KR100397274B1

KR100397274B1 - 개선된 안정성 및 안티센스 효과를 가진 신규한안티센스-올리고

Info

Publication number: KR100397274B1
Application number: KR10-2001-7013303A
Authority: KR
Inventors: 박종구
Original assignee: 주식회사 웰진
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2000-04-04
Publication date: 2003-09-13
Also published as: CA2369976A1; KR20020013522A; AU3464000A; KR20000065690A; CN100381455C; EP1175430A4; CN1346363A; JP2002540813A; JP3721308B2; KR20020013527A; EP1175430A1; WO2000061595A1; AU773641B2

Abstract

본 발명은 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 염기서열로부터 예측가능한 mRNA 2차 구조를 분석하여 상기 2차 구조가 적게 형성되는 영역을 안티센스서열로 선별함으로써 표적 mRNA에 대한 안티센스 반응 특이성을 개선시키고, 선형 안티센스-올리고를 접합시켜 폐쇄형으로 제조함으로써 뉴클레아제의 분해에 대한 안정성을 개선시킨 폐쇄형 안티센스-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 신규한 안티센스-올리고에 관한 것이다.

구체적으로 CMAS-올리고는, 안티센스서열을 선별하는 단계 및 상기 안티센스서열을 포함하는 선형 AS-올리고를 합성하는 단계를 거친후, 선형 AS-올리고의 5'말단 및 3'말단에 각각 상보적인 염기서열을 포함하는 접합 프라이머를 접합 템플리트로 이용하고 접합 효소를 처리함으로써 접합시키는 단계를 통해 제조된다. 본 발명은c-myb,c-myc또는k-ras를 포함하는 다양한 원인암유전자의 mRNA에 대한 다중 안티센스 서열을 포함하는 CMAS-올리고를 제공한다.

또한, RiAS-올리고는 안티센스서열을 선별하는 단계 및 상기 안티센스서열을 포함하는 선형 AS-올리고를 합성하는 단계를 거친후, 분자내 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 상기 선형 AS-올리고의 스템부위 단일가닥 염기서열이 동일구조의 다른 선형 AS-올리고의 스템부위 단일가닥과 상보적인 염기서열로 구성되어 접착 말단을 형성하는, AS-올리고 2분자를 상호 접합 템플리트로 이용하고, 접합 효소를 처리하여 접합시키는 단계를 통해 제조된다. 본 발명은c-myb,c-myc또는k-ras를 포함하는 다양한 원인암유전자의 mRNA에 대한 다중 안티센스 서열을 포함하는 리본형 안티센스(RiAS)-올리고를 제공한다. RiAS-올리고는 다중 안티센스 서열을 포함하는 두 개의 루프와 상기 두개의 루프를 연결하는 하나의 스템으로 구성된다.

본 발명의 신규한 AS-올리고는 엑소뉴클레아제 활성에 대해서 대단히 안정하며, 종양 세포의 성장을 유의적으로 저해한다.

따라서, 본 발명의 원인암유전자를 표적으로 하는 신규한 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고는 유전자 발현을 억제하는 효과적인 물질로 개발될 수 있는데, 이것은 유전자의 기능 연구뿐만 아니라 안티센스-분자 약제를 개발하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 신규한 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고는 유전자의 이상 발현으로 유발되는 암, 면역성 질환, 감염성 질환, 대사성 질환 또는 유전성 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

Description

개선된 안정성 및 안티센스 효과를 가진 신규한 안티센스-올리고{The novel antisense-oligos with better stability and antisense effect}

안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드(antisense oligodeoxynucleotides, 이하 "안티센스-올리고" 또는 "AS-올리고"라 한다)는 서열 특이적인 유전자 발현의 감소를 통하여 특정 유전자의 기능을 연구함에 있어 중요한 기능을 수행한다(Tompson, C. B., et al.,Nature, 314, 363-366, 1985). 그동안, 암의 발병과 진전에 관여된 유전자의 비정상적 발현을 제거할 수 있는 안티센스 분자를 개발하려는 많은 노력이 있어 왔다(Chavany, C., et al., Mol Pharm., 48, 738-746, 1995).

합성 AS-올리고는 질병 유발 유전자들에 대하여 특이적으로 작용하며, 디자인과 합성이 용이하여 널리 이용되어 왔다. 왓슨-크릭 염기 결합(Watson-Crick base pairing)에 따라 표적 유전자 서열과 상보적인 서열로 디자인된 짧은 길이(10-30 뉴클레오타이드)의 AS-올리고들은 표적 유전자 또는 표적 mRNA에 대한 특이성(specificity)과 친화력(affinity)을 제공해 준다. AS-올리고에 의한 유전자 발현의 억제 기작은 (안티센스)DNA-(표적)mRNA의 이중체(duplex)를 형성한 후 RNaseH 활성에 의해 표적 mRNA가 제거되거나 또는 표적 mRNA의 단백질 번역(translation)을 위한 리보좀 복합체(ribosomal complex)의 형성 및 진행을 방해함으로써 이루어진다고 알려져 있다(Dolnick, B. J., Cancer Inv., 9, 185-194, 1991). 또한, AS-올리고는 게놈 DNA와 결합하여 트리플-헬릭스(triple-helix) 구조를 형성함으로써 표적 유전자의 전사를 억제한다고도 알려져 있다(Young, S. L., et al.,PNAS,88, 10023-10026, 1991).

AS-올리고의 효능은 몇몇 동물모델 및 최근의 인간 질환에 대한 임상 연구를 통해 확인되었다. 포스포로티오에이트(phosphorothioate, 이하 "PS"라 한다) AS-올리고를 정맥주사하고 10일이 경과하면 오리의 간으로부터 B형 간염 바이러스 DNA가 사라지는 것이 확인되었다(Offenserger, W. B., et al.,EMBO J., 12, 1257-1262, 1993). AS-올리고는 또한, 고혈압 래트에게 주사하였을 경우 혈압을 낮추는 효과도 있는 것으로 밝혀졌다(Tomita, N., et al.,Hypertension, 26, 131-136, 1995). 무모 생쥐(nude mice)의 피하에 단백질 키나제 A의 RI_a소단위체(subunit)에 대한 포스포로티오에이트 AS-올리고를 주사하였을 경우 암의 성장이 중지된다는 보고도 있다(Nesterova, M., et al.,Nat. Med., 1, 528-533, 1995). 서로 다른 질병 유발 유전자에 대한 AS-올리고를 사용한 임상실험 결과 난소암 및 크론스 병(Crohn's disease)에서 상당한 효과가 있다는 것이 발견되었다(Roush, W., Science, 276, 1192-1193, 1997).

그러나, 표적 유전자 서열에 대한 서열 특이성을 이용한 AS-올리고의 효과는 기대한 효과를 얻지 못하는 경우가 많다. 이런 경우 AS-올리고의 두드러진 문제점은 뉴클레아제에 대한 불안정성 및 세포로의 흡입이 효과적으로 이루어지지 않는다는 것이다.

뉴클레아제에 대한 AS-올리고의 안정성은 PS(phosphorothioate) AS-올리고 또는 메틸포스포네이트(methylphosphonate, 이하 "MP"라 한다) AS-올리고와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 AS-올리고를 사용함으로써 어느정도 개선되었다. 그러나 각각의 변형된 뉴클레오타이드들은 서열 특이성이 결여되어 있거나 RNaseH에 대해 민감성이 떨어진다는 문제가 있다.

특정 서열로 구성된 AS-올리고는 표적 mRNA상의 상보적인 서열부위에 결합한다. 따라서, 특정 AS-올리고가 표적 mRNA의 모든 서열부분에 대하여 동일한 접근성을 보이는 것은 아니다. 이렇게 동일하지 않은 AS-올리고의 접근성은, 적어도 부분적으로는 표적 mRNA의 2차 및/또는 3차 구조에 의한 것으로 설명될 수 있다(Gryaznov, S., et al ,Nucleic Acids Res., 24, 1508-1514, 1996). 따라서, 표적 mRNA 전체 염기서열 중에서 보다 적은 2차 구조를 가질 것으로 예측되는 영역을 AS-올리고 제조를 위한 목적서열(안티센스서열)로 선별하는 것이 중요하다.

AS-올리고의 안정성을 증가시키기 위하여 본 발명자들은 표적 mRNA의 2차 구조를 예측할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 더 좋은 목적 서열(안티센스서열)을 찾아내는 방법을 고안하였으며, 이렇게 선별된 안티센스서열을 포함하고 스템-루프 구조를 갖는 AS-올리고 또는 공유-폐쇄형 AS-올리고를 제작하였다.

c-myb유전자에 대한 AS-올리고들은 암세포의 성장을 억제하는데 사용 가능하다.

c-myb원발암성유전자(protooncogene)에 의해 코딩되는 Myb 단백질은 주로 핵의 안쪽에 위치하며, 세포주기(cell cycle)에서 G1/S기의 전이 단계에 전사조절인자로서 작용한다. 원발암성유전자c-myb은 조혈세포(hematopoietic cell)의 증식(proliferation)과 분화(differentiation)에 중요한 역할을 한다. 조혈세포에서c-myb의 발현은 분화단계에 따라 다른 정도를 나타내며 분화의 마지막 단계에서는 거의 발현되지 않는 것으로 알려져 있다(Melani, C., et al.,Cancer Res., 51, 2897-2901, 1991). 그러나, 백혈병 세포(leukemic cells)에서는c-myb이 과잉 발현(overexpression)된다는 것이 발견되었다.

AS-올리고를 이용하여c-myb의 발현을 차단하면 전골수암(promyelocytic cancer) 세포주인 HL-60 및 만성 백혈병(chronic myelogenous leukemia) 세포주인 K562 세포의 성장이 억제된다는 것이 보고된 바 있다(Kimura, S., et al.,Cancer Res.,55, 1379-1384, 1995). 그러나, 상기 실험에 사용된c-mybAS-올리고는 부분적인 효과만 있는 것으로 확인되었다. 상기 실험에 사용된c-mybAS-올리고는 포스포디에스테르(phosphodiester, 이하 "PO"라 한다) AS-올리고 또는 PS AS-올리고(Anfossi, G., et al.,Proc. Nat1. Acad. Sci.USA, 86, 3379-3383, 1989)인데, 이들 올리고 분자들 특히 PO AS-올리고는 안정성이 떨어짐으로 인해 부분적인 안티센스 효과만을 나타낸다.

합리적인 목적부위 탐색에 의해 선별된 안티센스서열을 포함하고, 뉴클레아제에 대하여 증가된 안정성을 지닌 AS-올리고는c-mybmRNA를 완전히 제거하는데 사용될 수 있어 백혈병 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 최근 인간의 악성 질환(malignancies)에 대해 AS-올리고를 사용하는 것을 기초로 하는 분자 치료법(molecular therapeutics)의 개발에 초점이 모아지고 있다. 따라서, 백혈병 세포의 성장을 완전히 차단할 수 있는 개선된c-myb안티센스 분자를 찾는 것은 바람직하다.

이에 본 발명자들은 뉴클레아제에 대한 증가된 안정성과 안티센스 반응 특이성이 개선된 신규한 AS-올리고를 개발하기 위하여,c-mybmRNA의 2차 구조 분석을 통해 8개의 부위를 안티센스서열로 선별하고, 선별된c-myb의 안티센스서열들을 조합하여 신규한 안티센스 분자들, 즉 공유-폐쇄형 다중 안티센스(covalently-closed multiple antisense, 이하 "CMAS"라 한다)-올리고와 스템-루프 구조를 가지는 리본형 안티센스(ribbon-type antisense, 이하 "RiAS"라 한다)-올리고를 제조하고, 이들 신규한 AS-올리고들이 원발암성 유전자의 발현을 특이적으로 억제하며 뉴클레아제에 대하여 안정성을 보이는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 염기서열로부터 예측가능한 mRNA 2차 구조를 분석하여 상기 2차 구조가 적게 형성되는 영역을 안티센스서열로 선별함으로써 표적 mRNA에 대한 안티센스 반응 특이성을 개선시키고, 선형 안티센스-올리고를 접합시켜 폐쇄형으로 제조함으로써 뉴클레아제의 분해에 대한 안정성을 개선시킨 폐쇄형 안티센스-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 신규한 안티센스-올리고를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 보다 적은 2차 구조를 갖을 것으로 분석되는c-myb,c-myc또는k-ras의 mRNA 영역으로부터 선별된 안티센스서열을 제공한다.

또한, 본 발명은c-mybmRNA (표적 mRNA)에 대한 다중 안티센스 서열을 포함하는 CMAS(covalently-closed multiple antisense)-올리고를 제공한다. CMAS-올리고는 상보적인 접합 프라이머를 접합 템플리트로 이용하여 접합시킴으로써 폐쇄형으로 제조되었다.

또한, 본 발명은c-mybmRNA (표적 mRNA)에 대한 다중 안티센스 서열을 포함하는 RiAS(ribbon-type antisense)-올리고를 제공한다. RiAS-올리고는 서로 상보적인 서열로 구성되어 접착 말단 (cohesive end)을 형성하는 AS-올리고 두분자를 접합 템플리트로 이용하여 접합시킴으로써, 2개의 루프와 이것을 연결하는 1개의 스템 구조를 갖도록 제조되었다. 본 발명은 또한,c-mycmRNA 또는k-rasmRNA에 대한 다중 안티센스 서열을 포함하는 RiAS-올리고들을 제공한다.

또한, 본 발명은 유전자의 이상 발현(aberrant gene expression)으로 유발되는 암, 면역성 질환, 감염성 질환, 대사성 질환 또는 유전성 질환의 치료에 효과적인 신규한 AS-올리고, 이를 포함하는 안티센스-올리고-리포좀 복합체 및 약학적 조성물을 제공한다.

보다 상세하게는 본 발명은c-myb,c-myc또는k-ras를 포함하는 다양한 원발암성 유전자(protooncogene)를 표적 유전자로 하여 선별된 다중 표적 안티센스 서열(multiple target antisense sequence)을 포함하는 CMAS(covalently-closed multiple antisense)-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 CMAS-올리고에 관한 것이다. CMAS-올리고는 상보적 접합 프라이머를 접합 템플리트로 이용하여 접합시킴으로써 폐쇄형으로 제조되었다.

또한, 본 발명은c-myb, c-myc또는k-ras를 포함하는 다양한 원발암성 유전자를 표적 유전자로 하여 선별된 다중 표적 안티센스서열을 포함하는 RiAS(ribbon-type antisense)-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 RiAS-올리고에 관한 것이다. RiAS-올리고는 접착 말단(cohesive end)를 가지는 선형 안티센스-올리고 분자 자체를 접합 템플리트로 이용하여 접합시켜, 두개의 루프와 이것을 연결하는 하나의 스템으로 구성되는 구조를 갖도록 제조되었다.

또한, 본 발명은 유전자의 이상 발현(aberrant gene expression)으로 유발되는 암, 면역성 질환, 감염성 질환, 대사성 질환 또는 유전성 질환의 치료에 효과적인 신규한 AS-올리고, 이를 포함하는 안티센스-올리고-리포좀 복합체 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

도 1은c-myb폐쇄형 다중 안티센스-올리고(closed multiple antisense oligo, CMAS-올리고)의 구조를 나타내는 그림이고,

도 2는 CMAS-올리고의 전기영동 패턴을 보여주는 전기영동 사진이고,

A: 5% 메타포어(Metaphor) 아가로스 젤로 분석한 올리고,

레인 1; 사이즈 마커, 레인 2; 14머 라이게이션 프라이머,

레인 3; 선형 60머 올리고, 레인 4; CMAS-올리고.

B: 변성 폴리아크릴아마이드(denaturing polyacrylamide) 젤 상에서 선형 및 공유-폐쇄형 올리고의 안정성을 보여주는 전기영동 사진.

레인 1 및 레인 3; 엑소뉴클레아제 Ⅲ 미처리,

레인 2 및 레인 4; 엑소뉴클레아제 Ⅲ 처리.

도 3은c-myb리본형 안티센스-올리고(ribbon-type AS oligo, RiAS-올리고)의 구조를 나타내는 그림이고,

도 4는 RiAS-올리고의 전기영동 패턴을 보여주는 전기영동 사진이고,

A: 15%변성 아가로스 젤로 분석한 올리고,

레인 1; 58머 MIJ-78 분자, 레인 2; 116머 RIAS-올리고.

B: 엑소뉴클레아제 Ⅲ에 대한 MIJ-78 및 RiAS-올리고의 안정성을 보여주는 전기영동 사진.

레인 1 및 레인 3; 엑소뉴클레아제 Ⅲ 미처리,

레인 2 및 레인 4; 엑소뉴클레아제 Ⅲ 처리.

도 5는 혈청(serum) 존재시 선형 및 CMAS-올리고의 분리 양상(degradation pattern)을 보여주는 전기영동 사진이고,

A: 선형 AS-올리고의 안정성을 보여주는 전기영동 사진,

레인 1; 혈청 미처리(음성 대조군), 레인 2; 50% 혈청 처리,

레인 3; FBS 처리, 레인 4; 소 혈청(CS) 처리.

B: CMAS-올리고의 안정성을 보여주는 전기영동 사진.

레인 1; 혈청 미처리(음성 대조군), 레인 2; 50% 혈청 처리,

레인 3; FBS 처리, 레인 4; 소 혈청(CS) 처리,

도 6은 혈청 존재시 선형 및 RiAS-올리고의 분리 양상(degradation pattern)을 보여주는 전기영동 사진이고,

A. MIJ-78 분자의 안정성을 보여주는 전기영동 사진,

레인 1; 혈청 미처리(음성 대조군), 레인 2; 50% 혈청 처리,

레인 3; FBS 처리, 레인 4; 소 혈청(CS) 처리.

B: RiAS-올리고의 안정성을 보여주는 전기영동 사진.

레인 1; 혈청 미처리(음성 대조군), 레인 2; 50% 혈청 처리,

레인 3; FBS 처리, 레인 4; 소 혈청(CS) 처리.

도 7은 HL-60 세포에서c-myb발현에 미치는c-mybCMAS-올리고의 영향을 나타내는 전기영동 사진이고,

A: 총(total) RNA 및 두 개의c-myb프라이머를 사용하여 수행한 RT-PCR 결과를 보여주는 전기영동 사진,

레인 1; 60머 CMAS-올리고 0.3 ㎍ + 리포펙틴(lipofectin) 1 ㎍,

레인 2; 60머 CMAS-올리고 1 ㎍ + 리포펙틴 1 ㎍,

레인 3; 혼합된(scrambled) AS-올리고 1 ㎍ + 리포펙틴 1 ㎍.

B: 총 RNA 및 두 개의c-myb프라이머를 사용하여 수행한 RT-PCR 결과를 보여주는 전기영동 사진.

위:c-mybmRNA의 혼성화된 RT-PCR 밴드,

아래: β-액틴 mRNA의 혼성화된 RT-PCR 밴드.

도 8은 HL-60 세포에서c-mybmRNA의 발현에 미치는c-mybRiAS-올리고의 영향을 나타내는 전기영동 사진이고,

레인 1; RiAS-올리고 0.1 ㎍ + 리포펙틴(lipofectin) 0.8 ㎍,

레인 2; RiAS-올리고 0.1 ㎍ + 리포펙틴 0.8 ㎍,

레인 3; SC-올리고 0.2 ㎍ + 리포펙틴 0.8 ㎍.

위:c-mybmRNA의 혼성화된 RT-PCR 밴드,

아래: β-액틴 mRNA의 혼성화된 RT-PCR밴드.

도 9는 HL-60 세포의 증식에 미치는 60머 CMAS 또는 선형 AS-올리고의 영향을 나타내는 그래프이고,

-◆- : CMAS-올리고(1), -■- : CMAS-올리고(2), -●- : AS-올리고,

-▲- : S-MIJ-7, ● : 리포펙틴 단독, ○ : 대조군,

(1) 또는 (2) : AS-올리고의 처리회수.

도 10은 HL-60 세포의 증식에 미치는c-mybRiAS-올리고의 영향을 나타내는 그래프이고,

A:c-mybRiAS-올리고의 MTT분석 결과를 나타내는 그래프,

B:c-mybRiAS-올리고의 [³H]-티미딘(thymidine) 삽입을 나타내는 그래프.

도 11은c-mybRiAS-올리고에 의해 HL-60 세포의 성장이 저지되는 것을 보여주는 현미경 사진이고,

A:c-mybRiAS-올리고, B: SC-올리고, C: 리포펙틴 단독.

도 12는c-mybRiAS-올리고에 의해 HT-29 세포의 성장이 저지되는 것을 보여주는 현미경 사진이고,

A:c-mybRiAS-올리고, B: SC-올리고, C: 리포펙틴 단독.

도 13은c-mycRiAS-올리고에 의해 H7-29 세포의 성장이 저지되는 것을 보여주는 현미경 사진이고,

A:c-mycRiAS-올리고, B: SC-올리고, C: 리포펙틴 단독.

도 14는k-rasRiAS-올리고에 의해 HT-29 세포의 성장이 저지되는 것을 보여주는 현미경 사진이다.

A:k-rasRiAS-올리고, B: SC-올리고, C: 리포펙틴 단독.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 염기서열로부터 예측가능한 mRNA 2차 구조를 분석하여 상기 2차 구조가 적게 형성되는 영역을 안티센스서열로 선별함으로써 표적 mRNA에 대한 안티센스 반응 특이성을 개선시키고, 선형 안티센스-올리고를 접합시켜 폐쇄형으로 제조함으로써 뉴클레아제의 분해에 대한 안정성을 개선시킨 폐쇄형 안티센스-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 신규한 안티센스-올리고를 제공한다. 보다 구체적으로는, i) 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 염기 서열로부터 예측가능한 mRNA 2차 구조를 분석하여, 상기 2차 구조가 적게 형성되는 영역을 선별하는 단계; ii) 상기 단계(i)에서 선별된 영역의 염기서열을 하나 이상 포함하는 단일가닥의 선형 AS-올리고를 합성하는 단계; 및 iii) 상기 단계(ii)에서 합성된 선형 AS-올리고를, 접합 프라이머를 접합 템플리트로 이용하거나 또는 접착 말단을 가지는 선형 AS-올리고 분자 자체를 접합 템플리트로 이용하여 접합시키는 단계를 포함하는 폐쇄형 AS-올리고의 제조방법을 제공한다.

특히, 바람직한 실시예에 있는 바와 같이, 원발암성 유전자 중 하나인c-myb을 표적 유전자로 하는 안티센스-올리고를 제조하기 위하여 8개의 안티센스서열이 선별되었다. 상기 8개의 안티센스 서열들은 선택된 목적부위의 서열들과 상보적이다. AS-올리고를 제조하기 위하여 선별된 8개의 안티센스 서열중에서 4개(MIJ-1, MIJ-2, MIJ-3 및 MIJ-4)를 최종적으로 선택, 조합하여 CMAS-올리고를 제조하였으며, 3개(MIJ-3, MIJ-4 및 MIJ-17)를 조합하여서는 RiAS-올리고를 제조하였는데, 이들이 선택된 이유는 표적 mRNA에서 최소한의 2차 구조를 형성할 것으로 예측되었기 때문이다(표 1 참조).

개방된 말단을 가진 포스포디에스테르 골격(phosphodiester backbone)의 AS-올리고들은 성공적인 안티센스의 적용에 필수적인 뉴클레아제에 대한 안정성이 결여되어 있다. PS AS-올리고 또는 MP AS-올리고와 같이 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 AS-올리고들은 뉴클레아제에 대한 안정성은 증가되었으나, 증가된 안정성이 단지 부분적이거나 또는 가수분해 후 생성되는 변형-뉴클레오티드들이 DNA 복제나 회복(repair) 과정에서 잘못 삽입될(misincorporation) 위험성을 내포하고 있다. 양이온 리포좀(cationic liposome)과 결합된 스템-루프 올리고 또한 부분적인 안정성의 증가를 보여준다는 것이 보고되었다. 그러나, 뉴클레아제에 대한 안정성은 AS-올리고에 있어 여전히 중요한 관심사이다. 따라서 본 발명자들은 뉴클레아제에 대하여 증가된 안정성을 가지는 AS-올리고를 개발하기 위해 노력하였다.

따라서, 본 발명은 공유-폐쇄형 다중 안티센스(covalently-closed multiple antisense, CMAS)-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 CMAS-올리고를 제공한다. 보다 구체적인 CMAS-올리고의 제조방법은, 안티센스서열을 선별하는 단계 및 상기 안티센스서열을 포함하는 선형 AS-올리고를 합성하는 단계를 거친후, 선형 AS-올리고의 5'말단 및 3'말단에 각각 상보적인 염기서열을 포함하는 접합 프라이머를 접합 템플리트로 이용하고 접합 효소를 처리함으로써 접합시키는 것을 특징으로 한다.

특히, 폐쇄형 AS-올리고는 4개의 안티센스가 갖는 각기 다른 서열이 서로 상보적으로 결합되지 않도록 하여 표적 전사체와 원활한 결합이 이루어지도록 만들어 졌다. 이러한 AS-올리고들은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 4개의 안티센스 서열(MIJ-1, MIJ-2, MIJ-3 및 MIJ-4)을 포함하는 CMAS(covalently-closed multiple antisense)-올리고의 한 형태로 명명되었다(도 1 참조). CMAS-올리고는 15% 변성 PAGE 젤 상에서 선형에 비하여 약 10% 느려진 전기영동 운동 양상(electrophoretic mobility pattern)을 나타내었다(도 2의 A 참조). CMAS-올리고들은 또한, 기대했던 바와 같이 엑소뉴클레아제 Ⅲ에 대한 저항성을 보였으며, 변성 PAGE 젤 상에서 다중의 띠- 60머의 단량체, 120머의 이량체 및 180머의 3량체 -를 나타내었다. CMAS-올리고와는 달리 선형 올리고는 2시간만에 엑소뉴클레아제 Ⅲ 에 의하여 완전히 분해되었다(도 2의 B 참조).

또한, 본 발명은 리본형 안티센스(RiAS)-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 RiAS-올리고를 제공한다. 보다 구체적인 RiAS-올리고의 제조방법은, 안티센스서열을 선별하는 단계 및 상기 안티센스서열을 포함하는 선형 AS-올리고를 합성하는 단계를 거친후, 분자내 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 상기 선형 AS-올리고의 스템부위 단일가닥 염기서열이 동일구조의 다른 선형 AS-올리고의 스템부위 단일가닥과 상보적인 염기서열로 구성되어 접착 말단을 형성하는, AS-올리고 2분자를 상호 접합 템플리트로 이용하고, 접합 효소를 처리하여 접합시키는 것을 특징으로 한다.

CMAS-올리고는 매우 안정하지만 분자내 접합(ligation)을 위해 프라이머를 필요로 하며 이 프라이머는 후에 반드시 제거되어야 한다. 따라서 본 발명자들은 접합 프라이머를 이용하지 않고, 접착 말단(cohesive end)을 가지는 두분자의 선형 AS-올리고를 상호 템플리트로 이용함으로써 리본형의 RiAS-올리고를 제조하였다.

RiAS-올리고는 안티센스서열을 포함하는 두 개의 루프와 이들 루프를 연결하는 하나의 스템으로 구성되어 있다(도 3 참조). 구체적으로는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 기재되는 3개의 안티센스 서열(MIJ-3, MIJ-4 및 MIJ-17)들이 루프안에서 직렬로 연결되어 있다. 따라서, 3개의 서로 다른 안티센스 서열들 2 카피(총 6개의 안티센스 서열)가 하나의 RiAS-올리고를 형성하는 것이다. 이러한 RiAS-올리고 내에서 증가된 길이를 갖는 루프는 표적 mRNA 서열과 복합체를 형성할 때 생기는 비틀림 압력(torsional stress)을 순화시키는 역할을 한다. RiAS-올리고는 변성 PAGE 젤 상에서 선형 올리고(MIJ-78)에 비하여 현저하게 감소된 전기영동 운동 양상을 보인다(도 4의 A 참조). RiAS-올리고들은 또한, 기대했던 바와 같이 엑소뉴클레아제 Ⅲ에 대한 저항성을 보였으며, 변성 PAGE 젤 상에서 116머의 주요 밴드(major band)를 나타내었다. RiAS-올리고와는 달리 선형 올리고(MIJ-78)는 2시간 만에 엑소뉴클레아제 Ⅲ 에 의하여 완전히 분해되었다(도 4의 B 참조).

본 발명의 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고의 뉴클레아제 활성에 대한 증가된 안정성을 증명하기 위하여, CMAS-올리고 및 RiAS-올리고를 뉴클레아제 활성을 유지시키기 위해 열처리를 하지 않은 혈청과 함께 배양하였다.

그 결과, 선형 60머 올리고(CMAS-올리고의 원형, 도 5의 A 참조)와 선형 58머 올리고(RiAS-올리고의 원형, 도 6의 A 참조)는 혈청과 함께 24시간 동안 배양하면 완전히 분해되는 것을 확인하였다. 그러나, CMAS-올리고 및 RiAS-올리고는 인간 혈청, FBS 및 우혈청(calf serum)과 함께 24시간 동안 배양한 후에도 거의 영향받지 않음을 확인하였으며, 이는 본 발명의 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고가 뉴클레아제 활성에 대한 안정성이 현저히 증가되었다는 것을 보여주는 것이다(도 5의 B 및 도 6의 B).

또한, CMAS-올리고가 표적 mRNA를 서열 특이적인 방법으로 제거하는 기능을 한다는 것이 증명되었다(실시예 5 참조).

특히, CMAS-올리고는 리포펙틴(Lipofectin)과 결합하여 세포안으로 전달된다. 리포펙틴은 세포에 독성이 적고 재현성 있는 결과를 내기 때문에 선택되어 졌다. MIJ-5, 즉 인간c-myb을 표적으로 하는 CMAS-올리고는 대조군 SC-올리고에 비교해서c-mybmRNA의 95% 이상을 줄일 수 있다. MIJ-5의 선형 대응물인 MIJ-5A는c-mybmRNA의 약 37%를 감소시킨다(도 7 참조). 상기 결과는 본 발명의 CMAS-올리고가 표적 mRNA를 제거하는데 있어서, 소량을 사용하더라도 선형인 것보다 더 우수함을 나타낸다.

표적 mRNA를 제거하는 RiAS-올리고 기능은 CMAS-올리고와 동일한 방법으로 증명되었다.

HL-60세포를 리포펙틴 단독으로 뿐만 아니라 RiAS-올리고 및 SC-올리고 (scrambled-올리고)로 테스트하였다. RiAS-올리고는 리포펙틴과 복합체를 형성한 후 세포안으로 전달된다. 결과적으로 RiAS-올리고는c-mybmRNA를 완전히 제거할 수 있었다. 반면, SC-올리고는 리포펙틴을 단독으로 처리한 대조군에 비하여 약 30% 정도c-mybmRNA가 줄어들었다(도 8 참조). 이러한 결과는 본 발명의 RiAS-올리고는 소량으로 사용하더라도 표적 mRNA를 제거하는데 우수한 것을 나타낸다.

본 발명자들은 또한 PCR 산물의 서던블럿을 통하여 CMAS-올리고 및 RiAS-올 리고의 안티센스에 의해 감소된 전사체의 진위를 알아보았다.

CMAS-올리고의 경우에, RT-PCR로 증폭된c-myb은 MIJ-5의 처리에 의해 90% 이상이 줄어드는 것이 확인되었으며, 안티센스에 의해 줄어든 전사체가c-myb의 전사체임을 확인하였다(도 7의 B 참조).

RiAS-올리고의 경우에도, RT-PCR에 의해 증폭된c-myb의 메시지가 CMAS-올리고와 같이 안티센스에 의해 감소된 전사체가c-myb유래인 것을 확인하였다(도 8의 B 참조).

본 발명은 또한 유전자의 이상 발현(aberrant gene expression)으로 유발되는 암, 면역성 질환, 감염성 질환, 대사성 질환 또는 유전성 질환의 치료에 효과적인 신규한 AS-올리고(CMAS-올리고 또는 RiAS-올리고), 이를 포함하는 안티센스-올리고-리포좀 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

c-mybCMAS-올리고 또는c-mybRiAS-올리고가 백혈병 세포의 성장을 저해하는 것이 증명되었다.

특히,c-mybCMAS-올리고 및c-mybRiAS-올리고에 의한 백혈병 세포의 성장저해는 MTT분석, [³H] 티미딘 혼입(incorporation) 또는 연질(soft) 아가로스 상에서 콜로니 형성의 3가지 방법에 의해 측정된다.

MTT 분석의 결과, MIJ-5 즉 인간c-myb을 표적으로 하는 CMAS-올리고의 양을 증가하여 처리할 때 세포수가 점차로 감소되었다. MIJ-5로 두번 처리되었을 때 세포성장 저해가 현저하였다. HL-60 세포의 80% 이상의 성장저해가 낮은 농도에서도 관찰되었다(도 9 참조). 한편, 선형 60머 AS-올리고 즉 MIJ-5A 및 선형 센스-올리고는 대조군(sham control)과 비교하였을 때 세포 성장을 저해하지 않았다. 상기 결과는 본 발명의c-mybCMAS-올리고가 유용한 안티센스 제제이고 농도 의존적 방법으로 암세포 성장 억제효능을 가지고 있음을 의미한다.

또한, RiAS-올리고의 처리에 의해 세포 성장이 91% 이상 저해받는 것으로 관찰되었다(도 9의 A 참조). 한편, SC-올리고 및 리포펙틴 단독으로는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 세포 성장을 그다지 저해하지는 않았다. 상기 결과는 본 발명의c-mybRiAS-올리고가 또한 백혈병 세포 성장의 저해에 있어 효과적인 안티센스 제제라는 것을 의미한다.

연질 아가로스 상에서의 콜로니 형성 분석시, MIJ-5는 콜로니가 형성되는 수를 90%이상 감소시킨다(표 2 참조). MIJ-5A는 또한 콜로니 형성을 약 70% 정도 감소시키나, MIJ-5 보다 덜 효과적이었다. 반면에, 센스-올리고 및 SC-올리고는 각각 11% 및 32% 정도 콜로니가 감소되는 결과를 나타냈다.

또한, 세포에 트랜스펙트된c-mybRiAS-올리고는 대조군에 비해 형성된 콜로니수를 약 92% 정도 감소시킬 수 있다(표 3 참조). 한편, SC-올리고 및 리포펙틴 단독으로는 각각 7.9% 및 7.1% 정도 콜로니를 감소시킨다.

또한,c-mybRiAS-올리고의 백혈병 세포에 대한 성장 저해를 [³H] 티미딘 혼입에 의해 관찰하였다. 특히, RiAS-올리고는 HL-60 세포의 성장을 93% 억제한다. 한편, SC-올리고 및 리포펙틴 단독으로는 세포성장을 각각 16.8% 및 15.4% 정도로 저해한다(도 10의 B 참조). 현미경 관찰을 통해서 보면,c-mybRiAS-올리고로 처리한 후에 HL-60 세포의 성장은 SC-올리고 및 리포펙틴 단독으로 처리한 세포에 비해 두드러지게 저해되었다(도 11 참조).

본 발명의c-mybRiAS-올리고의 현저한 저해 활성에 고무되어, 본 발명자들은 두 개의 다른 원발암성유전자(protooncogene)c-myc및k-ras에 대한 다른 RiAS-올리고를 제조하고,c-mycRiAS-올리고 및k-rasRiAS-올리고가 세포성장의 저해기능이 있는지 조사하였다.

현미경 관찰 결과, HT-29 세포의 성장은 SC-올리고 및 리포펙틴 단독으로 처리한 세포에 비해 모든 RiAS-올리고 즉,c-mybRiAS-올리고,c-mycRiAS-올리고 및k-rasRiAS-올리고에 의해 두드러지게 저해되었다(도 12, 도 13 및 도 14 참조).

따라서, 본 발명의 새로운 RiAS-올리고는 뉴클레아제(nuclease) 활성에 대한 증가된 안정성 뿐만 아니라, 유전자의 이상 발현으로 유발되는 종양세포의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 보였다. 그러므로, 본 발명의 새로운 RiAS-올리고는 특정 유전자의 이상 발현으로 유발되는 질환의 치료를 위한 안티센스-올리고의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞ AS-올리고에 대한 목표 위치의 선별

AS-올리고의 목표 위치 선별은 안티센스 효과 즉, 표적 mRNA의 감소 또는 제거를 위하여 매우 중요한 것이다. 그러나 목표 위치 선별에 대한 방법은 다소 임의적(arbitrary)이다. 따라서 본 발명자들은 합리적인 목표 위치를 찾기 위하여 인간c-mybmRNA의 추정되는 이차 구조를 조사·분석하였다.

특히, 이차 구조의 시뮬레이션은 DNAsis 프로그램(Hitach Software, 일본)을 사용하여 수행하였다. 전체c-myb서열을 100 염기의 연속된 프레임에서 이차 구조 형성 가능성에 대해 순차적으로 조사하였다. 다음으로 이차 구조의 시뮬레이션에 대한 프레임은 30 염기씩 이동되었고 5'의 60 염기가 중복되게 하였다. 이러한 과정을 반복적으로 수행하여 주어진 염기서열에 대해 3가지 다른 프레임에서 예측가능한 2차 구조를 조사·분석하였다.

그 결과, 3가지 다른 프레임에서 2차 구조가 적게 형성되는 8개의 서열이c-mybmRNA 서열로부터 선별되었다(표 1).

표 1에서 표시된 바와 같이 상기 8개의 안티센스 서열은 선별된 목표 위치에대해 상보적(antisense)이다. 분자내 2차 구조 형성을 최소화하기 위하여, 선별된 8개의 안티센스서열 중에서 4개의 위치(MIJ-1, MIJ-2, MIJ-3 및 MIJ-4)가 CMAS-올리고를 형성하는 조합에서 마지막으로 선별되었고, 3개의 위치(MIJ-3, MIJ-4 및 MIJ-17)가 RiAS-올리고를 형성하는 조합에서 선별되었다.

＜실시예 2＞ CMAS(covalently-closed multiple antisense)-올리고의 제작

본 발명자들은 더욱 안정성있고, 개선된 AS-올리고를 개발하려 하였다. 상기 실시예 1에서 얻은 4개의 상이한 AS-올리고((MIJ-1, MIJ-2, MIJ-3 및 MIJ-4)를 CMAS-올리고를 제작하기 위하여 사용하였다. 목표 위치에 좀 더 쉽게 결합하기 위하여, 이차 구조 형성을 최소화하는 조합으로 4개의 상이한 안티센스 서열을 연결시켜 하나의 CMAS-올리고를 제작하였다. AS-올리고는 분자내 또는 분자간 공유 결합을 위해 합성되는 동안 5' 말단이 인산화되었다(도 1). 4개의 상이한 안티센스 서열을 포함하는 60머 AS-올리고의 서열은서열번호 6으로 기재된다.

AS-올리고의 양쪽 말단은, 상기 선형의 60머 AS-올리고의 양쪽 말단으로부터 각각 7 염기와 상보적인 서열을 갖고 있는 접합(ligation) 프라이머를 이용하여 접합시켰다. 접합 프라이머를 AS-올리고와 혼합하고 85℃에서 2분간 가열하고 상온에서 천천히 냉각시켰다. T4 라이게이제를 1유니트 첨가하고 16℃에서 16시간 동안 반응시켜 공유-폐쇄형 분자를 생성하였다. CMAS-올리고를 5% 메타포아 아가로스 젤(Metaphor agarose, FMC, USA) 또는 12% 변성 PAGE에서 전기영동하여, 선형 60머 올리고에 비해 다소 젤 지연현상과 엑소뉴클레아제(Exonuclease III)에 대해서도 분해되지 않는 것을 확인하였다. 접합 프라이머는 엑소뉴클레아제 III 에 의해 분해되거나 또는 AS-올리고를 90℃에서 가열시킨 후 변성 젤에서 전기영동함으로써 CMAS-올리고로부터 제거된다.

결과적으로, AS-올리고의 분자내 2차 구조는 상보적인 결합이 형성되지 않도록 제조되었으며, 표적 mRNA와 중합체 형성(duplex formation)이 용이하도록 제조되었다. 이러한 AS-올리고를 CMAS(covalently-closed multiple antisense)올리고라 명명하였다. CMAS-올리고는 15% 변성 PAGE 젤에서 선형 전구체에 비히 약 10% 정도 느린 전기영동 이동 양상을 보인다(도 2의 A) 예상했던 바와 같이 CMAS-올리고는 엑소뉴클레아제 Ⅲ에 의해 분해되지 않고, 변성 PAGE 젤에서 대부분을 차지하는 단량체(60머), 2량체(120머) 및 3량체(180 머)의 다중 밴드로 나타난다(도 2의 B). CMAS-올리고와는 달리 선형 AS-올리고는 엑소뉴클레아제 Ⅲ의 처리에 이해 2시간 후면 완전히 분해되었다.

＜실시예 3＞ 리본형 AS(RiAS)-올리고의 제작

본 발명자들은 두 개의 AS-올리고를 효소적으로 연결시켜 리본형 폐쇄 분자를 제조하고 RiAS-올리고라 명명하였다.

특히, RiAS-올리고는 두 개의 루프(loop)와 이것을 연결하는 하나의 스템(stem)으로 구성되어 있다. 각각의 루프는서열번호 3, 서열번호 4및서열번호 5로 기재되는 3개의 상이한 안티센스(MIJ-3, MIJ-4 및 MIJ-17) 서열을 포함한다. 표적 mRNA의 목표 위치에 좀더 쉽게 결합하기 위하여, 예측가능한 mRNA 2차 구조를 분석하고, 상기 2차 구조가 적게 형성되는 3개의 안티센스 서열의 조합을 선택하였다.c-mybAS-올리고(MIJ-78)는 5' 말단이 인산화되었다. 58머 MIJ-78의 서열은서열번호 7로 기재되며, 양말단이 개방된 선형 AS-올리고이다. MIJ-78은 분자내 스템-루프 구조를 형성한다. MIJ-78의 스템은 다른 MIJ-78 분자의 스템 부위와 상보적인 서열을 갖도록 구성되며, 구체적으로는 5'(p) GATC-3'의 염기서열로 표시된다. 2개의 MIJ78 분자는 양쪽 5' 말단이 상보적(cohesive)이므로 각각 다른 MIJ-78 분자에 대하여 접합 템플리트(ligation template)로 이용될 수 있다. MIJ-78 분자를 혼합하여 85℃에서 2분간 가열하고 상온에서 천천히 냉각하였다. T4 DNA 라이게이제를 1 유니트 첨가하고 16℃에서 24시간 반응시켜 디아드(diad)-대칭을 갖는 공유결합으로 연결된 분자를 생성하였다(도 3). RiAS-올리고를 15% 변성된 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하면 젤에서 지연 현상과 엑소뉴클리아제 Ⅲ에 대해서는 분해되지 않는 것을 관찰하였다.

그 결과, 두 개의 루프와 두 루프를 연결하는 하나의 스템을 포함하는 RiAS-올리고(116머)를 제작하였다. 루프 부위에는 3개의 안티센스 서열을 일렬로 위치시켜 RiAS-올리고의 길이를 증가시켰다.

결과적으로 3개의 상이한 안티센스 서열을 가진 2 카피(전부 6개의 안티센스 서열)가 RiAS-올리고에 있다. RiAS-올리고에서 확장된 길이의 루프는 표적 mRNA 서열과 RiAS-올리고가 복합체(duplex)를 형성할 때 생기는 비틀림(torsional stress)을 완충할 수 있다. RiAS-올리고는 변성 PAGE 젤에서 선형 전구체(MIJ-78)에 비해 두드러지게 천천히 이동되었다(도 4의 A). 예상했던 바와 같이 RiAS-올리고는 엑소뉴클레아제 Ⅲ에 의해 분해되지 않고, PAGE 젤에서 하나의 주요 밴드(116머)가 나타났다(도 4의 B). RiAS-올리고와는 다르게, MIJ-78(선형 AS-올리고)은 엑소뉴클레아제를 2시간 동안 처리하면 완전히 분해되었다.

＜실시예 4＞ 뉴클레아제 활성에 대한 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고의 향상된 안전성

본 발명의 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고의 뉴클레아제 활성에 대한 안정성을 테스트하기 위하여, CMAS-올리고 및 RiAS-올리고를 뉴클레아제 활성을 유지시키기 위하여 열로 불활성화 시키지 않은 혈청과 함께 반응시켰다.

특히, 비특이적 대조군-포스포디에스터(phosphodiester) 올리고(선형 60머)및 CMAS-올리고 각각 1 ㎍을 가공하지 않은 인간 혈청, FBS 및 소 혈청(가열하지 않고 불활성화된; HyClone, Logan, Utah, USA) 또는 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 첨가하여 반응시켰다. 100 ㎕ 반응액에 각각의 혈청의 15%를 AS-올리고에 첨가하고 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. AS-올리고를 페놀 및 클로로포름으로 추출하고 15% 변성 PAGE 젤에서 관찰하였다. 160 U/㎍ 올리고로 엑소뉴클레아제 Ⅲ(Takara, Japan)를 선형 및 CMAS-올리고에 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 엑소뉴클레아제 Ⅲ으로 처리한 AS-올리고를 추출하고 상기와 같은 방법으로 전기영동하였다. RiAS-올리고의 경우도 상기한 바와 같은 조건으로 반응시켰다.

CMAS-올리고의 안정성을 살펴보면, 선형 60머 올리고는 혈청의 존재하에서 24 시간 반응후에 완전히 분해되었다(도 5의 A). 그러나, 본 발명의 CMAS-올리고는 가공되지 않은 혈청, FBS 및 소 혈청과 함께 24 시간 동안 반응 후에 대부분이 원래대로 남아 있어 뉴클레아제에 대해 선형보다 향상된 안정성을 나타내었다(도 5의 B).

RiAS-올리고의 안정성을 살펴보면, 선형 58머는 각기 다른 혈청의 존재하에서 24시간 동안 반응후에 완전히 분해되었다(도 6의 A). 그러나, 본 발명의 RiAS-올리고는 가공되지 않은 혈청과 함께 24 시간 동안 반응 후에 대부분 원래의 모습으로 남아 있었고 이는 뉴클레아제에 대해 선형의 것 보다 향상된 안정성을 보였다(도 5의 B).

＜실시예 5＞ CMAS-올리고 및 RiAS-올리고에 의한 c-myb mRNA의 특이적 감소

본 발명에서 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고의 현저한 안정성으로 인해 본 발명자들은 AS-올리고가 서열 특이적인 방법으로 표적 mRNA를 제거하는 기능을 하는지 관찰하여 보았다.

＜5-1＞ 세포주 및 조직 배양

백혈병 세포주인 HL-60(promyelocytic leukemia cell line)와 K562 (chronic myelogenous leukemia cell line)를 대전, 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에서 분양받아 RPMI 1640(Gibco BRL, USA) 배지에 10% FBS(Gibco BRL, USA)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco BRL, USA)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하고, 배양 과정에서 세포 농도를 적정하게 유지시켰다. 적정한 세포 밀도를 유지하고 스톡(stock) 바이알을 녹인후 5 세대를 넘지 않도록 세포를 배양하였다. 배양액은 AS-올리고를 처리하기 하루전에 교체하였다.

＜5-2＞ 양이온 리포좀과 복합체를 형성한 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고의 형질전환

0.3 ㎍의 CMAS-올리고와 0.8 ㎍의 리포펙틴(Gibco BRL, USA) 또는 0.2 ㎍의 RiAS-올리고와 0.8 ㎍의 리포펙틴을 20 ㎕의 OPTI-MEM에 각각 희석하여 상온에서 40분간 반응시켰다. 각각의 성분을 상온에서 15분 동안 복합체를 형성하도록 혼합하였다. 세포를 AS-올리고를 첨가하기 하루 전에 항생제(RPMI 1640 + 10% FBS)가 없는 신선한 배양액에 첨가하고 실험을 하기 전에 OPTI-MEM으로 두 번 세척하였다. 세포 밀도를 5X10⁵세포/㎖로 맞추고 48-웰 플레이트(Falcon, USA)에 100 ㎕씩 분주하였다. 세포에 40 ㎕의 리포좀-올리고 복합체를 제0일과 제1일에 한번씩 2회 첨가하였다. AS-올리고로 처리한 세포를 37℃, 5% CO₂배양기에서 4시간 동안 반응시키고 10% FBS가 있는 OPTI-MEM 100 ㎕를 첨가하였다. 다음날 상층액 100 ㎕ 를 조심스럽게 제거하고 올리고-리포좀 복합체가 포함된 OPTI-MEM 20 ㎕로 교체하였다. 4시간 후에 세포에 항생제가 있는 완전 배지 100 ㎕를 추가적으로 첨가하고 분석하기 전에 37℃에서 하루 더 배양하였다.

＜5-3＞ RNA 분리 및 RT-PCR

Tripure^TM분리 시약(Boehringer Manhein, Germany)으로 제조회사의 지침에 따라 모든 RNA를 분리하였다. 모든 RNA를 분리하기 위하여 세포 배양액에 Tripure 시약 0.4 ㎖, 글리코젠 10 ㎍ 및 클로로포름 80 ㎕를 첨가하였다. RT-PCR은 Access^TMRT-PCR 키트(promega, USA)를 가지고 하나의 반응 튜브에서 수행하였다. PCR 튜브에 RNA, PCR 프라이머, AMV 역전사 효소(5 U/㎕), Tf1 DNA 중합효소(5 U/㎕), dNTP(10 mM, 1 ㎕) 및 MgSO₄(25 mM, 2.5 ㎕)를 첨가하였다. 일차 사슬 cDNA의 합성은 48℃에서 45분 동안 DNA 서멀 사이클러(termal cycler, Hybaid, USA)로 수행되었다. PCR 증폭은 제조회사의 지침에 따라 25 사이클로 연속적으로 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 젤에서 확인하고 젤 도큐먼트 프로그램(gel documentation program, Bio-Rad, USA)으로 정량을 측정하였다.

＜5-4＞ RT-PCR 절편의 서던 혼성화

RT-PCR 산물을 1% 아가로스 젤에서 전기영동하였다. DNA를 나일론 막(New England Biolab, USA)에 0.4 M NaOH에서 4시간 동안 트랜스퍼하였다. 막을 ECL 3' 올리고 표지된 30머 내부 프라이머 및 검출 시스템(Amersham Life Science, England)으로 혼성화하였다. 30머 내부 프라이머의 서열은서열번호 9로 기재된다. 혼성화는 5X SSC, 0.02% SDS가 포함된 버퍼 6 ㎖에서 62℃, 60분 동안 수행하였다. 막을 1% SDS가 포함된 5X SSC에서 두 번 세척하고 0.1% SDS가 포함된 1X SSC에서15분씩 두 번 세척하였다. 막을 블로킹 용액으로 처리한 다음 방사선 사진을 찍기 전에 HRP(horseradish peroxidase) 항-형광 접합 항체를 30분간 처리하였다.

본 발명의 CMAS-올리고는 서열 특이적인 방법으로 표적 mRNA를 제거하는 기능을 하는 것으로 증명되었다.

특히, CMAS-올리고는 리포펙틴과 복합체를 형성하여 세포안으로 전달된다. 리포펙틴은 세포에 독성이 적고 재현성 있는 결과를 내기 때문에 선택되어 졌다. 그 결과, 0.3 ㎍ MIJ-5 즉, 인간c-myb에 결합한 CMAS-올리고를 HL-60 세포에 형질전환을 위하여 리포펙틴 1 ㎍과 복합체를 형성하였다. MIJ-5는 대조군 SC-올리고에 비교하여c-mybmRNA의 95% 이상을 감소시킬 수 있었다. 한편, MIJ-5의 선형 대응물인 MIJ-5A는c-mybmRNA의 약 37%를 감소시켰다(도 7의 A). 이런 결과는 본 발명의 CMAS-올리고가 선형의 것보다 소량을 적용하더라도 표적 mRNA를 제거하는데 우수한 것을 나타낸다.

본 발명의 RiAS-올리고도 또한 서열 특이적인 방법으로 표적 mRNA를 잘 제거할 수 있다는 것이 증명되었다.

HL-60 세포를 리포펙틴 단독, RiAS-올리고 및 SC-올리고로 형질전환시켰다. RiAS-올리고는 리포펙틴과 복합체를 형성한 후에 세포 안으로 전달되었다. HL-60 세포에 형질전환을 위하여 인간c-myb에 결합하는 RiAS-올리고(0.1 ㎍ 또는 0.2㎍)를 0.8 ㎍ 리포펙틴과 복합체를 형성하였다. 결과적으로 RiAS-올리고(40 nM) 0.2 ㎍은c-mybmRNA를 완전히 제거할 수 있다(도 8의 A). 반면, SC-올리고는 리포펙틴 단독으로 처리한 것에 비하여 30% 정도c-mybmRNA를 감소시킬 수 있다. 그러나 α -액틴 발현은 다른 처리 조건 뿐만 아니라 RiAS-올리고 처리에 의해서도 영향을 받지 않았다. 상기 결과는 RiAS-올리고가 소량을 적용하더라도 표적 mRNA를 제거하는데 우수함을 나타낸다.

또한, 본 발명자들은 CMAS-올리고 및 RiAS-올리고의 안티센스 효과를 PCR 산물을 이용한 서던 블롯으로 조사하였다. HL-60 세포주를 MIJ-5 및 대조군 올리고를 포함하는 올리고로 감염시킨 후, 감염된 세포를 전체 DNA를 분리하기 위하여 사용하였다. CMAS-올리고의 경우에는 RT-PCR을 사용하여c-myb의 메시지(message)를 증폭하였고, 90% 이상의 메시지가 MIJ-5의 처리에 의하여 감소되는 것을 확인하였다(도 7의 B). 그러나, 아래쪽 패널(bottom panel)에서 관찰되는 α-액틴의 발현은 MIJ-5의 처리에 의해 영향을 받지 않았다. RiAS-올리고의 경우에는, 표지된 내부(internal) 교잡 올리고(30 단량체)를 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭된c-myb메시지를 검출하였다(도 8의 B). 상기 결과로부터, 증폭된 메시지는 실제로c-myb에 의해 유도되며, 0.2 ㎍의c-mybRiAS-올리고를 처리함으로써 메시지를 완전히 제거할 수 있음을 확인하였다.

＜실시예 6＞ c-myb CMAS-올리고와 c-myb RiAS-올리고에 의한 효과적인 백혈병 세포 성장의 저해.

c-myb가 백혈구의 증식에 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다.c-myb에 대한 AS-올리고의 작용 역시 보고되어 있는데, 이것은 백혈병 세포의 성장을 선택적으로 저해한다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의c-mybCMAS-올리고와c-mybRiAS-올리고가 백혈병 세포의 성장을 저해할 수 있는지를 확인하였다.

특히, 백혈병 세포에 대한c-mybCMAS-올리고와c-mybRiAS-올리고의 성장저해는 MTT 분석, [³H] 티미딘 흡입(incorporation) 또는 연질 아가로즈(soft agarose)에서의 콜로니 형성의 세가지 방법으로 측정하였다.

＜6-1＞ MTT 분석

MTT(3,-4[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, 이하, "MTT"라 약칭함) 분석을 위하여 HL-60 세포를 OPTI-MEM으로 두 차례 세척하였으며, 96-웰 플레이트에 50 ㎕씩 분주하였다. 조제된 올리고(CMAS-올리고의 경우에는 0.01 - 1 ㎕/15 ㎕, RiAS-올리고의 경우에는 0.2 ㎕/15 ㎕)와 리포펙틴(0.2㎍/15 ㎕)의 복합체로 세포를 5시간동안 미리 처리하였고, 이후 5일간 배양하였다. 세포를 100 ㎕ 부피로 수확한 후, PBS에 용해되어 있는 MTT 반응액(5 mg/㎖ in PBS; Sigma, USA)을 20 ㎕(100 ㎍) 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 0.1 N HCl을 포함하는 이소프로판올 100 ㎕를 세포에 첨가한 후 대기(ambient) 온도에서 1시간 더 반응시켰다. 살아있는 세포의 양을 계수하기 위하여 ELISA 판독기를 사용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, CMAS-올리고의 경우에는 MIJ-5의 처리량이 증가함에따라 세포의 수가 점진적으로 감소하였다. 세포를 MIJ-5로 두 번 처리한 경우에는 세포 성장 저해가 더욱 명확하게 나타났다. 0.13 ㎍(전체 0.24 ㎍) 정도의 매우 낮은 농도의 CMAS-올리고를 처리한 경우에도 80% 이상의 HL-60 세포 성장 저해가 관찰되었다(도 9). 한편, 선형의 60 단량체 AS-올리고, MIJ-5A 및 선형의 센스 올리고를 사용한 경우에는 대조군과 비교하였을 때 어떤 의미있는 세포성장 저해도 관찰되지 않았다. 상기 결과로부터,c-mybCMAS-올리고는 효과적인 안티센스 물질이며, 농도 의존적인 양식으로 종양 세포에 대해서 효과를 나타냄을 확인하였다.

RiAS-올리고의 경우에는, RiAS-올리고의 처리에 의해서 91%의 세포 성장이 저해되는 것이 관찰되었다(도 10의 A). 한편, SC-올리고와 리포펙틴 자체로는 처리되지 않은 대조군과 비교하였을 때 세포 성장을 의미있게 저해하지는 않았다. 상기 결과로부터,c-mybRiAS-올리고는 백혈구 세포의 성장을 저해하기 위한 효과적인 안티센스 물질임을 확인하였다.

＜6-2＞ 연질 아가로즈에서의 콜로니 형성

c-mybCMAS-올리고와c-mybRiAS-올리고에 의한 백혈구 세포 성장 저해를 확인하는 다른 방법으로서 연질 아가로즈에서의 콜로니 형성을 측정하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 6에 기재된 방법으로 K562 세포를 감염시켰고, 37℃, 5% CO₂존재하에서 24시간동안 배양하였다. 0.8%의 낮은 용해점 아가로즈와 20% FBS와 항생제를 포함하는 2x RPMI-1640 배지를 동일한 부피로 혼합한 혼합물을 세포에 첨가한 후 6-웰 플레이트에 분주하여 고체화시켰다. 6-웰 플레이트를 4℃에서 5분간 식힌 후에 15일동안 배양하였다. 20개 이상의 세포를 포함하는 콜로니를 양성으로 계수하였다.

그 결과, CMAS-올리고 MIJ-5는 콜로니의 형성을 90%이상 감소시켰다(표 2). MIJ-5A 또한 콜로니의 형성을 70% 감소시켰으나, 성장 저해는 덜 효과적이었다. 반면에, 센스 올리고와 SC-올리고는 각각 11%와 32% 정도의 콜로니 형성 감소를 나타내었다.

반면에,c-mybRiAS-올리고로 감염된 세포는 처리하지 않은 대조군과 비교하였을 때 형성된 콜로니의 수를 약 92% 감소시켰다(표 3). 한편, SC-올리고와 리포펙틴 단독으로는 각각 약 7.9%와 7.1%의 미미한 콜로니 형성 저해를 나타내었다.

＜6-3＞ [ ³ H] 티미딘 흡입

c-mybRiAS-올리고에 의한 백혈병 세포의 성장 저해를 확인하는 다른 방법으로서 [³H] 티미딘 흡입을 측정하였다. [³H] 티미딘 흡입을 측정하기 위하여, HL-60 세포를 상기에서와 동일하게 AS-올리고로 처리하였다. 세포에 0.5 μCi의 [³H] 티미딘(2.0 Ci/mmol; Amersham, England)을 첨가하여 16시간동안 3중으로(triplicate) 배양한 후, 유리미세섬유(glass microfiber) 여과지로 세포를 수확하였다. 여과지를 냉각된 PBS, 5% TCA 및 완전한(absolute) 에탄올의 순서로 사용하여 세척하였다. [³H] 티미딘 흡입은 톨루엔, 트리톤 X-100, PPO 및 POPOP를 포함하는 칵테일 용액에서 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, RiAS-올리고(0.2 ㎍)는 HL-60 세포의 성장을 93% 억제하였다(도 10의 B). 한편, SC-올리고 및 리포펙틴 단독으로는 각각 약 16.8% 및 15.4% 정도로 가볍게(mild) 세포의 성장을 억제하였다. 현미경으로 관찰한 결과,c-mybRiAS-올 리고를 처리하면 혼합(scrambled) 올리고 및 리포펙틴을 단독으로 처리한 세포와 비교하였을 때 HL-60의 성장이 눈에띄게 저해되었다(도 11).

＜실시예 8＞ c-myc RiAS-올리고와 k-ras RiAS-올리고의 효과적인 성장 저해

본 발명의c-mybRiAS-올리고의 현저한 저해 활성에 고무되어, 본 발명자들은 두 개의 다른 원인암유전자(protooncogene)인c-myc와k-ras에 대한 RiAS-올리고를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 제조하였다. 다음으로,c-mycRiAS-올리고와k-rasRiAS-올리고가 세포 성장을 잘 저해하는지를 조사하였다. 특히, 본 발명자들은 다른 종류의 세포주인 대장직장 선암종 세포주인 HT-29를 사용하였다.c-mycRiAS-올리고와k-rasRiAS-올리고에 의한 종양 세포의 성장 억제는 상기 실시예 ＜6-3＞과 동일한 방법의 [³H] 티미딘 흡입으로 측정하였다. HT-29 세포는 각각 0 2 ㎍c-mybRiAS-올리고 및 0.6 ㎍ 리포펙틴 또는 0.5 ㎍c-mycRiAS-올리고 및 1.5 ㎍ 리포펙틴 또는 0.5 ㎍k-rasRiAS-올리고 및 1.5 ㎍ 리포펙틴의 양이온 리포좀 복합체로 처리하였다. 각각의 RiAS-올리고로 5일 동안 처리한 후 현미경을 사용하여 HT-29 세포의 성장을 관찰하였다. 현미경사진으로 각각 RiAS-올리고(A), 혼합 올리고(B) 및 리포펙타민 단독(C)을 처리한 후의 성장 저해 효과를 조사하였다.

현미경사진 관찰 결과, HT-29 세포의 성장은 혼합 올리고 및 리포펙타민 단독 처리된 세포와 비교하였을 때 모든 RiAS-올리고,c-mybRiAS-올리고,c-mycRiAS-올리고 및k-rasRiAS-올리고에 의하여 현저하게 저해되었다(도 12, 도 13및도 14).

따라서, 본 발명의 신규한 RiAS-올리고는 뉴클레아제(nuclease) 활성에 대한 안정성이 증가되었을 뿐만 아니라 다양한 표적 서열을 가지는 종양세포의 성장을 효과적으로 저해하였다. 따라서, 본 발명의 신규한 RiAS-올리고는 유전자의 이상 발현으로 유발되는 다양한 인간의 질환에 대하여 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 염기서열로부터 예측가능한 mRNA 2차 구조를 분석하여 상기 2차 구조가 적게 형성되는 영역을 안티센스서열로 선별함으로써 표적 mRNA에 대한 안티센스 반응 특이성을 개선시키고, 선형 안티센스-올리고를 접합시켜 폐쇄형으로 제조함으로써 뉴클레아제의 분해에 대한 안정성을 개선시킨 폐쇄형 안티센스-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 신규한 안티센스-올리고를 제공한다.

보다 상세하게는, i) 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 염기 서열로부터 예측가능한 mRNA 2차 구조를 분석하여, 상기 2차 구조가 적게 형성되는 영역을 선별하는 단계; ii) 상기 단계(i)에서 선별된 영역의 염기서열을 하나 이상 포함하는 단일가닥의 선형 AS-올리고를 합성하는 단계; 및 iii) 상기 단계(ii)에서 합성된 선형 AS-올리고를, 접합 프라이머를 접합 템플리트로 이용하거나 또는 접착 말단을 가지는 선형 AS-올리고 분자 자체를 접합 템플리트로 이용하여 접합시키는 단계를 포함하는 폐쇄형 AS-올리고의 제조방법 및 상기 제조방법에 의하여 제조되는 신규한 안티센스-올리고를 제공한다.

인간 종양 세포를c-mycRiAS-올리고 및k-rasRiAS-올리고 뿐만 아니라c-mybCMAS-올리고 및c-mybCMAS-올리고로 처리하면, 본 발명의 신규한 AS-올리고에 의해서 유전자의 부적절한(aberrant) 발현은 효과적으로 제거된다. 따라서, 본 발명의 신규한 AS-올리고는 유전자의 기능 연구뿐만 아니라, 유전자의 이상 발현으로 유발되는 다양한 질환을 치료할 수 있는 안티센스 약제를 개발하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 신규한 AS-올리고는 유전자의 이상 발현으로 유발되는 암, 면역성 질환, 감염성 질환, 대사성 질환 또는 유전성 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물의 개발에 사용될 수 있다.

Claims

(1) 표적(target) 유전자 또는 표적 mRNA의 염기 서열로부터 예측가능한 mRNA 2차 구조를 분석하여, 상기 2차 구조가 적게 형성되는 영역을 선별하는 단계;

(2) 상기 단계(1)에서 선별된 영역의 염기서열을 하나 이상 포함하는 단일가닥의 선형 안티센스 올리고디옥시뉴클레오타이드(antisense oligodeoxynucleotide; AS-올리고)를 합성하는 단계; 및

(3) 상기 단계(2)에서 합성된 선형 AS-올리고를, 접합 프라이머(ligation primer)를 접합 템플리트(ligation template)로 이용하거나 또는 접착 말단(cohesive end)을 가지는 선형 AS-올리고 분자 자체를 접합 템플리트로 이용하여 접합시키는 단계를 포함하는, 표적 유전자 또는 표적 mRNA에 대한 안티센스 반응 특이성 및 뉴클레아제의 분해에 대한 안정성이 향상된, 폐쇄형 AS-올리고의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계(1)의 표적 유전자 또는 표적 mRNA는 유전자의 이상 발현으로 유발되는 암, 면역성 질환, 감염성 질환, 대사성 질환 또는 유전성 질환과 관련된 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 표적 유전자는 원인암유전자(protooncogene)인c-myc,c-myb또는k-ras인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계(3)의 접합 프라이머를 접합 템플리트로 이용하여 접합시키는 단계는, 제 1항 단계(2)에서 합성된 선형 AS-올리고의 5'말단 및 3'말단에 각각 상보적인 염기서열을 포함하는 접합 프라이머를 접합 템플리트로 이용하고 접합 효소(ligation enzyme)를 처리함으로써 접합시키는 것을 특징으로 하는, 공유-폐쇄형 다중 AS-올리고(covalently-closed multiple AS-올리고; CMAS-올리고)의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 접합 템플리트로 이용되는 접합 프라이머는 제 1항 단계(2)에서 합성된 선형 AS-올리고의 5'말단 및 3'말단으로부터 각각 5 내지 10개의 염기서열과 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 접합 효소는 T4 라이게이제 (T4 ligase)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항의 제조방법에 의하여 제조되는 CMAS-올리고.
c-myb유전자(표적 유전자)의 염기서열로부터 예측가능한c-mybmRNA 2차 구조를 분석하여 선별된 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 안티센스 서열중 하나 이상을 포함하고, 제 4항의 제조방법에 의하여 제조되는 CMAS-올리고.
제 8항에 있어서, 서열번호 6으로 기재되는 안티센스 서열을 포함하고, 제 4항의 제조방법에 의하여 제조되는 CMAS-올리고.
제 1항에 있어서, 상기 단계(3)의 접착 말단을 가지는 선형 AS-올리고 분자 자체를 접합 템플리트로 이용하여 접합시키는 단계는, 제 1항 단계(2)에서 합성되고 분자내 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 선형 AS-올리고의 스템부위 단일가닥 염기서열이 동일구조의 다른 선형 AS-올리고의 스템부위 단일가닥과 상보적인 염기서열로 구성되어 접착 말단을 형성하는, AS-올리고 2분자를 상호 접합 템플리트로 이용하고, 접합 효소를 처리하여 접합시키는 것을 특징으로 하는, 리본형 AS-올리고(ribbon-type AS-올리고; RiAS-올리고)의 제조방법.
제 10항에 있어서, 상기 접합 효소는 T4 라이게이제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항의 제조방법에 의하여 제조되는, 두 개의 루프와 이것을 연결하는 하나의 스템으로 구성되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 RiAS-올리고.
c-myb유전자(표적 유전자)의 염기서열로부터 예측가능한c-mybmRNA 2차 구조를 분석하여 선별된 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 기재되는 안티센스 서열중 하나 이상을 포함하고 접착 말단을 갖는 스템-루프 구조의 선형 AS-올리고 2분자를, 제 10항의 제조방법에 의하여 접합시켜 제조되는 RiAS-올리고.
제 13항에 있어서, 서열번호 7로 기재되는 안티센스 서열을 포함하고 접착 말단을 갖는 스템-루프 구조의 선형 AS-올리고 2분자를, 제 10항의 제조방법에 의하여 접합시켜 제조되는 RiAS-올리고.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 스템-루프 구조를 갖는 선형 AS-올리고의 접착 말단의 염기서열이 5'-(p)GATC-3'인 것을 특징으로 하는 RiAS-올리고.
제 4항의 제조방법에 의해 제조되는 CMAS-올리고 또는 제 10항의 제조방법에 의해 제조되는 RiAS-올리고를 포함하는 AS-올리고-리포좀(liposome) 복합체.
제 16항에 있어서, 상기 리포좀은 양이온(cationic) 리포좀인 것을 특징으로 하는 AS-올리고-리포좀 복합체.
제 4항의 제조방법에 의해 제조되는 CMAS-올리고 또는 제 10항의 제조방법에 의해 제조되는 RiAS-올리고를 유효성분으로 함유하는, 유전자의 이상 발현으로 유발되는 암, 면역성 질환, 감염성 질환, 대사성 질환 또는 유전성 질환의 치료에 사용되는 약학적 조성물.
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