CN108342386A - 一种多聚寡核酸分子及其在多靶标干扰中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多聚寡核酸分子及其在多靶标干扰中的应用。本发明将CON技术与纳米技术结合，通过构建具有准确且具有自我组装能力的核酸结构，从而实现多靶标干扰作用，可用于抑制疾病发生或发展的信号通路中的多个基因表达，或同时抑制多个疾病靶基因表达，在生物学、化学等多个学科领域具有广阔的应用前景。通过实验证明：本发明的多聚寡核酸分子具有如下优点：1)RNAi效能提高；2)化学稳定性好，抗核酸酶降解能力增强，半衰期延长；3)脱靶率降低；4)能形成具有可塑性的纳米颗粒，导入细胞的能力增强。

Description

一种多聚寡核酸分子及其在多靶标干扰中的应用
技术领域
本发明属于核酸纳米技术领域，具体涉及一种多聚寡核酸分子及其在多靶标干扰中的应用，所述分子可高效调控一个或多个目的基因的表达。
背景技术
CON(互补寡核苷酸)技术使得人工合成的寡核苷酸分子能够通过序列互补作用与靶向分子结合，并改变靶向分子的生物特性。CON技术包括RNAi(RNA干扰)技术和ASO(反义寡核苷酸)技术两大类，目前已广泛应用于功能基因组学研究，并有望成为除小分子化合物和生物制剂以外的第三大治疗手段。如用于治疗纯合子型家族性高胆固醇血症(homozygous familial hypercholesterolemia，FoFH)的米泊美生(mipomersen)，其是Genzyme研发的一种合成的硫代磷酸寡核苷酸，通过与Apo B-100蛋白mRNA的编码区互补配对，抑制Apo B-100蛋白(LDL和VLDL的主要载脂蛋白)的翻译合成，从而有效降低FoFH患者的LDL-C、TC、Non-HDL-C水平。尽管CON技术已经取得了一定成功，但这项技术仍有待完善之处。如传统的RNAi试剂有下述不足：1)繁琐的合成步骤及相对高的生产成本；2)对内切酶和外切酶高度敏感，稳定性不高；3)抑制有效率不够高，不能保证单个分子一定能抑制靶基因表达；4)非特异活性导致的副作用，该非特异性的作用主要源自正义链；5)难以导入细胞尤其是动物体内。
纳米技术研究的是直径在1～100nm纳米范围内物质的性质和应用。纳米结构物质所具有的小尺寸效应、表面效应、高扩散率等特性为科学研究和技术应用开拓了新领域。寡核苷酸结构灵活，如RNA结构，能够自我组装形成纳米结构。以DNA和RNA为代表的核酸纳米技术，是纳米技术领域发展的一个新方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于抑制靶基因表达的多聚核苷酸分子。
本发明提供的用于抑制靶基因表达的多聚核苷酸分子由M条寡核苷酸组成，
每条所述寡核苷酸依次由靶向性终端片段TTS、靶向性内部片段TIS和接头终端片段ATS组成；
所述M为大于或等于3的整数；
每条所述寡核苷酸序列的大小为15-50nt；
所述靶向性终端片段的大小为5-24nt；
所述靶向性内部片段的大小为1-20nt；
所述接头终端片段的大小为5-24nt；
每条所述寡核苷酸的靶向性终端片段TTS与其相邻的寡核苷酸的接头终端片段ATS互补；
每条所述寡核苷酸的靶向性终端片段TTS和所述靶向性内部片段TIS与靶基因互补。
本发明的多聚核苷酸分子优选为纳米级结构。每条所述寡核苷酸优选为开口状结构。所述寡核苷酸通过所述靶向性终端片段TTS和所述靶向性内部片段TIS与靶基因互补结合。
上述多聚核苷酸分子中，
每条所述寡核苷酸的靶向性终端片段TTS与其他寡核苷酸序列均不互补；所述M条寡核苷酸依次首尾相接(通过前一条寡核苷酸的接头终端片段ATS与下一条相邻的寡核苷酸的靶向性终端片段TTS互补实现)，最终组成一个包括x个双链螺旋结构域的核酸二级或三级结构。所述1为小于等于M的正整数。
在某些特定的情况下，与靶基因结合的区域可以延长至所述寡核苷酸的接头终端片段ATS的部分序列；若多条寡核酸序列(大于等于2)的靶基因相同，则其靶区域是间隔的或有部分重叠的。
上述多聚核苷酸分子中，
所述寡核苷酸为DNA或RNA或由DNA与RNA组成的寡核苷酸。
上述多聚核苷酸分子中，
所述靶基因的个数为一个或多个；所述靶基因的个数不超过M个。
上述多聚核苷酸分子中，
所述M的个数为3、4、5、6、7和8。
上述多聚核苷酸分子中，
每条所述寡核苷酸序列的大小为21-30nt；
所述靶向性终端片段的大小为9-12nt；
所述靶向性内部片段的大小为3-6nt；
所述接头终端片段的大小为9-12nt。
上述多聚核苷酸分子中，
每条所述寡核苷酸的靶向性终端片段的大小和接头终端片段的大小相同。
上述多聚核苷酸分子中，
每条所述寡核苷酸序列的大小相同。
上述多聚核苷酸分子中，
所述靶基因为PPIB基因、p65基因、VEGFA基因、TP53基因、SOD1基因、EIF4E基因和/或HIF1A6基因；
抑制所述p65基因的mRNA表达的多聚核苷酸分子为如下m1)-m5)：
m1)由P65-Oligo 1-4所示的单链RNA分子组成；
m2)由P65-Oligo 1-5所示的单链RNA分子组成；
m3)由P65-Oligo 1-6所示的单链RNA分子组成；
m4)由P65-Oligo 7-12所示的单链RNA分子组成；
m5)由P65-Oligo 13-18所示的单链RNA分子组成；
抑制所述TP53基因的mRNA表达的多聚核苷酸分子为如下n1)-n15)：
n1)由TP53-Oligo 3-6所示的单链RNA分子组成；
n2)由TP53-Oligo 2-6所示的单链RNA分子组成；
n3)由TP53-Oligo 1-6所示的单链RNA分子组成；
n4)由TP53-Oligo 7-12所示的单链RNA分子组成；
n5)由TP53-Oligo 13-18所示的单链RNA分子组成；
n6)由TP53-Oligo 19-24所示的单链RNA分子组成；
n7)由TP53-Oligo 25-30所示的单链RNA分子组成；
n8)由TP53-Oligo 31-36所示的单链RNA分子组成；
n9)由TP53-Oligo 37-42所示的单链RNA分子组成；
n10)由TP53-Oligo 20-24所示的单链RNA分子组成；
n11)由TP53-Oligo 26-30所示的单链RNA分子组成；
n12)由TP53-Oligo 32-36所示的单链RNA分子组成；
n13)由TP53-Oligo 21-24所示的单链RNA分子组成；
n14)由TP53-Oligo 27-30所示的单链RNA分子组成；
n15)由TP53-Oligo 33-36所示的单链RNA分子组成；
抑制所述VEGFA基因的mRNA表达的多聚核苷酸分子为如下p1)-p15)：
p1)由VEGFA-Oligo 1、VEGFA-Oligo 4、VEGFA-Oligo 5和VEGFA-Oligo 6所示的单链RNA分子组成；
p2)由VEGFA-Oligo 1、VEGFA-Oligo 2、VEGFA-Oligo 4、VEGFA-Oligo 5和VEGFA-Oligo6所示的单链RNA分子组成；
p3)由VEGFA-Oligo 1-6所示的单链RNA分子组成；
p4)由VEGFA-Oligo 7-12所示的单链RNA分子组成；
p5)由VEGFA-Oligo 13-18所示的单链RNA分子组成；
p6)由VEGFA-Oligo 19-24所示的单链RNA分子组成；
p7)由VEGFA-Oligo 25-30所示的单链RNA分子组成；
p8)由VEGFA-Oligo 31-36所示的单链RNA分子组成；
p9)由VEGFA-Oligo 37-42所示的单链RNA分子组成；
p10)由VEGFA-Oligo 19、VEGFA-Oligo 20、VEGFA-Oligo 22、VEGFA-Oligo 23和VEGFA-Oligo 24所示的单链RNA分子组成；
p11)由VEGFA-Oligo 25、VEGFA-Oligo 26、VEGFA-Oligo 28、VEGFA-Oligo 29和VEGFA-Oligo 30所示的单链RNA分子组成；
p12)由VEGFA-Oligo 31、VEGFA-Oligo 32、VEGFA-Oligo 34、VEGFA-Oligo 35和VEGFA-Oligo 36所示的单链RNA分子组成；
p13)由VEGFA-Oligo 19、VEGFA-Oligo 22、VEGFA-Oligo 23和VEGFA-Oligo 24所示的单链RNA分子组成；
p14)由VEGFA-Oligo 25、VEGFA-Oligo 28、VEGFA-Oligo 29和VEGFA-Oligo 30所示的单链RNA分子组成；
p15)由VEGFA-Oligo 31、VEGFA-Oligo 34、VEGFA-Oligo 35和VEGFA-Oligo 36所示的单链RNA分子组成；
抑制所述PPIB基因的mRNA表达的多聚核苷酸分子为如下q1)-q5)：
q1)由PPIB-Oligo 1、PPIB-Oligo 3、PPIB-Oligo 4和PPIB-Oligo 5所示的单链RNA分子组成；
q2)由PPIB-Oligo 1-5所示的单链RNA分子组成；
q3)由PPIB-Oligo 1-6所示的单链RNA分子组成；
q4)由PPIB-Oligo 7-12所示的单链RNA分子组成；
q5)由PPIB-Oligo 13-18所示的单链RNA分子组成；
上述P65-Oligos序列、TP53-Oligos序列、VEGFA-Oligos序列、PPIB-Oligos序列分别如表1、表7、表8和表9所示；
抑制所述PPIB、p65、VEGFA、SOD1、EIF4E和HIF1A6基因的mRNA表达的多聚核苷酸分子由SOD1-Oligo、PPIB-Oligo、P65-Oligo HIF1A-Oligo、EIF4E-Oligo和VEGFA-Oligo组成；
上述SOD1-Oligo、PPIB-Oligo、P65-Oligo HIF1A-Oligo、EIF4E-Oligo和VEGFA-Oligo序列如表10所示。
本发明的另一个目的是提供上述多聚核苷酸分子的衍生物。
本发明提供的多聚核苷酸分子的衍生物为如下(1)-(6)中任一所述的多聚核苷酸分子的衍生物：
(1)将上述多聚核苷酸分子删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
(2)将上述多聚核苷酸分子进行核苷酸取代或修饰，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
所述取代为将所述多聚核苷酸分子中的每条寡核苷酸的ATS片段自3’端第一位核苷酸起连续的3-9个核苷酸核糖2′-C的-OH基团均被-CH3、-OCH3、-NH2或-F取代；
所述修饰为将所述多聚核苷酸分子中的每条寡核苷酸的ATS片段自3’端第一位核苷酸起连续的3-9个核苷酸核糖2′-C的-OH基团均进行2＇-O-Me修饰；
(3)将上述多聚核苷酸分子的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
(4)将上述多聚核苷酸分子编码的RNA分子，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
(5)由上述多聚核苷酸分子编码的肽核酸、锁核酸或解锁核酸，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
(6)将上述多聚核苷酸分子的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物。
上述衍生物中，所述修饰为将所述多聚核苷酸分子中的每条寡核苷酸的ATS片段自3’端第一位核苷酸起连续的6-8个核苷酸核糖2′-C的-OH基团均进行2＇-O-Me修饰；所述修饰具体为将所述多聚核苷酸分子中的每条寡核苷酸的ATS片段自3’端第一位核苷酸起连续的7个核苷酸核糖2′-C的-OH基团均进行2＇-O-Me修饰。
本发明还有一个目的是提供上述多聚核苷酸分子的制备方法。
本发明提供的上述多聚核苷酸分子的制备方法包括如下步骤：
1)合成上述M条寡核苷酸序列；
2)将所述M条寡核苷酸序列退火，得到所述多聚核苷酸分子。
上述方法中，所述寡核苷酸为单链RNA分子。
上述方法中，所述退火的反应体系为将等摩尔量的各单链RNA分子、RNA退火buffer(5X)(碧云天Annealing Buffer for RNA oligos(5X),R0051)和水(DEPC水)混匀得到的体系，其中，各条单链RNA分子在退火反应体系中的终浓度均为20nM；所述退火的反应条件为PCR仪中90℃，2min使其充分变性，随后PCR仪中降温至25℃使其退火。
本发明还有一个目的是提供上述多聚核苷酸分子或上述衍生物的新用途。
本发明提供了上述多聚核苷酸分子或上述衍生物在如下A1)或A2)中的应用；
A1)调控细胞中靶基因表达水平；
A2)制备预防或缓解或治疗由靶基因表达引起的疾病的产品。
上述应用中，所述调控为抑制或降低。
上述应用中，所述细胞为肿瘤细胞；所述靶基因为疾病相关基因。
上述应用中，所述疾病相关基因为肿瘤相关基因；所述肿瘤相关基因具体为PPIB基因、p65基因、VEGFA基因、SOD1基因、EIF4E基因、HIF1A基因和/或TP53基因。
本发明还有一个目的是提供一种抑制或降低靶基因表达水平的试剂或试剂盒或药物。
本发明提供的抑制或降低靶基因表达水平的试剂或试剂盒或药物包括上述多聚核苷酸分子或上述衍生物。
本发明的最后一个目的是提供一种抑制或降低细胞中靶基因表达水平的方法。
本发明提供的抑制或降低细胞中靶基因表达水平的方法包括如下步骤：将上述多聚核苷酸分子或上述衍生物导入所述细胞，实现抑制或降低所述细胞中靶基因的表达水平。
上述方法中，所述导入的方法为将所述多聚寡核酸分子、转染试剂和缓冲液混匀后加入细胞培养基中，得到反应体系；所述多聚核苷酸分子在所述反应体系中的终浓度为1-300nM。
上述方法中，所述细胞为肿瘤细胞；所述靶基因为疾病相关基因。
上述方法中，所述疾病相关基因为肿瘤相关基因；所述肿瘤相关基因具体为PPIB基因、p65基因、VEGFA基因、SOD1基因、EIF4E基因、HIF1A基因和/或TP53基因。
本发明优势在于：
1)RNAi效能提高；
2)化学稳定性好：抗核酸酶降解能力增强，半衰期延长；
3)降低脱靶率；
4)能形成纳米颗粒结构，导入细胞能力增强；
5)可模块化设计核酸分子。
本发明将CON技术与纳米技术结合，通过构建具有可准确设计的，且具有自我组装能力的核酸结构，从而实现多靶标干扰作用，可用于抑制疾病发生或发展的信号通路中的多个基因表达，或同时抑制多个疾病靶基因表达，在生物学、化学等多个学科领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为多聚寡核酸设计图和结构示意图。图1A为多聚寡核酸设计图；图1B为多聚寡核酸结构示意图。
图2为不同多聚寡核酸结构对靶基因的影响。
图3为不同浓度4(R12+R6+R12)的多聚寡核苷酸的基因沉默效果。
图4为不同浓度6(R12+R6+R12)的多聚寡核苷酸的基因沉默效果。
图5为不同序列结构的多聚寡核苷酸的基因沉默效果。
图6为不同结构的多聚寡核苷酸的基因沉默效果。图6A为不同结构的多聚寡核苷酸的VEGFA基因沉默效果；图6B为不同结构的多聚寡核苷酸的PPIB基因沉默效果。
图7为针对不同基因的多寡核苷酸的基因沉默效果；图7A为不同结构的多聚寡核苷酸的基因沉默效果；图7B为不同结构的多聚寡核苷酸的基因沉默效果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、多聚寡核酸分子的设计与合成
一、多聚寡核酸分子的设计
本发明的多聚寡核酸分子包括至少3条寡核苷酸序列，多聚寡核酸分子中的每条寡核苷酸序列的大小为15-50nt，每条寡核苷酸序列自5’端到3’端依次由大小为5-24nt的靶向性终端片段TTS、大小为1-20nt的靶向性内部片段TIS和大小为5-24nt的接头终端片段ATS组成。多聚寡核酸分子中每条寡核苷酸序列均通过序列互补作用与多聚寡核酸分子中除自身外的另外两条序列形成双链区域，即每条寡核苷酸的靶向性终端片段TTS与其相邻的寡核苷酸的接头终端片段ATS互补；且每条寡核苷酸的靶向性终端片段TTS与其他寡核苷酸序列均不互补。每条寡核苷酸序列能通过其靶向性终端片段TTS和靶向性内部片段TIS与靶基因结合从而调控靶基因的表达。在某些特定的情况下，与靶基因结合的区域可以延长至寡核苷酸的接头终端片段ATS的部分序列。
本发明的寡核苷酸为DNA或RNA或由DNA和RNA组成的寡核苷酸。
本发明的多聚寡核酸分子的结构图如图1所示。①多聚寡核酸分子包括了多条独立的寡核苷酸序列，数量优选为3-8条，以4条(如图②～⑤)为例，进行示例性地说明。省略号(如图⑥)表示可以有更多的寡核苷酸序列。每条寡核苷酸序列分为三个片段：靶向性终端片段(targeting terminal segment，TTS)(如图⑦所示)、靶向性内部片段(targetinginternal segment，TIS)(如图⑧所示)、接头终端片段(adaptor terminal segment，ATS)(如图⑨所示)。相邻的两条序列其中一条序列的TTS片段与另一条序列的ATS片段通过序列互补作用连接在一起。最后一条序列的ATS片段(如图⑤所示)，与第一条序列的TTS片段(如图②所示)互补配对(如图⑩所示)。每条寡核苷酸序列的TTS片段和TIS片段顺次组成一条与靶基因或其部分片段互补的寡核苷酸序列(如图加粗线表示)。
二、多聚寡核酸分子的合成
本发明的单链寡核苷酸序列以序列特异性方式彼此退火，其互补性促进此类多聚寡核苷酸的自装配，形成具有二级结构的多聚寡核酸分子。具体制备方法如下：
1、合成每条单链RNA分子；
2、将单链RNA分子与其互补的单链RNA分子退火，自组装成二级结构体。
退火反应体系为将等摩尔量的各单链RNA分子、RNA退火buffer(5X)(碧云天Annealing Buffer for RNA oligos(5X),R0051)和水(DEPC水)混匀得到的体系，其中，各条单链RNA分子在退火反应体系中的终浓度均为20nM；
退火反应条件为PCR仪中90℃，2min使其充分变性，随后PCR仪中降温至25℃使其退火。
在具体实施方案中，为了增加核酸酶稳定性和生物学活性可在核苷酸中引入适当的糖、碱基和磷酸修饰，包括对核糖进行化学修饰(如2＇-O-Me、2＇-F、2＇-MOE、2’-氨基、2’-氧-烯丙基、2’-氢、LNA等)；对磷酸骨架进行化学修饰(如硫代磷酸修饰)；还包括连接特定的基团或配体。
在本发明的实施例中的每条寡核苷酸序列的ATS片段自3’端第一位核苷酸起连续的7个核苷酸的核糖均进行2＇-O-Me修饰。
实施例2、多聚寡核酸分子在抑制肿瘤细胞中靶基因表达中的应用
(一)针对同一靶基因的抑制试验
一、不同序列条数的多聚寡核酸分子抑制试验
1、针对p65基因的不同序列条数的多聚寡核酸分子抑制试验
(1)多聚寡核酸分子的制备
针对p65基因设计了3种多聚寡核酸N(Rm1+Rm2+Rm3)，即4(R12+R6+R12)、5(R12+R6+R12)、6(R12+R6+R12)。其中，N代表序列的条数，m1代表每条序列的TTS片段的核苷酸数目，m2代表每条序列的TIS片段的核苷酸数目，m3代表每条序列的ATS片段的核苷酸数目，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，核苷酸序列如表1所示，靶标为mRNA。其中，每条寡核苷酸序列中的小写字母的序列为经过2’Ome核糖修饰的序列；下划线标记的序列为与靶基因结合的序列，其自5'至3'端依次为TTS片段和TIS片段(本实施例中设计的每条寡核苷酸序列的TTS片段大小和ATS片段大小相同)；无下划线标记的序列为ATS片段，以下均同。多聚寡核酸分子的制备方法如下：
表1、P65-Ol igos
序列名称 序列(5'-3')
P65-Oligo 1 UGUGUAGCCAUUGAUCUUGCAUCaugaaga(序列1)
P65-Oligo 2 UCUUCAUGAUGCUCUUGAAUACCaccaaga(序列2)
P65-Oligo 3 UCUUGGUGGUAUCUGUGCUCGUCaccggau(序列3)
P65-Oligo 4 AUCCGGUGACGAUCGUCUUCAGGagaugaa(序列4)
P65-Oligo 5 UUCAUCUCCUGAAAGGAGAUCAGcuccuaa(序列5)
P65-Oligo 6 UUAGGAGCUGAUCUGACUAAUGGcuacaca(序列6)
P65-Oligo 7 UGUGUAGCCAUUGAUCUCAUCaugaaga(序列7)
P65-Oligo 8 UCUUCAUGAUGCUCUUGUACCaccaaga(序列8)
P65-Oligo 9 UCUUGGUGGUAUCUGUGCGUCaccggau(序列9)
P65-Oligo 10 AUCCGGUGACGAUCGUCCAGGagaugaa(序列10)
P65-Oligo 11 UUCAUCUCCUGAAAGGAUCAGcuccuaa(序列11)
P65-Oligo 12 UUAGGAGCUGAUCUGACAUGGcuacaca(序列12)
P65-Oligo 13 UGUGUAGCCAUUGAUCAUCaugaaga(序列13)
P65-Oligo 14 UCUUCAUGAUGCUCUUACCaccaaga(序列14)
P65-Oligo 15 UCUUGGUGGUAUCUGUGUCaccggau(序列15)
P65-Oligo 16 AUCCGGUGACGAUCGUAGGagaugaa(序列16)
P65-Oligo 17 UUCAUCUCCUGAAAGGCAGcuccuaa(序列17)
P65-Oligo 18 UUAGGAGCUGAUCUGAUGGcuacaca(序列18)
1)4(R12+R6+R12)的制备
分别合成P65-Oligo 1-4序列，将其退火，得到4(R12+R6+R12)；其中，P65-Oligo1-4的第1-12位均为TTS；第13-18位均为TIS；第19-30位均为ATS。退火体系为表2，退火反应条件为表3。
表2、退火反应体系(M＝4)
P65-Oligo 1(100μM) 20μL
P65-Oligo 2(100μM) 20μL
P65-Oligo 3(100μM) 20μL
P65-Oligo 4(100μM) 20μL
RNA退火buffer(5X) 15μL
DEPC水 5μL
总体积 100μL
表3、退火反应条件
步骤 温度 时间
1 90℃ 2min
2 每5秒下降0.1℃，降至25℃ 70min
2)5(R12+R6+R12)的制备
分别合成P65-Oligo 1-5序列；将其退火，得到5(R12+R6+R12)；其中，P65-Oligo1-5的第1-12位均为TTS；第13-18位均为TIS；第19-30位均为ATS。退火体系为表4，退火反应条件为表3。
表4、退火反应体系(M＝5)
3)6(R12+R6+R12)的制备
分别合成P65-Oligo 1-6序列；将其退火，得到6(R12+R6+R12)；其中，P65-Oligo1-6的第1-12位均为TTS；第13-18位均为TIS；第19-30位均为ATS。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
表5、退火反应体系(M＝6)
(2)抑制试验
将5×105个HeLa细胞(ATCC编号为CRL-1958)接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔培养板中，应用脂质体法分别将如下多聚寡核酸分子：4(R12+R6+R12)、5(R12+R6+R12)、6(R12+R6+R12)转染HeLa细胞：将多聚寡核酸分子与转染试剂、缓冲液(广州市锐博生物科技有限公司，名称riboFECTTM CP Buffer，货号C10511-1)混合后加入细胞培养基中，每孔体积1mL，使其多聚寡核酸分子的转染终浓度为100nM，将培养板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养48h。转染试剂及转染具体步骤参照riboFectTM(广州市锐博生物科技有限公司)中的方法。
每次细胞铺板除了试验组，还设置如下对照组(NC组)。试验组和对照组均有3个重复。NC组的对照序列为siRNA，为如下两条单链RNA分子互补结合得到的双链RNA分子：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3'和5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT-3'。对照寡核酸序列的终浓度为100nM。
(3)qPCR检测
37℃、5％CO2孵育48h后收集转染后细胞，rizol法提取转染后细胞的RNA进行实时定量PCR，检测靶基因mRNA表达水平，q-PCR重复3次，结果均用平均值±SD表示，SPSS17.0进行统计学分析。统计学差异用单因素方差分析和双侧t检验。P＜0.05表明差异显著。检测靶基因的实时定量PCR引物序列如表6所示。
表6、检测靶基因的实时定量PCR引物序列
2、针对TP53基因的不同序列条数的多聚寡核酸分子抑制试验
(1)多聚寡核酸分子的制备
针对TP53基因设计了3种多聚寡核酸N(Rm1+Rm2+Rm3)，即4(R12+R6+R12)、5(R12+R6+R12)、6(R12+R6+R12)。其中，N代表序列的条数，m1代表每条序列的TTS片段的核苷酸数目，m2代表每条序列的TIS片段的核苷酸数目，m3代表每条序列的ATS片段的核苷酸数目，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，核苷酸序列如表7所示，靶标为mRNA。多聚寡核酸分子的制备方法如下：
表7、TP53-Oligos
1)4(R12+R6+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 3-6序列；将其退火，得到4(R12+R6+R12)。退火体系为表2，退火反应条件为表3。
2)5(R12+R6+R12)的制备
合成TP53-Oligo 2-6序列；将其退火，得到5(R12+R6+R12)。退火体系为表4，退火反应条件为表3。
3)6(R12+R6+R12)的制备
合成TP53-Oligo 1-6序列；将其退火，得到6(R12+R6+R12)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
同步骤1中的(2)。
(3)qPCR检测
同步骤1中的(3)。
3、针对VEGFA基因的不同序列条数的多聚寡核酸分子抑制试验
(1)多聚寡核酸分子的制备
针对VEGFA基因设计了3种多聚寡核酸N(Rm1+Rm2+Rm3)，即4(R12+R6+R12)、5(R12+R6+R12)、6(R12+R6+R12)。其中，N代表序列的条数，m1代表每条序列的TTS片段的核苷酸数目，m2代表每条序列的TIS片段的核苷酸数目，m3代表每条序列的ATS片段的核苷酸数目，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，核苷酸序列如表8所示，靶标为mRNA。多聚寡核酸分子的制备方法如下：
表8、VEGFA-Oligos
1)4(R12+R6+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 1、VEGFA-Oligo 4、VEGFA-Oligo 5、VEGFA-Oligo 6序列；将其退火，得到4(R12+R6+R12)。退火体系为表2，退火反应条件为表3。
2)5(R12+R6+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 1、VEGFA-Oligo 2、VEGFA-Oligo 4、VEGFA-Oligo 5、VEGFA-Oligo6序列；将其退火，得到5(R12+R6+R12)。退火体系为表4，退火反应条件为表3。
3)6(R12+R6+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 1-6序列；将其退火，得到6(R12+R6+R12)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
同步骤1中的(2)。
(3)qPCR检测
同步骤1中的(3)。
4、针对PPIB基因的不同序列条数的多聚寡核酸分子抑制试验
(1)多聚寡核酸分子的制备
针对PPIB基因设计了3种多聚寡核酸N(Rm1+Rm2+Rm3)，即4(R12+R6+R12)、5(R12+R6+R12)、6(R12+R6+R12)。其中，N代表序列的条数，m1代表每条序列的TTS片段的核苷酸数目，m2代表每条序列的TIS片段的核苷酸数目，m3代表每条序列的ATS片段的核苷酸数目，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，核苷酸序列如表9所示，靶标为mRNA。多聚寡核酸分子的制备方法如下：
表9、PPIB-Oligos
1)4(R12+R6+R12)的制备
分别合成PPIB-Oligo 1、PPIB-Oligo 3、PPIB-Oligo 4、PPIB-Oligo 5序列；将其退火，得到4(R12+R6+R12)。退火体系为表2，退火反应条件为表3。
2)5(R12+R6+R12)的制备
分别合成PPIB-Oligo 1-5序列；将其退火，得到5(R12+R6+R12)。退火体系为表4，退火反应条件为表3。
3)6(R12+R6+R12)的制备
分别合成PPIB-Oligo 1-6序列；将其退火，得到6(R12+R6+R12)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
同步骤1中的(2)。
(3)qPCR检测
同步骤1中的(3)。
q-PCR检测结果如图2所示。结果表明：本发明针对p65、TP53、VEGFA和PPIB基因的R6、R5或R4结构的多聚寡核酸分子均实现了下调对应靶基因表达的目的，抑制率在85％以上。说明本发明制备的多聚寡核酸分子可以实现抑制靶基因的表达的目的。
二、不同浓度的多聚寡核酸分子抑制试验
1、4(R12+R6+R12)结构
(1)多聚寡核酸分子的制备
多聚寡核酸分子分别为上述步骤一中针对p65、TP53、VEGFA和PPIB基因制备的4(R12+R6+R12)。
(2)抑制试验
将5×105个HeLa细胞(ATCC编号为CRL-1958)接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔培养板中，应用脂质体法分别将上述步骤(1)中针对p65、TP53、VEGFA和PPIB基因制备的4(R12+R6+R12)转染HeLa细胞：将多聚寡核酸分子与转染试剂、缓冲液混合后加入细胞培养基中，每孔体积1mL，使其多聚寡核酸分子的转染终浓度分别为1nM、25nM、100nM和300nM，将培养板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养48h。转染试剂及转染具体步骤参照riboFectTM(广州市锐博生物科技有限公司)中的方法。
每次细胞铺板除了试验组，还设置如下对照组(NC组)。试验组和对照组均有3个重复。NC组的对照序列为siRNA，为如下两条单链RNA分子互补结合得到的双链RNA分子：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3'和5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT-3'。对照寡核酸序列的终浓度为100nM。
(3)qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1、2、3、4中的(3)。
结果如图3所示。结果表明：施用25nM-300nM的多聚寡核苷酸分子均能抑制靶基因TP53、VEGFA、p65和PPIB的mRNA表达；即使浓度在1nM时，也抑制了17％的VEGFA基因，44％的p65基因以及47％的PPIB基因的mRNA表达。
2、6(R12+R6+R12)结构
(1)多聚寡核酸分子的制备
多聚寡核酸分子分别为上述步骤一中针对p65、TP53、VEGFA和PPIB基因制备的6(R12+R6+R12)。
(2)抑制试验
将5×105个HeLa细胞(ATCC编号为CRL-1958)接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔培养板中，应用脂质体法分别将上述步骤(1)中针对p65、TP53、VEGFA、PPIB基因制备的6(R12+R6+R12)转染HeLa细胞：将多聚寡核酸分子与转染试剂、缓冲液混合后加入细胞培养基中，每孔体积1mL，使其多聚寡核酸分子的转染终浓度分别为1nM、17nM、100nM、300nM，将培养板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养48h。转染试剂及转染具体步骤参照riboFectTM(广州市锐博生物科技有限公司)中的方法。
每次细胞铺板除了试验组，还设置如下对照组(NC组)。试验组和对照组均有3个重复。NC组的对照序列为siRNA，为如下两条单链RNA分子互补结合得到的双链RNA分子：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3'和5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT-3'。对照寡核酸序列的终浓度为100nM。
(3)qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1、2、3、4中的(3)。
结果如图4所示。结果表明：施用1nM-300nM的多聚寡核酸分子均能抑制靶基因的表达，且针对VEGFA基因的最佳施用浓度为17nM(抑制效率95％)。
三、不同片段结构的多聚寡核酸分子抑制试验
1、针对p65基因的不同片段结构的多聚寡核酸分子抑制试验
(1)多聚寡核酸分子的制备
针对p65基因设计了3种多聚寡核酸分子：6(R12+R6+R12)、6(R11+R6+R11)、6(R10+R6+R10)，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，靶标为mRNA。
1)6(R12+R6+R12)的制备
6(R12+R6+R12)的制备方法见步骤一的1(1)中的3)。
2)6(R11+R6+R11)的制备
分别合成P65-Oligo 7-12序列；将其退火，得到6(R11+R6+R11)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
3)6(R10+R6+R10)的制备
合成P65-Oligo 13-18序列；将其退火，得到6(R10+R6+R10)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
将5×105个HeLa细胞(ATCC编号为CRL-1958)接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔培养板中，应用脂质体法分别将6(R12+R6+R12)、6(R11+R6+R11)、6(R10+R6+R10)转染HeLa细胞：将多聚寡核酸分子与转染试剂、缓冲液混合后加入细胞培养基中，每孔体积1mL，使其多聚寡核酸分子的转染终浓度为100nM，将培养板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养48h。转染试剂及转染具体步骤参照riboFectTM(广州市锐博生物科技有限公司)中的方法。
每次细胞铺板除了试验组，还设置如下对照组(NC组)。试验组和对照组均有3个重复。NC组的对照序列为siRNA，为如下两条单链RNA分子互补结合得到的双链RNA分子：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3'和5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT-3'。对照寡核酸序列的终浓度为100nM。
(3)qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1的(3)。
2、针对TP53基因的不同片段结构的多聚寡核酸分子抑制试验
针对TP53基因设计了3种多聚寡核酸分子：6(R12+R6+R12)、6(R11+R6+R11)、6(R10+R6+R10)，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，靶标为mRNA。
1)6(R12+R6+R12)的制备
6(R12+R6+R12)的制备方法见步骤一的2(1)中的3)。
2)6(R11+R6+R11)的制备
分别合成TP53-Oligo 7-12序列；将其退火，得到6(R11+R6+R11)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
3)6(R10+R6+R10)的制备
分别合成TP53-Oligo 13-18序列；将其退火，得到6(R10+R6+R10)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
抑制试验同上述步骤三的1中的(2)。
(3)qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1中的(3)。
3、针对VEGFA基因的不同片段结构的多聚寡核酸分子抑制试验
针对VEGFA基因设计了3种多聚寡核酸分子：6(R12+R6+R12)、6(R11+R6+R11)、6(R10+R6+R10)，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，靶标为mRNA。
1)6(R12+R6+R12)的制备
6(R12+R6+R12)的制备步骤见步骤一的3(1)中的3)。
2)6(R11+R6+R11)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 7-12序列；将其退火，得到6(R11+R6+R11)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
3)6(R10+R6+R10)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 13-18序列；将其退火，得到6(R10+R6+R10)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
抑制试验同上述步骤三的1中的(2)。
(3)qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1中的(3)。
4、针对PPIB基因的不同片段结构的多聚寡核酸分子抑制试验
针对PPIB基因设计了3种多聚寡核酸分子：6(R12+R6+R12)、6(R11+R6+R11)、6(R10+R6+R10)，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，靶标为mRNA。
1)6(R12+R6+R12)的制备
6(R12+R6+R12)的制备步骤见步骤一的4(1)中的3)。
2)6(R11+R6+R11)的制备
分别合成PPIB-Oligo 7-12序列；将其退火，得到6(R11+R6+R11)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
3)6(R10+R6+R10)的制备
分别合成PPIB-Oligo 13-18序列；将其退火，得到6(R10+R6+R10)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
抑制试验同上述步骤三的1中的(2)。
(3)qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1中的(3)。
结果如图5所示。结果表明：6(R12+R6+R12)、6(R11+R6+R11)、6(R10+R6+R10)三种结构的多聚寡核酸分子均可抑制靶基因TP53、VEGFA、p65和PPIB的mRNA表达，抑制效率达70％以上。
四、不同结构的多聚寡核酸分子抑制试验
1、针对VEGFA基因的不同结构的多聚寡核酸分子抑制试验
(1)多聚寡核酸分子的制备
针对VEGFA基因设计了15种不同结构的多聚寡核酸分子:6(R12+R6+R12)、6(R12+R5+R12)、6(R11+R6+R11)、6(R12+R4+R12)、6(R10+R6+R10)、6(R12+R3+R12)、6(R9+R6+R9)、5(R12+R6+R12)、5(R12+R5+R12)、5(R12+R4+R12)、5(R12+R3+R12)、4(R12+R6+R12)、4(R12+R5+R12)、4(R12+R4+R12)、4(R12+R3+R12)，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，靶标为mRNA。
1)6(R12+R6+R12)的制备
6(R12+R6+R12)的制备步骤见步骤一的3(1)中3)；
2)6(R12+R5+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 19-24序列；将其退火，得到6(R12+R5+R12)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
3)6(R11+R6+R11)的制备
6(R11+R6+R11)的制备步骤见步骤三的3中的2)。
4)6(R12+R4+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 25-30序列；将其退火，得到6(R12+R4+R12)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
5)6(R10+R6+R10)的制备
6(R10+R6+R10)的制备步骤见步骤三的3中的3)。
6)6(R12+R3+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 31-36序列；将其退火，得到6(R12+R3+R12)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
7)6(R9+R6+R9)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 37-42序列；将其退火，得到6(R9+R6+R9)。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
8)5(R12+R6+R12)的制备
5(R12+R6+R12)的制备步骤见步骤一的3(1)中的2)。
9)5(R12+R5+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 19、VEGFA-Oligo 20、VEGFA-Oligo 22、VEGFA-Oligo 23、VEGFA-Oligo 24序列；将其退火，得到5(R12+R5+R12)。退火体系为表4，退火反应条件为表3。
10)5(R12+R4+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 25、VEGFA-Oligo 26、VEGFA-Oligo 28、VEGFA-Oligo 29、VEGFA-Oligo 30序列；将其退火，得到5(R12+R4+R12)。退火体系为表4，退火反应条件为表3。
11)5(R12+R3+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 31、VEGFA-Oligo 32、VEGFA-Oligo 34、VEGFA-Oligo 35、VEGFA-Oligo 36序列；将其退火，得到5(R12+R3+R12)。退火体系为表4，退火反应条件为表3。
12)4(R12+R6+R12)的制备
4(R12+R6+R12)的制备步骤见步骤一的3(1)中的1)；
13)4(R12+R5+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 19、VEGFA-Oligo 22、VEGFA-Oligo 23、VEGFA-Oligo 24序列；将其退火，得到4(R12+R5+R12)。退火体系为表2，退火反应条件为表3。
14)4(R12+R4+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 25、VEGFA-Oligo 28、VEGFA-Oligo 29、VEGFA-Oligo 30序列；将其退火，得到4(R12+R4+R12)。退火体系为表2，退火反应条件为表3。
15)4(R12+R3+R12)的制备
分别合成VEGFA-Oligo 31、VEGFA-Oligo 34、VEGFA-Oligo 35、VEGFA-Oligo 36序列；将其退火，得到4(R12+R3+R12)。退火体系为表2，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
抑制试验同上述步骤一的1中的(2)。
(3)qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1中的(3)。
结果如图6A所示。结果表明：以上15种不同结构的多聚寡核酸分子均可抑制VEGFA基因的表达，对VEGFA抑制效率达75％以上。
2、针对TP53基因的不同结构的多聚寡核酸分子抑制试验
(1)多聚寡核酸分子的制备
针对TP53基因设计了15种不同结构的多聚寡核酸分子:6(R12+R6+R12)、6(R12+R5+R12)、6(R11+R6+R11)、6(R12+R4+R12)、6(R10+R6+R10)、6(R12+R3+R12)、6(R9+R6+R9)、5(R12+R6+R12)、5(R12+R5+R12)、5(R12+R4+R12)、5(R12+R3+R12)、4(R12+R6+R12)、4(R12+R5+R12)、4(R12+R4+R12)、4(R12+R3+R12)，其中每条寡核苷酸序列均为RNA，靶标为mRNA。
1)6(R12+R6+R12)的制备
6(R12+R6+R12)的制备步骤见步骤一的1(1)中3)；
2)6(R12+R5+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 19-24序列；将其退火，得到6(R12+R5+R12)；退火体系为表5，退火反应条件为表3。
3)6(R11+R6+R11)的制备
6(R11+R6+R11)的制备步骤见步骤三的2中的2)。
4)6(R12+R4+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 25-30序列；将其退火，得到6(R12+R4+R12)；退火体系为表5，退火反应条件为表3。
5)6(R10+R6+R10)的制备
6(R10+R6+R10)的制备步骤见步骤三的2中的3)。
6)6(R12+R3+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 31-36序列；将其退火，得到6(R12+R3+R12)；退火体系为表5，退火反应条件为表3。
7)6(R9+R6+R9)的制备
分别合成TP53-Oligo 37-42序列；将其退火，得到6(R9+R6+R9)；退火体系为表5，退火反应条件为表3。
8)5(R12+R6+R12)的制备
5(R12+R6+R12)的制备步骤见步骤一的2(1)中的2)。
9)5(R12+R5+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 20-24序列；将其退火，得到5(R12+R5+R12)；退火体系为表4，退火反应条件为表3。
10)5(R12+R4+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 26-30序列；将其退火，得到5(R12+R4+R12)；退火体系为表4，退火反应条件为表3。
11)5(R12+R3+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 32-36序列；将其退火，得到5(R12+R3+R12)；退火体系为表4，退火反应条件为表3。
12)4(R12+R6+R12)的制备
4(R12+R6+R12)的制备步骤见步骤一的2(1)中的1)；
13)4(R12+R5+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 21-24序列；将其退火，得到4(R12+R5+R12)；退火体系为表2，退火反应条件为表3。
14)4(R12+R4+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 27-30序列；将其退火，得到4(R12+R4+R12)；退火体系为表2，退火反应条件为表3。
15)4(R12+R3+R12)的制备
分别合成TP53-Oligo 33-36序列；将其退火，得到4(R12+R3+R12)；退火体系为表2，退火反应条件为表3。
(2)抑制试验
抑制试验同上述步骤三的1中的(2)。
(3)qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1中的(3)。
结果如图6B所示。结果表明：以上15种不同结构的多聚寡核酸分子均可抑制TP53基因的表达。
(二)针对不同靶基因的抑制试验
1、多靶多聚寡核酸分子的制备
设计同时靶向PPIB、p65、VEGFA、SOD1、EIF4E和HIF1A6基因的多靶多聚寡核酸分子，其结构如图7A，制备方法如下：分别合成SOD1-Oligo、PPIB-Oligo、P65-Oligo HIF1A-Oligo、EIF4E-Oligo、VEGFA-Oligo序列；将其退火，得到多靶多聚寡核酸分子。退火体系为表5，退火反应条件为表3。
表10、不同靶基因序列
SOD1-Oligo UACUUUCUUCAUUUCCACCUGUUccaaaaa(序列121)
PPIB-Oligo UUUUUGGAACAGUCUUUCUGAGAccuucaa(序列122)
P65-Oligo UUGAAGGUCUCAUAUGUCCCAGCaacuuga(序列123)
HIF1A-Oligo UCAAGUUGCUGGUCAUCAGGAGGuugcuaa(序列124)
EIF4E-Oligo UUAGCAACCUCCUGAUUACAUGCagauuau(序列125)
VEGFA-Oligo AUAAUCUGCAUGGUGAUGAUGAAgaaagua(序列126)
2、抑制试验
抑制试验同上述步骤一的1中的(2)。
3、qPCR检测
qPCR检测方法同上述步骤一的1中的(3)。
结果如图7B所示。结果表明：针对同时靶向PPIB、p65、VEGFA、SOD1、EIF4E、HIF1A6基因的多靶多聚寡核酸分子可以同时抑制HeLa细胞中PPIB、p65、VEGFA、SOD1、EIF4E和HIF1A6基因的mRNA表达。与NC组相比，PPIB、p65、VEGFA、SOD1、EIF4E、HIF1A6基因的mRNA表达水平分别下降了52％、43％、62％、91％、91％和83％，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
序列表
<110> 广州市锐博生物科技有限公司
<120> 一种多聚寡核酸分子及其在多靶标干扰中的应用
<160> 126
<210> 1
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
uguguagcca uugaucuugc aucaugaaga 30
<210> 2
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
ucuucaugau gcucuugaau accaccaaga 30
<210> 3
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ucuugguggu aucugugcuc gucaccggau 30
<210> 4
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
auccggugac gaucgucuuc aggagaugaa 30
<210> 5
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
uucaucuccu gaaaggagau cagcuccuaa 30
<210> 6
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
uuaggagcug aucugacuaa uggcuacaca 30
<210> 7
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
uguguagcca uugaucucau caugaaga 28
<210> 8
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
ucuucaugau gcucuuguac caccaaga 28
<210> 9
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
ucuugguggu aucugugcgu caccggau 28
<210> 10
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
auccggugac gaucguccag gagaugaa 28
<210> 11
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
uucaucuccu gaaaggauca gcuccuaa 28
<210> 12
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
uuaggagcug aucugacaug gcuacaca 28
<210> 13
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
uguguagcca uugaucauca ugaaga 26
<210> 14
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
ucuucaugau gcucuuacca ccaaga 26
<210> 15
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
ucuugguggu aucuguguca ccggau 26
<210> 16
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
auccggugac gaucguagga gaugaa 26
<210> 17
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
uucaucuccu gaaaggcagc uccuaa 26
<210> 18
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
uuaggagcug aucugauggc uacaca 26
<210> 19
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
uguggaauca acccacaguu ugcgugugga 30
<210> 20
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
uccacacgca aauuuccuac agaaacacuu 30
<210> 21
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
aaguguuucu gucauccaac uacaugugua 30
<210> 22
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
uacacaugua guuguaguug guaaucuacu 30
<210> 23
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
aguagauuac cacuggaguc uccgcaagaa 30
<210> 24
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
uucuugcgga gauucucugu ugauuccaca 30
<210> 25
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
uguggaauca acccacauug cgugugga 28
<210> 26
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
uccacacgca aauuucccag aaacacuu 28
<210> 27
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
aaguguuucu gucaucccua caugugua 28
<210> 28
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
uacacaugua guuguagggu aaucuacu 28
<210> 29
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 29
aguagauuac cacuggacuc cgcaagaa 28
<210> 30
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 30
uucuugcgga gauucucuug auuccaca 28
<210> 31
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 31
uguggaauca acccacugcg ugugga 26
<210> 32
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 32
uccacacgca aauuucagaa acacuu 26
<210> 33
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 33
aaguguuucu gucaucuaca ugugua 26
<210> 34
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 34
uacacaugua guuguaguaa ucuacu 26
<210> 35
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 35
aguagauuac cacugguccg caagaa 26
<210> 36
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 36
uucuugcgga gauucuugau uccaca 26
<210> 37
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 37
uguggaauca acccacauuu gcgugugga 29
<210> 38
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 38
uccacacgca aauuuccaca gaaacacuu 29
<210> 39
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 39
aaguguuucu gucauccacu acaugugua 29
<210> 40
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 40
uacacaugua guuguagugg uaaucuacu 29
<210> 41
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 41
aguagauuac cacuggaucu ccgcaagaa 29
<210> 42
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 42
uucuugcgga gauucucguu gauuccaca 29
<210> 43
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 43
uguggaauca acccacuuug cgugugga 28
<210> 44
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 44
uccacacgca aauuucacag aaacacuu 28
<210> 45
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 45
aaguguuucu gucaucacua caugugua 28
<210> 46
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 46
uacacaugua guuguauggu aaucuacu 28
<210> 47
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 47
aguagauuac cacuggucuc cgcaagaa 28
<210> 48
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 48
uucuugcgga gauucuguug auuccaca 28
<210> 49
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 49
uguggaauca acccauuugc gugugga 27
<210> 50
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 50
uccacacgca aauuuacaga aacacuu 27
<210> 51
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 51
aaguguuucu gucauacuac augugua 27
<210> 52
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 52
uacacaugua guuguuggua aucuacu 27
<210> 53
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 53
aguagauuac cacugucucc gcaagaa 27
<210> 54
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 54
uucuugcgga gauucguuga uuccaca 27
<210> 55
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 55
uguggaauca acccagcgug ugga 24
<210> 56
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 56
uccacacgca aauuugaaac acuu 24
<210> 57
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 57
aaguguuucu gucauacaug ugua 24
<210> 58
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 58
uacacaugua guuguuaauc uacu 24
<210> 59
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 59
aguagauuac cacugccgca agaa 24
<210> 60
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 60
uucuugcgga gauucgauuc caca 24
<210> 61
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 61
agcagaaagu ucaugguuuc uugggugcau 30
<210> 62
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 62
augcacccaa gacagcagag aucgaguaca 30
<210> 63
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 63
uguacucgau cucaucaggg uggacaucuu 30
<210> 64
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 64
aagaugucca ccagggucau gcggaucaaa 30
<210> 65
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 65
uuugauccgc auaaucuggg ccagcacaua 30
<210> 66
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 66
uaugugcugg ccuuggugga acuuucugcu 30
<210> 67
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 67
agcagaaagu ucauggucuu gggugcau 28
<210> 68
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 68
augcacccaa gacagcagau cgaguaca 28
<210> 69
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 69
uguacucgau cucaucagug gacaucuu 28
<210> 70
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 70
aagaugucca ccaggguugc ggaucaaa 28
<210> 71
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 71
uuugauccgc auaaucugcc agcacaua 28
<210> 72
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 72
uaugugcugg ccuugguaac uuucugcu 28
<210> 73
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 73
agcagaaagu ucaugguugg gugcau 26
<210> 74
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 74
augcacccaa gacagcaucg aguaca 26
<210> 75
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 75
uguacucgau cucaucugga caucuu 26
<210> 76
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 76
aagaugucca ccaggggcgg aucaaa 26
<210> 77
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 77
uuugauccgc auaaucccag cacaua 26
<210> 78
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 78
uaugugcugg ccuuggacuu ucugcu 26
<210> 79
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 79
agcagaaagu ucaugguucu ugggugcau 29
<210> 80
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 80
augcacccaa gacagcaaga ucgaguaca 29
<210> 81
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 81
uguacucgau cucaucaggu ggacaucuu 29
<210> 82
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 82
aagaugucca ccaggguaug cggaucaaa 29
<210> 83
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 83
uuugauccgc auaaucuggc cagcacaua 29
<210> 84
<211> 29bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 84
uaugugcugg ccuuggugaa cuuucugcu 29
<210> 85
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 85
agcagaaagu ucauggucuu gggugcau 28
<210> 86
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 86
augcacccaa gacagcagau cgaguaca 28
<210> 87
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 87
uguacucgau cucaucagug gacaucuu 28
<210> 88
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 88
aagaugucca ccaggguugc ggaucaaa 28
<210> 89
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 89
uuugauccgc auaaucugcc agcacaua 28
<210> 90
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 90
uaugugcugg ccuugguaac uuucugcu 28
<210> 91
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 91
agcagaaagu ucaugucuug ggugcau 27
<210> 92
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 92
augcacccaa gacagagauc gaguaca 27
<210> 93
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 93
uguacucgau cucauggugg acaucuu 27
<210> 94
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 94
aagaugucca ccaggaugcg gaucaaa 27
<210> 95
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 95
uuugauccgc auaauggcca gcacaua 27
<210> 96
<211> 27bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 96
uaugugcugg ccuuggaacu uucugcu 27
<210> 97
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 97
agcagaaagu ucaugugggu gcau 24
<210> 98
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 98
augcacccaa gacagucgag uaca 24
<210> 99
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
uguacucgau cucauggaca ucuu 24
<210> 100
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 100
aagaugucca ccaggcggau caaa 24
<210> 101
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 101
uuugauccgc auaaucagca caua 24
<210> 102
<211> 24bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 102
uaugugcugg ccuugcuuuc ugcu 24
<210> 103
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 103
agaugcucuu uccuccugca ugaaggugcu 30
<210> 104
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 104
agcaccuuca uguugcguca agguguauuu 30
<210> 105
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 105
aaauacaccu ugacggugga ugaagaugua 30
<210> 106
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 106
uacaucuuca ucuccaauuc ucuucggaaa 30
<210> 107
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 107
uuuccgaaga gaccaaagcg uguaaucaag 30
<210> 108
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 108
cuugauuaca cgauggaaga aagagcaucu 30
<210> 109
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 109
agaugcucuu uccuccuaug aaggugcu 28
<210> 110
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 110
agcaccuuca uguugcgaag guguauuu 28
<210> 111
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 111
aaauacaccu ugacgguaug aagaugua 28
<210> 112
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 112
uacaucuuca ucuccaacuc uucggaaa 28
<210> 113
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 113
uuuccgaaga gaccaaagug uaaucaag 28
<210> 114
<211> 28bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 114
cuugauuaca cgauggaaaa gagcaucu 28
<210> 115
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 115
agaugcucuu uccuccugaa ggugcu 26
<210> 116
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 116
agcaccuuca uguugcaggu guauuu 26
<210> 117
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 117
aaauacaccu ugacggugaa gaugua 26
<210> 118
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 118
uacaucuuca ucuccaucuu cggaaa 26
<210> 119
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 119
uuuccgaaga gaccaaugua aucaag 26
<210> 120
<211> 26bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 120
cuugauuaca cgauggaaga gcaucu 26
<210> 121
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 121
uacuuucuuc auuuccaccu guuccaaaaa 30
<210> 122
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 122
uuuuuggaac agucuuucug agaccuucaa 30
<210> 123
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 123
uugaaggucu cauauguccc agcaacuuga 30
<210> 124
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 124
ucaaguugcu ggucaucagg agguugcuaa 30
<210> 125
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 125
uuagcaaccu ccugauuaca ugcagauuau 30
<210> 126
<211> 30bp
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 126
auaaucugca uggugaugau gaagaaagua 30

Claims (10)

1.一种用于抑制靶基因表达的多聚核苷酸分子，其由M条寡核苷酸组成，
每条所述寡核苷酸依次由靶向性终端片段TTS、靶向性内部片段TIS和接头终端片段ATS组成；
所述M为大于或等于3的整数；
每条所述寡核苷酸序列的大小为15-50nt；
所述靶向性终端片段的大小为5-24nt；
所述靶向性内部片段的大小为1-20nt；
所述接头终端片段的大小为5-24nt；
每条所述寡核苷酸的靶向性终端片段TTS与其相邻的寡核苷酸的接头终端片段ATS互补；
每条所述寡核苷酸的靶向性终端片段TTS和所述靶向性内部片段TIS与靶基因互补。
2.根据权利要求1所述的多聚核苷酸分子，其特征在于：
所述寡核苷酸为DNA或RNA或由DNA与RNA组成的寡核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的多聚核苷酸分子，其特征在于：
所述靶基因的个数为一个或多个；
或所述靶基因的个数不超过M个。
4.根据权利要求1-3中任一所述的多聚核苷酸分子，其特征在于：
所述M的个数为3、4、5、6、7和8；
或每条所述寡核苷酸序列的大小为21-30nt；
或所述靶向性终端片段的大小为9-12nt；
或所述靶向性内部片段的大小为3-6nt；
或所述接头终端片段的大小为9-12nt。
5.根据权利要求1-4中任一所述的多聚核苷酸分子，其特征在于：
每条所述寡核苷酸的靶向性终端片段的大小和接头终端片段的大小相同。
6.根据权利要求5所述的多聚核苷酸分子，其特征在于：
每条所述寡核苷酸序列的大小相同。
7.权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子的衍生物，为如下(1)-(6)中任一所述的多聚核苷酸分子的衍生物：
(1)将权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
(2)将权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子进行核苷酸取代或修饰，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
所述取代为将所述多聚核苷酸分子中的每条寡核苷酸的ATS片段自3’端第一位核苷酸起连续的3-9个核苷酸核糖2′-C的-OH基团均被-CH3、-OCH3、-NH2或-F取代；
所述修饰为将所述多聚核苷酸分子中的每条寡核苷酸的ATS片段自3’端第一位核苷酸起连续的3-9个核苷酸核糖2′-C的-OH基团均进行2＇-O-Me修饰；
(3)将权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
(4)将权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子编码的RNA分子，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
(5)由权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子编码的肽核酸、锁核酸或解锁核酸，得到与所述多聚核苷酸分子具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物；
(6)将权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的多聚核苷酸分子的衍生物。
8.权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子的制备方法，包括如下步骤：
1)合成权利要求1-6中任一所述的M条寡核苷酸序列；
2)将所述M条寡核苷酸序列退火，得到所述多聚核苷酸分子。
9.权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子或权利要求7所述的衍生物在如下A1)或A2)中的应用；
A1)调控细胞中靶基因表达水平；
A2)制备预防或缓解或治疗由靶基因表达引起的疾病的产品；
或所述细胞为肿瘤细胞；
或所述靶基因为疾病相关基因；
或所述疾病相关基因为肿瘤相关基因；
或所述肿瘤相关基因具体为PPIB基因、p65基因、VEGFA基因、SOD1基因、EIF4E基因、HIF1A基因和/或TP53基因。
10.一种抑制或降低细胞中靶基因表达水平的试剂或试剂盒或药物，包括权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子或权利要求7所述的衍生物；
或一种抑制或降低细胞中靶基因表达水平的方法，包括如下步骤：将权利要求1-6中任一所述的多聚核苷酸分子或权利要求7所述的衍生物导入所述细胞，实现抑制或降低所述细胞中靶基因的表达水平。
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