质包括但非限于甘油一酸酯，甘油二酯，硫苷脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂角苷，胆酸等。一种特别有用的脂质载体是Lipofectin。这种脂质体配方的制备在本领域技术水平内，例如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，美国专利Nos.4235871，4501728，4837028；脂质体教材，Marc J.Ostro编辑，第一章，纽约Marcel Dekker公司(1983)，和Hope等，Chem.Phys.Lip.40：89(1986)所述，所有这些文献均并入参考。
本发明的药物组合物还可以包括这样的化合物如环式糊精等，其增强寡核苷酸输送入细胞中，如Zhao等所述(Zhao Q，TemsamaniJ，Agrawal S(1995)使用环式糊精及其衍生物作为寡核苷酸输送的载体，Antisense Res.Dev.5(3)：185-92)，或者本发明的组合物还可以包括慢释放聚合物。
所述反义寡核苷酸可以配制为本发明的水溶液组合物，包含一种有效量的所述反义寡核苷酸，单独或组合另一种制剂(例如但非限于化疗剂)。这种组合物通常溶解或分散于药物适当载体或水相培养基中。
本发明的反义寡核苷酸可以针对非肠道使用而配制，例如通过静脉内，肌内，皮下，肿瘤内或腹膜内途径进行注射。根据本发明揭示，本领域技术人员将得知制备只含有反义寡核苷酸或组合其它活性成分的水相组合物的方法。典型地，这种组合物可以制备为可注射的如液体溶液或悬浮液。也可以制备在注射之前可以通过加入液体而配制为溶液或悬浮液的固体形式以及乳状液。
当需要口服制品时，所述成分可以与典型的载体组合，如乳糖，蔗糖，淀粉，滑石硬脂酸镁，晶体纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素，甘油，藻酸钠，或阿拉伯树胶等。
在一些情况中，本发明的配方还可以以适于局部施用的形式制备，如乳液或洗剂。这些形式可以用于治疗与皮肤相关的疾病如各种肉瘤。
可以使用另外的药物学方法控制作用时间。控制释放制品可以通过使用复合或吸附蛋白质或其衍生物的聚合物获得。可以例如通过选择本领域已知的适当大分子，单独将一或多种反义寡核苷酸或组合其它活性成分掺入聚合物颗粒中(例如聚脂，聚氨基酸等)，或将这些物质包载于通过凝聚方法或界面聚合制备的微囊中进行控制释放。
优选的配方是非肠道施用的水相乳液。脂质体或脂质乳液是另一种优选的方法，以增强活性。确信口服配方可以延期施用。
施用途径
在配方的基础上，溶液可以以与剂量配方相容的方式及以治疗有效量和各种剂量方式施用。有效浓度的这种反义构建体或寡核苷酸可以口服，局部，眼内，非肠道，鼻内，静脉内，肌内，皮下或通过任何其它有效方式施用。另外，可以将有效量的一或多种寡核苷酸通过针管直接注射。
所述配方易于以如上述可注射溶液形式施用，甚至也可以以药物释放胶囊等形式施用。针对以水溶液进行非肠道施用而言，例如所述溶液应是适当缓冲的(如果需要)，而且所述液态稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特殊的水溶液尤其适于静脉内，肌内，皮下，腹膜内，口服，颅内，脑脊液，胸膜腔，occular或局部(皮肤洗剂)施用。在这种情况下，可以应用的无菌水相基质根据本发明的揭示是为本领域技术人员所知的。
通过本发明所述的方法配制的反义寡核苷酸，可以通过各种方法输送于靶癌细胞或特征在于非适当细胞增殖的任何细胞。例如包括但非限于将本发明反义核酸导入表达载体如质粒或病毒表达载体中。这种构建体可以导入细胞优选癌细胞中，通过磷酸钙转染，脂质体(例如LIPOFECTIN)介导转染，DEAE Dextran介导的转染，Polybrene介导的转染，或电穿孔。可以将病毒表达载体通过感染或转导，以可表达形式导入细胞优选癌细胞中。这种病毒载体包括但非限于逆转录病毒，腺病毒，疱疹病毒和禽痘病毒。
同样，反义寡核苷酸也可以通过各种方法导入癌细胞中。例如但非限于内窥镜，基因枪，或脂染(Mannino，R.J.等，1988，生物技术6：682690)Newton，A.C.and Huestis，W.H.，生物化学，1988，27：4655-4659；Tanswell，A.K.等，1990，生物化学及生物物理学1044：269-274；and Ceccoll，J.等，皮肤病学研究杂志，1989，93：190-194)。例如，反义核酸序列如反义构建体或反义寡核苷酸，可以通过针管直接注射或通过置于癌细胞中的导管或其它输送管道，在体腔中与癌细胞接触，所述体腔包括但非限于胃肠道，尿道，肺系或支气管系。任何有效的显影设备如X光，声波图或纤维视觉观测系统，均可以用于定位靶癌细胞组织和引导针管或导管。
或者，所述反义寡核苷酸可以全身性(例如血液循环，淋巴系统)施用于不可以直接到达或解剖学分离的靶癌细胞。
试剂盒/药物输送系统
抑制VEGF表达或抑制非适当细胞增殖如肿瘤细胞增殖或血管发生的所有基本原料，均可以组合在一个试剂盒或药物输送系统中。一或多种反义寡核苷酸，任选地组合其它制剂(例如化疗剂，细胞因子，直接抗VEGF的抗体等)，可以配制为一个单一的配方或分离的配方。所述试剂盒还可以包含或用有助于施用或为个体放置所述配方的仪器包装。这种仪器可以是吸入器，注射器，移液管，镊子，标准勺，滴眼器，或任何这种医药学认可的输送载体。或者，所述配方的容器自身就可以是一种吸入器，针管，移液管，滴眼器，或其它类似仪器，从中所述配方可以施用或应用于所述个体，或与试剂盒中其它成分混合。
所述试剂盒的成分可以通过各种方式配制。例如，试剂盒的成分可以是一或多种液体溶液，此液体溶液优选是水溶液，特别优选的是无菌水溶液。这些试剂盒的成分还可以是干燥或冻干形式的。当提供的试剂或成分是干燥形式时，通常需要加入适当的溶剂重建，其也可以在另一种容器中提供。在一个优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸可以通过本领域已知的方法配制为脂质体。
本发明的试剂盒还可以包括一个施用所述反义寡核苷酸的说明书。本发明的试剂盒还典型地包括一种商业销售的密闭的小瓶，例如其中保留所需小瓶的注射用或吹塑的塑料容器。其它设备包括阅读或监测反应的仪器。
本文所引用书籍，文章或专利均并入参考。以下实施例例证了本发明的各个方面，但无限制之意。
6.实施例
材料和方法
使用的抗体包括p-130和Tie-1抗体。抗体p130是一种亲和纯化的兔多克隆抗体，这种抗体是对抗相当于人源p130的羧基端的1120-1139位氨基酸的肽产生的。抗体Tie-1是一种亲和纯化的兔多克隆抗体，其是通过对抗相当于人源Tie-1前体的羧基端的1121-1138位氨基酸的肽产生的。
分离KS细胞  AIDS-KS衍生的纺锤状细胞品系是从原发肿瘤组织中分离的，如Nakamurae等，1988所述。将细胞在用1.5％的明胶包被的75cm2的培养瓶中的KS培养基中持续培养，所述培养基由以下物质组成：RPMI 1640(Life Technologies)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，2mM谷氨酰胺，必需的和非必需的氨基酸，10％胎牛血清(FBS，Life Technologies)，和1％Nutridoma-HU(Boehringer Mannheim)。对初级分离物通过使用免疫荧光分析确定其表型加以定性。表达的标记包括上皮细胞标记；UEA-1结合位点，EN-4，PALE；平滑肌细胞特异性标记包括血管平滑肌细胞特异性α肌动蛋白；巨噬细胞特异性标记包括CD14。致瘤性细胞系KSY-1是相似增殖的并具有相似表型。
实施例1：通过KS细胞表达VEGF和VEGF-C受体(flt-4)
体外研究示出KS细胞高水平表达VEGF家族的所有成员。Flt-4和KDR mRNA表达在KS细胞系(KSY1)，HUVEC，来自HIV+患者的正常皮肤和KS肿瘤组织，T1(成纤维细胞)，23-1(B-淋巴瘤)和HUT-78(T细胞淋巴瘤)中分析。将等量的RNA逆转录以产生cDNA。将cDNA使用配对的引物进行Flt-1和KDR特异性PCR扩增(分别产生500和700bp的产物)(图3A)，或者作为对照，将来自所有样品的cDNA进行β肌动蛋白特异性PCR扩增(548bp的产物)(图3B)。以相似方式检测VEGF-C受体(flt-4)的表达(图4)。
实施例2：通过KS细胞表达VEGF mRNA和产生VEGF蛋白质
在一些AIDS-KS细胞系中分析VEGF mRNA的表达。优选地，将来自KSC10，KSC29，KSC13，KSC59和KSY1，KSC10，HUVEC和AoSM(图1A)的共15μg RNA电泳，印迹并与人VEGF cDNA(图1A，上方)和β-肌动蛋白探针(图1A，下方)杂交。在48小时后收集来自KSY1，KSC10，AoSM，HUVEC和T1的等量细胞的上清，并通过ELISA分析VEGF蛋白(图1B)。
实施例3：VEGF反义寡核苷酸对KS细胞生长的作用
将KS细胞用VEGF反义AS-1(Veglin-1；SEQ.ID NO：1)，AS-3(Veglin-3；SEQ.ID NO：2)，和混杂的寡核苷酸，在1-10μM浓度进行处理。在这些和随后的实验中使用的混杂的寡核苷酸具有以下序列：(SEQ ID NO：33)5′-TAC GTA GTA TGG TGT ACG ATC-3′。在第3天测定细胞增殖情况(图6A)。数据以一式三份实验的平均值±标准误差表示。图6E表明rhVEGF对KS和HUVEC细胞生长的作用。将细胞以1×104个细胞/孔种植于24孔平板中，并用rhVEGF(1-10ng/mL)处理48小时。计数细胞数目，结果以一式四份实验的平均值+SD表示(图6E)。RhVEGF消除VEGF反义物对AIDS-KS细胞生长的作用。将KS细胞以1×104个细胞/孔的密度种植于24孔平板中。在第一天和第二天将细胞单独用1和10μM的AS-3(Veglin-3)或组合rhVEGF(10ng/mL)处理。72小时后测定细胞增殖情况。数据(图6F)以一式四份进行的两个实验的平均值±标准误差表示。通过图6的结果可以看出，用反义寡核苷酸将AIDS-KS细胞温育3天，导致剂量依赖性KS细胞生长抑制，如通过细胞计数测定。相反，有义寡核苷酸不引起明显的KS细胞生长抑制。这些发现表明VEGF对KS细胞而言是一种自泌性生长因子。
实施例4：VEGF反义寡核苷酸的特异性
合成人体VEGF基因的各个编码区的反义寡核苷酸，并进行硫代磷酸酯修饰以降低降解。将等量的细胞种植于24孔平板中。VEGF反义寡核苷酸的摩尔浓度依赖性抑制KS细胞(KSC-10，KSC-59)生长的潜力，在将细胞在第1天和第2天暴露并在第3天进行计数细胞后，在细胞增殖分析中检测。通过Coulter计数仪测定存活细胞数。每个数值均是一式三份实验的平均值+SE。对照物包括混杂的硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸。另外，对照实验包括T细胞系(HUT-78)，B细胞系(23-1)，平滑肌细胞(AoSM)，内皮细胞(HUVEC)和成纤维细胞(T1)。在这个实验中测试两种反义寡核苷酸示出抑制KS细胞系，而一些其它寡核苷酸没有明显的作用。这些寡核苷酸AS-1和AS-3也称为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。还应注意到SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2对各种对照细胞系如B细胞系，T细胞系和成纤维细胞系的生长没有明显作用。
将细胞以等密度种植，并用Veglin-1(SEQ ID NO：1)或Veglin-3(SEQ ID NO：2)，或混杂的寡核苷酸(在0，1，5 & 10μM)处理，随后计数细胞(图6B，6C和6D)，并提取总细胞RNA。总RNA分离自用各种浓度的AS-1/Veglin-1(SEQ ID NO：1)(图7A)，AS-3/Veglin-3(SEQ ID NO：2)(图7B)和混杂的寡核苷酸(SEQ ID NO：33)(图7C)处理的AIDS-KS细胞。将总RNA逆转录以产生cDNA。对VEGF和β-肌动蛋白进行PCR。上面一组示出相当于VEGF，2S和VEGF，6SmRNA的535和403bp的产物。下面一组示出β-肌动蛋白的548bp的PCR产物。NT＝未处理；M＝分子大小标记物，25-41和18-33表示PCR的循环次数。结果表明AS-1/Veglin-1和AS3/Veglin-3以剂量依赖性方式特异性降低VEGF，2S和VEGF，6SmRNA的积聚。图7D例证了这些VEGF寡核苷酸抑制KS细胞中VEGF蛋白的产生。在48小时收集用AS3(Veglin-3)和混杂的VEGF反义寡核苷酸处理的KS细胞上清，并通过ELISA对VEGF蛋白进行定量。结果以一式两份进行的实验的平均值±标准误差表示。
实施例5：通过VEGF寡核苷酸抑制肿瘤生长
在裸鼠中研究VEGF反义寡核苷酸对肿瘤生长的作用。将KS-Y1细胞(1×107)皮下接种于Balb/C/Nu+/NU+无胸腺小鼠的背部。将AS-1/Veglin-1(SEQ ID NO：1)，AS-3/Veglin-3(SEQ ID NO：2)，混杂的(S)(SEQ ID NO：33)VEGF寡核苷酸和稀释剂(PBS)每天经腹膜内注射，共5天(第2天-第5天)。将小鼠在第14天处死，并测定肿瘤大小。所得数据以每组10只小鼠是平均值±标准误差表示。图8例证了用AS-1(SEQ ID NO：1)和AS-3(SEQ ID NO：2)进行处理明显降低肿瘤生长。在对移植在小鼠中的人黑素瘤细胞(M21)进行的相似实验示出，肿瘤生长明显降低(图13)。使用移植在小鼠胰腺中的人胰腺癌细胞系进行的实验也示出肿瘤缩小，肿瘤扩散和腹水减少，及存活性改善。另外，用AS-3处理后血清和腹水中VEGF水平降低至正常水平。
实施例6：用脂质体胶囊化VEGF反义寡核苷酸
在第1天和第2天，将KS细胞用各种浓度的在中性脂质体中胶囊化的寡核苷酸处理，并在第3天进行细胞计数。在开始处理后72小时测定细胞增殖情况。所得数据以一式四份进行的两个实验的平均值±标准误差表示。脂质体胶囊化提高了VEGF反义寡核苷酸的的潜力。在比游离寡核苷酸所需的浓度低50倍的浓度下，观测到细胞生长降低50％以上(图6F，图9，下面)。另外，在相同浓度，混杂的寡核苷酸没有抑制作用(图9，上面)。
实施例7：VEGF对KS细胞存活性的作用
另外，研究反义寡核苷酸(AS-3)对KS细胞存活性的作用。将KS细胞用各种浓度的寡核苷酸处理。提取DNA并在琼脂糖凝胶上分离。如图10例证，用1μM及之上浓度的反义寡核苷酸处理，示出细胞死亡迹象，通过程序性细胞死亡机制，也称为细胞程序死亡(图10，左侧)。混杂的寡核苷酸(SEQ ID NO：30)在接近10μM的浓度也没有作用(图10，右侧)。这个实施例示出VEGF不仅是KS细胞的一种自泌生长因子，而且也是细胞存活所必需的。
实施例8：Flk-1/KDR和Flt-4抗体对KS生长的作用
图11A例证了Flk-1/KDR和Flt-4抗体以剂量依赖性方式抑制KS细胞生长。当将它们组合施用时，观测到协同作用。在受体上观测到相似作用，即Flk-1和Flt-1抗体以剂量依赖性方式诱导细胞程序死亡，当组合这二者时具有累加作用(图11B)。相反，另一种内皮细胞受体酪氨酸激酶的抗体没有这种作用，所述抗体也在KS细胞上表达。VEGF受体(Flk-1)的体内活性已经在体内示出。相对于对照组，Flk-1抗体处理的携带KS肿瘤的小鼠的肿瘤生长明显降低(图12)。
实施例9：使用反义寡核苷酸抑制培养的KS卵巢癌和黑素瘤细胞细胞增殖分析
将无限增殖的KS细胞系KS Y-1和KS-SLK，在用KS培养基中1.5％明胶包被的孔中生长，所述KS培养基包含RPMI-1640(LifeTechnologies，Gaithersburg MD)，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素，2mM谷氨酰胺，必需和非必需氨基酸，10％胎牛血清(FBS：LifeTechnologies)和1％Nutridoma-HU(Boehringer Mannheim，IndianapolisIN)。Kaposi′s肉瘤细胞系KS Y-1得自ATCC(CRL-11448)而且是美国专利5569602的主题。Kaposi′s肉瘤细胞系KS-SLK得自Dr.E.Rubinstein，Chaim Sheba医学中心，Tel-Hashomer，以色列。将人脐静脉上皮细胞(HUVEC)(Clonetics，San Diego CA)，根据供应商的指导生长于含有上皮生长因子的培养基中。将T1成纤维细胞；卵巢癌细胞Hoc-7和Hey；人黑素瘤细胞A375，397和526细胞系，在补加10％FBS和上述抗生素的RPMI 1640培养基中供养。卵巢癌细胞系Hoc-7和Hey得自Dr.Donald Buick，加拿大多伦多大学。黑素瘤细胞系A375得自美国典型培养物保藏中心(ATCC号CRL-1619)。黑素瘤细胞系397和523得自Dr.Steven Rosenberg，Surgery Branch，Division of Cancer Treatment；国立癌症协会，国立健康协会Bethesda，MD。在第0天将所有细胞以1.0×104个细胞/孔的密度种植于24孔平板中的适当生长培养基中。在使细胞附着过夜后，在第1天和第3天将细胞用不同浓度(1-10μM)的VEGF反义寡核苷酸处理。在第5天使用3-[4，5-二甲基-1-yl]-2，5-溴化二苯基四氮唑(MTT)分析细胞生长情况。将孔用90％异丙醇中0.5mg/ml MTT，0.5％SDS和40mM HCl处理。在ELISA平板读出器(MolecularDevices，CA)中在490nm读出产生的颜色，使用异丙醇作为空白对照。
通过标准化合方法合成相当于VEGF mRNA区域的反义寡核苷酸。将所述寡核苷酸合成为硫代磷酸酯而不用进一步修饰。使用上述细胞增殖分析测定IC50值，并示于表1。
表1：VEGF反义寡核苷酸在Kaposi′s肉瘤(KS)，卵巢癌(OV)和黑素瘤(MEL)中的活性
SEQIDNO： 序列 编码序列位置 IC50KS(μM) IC50OV(μM) IC50MEL(μM)
3 ATTGCAGCAG CCCCCACATC G 320-299 4.8 10 6.7
4 GCAGCCCCCA CATCGGATCA G 314-293 2.8 7.6 3.8
5 CCCACATCGG ATCAGGGGCA C 308-287 10 ＞10 ＞10
6 TCGGATCAGG GGCACACAGG A 302-281 10 ＞10 ＞10
7 CAGGGGCACA CAGGATGGCT T 296-275 ＞10 ＞10 ＞10
8 CACACAGGAT GGCTTGAAGA T 290-270 8.2 ＞10 ＞10
    * 9 ACACAGGATG GCTTGAAGAT G 289-269 0.85 1.6 1.6
    * 10 CACAGGATGG CTTGAAGATG T 288-268 0.9 1.9 1.5
    * 11 ACAGGATGGC TTGAAGATGT A 287-267 1.6 3.4 2 7
    * 12 CAGGATGGCT TGGAGATGTA C 286-266 0.9 1.8 0.9
    ** 13 AGGATGGCTT GGAGATGTAC T 285-265 0.4 1.1 0.6
    ** 14 GGATGGCTTG AAGATGTACT C 284-264 0.38 1.1 0.7
    * 15 GATGGCTTGA AGATGTACTC G 283-263 1.11 2.4 1.2
    * 16 ATGGCTTGAA GATGTACTCG A 282-262 1.42 3.0 2.5
    * 2 TGGCTTGAAG ATGTACTCGA T 281-261 2.1 5.2 3.2
    ** 17 GGCTTGAAGA TGTACTCGAT C 280-260 0.5 1.2 0 5
    * 18 GCTTGAAGAT GTACTCGATC T 279-259 1.38 3.1 2.2
19 CTTGAAGATG TACTCGATCT C 278-258 2.42 6.0 3.7
    * 20 GGATGGCTTG AAGATGTACT 284-265 0.95 2.7 1.0
    * 21 GGATGGCTTG AAGATGTAC 284-266 1.1 2.8 1.4
22 GGATGGCTTG AAGATGTA 284-267 3.8 ＞10 5.8
23 GGCTTGAAGA TGTACTCGAT 280-261 4.8 ＞10 7.1
24 GCTTGAAGAT GTACTCGAT 279-261 4.6 ＞10 6.2
25 CTTGAAGATG TACTCGAT 278-261 6.2 ＞10 8.6
26 TGGCTTGAA GATGTACTCG A 281-262 3.4 ＞10 4.7
27 TGGCTTGAAG ATGTACTCG 281-263 6.9 ＞10 ＞10
28 GGGCACACAG GATGGCTTGA AGATGTACTC GAT 293-261 0.6 1.2 1.3
    * 29 GGGCACACAG GATGGCTTGA AGA 293-271 0.7 1.5 1.2
表1说明
在第4列示出的核苷酸数是从VEGF-165同种型的翻译起始位点开始的，见于Leung DW，Cachianes G，Kuang W-J，Goeddel DV，和Ferrara N.(1989)″V血管内皮生长因子是一种分泌的血管发生性促分裂原″，科学246：1306-1309。所述反义分子通常是以5′→3′方向表示的。反义分子是DNA编码链的互补体，所述DNA编码链通常也是5′→3′方向的。核酸退火为具有相反极性的链，因此在第4列中的数号，代表3’→5′基因序列(由多至少)。IC50值表示半数抑制细胞增殖必需的反义寡核苷酸浓度。
实施例10：反义寡核苷酸对VEGF-A，VEGF-C和VEGF-D表达的作用
在第0天，将KS Y-1细胞以1×104密度种植于明胶包被的平板中。然后在第1天将细胞用各种浓度的(0，1，5，和10μM)反义寡核苷酸SEQ ID NOS：3-29个别处理。在第3天收获细胞并提取总RNA。通过逆转录酶使用随机六聚体引物(Superscript，LifeTechnologies Inc.)合成总体积20μl的cDNA。将5μl cDNA反应物用于PCR中，使用基因特异性引物i)VEGF-A，ii)VEGF-C和iii)VEGF-D。每次PCR循环包括在94℃变性1分钟，在60℃引物退火2分钟，并在72℃延伸3分钟。将样品扩增41次循环，并从第25次循环开始每4次循环后的PCR混合物中取5μl等分。将扩增的产物在含有溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上观测。每个PCR循环包括在94℃变性1分钟，在60℃退火2分钟，并在72℃延伸3分钟。将样品扩增41次循环，并从第25次循环开始每4次循环的PCR混合物中取5μl等分。在含有溴化乙锭的1.5％的琼脂糖凝胶上观测扩增产物。对所有样品分析VEGF-A，VEGF-C或VEGF-D的表达情况及β-肌动蛋白的表达情况，以确定RNA的完整性和数量。表2示出通过β-肌动蛋白扩增修正的反义寡核苷酸SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：14对各种VEGF成员表达的作用。
表2：定量应答反义寡核苷酸的mRNA水平
表2表明各种反义寡核苷酸对VEGF蛋白家族成员表达的作用。AS-3/Veglin-3(SEQ ID NO：2)导致VEGA-A mRNA水平以剂量依赖性方式降低。AS-3/Veglin-3对VEGF-C，VEGF-D或PIGF的表达没有明显作用。相反，SEQ ID No：14导致VEGF-A，-C和-D的mRNA水平以剂量依赖性方式降低。这个反义分子在1μM浓度使VEGF-AmRNA水平降低2.7-3倍，在5μM降低4.6-6.3倍。另外，VEGF-C和VEGF-D的水平相似地明显降低，在1μM浓度降低3倍，在5μM浓度降低6倍。对PIGF没有明显作用。这些寡核苷酸当中无一导致β肌动蛋白的mRNA水平降低，这是一种持家基因。
表2：应答反义寡核苷酸的mRNA水平的定量
                                       mRNA水平降低倍数
VEGF-A VEGF-C VEGF-D PIGF β-肌动蛋白
AS-3/Veglin-3/SEQ ID NO：2
1μM 1.6 无 无 无 无
5μM 3.2 无 无 无 无
SEQ ID NO：14
1μM 2.7-3.0 3 3 无 无
5μM 4.6-3.2 6 6 无 无
反义寡核苷酸抑制细胞生长的能力依赖于其抑制多种形式VEGF的能力。表3示出针对VEGF的反义寡核苷酸对VEGF，-A，-C，和-D基因表达的相对作用。特别地，高亲和性序列能抑制多种形式的VEGF。那些示出最大抑制的拮抗剂用**表示。其它示出对抗多种形式VEGF的广谱活性的拮抗剂用*表示。使用这些数据，本领域技术人员可以选择一种适当的寡核苷酸序列以抑制特异形式的VEGF，或抑制肿瘤细胞的生长，这是一种显著抑制多种VEGF形式的序列。
表3：反义寡核苷酸对VEGF-A，-C和-D的作用
SEQ IDNO：  序列 VEGFA VEGFC VEGFD
3  ATTGCAGCAGCCCCCACATCG - - -
4  GCAGCCCCCACATCGGATCA G - - -
5  CCCACATCGGATCAGGGGCAC - - -
6  TCGGATCAGGGGCACACAGGA - - -
1  CAGGGGCACACAGGATGGCTT - - -
8  CACACAGGATGGCTTGAAGA T - - -
* 9  ACACAGGATGGCTTGAAGATG + + +
* 10  CACAGGATGGCTTGAAGATGT + + +
* 11  ACAGGATGGCTTGAAGATGTA +/- + +
* 12  CAGGATGGCTTGGAGATGTAC + + +
** 13  AGGATGGCTT GGAGATGTACT + ++ ++
** 14  GGATGGCTTG AAGATGTACT C + ++ ++
* 15  GATGGCTTGAAGATGTACTCG + + +
* 16  ATGGCTTGAA GATGTACTCG A +/- + +
* 2  TGGCTTGAAG ATGTACTCGA T ++ + +
** 17  GGCTTGAAGATGTACTCGATC + ++ ++
* 18  GCITGAAGATGTACTCGATCT +/- + +
19  CTTGAAGATG TACTCGATCT C - +/- +/-
* 20  GGATGGCTTGAAGATGTACT +/- + +
* 21  GGATGGCTTG AAGATGTAC +/- + +
22  GGATGGCTTG AAGATGTA - -
23  GGCTTG AAGA TGTACTCGAT -- - -
24  GCTTGAAGAT GTACTCGAT - - -
25  CTTGAAGATG TACTCGAT - - -
26  TGGCTTGAAG ATGTACTCGA - - -
27  TGGCTTGAAG ATGTACTCG - - -
28  GGGCACACAG GATGGCTTGAAGATGTACTCGAT +/- +/- +/-
* 29  GGGCACACA GGATGGCTTGA AGA +/- + +
+表示较强的表达抑制
-表示表达未抑制
+/-表示表达受到一些抑制
反义寡核苷酸通常以5’→3’方向表示。反义分子是DNA编码链的互补序列。
实施例11：反义寡核苷酸对胰腺癌细胞的作用
血管内皮细胞生长因子(VEGF)在人体胰腺癌(PaCa)中是过表达的。先前的研究推测VEGF不直接针对PaCa细胞起作用，但是作为胰腺肿瘤新血管化的刺激剂。这项研究研究了VEGF在人体胰腺癌细胞中的产生/表达，并评价了VEGF反义寡核苷酸对同位裸鼠模型中人PaCa的体内生长和血管发生的作用。
体外：通过RT-PCR对两种人PaCa细胞系(AsPC-1低分化的；HPAF-2，适度良好分化的)评价/测试VEGF mRNA转录。通过ELISA确定细胞培养上清中VEGF的分泌。这两种PaCa细胞系均表达VEGFmRNA和分泌的VEGF蛋白(AsPC-1：4205±39pg/106个细胞；HPAF-2：8123±64pg/106个细胞)。体内：VEGF反义寡核苷酸(AS-3/Veglin-3，SEQ ID NO：2)是用硫代磷酸酯修饰合成的，将1mm3的sc.PaCa供体肿瘤片段同位移植于裸鼠胰腺中。动物经腹膜内接受AS-3(10mg/kg/天)或运载体，共14周。通过尸检确定原发肿瘤的体积(TU Vol)，转移范围(Met-Score)及血清(VEGFs)和腹水(VEGFA)中VEGF表达。在CD31染色的肿瘤切片中通过免疫组织化学分析微管密度(MVD)。体内研究的这些结果示于表4。
表4：AS-3/Veglin-3治疗的结果
*＝相对于对照组p＜0.05           AsPC-1             HPAF-2
对照组 AS-3 对照组 AS-3
TU-Vol.(mm3) 1404±149 1046±81 3829±594 860±139*
Met-Score(pts.) 16.7±0.9 6.5±0.8* 8.3±1.5 2.5±.02*
存活(n/n) 1/8 6/8* 4/8 7/8
VEGFs(pg/ml) 59.5±5.8 26.6±1.1* 192.3±41.2 38.3±6.1*
VEGFA(pg/ml) 1190±88 无腹水 1405±97 无腹水
MVD(/0.74mm2) 64.1±4.4 33.2±2.3* 76.4±6.0 24.1±2.5*
人PaCa细胞在体外分泌高水平的生物活性VEGF。VEGF反义疗法降低体内VEGF分泌和肿瘤新血管发生，从而降低肿瘤生长和转移，并改善存活性。转移似乎对VEGF-AS治疗特别敏感。AS-3处理的动物没有一种产生腹水，提示血管通透性由于抑制VEGF在PaCa细胞中的表达也发生降低。
实施例12：VEGF和VEGF受体在人体肿瘤细胞系中的表达
细胞系和试剂：细胞系T1，HuT 78，A375，LNCaP，U937和HL-60全部得自ATCC(Manassas，VA)。其它细胞系得自南加州大学；M21(Bumol，T.F.& Reisfeld，R.A.(1982)美国科学院院报79：1245-9)得自P.Brooks，526得自J.Weber，Hey和Hoc-7得自L.Dubeau及Panc-3得自D.Parekh。先前对KS Y-1已经加以阐述(Lunard等，(1995)国立癌症协会杂志87：974-81)。VEGFR-1多克隆抗体(C-17)，VEGFR-2多克隆抗体(C-1158)得自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。重组的人VEGF购自R & D Systems(Minneapolis，MN)。
制备cDNA和RT-PCR：从1×105个细胞中制备总RNA。通过逆转录(RT)合成互补DNAs，使用共20μl体积的随机六聚体引物(Superscript II，Life Technologies，Gaithersberg，MD)。将5μl cDNA反应物如前述通过PCR扩增(Masood，R.等，(1997)美国科学院院报94，979-84)。每次PCR循环包括在94℃变性1分钟，在60℃引物退火2分钟，并在72℃延伸3分钟。将样品扩增41次循环，并从第25次循环开始每4次循环后的PCR混合物中取5μl等分。将扩增的产物在含有溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上观测。每个PCR循环包括在94℃变性1分钟，在60℃退火2分钟，并在72℃延伸3分钟。将样品扩增30次循环。在含有溴化乙锭的1.5％的琼脂糖凝胶上观测扩增产物。通过β肌动蛋白扩增确定所有样品的cDNA的完整性和数量。用于检测cDNA的引物列于下表5A。
流式细胞计量：流式细胞计量用于分析细胞表面分子的表达。将所有的细胞系(KS Y-1，M21，Hey，T1，U937)以每个T75培养瓶1×106个细胞的密度种植于适当的培养基中。在第二天用乳胶刮刷收集贴壁细胞(KS Y-1，M21，Hey，T1)。将在悬浮液中生长的细胞(U937，HL-60，A6876，P3HR1)移至12×15mm圆底离心管中。通过台盼蓝染色排除法确定存活的细胞数。将细胞用抗体(Flt-1，Flk-1，对照血清均得自Santa Cruz生物技术公司)温育，随后用抗兔FITC缀合物(Sigma)温育。在每次温育后，将细胞用冰冻的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗两次。将细胞沉淀悬浮于1ml PBS中，并用FACScan流式细胞计量仪(Becton Dickinson)分析。数据以平均荧光强度比率(MFIRs)表示(具有相应抗体平均荧光强度与具有对照独特型特异性兔IgG的平均荧光强度的比值)。阴性对照是用抗兔FITC温育细胞，不预先暴露于受体特异性抗体。
在多种人体肿瘤细胞系中评价VEGF的产生情况。人黑素瘤细胞系(M21)，人卵巢癌细胞系(Hey和Hoc-7)，及人前列腺癌细胞系(LNCaP)均高水平将VEGF分泌入培养基中(表6)。这与人T细胞白血病细胞系(HuT-78)和人成纤维细胞系(T1)相反，其不具有可检测的VEGF。我们还在这些细胞系和其它细胞系中通过RT-PCR测定了VEGF mRNA水平，包括在胰腺癌代表性Panc3细胞系，卵巢癌代表性Hey-7和Hoc细胞系，黑素瘤代表性细胞系A375和526中进行测定。除了T1成纤维细胞，所有测试的细胞系均表达VEGF(表6)。
对VEGF受体(VEGFR-1/Flt-1和VEGFR-2/Flk-1)的表达也进行了测定。衍生自黑素瘤，卵巢癌和胰腺癌的许多人体肿瘤细胞系，示出VEGF受体表达，通过一些不同的方法包括RT-PCR，免疫细胞化学和流式细胞计量术。结果示于图15和表6。流式细胞计量术和RT-PCR还示出一种类红细胞白血病细胞系HL-60，和T细胞白血病细胞系HuT 78，其不表达VEGFR-1或2(图15A)。U937，一种单核细胞系，表达高水平的VEGFR-1(表6)，但不表达VEGFR-2。在一些这些肿瘤细胞系中共同表达VEGF及其受体，有可能提高自泌生长因子活性。这种活性可以通过阻断配体VEGF的表达而测试。
表5A：进行RT-PCR的基因特异性引物
基因 方向 序列
VEGF 正向 5′-CGA AGT GGT GAA GTT CAT GGA TG-3′
反向 5′-TTC TGT ATC AGT CTT TCC TGG TGA G-3′
VEGF-B 正向 5′-TGG CCA AAC AGC TGG TGC-3′
反向 5′-GAG GAA GCT GCG GCG TCG-3′
P1GF 正向 5′-ATG AGG CTG TCC CCT TGC TTC-3′
反向 5′-AGA GGC CGG CAT TCG CAG CGA A-3′
VEGFR-1 正向 5′-CAA GTG GCC AGA GGC ATG GAG TT-3′
反向 5′-GAT GTA GTC TTT ACC ATC CTG TTG-3′
VEGFR-2 正向 5′-GAG GGC CTC TCA TGG TGA TTG T-3′
反向 5′-TGC CAG CAG TCC AGC ATG GTC TG-3′
β-肌动蛋白 正向 5′-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3′
反向 5′-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′
表5B：VEGF反义ODN和突变体的序列
寡核苷酸 序列
AS-3 5′-TGG-CTT-GAA-GAT-GTA-CTC-GAT-3′
AS-3突变体1 5′-TGG-CTT-GAA-GAT-GTA-CTG-CAT-3′
AS-3突变体2 5′-TGG-CTT-GAA-CAT-GTA-CTC-GAT-3′
表6：VEGF及其受体在肿瘤细胞系中的表达
细胞系 类型 VEGF(pg/106个细胞)* VEGFR-2(Flk-1) VEGFR-1(Flt-1)
KS Y-1 Kaposi’s肉瘤 +(625) + +
M21 黑素瘤 +(487) + +
A375 黑素瘤 + + +
526 黑素瘤 + + +
Hey 卵巢癌 +(419) + +
Hoc-7 卵巢癌 +(550) + +
PANC3 胰腺癌 + + +
LNCaP 前列腺癌 +(719) + -
U937 原单核细胞 +(1476) - +
HL-60 类红细胞白血病 - - -
HuT 78 T细胞白血病 - - -
T1 成纤维细胞 - - -
*细胞是培养48小时的。上清中VEGF水平通过ELISA(R & DSystems)测定。
实施例13：VEGF-AS3特异性阻断VEGF表达
测试寡核苷酸：合成具有或没有5’荧光素标记(Operon technologies，Alameda，CA)的VEGF特异性ODN，在此称为AS-3并互补于VEGFmRNA(261-281)(Leung，D.W.等(1989)，科学246，1306-9)，和AS-3的两种突变体，如表5所示。突变的碱基以黑体字表示。合成AS-3的混合骨架衍生物(称为AS-3m)
Figure A20071000637900521
和对照的21-mer混合骨架ODN，在此称为“混杂的”
Figure A20071000637900523
纯化并分析，如Agrawal，S.等(1997)，美国科学院院报94，2620-5所述。在5’末端的4个核苷酸和在3’末端的4个核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(用黑体字表示)；剩余的是脱氧核苷酸。就这两种混合骨架寡核苷酸而言，所有核苷酸间键合是硫代磷酸酯。所述寡核苷酸的纯度通过毛细管凝胶电泳和PAGE示出高于90％，剩余的是n-1和n-2产物。核苷酸间键合的完整性通过31P NMR确定。
免疫荧光研究：
接下来论证所述AS-ODNs进入细胞。合成表5中所列的5’荧光素标记的AS-ODNs(Operon Technologies，Alameda CA)。将KS Y-1细胞以10000个细胞/孔的密度种植于腔式玻片上(Nunc)含有血清的培养基中，并使其附着过夜。将培养基用无血清的培养基置换，并将细胞暴露于荧光素标记的AS-3m，AS-3m突变体1或AS-3m突变体2中4小时。注意我们不使用阳离子脂质或通透剂，以增强寡核苷酸的吸收。温育4小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)5次。取出所述腔并将活细胞置于盖玻片下，通过聚焦显微镜分析。
测定VEGF和IL-8蛋白质水平：在这些实验中，将细胞在2％FCS中培养。将细胞在0小时和16小时用各种浓度的所述寡核苷酸处理。在第24小收集上清，离心以除去细胞碎片并在-70℃贮存，直至使用ELISA试剂盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)根据使用说明进行分析。检测的VEGF水平折算为细胞数目。将取自关于肿瘤生长的体内实验的肿瘤组织裂解，并使用人VEGF ELISA试剂盒和小鼠VEGF ELISA试剂盒(均得自R & D Systems)测定VEGF蛋白的水平。检测的VEGF水平折算为总蛋白量。
因此对AS-3和具有一或两个核苷酸突变的突变体(表5B)(均是硫代磷酸酯修饰的)测试其对细胞系存活的作用，示出VEGF依赖性自泌生长因子活性。将在1％FCS中培养的KS Y1细胞在第1和第3天用ODNs处理，并在第5天通过MTT分析测定所述细胞存活力。观测到AS-3表现为剂量依赖性存活力丧失，而两个突变体这个活性明显降低(图16A)。AS-3突变体2，其具有一个碱基变化，在2.5μM浓度AS-ODN情况下导致效力丧失60％。针对AS-3突变体1获得相似结果。
为证实ODN活性的特异性，使等量的KS Y1细胞在含有1％FCS的培养基中贴壁。将细胞在第0和16小时用各种浓度的所述寡核苷酸处理。在第24小时收集上清，并针对VEGF或IL-8进行分析。在10μM的AS-3，VEGF几乎完全移至，而这两个突变体的作用均明显降低。因此在短期实验中，需要较高剂量的ODN以完全抑制VEGF，而且所述活性是序列依赖性的。
为测定VEGF的抑制与非特异性作用不相关，对同样的上清研究产生其它分泌蛋白的情况。KS Y1细胞产生有效数量的IL-8，其不受亲代化合物AS-3或所述两种突变体的影响。因此AS-3的活性高特异性抑制VEGF而且是序列依赖性的。
为测定所述突变体活性降低与细胞吸收失常不相关，将荧光素标记的ODNs通过免疫荧光分析进行研究。合成5’荧光素标记的AS-ODNs(Operon Technologies，Alameda CA)。将KS Y-1细胞以10000个细胞/孔的目的直至于腔式玻片(Nunc)上的含有血清的培养基中，并使其附着过夜。将培养基用无血清的培养基置换，并将细胞暴露于各种浓度的荧光素标记的AS-3m，AS-3m突变体1或AS-3m突变体2中4小时。注意我们不使用阳离子直至或通透剂以促进细胞吸收所述寡核苷酸。在温育4小时后，取出所述腔，并将活细胞置于盖玻片下，并通过聚焦显微镜分析。图15C示出荧光素荧光和相差的覆盖显影。荧光信号在用最低浓度的测试ODN(1μM)处理的所有样品的细胞中均可检测，并呈现定位于细胞核。细胞吸收和定位于核不受一或两个核苷酸突变的影响。这些数据示出VEGF-AS-3是VEGF的高度特异性抑制剂，而且这种活性是序列依赖性的。还测试了荧光素VEGF-AS3及黑素瘤(M21)和卵巢癌细胞系(Hey)的突变体。所有这三种ODN′s均倍这些细胞吸收。
还测试了混合骨架寡核苷酸(MBO)，其相当于前述AS-3序列(图17A)。AS-3m的序列互补于VEGF mRNA，并含有许多其它VEGF家族基因的错配(图17B)，因此我们在KS Y-1细胞中测试其活性特异性。用AS-3m处理表达所有VEGF家族chyaun d KS Y-1细胞，与5μM的未处理水平相比，导致VEGF mRNA剂量依赖性抑制(图18A)。相反，在存在5μM AS-3m的情况下，VEGF-B和P1GF(VEGF相关蛋白)和未处理的β肌动蛋白信息水平不明显改变，表明这种作用是特异性的。现已示出AS-3m明显抑制VEGF信息，接下来示出其抑制VEGF蛋白在体外产生。用AS-3m抑制M21黑素瘤和Hey卵巢癌细胞系导致培养上清中VEGF蛋白水平以剂量依赖性方式降低(图18B)。使用混杂的MBO观测到没有明显作用。因此混合骨架的AS-3衍生物保留抑制VEGF表达和蛋白质产生的活性。
实施例14：VEGF-AS直接抑制肿瘤细胞在体外增殖
细胞增殖分析：在第0天，将细胞以1×104个细胞/孔的密度，种植于48孔明胶包被的平板中，平板中有含有2％胎牛血清(FCS)的适当生长培养基，除了在KS Y-1中使用1％FCS。在第二天，更换培养基并将细胞用各种浓度(1-10μM)的寡核苷酸处理。更换培养基，并在第三天重复处理。在第五天，使用3-(4，5-二硫代甲基-2-yl)-2，5-溴化二苯基四氮唑(MTT)，在终浓度0.5mg/ml测定存活力。将细胞温育2小时，抽吸出培养基，并将细胞溶解于酸性异丙醇中(90％异丙醇，0.5％SDS和40mM HCl)。在ELISA读出器中在490nm读出光密度，使用异丙醇作为空白对照(Molecular Devices，CA)。
KS细胞系衍生自内皮细胞系，而且转化过程与VEGF的激活相关。与内皮细胞一样，KS细胞表达VEGF受体。抑制VEGF表达随后示出抑制KS细胞增殖和存活力。已经推测VEGF受体只在内皮细胞中起作用，因为使用表达载体诱导VEGF受体表达，在一些非内皮细胞系细胞中不能建立VEGF介导的信号化。然而，在此数据表明来自不同离心肿瘤的肿瘤细胞表达VEGF和VEGF受体。因此，在致瘤性转化的情况中，细胞可以不仅获得表达VEGF的能力而且还获得特异于VEGF的VEGF受体和信号途径。
接下来测试使用VEGF-AS3或其衍生物抑制VEGF，在VEGF循环中是否能影响细胞的存活力。数据示出对VEGF抑制的应答。注意示出最大抑制细胞存活力的所述细胞系，是那些既表达VEGF又表达VEGF受体的细胞系。黑素瘤和两次癌细胞系示出最大应答，并类似于KS细胞系(KSY1)。明显相反的是不能示出应答的细胞系是erthroleukemia(HL-60)，HUT-78和成纤维细胞(T1)，所有这些均缺乏VEGF和VEGF受体表达。就VEGF-AS3或VEGF-AS3m(图19A，左侧)而言，结果是相似的。混杂的MBO衍生的ODN没有明显的作用，除了在较高的剂量水平在选择的细胞系中具有微弱的毒性(图19A，右侧)。VEGF在细胞存活力中的作用通过加入重组的VEGF得以进一步证实，其几乎完全消除了AS-3m在M21(图19B，左侧)和Hey细胞(图5B，右侧)中的作用。这些结果具有临床意义，因为我们及其它人员已经示出一部分原发肿瘤细胞表达VEGF和VEGFR-1/R-2(Herold-Mende，C.等(1999)Lab Invest 79，1573-82)。
实施例15：在体内抑制肿瘤生长
体内研究：将人体肿瘤细胞系KS Y-1，M21，和Hey(2×106个细胞)经皮下注射至5周龄雄性Balb/C Nu+/nu+无胸腺小鼠的后背部。在第一种处理方案中，包括在移植肿瘤细胞后的当天，每天口服施用AS-3m或混杂的MBO或稀释剂(PBS)，并持续2周。通过管饲剂量为100μl中10mg/kg。在称为测试肿瘤抑制的第二种方案中，移植所述细胞并使异种移植物建立5天，之后开始处理。处理包括每天经腹膜内注射AS-3m(1，5或10mg/kg，总体积100μl)或稀释剂。Taxol(1.25或2.5mg/kg)处理，是在第5和12天通过腹膜内注射。每周3次测定小鼠中肿瘤生长情况。在结束研究时将小鼠处死。收集肿瘤并分析VEGF水平。所有小鼠均根据南加州大学管理实验小鼠的规章制度加以饲养。
现已示出VEGF PS-ODN AS-3特异性抑制小鼠中KS Y-1肿瘤异种移植物的生长(Masood等(1997)，PNAS)。使用相同的模型测定混合骨架寡核苷酸AS-3m是否可以适于口服。每天口服施用AS-3m两周以上，导致几乎完全抑制KS Y-1肿瘤异种移植物生长(图20A，左侧)。KS的生长在一些小鼠中完全阻断，同时肿瘤大小在有些小鼠中是最小的。然后对不具有可评估肿瘤的小鼠非治疗性观测。在4周内在所有小鼠中均观测到肿瘤复发(数据未示出)。当在抑制肿瘤后当天开始处理时，对人体黑素瘤M21肿瘤异种移植物通过每天口服施用AS-3m进行的相似处理方案，导致肿瘤体积比对照组小20％(图20A，右侧)。如果在使肿瘤建立5天后再开始处理，也可以产生剂量依赖性活性(图19B，左侧)，在1，5和10mg/kg的剂量范围，分别示出肿瘤生长抑制20％，68％和80％以上。另外，当VEGF-AS3m与低剂量的Taxol组合时，观测到累加作用(图20B，右侧)，例证了组合处理方案比单一制剂更有潜力。显而易见Taxol和AS-3m在所使用剂量的作用是累加的。使用卵巢癌细胞系(Hey)进行的VEGF-AS3体内研究也示出明显的应答。
实施例16：AS-3m在体内对VEGF水平的作用
在施用最后一次治疗剂量后24小时，收集人体肿瘤异种移植物(人卵巢癌细胞系Hey)，并制备肿瘤裂解物。定量VEGF水平并折算为总蛋白水平。在用AS-3m进行的处理中观测到人(肿瘤衍生的)和小鼠(宿主衍生的)VEGF，均呈剂量依赖性抑制。在代表性实验中，在每天施用10mg/kg剂量后，观测到人和小鼠的VEGF水平均降低大约60％(表7)。VEGF-AS3具有一段17个核苷酸的序列，其同源于小鼠VEGF编码区(图17C)，并因此可以解释小鼠VEGF的定向。
表7：人和小鼠VEGF在反义处理的携带肿瘤(Hey)的小鼠中的水平
处理组 VEGF(pg/mg蛋白；平均值±S.E.M.)
小鼠 人
对照组(只用稀释剂) 76.14±17.81 198.29±29.88
1mg/kg AS-3m 47.11±3.47 175.15±33.54
5mg/kg AS-3m 34.68±4.27 94.71±19.57*
10mg/kg AS-3m 31.15±4.05* 81.20±15.50*
*P≤0.05
实施例17：VEGF-AS3在同位移植的前列腺癌模型中是活性的
同位移植肿瘤细胞：收集培养的PC-3P细胞(60-80％铺满)进行注射。将小鼠用methocyflurane麻醉，并作下背部切口。将HBSS中的肿瘤细胞(1×105/10μl)使用解剖显微镜移植在前列腺背部。使用具有控制分送系统的校准钮的注射器，将细胞通过30号针头进行注射。需要在研究小鼠的注射位点形成小隆起。将前列腺送回原来的位置，并缝合腹部切口。将小鼠用盐水或研究药物在第10天开始处理。每组6只小鼠。处理组接受VEGF AS-3m，剂量为每天腹膜内注射10mg/kg，共2周。在移植肿瘤后24天将小鼠处死。在解剖显微镜下切除前列腺和肿瘤。将组织在10％缓冲的福尔马林溶液中固定，并置于OCT(Miles Laboratories，IN)中。将组织切片用HE染色或进行加工以免疫细胞化学。
免疫组织化学：将福尔马林固定的组织切片脱蜡，并用10％山羊血清在-70℃温育10分钟，及用抗VEGFR-1/flt-1或VEGFR-2/Flk-1/KDR(1∶100)的初级兔抗体在40℃温育过夜。使用独特型特异性兔IgG作对照。使用得自Vector Laboratories(Burlingame，CA)的抗生物素蛋白-生物素试剂盒表明这些受体的免疫反应性。过氧化酶活性是通过二氨基联苯胺(Sigma)细胞化学反应表明的。然后将所述玻片用0.12％的亚甲蓝或HE复染。
具有进展性前列腺癌的VEGF表达提高，当肿瘤成为非激素依赖性的时候甚至进一步提高。如果不可观测到，前列腺癌可以只用减轻疗法进行处理。前列腺基质与其它器官一样，在组织重塑和肿瘤调节中起关键作用。为确定抑制VEGF是否具有抗肿瘤作用，将人体前列腺细胞系(PC3)通过直接移植至小鼠前列腺中进行检测。在移植10天后开始处理，所述处理包括每天施用10mg/kg的AS-3m。在移植肿瘤3周后，将小鼠处死，并收集前列腺进行分析。所有对照小鼠(n＝6)在前列腺注射位置产生肿瘤。在肿瘤细胞和基质内有VEGF表达迹象，而且通过免疫组织化学分析在肿瘤内存在CD31阳性微管。如果淋巴细胞迁移入肿瘤组织，主要在肿瘤周围可见非常少量的淋巴细胞侵染(图21A，上组)。6只处理的小鼠中只有两只示出有肿瘤，但其相对较小(图21A，下组)。最显著的发现是在肿瘤中存在免疫细胞。对侵染细胞进行原位定性表明存在单核细胞，树状细胞和NK细胞(图21B，上组)。NK细胞裂解蛋白如perforin和粒酶B的表达也局限于NK细胞的所述区域(图21Bb，下组)。另外，干扰素可诱导的蛋白-10(IP-10)也主要局限于细胞侵染区域(图21B，下组)。IP-10是应答γ干扰素而产生的，并表现为调节NK细胞功能及非依赖性抑制血管发生。
VEGF在脉管发生和血管发生中起关键作用(Plate，K.H.(1998)Adv Exp Med Biol 451，57-61)。由于内皮细胞促分裂原VEGF在肿瘤细胞中的过表达及提高肿瘤脉管中VEGF受体，这种作用是特别明显的。另外，VEGF水平提高与肿瘤转移和存活力相关(Chan，A.S.etal.，(1998)Am J Surg Pathol 22，816-26；Benjamin，L.E.& Keshet，E.(1997)美国科学院院报94，8761-6，Benjamin，L.E.等(1999)，J.ClinInvest 103，159-65)。在发育下的各种抑制剂包括VEGF的单克隆抗体，在结合配体后VEGF受体激活抑制剂(Fong，T.A.等(1999)，癌症研究59，99-106；Yukita，A.等(2000)，抗癌研究20，155-60；Dias，S.等(2000)，Proc American Assoc Cancer Res，Vol.41，pp.792)。
前述实施实施例表明VEGF-AS3进入细胞而且不通过任何操纵定位于细胞核，如使用阳离子脂质体或使用膜通透剂。细胞吸收ODNs是高度可变的及归因于负电荷是受限的。另外，示出所述活性是剂量依赖性的，因为VEGF-AS3抑制VEGF产生但不抑制其他蛋白如IL-8产生，同时一或两个核苷酸突变明显降低抑制VEGF产生而又不降低细胞吸收的能力。这种特异性活性在显示VEGF介导的自泌生长因子活性的细胞系中进一步证实。
本文所示的是许多产生VEGF而且还表达VEGF受体的肿瘤细胞系。这些结果表明归因于VEGF暴露延长而丧失调节功能，导致在正常内皮细胞中VEGF受体的调节功能下降(Wang，D.等(2000)，生物化学杂志275，15905-15911)。还示出所述受体是功能性的。存在VEGF自泌生长因子活性是在4种不同的人体肿瘤中证实的，包括黑素瘤，卵巢癌，胰腺癌和Kaposi′s肉瘤。这些细胞均表达VEGF，促分裂原性受体VEGFR-2，而且示出应答VEGF消除而产生的存活力削弱。抑制细胞存活力是通过外源性VEGF恢复。VEGF受体在肿瘤细胞上的表达先前已经阐述(Herold-Mende，C.等(1999)，LabInvest 79，1573-82)，而且对外源性VEGF的促分裂原性应答已经在胰腺癌，绒毛膜癌和黑素瘤中证明(Itakura，J.等，(2000)Int J Cancer85，27-34；Charnock-Jones，D.S.等(1994)Biol.Repros 51，524-30；Liu，B.et al.，(1995)，Biochem Biophys Res Commun 217，721-7)。不受理论的影响，在一些肿瘤中存在自泌生长途径意味着VEGF反义治疗有两方面的作用：对肿瘤脉管的抗血管发生作用及对肿瘤细胞群的抗致瘤性作用。肿瘤细胞中VEGFR-2的表达因此可以推定对VEGF消除更好应答。
最广泛使用的是硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(PS-ODNs)，以稳定ODNs。PS-ODNs已经示出具有一些副作用如发热，肝功能障碍，肝肿大，血小板减少，激活补体等。这种副作用与ODNs的聚阴离子电荷相关。也已经示出ODNs诱导一些细胞因子如IL-6，IL-12，TNF-α等。细胞因子的诱导表现为是序列依赖性的，尤其在存在CpG岛的情况下。CpG岛是通过在5’末端的一对嘌呤和3’末端的一对嘧啶核苷酸的两侧存在CpG诱导细胞因子而阐述的(免疫学杂志(2000)164：1617-1624)。具有CpG的ODNs还激活B细胞和单核细胞。dG(G弦)也可诱导非特异性作用。核酶抗性骨架可以刺激B细胞功能。VEGF-AS3和VEGF-AS3突变体1不含有CpG岛，或G弦，而且不示出诱导炎性细胞因子。
评价VEGF-AS3混合骨架的ODNs的衍生物，其中ODNs部分用修饰的核苷酸取代。VEGF-AS3在PS-ODNs的3’末端和5’末端均特异性含有2-O-甲基核糖核苷酸节段(每端4个核苷酸)。需要的是6-8个核苷酸以上的PS-ODNs，以保持Rnase I激活。VEGF-AS3m衍生物示出保持在体外和体内特异性抑制VEGF表达。在非肠道以及口服施用后，观测到抗肿瘤活性。VEGF-AS3m还可以与化疗组合累加活性。总之，示出VEGF-AS3是一种VEGF高特异性抑制剂，其由细胞吸收而且只在体内是活性的，当与其它治疗组合时具有累加或协同作用。
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在上述说明书中或下列引用的参考文献在此以其全文并入参考。
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尽管通过例证和实施例对本发明加以了详细阐述，但本领域技术人员在权利要求范围内可对本发明加以一定改变和修改。

Claims (21)

1.一种组合物，其包含：
一种抗血管内皮生长因子(VEGF)的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸具有选自由SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、28和29组成的组中的核苷酸序列，且其以大约0.5-2.5μmol的IC50浓度抑制呈现自泌VEGF活性的细胞的增殖。
2.权利要求1的组合物，其中IC50浓度小于或等于大约1.5μmol。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述反义寡核苷酸是包在脂质体中的。
4.权利要求1或2的组合物，其还包含另一种活性剂。
5.权利要求4的组合物，其中所述活性剂是一种化疗剂如Taxol。
6.权利要求1或2的组合物，其中所述细胞是卵巢癌细胞，黑素瘤细胞，Kaposi’s肉瘤细胞，前列腺癌细胞或胰腺癌细胞。
7.权利要求1或2的组合物，其中所述反义寡核苷酸抑制癌细胞增殖。
8.权利要求1或2的组合物，其中所述反义寡核苷酸抑制血管发生。
9.权利要求1或2的组合物，其中所述反义寡核苷酸抑制VEGF表达。
10.一种寡核苷酸，其选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、28和29。
11.权利要求10的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自SEQ IDNOS：9、10、13、14、17、28和29。
12.一种反义寡核苷酸在制备用于治疗Kaposi’s肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌或黑素瘤的药物中的应用，其中所述反义寡核苷酸具有选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、28和29的核苷酸序列。
13.权利要求12的用途，其中IC50浓度小于或等于大约1.5μmol。
14.权利要求13的用途，其中IC50浓度小于或等于大约1μmol。
15.权利要求12的应用，其中所述反义寡核苷酸是包在脂质体胶囊中的。
16.一种确定一种候选试剂抑制癌细胞增殖或血管发生的治疗潜力的方法，所述方法包括：(i)将呈现自泌生长活性的细胞与至少一种候选试剂接触，及(ii)测定VEGF表达或活性或细胞生长水平，其中VEGF表达或细胞生长受到抑制，表明候选试剂的治疗潜力。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞是Kaposi’s肉瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞或黑素瘤细胞。
18.权利要求16的方法，其中所述候选试剂是一种反义寡核苷酸。
19.一种对患有涉及异常细胞增殖或血管发生的疾病的个体的预后分析，包括：
(i)从患有涉及异常细胞增殖的疾病(例如癌症)或血管发生的疾病的个体中分离生物学样品；及
(ii)评价所述样品的自泌VEGF活性或VEGF表达或VEGF受体表达情况，其中自泌活性是所述个体预后不好的指征。
20.权利要求12的应用，还包括应用另一种活性剂。
21.权利要求20的应用，其中所述活性试剂是一种化疗剂如Taxol。
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