KR100385905B1 - 유니진 유래의 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법 - Google Patents

유니진 유래의 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유니진(unigene) 유래의 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 효율적인 안티센스 활성을 나타내고 안정성이 뛰어난 단일가닥의 길이가 대단히 긴 폐쇄형 안티센스 분자를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 안티센스 분자는 각각의 유니진으로부터 제조되며 그 활성이 우수하고 신속하고 정확한 제조가 가능할 뿐만 아니라 안정성도 뛰어나므로, 상기 안티센스 분자를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법은 기능이 밝혀져 있지 않은 미지의 유전자를 검색하고 기능을 분석할 수 있을 뿐 아니라 난치성 질환에 대한 안티센스 치료제의 후보자를 선별하는데 있어서도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유니진 유래의 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법{Method for high-throughput screening and functional analysis of genes using unigene antisense library}
본 발명은 유니진 (unigene) 유래의 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 이용한 유전자 검색 및 기능 분석 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 효율적인 안티센스 활성을 나타내고 안정성이 뛰어난 단일가닥의 길이가 대단히 긴 폐쇄형 안티센스 분자를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법에 관한 것이다.
인간 게놈의 유전정보가 대부분 해독되면서 선진 발명 기관을 중심으로 새로운 유전자의 검색과 기능 분석을 위해 활발한 발명이 진행되고 있다. 새로운 유전자의 검색과 기능 분석은 세포의 생존뿐만 아니라 질병과 관련된 복잡한 생화학적, 생리적 물질대사를 이해하는데 많은 정보를 제공하고 있다. 이들은 궁극적으로 난치성 질병의 발병 기전을 밝히고, 세포내 혹은 세포간의 관계를 효율적으로 조절할 수 있게 함으로써 질병에 대한 효과적인 치료를 가능하게 한다.
안티센스 (antisense ; AS) 기술은 목적 유전자의 발현을 차단함으로써 발생되는 현상에 기초하여 유전자의 기능을 분석하도록 고안되어 사용되었다. 안티센스 분자 (antisense molecules)란 목적 유전자의 염기서열과 상보적이며 역순인 염기서열을 갖는 인위적인 합성 DNA 물질 혹은 RNA 전사체를 말한다. 안티센스 분자는 이론적으로 상보적인 목적 유전자의 염기서열 인식과 전사체 제거를 통하여 유전자의 발현을 특이적으로 감소시킬 수 있다. 따라서 유전자 산물의 상호 유연관계 및 기능 분석 발명에 대단히 유용할 수 있다. 근년에는 안티센스의 유전자 발현 억제 능력을 활용하여 유전자의 과발현으로 의해 발생하는 질병을 치료할 목적으로 분자 치료제의 개발 발명이 주로 진행되고 있다.
안티센스 작용 기전은 주로RNaseH의 활성으로 이루어진다.RNaseH는 DNA-RNA 혼성체 (hybrid) 를 특이적으로 인식한 후 RNA를 선택적으로 분해하는 효소이다. 즉, 외부에서 공급된 안티센스 분자가 목적 mRNA와 상보적으로 결합하면 전사체가RNaseH의 활성에 의해 분해됨으로써 단백질 합성이 저해되는 것이다. 또 다른 안티센스 작용 기전은 안티센스 DNA가 결합된 mRNA가 단백질 합성의 주형으로서의 기능을 상실토록 하는 것이다. 즉, DNA-RNA 결합에 따라 라이보좀(ribosome) 의 결합 및 진행을 방해함으로써 불완전한 단백질이 만들어지거나 단백질 합성이 되지 않도록 하는 기전을 통해 안티센스 작용을 한다. 그 외 안티센스 DNA가 게놈 DNA 선상의 프러모터에 결합한 후 트리플 헬릭스 (triple helix)를 형성하고 그 결과 mRNA 합성 과정인 전사를 억제하기도 한다. 이렇듯이 안티센스 작용기전은 이론적으로 목적 유전자에만 특이적으로 결합하여 작용하기 때문에 유전자의 기능을 분석하는데 매우 우수한 장점을 가질 수 있다.
이러한 연구의 일환으로서 개발된 제 1세대 안티센스 약물은 포스포다이에스테르 (phosphodiester : PO) 구조로 구성된 자연형의 합성 올리고뉴클레오타이드인데 제 1세대는 핵산분해효소 (nuclease)에 대단히 취약한 단점을 가지고 있었다. 따라서 핵산분해효소에 대한 안정성을 개선하기 위해 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트 (phosphate) 연결구조를 화학적으로 변조 (modification) 한 것이 제2세대 안티센스이며, 이러한 것에는 포스포로치오에이트 (phosphorothioate), 메틸포스페이트 (methylphosphate) 등이 알려져 있다. 포스포로치오에이트는 포스페이트의 산소 한 개가 황으로 치환된 올리고머로서, mRNA에 대한 결합력은 자연형 DNA보다 떨어지나 뉴클레아제에 대하여 강한 내성을 보이며, 생체외 (in vitro) 또는 생체내 (in vivo) 실험에서 약리활성을 가짐이 확인되었다. 그러나 화학적으로 변조된 안티센스 올리고머는 상보적 염기서열에 대한 결합 특이성의 저하 혹은RNaseH 활성의 저하 및 혈액응고 지연 등의 다양한 문제점들을 노출시켰다.
상기 제 2세대 안티센스 약물 중, 현재 그 일부는 항바이러스제, 항암제로서 임상시험 중에 있으며, 항바이러스제로서 시판중인 것도 있다 (Bennett et al.,Biochem. Pharmacol., 55, 9-19, 1998). 그러나 이들은 독성, 면역반응 유발 등의 문제점을 가지고 있어서 (Stein et al.,Current Opinion in Oncology, 6, 587-594, 1994; Krieg et al,Nature, 374, 549, 1995; O'Brien et al.,Leukemia, 8, 2156, 1994) 이러한 단점을 보완할 수 있는 안티센스 약물의 개발을 위한 새로운 전략들이 대두되었는데, 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트 골격을 아마이드나 에테르 등으로 바꾸는 방법, 뉴클레오타이드의 염기 구조를 변화시키는 방법 및 리보오스 당의 구조를 변화시키는 방법에 관한 연구 등이 이에 해당된다 (De Mesmaeker et al.,Acc. Chem. Res., 28, 366-374, 1995).
또 다른 일련의 제 2세대 안티센스로는 올리고뉴클레오타이드의 당의 구조에 변화를 준 올리고머가 있다. 이러한 당의 구조에 변화를 준 올리고머에는 2' 위치에 메톡시, 메톡시에톡시 (Martin et al.,Helv. Chim. Acta., 186, 584, 1995) 또는 아미노알콕시기 (Griffey et al.,J. Med. Chem., 39, 5100-5109, 1996)가 도입된 올리고머, 헥소오스 (hexose) 함유 올리고머 (Herdewijn et al., In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; ACS Symposium Series 580; Sanghvi, Y. S., Cook, P. D., Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, 1994; pp 80-99), 펜토오스 (pentose) 함유 올리고머 (Moser et al., Strategies and Chemical Approaches toward Oligonucleotide Therapeutics. In Perspectives in Medicinal Chemistry; Testa, B. et al., Eds.; Verlag Helvetica ChimicaActa: Basel, 1993, pp 275-97), 4'-아미노리보오스 (4'-aminoribose) 함유 올리고머 (Scharer et al.,J. Am. Chem. Soc., 117, 6623-6624, 1995), 4'-치오리보오스 (4'-thioribose) 함유 올리고머 (Bellonet al., 4-Thio RNA: a novel class of sugar-modified B-RNA. In Carbohydrate Modifications in Antisense Research; ACS Symposium Series 580; Sanghvi, Y. S., Cook, P. D., Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, 1994; pp 68-79) 및 이들의 유도체 등이 있다.
제 2세대에서는 안정성을 부여하기 위해 분자 자체에 화학적 치환을 도입하였으나 여전히 유전자 기능 분석에 있어서 몇 가지 중대한 단점을 가지고 있다. 첫째, 화학적 변형에 따른 비특이성 유발 및 세포독성 등의 부작용으로 유전자 기능을 분석하는데 있어 왜곡된 결과를 초래할 수 있다. 둘째, 합성 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 대부분 15∼28 mer로 목적 유전자에 작용할 효율적 안티센스 작용 부위를 찾는 필수적 과정을 거쳐야만 한다. 셋째, 염기 합성 오류에 의한 안티센스 작용부위에 대한 결합 특이성이 떨어져 안티센스의 활성 효율이 떨어질 가능성이 높다. 넷째, 고가의 합성 기기 및 시약으로 인한 생산비용이 높다. 다섯째, 목적 전사체에 대한 불완전한 안티센스 활성으로 인한 유전자 기능 누출 가능성이 있다.
유전자 기능 분석에 있어 제 1세대 및 제 2세대 안티센스의 이러한 문제점을 해소하기 위해 본 발명자들은 폐쇄형 안티센스로서 CMAS (closed multipleantisense)와 RiAS (ribbon type antisense)등의 제 3세대 안티센스 분자를 개발하였고, 이러한 분자가 혈장과 세포질에서 실제 우수한 안정성을 나타낼 뿐만 아니라 높은 안티센스 활성을 나타낸다는 사실을 보고하였다 (Moon et al.,J. Biol. Chem., 275, 4647-4653, 2000). 제 3세대 안티센스 분자는 기존의 여러 문제점들을 상당히 개선하였으나, 역시 합성에 따른 고비용과 상대적으로 긴 길이에 따른 합성의 효율성 (elongation coefficiency)에 문제점을 갖고 있다.
기존의 안티센스 분자가 가지는 상기 문제점들을 근본적으로 해결하기 위해 본 발명자들이 발명한 제 4세대 안티센스는 단일가닥의 길이가 대단히 긴 폐쇄형 안티센스 DNA 분자이며 세균 세포를 감염하는 단일가닥의 DNA 게놈을 가진 재조합 박테리오페이지로부터 제조된다(대한민국 특허출원 제2001-12061호 참조). 제 4세대 안티센스는 기존의 안티센스 분자에 비해 소량의 사용으로도 월등한 안티센스 효과를 나타낼 수 있으며, 전사체의 전체 염기서열을 대상으로 안티센스의 길이를 자유롭게 제작할 수 있다. 더불어 목표 설정 과정도 필요치 않을 뿐만 아니라 매우 안정하며, 단일유전자를 근간으로 수천 또는 수만의 다양한 종류의 안티센스를 대규모로 동시에 생산할 수 있고, 미생물을 통한 대량 생산이 용이하며 생산 비용 또한 저렴하다는 큰 장점들을 가진다. 이러한 제 4세대 안티센스의 장점을 활용하여 유전자 기능 분석에 적용하면 비용 절감과 더불어 신속성, 정확성을 기할 수 있으며 무엇보다 대량으로 분석할 수 있을 것으로 기대된다.
이러한 제 4세대 안티센스 분자의 특징을 정리하면 하기와 같다.
첫째, 현저히 개선된 안티센스 활성을 나타낸다. 약 십만개의 세포에 0.1 ㎍의 제 4세대 안티센스 분자를 처리하여서 제거 대상 전사체의 완전한 제거가 통상적으로 이루어진다. 사용한 단일가닥의 핵산에서 실제 안티센스 일련염기가 차지하는 비율은 대개 전체 분자의 1/5 이하가 된다. 따라서, 실제 사용된 안티센스의 양에 대비한 안티센스 활성은 대단히 우수함을 알 수 있다. 제 4세대가 높은 안티센스 활성을 가지는 이유는 기존의 합성 안티센스 올리고에 비해 길이가 매우 길기 때문일 것으로 생각되는데, 실제로 안티센스 벡터내에서 차지하는 안티센스 염기의 길이가 짧아질수록 안티센스 활성은 현저히 감소한다.
둘째, 신속하고 정확한 안티센스 분자의 제작이 가능하다. 제 4세대 안티센스는 안티센스 벡터의 일부로서 제작되므로 플라스미드 벡터를 가지고 있는 재조합 대장균 세포에서 배양 후 단일가닥 폐쇄형 분자로서 분리될 수 있다. 박테리오페이지 게놈의 일부로서 대장균에서 복제되어 분리되므로 안티센스 일련의 염기서열은 기존의 합성 올리고와 비교할 때 월등히 정확하다.
셋째, 리포좀과 복합체를 형성할 경우 원활한 세포내 흡수가 일어난다. 짧은 길이의 합성 올리고는 리포좀과의 결합시에 DOTAP 등과 같은 특정의 양이온 리포좀과 결합하는 경우에 세포내에 전달된 후 효율적인 안티센스 활성을 나타낸다. 합성 올리고와는 달리 제 4세대 안티센스 분자는 전체 길이가 3,000 bp 이상일 수 있으며 여러 곳에서 부분적으로 2차 구조를 형성하므로 양이온 리포좀에 결합한 후의 세포내 전달은 플라스미드의 세포내 흡수와 유사한 양상을 나타낸다. 상기의이유로 플라스미드의 세포내 전달에 사용될 수 있는 양이온 리포좀이 제 4세대 안티센스 분자의 세포내 전달에도 효율적으로 이용될 수 있다.
넷째, 안정성 개선으로 소량 사용이 가능하다. 제 3세대 폐쇄형 안티센스 합성 올리고는 기존의 핵산 올리고 분자보다 뛰어난 안정성을 나타내었다. 폐쇄형 합성 안티센스 올리고의 향상된 안정성은 엑소뉴클레아제의 활성 작용점의 소멸에 의한 것이므로, 제 4세대 안티센스 분자 역시 폐쇄형 분자로서 혈장의 존재 하에서 높은 안정성을 나타내며 양이온 리포좀과의 결합 시에는 더욱 안정화된다. 안티센스 분자의 안정성은 안티센스 기술의 성패여부를 결정짓는 가장 핵심적인 부분이므로 본 발명의 새로운 안티센스 분자가 우수한 안정성을 나타내는 것은 매우 고무적이다.
다섯째, 생산된 안티센스 분자의 염기서열이 자연상태의 핵산과 조성이 동일하며 대량생산이 용이하다. 제 4세대 안티센스는 박테리오페이지 게놈의 파생체인 페이지미드로서 수용 대장균에 도입된 후 대장균 자체의 DNA 복제 기전을 이용하여 생산되므로 화학적으로 변조되지 않은 자연상태의 핵산 조성을 가진다. 더불어 형질전환된 (transformed) 세균의 대량배양과 분리정제를 통하여 다량의 안티센스 분자 생산이 저렴한 비용으로 가능하다. 실제 안티센스 분자로 사용하는 고순도의 합성 올리고 제작은 고비용을 수반하므로 전임상 동물실험 혹은 임상실험의 장애요인으로 지적되어 왔다.
여섯째, 상이한 종류인 다중의 전사체 제거가 용이하다. 제 4세대 안티센스 분자는 단일가닥 벡터내에 크기의 제약을 받지 않고 안티센스 일련의 염기(sequence)를 포함시킬 수 있다. 안티센스 일련의 염기서열은 길이가 3,000 bp 이상으로도 용이하게 제작될 수 있으므로 여러개의 상이한 안티센스 일련의 염기를 직렬로 위치시킬 수 있고, 따라서 여러개의 상이한 유전자 전사체의 동시 다발적인 제거를 목표로 하는 것이 가능하다. 이러한 특성은 암 등의 난치성 질환에서 여러 발암관련 유전자의 발현을 동시에 억제해야 할 경우 대단히 유용할 수 있는 특성이다.
일곱번째, 자연성 핵산 조성으로 독성이 낮다. 화학적으로 변조된 기존 제 2세대 안티센스 분자와는 달리 제 4세대 안티센스 분자는 대장균의 배양을 통하여 얻어진 자연성 핵산을 기본조성으로 가지므로, 화학적 변조 핵산체에서 빈번히 관찰되던 비특이성, 독성 등의 문제가 현저하게 줄어들 것으로 예상된다.
여덟번째, 수천 혹은 수만 종류의 단일 유전자 유래의 안티센스 염기서열을 포함하는 단일가닥의 분자를 대규모로 동시에 제작할 수 있다. 페이지미드 벡터 혹은 M13 박테리오페이지에 기반을 둔 다양한 벡터들을 이용하여 제 4세대의 안티센스 분자를 제작할 수 있으므로 cDNA의 방향성을 선택적으로 할 경우 많은 수의 안티센스 분자를 단기간에 제작할 수 있다. 이렇게 제작된 수천 혹은 수만 종의 안티센스 분자들은 특정 세포주에서 일시적인 유전자의 발현 억제를 통한 유전자의 기능 분석에 효율적으로 이용될 수 있다. 합성 안티센스 올리고를 사용할 경우에는 제작상 장기간에 걸치는 시간적 소요와 전사체 상의 타겟 염기서열 (target sequence) 설정 등의 문제점이 수반되므로 효율적인 대규모 기능 분석 시스템을 확립하기가 쉽지 않다.
일반적으로 유전자 검색 시스템을 구축함에 있어서 안티센스를 이용한 다양한 방법들이 적용되어 왔는데, 기존의 유전자 검색 시스템은 단지 유전자 검색 기능만을 수행할 수 있기 때문에 부수적으로 복잡하고 장기간을 요하며 고비용이 수반되는 기능 분석 시스템을 별도로 구축하여야 하는 문제점이 지적되고 있다.
이에, 본 발명자들은 제 4세대 안티센스 기술을 이용하여 유니진 유래의 안티센스 분자들을 대규모로 동시에 정제하여 안티센스 라이브러리를 제작하였고, 상기 안티센스 분자를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 이용하여 유전자 기능의 효율적 분석 및 난치성 질환에 대한 안티센스 치료제의 후보자 선별을 대량으로 보다 신속히 수행할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유니진 유래의 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 랫트 rTNFα-M13 안티센스 (rTNFα-M13AS)의 제조 과정을 나타내는 모식도이고,
도 2는 본 발명의 rTNFα-M13AS 안티센스의 염기서열을 분석한 결과이고,
도 3은 본 발명의 rTNFα-M13AS 안티센스에 제한효소를 처리하여 rTNFα-M13AS이 단일가닥임을 확인한 결과(A), 및
레인 1 ; rTNF-αcDNA를 포함하는 페이지미드 DNA (rTNFα-페이지미드)
레인 2 ; rTNF-αM13AS
레인 3 ; 제한효소XhoI을 처리한 rTNFα-페이지미드
레인 4 ; 제한효소XhoI을 처리한 rTNF-αM13AS
레인 5 ; S1 뉴클리아제를 처리한 rTNFα-페이지미드
레인 6 ; S1 뉴클리아제를 처리한 rTNF-αM13AS
레인 7 ; 제한효소XhoI을 처리한 후 엑소뉴클리아제 III를 처리한 rTNF-α페이지미드
레인 8 ; 제한효소XhoI을 처리한 후 엑소뉴클리아제 III를 처리한 rTNF-αM13AS
뉴클리아제에 대한 본 발명의 rTNFα-M13AS 안티센스의 안정성을 확인한 결과(B)이고,
레인 1 ; rTNFα-페이지미드
레인 2 : rTNFα-M13AS
레인 3 ; rTNFα-페이지미드 + FBS(fetal bovine serum)
레인 4 ; 제한효소XhoI을 처리한 rTNFα-페이지미드 + 소 태아 혈청
레인 5 ; rTNFα-M13AS + FBS
레인 6 ; rTNFα-M13AS와 리포좀 복합체 + FBS
레인 7 ; rTNFα-페이지미드 + FBS
레인 8 : 제한효소XhoI을 처리한 rTNFα-페이지미드 + FBS
레인 9 ; rTNFα-M13AS + FBS
레인 10 ; rTNFα-M13AS와 리포좀 복합체 + FBS
도 4는 본 발명의 rTNF-αM13AS 안티센스에 의해 TNF-α의 발현이 특이적으로 억제되는 것을 나타내는 사진이고,
레인 1 ; 리포좀
레인 2 ; rTNFα-M13AS
레인 3 ; rTNFα-M13 센스
레인 4 ; rTNF-αcDNA를 포함하지 않는 단일가닥의 페이지미드
A; rTNF-α특이적 프라이머 쌍 및 β-액틴 특이적 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR 결과
B ; IL-1β 및 GAPDH를 증폭시킨 RT-PCR 결과
C ; TNF-α특이적 혼성화 탐침을 이용한 서던 블럿 분석 결과
도 5는 세포로부터 분비된 TNF-α단백질을 ELISA로 정량하여 본 발명의 rTNFα-M13AS 안티센스 분자에 의해 TNF-α의 발현이 감소된 것을 확인한 결과이고,
레인 1 ; rTNFα-M13AS
레인 2 ; rTNFα-M13SS
레인 3 ; M13 SS
레인 4 ; 리포펙타민(lipofectamine)만 첨가
도 6은 본 발명의 인간 NF-κB-M13AS 안티센스에 의해 인간 NF-κB의 발현이 억제되는 것을 확인한 결과이고,
A ; 농도 의존성 양상으로 NF-κB-M13AS에 의해 NF-κB의 RNA 수준이 감소하는 것을 나타내는 RT-PCR 결과
B ; NF-κB 특이적 혼성화 탐침을 이용한 서던 블럿 분석 결과
도 7은 본 발명의 단일 세포주에 다양한 종류의 유니진 유래 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 적용하는 신규 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법의 모식도이고,
도 8은 본 발명의 선별된 제한된 종류의 유니진 유래 안티센스 분자로 구성된 멀티-매크로어레이를 다양한 종류의 세포주에 적용하는 신규 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법의 모식도이고,
도 9는 본 발명의 폐쇄형 단일가닥 안티센스 분자를 이용한 유전자 기능 분석 방법의 체계를 나타낸 모식도이고,
도 10은 안티센스 분자를 제조하기 위한 전단계의 예로서 pBluescript SK(-) 페이지미드 벡터에 단일유전자의 단편을 삽입한 후 24-웰 플레이트 상에서 형질전환하여 얻은 선택배지상의 형질전환체 (transformant)를 일례로서 나타내는 사진이고,
도 11은도 10에서 얻은 형질전환체내의 재조합 페이지미드를 96개 단위로 대규모 분리정제한 결과를 일례로서 나타낸 것이며,
도 12는도 11에서 분리정제한 96개의 재조합 페이지미드를 제한효소로 처리하여 삽입 단편을 확인함으로써 서브클로닝 (subcloning) 이 성공적으로 되었음을 의미하는 결과를 일례로서 나타낸 것이며,
도 13은도 10~도 12를 거쳐 확인한 형질전환체를 배양한 후 배양 상등액(supernatant) 으로부터 단일가닥의 폐쇄형 안티센스 분자를 96개 단위로 대규모 분리정제한 결과를 일례로서 나타낸 것이며,
도 14는 단일 세포주에 다수의 안티센스 분자를 적용하여 대규모 유전자 검색 및 기능 분석을 수행한 일례로서, 폐암세포주 (NCI-H1299 cell line) 에 384 종류의 유니진 유래 안티센스 분자를 형질감염 (transfection) 한 후 MTT 분석을 통해 세포의 성장에 영향을 주는 유전자를 1차적으로 검색함과 동시에 그 기능을 분석한 결과의 예를 나타낸 것이며,
도 15는 선별된 제한된 숫자의 안티센스 분자를 다양한 종류의 세포주에 적용하여 대규모 유전자 검색 및 기능 분석을 수행한 예로서, 96 종류의 유니진 유래 안티센스 분자를 간암세포주 (HepG2 cell line) 및 폐암세포주 (NCI-H1299 cell line) 에 형질감염 (transfection) 한 후 MTT 분석을 통해 세포의 성장에 영향을 주는 유전자를 1차적으로 검색함과 동시에 그 기능을 분석한 결과의 예를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일가닥으로서 길이가 대단히 긴단일유전자 유래의 제 4세대 폐쇄형 안티센스 분자 및 그의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 단일 세포주에 다양한 종류의 안티센스 분자를 적용하여 수행하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 선별한 제한된 종류의 안티센스 분자를 다수의 세포주에 적용하여 수행하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 제공한다.본 발명에 있어서, "유니진 (unigene)"이라는 용어는 한 종류의 특정 유전자를 의미하며, 이러한 유니진들의 염기서열은 기존의 연구를 통해 이미 밝혀져 있다.또한, "안티센스 라이브러리 (antisense library)" 또는 "안티센스 멀티-매크로어레이 (antisense multi-macroarray)"라는 용어는 다양한 종류의 유니진 유래 안티센스 분자들을 정제한 후 각각의 안티센스 분자들을 마이크로플레이트의 독립적인 웰에 정렬해 놓은 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 핵산 분해효소에 대한 안정성 및 표적 mRNA 또는 표적 유전자에 대한 안티센스 반응 특이성이 우수하면서 길이가 긴 안티센스-분자를 제조하기 위하여, 폐쇄형의 단일가닥 게놈을 갖는 박테리오페이지로부터 유래하여 상기 페이지의 복제원점을 포함하는 페이지미드 벡터 및 헬퍼페이지 시스템을 이용하는 안티센스-분자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 안티센스 분자의 제조 방법은,
1) 하나 이상의 유니진 또는 표적 mRNA로부터 cDNA 단편을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1의 cDNA 단편을 클로닝 벡터에 안티센스 서열이 복제되는 방향으로 삽입하여 재조합 페이지미드를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2의 재조합 페이지미드를 형질전환체에 도입하여 배양함으로써, 유니진 또는 표적 mRNA에 대한 안티센스 서열을 포함하고 폐쇄형 단일가닥 형태의 안티센스-분자를 대량으로 생산하는 단계를 포함한다.
상기 제조 방법을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
우선, 상기 단계 1의 cDNA 단편, 즉 삽입체(insert)는 하나 이상의 유니진 또는 표적 mRNA로부터 당업계에서 통상적으로 사용되는 여하한 방법을 통하여 제조될 수 있으며, 유니진 cDNA 단편은 당업계에서 시판되는 유니진 클론 셋트를 구매함으로써 확보할 수 있다. 또한, 세포주로부터 전체 mRNA를 분리한 후, 상기 표적 mRNA의 전체 또는 일부 염기서열을 RT-PCR로 클로닝하는 방법도 가능하다. 이를 위하여 올리고 뉴클레오타이드(프라이머)를 제작하는데, 상기 올리고 뉴클레오타이드에는 용이한 클로닝을 위하여 제한효소 인식부위를 포함할 수 있다.
RT-PCR를 통해 제조되어, 겔로부터 분리한 cDNA 단편을 폐쇄형 단일가닥 게놈을 가지는 페이지에서 유래하여 상기 페이지의 복제원점을 포함하는 페이지미드 벡터에 삽입하여 재조합 페이지미드 벡터를 제조한다. 상기 재조합 페이지미드벡터를 대장균 등에 형질전환(transformation)시킨 후 이 형질전환체를 분리하여 -20℃에 보관하며, 염기서열 분석을 통하여 목적하는 유전자의 cDNA가 삽입되었는지 여부를 확인한다.
상기 단계 1에서 표적 유전자 (또는 표적 mRNA)는 암을 유발하는 원발암성 유전자(proto-oncogene)를 비롯하여 유전자의 이상 발현으로 유발되는 면역질환, 감염 질환, 대사 질환 및 유전성 질환 등의 발생과 진행에 관련된 유전자가 될 수 있다. 또한, 본원의 제조방법에 의하여 제조되는 안티센스-분자는 수백 베이스(base)의 안티센스서열을 포함할 수 있으므로, 하나 이상의 표적 유전자(또는 표적 mRNA)에 대한 안티센스서열을 포함하는 것이 가능하다. 본 발명자들은 바람직한 실시예에서 종양괴사 인자인 TNF-α및 NF-κB를 각각 표적 유전자로 하는 안티센스 분자를 제조하였다.
또한, 상기 단계 2에서 클로닝 벡터는 폐쇄형 단일가닥 게놈을 가지는 페이지로부터 유래하며 상기 페이지의 복제개시점을 포함하는 벡터인 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 선형 페이지(filamentous phage) f1 Ori(f1 복제 시작점)를 포함하는 벡터, 예를 들면 pUC 벡터, M13mp 벡터, pBluescript 벡터(Stratagene, USA), pGEM-f(Promega, USA) 벡터, 또는 M13 페이지미드 벡터 등의 페이지미드 벡터가 바람직하며, 본 발명자들은 바람직한 실시예로서 M13 박테이오페이지의 페이지미드 벡터인 pBluescript SK(-)를 사용하였다. 여기서 선형 박테리오페이지(filmentous bacteriophages)인 M13을 기반으로 하는 재조합 바이러스 벡터가 다양한 크기의 안티센스 염기서열을 받아들일 수 있으므로 유리하다. 그럼에도 불구하고, 다면체 구형(icosaheral shape)이며 단일가닥 폐쇄형 게놈을 갖고있는 여러종류의 박테리오페이지(예를 들면, φχ174 phages 등)를 사용할 경우 정해진 크기의 범위내에서는 안티센스의 클로닝 벡터로 사용이 가능하다.
아울러, 단계 3에서 생산된 안티센스-분자는 대장균 등 형질전환체에서 염기서열 교정(proof reading) 기능이 있는 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의해 복제되기 때문에, 화학합성된 안티센스-올리고와는 달리 안티센스 염기서열의 충실도가 대단히 우수하며, 세균세포의 대량 배양으로 다량의 안티센스-분자를 획득할 수 있으므로 화학합성에 따른 고비용의 문제가 발생하지 않는 추가적인 장점을 갖는다.
또한, 본 발명은 상기의 제조방법에 따라 제조되어 핵산 분해효소에 대한 안정성이 뛰어나고 표적 mRNA (또는 표적 유전자)에 대한 안티센스 반응 특이성이 우수한 안티센스-분자를 제공한다.
상기의 제조방법에 의해 생산된 본 발명의 폐쇄형 단일가닥 안티센스-분자는 표적 유전자 또는 표적 mRNA 염기서열의 일부분 또는 전체를 포함할 수 있다. 또한, M13 박테리오페이지는 구조상 여러개의 안티센스 염기서열을 단일가닥 분자 내에 위치시키는 것이 용이하며, 더불어 재조합 페이지미드에 의해 생산된 안티센스-분자는 표적 mRNA에 대하여 매우 충실한 염기서열을 갖는다. 본 발명자들은 길이가 708 bp인 TNF-αmRNA에 대한 안티센스 염기서열을 포함하는 M13 안티센스-분자를 제조하였는데, 이와 같이 표적 mRNA에 대한 안티센스 염기서열이 대단히 긴 경우에는 상보적으로 결합하고자 하는 안티센스 염기서열의 충실도가 크게 문제되지 않는다. 따라서, 본 발명의 안티센스-분자 제조방법은, 기존의 화학합성에 의해 생산되는 안티센스-올리고의 반응 특이성을 증진시키기 위하여 꼭 필요한 표적 mRNA의 2차 구조분석 후 특정한 인식부위(안티센스서열)를 선별하는 단계 등을 요하지 않으므로, 안티센스서열 선별에 필요한 시간과 노력을 절감하는 장점이 있다.
이러한 장점은 단일 뉴클레오타이드(single nucleotide)에서의 빈번한 동질이상(polymorphism)의 발생이 발견되는 면역질환 및 유전질환 또는 HIV와 같은 저항성 균주의 발생이 문제되는 감염성질환에 대하여 포괄적으로 안티센스 활성을 가지는 분자치료제의 개발을 가능하게 한다.
M13 박테리오페이지는 폐쇄형 단일가닥 DNA 바이러스(closed single strand DNA virus)로서, 현재까지는 Sanger의 방법을 통한 DNA 염기서열 분석(sequencing)이나 돌연변이 유발(mutagenesis)에 보편적으로 이용되어 왔으나, 본원에서와 같이 안티센스-분자를 제조하기 위하여 사용된 바가 전혀 없었으며, 대량생산과 분리가 쉽게 이루어 질 수 있는 장점 또한 가지고 있다. 따라서, 폐쇄형 안티센스-분자의 안정성과 M13 박테리오페이지의 생물학적인 배양을 활용하여 길이가 길고 대량생산이 용이한 단일가닥 M13 DNA에 기반을 둔 안티센스-분자를 제조하기 위해서 재조합 박테리오페이지 시스템이 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명자들은 상기의 안티센스 제조방법에 따라 재조합 M13 박테리오페이지 시스템을 이용하여 면역 유발성 싸이토카인인 TNF-αmRNA 및 전사인자(transcription factor)인 NF-κB mRNA에 대한 안티센스-분자를 단일가닥 M13 페이지 게놈의 일부로 제조하였다.
종양 괴사 인자 알파(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-α)는 정상적인 면역반응 과정에 필요한 싸이토카인(cytokine)이지만, 이들이 과다생성되면 류마티스 관절염 등의 자가면역 질환, 알러지(allergy), 염증성 질환 및 패혈증 등의 면역학적 질환(immunopathology)의 발생 및 진행을 유도한다고 알려져 있다(Waszczykowska E, Robak E, Wozniacka A, Narbutt J, Torzecka JD, and Sysa-Jedrzejowska A.,Mediators Inflamm.,1999, 8(2), 93-100 ; Pulsatelli L, Dolzani P, Piacentini A, Silvestri T, Ruggeri R, Gualtieri G, Meliconi R, and Facchini A.,J. Rheumatol.,1999, 26(9), 1992-2001). 또한, 대표적 전사인자(transcription factor)인 NF-κB는 세포성장에 관여하는 여러 유전자의 전사를 활성화 하는 것으로 알려져있다. 따라서, 재조합 M13 박테리오페이지 시스템을 이용하여 제조한 TNF-α 및 NF-κB에 대한 안티센스-분자는 상기 유전자의 이상 발현으로 인해 유발되는 질병의 발생 및 진행을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.
상기의 제조방법에 따라 생산된 TNF-α 및 NF-κB에 대한 단일가닥 안티센스-분자들은 각각 3.7 Kb 크기로 708 bp의 TNF-α안티센스 염기서열 및 700 bp 크기의 NF-κB 안티센스 염기서열을 포함하고 있으며(도 2참조), 핵산 분해효소에 대한 안정성 및 표적으로 하는 mRNA에 대한 안티센스 반응 특이성이 우수하여 rTNF-α 및 NF-κB의 발현을 효과적으로 억제하며 안티센스 활성이 월등하게 향상되었음을 확인하였다(도 3, 도 6a및6b참조).
실제로 TNF-α의 안티센스 염기서열만을 계산하면 기존에 본 발명자들이 보고한 RiAS-올리고에 비하여 10배 이상 안티센스 활성이 증가됨을 보였다. RiAS-올리고는 기존의 어떠한 선형(linear) 올리고 보다도 핵산 분해효소에 대한 안정성 및 안티센스 활성이 우수한 것으로 보고되었는데, 이러한 RiAS-올리고 보다 본 발명의 M13 안티센스-분자가 월등한 안티센스 활성을 나타내는 것은 M13 안티센스-분자가 기존의 안티센스-올리고 보다 매우 긴 안티센스 염기서열을 포함하고 있어, M13 안티센스-분자와 표적 mRNA (또는 표적 유전자)간의 상보적 결합이 향상된 때문인 것으로 사료된다.
또한, 본 발명의 안티센스-분자는 길이가 길어서 리포좀 전달 효율(liposome delivery efficiency)이 좀더 플라스미드에 가까울 것으로 예상되며, 실제로 리포좀과 결합된 M13 안티센스-분자 복합체는 세포 내로의 흡수율이 증가하여 결과적으로 안티센스의 활성을 향상시킨다.
한편, 본 발명의 M13 안티센스-분자는 cDNA 단편의 클로닝 방향에 따라 표적 mRNA에 대한 안티센스 염기서열 이외에 암피실린(ampicillin) 내성유전자 및 β-갈락토시데아제 유전자(β-galactosidease, lacZ) 등의 페이지미드 벡터유래의 다른 유전자에 대한 안티센스 염기서열이 함께 포함될 수 있지만, M13 안티센스-분자에 의한 비선택적 저해 활성(non specific inhibition)은 관찰되지 않는다. 실제로, 안티센스-분자에 의한 비선택적 저해는 화학적으로 변조된 합성 올리고에 의해서 주로 관찰되며, 원핵세포 유전자(prokaryotic genes)와 진핵세포 유전자(eukaryotic genes)의 염기서열에 있어서의 상동성(homology)이 대부분의 경우 현저한 차이를 보인다는 사실과 플라스미드상에 존재하는 유전자가 원핵세포에서 유래한다는 사실 등을 고려할 때, 본 발명의 M13 안티센스-분자에 포함된 벡터유래의 유전자 염기서열과 표적 mRNA에 대한 안티센스 염기서열은 비선택적 저해를 유발하지 않을 것으로 보인다.
기존의 합성 안티센스-올리고가 핵산 분해효소에 의해 쉽게 분해되는 단점을 보완하기 위하여 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 제조하기도 하는데, 이렇게 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 게놈에 재편입시 돌연변이를 유발할 수 있을 뿐만 아니라 혈액응고지연 또는 보체활성작용(complement activation) 등의 문제점을 유발하기도 한다. 하지만, 본 발명에서 제공하는 안티센스-분자는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드가 아니기 때문에 인체 내에서 분해된 후 DNA 복제 혹은 수복 때 재 사용되더라도 돌연변이를 유발하지 않는 장점을 갖는다.
또한, 본 발명은 단일 세포주에 다양한 종류의 유니진 유래 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 적용하여 수행하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 제공한다.
단일 세포주에 다양한 종류의 안티센스 분자를 적용하여 수행하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법은,
1) 다양한 종류의 유니진 유래 안티센스 분자를 대규모로 제조하여 안티센스 라이브러리를 제작하는 단계;
2) 마이크로 플레이트의 각 웰에 한 종류의 세포주를 분주하는 단계;
3) 각 종류의 안티센스 분자마다 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계; 및
4) 단계 3)의 다양한 종류의 안티센스 분자-전달체 복합체를 각각 단계 2)의 세포주에 형질감염한 후 유전자 기능 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
상기 단계 2)는 상기 단계 1)의 안티센스 라이브러리를 적용할 단일 세포주를 선택한 후 각 웰마다 동일한 숫자의 세포를 균등하게 분주하는 것이다.
적용 세포주로는 간암, 폐암, 위암, 유방암, 방광암, 전립선안, 혈액암, 피부암 등의 암 관련 세포주, 비만 세포주, 탈모증 세포주, 자가면역 질환 세포주, 대사질환 세포주 등 광범위한 질환 관련 세포주 및 특정 세포주 중 하나를 선택할 수 있다. 세포주의 분주 시기는 세포의 특성(예 : 부유세포 및 부착세포)에 따라 안티센스-전달체의 적용 시기 전 또는 후로 달라질 수 있다.
단계 3)은 안티센스 분자와 전달체의 복합체를 형성하는 단계로서, 제작된 안티센스 분자를 특정 세포주내로 효율적으로 전달하기 위해 전달체를 사용한다. 사용될 전달체는 안티센스 및 세포주에 따라서 결정되며 리포좀, 양이온 폴리머 및 양이온 폴리머-바이러스 복합체, 바이러스 및 펩타이드 등이 사용될 수 있고 안티센스-전달체의 복합체 형태로 세포주에 적용된다. 안티센스 분자-전달체의 복합체는 96-웰 또는 384-웰 마이크로플레이트의 각 웰마다 종류가 다른 안티센스 분자가 적용된다.
단계 4)는 상기 단계 2)에서 분주해 놓은 단일 세포주에 단계 3)에서 제조한 안티센스 분자-전달체 복합체를 형질감염 한 후 유전자 기능 분석을 수행하는 단계이다. 96-웰 플레이트를 사용할 경우, 세포 및 리포좀의 종류에 따라 안티센스 DNA와 양이온 리포좀을 1 : 3 내지 1 : 4 등의 다양한 비율로 혼합할 수 있으며 일반적으로는 1 : 3 (w/w)의 비율로 혼합하여 세포를 형질감염 (transfection) 한다. 안티센스 분자의 활성을 확인하기 위하여 세포 상등액은 일례로 ELISA 분석 등에 사용하고 세포들은 RNA 분리에 사용할 수 있다. 추가적으로 현미경을 사용하여 시간대별 또는 일일별 세포의 형태학적 관찰, 세포사멸 및 세포 성장 상태를 관찰하고 특정 기질에 대한 반응을 통해 1차적인 유전자 기능 분석을 할 수 있다. 또한, 유전자의 기능 분석은 안티센스에 의한 전사체의 억제 및 제거 결과로 나타날 세포의 생화학적, 생리학적, 면역학적, 형태학적 상태와 성장 변화 등을 주기적으로 시간대별 또는 일일별로 점검하는 것을 포함한다. 상기의 방법은 단일 세포주의 유전자 검색을 위하여 다양한 안티센스 분자를 적용함으로써 한 종류의 목표 세포주를 대상으로 수천에서 수만의 안티센스 DNA로 유전자 검색 및 기능 분석을 가능하게 한다(도 7참조).
또한, 본 발명은 선별한 제한된 종류의 안티센스 분자로 구성된 안티센스 멀티-매크로 어레이 (antisense multi-macroarray)를 다양한 종류의 세포주에 적용하여 수행하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법 및 그의 장치를 제공한다.
상기에서, 선별한 제한된 종류의 안티센스 분자를 다양한 종류의 세포주에 적용하여 수행하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법은,
1) 선별한 제한된 종류의 유니진 유래 안티센스 분자를 제조하여 안티센스 멀티-매크로어레이 (antisense multi-macroarray)를 구성하는 단계;
2) 마이크로 플레이트의 각 웰에 다양한 종류의 세포주를 분주하는 단계;
3) 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계; 및
4) 단계 3)의 안티센스 분자-전달체 복합체를 각각 단계 2)의 다양한 종류의 세포주에 형질감염한 후 유전자 기능 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
단계 1)은 상기의 제 4세대 안티센스 제조방법을 이용하여 선별한 제한된 종류의 유니진 유래 안티센스 분자를 제작한 후 마이크로플레이트에 정렬한 안티센스 멀티-매크로어레이를 제작하는 것을 의미한다.
단계 2)는 안티센스 분자-전달체 복합체를 적용할 다양한 세포주를 선택한 후 각 웰마다 동일한 숫자의 세포를 균등하게 분주하는 것이다. 적용 세포주로는 간암, 폐암, 위암, 유방암, 방광암, 전립선안, 혈액암, 피부암 등의 암 관련 세포주, 비만 세포주, 탈모증 세포주, 자가면역 질환 세포주 및 대사질환 세포주 등 광범위한 질환 관련 세포주 및 특정 세포주 중 하나를 선택할 수 있다. 세포주의 분주 시기는 세포의 특성(예 : 부유세포 및 부착세포)에 따라 안티센스-전달체의 적용 시기 전 또는 후로 달라질 수 있다.
단계 3)은 안티센스 분자와 전달체의 복합체를 적용 대상 세포주의 종류와 동일한 수로 제작하는 단계이다. 하나의 마이크로플레이트에는 웰마다 종류가 다른 안티센스 분자가 적용되며, 적용 대상 세포주의 종류와 동일한 수로 제작되는 각각의 마이크로플레이트는 동일한 배열(array)로 구성된다. 사용될 전달체는 안티센스 및 세포주에 따라서 결정되며 리포좀, 양이온 폴리머 및 양이온 폴리머-바이러스 복합체, 바이러스 및 펩타이드 등이 사용될 수 있고 안티센스-전달체의 복합체 형태로 세포주에 적용된다.
단계 4)는 상기 단계 3)에서 제조한 안티센스 분자-전달체 복합체를 다양한 세포주에 형질감염 한 후 1차적인 유전자 기능 분석을 수행하는 단계이다. 96-웰 플레이트를 사용할 경우, 세포 및 리포좀의 종류에 따라 안티센스 DNA와 양이온 리포좀을 1 : 3 내지 1 : 4 등의 다양한 비율로 혼합할 수 있으며 일반적으로는 1 : 3 (w/w)의 비율로 혼합하여 세포를 형질감염 (transfection) 한다. 안티센스 분자의 활성을 확인하기 위하여 세포 상등액은 일례로 ELISA 분석 등에 사용하고 세포들은 RNA 분리에 사용할 수 있다. 추가적으로 현미경을 사용하여 시간대별 또는 일일별 세포의 형태학적 관찰, 세포사멸 및 세포 성장 상태를 관찰하고 특정 기질에 대한 반응을 통해 1차적인 유전자 기능 분석을 할 수 있다. 또한, 유전자의 기능 분석은 안티센스에 의한 전사체의 억제 및 제거 결과로 나타날 세포의 생화학적, 생리학적, 면역학적, 형태학적 상태와 성장 변화 등을 주기적으로 시간대별 또는 일일별로 점검하는 것을 포함한다.
본 발명의 선별된 제한된 숫자의 안티센스 분자로 다양한 종류의 세포주에서 유전자 기능을 검색 및 분석하는 방법은 질환관련 또는 특정 세포주의 유전자 정보를 토대로 선택된 안티센스를 사용하여 다양한 계열의 세포주 또는 유사 질환 세포주를 대상으로 좀 더 면밀한 유전자의 검색 및 기능 분석을 할 수 있도록 고안된 시스템이다(도 8참조). 상기 시스템은 다양한 계열의 세포 또는 유사 질환 세포간의 유전자 상호관계 및 효율적인 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
추가적인 유전자의 기능 분석에서는 분자생물학, 세포생물학, 면역학, 생화학적 분석을 통하여 유전자 기능검정을 보강함으로써 유전자 기능 및 상호관계에 대한 정확한 정보를 얻을 수 있다.
유전자의 기능 분석은 그 목적에 따라 다양한 방법이 적용될 수 있다. 유전자의 기능 분석은 기존에 확립된 방법을 이용하여 수행될 수 있는데, 1차적인 유전자의 기능 분석 방법의 일례로서는 현미경으로의 세포의 형태적 변화, 성장 변화 (성장억제 및 촉진) 및 세포사멸을 관찰하는 것을 들 수 있다.
특정 유전자의 기능 분석을 위해서는 많은 방법들을 활용할 수 있지만 주로 다음과 같은 방법을 이용한다.
1) 안티센스 활성에 의한 유전자 발현 억제 분석은 주로 RT-PCR과 웨스턴 블럿 분석 (Western blot analysis)에 의한 mRNA 발현, 단백질 발현 및 단백질 활성의 측정 (예; 면역분석 방법 [immunoassay])을 통해 이루어진다.
2) 세포 성장과 분화 분석은 MTT 분석, 사이미딘 편입 (thymidine incorporation) 양 측정, 콜로니 형성 등의 실험으로 측정할 수 있고 세부적으로는 사이토카인 수용체에 관한 인자의 탐색, DNA 복제관련 유전자의 탐색, 크로마틴 활성화 인자 (histon acetylase)의 탐색 등 여러 방법으로 유전자의 기능을 분석한다.
3) 세포사멸 (apoptossis) 분석은 세포의 형태학적 변화, 핵의 응축 및 단편화, DNA 단편화, 세포사멸의 정량 분석, 세포사멸의 신호전달 기구 분석 등의 방법으로 유전자 기능을 분석한다.
4) 세포주기 조절의 분석은 플로우 사이토메트리 (flow cytometry)를 이용한 세포주기 측정, 세포주기 억제 인자의 활성, 세포주기 촉진 인자의 활성, 세포주기 조절 인자간의 복합체 형성 확인 등의 분석으로 유전자의 기능을 분석한다.
이외에도 다양한 방법을 이용하여 특정 유전자의 발현억제에 의한 세포의 생리적, 생화학적, 형태학적 및 분자생물학적 변화를 검색할 수 있다.
본 발명에서는 새로이 개발된 제 4세대 안티센스 분자를 이용하여 유전자의 검색 및 기능 분석을 함으로써 기존의 방법보다 대규모로 미지의 유전자를 신속하게 검색할 수 있는 유전자 검색 및 기능 분석 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 유전자 검색 및 기능 분석 방법은 유전자의 기능을 포괄적으로 검색할 수 있을 뿐 아니라 유전자 각각의 기능을 명확히 확인 또는 유추할 수 있게 하며, 더불어 유전자간의 상호관계를 밝히는데도 유용하게 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 제 4세대 안티센스 분자는 현저히 개선된 안티센스 활성; 신속하고 정확한 안티센스 분자의 제작; 리포좀과 복합체를 형성할 경우 원활한 세포내 흡수; 안정성 개선으로 소량 사용; 생산된 안티센스 분자의 염기서열과 자연상태 핵산의 동일한 조성 및 대량생산 용이; 상이한 종류인 다중의 전사체 제거 용이; 자연성 핵산 조성으로 낮은 독성; 및 방향성을 갖는 (directional) 다수 (수천 혹은 수만 종류)의 단일유전자 유래 안티센스 염기서열을 포함하는 단일가닥의 분자를 대규모로 제작할 수 있다는 등의 다양한 장점을 갖는다. 이러한 장점은 유전자 기능의 대규모 분석에 직·간접적으로 도움이 된다.
본 발명의 제 4세대 안티센스 분자 기술을 이용한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법과 그의 장치는 미지의 유전자를 검색하여 그 기능을 대규모로 분석할 수 있을 뿐 아니라 이러한 실험에서 얻어진 결과를 안티센스 분자 치료제의 개발에 직접적으로 이용할 수 있는 매우 유용한 발명이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> M13 박테이오페이지를 이용한 안티센스 분자의 제조
본 발명자들은 제 4세대 안티센스 제조기술을 본 발명의 유전자 검색 및 기능 분석 방법에 적용하기 위하여, 우선 폐쇄형 단일가닥의 DNA를 게놈으로 갖는 M13 박테리오페이지 (M13 bacteriophages)를 이용하여 길이가 길면서 안티센스 활성이 우수한 안티센스 분자를 제조하고자 목적 염기서열을 TNF-α로 하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<1-1> rTNF mRNA의 발현과 유전자 재조합
랫트의 TNF-αmRNA를 발현시키기 위하여, 쥐의 단핵구 세포주인 WRT7/P2 세포 (Dr. Yagita로부터 분양받음, Juntendo University)를 48-웰 플레이트 (48-well plate)에 웰당 1 ×106cells/200 ㎕ 농도로 분주한 후, 지질 다당류 (lipopolysaccharide, LPS, Sigma)를 30 ㎍/㎖ 첨가하여 4시간 내지 24시간 동안 반응시켰다. 이와 같이 반응된 세포를 시간대별로 회수하여 rTNF-α의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로 조사한 결과, rTNF-α mRNA가 가장 많이 발현되는 시간대는 LPS를 첨가하고 6시간 경과 후임을 확인하였다.
재조합 벡터에 삽입될 rTNF-α의 cDNA를 제조하기 위하여, 상기에서 확인한 바와 같이 WRT7/P2 세포를 6시간 동안 LPS와 반응시킨 후 RNA를 추출하였다. 상기 RNA를 주형으로 하고서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 rTNF-α의 단백질 암호화 (coding) 부분 전체 (708 bp)가 포함되도록 RT-PCR을 수행하여 삽입 유전자를 제조하였다. rTNF-αmRNA의 암호화 염기서열 전체에 대한 안티센스를 재조합하기 위하여, pBluescript 페이지미드가 f1 오리진 (f1 origin)의 방향에 따라서 센스 (sense) 혹은 안티센스 (antisense)로 발현된다는 점을 이용하여 상기로부터 얻은 rTNF-α삽입 유전자를 pBluescript (pBS-KS(±), Stratagene, USA) 클로닝 벡터 내 다중 클로닝 부위 (multiple cloning sites)의 제한효소SalI과EcoRI 부위에 lacZ와 동일한 방향으로 클로닝하여 rTNF-αcDNA가 삽입된 pBS-KS(-) 페이지미드 (rTNF-αin pBS-KS[-])를 제조하였다 (도 1).
<1-2> M13K07 헬퍼 페이지를 이용한 폐쇄형 안티센스 분자의 제조
폐쇄형 안티센스 분자를 Sambrook 등 (Molecular Cloning, 1989)의 방법을 이용하여 제조하였다. rTNF-αcDNA가 삽입된 pBS-KS(-) 페이지미드가 형질전환된 균주에 M13K07 헬퍼 페이지 (M13K07 helper phage, NEB Nucleic Acids, USA)를 형질감염시켰다. 이와 같이 헬퍼 페이지에 의하여 rTNF-α안티센스를 포함하는 재조합 M13 페이지 게놈 (phage genome)이 복제될 경우, 페이지미드 상에 존재하는 f1 오리진에 의해 TNF-α안티센스를 포함하여 전체가 단일가닥으로 제작되어 TNF-α뿐 아니라 페이지미드 상에 존재하는 암피실린 내성 유전자 (ampicillin resistance gene) 및 lacZ와 같은 다른 유전자도 안티센스 방향으로 복제된다.
구체적으로, M13KO7 헬퍼 페이지를 포함하는 2×YT 배지 (10 g NaCl, 10 g yeast extract 및 16 g bactotrypton/L)에서 상기 형질전환 균주를 배양한 후 배양액에 20% 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG 8000)를 첨가하여 박테리오페이지를 침전시켰다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후 침전물을 TE 완충용액 (pH 8.0)에 용해시키고 페놀 추출법 및 에탄올 침전법을 이용하여 DNA를 분리하였다.
헬퍼 페이지 DNA로부터 분리된 폐쇄형 단일가닥 rTNF-α안티센스 DNA를 확인하기 위하여, 1% 아가로즈 겔을 사용하여 폐쇄형 단일가닥 rTNF-α안티센스 DNA를 전기영동하였다. 이때, 대조군으로 rTNF-αcDNA를 pBS-KS(-)에 lacZ와 반대방향 (센스 방향)으로 삽입시킨 이중가닥 rTNF-α안티센스 cDNA가 삽입된 원래의 pBS-KS(-) 플라스미드를 사용하였다. 상기와 같이 제조된 폐쇄형 단일가닥 rTNF-α안티센스 분자가 실제로 rTNF-α에 대한 안티센스 염기서열을 포함하고 있는지의 진위를 자동 염기 서열 분석기 (automated fluorescence sequencing)를 이용하여 확인하였다.
염기서열 분석 결과,도 2에 나타낸 바와 같이, 5' 말단 방향은 페이지미드 벡터의 염기서열을 나타내고 3' 말단 방향은 rTNF-αcDNA의 염기서열을 나타내었다. 상기 염기서열은 주형으로 사용된 DNA 분자에 대해서 상보적이며 역순이기 때문에 페이지미드 게놈에 TNF-α의 안티센스가 생성된 것을 알 수 있다. 상기와 같이 제조된 폐쇄형 단일가닥 rTNF-α안티센스 분자를 rTNFα-M13AS로 명명하였다.
<실험예 2> 폐쇄형 rTNFα안티센스 분자의 구조 확인 및 안정성 시험
<2-1> 폐쇄형 단일가닥 형태의 rTNFα안티센스 분자
M13K07 헬퍼 페이지의 형질감염 후 생산된 폐쇄형의 안티센스 분자가 폐쇄형의 단일가닥 DNA를 가지는지를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
rTNFα-M13AS 1 ㎍에 제한효소XhoⅠ(10 units/㎍ DNA), 엑소뉴클리아제 Ⅲ (Exonuclease Ⅲ, 160 units/g DNA), S1 뉴클리아제 (S1 nuclease, 10 units/㎍ DNA)를 처리하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후 상기 안티센스 분자를 페놀 추출법 및 에탄올 침전법을 이용하여 분리한 후 1% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
rTNFα-M13AS 분자는 재조합 페이지미드가 형질전환된 균주를 M13K07 헬퍼페이지로 감염시킨 후 이로부터 획득된 재조합 M13 페이지로부터 분리되었다. 따라서, 상기와 같이 제조된 rTNFα-M13AS 분자는 폐쇄형 단일가닥 분자이므로 엑소뉴클리아제에 대해 높은 저항성을 나타낼 것으로 기대되었다. 실제적으로,도 3A에 나타낸 바와 같이, rTNFα-M13AS 분자에 이중가닥 DNA를 인식하여 절단하는 제한효소XhoI과 엑소뉴클리아제 Ⅲ를 처리한 결과, rTNFα-M13AS 분자는 3시간의 처리 후에도 분해되지 않고 안정하였다 (레인 4 및 레인 8). 반면, 이중나선의 복제형 (replicative form)인 M13 페이지 DNA는 제한효소XhoI에 의해 효과적으로 절단되었다. 또한, rTNFα-M13AS는 단일가닥 DNA를 인식하여 절단하는 S1 뉴클리아제에 의해서 완벽하게 분해되었는데, 상기 결과들은 본 발명의 안티센스 분자가 페쇄형 단일가닥 DNA (closed single strand DNA) 구조를 가짐을 뒷받침 해준다.
<2-2> rTNFα안티센스 분자의 안정성 시험
안티센스 분자가 세포 내로 효과적으로 흡수되기 위하여 리포좀 (liposomes)과 결합하여 복합체를 형성할 때, 본 발명의 rTNFα-M13AS 분자가 세포 내 또는 혈장 내 존재하는 뉴클리아제에 대하여 안정한지를 조사하였다.
구체적으로, 1 g의 폐쇄형 단일가닥 DNA를 그대로 사용하거나 또는 리포좀과 1 : 3 (w/w)의 비율로 혼합하여 복합체를 형성시킨 후 30% 비가열 불활성화 소 태아 혈청 (non-heat inactivated fetal bovine serum, FBS) 또는 송아지 혈청 (calf serum)과 혼합하여 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후 DNA를 페놀과 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 분리한 후 1% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
그 결과, rTNFα-M13AS는 전혀 분해되지 않았는데, 이러한 결과는 rTNFα-M13AS가 양이온 리포좀 (cationic liposomes)과의 복합체 형태로 인체 내에 주입될 경우 혈장이나 세포 내로 전달되는 과정에서 안정할 수 있음을 나타낸다 (도 3B).
<실험예 3> rTNFα-M13AS에 의한 rTNF-α 발현 억제
본 발명의 rTNFα-M13AS가 기존의 안티센스 올리고에 비하여 뉴클리아제에 대한 안정성이 매우 우수하며 담체 (carrier)인 양이온 리포좀과 결합된 복합체 역시 세포 내에서의 안정성이 월등히 개선되었음을 확인한 본 발명자들은 세포 내로 전달된 rTNFα-M13AS가 과연 우수한 안티센스 활성을 나타내는지 조사하기 위하여, rTNFα-M13AS-리포좀 복합체를 세포 내로 전달시킨 후 rTNFα-M13AS의 rTNF-αmRNA에 대한 안티센스 효과를 RT-PCR과 서던 블럿 분석을 통하여 조사하였다.
<3-1> 세포 배양
쥐의 단핵구 세포주인 WRT7/P2를 야기타 박사 (Dr. Yagita, Juntendo University)의 실험실로부터 분양받아 실험에 사용하였다. 10% 가열-비활성 FBS (heat-inactivated FBS, Hyclone, USA), 100 units/㎖ 페니실린 (penicillin) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin)이 첨가된 RPMI 1640 (Gibco BRL, USA) 배지에 상기 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2항온기에서 배양하고, 배양 과정에서 세포 농도를 적정하게 유지시켰다. 형질감염 (transfection) 실험에 사용되는 세포는 모두 실험 전날 (16시간 전) 신선한 배양액으로 교체하여 0.4% 트립판 블루로 생존율 (viability)을 확인하였다.
<3-2> rTNFα-M13AS와 리포좀의 복합체를 이용한 세포 내 형질감염
rTNFα-M13AS를 양이온 리포좀 복합체를 이용하여 세포 내로 형질감염 시키기 위하여, 리포펙틴 (Lipofectin, Gibco BRL, USA) 또는 리포펙타민 (Lipofectamine, Gibco BRL, USA)의 양이온 리포좀을 사용하였다. 우선, rTNFα-M13AS 또는 대조군인 M13 페이지 게놈 DNA를 FBS와 항생제를 첨가하지 않은 OPTI-MEM (Gibco BRL, USA) 배지로 희석한 후 상기 양이온 리포좀과 혼합하여 상온에서 40분 동안 반응시켜 각각의 양이온 리포좀 복합체를 준비하였다. 실험 전날 신선한 RPMI-1640 배양액으로 교환해 준 WRT7/P2 세포를 OPTI-MEM 배지로 두 번 세척하고 웰당 1 ×106cells/㎖의 세포 농도로 48-웰 플레이트에 분주하였다. 이때, DNA와 양이온 리포좀을 1 : 3 (w/w)의 비율로 형질감염 시켰으며, FBS가 없는 상태로 37℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 그 후 2×FBS (Gibco BRL, USA) 및 항생제가 첨가된 OPTI-MEM 배지를 첨가하여 다시 37℃에서 18시간 추가적으로 배양하였다. 상기와 같이 형질감염된 세포로부터 RNA를 추출하기 전에 6시간 동안 지질 다당류 (lipopolysaccharide, LPS) 30 ㎍/㎖을 첨가하여 rTNF-α의 발현을 유도 (induction)하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 상등액과 세포 침전물로 분리한후 상등액은 단백질 발현 양상 측정을 위한 ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) 분석에 사용하였고 세포 침전물은 RNA 분리에 사용하였다.
<3-3> RNA 분리 및 RT-PCR
양이온 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달된 rTNFα-M13AS의 rTNFα염기서열에 대한 특이적인 안티센스 효과를 조사하기 위하여, 상기 세포로부터 RNA를 분리하여 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 트리 시약 (Tri ReagentRMRC, USA)을 사용하여 제조회사에서 권장하는 방법에 따라 RNA를 분리하였는데, 상기 <3-2>에서 형질감염시킨 각각의 웰로부터 회수한 세포에 1 ㎖ 트리 시약과 200 ㎕ 클로로포름을 첨가하여 전체 RNA 를 분리하였다. 이와 같이 분리한 RNA를 주형으로 사용하고서열번호 3및서열번호 4로 기재되는 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR 키트 (AccessRRT-PCR kit, Promega, USA)로 제조사의 지침에 따라 RT-PCR을 수행하였다. 0.5 ㎖ PCR 튜브에 총 반응용량을 50 ㎕로 하여 AMV 역전사효소 (AMV reverse transcriptase, 5 U/㎕), Tfl DNA 중합효소 (Tfl DNA polymerase, 5 U/㎕), dNTP (10 mM, 1 ㎕) 및 MgSO4(25 mM, 2.5 ㎕)를 첨가한 후, DNA 써멀 싸이클러 (DNA thermal cycler, Hybaid, UK)를 이용하여 역전사반응 (reverse transcription) 및 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction)을 순차적으로 수행하였다. 1번째 가닥의 cDNA 합성반응은 48℃에서 45분 동안 실시하였으며, 2번째 가닥의 cDNA 합성반응 및 PCR증폭반응은 94℃에서 30초, 59℃에서 1분, 68℃에서 2분 동안의 반응을 30회 반복하여 수행하였다. 이로부터 얻은 PCR 생성물을 1% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동을 수행하여 확인하였으며, 겔 독 프로그램 (gel documentation program, Gel Doc. 1000, Bio-Rad, USA)을 이용하여 증폭된 cDNA를 정량적으로 비교, 분석하였다.
<3-4> 서던 블럿 분석
서던 블럿 분석 (Southern blot analysis)은 ECL 3' 말단 올리고-표지 및 검출 시스템 (ECL 3 prime end oligo-labeling and detection system, Amersham Life Science, UK)을 사용하여 제조회사에서 권장하는 방법에 따라 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로, 상기 <3-3>으로부터 얻은 RT-PCR 생성물을 1% 아가로오즈 겔에 전기영동한 후 0.4 M NaOH 용액상에서 나일론 막 (nylon membrane)에 이전시켰다. 탐침으로서열번호 5로 기재되는 22 mer의 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 DNA 100 pmol에 플루오르세인-11-dUTP (fluorescein-11-dUTP), 카코딜레이트 완충용액 (cacodylate buffer), 말단 전이효소 (terminal transferase)를 잘 혼합한 후 37℃에서 70분 동안 반응시켜 표지-탐침 (labeled probe)을 제조하였다. 혼성화 반응은 나일론 막을 혼성화 완충용액 (5 ×SSC, 0.02% SDS, liquid block) 6 ㎖로 42℃에서 40분 동안 처리한 후 상기와 같이 표지된 올리고뉴클레오타이드 탐침을 6.25 ng/㎖ 첨가하여 42℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 막을 0.1% SDS가 포함된 5 ×SSC로 두번 세척하고, 다시 1 ×SSC (0.1% SDS)로 45℃에서 15분 동안 두번 세척하였다. 막 블러킹 (Membrane blocking) 과정을 거친 후 HRP-항 플루오르세인 접합 항체 (HRP anti-fluorescein conjugated antibody)를 처리하여 30분 동안 반응시킨 후 ECL 검출시약을 처리하여 검출하고 상기 막을 X-ray 필름에 노출시켜 현상하였다.
상기와 같이 양이온 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달한 rTNFα-M13AS의 rTNFα염기서열에 특이적인 안티센스 효과를 RT-PCR 및 서던 블럿 분석을 통하여 조사한 결과, rTNFα-M13AS-리포좀 복합체가 형질감염된 세포주에서의 rTNF-α의 발현은 현저하게 감소한 반면, 대조구인 rTNFα-M13S (TNF-α센스 가닥)가 도입된 세포주 또는 안티센스 염기서열을 포함하지 않는 M13SS (M13 단일가닥)가 도입된 세포주에서는 TNF-αmRNA의 감소가 관찰되지 않았다 (도 4A및4C).
본 발명의 rTNFα-M13AS는 TNF-α안티센스 염기서열과 함께 LacZ 및 암피실린 내성 유전자 등의 벡터 유래 염기서열을 포함하여 전체적으로 3.7 Kb 크기의 폐쇄형 단일가닥 안티센스 분자이다. 따라서, 상기에서 확인한 안티센스 활성이 TNF-α안티센스 이외의 염기서열에 의한 비특이적 활성에 의한 것인지 또는 TNF-α안티센스 자체에 의한 비특이적 활성에 의한 것인지를 조사하기 위하여, 동일한 세포 내에서 TNF-α가 아닌 3종류의 다른 유전자 발현을 조사하였다.
도 4A및4B에 나타낸 바와 같이 β-액틴 (β-actin), GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 및 IL-1β의 발현을 조사한 결과, 본 발명의 rTNFα-M13AS 분자가 상기 유전자들의 발현에는 아무런 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 rTNFα-M13AS의 안티센스 활성효율을 조사하기 위하여, 안티센스 분자의 사용량을 순차적으로 감소시킨 후 목적하는 mRNA의 제거정도를 측정하였다. 1 ×106cells/㎖ 세포농도의 세포에 대하여 rTNFα-M13AS를 0.1 ㎍ 처리한 경우에는 rTNF-α의 발현이 완전히 억제되었고, 0.05 ㎍ 처리한 경우에는 rTNF-α의 발현이 부분적으로 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 rTNFα-M13AS가 기존의 안티센스 올리고 보다 현저히 적은 양에서도 효과적으로 유전자 발현을 억제할 수 있음을 나타낸다.
<실험예 4> rTNFα의 단백질 발현 양상
rTNFα-M13AS에 의해 TNF-αmRNA가 감소함을 확인한 본 발명자들은 rTNFα-M13AS가 세포외부로 유리되는 rTNFα단백질의 양에도 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 세포외부로 유리되는 랫트의 rTNFα단백질의 발현양상을 ELISA 키트 (Biosource, USA)를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 상기 <3-2>에서 얻은 세포 상등액을 50배로 희석하여 rTNF-α항체로 코팅된 플레이트에 먼저 첨가한 후 바이오틴화 항 TNF-α항체 (biotinylated anti TNF-αantibody)를 2차 항체로써 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 90분 동안 상온에서 반응시킨 후 세척 완충용액 (wash buffer in 'Cytoscreen TM' kit from BioSource, USA)으로 네번 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하고 스트렙타비딘-퍼옥시다제 (streptavidin-peroxidase)를 첨가하여 45분 동안 더 반응시켰다. 비결합 스트렙타비딘-퍼옥시다제를 제거하기 위하여 상기 세척완충용액으로 네번 세척한 후 상기 플레이트의 웰상에 크로모젠 (chromogen)을 첨가하여 20분 동안 발색시키고 450 nm에서 흡광정도를 측정하였다.
그 결과, rTNFα-M13AS를 처리한 경우에는 배양 세포액 내로 유리되는 rTNF-α단백질의 양이 현저하게 감소된 반면, rTNFα-M13S (센스 가닥)와 M13SS (단일가닥 벡터)를 처리한 대조구에서는 TNF-α단백질의 양이 전혀 감소하지 않았다 (도 5). 한편, 세포에 폐쇄형 단일가닥 핵산물질을 제외하고 리포좀만을 처리한 다른 대조구 실험에서는 부분적으로 TNF-α단백질의 양이 감소되었는데, 이러한 결과는 양이온 리포좀만을 사용할 경우에는 라이소좀 (lysosomes) 내에 양 (+) 전하가 축적되어 이로 인한 세포 독성에 기인한 것으로 판단된다.
<실험예 5> NF-κB-M13AS에 의한 인간 NF-κB의 발현 양상
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 인간 NF-κB를 목적하는 염기서열로 하는 안티센스 분자를 제조하여 이를 NF-κB-M13AS라 명명한 후 상기 안티센스 분자가 양이온 리포좀과의 복합체로서 세포 내로 전달되어 우수한 안티센스 활성을 나타내는지를 조사하기 위하여, NF-κB-M13AS-리포좀 복합체를 세포 내로 전달한 후 NF-κB-M13AS의 NF-κB에 대한 안티센스 활성을 RT-PCR 및 서던 블럿 분석을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 <3-2>와 같이 배양한 백혈구 단핵세포중의 대식세포 계열에서 유래한 THP1 세포를 1 ×106cells/㎖ 세포농도로 웰 플레이트에 분주한 후 NF-κB-M13AS, NF-κB-M13S 또는 M13SS로 형질감염시켰다. 이때, 양이온 리포좀인 리포펙타민을 DNA에 대하여 1 : 4 (w/w)의 비율로 혼합하여 형질감염시켰으며, 이를 하루동안 배양하였다. 형질감염시키고 하루 경과한 세포로부터 RNA를 추출하기 전에 6시간 동안 PMA (160 nM)를 첨가하여 NF-κB의 발현을 유도하였다. 상기 세포로부터 실험예 <3-3>과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출한 후 이를 주형으로 하고서열번호 6및서열번호 7로 기재되는 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 또한, RT-PCR로부터 얻은 PCR 산물을 실험예 <3-4>와 동일한 방법으로서열번호 8로 기재되는 22 mer의 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용하여 서던 블럿 분석을 수행하였다.
상기와 같이 양이온 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달한 NF-κB-M13AS의 NF-κB 염기서열에 특이적인 안티센스 효과를 RT-PCR 및 서던 블럿 분석을 통하여 조사한 결과, NF-κB-M13AS-리포좀 복합체가 형질감염된 세포주에서의 NF-κB의 발현은 현저하게 감소한 반면, 대조구인 NF-κB-M13S (NF-κB센스 가닥)가 도입된 세포주 또는 안티센스 염기서열을 포함하지 않는 M13SS (M13 단일가닥)가 도입된 세포주에서는 NF-κB mRNA의 감소가 관찰되지 않았으며 (도 6A), NF-κB-M13AS 분자가 β-액틴의 발현에 아무런 영향을 미치지 않았다. 따라서, 본 발명의 NF-κB-M13AS 분자는 NF-κB 염기서열에 대해서만 반응 특이적으로 안티센스 활성을 나타냄을 확인하였다.
또한, 본 발명의 NF-κB-M13AS의 안티센스 활성효율을 조사하기 위하여, 안티센스 분자의 사용량을 순차적으로 감소시킨 후 목적하는 mRNA의 제거정도를 측정하였다. 1 ×106cells/㎖ 세포농도의 세포에 대하여 NF-κB-M13AS를 0.1 ㎍ 처리한 경우에는 NF-κB의 발현이 완전히 억제되었고, 0.05 ㎍ 처리한 경우에는 NF-κB의 발현이 부분적으로 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 NF-κB-M13AS가 기존의 안티센스 올리고 보다 현저히 적은 양에서도 효과적으로 유전자 발현을 억제할 수 있음을 나타낸다.
<실험예 6> 단일가닥 안티센스 분자의 제조
<6-1> 다양한 유니진 유래 cDNA의 서브클로닝 (subcloning)
본 발명자들은 384 종류의 유니진 유래 cDNA를 단일가닥의 안티센스 분자를 생산할 수 있는 M13 유래 페이지미드 벡터에 서브클로닝하였다 (도 10). 즉, 벡터내에 삽입되어 있는 단일 유전자들의 cDNA 삽입물을 제한효소 (EcoR I,XhoI)로 이중 분해 (double digestion) 한 후 T4 DNA 접합효소 (ligase)를 이용하여 pBlueScriptII SK(-) 벡터 내로 클로닝하여 재조합 페이지미드를 제조하였다. 이때, 상기 벡터는 클로닝을 용이하게 하기 위하여 미리 동일한 제한효소 (EcoR I,XhoI)로 절단한 후 탈인산화 과정을 거친 것을 사용하였다. 재조합 페이지미드는 칼슘 클로라이드 방법으로 수용 대장균 (competent cell ;Escherichia coli; XL-1 Blue, Stratagene)에 형질전환하여 단일가닥 안티센스를 생산하는 대장균 형질전환체를 확보하였다 (도 10). 수용 대장균으로는 단일가닥 안티센스의 생성을 도와 주는 M13 helper phage를 미리 감염해 놓은 것을 사용하였다.
또한, 본 발명자들은 서브클로닝이 성공적으로 되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 획득한 형질전환체에서 재조합 페이지미드를 알칼리 변성법으로 정제 (도 11)한 뒤 클로닝시 사용한 제한효소 (EcoR I,XhoI)로 자른 후 전기영동하여 삽입물이 존재함을 확인함으로써 서브클로닝이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다 (도 12).
<6-2> 단일가닥 안티센스 DNA의 분리 및 정제
상기 실험예 <6-1>에서 제조한 384 종류의 단일가닥의 안티센스 분자는 구체적으로 하기의 방법으로 정제하였다. 암피실린 (최종농도 50 ㎍/㎖)과 카나마이신 (최종농도 70 ㎍/㎖)이 첨가된 LB 고형배지에서 생육한 콜로니를 동일한 조성의 LB 액체배지 1.5 ㎖에 접종한 후 12 내지 16시간 동안 진탕배양 (37℃, 250 rpm)하였다. 여기서 얻은 배양액으로부터 단일가닥 안티센스 DNA를 대규모로 분리정제하기 위하여 정제 킷트 (QIAprep 96 M13 Kit, QIAGEN, GERMAN) 및 정제장치 (QIAVAC Vacumn Manifold, QIAGEN, GERMAN)를 사용하였고, 일련의 정제는 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 단일가닥 안티센스 DNA의 확인은 0.7 내지 1.2%의 아가로스 겔 상에서의 전기영동으로 수행하였다 (도 13).
<실시예 1> 단일 세포주에 다양한 종류의 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 적용하여 실시한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법
유전자 검색 시스템을 구축하는데 있어 안티센스를 이용한 다양한 방법이 적용된다. 기존의 유전자 검색 시스템은 단지 유전자만을 검색할 수 있기 때문에 부수적으로 복잡한 기능 분석 시스템을 구축하고 실행해야 하지만, 본 발명의 유전자 검색 시스템은 제 4세대 안티센스 분자로 이루어진 방대한 규모의 안티센스 분자들을 사용함으로써 기존의 방법에 비해 대규모로 신속하게 유전자를 검색할 수 있다. 또한, 유전자 기능의 포괄적 검색뿐만 아니라 각각의 유전자의 기능을 명확히 확인 및 유추할 수 있고 유전자간의 상호관계를 밝히는데도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법은 다수의 상이한 전사체에 대한 안티센스 분자들을 신속하게 확보할 수 있으며, 한 종류의 세포주를 대상으로 수 천에서 만종 이상의 안티센스 분자에 대한 기능을 검색할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 선별한 제한된 안티센스 분자를 수십에서 수백 종의 세포주에서 적용하여 특정 유전자의 기능을 동시에 검색할 수 있다. 아울러, 기능이 알려진 유전자의 안티센스 분자를 처리하여 특정 전사체의 발현을 억제하고 그 이후의 유전자들의 발현을 대조군과 비교하여 유전자 상호간의 관계를 검색할 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 안티센스 라이브러리를 사용한 대규모 유전자 검색 방법은 제 4세대의 새로운 안티센스 기술에 바탕을 둔 안티센스 분자를 이용함으로써 유전자 기능을 대규모로 검색할 수 있으며, 여기에서 얻어진 결과로부터 안티센스 분자 치료제를 직접 개발할 수 있다는 것이 이 방법의 가장 큰 장점이다.
본 발명자들은 본 분석의 일례로서 한 종류의 폐암 세포주 (NCI-H1299 cell line)에 384 종류의 안티센스 분자를 형질감염한 후 MTT 분석을 통해 각 안티센스 분자가 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다 (도 7). 우선, 형질감염 하루 전날 폐암세포주인 NCI-H1299를 96 웰 플레이트에 웰당 5 ×103개씩 분주하고 37℃, 5% CO2조건에서 24시간 배양하였고, 양이온 리포좀인 리포펙타민 2000 시약 (LIPOFECTAMINE 2000 reagent, Gibco BRL, USA)을 상기 실시예 <1-2>에서 확보한 제 4세대 안티센스 분자와 복합체를 형성한 후 이들 복합체를 OPTI-MEM (Gibco BRL, USA)으로 희석하고 제조사의 지침에 따라 배양세포에 형질감염하였다. 이때, 안티센스 DNA와 양이온 리포좀의 혼합비율은 1 : 3 (w/w)으로 하였다. 형질감염 후 배양을 위한 배지로는 소태아 혈청 (Fetal Bovine Serum)은 함유하나 항생제는 포함하지 않는 DMEM 배지(Gibco BRL, USA)를 사용하였고, 배양조건은 37℃, 5% CO2로 하였다.
형질감염 2일 후 대규모로 세포의 성장에 영향을 미치는 유전자를 검색하고 그 기능을 분석하기 위한 일례로서 MTT 분석법 (MTT Assay)을 하기와 같이 수행하였다. 구체적으로 이미 제4세대 안티센스-전달체 복합체를 형질감염 해 놓은 96 웰 플레이트의 각 웰의 배양배지를 제거하는 대신 50 ㎕의 신선한 DMEM 배지 (소 태아 혈청 함유, 항생제 미함유) 및 25 ㎕ (5 mg/ml)의 MTT 시약 (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, SIGMA, USA)을 첨가하고 37℃에서 4시간 반응시켰다. 이후 각 웰마다 0.1 N HCl을 함유하는 이소프로파놀(isopropanol)을 150 ㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 형질감염을 하지 않은 대조군과 형질감염을 한 실험군의 흡광도를 570 nm에서 측정하고 성장저해율을 계산하였다.
그 결과, 본 실시예를 통해 384 종류의 유니진 유래 안티센스 분자 중 50~90%에 이르는 다양한 저해율을 나타내는 34 종류의 안티센스 분자를 선별할 수 있었다 (도 14및표 1).
폐암 관련 유전자의 일부 목록
웰의 위치 G.I. 비율 유전자의 이름
A-1 65% Spoiceosome-associated factor 155
A-2 56% EGF-response factor 2 (butyrate resopnse factor)
B-1 61% KIAA0239 protein
B-8 57% ATPase, CA2+ transporting, cardiac muscle, low twich
C-1 90% Protease inhibitor 5 (maspin)
C-2 71% Cytochrome p450, superfamily XIX (aromation of androgens)
D-2 64% KIAA0050 gene product
D-4 68% TGF-β stimulated protein, TSC-22
D-12 65% KIAA0159 gene product
G-2 67% ESTs, Weakly similar to U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein hPrp 4
H-9 56% ESTs
<실시예 2> 선별된 제한된 종류의 안티센스 분자를 다양한 종류의 세포주에 적용하여 실시한 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법
질환관련 또는 특정 세포주의 유전자 정보를 토대로 선택된 안티센스를 사용하여 동일한 계열의 세포주 또는 유사 질환 세포주를 대상으로 좀 더 면밀한 검색 및 기능 분석을 할 수 있도록 고안된 유전자 검색 및 기능 분석 방법이다(도 8). 본 발명자들은 본 분석의 일례로서 선별한 96 종류의 유니진 유래 안티센스 분자를 간암세포주 (HepG2 cell line) 및 폐암세포주 (NCI-H1299) 에 형질감염 한 후 MTT 분석을 통해 각 안티센스 분자의 세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 우선, 형질감염 하루 전날 96 웰 플레이트에 폐암세포주의 경우는 웰당 5 ×103개씩, 간암세포주의 경우는 웰당 7 ×103개씩 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였고, 양이온 리포좀인 리포펙타민 2000 시약 (LIPOFECTAMINE 2000 reagent, Gibco BRL, USA)을 상기 실시예 <1-2>에서 확보한 제4세대 안티센스 분자와 복합체를 형성한 후 이들 복합체를 OPTI-MEM (Gibco BRL, USA)으로 희석하고 제조사의 지침에 따라 배양세포에 형질감염하였다. 안티센스 DNA와 양이온 리포좀의 혼합비율은 1 : 3 (w/w)으로 하였다. 형질감염 후 배양을 위한 배지로는 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum)은 함유하나 항생제는 포함하지 않는 DMEM (Gibco BRL, USA) 또는 RPMI (Gibco BRL, USA) 배지를 사용하였고, 배양조건은 37℃, 5% CO2로 하였다.
형질감염 2일 (폐암세포주의 경우) 또는 3일 (간암세포주의 경우) 후 대규모로 세포의 성장에 영향을 미치는 유전자를 검색하고 그 기능을 분석하기 위한 일례로서 MTT 분석법 (MTT Assay)을 하기와 같이 수행하였다. 구체적으로 이미 제 4세대 안티센스-전달체 복합체를 형질감염 해 놓은 96 웰 플레이트의 각 웰의 배양배지를 제거하는 대신 50 ㎕의 신선한 DMEM 배지 (소 태아 혈청 함유, 항생제 미함유) 및 25 ㎕ (5 mg/ml)의 MTT 시약 (SIGMA, USA)을 첨가하고 37℃에서 4시간 반응시켰다. 이후 각 웰마다 0.1 N HCl을 함유하는 이소프로파놀(isopropanol)을 150 ㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 형질감염을 하지 않은 대조군과 형질감염을 한 실험군의 흡광도를 570 nm에서 측정하고 성장저해율을 계산하였다.
그 결과, 본 실시예를 통해 간암세포주 및 폐암세포주에 대해 50~80%에 이르는 다양한 성장저해율을 나타내는 다수 종류의 안티센스 분자들을 1차적으로 검색할 수 있었다 (도 15,표 2및표 3).
간암 관련 유전자의 일부 목록
polymyositis/schleoderma autoantigen 1
ESTs (N21972)unknown
Nuclear matrix protein p84
Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor beta 3
SRY (sex-determining region Y)-box 9
ESTs (H13112)unknown
ESTs (AW294133)unknown
Primase, polypeptide 1 (49 kDa)
Human EV12 protein gene
Tetratricopeptide repeat domain 2
Trefoil factor 1 (breast cancer, estrogen-inducible sequence
폐암 관련 유전자의 일부 목록
Phenylalanine hydroxylase
General transcription factor IIH
Cytochrome P450, subfamily IIIA, polypeptide 7
KIAA0094 protein (D42084) unknown
MAX dimerization protein
Serine/threonine kinase 13 (aurora/IPL 1-like)
ESTs (AI057094) unknown
Ras-related GTP-binding protein
MHC class I region ORF
Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 17
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 다양한 종류의 유니진 유래 안티센스 분자로 구성된 안티센스 라이브러리를 이용한 유전자 검색 및 기능 분석 방법은 현재 유전자 발현 검색만이 가능한 기존의 대량 분석 시스템에서는 수행이 가능하지 않던 대규모의 유전자 기능 분석을 가능하게 하며, 나아가 암 및 유전 질환의 분자 치료제 후보자를 검색하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

1) 다양한 종류의 유니진(unigene) 유래 안티센스 분자를 대규모로 제조하여 안티센스 라이브러리를 제작하는 단계;
2) 마이크로 플레이트의 각 웰에 한 종류의 세포주를 분주하는 단계;
3) 단계 1의 안티센스 라이브러리를 전달체와 혼합하여 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계; 및
4) 단계 3의 다양한 종류의 안티센스 분자-전달체 복합체를 각각 단계 2)의 세포주에 형질감염한 후 유전자 기능 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 한 종류의 세포주에 다양한 종류의 유니진 유래 안티센스 분자를 적용하여 수행하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1의 안티센스 분자는
1) 하나 이상의 유니진 또는 표적 mRNA로부터 cDNA 단편을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1의 cDNA 단편을 클로닝 벡터에 안티센스 서열이 복제되는 방향으로 삽입하여 재조합 페이지미드를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2의 재조합 페이지미드를 형질전환체에 도입하여 배양하는 단계를 포함하는 제조방법으로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 2항에 있어서, 단계 2)의 클로닝 벡터는 폐쇄형 단일가닥 게놈을 가지는 페이지로부터 유래하며 상기 페이지의 복제개시점 (F1 Origin)을 포함하는 벡터인 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 3항에 있어서, 복제개시점을 포함하는 벡터는 pUC 벡터, M13mp 벡터, pBluescript 페이지미드 벡터, pGEM-f 페이지미드 벡터 및 M13 박테리오페이지 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 2항에 있어서, 단계 3의 형질전환체는 박테리아인 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 5항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 세포주는 암 세포주, 비만 세포주, 탈모증 세포주, 자가면역 질환 세포주, 대사질환 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
1) 선별한 제한된 종류의 유니진 유래 안티센스 분자를 제조하여 안티센스 멀티-매크로어레이 (antisense multi-macroarray)를 구성하는 단계;
2) 마이크로 플레이트의 각 웰에 다양한 종류의 세포주를 분주하는 단계;
3) 안티센스 분자-전달체 복합체를 형성하는 단계; 및
4) 단계 3)의 안티센스 분자-전달체 복합체를 각각 단계 2)의 다양한 종류의 세포주에 형질감염한 후 유전자 기능 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 선별한 제한된 종류의 안티센스 분자를 다양한 종류의 세포주에 적용하여 수행하는 대규모 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 8항에 있어서, 단계 2의 세포주는 암세포주, 비만 세포주, 탈모증 세포주, 자가면역 질환 세포주 및 대사질환 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 1항 또는 제 8항에 있어서, 단계 3의 전달체는 리포좀, 양이온 폴리머 및 양이온 폴리머-바이러스 복합체, 바이러스 및 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 1항 또는 제 8항에 있어서, 유전자 기능 분석은 안티센스 활성에 의한 유전자 발현 억제 분석, 세포 성장과 분화 분석, 세포사멸 (apoptosis) 분석 및 세포주기 조절의 분석으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 11항에 있어서, 안티센스 활성에 의한 유전자 발현 억제 분석은 RT-PCR과 웨스턴 블럿 분석 (Western blot analysis)에 의한 mRNA 발현, 단백질 발현 및 단백질 활성의 측정을 통해 이루어지고, 세포 성장과 분화 분석은 MTT 분석, 사이미딘 편입 (thymidine incorporation) 양 측정, 콜로니 형성 실험, 사이토카인 수용체에 관한 인자의 탐색, DNA 복제관련 유전자의 탐색, 크로마틴 활성화 인자 (histon acetylase)의 탐색을 통해 이루어지고, 세포사멸 (apoptossis) 분석은 세포의 형태학적 변화, 핵의 응축 및 단편화, DNA 단편화, 세포사멸의 정량 분석, 세포사멸의 신호전달 기구 분석을 통해 이루어지고, 세포주기 조절의 분석은 플로우 사이토메트리 (flow cytometry)를 이용한 세포주기 측정, 세포주기 억제 인자의 활성, 세포주기 촉진 인자의 활성, 세포주기 조절 인자간의 복합체 형성 확인으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
제 11항에 있어서, 유전자 기능 분석은 분자생물학적 분석 방법, 세포생물학적 분석 방법, 면역학적 분석 방법 및 생화학적 분석 방법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 통하여 유전자의 기능을 검정하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 검색 및 기능 분석 방법.
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