BR112020006746A2

BR112020006746A2 - intensificador para células t ou células b, composição farmacêutica, inibidor da recorrência de tumor maligno, e, indutor para induzir uma função de memória em células t ou células b

Info

Publication number: BR112020006746A2
Application number: BR112020006746-6A
Authority: BR
Inventors: Koji Tamada; Yukimi SAKODA; Keishi ADACHI; Takafumi Nakamura
Original assignee: Yamaguchi University; National University Corporation Tottori University
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2018-10-09
Publication date: 2020-10-06
Also published as: RU2020113588A3; US11617765B2; ZA202000986B; SG11202003252TA; JPWO2019073973A1; CA3075886A1; CL2020000950A1; EP3695846A4; TW201927314A; IL305898A; EP3695846B1; EP4265634A2; WO2019073973A1; US20200352997A1; KR20200068661A; CN111163758A; IL305898B1; RU2020113588A; JP7232447B2; IL273689A

Abstract

O propósito da presente invenção é prover, de modo a continuar a rejeição de tumores malignos durante um longo período de tempo, um intensificador para células T ou células B endógenas tendo uma função de memória e um inibidor de recorrência de tumor maligno. A presente invenção envolve preparar: um intensificador para as células T ou células B objetos tendo uma função de memória, o dito intensificador incluindo um meio de transporte de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina 7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 (CCL 19) da quimiocina (motivo C-C); um indutor que induza função de memória nas células T ou células B em um sujeito e um inibidor da recorrência de tumor maligno que inclua um meio de transporte de aço nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina 7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando CCL19.

Description

INTENSIFICADOR PARA CÉLULAS T OU CÉLULAS B, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, INIBIDOR DA RECORRÊNCIA DE TUMOR MALIGNO, E, INDUTOR PARA INDUZIR UMA FUNÇÃO DE

MEMÓRIA EM CÉLULAS T OU CÉLULAS B Campo Técnico

[001] A presente invenção se refere a um intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração, um inibidor da recorrência de tumor maligno e um indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração, compreendendo um veículo de entrega de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 de quimiocina (motivo C-C) (CCL19).

FUNDAMENTOS DA INVNEÇÃO

[002] Tumor maligno é uma doença que afeta muitas pessoas no mundo todo. No geral, quimioterapia, radioterapia ou terapia cirúrgica são amplamente praticadas, por conseguinte. Entretanto, têm havido vários problemas tais como a ocorrência de reações adversas, uma perda de algumas funções e irremediabilidade da reincidência ou metástase. Consequentemente, o desenvolvimento de terapia de célula imune tem estado em andamento nos anos recentes de modo a manter a qualidade de vida dos pacientes (QOL) alta. Esta terapia de célula imune é uma terapia que envolve coletar células imunes de um paciente, tratando as células imunes de modo a realçar a sua função imune, amplificando as células e transferindo as células novamente para o paciente. Especificamente, um método é conhecido que envolve coletar células T de um paciente, introduzindo um ácido nucléico codificando CAR nas células T, amplificando as células T e transferindo as células T mais uma vez para o paciente (ver documento não patentário 1). Esta terapia está atualmente sob teste clínico no mundo todo e tem produzido resultados que indicam eficácia para tumor maligno hematopoiético tal como leucemia ou linfoma.

[003] Pelo menos diversas centenas de tipos de fatores tais como citocinas, quimiocinas e proteínas reguladoras de sinal são conhecidos como fatores de controle da função imune para células imunes tais como células T. Entre eles, a interleucina-7 (IL-7) é uma citocina essencial para a sobrevivência de células T e é conhecida ser produzida pelas células não hematopoiéticas tais como as células estrômicas da medula óssea, a glândula do timo e órgãos ou tecidos linfoides. As células T expressando um receptor de citocina quimérico de IL-7 e IL-7R alfa fundidos um com o outro (ver documento patentário 1) são descritas como células T explorando a função desta IL-7. Entretanto, o receptor de citocina quimérico nestas células T é expresso como uma proteína de fusão em uma maneira limitada à superfície de membrana das células T abrigando o receptor de citocina quimérico e meramente transduz sinais de citocina de IL-7R ou similares para as próprias células em uma maneira independente de ligante. Assim, o receptor de citocina quimérico tem falhado em realçar a função de células T que não abrigam o receptor.

[004] Outras divulgações estabelecem que a expressão diminuída de CCL19, CCL21 ou IL-7 é responsável pela manutenção defeituosa de uma zona de célula T nos baços de camundongos mutantes SIRP alfa (ver documento não patentário 2) e que CCL19, CCL21 ou IL-7 trabalham para manter a homeostase de células T em tecidos linfoides secundários (baço ou linfonodo) (ver documento não patentário 3). Entretanto, estes documentos não patentários 2 e 3 mostram a ação sobre células T não ativadas que constantemente residem nas zonas de células T de tecidos linfoides secundários e não mostram relação direta com resposta imune antitumoral. Além disso, as células expressando CCL19, CCL21 ou IL-7 nos documentos não patentários 2 e 3 são células do sistema reticulo endotelial, não células T, residindo nos tecidos linfoides secundários.

[005] Entrementes, os presentes inventores propuseram a terapia de célula imune de suprimir acentuadamente câncer sólido pela coexpressão de IL-7 e CCL19 (ver documentos patentários 2 e 3). Este método pode realçar a ativação de células imunes endógenas ou a sua capacidade para acumular nas células de tumor em um hospedeiro (receptor). Entretanto, é incerto se a terapia de célula imune pode prevenir a reincidência, etc. em um período longo de tempo e continuar a rejeitar tumor maligno. Documentos da Técnica Anterior Documentos patentários

[006] Documento patentário 1: Publicação Internacional No. WO 2013/12306] Documento patentário 2: Publicação Internacional No. WO 2016/056228 Documento patentário 3: Publicação Internacional No. WO 2017/159736 Documento não patentários

[007] Documento não patentário 1: Yozo Nakazawa, The Shinshu Medical Journal, 61 (4): 197-203 (2013) Documento não patentário 2: SATO-HASHIMOTO M. et al., J. Immunol., 2011, vol. 187, no. 1, 291-7 Documento não patentário 3: SIEGERT S. et al., Front. Immunol., 2012, vol. 3, artigo 285 Sumário da Invenção Objetivo a ser Resolvido pela Invenção

[008] Como mencionado acima, a terapia de célula imune usando células T expressando CAR, células T expressando TCR ou similares, coexpressando IL-7 e CCLI9 foi desenvolvida e o desenvolvimento de técnicas de melhorar acentuadamente a capacidade das células imunes para proliferar, a capacidade para sobreviver ou a capacidade das células imunes do hospedeiro para acumular e serem adaptáveis ao câncer sólido sobre o qual a terapia convencional de célula imune foi verificada não ter efeito terapêutico suficiente, estão em andamento. Entretanto, tumor maligno frequentemente volta. Não está claro se a terapia de célula imune continua ou não a rejeitar tumor maligno durante um longo período de tempo mesmo se o tumor maligno possa ser temporariamente tratado. Além disso, medidas preventivas contra a reincidência não foram debatidas. Consequentemente, um objetivo da presente invenção é prover um intensificador para células T ou células B endógenas tendo uma função de memória, um inibidor da recorrência de tumor maligno e um indutor para induzir uma função de memória nas células T ou células B endógenas de modo a continuar a rejeitar tumor maligno durante um longo período de tempo. Meios para Resolver o Objetivo

[009] Os presentes inventores estudaram as possibilidades adicionais das células T anteriormente desenvolvidas expressarem CAR, IL-7 e CCL19 e consequentemente verificaram que: a administração das células T a um sujeito induz uma função de memória não apenas nas células T administradas mas nas células T endógenas no sujeito (hospedeiro) e aumenta o número absoluto de células tendo uma função de memória; e em um experimento de modelo de reincidência de tumor maligno, esta administração suprime a formação de tumor maligno em células não tendo nenhum antígeno que seja reconhecido por CAR. Os presentes inventores verificaram adicionalmente que o uso de TCR ao invés de CAR ou o uso de um vírus ao invés de células T também produz efeitos similares. Com base nestas verificações, a presente invenção foi completada.

[0010] Especificamente, a presente invenção é como segue.

[0011] (1) Um intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração, compreendendo um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19).

[0012] (2) O intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com (1), em que o veículo de liberação de ácido nucléico é pelo menos um membro selecionado de uma célula imune, um vírus, um anaeróbio, um lipossoma, uma célula tronco mesenquimatosa (MSC) e uma nanopartícula.

[0013] (3) O intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com (1) ou (2), em que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma capacidade para acumular nas células de tumor maligno ou uma capacidade para proliferar especificamente nas células de tumor maligno.

[0014] (4) O intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma citotoxicidade contra células de tumor maligno.

[0015] (5) O intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune e a célula imune tem uma molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno.

[0016] (6) O intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com (5), em que a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T(TCR).

[0017] (7) O intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com (5) ou (6), em que a célula imune é uma célula T.

[0018] (8) O intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com qualquer um de (1) a (7), em que as células T ou células B tendo uma função de memória são células T de memória central.

[0019] (9) Uma composição farmacêutica compreendendo um intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com qualquer um de (1) a (8) e um aditivo farmaceuticamente aceitável.

[0020] (10) Um inibidor da recorrência de tumor maligno compreendendo um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19).

[0021] (11) O inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com (10), em que o veículo de liberação de ácido nucléico é pelo menos um membro selecionado de uma célula imune, um vírus, um anaeróbio, um lipossoma, uma célula tronco mesenquimatosa (MSC) e uma nanopartícula.

[0022] (12) O inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com (10) ou (11), em que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma capacidade para acumular nas células de tumor maligno ou uma capacidade para proliferar especificamente nas células de tumor maligno.

[0023] (13) O inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com qualquer um de (10) a (12), em que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma citotoxicidade contra células de tumor maligno.

[0024] (14) O inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com qualquer um de (10) a (13), em que o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune e a célula imune tem uma molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno.

[0025] (15) O inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com (14), em que o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune tendo uma molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de célula de tumor maligno e a reincidência de tumor maligno é um reincidência de tumor maligno atribuível a uma célula de tumor maligno não tendo nenhum antígeno de tumor maligno que é especificamente reconhecido pela molécula de superfície celular.

[0026] (16) O inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com (14) ou (15), em que a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de célula de tumor maligno é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T (TCR).

[0027] (17) O inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com qualquer um de (14) a (16), em que a célula imune é uma célula T.

[0028] (18) O inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com (11), em que o veículo de liberação de ácido nucléico é um vírus oncolítico.

[0029] (19) Uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com qualquer um de (10) a (18) e um aditivo farmaceuticamente aceitável.

[0030] (20) Um indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração, compreendendo um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19).

[0031] Outros aspectos da presente invenção são como segue.

[0032] 1) Uso de um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19) para a preparação de um intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração.

[0033] 2) Um método para realçar células T ou células B tendo uma função de memória, compreendendo administrar um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19) a um sujeito.

[0034] 3) Uso de um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19) para a preparação de um inibidor da recorrência de tumor maligno.

[0035] 4) Um método para inibir a reincidência de tumor maligno, compreendendo administrar um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19) a um sujeito.

[0036] 5) Uso de um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19) para a preparação de um indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração.

[0037] 6) Um método para induzir uma função de memória em células T ou células B, compreendendo administrar um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando o ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19) a um sujeito.

[0038] 7) O indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração de acordo com (20), em que o veículo de liberação de ácido nucléico é pelo menos um membro selecionado de uma célula imune, um vírus, um anaeróbio, um lipossoma, uma célula tronco mesenquimatosa (MSC) e uma nanopartícula.

[0039] 8) O indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração de acordo com (20) ou 7), em que o veículo de liberação de ácido nucléico tem a capacidade para acumular nas células de tumor maligno ou a capacidade para proliferar especificamente nas células de tumor maligno.

[0040] 9) O indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração de acordo com (20), 7) ou 8), em que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma citotoxicidade contra células de tumor maligno.

[0041] 10) O indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração de acordo com qualquer um de (20) e 7) a 9), em que o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune e a célula imune tem uma molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno.

[0042] 11) O indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração de acordo com 10), em que a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T (TCR).

[0043] 12) O indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração de acordo com 10) ou 11), em que a célula imune é uma célula T. Efeito da Invenção

[0044] O uso do intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória de acordo com a presente invenção permite o realce em células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração. Além disso, o uso do inibidor da recorrência de tumor maligno da presente invenção permite a inibição da reincidência de tumor maligno depois do tratamento. O uso do indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B de acordo com a presente invenção permite a indução de uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração.

Breve Descrição dos Desenhos

[0045] [Figura 1] A Figura 1(a) é um diagrama mostrando resultados cerca do Exemplo 1 no qual a localização das células T nos tecidos de tumor maligno foi observada sob um microscópio pelo tingimento com um anticorpo rotulado. A Figura 1(b) é um gráfico mostrando as áreas (nm?) de células T de doador administradas e células T endógenas de um receptor pelo processamento de análise de imagem dos resultados observados na Figura 1(a).

[0046] [Figura 2] A Figura 2 é um gráfico de volumes de tumor maligno (mm?) examinados no dia 14 depois da administração quando células T expressando CAR-IL-7/CCLI9 anti-CD20 humana (7 x 19) ou um anticorpo anti-CD90.2 (anti-CD90.2) junto com as células T foram administrados aos camundongos no Exemplo 2.

[0047] [Figura 3] A Figura 3 é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 3 no qual células T do doador administradas e células T endógenas de um receptor foram examinadas quanto aos seu potencial de memória.

[0048] [Figura 4] A Figura 4 é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 3 no qual células T do doador administradas e células T endógenas de um receptor foram examinadas quanto à sua função de potencial de memória pela produção de IFN-y. À Figura 4(a) mostra a razão de células positivas em IFN-y para células T do doador positivas em CD90.1. a Figura 4(b) mostra resultados da detecção de células positivas em IFN-y nas células T positivas em CD90.2 e positivas em CD8 endógenas pela citometria de fluxo.

[0049] [Figura SA] A Figura SA é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 4 no qual a mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) antes do tratamento com células T expressando CAR-IL-7/CCL19 (cadeia a: antes do tratamento, positivas em CAR) foi examinada.

[0050] [Figura SB] A Figura SB é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 4 no qual mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) antes do tratamento com células T expressando CAR-IL-7/CCL19 (cadeia a: antes do tratamento, negativo em CAR) foi examinada.

[0051] [Figura 5C] A Figura 5C é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 4 no qual mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) depois do tratamento com células T expressando CAR-IL-7/CCL19 (cadeia a: depois do tratamento, positivo em CAR) foi examinada.

[0052] [Figura 5D] A Figura 5D é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 4 no qual mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) depois do tratamento com células T expressando CAR-IL-7/CCL19 (cadeia a: depois do tratamento, negativa em CAR) foi examinada.

[0053] [Figura 6A] A Figura 6A é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 4 no qual mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) antes do tratamento com células T expressando CAR-IL-7/CCL19 (cadeia B: antes do tratamento, positivo em CAR) foi examinada.

[0054] [Figura 6B] A Figura 6B é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 4 no qual mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) antes do tratamento com células T expressando CAR-IL-7/CCL19 (cadeia B: antes do tratamento, negativa em CAR) foi examinada.

[0055] [Figura 6C] A Figura 6C é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 4 no qual mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) depois do tratamento com células T expressando CAR-IL-7/CCL19 (cadeia B: depois do tratamento, positivo em CAR) foi examinada.

[0056] [Figura 6D] A Figura 6D é um gráfico mostrando resultados acerca do Exemplo 4 no qual mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) depois do tratamento com células T expressando CAR-IL-7/CCL19 (cadeia B: depois do tratamento, negativa em CAR) foi examinada.

[0057] [Figura 7A] A Figura 7A é um diagrama mostrando resultados da medição de volumes de tumor no Exemplo 5 no qual P815-hCD20 ou a linhagem precursora P815 não expressando nenhuma hCD20 foi inoculada a cada uma das regiões laterais direita e esquerda dos abdomens de camundongos rejeitados pelo tumor ou camundongos não expostos de controle no dia 140 depois da inoculação de P815-hCD20.

[0058] [Figura 7B] A Figura 7B é um diagrama mostrando resultados da medição dos volumes de tumor no Exemplo 5 no qual 3LL-hCD20 ou a linhagem precursora 3LL não expressando nenhuma hCD20 foi inoculada a cada uma das regiões laterais direita e esquerda dos abdomens de camundongos rejeitados pelo tumor ou camundongos não expostos de controle no dia 140 depois da inoculação de 3LL-hCD20.

[0059] [Figura 8] A Figura 8 é um diagrama mostrando um protocolo experimental para confirmar um efeito inibidor da reincidência de tumor no Exemplo 6.

[0060] [Figura 9A] A Figura 9A é um diagrama mostrando resultados acerca do Exemplo 6 no qual depois da administração de ACC-MESO1-GFP- Luc mencionado mais tarde, camundongos de 1, 3, 7, 10, 14, 21, 31 e 38 dias em um grupo administrado com células T expressando CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana (CAR-T 7 x 19) e um grupo administrado com células T expressando CAR anti-mesotelina humana convencionais (CAR-T convencional) no dia 1 foram fotografadas durante um tempo de exposição de segundos.

[0061] [Figura 9B] A Figura 9B é um diagrama mostrando resultados acerca do Exemplo 6 no qual depois da administração de ACC-MESO1-GFP- Luc mencionado mais tarde, camundongos de 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129 e 143 dias em um grupo administrado com células T expressando CAR-IL-7- CCLI19 anti-mesotelina humana (CAR-T 7 x 19) e um grupo administrado com células T expressando CAR anti-mesotelina humana convencionais (CAR-T convencional) no dia 1 foram fotografados durante um tempo de exposição de 30 segundos. O segundo indivíduo contado a partir da esquerda no dia 129 estava morto, de modo que a sua fotografia é omitida.

[0062] [Figura 10] A Figura 10 é um gráfico mostrando a relação entre o número de dias de administração de ACC-MESO1-GFP-Luc mencionado mais tarde e as taxas de sobrevivência de camundongos no Exemplo 6.

[0063] [Figura 11] A Figura 11 é um gráfico mostrando a relação entre o número de dias da administração de ACC-MESO1-GFP-Luc mencionado mais tarde e a quantidade total de fluorescência no Exemplo 6.

[0064] [Figura 12] A Figura 12(a) é um diagrama mostrando resultados acerca do Exemplo 7 no qual a razão de células CD8*GFP"* para as células do baço foi analisada pela citometria de fluxo. A Figura 12(b) é um diagrama mostrando resultados acerca do Exemplo 7 no qual o número absoluto de células CD8*GFP"* foi analisado pela citometria de fluxo.

[0065] [Figura 13] A Figura 13(a) é um diagrama mostrando o número de células CD44* nas células de baço CD8* de camundongos BDA/2 não expostos e células do baço CD8*GFP' ou CD8*GFP* de camundongos tratados com células T expressando TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de PIA no Exemplo 7. A Figura 13(b) é um diagrama mostrando a razão das células CD44* na Figura 13(a).

[0066] [Figura 14] A Figura 14 é um diagrama mostrando resultados acerca do Exemplo 7 no qual depois da cocultura durante aproximadamente 5 dias com células mastoides mucósicas (MMC) tratadas com P815, a concentração de IFN-y em um sobrenadante do meio de cultura foi detectada pelo ELISA (ensaio imunossorvente ligado à enzima).

[0067] [Figura 15] A Figura 15(a) é um diagrama mostrando a estrutura do vírus da vaccinia geneticamente recombinante LC16mO TK-SP- IL-7 de camundongo-F2A-CCLI19 de camundongo-F2A-eGFP (TK-ICE) no Exemplo 8. A Figura 15(b) é um diagrama mostrando a estrutura do vírus da vaccinia geneticamente recombinante LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP (TK- LE) no Exemplo 8.

[0068] [Figura 16] A Figura 16 é um diagrama mostrando imagens de observação da relação entre o efeito citopático do vírus da vaccinia geneticamente recombinante TK-ICE ou TK-LE em células A549 e células CT26 infectadas com o vírus da vaccinia e emissão de fluorescência eGFP no Exemplo 8.

[0069] [Figura 17] A Figura 17 é um diagrama mostrando resultados de examinar as quantidades de IL-7 e CCL19 secretadas em células AS49 ou células CT26 infectadas com vírus da vaccinia geneticamente recombinante TK-ICE ou TK-LE no Exemplo 8.

[0070] [Figura 18] A Figura 18 é um diagrama conceitualmente mostrando o transplante subcutâneo de células de câncer do intestino grosso de camundongo CT26 nas partes abdominais direita e esquerda de um camundongo no Exemplo 8.

[0071] [Figura 19] A Figura 19 é um diagrama mostrando mudança transicional no tamanho do tumor (mm?) depois da administração intratumoral do vírus da vaccinia geneticamente recombinante TK-ICE ou TK-LE aos modelos de camundongo BALB/c bilateralmente subcutaneamente transplantados com tumor obtido usando célula de câncer do intestino grosso de camundongo CT26 no Exemplo 9. Modo de Realizar a Invenção

[0072] No presente relatório descritivo, o “intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória” não é particularmente limitado contanto que o intensificador compreenda um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando IL-7 e um ácido nucléico codificando CCLI19. Este intensificador permite o realce em células T ou células B tendo uma função de memória. No presente relatório descritivo, o “indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B” não é particularmente limitado contanto que o indutor compreenda um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando IL-7 e um ácido nucléico codificando CCL19. Este indutor permite a indução de uma função de memória em células T ou células B. Daqui em diante, no presente relatório descritivo, o “intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória” e o “indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B” também são coletivamente aludidos como o “presente intensificador ou indutor”.

[0073] No presente relatório descritivo, o “inibidor da recorrência de tumor maligno” não é particularmente limitado contanto que o inibidor da recorrência de tumor maligno compreenda um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando IL-7 e um ácido nucléico codificando CCL19. Este inibidor da recorrência de tumor maligno permite a inibição da reincidência de tumor maligno. Daqui em diante, no presente relatório descritivo, o “inibidor da recorrência de tumor maligno” também é aludido como o “presente inibidor da recorrência de tumor maligno”.

[0074] Os exemplos preferidos do ácido nucléico codificando IL-7 e do ácido nucléico codificando CCLI19 podem incluir um ácido nucléico derivado de ser humano. Cada um destes ácidos nucléicos pode ser apropriadamente selecionado de acordo com o tipo de células para introdução. A informação de sequência sobre cada um dos ácidos nucléicos pode ser apropriadamente obtida de um documento conhecido na técnica ou uma base de dados tal como NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). Os exemplos do ácido nucléico codificando IL-7 podem incluir a sequência de nucleotídeo de um ácido nucléico codificando a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1. A sequência de nucleotídeo de um ácido nucléico codificando uma sequência de aminoácido tendo 80% ou mais alta, preferivelmente 85% ou mais alta, mais preferivelmente 90% ou mais alta, de modo adicionalmente preferível 95% ou mais alta, o mais preferivelmente 98% ou mais alta de identidade de sequência com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1 pode ser usada contanto que a IL-7 resultante tenha a ação de aumentar uma taxa de proliferação celular ou uma taxa de sobrevivência celular. Os exemplos do ácido nucléico codificando CCL19 podem incluir a sequência de nucleotídeo de um ácido nucléico codificando a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2. A sequência de nucleotídeo de um ácido nucléico codificando uma sequência de aminoácido tendo 80% ou mais alta, preferivelmente 85% ou mais alta, mais preferivelmente 90% ou mais alta, de modo adicionalmente preferível 95% ou mais alta, o mais preferivelmente 98% ou mais alta de identidade de sequência com a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2 pode ser usada contanto que o CCL 19 resultante tenha a ação de migrar células. A ação de aumentar uma taxa de proliferação celular ou uma taxa de sobrevivência celular pela IL-T ea ação de migrar células pelo CCL1I9 pode ser confirmada pelos métodos descritos no documento patentário 2.

[0075] No presente relatório descritivo, o termo “identidade” significa o grau de similaridade de sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo (que é determinado pela equiparação de uma sequência de consulta com uma outra sequência, preferivelmente, do mesmo tipo (sequência de ácido nucléico ou proteína)). Os exemplos preferidos do método de programa de computador para calcular e determinar a “identidade” podem incluir GCG BLAST (ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3389- 3402; e Devereux et al., Nucleic Acid Res. 1984, 12: 387), BLASTN 2.0 (Gish W., http://blast.Wustl.edu, 1996-2002), FASTA (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 2444-2448) e GCG GelMerge que envolve determinar e alinhar um par de contíguos com a sobreposição mais longa (Wibur e Lipman, SIAM J. Appl. Math. 1984, 44: 557-567; e Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453).

[0076] O ácido nucléico codificando IL-7 e/ou o ácido nucléico codificando CCL19 podem ser incorporados em um vetor contendo uma sequência de controle tal como um promotor ou um terminador e uma sequência marcadora seletiva tal como um gene de resistência a fármaco ou um gene repórter. O vetor pode conter adicionalmente um ácido nucléico codificando gene suicida ou um ácido nucléico codificando peptídeo 2A ou IRES. O vetor, o ácido nucléico codificando gene suicida e o ácido nucléico codificando peptídeo 2A ou IRES podem ser obtidos ou preparados com referência aos documentos patentários 2 e 3. Os exemplos do promotor podem incluir o promotor do gene IE (precoces de expressão imediata) de citomegalovírus (CMV), promotor precoce de SV40, promotor de retrovírus, promotor de metalotioneína, promotor de choque térmico, promotor SRa, promotor NFAT e promotor HIF. Os exemplos do vetor podem incluir um vetor retroviral tal como o vetor PpMSGV (Tamada Kk er al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) e vetor pMSCV (fabricado pela Takara Bio Inc.) e um vetor derivado de qualquer um destes vetores.

[0077] Um ácido nucléico codificando um fator de controle de função imune adicional tal como IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL- 18, IP-10, CCLA, FIGL, interferon-y, MIP-la, GM-CSF, M-CSF, TGF-R, TNF-o, um anticorpo inibidor do ponto de checagem ou um fragmento do mesmo podem estar contidos juntos com o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19. Entretanto, o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno, mesmo livre do ácido nucléico codificando o fator de controle de função imune adicional, pode suficientemente exercer um efeito como o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno contanto que o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno contenha pelo menos o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 como ácidos nucléicos codificando fatores de controle de função imune.

[0078] A “função de memória” significa uma função de células T ou células B ativando mais rapidamente e fortemente que previamente experienciaram estimulação com um antígeno de tumor e entram em contato com células de tumor maligno mais uma vez, quando comparadas com células T não expostas ou células B não expostas sem estimulação prévia com o antígeno de tumor e permitindo deste modo que as células T ou as células B exerçam alta função imune contra as células de tumor maligno. Os exemplos das células T ou células B tendo uma função de memória podem incluir células T de memória e células B de memória centrais. Estas células T ou células B tendo uma função de memória podem ser confirmadas avaliando-se compreensivamente positividade/negatividade (+/-) para ou intensidade de expressão de cada um de CD44, CD62L e CD127 (IL-7R). A molécula de CD a ser medida pode ser apropriadamente selecionada de acordo com um sujeito tal como um ser humano ou um camundongo. Daqui em diante, no presente pedido, a positividade e a negatividade também são descritas como “+” e “-”, respectivamente.

[0079] O “realce em células T ou células B tendo uma função de memória” significa aumento na razão das células T ou células B tendo uma função de memória, aumento no número absoluto das células T ou células B tendo uma função de memória ou realce na função de memória por célula das células T ou células B tendo uma função de memória, em uma população de célula incluindo as células T ou células B tendo uma função de memória.

[0080] A “indução de uma função de memória em células T ou células B” significa indução de células T não expostas ou células B não expostas de modo a ter uma função de memória pela aquisição de memória imune em resposta à estimulação com um antígeno de tumor, indução de células T ou células B já tendo uma função de memória de modo a ter uma função de memória mais alta e aumento no número de células T ou células B já tendo uma função de memória in vivo, em uma população de célula incluindo as células T não expostas ou as células B não expostas. Os exemplos específicos da mesma podem incluir a indução de células T não expostas nas células T de memória central.

[0081] Os exemplos preferidos do sujeito de administração podem incluir um mamífero e células mamíferas. Entre os mamíferos, os exemplos mais preferidos dos mesmos podem incluir um ser humano, um camundongo, um cão, um rato, um porquinho da Índia, um coelho, um pássaro, uma ovelha, um porco, um gado, um cavalo, um gato, um macaco e um chimpanzé, de modo particularmente preferível um ser humano.

[0082] O “veículo de liberação de ácido nucléico” pode ser pelo menos um membro selecionado de uma célula imune, um vírus, um anaeróbio, um lipossoma, uma célula tronco mesenquimatosa (MSC) e uma nanopartícula, duas ou mais dos quais podem ser misturados e usados.

[0083] Neste contexto, a célula imune não é particularmente limitada contanto que a célula esteja envolvida em resposta imune e possa expressar IL-7 e CCLI19 pela introdução do ácido nucléico codificando IL-7 e do ácido nucléico codificando CCL19. Uma célula imune separada (coletada) de um corpo vivo é preferida. Os exemplos da mesma podem incluir uma forma separada de uma célula da linhagem linfoide tal como uma célula T, uma célula exterminadora natural (célula NK) e uma célula B, uma célula apresentando antígeno tal como um monócito, um macrófago e uma célula dendrítica ou um granulócito tal como um neutrófilo, um eosinófilo, um basófilo e um mastoide e pode preferivelmente incluir uma célula T separada de um mamífero tal como um ser humano, um cão, um gato, um porco ou um camundongo, preferivelmente uma célula T separada de um ser humano. As células T separadas podem adicionalmente incluir células outras que não células T e podem incluir as células T em uma proporção de 50% ou mais, preferivelmente 60% ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais, de modo adicionalmente preferível 80% ou mais, o mais preferivelmente 90% ou mais. As células T podem ser obtidas pela separação de uma população de célula incluindo a célula imune de um fluido corporal tal como sangue ou fluido da medula óssea, um tecido tal como um tecido do baço, um tecido tímico ou um linfonodo ou células imunes infiltrando um tecido canceroso tal como tumor primário, tumor metastático ou ascite canceroso. De modo a elevar a razão de células T incluídas na população de célula, a população de célula assim separada pode ser submetida adicionalmente à isolação ou purificação, se necessário, por um método padrão para se obter as células T. Alternativamente, as células T preparadas a partir das células ES ou células iPS podem ser utilizadas. Os exemplos de uma tal célula T pode incluir uma célula T alfa-beta, uma célula T gama-delta, uma célula T CD8*, uma célula T CD4*, uma célula T infiltrante de tumor, uma célula T de memória, uma célula T não exposta e uma célula T NK. A origem da célula imune e o sujeito de administração pode ser a mesma ou diferente e é preferivelmente a mesma. Quando o sujeito de administração é um ser humano, uma célula autóloga coletada de um paciente como o sujeito de administração ou uma célula alogênica coletada de uma outra pessoa pode ser usadas como a célula imune. Especificamente, o doador e o receptor podem ser os mesmos ou diferentes e são preferivelmente os mesmos.

[0084] O vírus não é particularmente limitado contanto que o vírus pode incluir o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL!19 e é capaz de infectar células de tumor maligno. Um vírus oncolítico é preferido. O vírus oncolítico significa um vírus que raramente prolifera na infecção em células normais, mas prolifera na infecção nas células de tumor maligno e tem a capacidade para matar as células de tumor maligno (citotoxicidade contra células de tumor maligno). O vírus oncolítico é revisado, por exemplo, em Molecular Therapy, Vol. 18, No. 2, fevereiro de 2010, p. 233-234. Este vírus oncolítico não é particularmente limitado contanto que o vírus oncolítico tenha a capacidade para matar as células de tumor maligno pela infecção das células de tumor maligno. Os exemplos do mesmo podem incluir vírus oncolítico da vaccinia, adenovírus oncolítico, vírus oncolítico simples do herpes, reovírus oncolítico, vírus oncolítico do sarampo, vírus oncolítico da doença de Newcastle, vírus oncolítico da varíola bovina, vírus oncolítico da cachumba e vírus oncolítico coxsackie. Os exemplos do vírus oncolítico da vaccinia que podem ser usados incluem, mas não são limitados a um vírus descrito em Kim MK et al., Science Translational Medicine. 15 de maio de 2013; 5 (185): 185ra63, Heo 1], et al., Nature Medicine, 2013 (3): 329-36. doi: 10,1038/nm.3089. Epub 10 de fevereiro de 2013. e Publicação Internacional No. WO 2012/094386. Os exemplos do adenovírus oncolítico que podem ser usados incluem, mas não são limitados a um vírus descrito em Tedcastle A et al., Mol Ther. 2016; 24: 796-804, Marino N, Illingworth S, Kodialbail P, Patel A, Calderon H, Lear R, Fisher KD, Champion BR, Brown ACN. PLoS One 2017; 12 (5): e0177810, Freedman JD, et al., EMBO Mol Med 9: 1067-1087 (2017), Lang FF et al., Journal of Clinical Oncology (2018), James M. et al., The Journal of Oncology, 188 (6): 2391-7, 2012 e Patentes Japonesas Nos. 3867968 e

5574284. Os exemplos do vírus oncolítico simples do herpes que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, um vírus descrito em Mazzacurati et al., Mol Ther, janeiro de 2015; 23 (1): 99-107, Hirooka Y, er al., BMC Cancer 2018, 18, 596, Nakatake R, et al., Cancer Sci. março de 2018, 109 (3); 600-610 e Andtbacka RHI, et al., J Clin Oncol. 2015; 33: 2780-2788. Os exemplos do reovírus oncolítico que podem ser usados incluem, mas não são limitados a um vírus descrito em Mahalingam, et al., Cancers 2018, 10, 160. Os exemplos do vírus oncolítico da doença de Newcastle que podem ser usados incluem, mas não são limitados a um vírus descrito em Journal of Virology. junho de 2016; 90 (11): 5343-5352. Os exemplos do vírus oncolítico da estomatite vesicular que podem ser usados incluem, mas não são limitados a um vírus descrito em Muik A. et al., Cancer Res; 74 (13); 3567-

78. Alguns vírus oncolítico têm uma função de expressão de proteína adicionada pela modificação genética e podem ser deixados expressar IL-7 e CCL19 descritos acima ao invés de ou além de uma tal proteína.

[0085] O anaeróbio não é particularmente limitado contanto que o anaeróbio possa expressar IL-7 e CCL19 pela introdução do ácido nucléico codificando IL-7 e do ácido nucléico codificando CCL19 dentro da sua célula. Uma bactéria anaeróbica gram positiva tendo a capacidade para acumular nas células de tumor maligno é preferida. Os exemplos do mesmo podem incluir uma bactéria do gênero Bifidobacterium tal como bifidus, uma bactéria do gênero Lactobacillus e uma bactéria do gênero Listeria. O anaeróbio é conhecido por acumular facilmente nas células de tumor maligno porque o anaeróbio cresce facilmente em um ambiente contendo menos oxigênio.

[0086] O lipossoma não é particularmente limitado contanto que o lipossoma possa liberar o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCLI19 para as células de tumor e é uma nanocápsula lipídica constituída por uma bicamada fosfolipídica. O lipossoma pode ser obtido pelo uso de um produto comercialmente disponível ou pela síntese de acordo com um método de rotina.

[0087] A MSC não é particularmente limitada contanto que a MSC possa expressar IL-7 e CCL19 pela introdução do ácido nucléico codificando IL-7 e do ácido nucléico codificando CCL19 dentro da célula e tem a capacidade para acumular nas células de tumor maligno.

[0088] A nanopartícula não é particularmente limitada contanto que a nanopartícula tenha a capacidade para ser capaz de liberar o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 para as células de tumor e está em uma forma de partícula da ordem nanométrica, preferivelmente de 5 a 800 nm no diâmetro. Os exemplos da mesma podem incluir uma nanopartícula metálica tal como uma nanopartícula de ouro e uma nanopartícula de sílica. A nanopartícula pode ser obtida pelo uso de um produto comercialmente disponível ou pela síntese de acordo com um método de rotina.

[0089] A frase “o veículo de liberação de ácido nucléico tem a capacidade para acumular nas células de tumor maligno” significa que o veículo de liberação de ácido nucléico tem a capacidade para acumular especificamente nas células de tumor maligno. Os exemplos específicos de tal capacidade podem incluir a) a capacidade do veículo de liberação de ácido nucléico para acumular nas células de tumor maligno pela ação de uma substância que reconheça uma molécula de superfície celular das células de tumor maligno, a substância sendo carreada pelo veículo de liberação de ácido nucléico e b) a capacidade do veículo de liberação de ácido nucléico para acumular nas células de tumor maligno por um efeito de EPR (permeabilidade e retenção realçadas) que explora uma abertura de diversas centenas de nm que é aberta na parede vascular de um tecido tumoral e é mais ampla em um único dígito ou mais do que aquela do vaso vascular de um tecido normal. Os exemplos da substância que reconhece uma molécula de superfície celular de células de tumor maligno, carreadas pelo veículo de liberação de ácido nucléico podem incluir um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um receptor de célula T (TCR). Um receptor descrito nos documentos patentários 2 e 3 pode ser usado como o CAR ou o TCR. Assim, exemplos do veículo de liberação de ácido nucléico tendo a capacidade para acumular nas células de tumor maligno podem incluir uma célula imune expressando CAR e uma célula imune expressando TCR. O receptor de antígeno quimérico (CAR) é uma proteína quimérica artificial em que Fv de cadeia única (scFv) que reconhece um antígeno de superfície celular de células cancerosas é fundida com uma região de transdução de sinal que induz a ativação de células T.

[0090] A “capacidade para proliferar especificamente nas células de tumor maligno” significa a capacidade para raramente proliferar em células normais infectadas, mas proliferam em células infectadas de tumor maligno. Os exemplos da mesma podem incluir a capacidade de um vírus oncolítico para proliferar especificamente nas células de tumor maligno. Assim, os exemplos do veículo de liberação de ácido nucléico tendo a capacidade para proliferar especificamente nas células de tumor maligno podem incluir um vírus oncolítico.

[0091] A “citotoxicidade contra células de tumor maligno” significa a capacidade para lisar ou matar células de tumor maligno danificando-se as células de tumor maligno. As células de tumor maligno são lisadas ou mortas de modo que um antígeno de tumor maligno nas células de tumor maligno seja liberado aos arredores das células lisadas ou mortas.

[0092] A “molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno” pode ser qualquer molécula de superfície celular que reconheça um antígeno de tumor maligno na superfície celular de tumor maligno. Os exemplos da mesma podem incluir um receptor de antígeno quimérico (CAR) e um receptor de célula T (TCR). Um receptor descrito nos documentos patentários 2 e 3 pode ser usado como o CAR ou o TCR. Assim, os exemplos da célula imune tendo a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno podem incluir uma célula imune expressando CAR e uma célula imune expressando TCR.

[0093] O antígeno de tumor maligno significa uma substância, tal como uma proteína ou um glicolipídeo, que é expressa mais altamente nas células de tumor maligno do que nas células normais ou especificamente expressa nas células de tumor maligno. Os exemplos de um tal antígeno de tumor maligno podem incluir um peptídeo de epítopo de um antígeno associado a tumor, um antígeno de câncer de testículo, um antígeno associado com a angiogênese ou um antígeno recém gerado em tumor maligno pela mutação genética (neoantígeno) e podem especificamente incluir uma proteína tal como WTI, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-AIl, MAGE-AS3,

MAGE-AA, Glipican-3, KIF20A, Survivina, AFP-1, go100, MUCI1, PAP-I1O, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFRI, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPHI, DEPDC1, FOXMI1, CDH3, TTK, TOMM34, URLCI10, KOCI, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, PIA, 5T4, B7-H6, BCMA, CD123, CD133, CD138, CD1I71, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CEA, cMet, CS1, EGFR, EGFRvIII, EphA2, ErbB2, FAP, FR-a, HER2, IL13Ra2, MUC1, MUC16, NKG2D, PSCA, PSMA, RORI1, TARP, DLL3, PRSS21, Claudin18.2, Claudin18, CAIX, LI-CAM, FAP-o, CTAGIB e FR-a e um glicolipídeo tal como GD2 e GM?2.

[0094] A frase “compreendendo um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando IL-7 e um ácido nucléico codificando CCL19” também inclui um aspecto no qual o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCLI19 estão contidos no veículo de liberação de ácido nucléico. Quando o veículo de liberação de ácido nucléico é, por exemplo, uma célula imune, o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 podem estar contidos na célula imune. A célula imune pode conter o ácido nucléico codificando IL- 7 eo ácido nucléico codificando CCL1I9 em um estado integrado dentro do genoma ou em um estado não integrado dentro do genoma (por exemplo, em um estado epissômico).

[0095] Quando o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune, o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno pode ser preparado pela introdução do ácido nucléico codificando IL-7 e do ácido nucléico codificando CCL19 na célula imune, isto é, introduzindo um ácido nucléico codificando IL-7 e ácido nucléico codificando CCL19 estranhos (preferivelmente um ácido nucléico codificando IL-7 e ácido nucléico codificanto CCLI9 estranhos operavelmente ligados à jusante de um promotor) na célula imune. O método de introdução pode ser qualquer método para introduzir DNA em uma célula imune. Os exemplos do mesmo podem incluir um método tal como um método de eletroporação (Citotechnology, 3, 133 (1990)), um método do fosfato de cálcio (Publicação de Pedido de Patente Não Examinada Japonesa No. 2-227075), um método de lipofecção (Proc. Natl. Acad. Sci. U.-S.A., 84, 7413 (1987)) e um método de infecção viral. Os exemplos do método de infecção viral podem incluir um método que envolva transfectar células de empacotamento tais como células GP2-293 (fabricadas pela Takara Bio Inc.), células Plat-GP (fabricadas pela Cosmo Bio Co., Ltd.), células PG13 (ATCC CRL-10686) ou células PA3I7 (ATCC CRL-9078) com um vetor compreendendo um ácido nucléico a ser introduzido e um plasmídeo de empacotamento para preparar um vírus recombinante e infectar as células T com o vírus recombinante (documento patentário 2).

[0096] Quando o veículo de liberação de ácido nucléico é um vírus, um “vírus que tem o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCLI1I9 e expressa IL-7 e CCLI9” pode ser preparado pela introdução do ácido nucléico codificando IL-7 e do ácido nucléico codificando CCLI9 no vírus, isto é, introduzindo um ácido nucléico codificando IL-7 e ácido nucléico codificando CCLI9 estranhos (preferivelmente um ácido nucléico codificando IL-7 e ácido nucléico codificando CCLI9 estranhos operavelmente ligados à jusante de um promotor) ao vírus. O vírus assim preparado pode ser usado como o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno.

[0097] Igualmente, quando o veículo de liberação de ácido nucléico é um anaeróbio, um lipossoma ou uma célula tronco mesenquimatosa (MSC), um “anaeróbio, lipossoma ou célula tronco mesenquimatosa (MSC) que tem o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 e expressa IL-7 e CCLI9” pode ser preparado pela introdução do ácido nucléico codificando IL-7 e do ácido nucléico codificando CCLI9 ao anaeróbio, ao lipossoma ou à célula tronco mesenquimatosa (MSC), isto é, introduzindo um ácido nucléico codificando IL-7 e ácido nucléico codificando CCLI9 estranhos (preferivelmente um ácido nucléico codificando IL-7 e ácido nucléico codificando CCLI9 estranhos operavelmente ligados à jusante de um promotor) ao anaeróbio, ao lipossoma ou à célula tronco mesenquimatosa (MSC). O anaeróbio, o lipossoma ou a célula tronco mesenquimatosa (MSC) assim preparados podem ser usados como o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno. Também, o “vírus que tem o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 e expressa IL-7 e CCL19”, o “anaeróbio que tem o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCLI19 e expressa IL-7 e CCL19”, o “lipossoma que tem o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 e expressa IL-7 e CCL19” ou a “célula tronco mesenquimatosa (MSC) que tem o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 e expressa IL-7 e CCLI9” podem ser usados como um inibidor da proliferação de tumor maligno.

[0098] Um outro método para introduzir ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 na célula imune pode ser um método que envolva integrar o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 dentro do genoma da célula imune pelo uso de uma técnica de edição de gene conhecido na técnica tal que estes ácidos nucléicos sejam expressáveis sob o controle de um promotor adequado. Os exemplos da técnica de edição de gene conhecidos na técnica podem incluir uma técnica usando uma endonuclease tal como nuclease de dedo de zinco, sistemas TALEN (nuclease efetoras semelhantes ao ativador de transcrição) ou CRISPR (repetição palindrômica curta regularmente interespaçada agrupada)-Cas.

[0099] No caso de preparar uma “célula imune que contenha o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCLI19 e tenha CAR como a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno, isto é, uma célula imune que contenha ácidos nucléicos codificando CAR, IL-7 e CCLI1I9 e expresse CAR, IL-7 e CCLI9” como o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno, esta célula imune pode ser preparada por qualquer um dos seguintes métodos:

(1) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de IL-7-CCL19 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 e um vetor de expressão de CAR contendo ácido nucléico codificando CAR, na célula imune;

(2) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de CAR-IL-7 contendo ácido nucléico codificando CAR e o ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de CAR-CCLI9 contendo ácido nucléico codificando CAR e o ácido nucléico codificando CCL19, na célula imune;

(3) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de CAR-IL-7 contendo ácido nucléico codificando CAR e o ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de IL-7-CCL19 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19, na célula imune;

(4) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de CAR-CCL19 contendo ácido nucléico codificando CAR e o ácido nucléico codificando CCLI19 e um vetor de expressão de IL-7-CCLI19 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCLI19, na célula imune;

(5) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de CAR-IL-7 contendo ácido nucléico codificando CAR e o ácido nucléico codificando IL-7 e um CCLI19 vetor de expressão contendo ácido nucléico codificando CCLI19, na célula imune; (6) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de CAR-CCL19 contendo ácido nucléico codificando CAR e o ácido nucléico codificando CCLI19 e um vetor de expressão de IL-7 contendo ácido nucléico codificando IL-7, na célula imune; e (7) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir três tipos de vetores, um vetor de expressão de CAR contendo ácido nucléico codificando CAR, um vetor de expressão de IL-7 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de CCL19 contendo ácido nucléico codificando CCL19, na célula imune.

[00100] Igualmente, no caso de preparar uma “célula imune que contenha o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 e tenha TCR como a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno, isto é, uma célula imune que contenha ácidos nucléicos codificando TCR, IL-7 e CCLI19 e expresse TCR, IL-7 e CCL1I9” como o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno, esta célula imune pode ser preparada por qualquer um dos seguintes métodos: (1) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de IL-7-CCL19 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 e um vetor de expressão de TCR contendo ácido nucléico codificando TCR, na célula imune; (2) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de TCR-IL-7 contendo ácido nucléico codificando TCR e o ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de TCR-CCL19 contendo ácido nucléico codificando TCR e o ácido nucléico codificando CCL19, na célula imune; (3) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de TCR-IL-7 contendo ácido nucléico codificando TCR e o ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de IL-7-CCL19 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19, na célula imune; (4) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de TCR-CCL19 contendo ácido nucléico codificando TCR e o ácido nucléico codificando CCLI19 e um vetor de expressão de IL-7-CCLI19 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCLI19, na célula imune; (5) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de TCR-IL-7 contendo ácido nucléico codificando TCR e o ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de CCL19 contendo ácido nucléico codificando CCLI19, na célula imune; (6) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de TCR-CCL19 contendo ácido nucléico codificando TCR e o ácido nucléico codificando CCLI19 e um vetor de expressão de IL-7 contendo ácido nucléico codificando IL-7, na célula imune; e (7) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir três tipos de vetores, um vetor de expressão de TCR contendo ácido nucléico codificando TCR, um vetor de expressão de IL-7 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de CCL19 contendo ácido nucléico codificando CCL19, na célula imune.

[00101] No caso de preparar a “célula imune expressando TCR, IL-7 e CCL19”, uma célula imune expressando TCR específica para o antígeno de tumor desejado é preparada de antemão e a célula imune expressando TCR, IL-7 e CCLI9 pode ser preparada por qualquer um dos seguintes métodos usando a célula imune expressando TCR: (1) um método de introduzir um vetor de expressão de IL-7- CCLI19 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 na célula imune expressando TCR; e (2) um método de simultaneamente ou sequencialmente introduzir dois tipos de vetores, um vetor de expressão de IL-7 contendo ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de CCL19 contendo ácido nucléico codificando CCL19, na célula imune expressando TCR.

[00102] Além disso, uma “célula imune expressando CAR, TCR, IL-7 e CCL19” pode ser preparada como o presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno. Os exemplos específicos do método para tal podem incluir um método de preparação de permitir adicionalmente que todo ou qualquer um dos vetores descritos no “caso de preparar uma célula imune expressando CAR, IL-7 e CCL19” contenha o ácido nucléico codificando TCR tal que TCR também seja expresso, um método de preparação de permitir adicionalmente que todo ou qualquer um dos vetores descritos no “caso de preparar uma célula imune expressando TCR, IL-7 e CCL1I9” contenha o ácido nucléico codificando CAR tal que CAR também seja expresso e um método de preparação de introduzir vetores descritos no “caso de preparar uma célula imune expressando CAR, IL-7 e CCL19” na “célula imune expressando TCR”.

[00103] Além disso, quando a célula imune no presente intensificador ou indutor ou no presente inibidor da recorrência de tumor maligno tem CAR, uma “célula imune expressando uma pluralidade de, preferivelmente dois tipos de CARs que reconhecem antígenos de tumor maligno diferentes” pode ser preparada. Os exemplos específicos do método para tal podem incluir um método de preparação de permitir que os vetores descritos no “caso de preparar uma célula imune expressando CAR, IL-7 e CCL19” contenham ácidos nucléicos codificando uma pluralidade de, preferivelmente dois tipos de CARs que reconhecem antígenos de tumor maligno diferentes tal que a pluralidade de, preferivelmente os dois tipos de CARs sejam expressos. Particularmente, por exemplo, um vetor de expressão de CAR-IL-7 reconhecendo antígeno de tumor maligno X contendo ácido nucléico codificando CAR que reconhece antígeno de tumor maligno X e o ácido nucléico codificando IL-7 e um vetor de expressão de CAR-CCLI19 reconhecendo antígeno de tumor maligno Y contendo ácido nucléico codificando CAR que reconhece antígeno de tumor maligno Y e o ácido nucléico codificando CCL19 são preparados e introduzidos na célula imune. A célula imune resultante pode ter especificidade de tumor mais alta porque IL-7 e CCLI9 são secretados nos arredores das células tendo antígenos de tumor maligno X e Y.

[00104] Quando o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune, um vírus, um anaeróbio ou uma célula tronco mesenquimatosa, um produto de cultura que é obtido cultivando-se a célula imune, o vírus, o anaeróbio ou a célula tronco mesenquimatosa e contém as células imunes podem ser usados.

[00105] A “reincidência de tumor maligno” para o inibidor da recorrência de tumor maligno significa a ocorrência de tumor maligno mais uma vez depois do tratamento do tumor maligno pela quimioterapia geral, radioterapia ou terapia cirúrgica, etc. A reincidência de tumor maligno é preferivelmente reincidência atribuível nas células de tumor maligno tendo resistência à capacidade do veículo de liberação de ácido nucléico para acumular nas células de tumor maligno ou a capacidade do veículo de liberação de ácido nucléico para proliferar especificamente nas células de tumor maligno.

[00106] Neste contexto, os exemplos da “reincidência atribuível nas células de tumor maligno tendo resistência à capacidade para acumular nas células de tumor maligno” podem incluir o caso em que o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune tendo uma molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno e a reincidência de tumor maligno é reincidência de tumor maligno atribuível nas células de tumor maligno não tendo nenhum antígeno de tumor maligno que seja especificamente reconhecido pela molécula de superfície celular ou tendo perdido o antígeno de tumor maligno que é especificamente reconhecido pela molécula de superfície celular. Os exemplos da “reincidência atribuível nas células de tumor maligno tendo resistência à capacidade do veículo de liberação de ácido nucléico para proliferar especificamente nas células de tumor maligno” podem incluir reincidência de tumor atribuível nas células de tumor maligno não tendo nenhum sensibilidade à infecção com um vírus oncolítico para tumor maligno ou tendo perdido a sensibilidade à infecção com um vírus oncolítico para tumor maligno. A “reincidência atribuível nas células de tumor maligno tendo resistência à capacidade para acumular nas células de tumor maligno” pode ser confirmada, por exemplo, examinando-se um antígeno de tumor maligno nas células de tumor maligno de um tecido que sofreu reincidência.

[00107] O inibidor da recorrência de tumor maligno pode ser usado para a administração a um sujeito tendo tumor maligno tratado pela imunoterapia. O inibidor da recorrência de tumor maligno pode ser usado para a administração a um sujeito tendo tumor maligno tratado pela imunoterapia, dia 100 ou mais tarde depois do tratamento pela imunoterapia para O propósito de inibir a reincidência durante um longo período.

[00108] O presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno podem conter um aditivo farmaceuticamente aceitável. O presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno podem conter adicionalmente uma instrução para o seu uso. O presente intensificador ou indutor ou o presente inibidor da recorrência de tumor maligno podem ser preparados em uma composição farmacêutica contendo um aditivo farmaceuticamente aceitável. Daqui em diante, a “composição farmacêutica contendo o presente intensificador e um aditivo farmaceuticamente aceitável”, a “composição farmacêutica contendo o presente indutor e um aditivo farmaceuticamente aceitável” e a “composição farmacêutica contendo o presente inibidor da recorrência de tumor maligno e um aditivo farmaceuticamente aceitável” também são coletivamente aludidas como a “presente composição farmacêutica”. Os exemplos do aditivo podem incluir solução salina, solução salina tamponada, um meio de cultura para a cultura de célula, dextrose, água injetável, glicerol, etanol e uma combinação do mesmo, um estabilizante, um solubilizante, um tensoativo, um tampão, um antisséptico, um agente de tonicidade, um enchedor e um lubrificante.

[00109] O presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica podem ser administrados a um sujeito em necessidade de tratamento de tumor maligno ou inibição da sua reincidência pelo uso de um método conhecido por aqueles versados na técnica. Os exemplos do método de administração podem incluir injeção intravenosa, intratumoral, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intramedular, intracardíaco, intra- articular, intrassinovial, intracraniano, intraespinhal e subaracnoidal (fluido espinhal).

[00110] Os exemplos do método para administrar o presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica podem incluir a administração independentemente realizada quatro vezes, três vezes, duas vezes ou uma vez ao dia, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, a cada 6 dias, uma vez por semana, a cada 8 dias, a cada 9 dias, a cada 10 dias, duas vezes por semana, uma vez ao mês ou duas vezes ao mês.

[00111] A dose do presente intensificador ou indutor, do presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou da presente composição farmacêutica pode ser apropriadamente determinada de acordo com a idade, sexo, saúde e peso corporal, etc. de um sujeito. Quando o veículo de liberação de ácido nucléico é, por exemplo, uma célula imune, os exemplos da mesma podem incluir 1 x 10º a 1 x 10º células, preferivelmente 1 x 10º a 1 x 10º células, mais preferivelmente 1 x 10º a 1 x 107 células, por kg de peso corporal a um adulto humano. Quando o veículo de liberação de ácido nucléico é um vírus oncolítico, os exemplos do mesmo podem incluir aproximadamente 10º a 10'"º unidades formadoras de placa (PFU), preferivelmente 10º a 10º unidades formadoras de placa (PFU), por dosagem a um adulto humano.

[00112] No presente relatório descritivo, o tumor maligno pode ser tumor maligno sólido ou tumor maligno hematológico. Os exemplos do mesmo podem incluir um câncer tal como glioma, melanoma, mesotelioma maligno, adenocarcinoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma adenoescamoso, câncer anaplástico, câncer de célula grande, câncer de célula pequena, câncer de pele, câncer da glândula tireóide, câncer de mama, câncer de próstata, câncer da bexiga urinária, câncer vaginal, câncer da cabeça e pescoço, câncer de pescoço, câncer uterino, câncer hepático, câncer renal, câncer pancreático, câncer esplênico, câncer pulmonar, câncer da traqueia, câncer brônquico, câncer do intestino grosso, câncer colônico, câncer do intestino delgado, câncer estomacal, câncer esofágico, câncer do trato biliar, câncer da vesícula biliar, câncer de testículo, câncer ovariano e tumor cerebral, um câncer de um tecido ósseo, um tecido cartilaginoso, um tecido adiposo, um tecido muscular, um tecido vascular ou um tecido hematopoiético assim como um sarcoma tal como condrossarcoma, sarcoma de Ewing, hemangioendotelioma maligno, schwannoma maligno, osteossarcoma e sarcoma de tecido mole, um blastoma tal como hepatoblastoma, meduloblastoma, nefroblastoma, neuroblastoma, pancreatoblastoma, blastoma pleuropulmonar e retinoblastoma, tumor da célula germinativa, linfoma, leucemia e mieloma.

[00113] O presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica podem ser usados em combinação com um agente antitumoral adicional. Também, um método usando o presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica pode ser combinado com um método de tratamento de câncer usando radiação. Os exemplos do agente antitumoral adicional podem incluir um fármaco alquilante tal como ciclofosfamida, bendamustina, ifosfamida e dacarbazina, um fármaco antimetabólico tal como pentostatina, fludarabina, cladribina, metotrexato, 5-fluorouracila, 6-mercaptopurina e enocitabina, um fármaco de alvejamento molecular tal como rituximab, cetuximab e trastuzumab, um inibidor da cinase tal como imatinib, gefitinib, erlotinib, afatinib, dasatinib, sunitinib e trametinib, um inibidor de proteassoma tal como bortezomib, um fármaco inibidor de calcineurina tal como ciclosporina e tacrolimus, um antibiótico anticâncer tal como idarrubicina e doxorrubicina-mitomicina C, um alcalóide vegetal tal como irinotecano e etoposídeo, um fármaco contendo platina tal como cisplatina, oxaliplatina e carboplatinay, um produto terapêutico hormonal tal como tamoxifeno e bicalutamida e um fármaco imunorregulador tal como interferon, nivolumab e pembrolizumab.

[00114] Os exemplos do método usando o presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica em combinação com o agente antitumoral adicional podem incluir um método usando o agente antitumoral adicional e depois usando o presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica, um método concorrentemente usando o presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica e o agente antitumoral adicional e um método usando o presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica e depois usando o agente antitumoral adicional. No caso de usar o presente intensificador ou indutor, o presente inibidor da recorrência de tumor maligno ou a presente composição farmacêutica e o agente antitumoral adicional em combinação, um efeito terapêutico sobre um câncer é adicionalmente melhorado enquanto as suas respectivas reações adversas podem ser reduzidas pela diminuição das suas respectivas frequências de administração ou doses.

[00115] Referências tais como documentos acadêmicos e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados por referência na sua totalidade no mesmo grau como se cada um fosse especificamente descrito. Exemplos

[00116] Daqui em diante, a presente invenção será mais especificamente descrita com referência aos Exemplos. Entretanto, o escopo técnico da presente invenção não é limitado por estes exemplos. (Preparação de células T anti-CD20 humana expressando CAR-IL-7/CCL19 e células T anti-CD20 humano expressando CAR)

[00117] As “células T expressando CAR anti-CD20 humana, IL-7 de camundongo e CCLI9 de camundongo (células T expressando CAR-IL- T7ICCL19 anti-CD20 humana; também aludidas como “7 x 19” nos seguintes Exemplos ou desenhos)” e as “células T expressando CAR anti-CD20 humana; também aludidas “Conv.” nos seguintes Exemplos ou desenhos)” usadas nos Exemplos mencionados mais tarde foram preparadas de acordo com os métodos descritos no documento patentário 3 e no artigo de Tamada et al. (Nature Biotechnology doi: 10.1038/nbt.4086). Daqui em diante, o método de preparação será brevemente descrito. As “células T expressando CAR anti-CD20 humana, IL-7 de camundongo e CCL19 de camundongo” são células T tendo CAR anti-CD20 humana como a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de célula de tumor maligno e compreende o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19.

[00118] Para as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana, primeiro, um vetor de expressão PMSGV de CAR-IL-7-CCLI19 anti- CD?20 humana contendo ácido nucléico codificando CAR anti-CD20 humana, o ácido nucléico codificando IL-7 de camundongo e o ácido nucléico codificando CCLI9 de camundongo foi preparado de antemão. Subsequentemente, o vetor foi introduzido usando retrovírus para células T de camundongo separadas dos baços e linfonodos de camundongos congênitos positivos em CD90.1 (CD90.1*) e negativos em CD90.2 (CD90,2) (fabricados pela The Jackson Laboratory) usando o Kit de Isolação de Célula Pan T II (fabricado pela Miltenyi Biotec) para preparar as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana. Entrementes, as células T expressando CAR anti-CD20 humana (células T expressando CAR anti-CD20 humana) foram preparadas preparando-se um vetor de expressão pMSGV de anti-CD20 humana de antemão e introduzindo o vetor nas células T de camundongo separadas usando retrovírus. As células T de camundongo separadas sem introdução do gene (células T não transduzidas) também são aludidas como “não transduzidas” nos seguintes Exemplos ou desenhos. Neste contexto, um vetor pMSGV foi usado como o vetor retroviral para introduzir ácido nucléico codificando CAR anti-CD20 humana, o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 às células T de camundongo separadas como descrito acima. Consequentemente, no caso de cultivar as células T de camundongo assim abrigando os ácidos nucléicos para proliferação, algumas células T de camundongo contêm o vetor retroviral nos seus citoplasmas, ao passo que o ácido nucléico codificando CAR anti- CD20 humana, o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 são integrados dentro dos genomas da maioria das células

T de camundongo. As células T de camundongo expressam CAR anti-CD20 humana, IL-7 e CCL19 de um construto recombinante estranho quando ácido nucléico codificando CAR anti-CD20 humana, o ácido nucléico codificando IL-7 e o ácido nucléico codificando CCL19 são integrados nos seus genomas.

[00119] A cultura das células T utilizaram meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de soro de bezerro fetal (FCS), 100 U/mL de penicilina, 100 ug/mL de estreptomicina, 50 uM de 2-mercaptoetanol, 25 mM de HEPES e 2 mM de L-glutamina. [Exemplo 1] <Localização de células T>

[00120] De modo a examinar o efeito antitumoral das células T expressando CAR-IL-7/CCLI9, se células T endógenas derivadas de hospedeiro (receptor) infiltrariam tecidos tumorais, como nas células T do doador administradas, foi examinado. Primeiro, 2,5 x 10º células de 3LL- hCD20 (células 3LL derivadas de câncer pulmonar de camundongo permitiram expressar CD20 humana pela recombinação de gene) foram subcutaneamente inoculadas a cada um dos camundongos CS7BL/6 de 7 a 10 semanas de idade (fabricado pela Japan SLC, Inc.) (dia O). Depois, no dia 7, um agente anticâncer ciclofosfamida (CPA; 100 mg/kg) foi intraperitonealmente administrado a estes. No dia 10, 1 x 10º células T expressando CAR anti-CD20 humana ou células T expressando CAR-IL- T7ICCL19 anti-CD20 humana produzidas a partir dos camundongos congênitos positivos em CD90.1 (CD90.1*) e negativos em CD90.2 (CD90.2) ou células T de camundongo separadas sem introdução de gene como descrito acima foram intravenosamente administrados a estes. No dia 19, tecidos tumorais foram excisados dos camundongos. Um anticorpo anti-CD90.1 rotulado com biotina (clone OX-7 fabricado pela BioLegend, Inc.; ligando às células T do doador) e um anticorpo anti-CD3 (clone 17A2; fabricado pela Tonbo Biosciences Inc.; ligando tanto às células T do doador quanto às células T do receptor endógenas) foram usados em combinação no tingimento primário e estreptavidina conjugada a Alexa Fluor 488 (fabricada pela Thermo Fisher Scientific, Inc.; verde) e anti-IgG2b de rato conjugado com Alexa Fluor 647 (fabricado pela Abcam PLC; vermelho) foram usados no tingimento secundário. Os núcleos foram tingidos com DAPI (fabricado pela Thermo Fisher Scientific Inc.; azul). Observação sob um microscópio foi realizada na x400. Os resultados são mostrados na Figura l(a). As células indicaram tingimento secundário ligadas com o anticorpo anti-CD90.1 rotulados com biotina pela cor verde e as células ligadas com o anticorpo anti-CD3 pela cor vermelha. Portanto, as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana como as células T do doador foram amarelas (cor verde + cor vermelha; CD90.1* + CD3*) e as células T endógenas do receptor foram vermelhas (CD90.1º + CD3*). Na Figura 1l(a), as células são indicadas pela escala cinza.

[00121] A Figura 1(b) mostra resultados da quantificação de cada região positiva rotulada na Figura 1(a) usando o programa Hybrid Cell Count (fabricado pela Keyence Corp.). Na Figura 1(b), a coluna cheia representa a área das células T endógenas do receptor (hospedeiro) (vermelho na imagem direita da Figura l(a)) e a coluna aberta representa a área das células T do doador administradas (amarelo na imagem direita da Figura 1(a)). As figuras l(a) e 1(b) demonstraram que a administração das células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana realça o acúmulo local de não apenas as células T administradas mas as células T endógenas do receptor (hospedeiro) no tumor, em outras palavras, realça o acúmulo local mesmo das células T endógenas no tumor pela secreção local de IL-7 e CCL19 no tumor. [Exemplo 2] <Envolvimento de células T no efeito antitumoral>

[00122] 2,5 x 10º células de 3LL-hCD20 foram subcutaneamente inoculadas a cada um dos camundongos C57BL/6 (dia O). Depois, no dia 3, 1 x 10º células T expressando CAR anti-CD20 humana (Convencional: Conv.) ou células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana (7 x 19) produzidas a partir de camundongos congênitos positivos em CD90.1 (CD90.1*) e negativos em CD90.2 (CD90.2) foram intravenosamente administradas a estes. Um anticorpo anti-CD90.2 (anti-CD90.2; preparado usando um hibridoma adquirido da ATCC pelos presentes inventores), um anticorpo contra CD90.2 (Thy1.2) expresso nas células T endógenas, foi intraperitonealmente administrado duas vezes por semana a partir do dia 1. As primeiras duas doses foram ajustadas a 1 mg/camundongo e as doses subsequentes foram ajustadas a 0,5 mg/camundongo. A Figura 2 mostra a média + SD de volumes de tumor do dia 14 em cada grupo (n = 5). o representa o valor de cada camundongo.

[00123] Como mostrado na Figura 2, a administração das células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana suprimiu a proliferação de tumor maligno e o tumor desapareceu por causa de um efeito antitumoral muito alto. Entretanto, a administração do anticorpo anti-CD90.2 reduziu o efeito antitumoral em aproximadamente 50%. Estes resultados demonstraram que as células T endógenas do receptor também estão envolvidas no efeito antitumoral realizado pelas células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti- CD20 humana, em outras palavras, não apenas as próprias células T expressando CAR-IL-7/CCLI9 anti-CD20 humana mas as células T endógenas do receptor estão amplamente envolvidas no efeito antitumoral realizado pelas células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana. [Exemplo 3] <Potencial de memória das células T endógenas do receptor>

[00124] As células T expressando CAR-IL-7/CCLI9 anti-CD20 humana foram avaliadas quanto à aquisição de uma função de memória pelas células T de CAR doadoras e células T endógenas e aumento no número de células tendo uma função de memória, usando os marcadores de memória

CD44 e CD62L.

[00125] 2,5 x 10º células de 3LL-hCD20 foram subcutaneamente inoculadas a cada um dos camundongos C57BL/6 (dia O). Depois, no dia 3, 1 x 10º células T expressando CAR anti-CD20 humana (Conv.) ou células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana (7 x 19) produzidas a partir de camundongos congênitos positivos em CD90.1 (CD90.1+) e negativos em CD90.2 (CD90.2-) como descrito acima foram intravenosamente administradas a estes. No dia 28, células do baço foram coletadas e usadas na análise seguinte.

[00126] As células T do doador foram identificadas como células positivas em CD90.1 (CD90.1*) e as células T do receptor foram identificadas como células positivas em CD90.2 (CD90.2*). A expressão dos marcadores de célula T de memória (CD44 e CD62L) e CAR nas células T positivas em CD4 e positivas em CD8 foi detectada pela citometria de fluxo. Os valores numéricos das plotagens de pontos ou histogramas representam a proporção de células em cada porta. Os resultados são mostrados na Figura 3.

[00127] A aquisição da função de potencial de memória, isto é, reatividade com estimulação, foi examinada pela produção de IFN-y. Primeiro, as células do baço coletadas no dia 28 foram estimuladas pela cocultura com 3LL-hCD20 ou a linhagem precursora 3LL não expressando nenhuma hCD20, tratadas com mitomicina C (fabricada pela Kyowa Kirin Co., Ltd.) a 37ºC durante 90 minutos. A produção de IFN-y foi examinada pelo tingimento com citocina intracelular. Os resultados são mostrados na Figura 4. Os valores numéricos nos histogramas da Figura 4(a) representam a razão de células positivas em IFN-y para células T positivas em CD90.1 do doador. A Figura 4(b) mostra resultados de detectar células positivas em IFN- 7 em células T positivas em CD90.2 e positivas em CD8 endógenas pela citometria de fluxo. Os valores numéricos das plotagens de pontos representam as proporções de células em 4 quadrantes.

[00128] Como mostrado na Figura 3, no caso de administrar as células T expressando CAR anti-CD20 humana (Conv.), as células ativadas por CD90.2 (células T endógenas do receptor) incluíram células T de memória central (células positivas em CD44 e positivas em CD62L marcadoras de célula T de memória) a 5,5% de células positivas em CD4 e 24,8% de células positivas em CD8. Por outro lado, no caso de administrar as células T expressando CAR-IL-7/CCLI9 anti-CD20 humana (7 x 19), as células ativadas por CD90.2 (células T endógenas do receptor) incluíram células T de memória central a 6,76% de células positivas em CD4 e 49,2% de células positivas em CD8. A razão de células T de memória central foi aumentada em ambos os casos. Estes resultados demonstraram que a administração das células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana (7 x 19), isto é, a cossecreção de IL-7 e CCLI19 a partir de células únicas, pode ativar as células T endógenas do receptor enquanto induzem a diferenciação das células T endógenas do receptor dentro das células T de memória central para aumentar o número de células T de memória central e também aumentam a razão de células T de memória central para um grupo de célula do baço. Em outras palavras, está evidente que as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana podem ser usadas como um indutor para células T tendo uma função de memória em um sujeito de administração ou um intensificador para células T tendo uma função de memória em um sujeito de administração.

[00129] Por outro lado, as células ativadas por CD90.1 (células T do doador) incluíram células T de memória central a 75,8% de células positivas em CD4 e 90,7% de células positivas em CD8, confirmando que as próprias células T do doador foram induzidas dentro das células T de memória central. No caso de usar Conv., as células ativadas por CD90.1 foram 0% e as células positivas em CD90.1 não foram detectadas (n.d.) porque Conv. não expressou IL-7 nem CCLI19 e exibiu uma baixa taxa de sobrevivência de células T expressando CAR.

[00130] Como mostrado na Figura 4, as células de doador incluíram 90,5% de células positivas em CD4 e 93,6% de células positivas em CD8 produzindo IFN-y pela estimulação com 3LL. Também, entre as células T endógenas do receptor (não expressando nenhum CAR-T), enquanto 0,957% das células positivas em CD4 produziram IFN-y pelo tratamento Conv., 14,9% das células positivas em CD4 produziram IFN-y pelo tratamento com 7 x 19. Estes resultados demonstraram que pela secreção de IL-7 e CCL19 usando as células T expressando CAR-IL-7/CCLI1I9 anti-CD20 humana, ambas as células T do doador e as células do receptor produziram IFN-y pela estimulação e adquire uma função de memória. [Exemplo 4] <Mudança no padrão de expressão de gene de receptor de célula T>

[00131] De modo a examinar a diversidade de epítopos de célula T, a mudança no repertório do receptor de célula T (TCR) entre antes e depois do tratamento com as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 foi examinada. 5 x 10º células de P815-hCD20 (células P815 de mastocitoma de camundongo deixadas expressar CD20 humano pela recombinação de gene) foram subcutaneamente inoculadas aos camundongos DBA/2 (n = 5) (dia O). Depois, no dia 10, ciclofosfamida (CPA; 100 mg/kg) e 1 x 10º células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana foram intravenosamente administradas a estes para tratar o tumor. No dia 140 depois da administração de células P815 de tumor, células do baço foram coletadas de camundongos completamente curados pelo tratamento do tumor como descrito acima (camundongos rejeitaram o tumor) e cultivadas com P815-hCD20 ou a linhagem precursora P815 não expressando nenhuma hCD20 (negativa em hCD?20: hCcD207 durante 4 dias para a proliferação de células T positivas em CAR ou células T negativas em CAR classificadas usando um classificador de célula (SH800; fabricado pela Sony Corp.). Depois, para a análise do repertório de TCR, a população positiva em CD8 e positiva em CAR

(CD8*CAR*) ou positiva em CD8 e negativa em CAR (CD8*'CAR) foi classificada usando um citômetro de fluxo. Uma população positiva em CD8 e positiva em CAR ou positiva em CD8 e negativa em CAR antes da administração aos camundongos foi classificada como um controle. O repertório de TCR foi analisado com um sequenciamento de próxima geração e a frequência de uso das regiões V e J nas cadeias a e à foi indicada pelo gráfico 3-D. Os resultados são mostrados nas Figuras SA a 5D e 6A a 6D. As Figuras 5SA a 5D mostram os resultados acerca da cadeia a e as Figuras 6A a 6D mostram os resultados acerca da cadeia B. As Figuras SA, 5B, 6A e 6B mostram os resultados obtidos antes da administração de células de cada linhagem e as Figuras SC, 5D, 6C e 6D mostram os resultados obtidos depois da administração das células de cada linhagem. Os valores numéricos esquerdos superiores nos diagramas representam fíndices de diversidade calculados pelo índice de Pielou de uniformidade (um número mais alto indica uma diversidade menor) e significa que um valor numérico mais baixo indica uma diversidade mais alta.

[00132] O receptor de célula T é uma molécula receptora de antígeno expresso sobre as membranas celulares de células T. O receptor de célula T existe como um heterodímero consistindo de uma cadeia a e uma cadeia B ou uma cadeia y e uma cadeia ô e é conhecido ativar células T pelo reconhecimento de uma molécula de antígeno ligada com complexo de histocompatibilidade maior (MHC).

[00133] Como está evidente a partir dos índices de diversidade mostrados nas Figuras SA a 5D e 6A a 6D, o valor de índice de diversidade foi aumentado tanto para a cadeia a quanto para as cadeias BB pela administração das células T expressando CAR-IL-7/CCLI9 anti-CD20 humana. Assim, a diversidade de TCR foi reduzida não apenas nas células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana administradas mas nas células T endógenas do receptor, demonstrando que as células T presumivelmente tendo uma função de memória contra antígeno de tumor pela secreção local de IL-7 e CCL19 ao tumor enquanto destrói as células de tumor são seletivamente aumentadas em número. [Exemplo 5] <Inibição da reincidência de tumor - 1>

[00134] Modelos de reincidência de câncer explorando um animal foram preparados pelo seguinte método: primeiro, a resposta de memória específica de tumor de células T de receptor foi examinada em camundongos tratados com as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana. x 10º células de P815-hCD20 foram subcutaneamente inoculadas a cada um dos camundongos de 7 a 10 semanas de idade portando câncer (DBA/2; n = 4; fabricado pela Japan SLC, Inc.). Depois, no dia 10, um agente anticâncer ciclofosfamida (CPA; 100 mg/kg) foi intraperitonealmente administrado a estes. No dia 14, 1 x 10º células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana foram intravenosamente inoculadas a estes. No dia 140 depois da inoculação de P815-hCD20, P815-hCD20 ou a linhagem precursora P815 não expressando nenhuma hCD20 foi inoculada a cada uma das regiões laterais direita e esquerda dos abdomens de camundongos rejeitados pelo tumor ou camundongos não expostos de controle. Os volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana. Os resultados são mostrados na Figura 7A. Análise similar também foi conduzida usando camundongos C57BL/6 inoculados com 3LL-hCD?20 ou a linhagem precursora 3LL não expressando nenhuma hCD20 ao invés da P815-hCD20. Os resultados são mostrados na Figura 7B. As linhagens precursoras P815 e 3LL não expressam nenhuma CD20 humana e, portanto, servem como células de tumor maligno não tendo nenhum antígeno de tumor maligno que seja especificamente reconhecido pela molécula de superfície celular das células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana.

[00135] A abscissa da Figura 7A representa o número de dias a partir do dia no qual P815-hCD20 ou P815 foram inicialmente administradas (dia O) para os camundongos não expostos e o número de dias a partir do dia no qual P815-hCD20 foi inoculada mais uma vez no dia 140 depois da inoculação inicial de P815-hCD20 (dia 0) para os camundongos rejeitados pelo tumor. À abscissa da Figura 7B representa o número de dias a partir do dia no qual 3LL-hCD20 ou 3LL foi inicialmente administrado (dia O) para os camundongos não expostos e o número de dias a partir do dia no qual 3LL- hCD?20 foi inoculado mais uma vez (dia O) para os camundongos rejeitados pelo tumor. As ordenadas das Figuras 7A e 7B representam volumes de tumor (mm?).

[00136] Como mostrado nos gráficos inferiores das Figuras 7A e 7B, nenhum tumor foi formado nos camundongos rejeitados pelo tumor inoculados com P815-hCD20 ou 3LL-hCD?20. Estes resultados demonstraram que o tratamento de tumor com as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana pode inibir a reincidência de tumor atribuível às células de tumor tendo um antígeno que é reconhecido por CAR. Como mostrado nos gráficos superiores das Figuras 7A e 7B, surpreendentemente, a formação de tumor foi acentuadamente inibida nos camundongos rejeitados pelo tumor inoculados com a linhagem precursora P815 ou 3LL não tendo nenhum CD20 na superfície celular, quando comparados com os camundongos não expostos. Estes resultados demonstraram que o tratamento com as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana também pode inibir a formação de tumor atribuível às células de tumor não tendo nenhum antígeno que seja reconhecido por CAR, em outras palavras, a reincidência de tumor atribuível às células de tumor não tendo nenhum antígeno que seja reconhecido por CAR. Um tal evento no qual a administração das células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana influencia a função imune de um sujeito de administração e inibe a reincidência permitindo-se que o sujeito de administração continue a rejeitar tumor derivado da linhagem precursora não expressando nenhum antígeno alvejado por CAR durante um longo período foi inesperado a partir do ponto de vista da reatividade específica da molécula alvo de células T de CAR. Quando tomados juntos com os resultados acerca da mudança no padrão de expressão de gene do receptor de célula T no Exemplo 4, a administração das células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana causou a destruição de células de tumor e como um resultado, as células T endógenas do receptor semeadas para reagir com o antígeno de tumor originalmente carreadas pelas células de tumor para induzir uma função de memória de longa duração. Isto sugere que a administração das células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana destrói as células de tumor enquanto localmente secreta IL-7 e CCL19 ao tumor, inibindo deste modo a reincidência de tumor maligno pela indução muito eficientemente de um fenômeno que espalha epítopo e induzindo e realçando uma função de memória. Para os modelos de reincidência de câncer acima, primeiro, P815-hCD20, P815, 3LL-hCD20 ou 3LL foram subcutaneamente inoculadas e no dia 140, as células de cada linhagem foram inoculadas a cada uma das regiões laterais direita e esquerda do abdômen. Consequentemente, a administração das células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana não apenas inibiu a reincidência de tumor maligno, mas pode inibir metástase de tumor maligno. Assim, as células T expressando CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humana provavelmente também estão disponíveis como um “inibidor da metástase de tumor maligno”. [Exemplo 6] <Inibição de reincidência de tumor - 2>

[00137] De modo a confirmar um efeito inibidor da reincidência de tumor, o tumor foi formado administrando-se uma linhagem de célula de mesotelioma pleural maligno humano aos camundongos e depois, a presença ou ausência de reincidência de tumor durante 143 dias foi examinada pela presença ou ausência de administração das células T anti-mesotelina humana expressando CAR-IL-7/CCLI9. A Figura 8 mostra um protocolo experimental específico. Métodos para preparar “ACC-MESO1-GFP-Luc”, “células T expressando CAR anti-mesotelina”, “células T anti-mesotelina expressando CAR-IL-7/CCL19” mostrada na Figura 8 e um método para ativar células T são como segue. (Preparação da linhagem ACC-MESO1-GFP-Luc)

[00138] Um gene de proteína de fluorescência verde-luciferase (GFP- Luc) foi introduzida usando lentivírus para a linhagem de célula maligna de mesotelioma humana ACC-MESO1, uma linhagem de célula de tumor positiva em mesotelina gentilmente provida pelo Professor Yoshitaka Sekido da Aichi Cancer Center Research Institute.

[00139] No dia 0, ACC-MESOI1 foi semeada a 1 x 10º células/poço para uma placa de 96 poços. O meio de cultura usado foi RPMI1640 (fabricado pela Gibco) suplementado com 10% de FBS. No dia 1, RediFect Red-FLuc-GFP (fabricado pela PerkinElmer, Inc.), partículas de lentivírus para preparação de célula luminescente, foi adicionada a este em MOI 100 para começar a transdução. De modo a realçar a eficiência de introdução de gene, brometo de hexadimetrina (fabricado pela Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a este meio de cultura tal que a concentração final fosse 4 ug/mL. 24 horas depois da adição de vírus (no dia 2), o meio de cultura contendo o vírus foi removido e o meio de cultura foi substituído com um fresco. Depois da continuação da cultura, apenas células expressanto GFP foram classificadas usando SH800 (fabricado pela Sony Corp.) e usadas como a linhagem ACC-MESO1-GFP-Luc. (Preparação de células T expressando CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana e células T expressando CAR anti-mesotelina humana)

[00140] As células T expressando CAR-IL-7-CCLI19 anti-mesotelina humana e as células T expressando CAR anti-mesotelina humana (células T expressando CAR convencional) foram preparadas com base nos métodos descritos no Pedido de Patente Japonês No. 2017-247109 e Publicação Internacional No.

WO 2016/056228. Como brevemente descrito, um construto de CAR de terceira geração (SEQ ID NO: 6) foi preparado que teve Fv de cadeia única anti-mesotelina humana consistindo da sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácido de um ligador apresentada na SEQ ID NO: 4 e a sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 5, uma região de transmembrana CD8 humana e um motivo de sinal intracelular CD28-4-1BB-CD36 humano nesta ordem.

Um gene de um construto tendo IL-7 humana apresentada na SEQ ID NO: 1, peptídeo 2A derivado de picornavírus subsequente (F2A) apresentado na SEQ ID NO: 7, CCL19 humana apresentada na SEQ ID NO: 2 e gene da timidina cinase derivado do vírus do herpes (HS V-tk) nesta ordem no terminal C do construto foi preparado e inserido no vetor de expressão retroviral PMSGV] (Tamada k er al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) para preparar o vetor de expressão retroviral pMSGV1 para a expressão de IL-7/CCL19 humana e HSV-tk.

O vetor de expressão retroviral pMSGV1 obtido foi introduzido nas células T de camundongo usando retrovírus para preparar as células T expressaado CAR-IL-7-CCLI9 anti-mesotelina humana.

Igualmente, vetor de expressão retroviral pMSGVI1 para a expressão do construto CAR de terceira geração tendo Fv de cadeia única anti-mesotelina humana, uma região de transmembrana de CD8 humana e um motivo de sinal intracelular CD28-4-1BB-CD36 humano nesta ordem foi introduzido ao invés do vetor de expressão retroviral PpMSGVI para a expressão de IL-7/CCL19 humana e HSV-tk às células T de camundongo usando retrovírus para preparar as células T expressando CAR anti-mesotelina humana (células T expressando CAR anti-mesotelina humana convencional). O peptídeo de sinal usado foi um peptídeo de sinal apresentado na SEQ ID NO: 8.

(Ativação de células T)

[00141] No dia 0, a cultura de 2 x 10º células mononucleares de sangue periférico coletadas de doadores humanos saudáveis, junto com 200 IU/mL de IL-2 (fabricado pela PeproTech, Inc.) foi iniciada a 37ºC em uma placa de 6 poços para cultura de célula na qual 25 uL/mL de RetroNectina (fabricada pela Takara Bio Inc.) e 5 ug/mL de anticorpo monoclonal anti-CD3 humana (fabricado pela Invitrogen Corp., 5 ug/mL) foram imobilizados, usando um incubador com 5% de CO;. À solução de cultura usada conteve OpTmizer CTS (fabricado pela Gibco) suplementado com 2 mM de L-glutamina (fabricada pela Gibco), 1% de penicilina-estreptomicina (fabricada pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e 2,5 ug/mL de fungizona (fabricado pela Bristol-Myers Squibb Company). Depois de cultivar durante 3 dias, as células T no dia 3 foram confirmadas sob um microscópio serem ativadas e morfologicamente mudadas. (Observação de reincidência de tumor)

[00142] Primeiro, no dia O, a ACC-MESOI-GFP-Luc foi intratoraxicamente administrada a 2 x 10º células/camundongo aos camundongos imunodeficientes NSG fêmeas com em 8 semanas de idade. No dia 1, o enxerto de tumor intratoráxico foi confirmado usando um sistema de imageamento in vivo (IVIS). No dia 1, as células T expressando CAR convencionais, as células T expressando CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana e as células T ativadas pelo método, que foram preparadas a partir das células mononucleares de sangue periférico de doador saudável (PBMC) e criopreservadas, foram descongeladas. As células T expressando CAR anti- mesotelina humana convencional e as células T expressando CAR-IL-7- CCLI19 anti-mesotelina humana tiveram uma taxa de expressão de CAR de 49,6% e 32,5%, respectivamente. Portanto, as células T foram adicionadas às células T expressando CAR anti-mesotelina humana convencionais para combinar as suas taxas de expressão de CAR. Depois, um grupo administrado com 1 x 10º células das células T expressando CAR anti-mesotelina humana convencionais (N = 5) e um grupo administrado com 1 x 10º células das células T expressando CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana (N = 5) foram providos. A administração das células T expressando CAR anti- mesotelina humana convencionais e as células T expressando CAR-IL-7- CCLI19 anti-mesotelina humana foi realizada pela administração intravenosa através das veias da cauda. No dia 3 ou mais tarde, a intensidade de fluorescência de tumor foi medida (fluxo total (fótons/s) usando IVIS. Os resultados são mostrados nas Figuras 9A e 9B. A Figura 10 graficamente mostra a relação entre o número de dias de administração e as taxas de sobrevivência de camundongo nos resultados descritos acima. A Figura 11 graficamente mostra a relação entre o número de dias de administração e a quantidade total de fluorescência (fótons/s) nos resultados descritos acima. Nas Figuras 9A, 9B, 10 e 11, os camundongos administrados com as células T expressando CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana são indicados por “CAR-T 7 x 19º e os camundongos administrados com as células T expressando CAR antimesotelina convencionais são indicadas por “CAR-T Convencional”. Neste Exemplo 6, camundongos imunodeficientes em NSG defeituosos em células T endógenas foram usados como receptores. Portanto, a influência das células T endógenas do receptor foi eliminada e o efeito das próprias células T expressando CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana administradas foi avaliado.

[00143] Como mostrado nas Figuras 94, 9B, 10 e 11, a intensidade de fluorescência de tumor foi raramente observada tanto em CAR-T 7 x 19 quanto CAR-T Convencional no ou em torno do dia 21. Depois, nenhuma fluorescência de tumor foi observada no CAR-T 7 x 19 até o dia 143, confirmando que a reincidência foi completamente inibida. Por outro lado, a fluorescência de tumor torna-se observável em CAR-T Convencional no ou em torno do dia 45 e a intensidade de fluorescência de tumor foi elevada no dia 115, com uma morte no dia 129 e os quatro remanescentes também morreram no dia 143. Estes resultados demonstraram que a reincidência de tumor maligno pode ser inibida pela administração das células T expressando CAR-IL-7-CCLI9, isto é, localmente secretando IL-7 e CCLI9 ao tumor enquanto destrói as células de tumor. [Exemplo 7] <Potencial de memória das células T endógenas do receptor>

[00144] Os exemplos descritos acima utilizaram células T tendo CAR como a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno. O potencial de memória de células T endógenas do receptor foi examinado usando células T tendo um receptor de célula T (TCR) ao invés de CAR como a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno. (Preparação de células T expressando TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de PIA)

[00145] As células T expressando TCR específicas para o antígeno de tumor PIA de P815, IL-7 de camundongo, CCL19 de camundongo e GFP foram preparadas de acordo com o método descrito no documento patentário

3. O método de preparação será brevemente descrito abaixo.

[00146] Um fragmento de DNA de IL-7-F2A-CCL19 codificando IL-7 de camundongo (sem um códon de parada), peptídeo 2A derivado de picornavírus subsequente (F2A) e CCL19 de camundongo foi artificialmente sintetizado (Life Technologies Corp.). O fragmento de DNA IL-7-F2A- CCLI19 assim sintetizado foi inserido ao sítio de clonagem múltipla de vetor de expressão retroviral pMSGV (documento patentário 3) tendo uma sequência F2A-eGFP pelo tratamento com enzima de restrição (NCOI e ECORT) e ligação para se obter vetor PMSGV compreendendo um fragmento de DNA IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP (SEQ ID NO: 9) (IL-7 x vetor de expressão de CCL19-eGFP). Também, vetor PMSGV compreendendo eGFP e não compreendendo IL-7 nem CCLI9 (vetor de controle de eGFP) foi preparado como um controle. Na SEQ ID NO: 9, os nucleotídeos 1 a 462 correspondem a um ácido nucléico codificando IL-7 (os nucleotídeos 1 a 75 correspondem a um ácido nucléico codificando uma sequência de sinal de IL- 7), os nucleotídeos 463 a 537 correspondem a um ácido nucléico codificando F2A, os nucleotídeos 538 a 861 correspondem a um ácido nucléico codificando CCLI19 (os nucleotídeos 538 a 612 correspondem a um ácido nucléico codificando uma sequência de sinal de CCL19), os nucleotídeos 868 a 942 correspondem a um ácido nucléico codificando F2A, os nucleotídeos 946 a 1662 correspondem a um ácido nucléico codificando eGFP e os nucleotídeos 1663 a 1665 correspondem a um códon de parada.

[00147] As células do baço foram coletadas a partir de camundongos transgênicos expressando TCR específico para antígeno de tumor PIA restringido em H-2Lº de P815 (Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189:811.) obtidas de Y. Liu. As células T derivadas de células de baço de camundongo expressando TCR específicas para o antígeno de tumor PI A de P815 (células T de TCR específicas de PIA) foram obtidas destas. Subsequentemente, retrovírus abrigando o vetor de expressão IL-7 x CCL19-eGFP ou o vetor de controle eGFP foi preparado e as células obtidas pela ativação das células do baço (3 x 10º células/poço) incluindo as células T de TCR específicas de PIA com peptídeo PIA durante 48 horas foram transduzidas com o retrovírus para se obter células T expressando TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de PIA (7 x 19 PIA-CTL) ou células T expressando TCR/eGFP específica de PIA (PI A-CTL conv.). À transdução com cada vetor de expressão foi confirmada pela análise de citometria de fluxo de detectar eEGFP como um marcador substituto. O nível de expressão de eGFP das células T obtidas de cada linhagem foi de 70 a 80% em todos os experimentos.

[00148] As Figuras 12(a) e 12(b) mostram resultados de análise da razão de células CD8*GFP* para células do baço e o número absoluto de células CD8*GFP* em camundongos tratados com as células T expressando TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de PIA ou as células expressando T TCR/eGFP específicas de PIA pela citometria de fluxo. O tratamento com as células T expressando TCR/IL-7/CCLI9/eGFP específicas de PIA foi confirmado aumentar a razão de células CD8*GFP* para células do baço e o número absoluto de células CD8*GFP*.

[00149] As Figuras 13(a) e 13(b) mostram resultados da análise da expressão de CD44 nas células CD8* do baço de camundongos BDA/2 não expostos e células CD8*GFP' ou CD8'*GFP* do baço de camundongos tratados com as células T expressando TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de PIA pela citometria de fluxo. A Figura 13(a) mostra o número representativo de células CD44*. A Figura 13(b) mostra a proporção de células CD44*. Como mostrado nas Figuras 13(a) e 13(b), não apenas as células T administradas (ativadas por GFP*) mas as células T endógenas do receptor (ativadas por GFP”) tiveram a proporção de células CD44* aumentadas em duas ou mais vezes quando comparadas com as células T não expostas. Assim, as células T expressando TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de PIA foram confirmadas ter a ação de comunicar potencial de memória para células T intrínsecas do receptor, isto é, a ação de induzir uma função de memória nas células T intrínseca do receptor e realçar a função de memória nas células T intrínseca de receptor.

[00150] De modo a confirmar adicionalmente a aquisição da função de potencial de memória, isto é, reatividade com estimulação, esta aquisição foi examinada pela produção de IFN-y. As células T foram magneticamente isoladas a partir de células do baço e cocultivadas durante aproximadamente 5 dias com mastoides mucósicos (MMC) tratados com P815. A Figura 14 mostra resultados de detectar a concentração de IFN-y em um sobrenadante do meio de cultura pelo ELISA (ensaio imunossorvente ligado à enzima).

Como mostrado na Figura 14, as células T expressando TCR/IL- T7ICCL19/eGFP específicas de PIA foram confirmadas ser ricas na produção de IFN-y. Assim, as células T expressando TCR/IL-7/CCL19/e2GFP específicas de PIA foram confirmadas melhorar a atividade antitumoral das células T endógenas do receptor. Isto sugeriu que as células T expressando TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de PIA induzem um efeito inibidor da reincidência nos receptores. [Exemplo 8] <Vírus expressando IL-7 e CCL19>

[00151] Os exemplos descritos acima utilizaram uma célula imune como o veículo de liberação de ácido nucléico. O realce em células T ou células B tendo uma função de memória ou inibição de reincidência de tumor maligno em um sujeito de administração deve ser obtido sem o uso da célula imune contanto que IL-7 e CCLI19 sejam localmente secretados ao tumor. Consequentemente, análise foi conduzida usando um vírus ao invés da célula imune como o veículo de liberação de ácido nucléico. (Preparação de vírus da vaccinia geneticamente recombinante expressando IL-7 de camundongo e CCL19 de camundongo)

[00152] Um vírus da vaccinia geneticamente recombinante expressando IL-7 de camundongo e CCLI19 de camundongo foi preparado pelo seguinte método de acordo com o método descrito no documento patentário 3 e Publicação Internacional No. WO 2011/125469. Uma região de gene da proteína fluorescente azul (BFP) foi amplificado com DNA do vetor pTagBFP-N (FP172, Evrogen) como um padrão usando dois iniciadores (5'- ATG GCC GGA CCG GCC ACC GGT CGC CAC GATO GAG CGA G-3': SEQ ID NO: 10) e (5-TCG AAT TCG CTA GCG GCC GCT TAA TTA AGC TTG TGC CCC AG-3': SEQ ID NO: 11). O produto de PCR foi clivado com enzimas de restrição Sfil e EcoRI e o resultante foi clonado dentro do sítio de restrição correspondente do vetor pTK-SP-LG (Publicação

Internacional No. WO 2011/125469) para construir pTK-SP-BFP no qual o gene BFP foi ligado sob o promotor sintético do vírus da vaccinia (Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66 (1): 135-138). Subsequentemente, o vetor pAMCyan1I-N1 (fabricado pela Takara Bio Inc.) foi clivado com as enzimas de restrição Agel e NotlI e o fragmento AmCyanl da proteína de fluorescência resultante foi clonado dentro de um sítio, tratado com a mesma enzima de restrição thereas, de pTK-SP-BFP para construir pTK-SP-AmCyanl.

[00153] O plasmídeo pMSGV compreendendo um fragmento de DNA codificando IL-7 de camundongo, peptídeo 2A derivado de picornavírus subsequente (F2A), CCLI9 de camundongo, F2A e eGFP (documento patentário 3) foi clivado com a enzima de restrição BamHI, tratado quanto à extremidade abrupta e depois clivado com Ncol. O fragmento IL-7 de camundongo-F2A-CCLI19 de camundongo-F2A-eGFP obtido foi clonado dentro de um sítio obtido pela clivagem de pTK-SP-AmCyanl com Nhel e tratamento para extremidade abrupta, seguido pela clivagem com Ncol para construir o plasmídeo vetor de transferência pTK-SP-IL-7 de camundongo- F2A-CCLI19 de camundongo-F2A-eGFP.

[00154] Uma região do gene da luciferase de vagalume foi amplificada com DNA de pGLA4.20 (fabricado pela Promega Corp.) como um padrão usando dois iniciadores (5'-GCT CCG GAC GCC ACC ATG GAA GAT GCC AAA AAC-3' (SEQ ID NO: 12) e 5”-GCG AAT TCC ACG GCG ATC TTG CCG CCC TTC T-3' (SEQ ID NO: 13)). O produto de PCR foi clivado com enzimas de restrição BspEI e EcoRI e o fragmento Luc obtido e um fragmento compreendendo uma porção de eGFP, obtidos pela clivagem de pPTK-SP-IL-7 de camundongo-F2A-CCL19 de camundongo-F2A-eGFP com enzimas de restrição EcoRI e BsrGI foram simultaneamente clonados dentro de um sítio de pTK-SP-IL-7 de camundongo-F2A-CCLI19 de camundongo- F2A-eGFP clivado com enzimas de restrição BspEI e BsrGI para construir o plasmídeo vetor de transferência pTK-SP-Luc-F2A-eGFP.

[00155] De modo a recuperar um vírus da vaccinia recombinante tendo o genoma viral mostrado na Figura 15(a) ou 15(b), células CV1 cultivadas a 80% de confluência em uma placa de 6 poços foram infectadas com vírus da vaccinia (LC16mO) em MOI = 0,02 a 0,1. Depois da adsorção na temperatura ambiente durante 1 hora, o DNA do vetor de transferência de plasmídeo (PTK-SP-IL-7 de camundongo-F2A-CCL19 de camundongo-F2A-eGFP ou PTK-SP-Luc-F2A-eGFP) misturado com FuGENE HD (fabricado pela Promega Corp.) foi adicionado às células de acordo com o manual de modo que as células incorporassem o DNA. As células foram cultivadas a 37ºC durante 2 a 5 dias. As células foram recuperadas, congeladas e descongeladas, depois sonicadas, apropriadamente diluídas e inoculadas dentro das células BSCI1 quase confluentes. Meio de cultura MEM de Eagle contendo 0,8% de metilcelulose e 5% de FBS foi adicionado a estas e as células foram cultivadas a 37ºC durante 2 a 5 dias. O meio de cultura foi removido e as placas expressando BFP foram raspadas com uma ponta de pipeta e colocadas em suspensão em meio de cultura Opti-MEM (fabricado pela Invitrogen Corp.). Esta operação foi repetida adicionalmente três ou mais vezes usando células BSC1 para purificar as placas. À suspensão das placas coletadas depois da purificação da placa foi sonicada. Depois, DNA genômico foi extraído de uma alíquota de 200 uL do mesmo usando High Pure Viral Nucleic Acid Kit (fabricado pela F. Hoffmann-La Roche, Ltd.) de acordo com o manual e submetido à triagem pela PCR. A PCR foi realizada usando dois iniciadores (5”-ATT TCT CCG TGA TAG GTA TCG ATG-3' (SEQ ID NO: 14) e ”-AAC GGT TTA CGT TGA AAT GTC C-3'SEQ ID NO: 15) e clones com um tamanho predeterminado de um produto de PCR detectado foram diretamente sequenciados para confirmar a sequência de nucleotídeo do produto de PCR. Um clone viral não tendo nenhum problema na sequência de nucleotídeo foi selecionado e amplificado em células AS549, seguidas pela medição do título viral nas células RK13. O vírus obtido foi submetido como vírus da vaccinia geneticamente recombinante LCI6mO TK-SP-IL-7 de camundongo-F2A-CCL1I19 de camundongo-F2A-eGFP (TK-ICE; Figura 15(a)) ou LCI6mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP (TK-LE; Figura 15(b)) ao experimento seguinte.

[00156] As células A549 (1 x 10º células/poço) ou células CT26 (5 x 10º células/poço) foram semeadas a uma placa de 24 poços e cultivadas a 37ºC. Depois, as células A5S49 e as células CT26 foram infectadas com TK- ICE ou TK-LE na MOI = 0,1 e MOI = 10, respectivamente (n = 3). 24, 48 e 72 horas depois da infecção, as células foram observadas sob um microscópio de fluorescência (fabricado pela Olympus Corp.) (Figura 16) e os sobrenadantes foram recuperados destas. O sobrenadante recuperado das células de cada linhagem 24, 48 ou 72 horas mais tarde foi diluído 100 vezes e as quantidades de IL-7 e CCLI9 secretados em 0,5 mL do sobrenadante foram medidas usando DuoSet ELISA Mouse IL-7 (DY407 fabricado pela R&D Systems, Inc.), DuoSet ELISA Mouse CCL-19 (DY440 fabricado pela R&D Systems, Inc.) e DuoSet Ancillary Reagent Kit 2 (DY008 fabricado pela R&D Systems, Inc.). Os resultados de medição são mostrados na Figura 17.

[00157] Como mostrado nas Figuras 16 e 17, a emissão de fluorescência de eGFP das células A5S49 e das células CT26 24, 48 ou 72 horas depois da infecção foi no mesmo nível entre TK-ICE e TK-LE. À emissão de fluorescência de eGFP foi detectada em quase todas as células ASA49 48 horas depois da infecção. À emissão de fluorescência eGFP foi aumentada nas células CT26 com um lapso de tempo. IL-7 e CCL19 foram detectadas a partir de 24 horas depois da infecção nas células AS49 e células CT26 infectadas com TK-ICE. As quantidades de IL-7 e CCL19 nas células AS49 atingiram quase um platô 48 horas depois da infecção. As quantidades de IL-7 e CCL19 nas células CT26 foram elevadas com um lapso de tempo. Por outro lado, as quantidades de IL-7 e CCL19 foram iguais a ou mais baixas do que os limites de detecção nas células infectadas com TK-LE. A partir destes resultados, TK-ICE foi confirmado secretar IL-7 e CCL19 enquanto destrói células de tumor. [Exemplo 9] <Efeito Antitumor>

[00158] No Exemplo 8, o vírus da vaccinia geneticamente recombinante TK-ICE preparado como descrito acima foi confirmado secretar IL-7 e CCL19 enquanto destrói células cancerosas pela infecção das células de tumor. Consequentemente, o Vírus da vaccinia geneticamente recombinante TK-ICE foi examinado quanto ao seu efeito antitumoral.

[00159] Como mostrado na Figura 18, células CT26 de câncer de intestino grosso de camundongo (5 x 10” células) foram subcutaneamente transplantado nas partes abdominais direita e esquerda de cada um dos camundongos BALB/c e deixados crescer. Subsequentemente, cada vírus da vaccinia geneticamente recombinante (3 a 5 x 107 unidades formadoras de placa (PFU)) foi intratumoralmente administrado um total de três vezes (dias 0,2 e 4) a um maior selecionado de tumores formados nas partes abdominais direita e esquerda. Depois, o efeito antitumoral do vírus foi estudado pela medição do diâmetro de tumor nas partes abdominais direita e esquerda. O tumor no lado de administração antes da primeira dosagem foi de 43 a 102 mn” e o tumor no lado da não administração antes da primeira dosagem foi de 24 a 82 mm?. Os resultados são mostrados na Figura 19.

[00160] A partir dos resultados da Figura 19, a proliferação do tumor no lado da administração foi suprimido no grupo administrado com TK-LE não expressando IL-7 nem CCL19 (N = 7) quando comparado com um grupo de administração de PBS (N = 8), ao passo que nenhum efeito supressivo de tumor foi observado no grupo da não administração. Ao contrário, a supressão da proliferação de tumor foi observada não apenas no tumor no lado da administração, mas no tumor no lado da não administração no grupo administrado com TK-ICE expressando IL-7 e CCLI9 (N = 4) quando comparado com um grupo da administração de PBS (N = 4). O vírus da vaccinia geneticamente recombinante administrado ao tumor em um lado das partes abdominais foi confirmado não ser migrado para o tumor no outro lado, por um método para detectar não invasivamente um vírus pela administração de um substrato (luciferina) para uma enzima luminescente (luciferase) expressa em células de tumor infectadas com TK-LE e confirmando a presença ou ausência de luminescência (não mostrada). Isto sugere que a destruição de células de tumor pelo TK-ICE assim como a secreção local de IL-7 e CCLI9 ao tumor deflagra a imunidade de tumor em um sujeito de administração enquanto realça a função de memória de células T endógenas, confirmando deste modo não apenas o desaparecimento de tumor no lado da administração mas a supressão da proliferação de tumor no lado da não administração e inibindo a reincidência do tumor maligno.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração, caracterizado pelo fato de que compreende um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19).

2. Intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico é pelo menos um membro selecionado de uma célula imune, um vírus, um anaeróbio, um lipossoma, uma célula tronco mesenquimatosa (MSC) e uma nanopartícula.

3. Intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma capacidade para acumular nas células de tumor maligno ou uma capacidade para proliferar especificamente nas células de tumor maligno.

4. Intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma citotoxicidade contra células de tumor maligno.

5. Intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 4, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune e a célula imune tem uma molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno.

6. Intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T (TCR).

7. Intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a célula imune é uma célula T.

8. Intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 7, caracterizado pelo fato de que as células T ou células B tendo uma função de memória são células T de memória central.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um intensificador para células T ou células B tendo uma função de memória em um sujeito de administração como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um aditivo farmaceuticamente aceitável.

10. Inibidor da recorrência de tumor maligno, caracterizado pelo fato de que compreende um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19).

11. Inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico é pelo menos um membro selecionado de uma célula imune, um vírus, um anaeróbio, um lipossoma, uma célula tronco mesenquimatosa (MSC) e uma nanopartícula.

12. Inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma capacidade para acumular nas células de tumor maligno ou uma capacidade para proliferar especificamente nas células de tumor maligno.

13. Inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico tem uma citotoxicidade contra células de tumor maligno.

14. Inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune e a célula imune tem uma molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de tumor maligno.

15. Inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico é uma célula imune tendo uma molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de célula de tumor maligno e a reincidência de tumor maligno é uma reincidência de tumor maligno atribuível a uma célula de tumor maligno não tendo nenhum antígeno de tumor maligno que é especificamente reconhecido pela molécula de superfície celular.

16. Inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a molécula de superfície celular que reconhece um antígeno de célula de tumor maligno é um receptor de antígeno quimérico (CAR) ou um receptor de célula T (TCR).

17. Inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a célula imune é uma célula T.

18. Inibidor da recorrência de tumor maligno de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o veículo de liberação de ácido nucléico é um vírus oncolítico.

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um inibidor da recorrência de tumor maligno como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 18 e um aditivo farmaceuticamente aceitável.

20. Indutor para induzir uma função de memória em células T ou células B em um sujeito de administração, caracterizado pelo fato de que compreende um veículo de liberação de ácido nucléico, um ácido nucléico codificando interleucina-7 (IL-7) e um ácido nucléico codificando ligante 19 da quimiocina (motivo C-C) (CCL19).