KR20200068661A - 메모리 기능을 갖는 t세포 또는 b세포의 증강제, 악성 종양 재발 억제제 및 t세포 또는 b세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제 - Google Patents

메모리 기능을 갖는 t세포 또는 b세포의 증강제, 악성 종양 재발 억제제 및 t세포 또는 b세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제 Download PDF

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유키미 사코다
케이시 아다치
타카후미 나카무라
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고쿠리츠다이가쿠호우진 야마구치 다이가쿠
코쿠리츠 다이가쿠 호우진 돗토리 다이가쿠
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Abstract

장기간에 걸쳐 악성 종양을 계속해서 거절하기 위해, 메모리 기능을 갖는 내재성 T세포 또는 B세포의 증강제 및 악성 종양 재발 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제나 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제를 제작한다. 또한, 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하는 악성 종양 재발 억제제를 제작한다.

Description

메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제, 악성 종양 재발 억제제 및 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제
본 발명은 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(Interleukin-7: IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(chemokine(C-C motif) ligand 19: CCL19)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제, 악성 종양 재발 억제제 및 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제에 관한 것이다.
악성 종양은 전세계에 많은 이환자(罹患者)가 있는 질환으로, 일반적으로 화학 요법, 방사선 요법 또는 외과 요법이 널리 수행되고 있다. 그러나, 부작용이 생기는 것이나, 일부 기능을 잃어버리는 것이나, 재발 혹은 전이를 치료하지 못하는 것 등 다양한 문제가 있었다. 이에, 보다 환자의 삶의 질(QOL)을 높게 유지하기 위해, 최근에는 면역 세포 요법의 개발이 진행되고 있다. 이 면역 세포 요법은 환자로부터 면역 담당 세포를 채취하고, 이와 같은 면역 담당 세포의 면역 기능을 높이도록 처치하고 증폭하여, 재차 환자에게 이입하는 요법이다. 구체적으로는, 환자로부터 T세포를 채취하고, 이와 같은 T세포에 CAR을 코딩하는 핵산을 도입하고 증폭하여, 재차 환자에게 이입하는 요법(비특허 문헌 1 참조)이 알려져 있다. 이와 같은 요법은 현재 전세계에서 임상 시험이 진행되고 있으며, 백혈병이나 림프종 등의 조혈기 악성 종양 등에서 유효성을 나타내는 결과가 얻어지고 있다.
또한, T세포 등의 면역 담당 세포의 면역 기능 제어 인자로서는 사이토카인, 케모카인, 시그널 제어 단백질 등, 적어도 수백 종류의 인자가 알려져 있다. 그 중에서 인터루킨 7(IL-7)은 T세포의 생존에 필수적인 사이토카인이며, 골수, 흉선, 림프 기관·조직의 스트로마 세포 등의 비조혈 세포에 의해 산생(産生)되는 것이 알려져 있다. 이와 같은 IL-7의 기능을 이용한 T세포로서, IL-7과 IL-7R 알파를 융합한 키메라 사이토카인 수용체를 발현하는 T세포(특허 문헌 1 참조)가 개시되어 있다. 그러나, 이와 같은 T세포에서의 키메라 사이토카인 수용체는 하나의 융합 단백질로서 도입한 T세포의 막 표면에 한정되어 발현하여, 자기 세포에 대해서만 리간드 비의존적으로 IL-7R 등의 사이토카인 시그널을 전달하는 것에 지나지 않으며, 상기 수용체를 도입하지 않은 T세포의 기능을 높일 수는 없었다.
또한, CCL19나 CCL21, IL-7의 발현 저하가 SIRP 알파 변이 마우스의 비장에서의 T세포 영역의 유지 결손의 원인이 된다는 것(비특허 문헌 2 참조)이나, CCL19나 CCL21, IL-7이 2차 림프 조직(비장이나 림프절)에서 T세포의 항상성을 유지하는 기능을 가지고 있다는 것(비특허 문헌 3 참조)이 개시되어 있다. 그러나, 상기 비특허 문헌 2, 3은 2차 림프 조직의 T세포 영역에 항상적으로 존재하는 비활성화 T세포에 대한 작용을 나타낸 것이며, 항종양 면역 응답과 직접적인 관계성을 나타내는 것은 아니었다. 또한, 상기 비특허 문헌 2, 3에서의 CCL19나 CCL21, IL-7 발현 세포는 T세포가 아니라, 2차 림프 조직에 존재하는 세망내피계의 세포였다.
한편, 본 발명자들은 IL-7과 CCL19를 동시에 발현함으로써, 고형암을 현저히 억제하는 면역 세포 요법(특허 문헌 2, 3 참조)을 제안했다. 이와 같은 방법에 의해, 숙주(리시피언트, recipient)에서의 내재성의 면역 담당 세포의 활성화나 종양 세포로의 집적능을 높일 수 있지만, 상기 면역 세포 요법에 의해 장기간에 걸쳐 재발 등을 방지하여, 악성 종양을 계속해서 거절할 수 있을지는 불분명했다.
특허문헌 1: 국제 공개 제2013/123061호 팜플렛 특허문헌 2: 국제 공개 제2016/056228호 팜플렛 특허문헌 3: 국제 공개 제2017/159736호 팜플렛
비특허문헌 1: 나카자와 요조(Nakazawa Yozo) 신슈(shinshu) 의학 잡지 61(4): 197~203(2013) 비특허문헌 2: SATO-HASHIMOTO M. et al., J. Immunol., 2011, vol. 187, no. 1,291-7 비특허문헌 3: SIEGERT S. et al., Front. Immunol., 2012, vol. 3, article 285
상술한 바와 같이 IL-7과 CCL19를 동시에 발현하는 CAR 발현 T세포나 TCR 발현 T세포 등의 면역 세포 요법을 개발하고, 면역 담당 세포의 증식능, 생존능 또는 숙주의 면역 담당 세포의 집적능을 현저히 향상시켜, 종래 면역 세포 요법에서 충분한 치료 효과가 확인되지 않았던 고형암에 적용할 수 있는 기술의 개발이 진행되고 있다. 그러나, 악성 종양은 재발하는 경우가 많으며, 설령 상기 면역 세포 요법으로 일시적으로 악성 종양을 치료할 수 있더라도, 장기간에 걸쳐 악성 종양을 계속해서 거절할지 여부는 명백하지 않으며, 또한 재발에 대한 예방책도 검토되지 않았다. 이에 본 발명의 과제는 장기간에 걸쳐 악성 종양을 계속해서 거절하기 위해, 메모리 기능을 갖는 내재성 T세포 또는 B세포의 증강제, 악성 종양 재발 억제제 및 내재성 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 지금까지 자신이 개발해 온 CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 T세포의 추가적인 가능성을 검토하던 중, 이와 같은 T세포를 대상에 투여하면, 투여한 T세포뿐만 아니라 대상(숙주)에서의 내재성 T세포에서도 메모리 기능을 유도하여 메모리 기능을 갖는 세포의 절대수가 증가하는 것, 및 악성 종양의 재발 모델 실험에서, CAR이 인식하는 항원을 갖지 않는 세포에 대해 악성 종양 형성을 억제하는 것을 발견했다. 또한 CAR 대신 TCR을 이용한 경우나 T세포 대신 바이러스를 이용한 경우에도 유사한 효과가 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
(2) 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포, 바이러스, 혐기성 균, 리포좀, 간엽계 줄기세포(Mesenchymal stem cell: MSC), 나노 입자로부터 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 상기 (1)에 기재된 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
(3) 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포로의 집적능 또는 악성 종양 세포에서 특이적인 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
(4) 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포 상해능을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
(5) 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포이고, 상기 면역 담당 세포가 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
(6) 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자가 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor: CAR) 또는 T세포 수용체(T-Cell Receptor: TCR)인 것을 특징으로 하는, 상기 (5)에 기재된 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
(7) 면역 담당 세포가 T세포인 것을 특징으로 하는, 상기 (5) 또는 (6)에 기재된 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
(8) 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포가 센트럴 메모리 T세포인 것을 특징으로 하는, 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
(9) 상기 (1)~(8) 중 어느 하나에 기재된 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 의약 조성물.
(10) 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 포함하는 악성 종양 재발 억제제.
(11) 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포, 바이러스, 혐기성 균, 리포좀, 간엽계 줄기세포(MSC), 나노 입자로부터 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 상기 (10)에 기재된 악성 종양 재발 억제제.
(12) 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포로의 집적능 또는 악성 종양 세포에서 특이적인 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (10) 또는 (11)에 기재된 악성 종양 재발 억제제.
(13) 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포 상해능을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (10)~(12) 중 어느 하나에 기재된 악성 종양 재발 억제제.
(14) 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포이고, 상기 면역 담당 세포가 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (10)~(13) 중 어느 하나에 기재된 악성 종양 재발 억제제.
(15) 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 면역 담당 세포이고, 악성 종양 재발이 상기 세포 표면 분자가 특이적으로 인식하는 악성 종양 항원을 갖지 않는 악성 종양 세포에서 기인하는 악성 종양 재발인 것을 특징으로 하는, 상기 (14)에 기재된 악성 종양 재발 억제제.
(16) 악성 종양 세포 항원을 인식하는 세포 표면 분자가 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T세포 수용체(TCR)인 것을 특징으로 하는, 상기 (14) 또는 (15)에 기재된 악성 종양 재발 억제제.
(17) 면역 담당 세포가 T세포인 것을 특징으로 하는, 상기 (14)~(16) 중 어느 하나에 기재된 악성 종양 재발 억제제.
(18) 핵산 송달 매체가 종양 용해성 바이러스인 것을 특징으로 하는, 상기 (11)에 기재된 악성 종양 재발 억제제.
(19) 상기 (10)~(18) 중 어느 하나에 기재된 악성 종양 재발 억제제와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 의약 조성물.
(20) 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제.
또한, 본 발명의 다른 양태로서는, 이하와 같다.
1) 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제의 조제를 위한, 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산의 사용;
2) 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 대상에 투여하는 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강 방법;
3) 악성 종양 재발 억제제의 조제를 위한, 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산의 사용;
4) 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 대상에 투여하는 악성 종양 재발의 억제 방법;
5) 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제의 조제를 위한, 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산의 사용;
6) 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 대상에 투여하는 T세포 또는 B세포에의 메모리 기능의 유도 방법;
7) 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포, 바이러스, 혐기성 균, 리포좀, 간엽계 줄기세포(MSC), 나노 입자로부터 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 상기 (20)에 기재된 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제.
8) 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포로의 집적능 또는 악성 종양 세포에서 특이적인 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (20) 또는 7)에 기재된 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제.
9) 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포 상해능을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (20), 7) 또는 8) 중 어느 하나에 기재된 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제.
10) 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포이고, 상기 면역 담당 세포가 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 (20), 7)~9) 중 어느 하나에 기재된 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제.
11) 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자가 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T세포 수용체(TCR)인 것을 특징으로 하는, 상기 10)에 기재된 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제.
12) 면역 담당 세포가 T세포인 것을 특징으로 하는, 상기 10) 또는 11)에 기재된 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제.
본 발명의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제를 이용하면, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포를 증강하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 악성 종양 재발 억제제를 이용하면, 악성 종양 치료 후의 재발을 억제하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제를 이용하면, 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 것이 가능해진다.
도 1의 (a)는 실시예 1에서, 악성 종양 조직에서의 T세포의 국소적 존재를 표지 항체에 의해 염색하고, 현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. (b)는 상기 (a)에서 관찰한 결과를 화상 해석 처리하여, 투여한 도너 T세포와 리시피언트의 내재성 T세포의 구역(μm2)을 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 2에서, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(7×19) 또는 이와 같은 T세포와 함께 항CD90.2 항체(anti-CD90.2)를 마우스에 투여한 경우의 투여 후 14일째의 악성 종양 부피(mm3)를 조사한 그래프이다.
도 3은 실시예 3에서, 투여한 도너 T세포 및 리시피언트의 내재성 T세포의 메모리화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 3에서, 투여한 도너 T세포 및 리시피언트의 내재성 T세포의 메모리화의 기능을 IFN-γ의 생산에 의해 조사한 결과를 나타내는 그래프이다. (a)는 CD90.1 양성의 도너 T세포에서의 IFN-γ 양성 세포의 비율, (b)는 CD90.2 양성의 내재성 CD8 양성 T세포에서의 IFN-γ 양성 세포를 유세포 분석(flow cytometry)으로 검출한 결과이다.
도 5a는 실시예 4에서, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 전의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화(α사슬: 처리 전, CAR-positive)를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 실시예 4에서, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 전의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화(α사슬: 처리 전, CAR-negative)를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 실시예 4에서, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 후의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화(α사슬: 처리 후, CAR-positive)를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 실시예 4에서, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 후의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화(α사슬: 처리 후, CAR-negative)를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 실시예 4에서, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 전의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화(β사슬: 처리 전, CAR-positive)를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6b는 실시예 4에서, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 전의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화(β사슬: 처리 전, CAR-negative)를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 실시예 4에서, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 후의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화(β사슬: 처리 후, CAR-positive)를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6d는 실시예 4에서, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 후의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화(β사슬: 처리 후, CAR-negative)를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 실시예 5에서, P815-hCD20을 접종 후 140일째에, 종양을 치료하여 근치(根治)한 마우스(tumor-rejected mice) 또는 컨트롤의 나이브 마우스(naive mice)에 대해 P815-hCD20 또는 hCD20을 발현하지 않은 친주(親株)의 P815를 좌우 옆구리에 각각 접종하고, 종양 부피의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 7b는 실시예 5에서, 3LL-hCD20을 접종 후 140일째에, 종양을 치료하여 근치한 마우스(tumor-rejected mice) 또는 컨트롤의 나이브 마우스(naive mice)에 대해 3LL-hCD20 또는 hCD20을 발현하지 않은 친주의 3LL을 좌우 옆구리에 각각 접종하고, 종양 부피의 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 6에서, 종양의 재발 억제 효과를 확인하기 위한 실험 프로토콜 도면이다.
도 9a는 실시예 6에서, 후술하는 ACC-MESO1-GFP-Luc를 투여하고, day 1에 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포(7×19 CAR-T)를 투여한 군 및 conventional 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포(conventional CAR-T)를 투여한 군에서의 day 1, 3, 7, 10, 14, 21, 31, 38의 마우스를 노광 시간 30초로 촬영한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9b는 실시예 6에서, 후술하는 ACC-MESO1-GFP-Luc를 투여하고, day 1에 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포(7×19 CAR-T)를 투여한 군 및 conventional 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포(conventional CAR-T)를 투여한 군에서의 day 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129, 143의 마우스를 노광 시간 30초로 촬영한 결과를 나타내는 도면이다. day 129의 좌측부터 2번째 개체는 사망했기 때문에 사진을 생략한다.
도 10은 실시예 6에서, 후술하는 ACC-MESO1-GFP-Luc 투여로부터의 일수와 마우스의 생존율의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 6에서, 후술하는 ACC-MESO1-GFP-Luc 투여로부터의 일수와 토탈 형광량의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 7에서, (a)는 비장 세포에서의 CD8+GFP+ 세포의 비율을 유세포 분석으로 해석한 결과, (b)는 CD8+GFP+ 세포 절대수를 유세포 분석으로 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 실시예 7에서, (a)는 naive BDA/2 마우스의 CD8+ 비장 세포 및 P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포로 처리한 마우스의 CD8+GFP- 또는 CD8+GFP+ 비장 세포에서의 CD44+ 세포의 세포수를 나타내는 도면이며, (b)는 (a)에서의 CD44+ 세포의 비율을 나타내는 도면이다.
도 14는 실시예 7에서, P815로 처리한 점막형 비만 세포(Mucosal mast cell: MMC)와 5일간 정도 공배양하고, 배지의 상청 내 IFN-γ의 농도를 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)에 의해 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 실시예 8에서, (a)는 유전자 재조합 백시니아 바이러스 LC16mO TK-SP-마우스 IL-7-F2A-마우스 CCL19-F2A-eGFP(TK-ICE)의 구조, (b)는 유전자 재조합 백시니아 바이러스 LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP(TK-LE)의 구조를 나타내는 도면이다.
도 16은 실시예 8에서, 유전자 재조합 백시니아 바이러스 TK-ICE 또는 TK-LE를 감염시킨 A549 세포 및 CT26 세포에서의 백시니아 바이러스의 세포 변성 효과와 eGFP 형광 발현의 관계를 관찰 이미지로 나타내는 도면이다.
도 17은 실시예 8에서, 유전자 재조합 백시니아 바이러스 TK-ICE 또는 TK-LE를 감염시킨 A549 세포 또는 CT26 세포에서의 IL-7 및 CCL19의 분비량을 조사한 도면이다.
도 18은 실시예 8에서, 마우스 대장암 CT26 세포를 마우스의 양복부의 피하에 이식하는 개념을 나타내는 도면이다.
도 19는 실시예 9에서, 마우스 대장암 세포 CT26을 이용한 종양 양측 피하 이식 BALB/c 마우스 모델에 대해, 유전자 재조합 백시니아 바이러스 TK-ICE 또는 TK-LE를 종양 내 투여한 후의 종양 사이즈(mm3)의 추이를 나타내는 도면이다.
본 명세서에서의 '메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제'로서는, 핵산 송달 매체, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하고 있으면 특별히 제한되지 않으며, 이와 같은 증강제에 의해 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포를 증강하는 것이 가능해진다. 또한, 본 명세서에서의 'T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제'로서는, 핵산 송달 매체, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하고 있으면 특별히 제한되지 않으며, 이와 같은 유도제에 의해 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 것이 가능해진다. 아울러, 이하, 본 명세서에서 상기 '메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제' 또는 상기 'T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제'를 합쳐 '본건 증강제 또는 유도제'라고도 한다.
본 명세서에서의 '악성 종양 재발 억제제'로서는, 핵산 송달 매체, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하고 있으면 특별히 제한되지 않으며, 이와 같은 악성 종양 재발 억제제에 의해 악성 종양 재발을 억제하는 것이 가능해진다. 아울러, 이하, 본 명세서에서 상기 '악성 종양 재발 억제제'를 '본건 악성 종양 재발 억제제'라고도 한다.
IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산으로서는, 사람 유래의 핵산을 바람직하게 들 수 있다. 상기 각각의 핵산은 도입하는 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 이와 같은 각각의 핵산의 서열 정보는 공지의 문헌이나 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있다. IL-7을 코딩하는 핵산으로서는, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 들 수 있으며, IL-7에서의 세포 증식률 또는 세포 생존율의 항진 작용을 갖는 한, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 코딩하는 염기 서열일 수 있다. CCL19를 코딩하는 핵산으로서는, 서열 번호 2에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 들 수 있으며, CCL19에서의 세포의 유주(遊走) 작용을 갖는 한, 서열 번호 2에 나타내는 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산을 코딩하는 염기 서열을 이용할 수도 있다. 아울러, 상기 IL-7에서의 세포 증식률 또는 세포 생존율의 항진 작용이나 CCL19에서의 세포의 유주 작용은 상기 특허 문헌 2에 기재된 방법에 의해 확인할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 '동일성'은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 근사성의 정도(이는 쿼리 서열과 다른 바람직하게는 동일형의 서열(핵산 혹은 단백질 서열)과의 매칭에 의해 결정됨)를 의미한다. '동일성'을 계산 및 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램법으로서는, 예를 들어 GCG BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389-3402; Devereux et al., Nucleic Acid Res. 1984, 12:387) 및 BLASTN 2.0(Gish W., http://blast.Wustl.edu, 1996-2002) 및 FASTA(Pearson 및 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85:2444-2448) 및 가장 길게 중복된 한 쌍의 콘티그를 결정 및 얼라인먼트하는 GCG GelMerge(Wibur 및 Lipman, SIAM J. Appl. Math. 1984, 44:557-567; Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48:443-453)를 들 수 있다.
상기 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산은 프로모터나 터미네이터 등의 제어 서열이나, 약제 내성 유전자, 리포터 유전자 등의 선택 마커 서열을 함유하는 벡터에 편입되어 있을 수도 있다. 또한, 벡터 내에는 자살 유전자를 코딩하는 핵산이나, 2A 펩타이드 또는 IRES를 코딩하는 핵산을 포함하고 있을 수도 있다. 상기 벡터, 자살 유전자를 코딩하는 핵산이나, 2A 펩타이드 또는 IRES를 코딩하는 핵산에 대해서는, 상기 특허 문헌 2, 3을 참조로 입수 또는 제작하는 것이 가능하다. 상기 프로모터로서는 예를 들어 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터, NFAT 프로모터, HIF 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 상기 벡터로서는 예를 들어 pMSGV 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))나 pMSCV 벡터(타카라 바이오사(Takara Bio Inc.) 제품) 등의 레트로바이러스 벡터 또는 이와 같은 벡터 유래의 것을 들 수 있다.
또한, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산과 함께, IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, CCL4, Flt3L, interferon-γ, MIP-1α, GM-CSF, M-CSF, TGF-β, TNF-α, 체크 포인트 저해 항체 혹은 그 단편 등의 다른 면역 기능 제어 인자를 코딩하는 핵산을 포함하고 있을 수도 있다. 단, 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제는 면역 기능 제어 인자를 코딩하는 핵산으로서 적어도 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하고 있다면, 상기 다른 면역 기능 제어 인자를 코딩하는 핵산을 함유하고 있지 않아도 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제로서의 효과를 충분히 발휘할 수 있다.
상기 '메모리 기능'이란, 과거에 종양 항원에 의한 자극을 받은 경험을 가지고, 다시 악성 종양 세포에 접한 경우에, 과거에 종양 항원에 의한 자극을 받았던 적이 없는 나이브 T세포에 비해 보다 빠르고 강력하게 활성화하여 악성 종양 세포에 대한 높은 면역 기능을 발휘하는 기능을 의미한다. 또한, 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포로서는, 센트럴 메모리 T세포, 메모리 B세포를 들 수 있다. 이와 같은 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포는 CD44, CD62L, CD127(IL-7R) 등의 각각의 양성/음성(+/-)이나 발현 강도를 종합적으로 평가함으로써 확인할 수 있으며, 인간, 마우스 등의 대상에 따라 적절히 어느 CD를 측정하면 좋을지를 선택하는 것이 가능하다. 아울러, 본원에서, 이하, 양성을 '+', 음성을 '-'로 기재하는 경우도 있다.
상기 '메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강'이란, 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포를 포함하는 세포 집단에서, 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 비율이 증가하는 것이나, 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 절대수가 증가하는 것이나, 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 세포당 메모리 기능이 증강하는 것을 의미한다.
상기 'T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도'란, 나이브 T세포 또는 나이브 B세포를 포함하는 세포 집단에서, 이와 같은 나이브 T세포 또는 나이브 B세포가 종양 항원에 의한 자극을 받아 면역 기억을 획득함으로써, 메모리 기능을 갖도록 유도하는 것이나, 이미 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포에서, 그 메모리 기능이 보다 높아지도록 유도하는 것이나, 이미 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 생체 내에서의 수를 증가시키는 것을 의미한다. 구체적으로는, 예를 들어 나이브 T세포를 센트럴 메모리 T세포로 유도하는 것을 들 수 있다.
상기 투여 대상으로서는, 포유 동물 또는 포유 동물 세포를 바람직하게 들 수 있으며, 이와 같은 포유 동물 중에서도, 인간, 마우스, 개, 랫트, 모르모트, 토끼, 새, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 원숭이, 침팬지를 보다 바람직하게 들 수 있으며, 인간을 특히 바람직하게 들 수 있다.
상기 '핵산 송달 매체'로서는, 면역 담당 세포, 바이러스, 혐기성 균, 리포좀, 간엽계 줄기세포(MSC), 나노 입자로부터 선택되는 적어도 1종 이상일 수 있으며, 복수종을 혼합하여 이용할 수도 있다.
여기서, 상기 면역 담당 세포로서는, 면역 응답에 관여하고, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 도입함으로써 IL-7 및 CCL19를 발현할 수 있는 세포이면 특별히 제한되지 않으나, 생체로부터 분리(채취)된 면역 담당 세포인 것이 바람직하고, T세포, 자연 살해 세포(NK 세포), B세포 등의 림프구계 세포나 단구(單球), 대식 세포, 수상 세포 등의 항원 제시 세포나, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포 등의 과립구이며 분리된 것을 들 수 있고, 인간, 개, 고양이, 돼지, 마우스 등의 포유 동물로부터 분리된 T세포, 바람직하게는 인간으로부터 분리된 T세포를 바람직하게 들 수 있다. 아울러, 상기 분리된 T세포로서는, T세포 이외에 다른 세포도 포함하고 있을 수 있는데, 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90%의 비율로 T세포를 포함하고 있을 수 있다. 또한, T세포는 혈액, 골수액 등의 체액이나, 비장, 흉선, 림프절 등의 조직, 혹은 원발 종양, 전이성 종양, 암성 복수 등의 암 조직에 침윤하는 면역 세포로부터 면역 담당 세포를 포함하는 세포 집단을 분리하여 얻을 수 있다. 상기 세포 집단에 포함되는 T세포의 비율을 높이기 위해, 분리한 상기 세포 집단을 필요에 따라 정법(定法)에 의해 추가로 단리 또는 정제하여 얻을 수도 있다. 또한 ES 세포나 iPS 세포로부터 제작된 것을 이용할 수도 있다. 이와 같은 T세포로서는, 알파·베타 T세포, 감마·델타 T세포, CD8+ T세포, CD4+ T세포, 종양 침윤 T세포, 메모리 T세포, 나이브 T세포, NKT 세포를 들 수 있다. 아울러, 면역 담당 세포 유래와 투여 대상은 동일할 수도 상이할 수도 있으나, 동일한 것이 바람직하다. 또한, 투여 대상이 인간인 경우에, 면역 담당 세포로서는 투여 대상인 환자 본인으로부터 채취한 자가 세포를 이용할 수도, 타인으로부터 채취한 타가 세포를 이용할 수도 있다. 즉, 도너(donor)와 리시피언트(recipient)는 일치할 수도 불일치할 수도 있으나, 일치하는 것이 바람직하다.
상기 바이러스로서는, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 봉입할 수 있고, 악성 종양 세포에 감염할 수 있는 바이러스면 특별히 제한되지 않으나, 종양 용해성 바이러스인 것이 바람직하다. 상기 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus)란, 정상 세포에 감염하더라도 거의 증식하지 않지만, 악성 종양 세포에 감염하면 증식하여, 악성 종양 세포를 사멸(악성 종양 세포 상해)시키는 능력을 갖는 바이러스를 의미하는 것으로, 예를 들어 Molecular Therapy, 제18권, 제2호, 2010년 2월, 233~234페이지에 총설되어 있다. 이와 같은 종양 용해성 바이러스로서는 악성 종양 세포에 감염하여 악성 종양 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 한 특별히 한정되지 않으나, 종양 용해성 백시니아 바이러스, 종양 용해성 아데노바이러스, 종양 용해성 단순 헤르페스 바이러스, 종양 용해성 레오바이러스, 종양 용해성 홍역 바이러스, 종양 용해성 뉴캐슬병 바이러스, 종양 용해성 우두 바이러스, 종양 용해성 멈프스 바이러스, 종양 용해성 콕삭키바이러스 등을 들 수 있다. 또한, 상기 종양 용해성 백시니아 바이러스로서는, Kim MK et al. Science Translational Medicine. 2013 May 15;5(185):185ra63, Heo J, et al. Nature Medicine, 2013 (3):329-36. doi: 10.1038/nm. 3089. Epub 2013 Feb 10., 국제 공개 제2012/094386호 팜플렛에 기재된 것을 이용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 종양 용해성 아데노바이러스로서는, Tedcastle A et al. Mol Ther. 2016;24:796-804, Marino N, Illingworth S, Kodialbail P, Patel A, Calderon H, Lear R, Fisher KD, Champion BR, Brown ACN. PLoS One 2017;12(5):e0177810, Freedman JD, et al. EMBO Mol Med 9:1067-1087 (2017), Lang FF et al., Journal of Clinical Oncology (2018), James M. et al. The Journal of Oncology, 188(6):2391-7, 2012, 특허 제3867968호 공보 및 특허 제5574284호 공보에 기재된 것을 이용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 종양 용해성 단순 헤르페스 바이러스로서는, Mazzacurati et al., Mol Ther, 2015 Jan;23(1):99-107, Hirooka Y, et al. BMC Cancer 2018, 18, 596, Nakatake R, et al. Cancer Sci. 2018 Mar, 109(3);600-610. 및 Andtbacka RHI, et al. J Clin Oncol. 2015;33:2780-2788에 기재된 것을 이용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 종양 용해성 레오바이러스로서는, Mahalingam, et al, Cancers 2018, 10, 160에 기재된 것을 이용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 종양 용해성 뉴캐슬병 바이러스로서는, Journal of Virology. 2016 Jun; 90(11):5343-5352.에 기재된 것을 이용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 종양 용해성 수포 구내염 바이러스병 바이러스로서는, Muik A. et al. Cancer Res; 74(13); 3567-78.에 기재된 것을 이용할 수도 있으나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 종양 용해성 바이러스는 유전자 개변에 의해 단백질을 발현하는 기능을 부가하고 있는 것도 있는데, 그러한 단백질 대신 또는 더하여, 추가로 상기 IL-7 및 CCL19를 발현시킬 수도 있다.
상기 혐기성 균으로서는, 세포 내에 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 도입함으로써 IL-7 및 CCL19를 발현할 수 있는 혐기성 균이면 특별히 제한되지 않으나, 악성 종양 세포에 집적하는 능력을 갖는 혐기성 그람 양성균인 것이 바람직하고, 비피더스균 등의 비피도박테리움속균, 락토바실러스속균, 리스테리아속균을 들 수 있다. 아울러, 혐기성 균은 산소가 적은 환경하에서 생육하기 쉽기 때문에, 악성 종양 세포에 집적하기 쉽다는 것이 알려져 있다.
상기 리포좀으로서는, 종양 세포에 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 봉입할 수 있고, 인지질 이중막으로 구성되는 지질 나노캡슐이면 특별히 제한되지 않으며, 이와 같은 리포좀은 시판품을 이용하거나 상법에 의해 합성함으로써 얻을 수 있다.
상기 MSC로서는, 세포 내에 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 도입함으로써 IL-7 및 CCL19를 발현할 수 있고, 악성 종양 세포에 집적하는 능력을 갖는 MSC이면 특별히 제한되지 않는다.
상기 나노 입자로서는, 종양 세포에 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 송달할 수 있는 능력을 가지고, 나노미터 오더, 바람직하게는 직경 5~800nm의 입자체이면 특별히 제한되지 않으며, 금 나노 입자 등의 금속 나노 입자나 실리카 나노 입자를 들 수 있다. 이와 같은 나노 입자는 시판품을 이용하거나 상법에 의해 합성함으로써 얻을 수 있다.
상기 '핵산 송달 매체가 악성 종양 세포로의 집적능을 갖는다'란, 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포에 특이적으로 집적하는 능력을 의미한다. 구체적으로는, a)핵산 송달 매체가 악성 종양 세포의 세포 표면 분자를 인식하는 물질을 가지고, 이와 같은 물질의 작용에 의해 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포에 집적하는 능력이나, b)종양 조직의 혈관벽은 정상 조직의 혈관보다 1자릿수 이상 넓은 수백 나노미터의 틈이 벌어져 있는 것을 이용한 EPR(enhanced permeability and retention) 효과에 의해 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포에 집적하는 능력을 들 수 있다. 상기 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포의 세포 표면 분자를 인식하는 물질로서는, 키메라 항원 수용체(CAR)나 T세포 수용체(TCR)를 들 수 있다. 이와 같은 CAR이나 TCR은 상기 특허 문헌 2, 3에 기재된 것을 이용할 수 있다. 따라서, 악성 종양 세포로의 집적능을 갖는 핵산 송달 매체로서는 CAR 발현 면역 담당 세포나 TCR 발현 면역 담당 세포를 들 수 있다. 아울러, 키메라 항원 수용체(CAR)란, 암세포의 세포 표면 항원을 인식하는 단일사슬 항체(single chain Fv: scFv)와 T세포의 활성화를 유도하는 시그널 전달 영역을 융합시킨 인공적인 키메라 단백질이다.
상기 '악성 종양 세포에서 특이적인 증식능을 갖는다'란, 정상 세포에 감염해도 거의 증식하지 않으나, 악성 종양 세포에 감염하면 증식하는 능력을 의미하며, 예를 들어 종양 용해성 바이러스가 갖는, 악성 종양 세포에서 특이적으로 증식하는 능력을 들 수 있다. 따라서, 악성 종양 세포에서 특이적인 증식능을 갖는 핵산 송달 매체로서는 종양 용해성 바이러스를 들 수 있다.
상기 '악성 종양 세포 상해능을 갖는다'란, 악성 종양 세포를 상해하여 악성 종양 세포를 용해 또는 사멸시키는 능력을 의미한다. 아울러, 악성 종양 세포를 용해 또는 사멸시킴으로써, 악성 종양 세포 내의 악성 종양 항원이 용해 또는 사멸한 세포 주변으로 방출되게 된다.
상기 '악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자'로서는, 악성 종양의 세포 표면에 갖는 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자일 수 있으며, 키메라 항원 수용체(CAR)나 T세포 수용체(TCR)를 들 수 있다. 이와 같은 CAR이나 TCR은 상기 특허 문헌 2, 3에 기재된 것을 이용할 수 있다. 따라서, 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 면역 담당 세포로서는 CAR 발현 면역 담당 세포나 TCR 발현 면역 담당 세포를 들 수 있다.
상기 악성 종양 항원으로서는, 악성 종양 세포에서 정상 세포보다 높게 발현하는, 혹은 악성 종양 세포에 특이적으로 발현하는 단백질, 당지질 등의 물질을 의미하며, 이와 같은 악성 종양 항원으로서는, 종양 관련 항원이나 암정소 항원, 혈관 신생 관련 항원, 유전자 변이에 의한 악성 종양 신생 항원(네오안티겐)의 에피토프 펩타이드를 들 수 있으며, 구체적으로는 WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Survivin, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A, 5T4, B7-H6, BCMA, CD123, CD133, CD138, CD171, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CEA, cMet, CS1, EGFR, EGFRvIII, EphA2, ErbB2, FAP, FR-α, HER2, IL13Ra2, MUC1, MUC16, NKG2D, PSCA, PSMA, ROR1, TARP, DLL3, PRSS21, Claudin18.2, Claudin18, CAIX, L1-CAM, FAP-α, CTAG1B, FR-α 등의 단백질이나, GD2, GM2 등의 당지질을 들 수 있다.
상기 '핵산 송달 매체, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하는'에는 , 핵산 송달 매체 내에 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함하는 양태도 포함된다. 예를 들어, 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포인 경우에는, 면역 담당 세포 내에 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산이 포함되어 있을 수 있다. 또한, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산이 면역 담당 세포의 게놈에 편입된 상태일 수도, 게놈에 편입되지 않는 상태(예를 들어 에피소말(episomal)인 상태)일 수도 있다.
상기 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포인 경우, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 상기 면역 담당 세포에 도입하는 것, 즉 면역 담당 세포에 외래성 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산(바람직하게는 프로모터의 하류에 작동 가능하도록 연결되어 있는 외래성 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산)을 도입함으로써 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제를 제작할 수 있다. 도입하는 방법으로서는, 면역 담당 세포에 DNA를 도입하는 방법일 수 있으며, 예를 들어 일렉트로포레이션법(Cytotechnology, 3, 133(1990)), 인산칼슘법(일본 특허공개공보 제(평)2-227075호), 리포펙션법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7413(1987)), 바이러스 감염법 등의 방법을 들 수 있다. 이와 같은 바이러스 감염법으로서는, 도입하는 핵산을 포함하는 벡터와 패키징 플라스미드를 GP2-293 세포(타카라 바이오사 제품), Plat-GP 세포(코스모 바이오사(Cosmo Bio Co., Ltd.) 제품), PG13 세포(ATCC CRL-10686), PA317 세포(ATCC CRL-9078) 등의 패키징 세포에 트랜스펙션하여 재조합 바이러스를 제작하고, 이와 같은 재조합 바이러스를 T세포에 감염시키는 방법(상기 특허 문헌 2)을 들 수 있다.
또한, 상기 핵산 송달 매체가 바이러스인 경우, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 상기 바이러스에 도입하는 것, 즉 바이러스에 외래성 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산(바람직하게는 프로모터의 하류에 작동 가능하도록 연결되어 있는 외래성 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산)을 도입하여, 'IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 가지고, IL-7 및 CCL19를 발현하는 바이러스'를 제작할 수 있다. 이와 같은 제작한 바이러스를 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제로서 이용할 수 있다.
마찬가지로, 상기 핵산 송달 매체가 혐기성 균, 리포좀 또는 간엽계 줄기세포(MSC)인 경우에도, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 상기 혐기성 균, 리포좀 또는 간엽계 줄기세포(MSC)에 도입하는 것, 즉 혐기성 균, 리포좀 또는 간엽계 줄기세포(MSC)에 외래성 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산(바람직하게는 프로모터의 하류에 작동 가능하도록 연결되어 있는 외래성 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산)을 도입하여, 'IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 가지고, IL-7 및 CCL19를 발현하는 혐기성 균, 리포좀 또는 간엽계 줄기세포(MSC)'를 제작할 수 있다. 이와 같은 제작한 혐기성 균, 리포좀 또는 간엽계 줄기세포(MSC)를 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제로서 이용할 수 있다. 또한, 상기 'IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 가지고, IL-7 및 CCL19를 발현하는 바이러스', 'IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 가지고 IL-7 및 CCL19를 발현하는 혐기성 균', 'IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 가지고, IL-7 및 CCL19를 발현하는 리포좀', 또는 'IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 가지고, IL-7 및 CCL19를 발현하는 간엽계 줄기세포(MSC)'를 악성 종양의 증식 억제제로서 이용할 수도 있다.
또한, 상기 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 면역 담당 세포에 도입하는 다른 방법으로서는, 면역 담당 세포에 IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 공지의 유전자 편집 기술을 이용하여, 적절한 프로모터의 제어하에서 발현 가능하도록 세포의 게놈에 편입하는 방법일 수도 있다. 공지의 유전자 편집 기술로서는, 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc finger nuclease), TALEN(전사 활성화 유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease)), CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas 시스템 등의 엔도뉴클레아제를 이용하는 기술을 예시할 수 있다.
본건 증강제 또는 유도제나, 본건 악성 종양 재발 억제제로서, 'IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하고, 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자로서 CAR을 갖는 면역 담당 세포, 즉 CAR, IL-7 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여, CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포'를 제작하는 경우에는, 이하 중 어느 방법에 의해 제작할 수 있다.
(1) IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7 및 CCL19를 발현하는 벡터, 및 CAR을 코딩하는 핵산을 함유하여 CAR을 발현하는 벡터의 2 종류를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(2) CAR을 코딩하는 핵산과 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 CAR과 IL-7을 발현하는 벡터, 및 CAR을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 CAR과 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(3) CAR을 코딩하는 핵산과 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 CAR과 IL-7을 발현하는 벡터, 및 IL-7을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7과 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(4) CAR을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 CAR과 CCL19를 발현하는 벡터, 및 IL-7을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7과 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(5) CAR을 코딩하는 핵산과 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 CAR과 IL-7을 발현하는 벡터, 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(6) CAR을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 CAR과 CCL19를 발현하는 벡터, 및 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7을 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(7) CAR을 코딩하는 핵산을 함유하여 CAR을 발현하는 벡터, IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7을 발현하는 벡터, 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 CCL19를 발현하는 벡터의 3종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
마찬가지로, 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제로서, 'IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하고, 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자로서 TCR을 갖는 면역 담당 세포, 즉 TCR, IL-7 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여, TCR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포'를 제작하는 경우에는, 이하 중 어느 방법에 의해 제작할 수 있다.
(1) IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7 및 CCL19를 발현하는 벡터, 및 TCR을 코딩하는 핵산을 함유하여 TCR을 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(2) TCR을 코딩하는 핵산과 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 TCR과 IL-7을 발현하는 벡터, 및 TCR을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 TCR과 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(3) TCR을 코딩하는 핵산과 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 TCR과 IL-7을 발현하는 벡터, 및 IL-7을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7과 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(4) TCR을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 TCR과 CCL19를 발현하는 벡터, 및 IL-7을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7과 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(5) TCR을 코딩하는 핵산과 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 TCR과 IL-7을 발현하는 벡터, 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(6) TCR을 코딩하는 핵산과 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 TCR과 CCL19를 발현하는 벡터, 및 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7을 발현하는 벡터의 2종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(7) TCR을 코딩하는 핵산을 함유하여 TCR을 발현하는 벡터, IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7을 발현하는 벡터, 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 CCL19를 발현하는 벡터의 3종류의 벡터를 동시에 또는 단계적으로 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
또한, 상기 'TCR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포'를 제작하는 경우에는, 미리 원하는 종양 항원에 특이적인 TCR을 발현하는 면역 담당 세포를 조제하고, 이와 같은 TCR 발현 면역 담당 세포를 이용하여 이하 중 어느 방법에 의해 제작할 수도 있다.
(1) IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7 및 CCL19를 발현하는 벡터를 상기 TCR 발현 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
(2) IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여 IL-7을 발현하는 벡터, 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여 CCL19를 발현하는 벡터의 2종류를 동시에 또는 단계적으로 상기 TCR 발현 면역 담당 세포에 도입하는 방법;
그 외, 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제로서, 'CAR, TCR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포'를 제작할 수도 있다. 구체적으로는, 상기 'CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 제작하는 경우'에 기재한 각 벡터 모두 또는 어느 하나에, 추가로 TCR을 코딩하는 핵산을 포함시켜 TCR도 발현하도록 제작하는 방법이나, 상기 'TCR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 제작하는 경우'에 기재한 각 벡터 모두 또는 어느 하나에, 추가로 CAR을 코딩하는 핵산을 포함시켜 CAR도 발현하도록 제작하는 방법이나, 상기 'TCR 발현 면역 담당 세포'에 상기 'CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 제작하는 경우'에 기재한 각 벡터를 도입하여 제작하는 방법을 들 수 있다.
또한, 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제에 있어서, 면역 담당 세포에 CAR을 갖는 경우에는, '상이한 악성 종양 항원을 인식하는 복수, 바람직하게는 2종류의 CAR을 발현하는 면역 담당 세포'를 제작할 수도 있다. 구체적으로는, 상기 'CAR, IL-7 및 CCL19를 발현하는 면역 담당 세포를 제작하는 경우'에 기재한 각 벡터에 있어서, 상이한 악성 종양 항원을 인식하는 복수, 바람직하게는 2종류의 CAR을 코딩하는 핵산을 포함시켜, 복수, 바람직하게는 2종류의 CAR을 발현하도록 제작하는 방법을 들 수 있다. 특히, 예를 들어 악성 종양 항원 X를 인식하는 CAR을 코딩하는 핵산 및 IL-7을 코딩하는 핵산을 함유하여, 악성 종양 항원 X를 인식하는 CAR 및 IL-7을 발현하는 벡터와, 악성 종양 항원 Y를 인식하는 CAR을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여, 악성 종양 항원 Y를 인식하는 CAR 및 CCL19를 발현하는 벡터를 제작하여 면역 담당 세포에 도입하면, X 및 Y를 악성 종양 항원으로서 갖는 세포의 주변에 IL-7과 CCL19가 분비되어, 보다 종양 특이성을 높이는 것이 가능해진다.
아울러, 상기 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포, 바이러스, 혐기성 균 또는 간엽계 줄기세포인 경우, 면역 담당 세포, 바이러스, 혐기성 균 또는 간엽계 줄기세포를 배양하여 얻어진 배양물이며, 상기 면역 세포를 함유하는 것을 이용할 수도 있다.
상기 악성 종양 재발 억제제에서의 '악성 종양 재발'로서는, 일반적인 화학 요법, 방사선 요법 또는 외과 요법 등에 의해 악성 종양 치료 후에 재차 악성 종양이 발생하는 것을 의미한다. 이와 같은 악성 종양 재발로서는, 핵산 송달 매체의 악성 종양 세포로의 집적능 또는 악성 종양 세포에서 특이적인 증식능에 대해 저항성을 갖는 악성 종양 세포에서 기인하는 재발인 것이 바람직하다.
여기서, '악성 종양 세포로의 집적능에 대해 저항성을 갖는 악성 종양 세포에서 기인하는 재발'이란, 예를 들어 핵산 송달 매체가 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 면역 담당 세포이며, 악성 종양 재발이 세포 표면 분자가 특이적으로 인식하는 악성 종양 항원을 갖지 않는, 또는 세포 표면 분자가 특이적으로 인식하는 악성 종양 항원을 잃은 악성 종양 세포에서 기인하는 악성 종양 재발을 들 수 있다. 또한, '핵산 송달 매체의 악성 종양 세포에서 특이적인 증식능에 대해 저항성을 갖는 악성 종양 세포에서 기인하는 재발'이란, 예를 들어 악성 종양 용해성 바이러스에 의한 감염에 대해 감수성을 갖지 않는, 또는 악성 종양 용해성 바이러스에 의한 감염에 대해 감수성을 잃은 악성 종양 세포에서 기인하는 종양 재발을 들 수 있다. 이와 같은 '악성 종양 세포로의 집적능에 대해 저항성을 갖는 악성 종양 세포에서 기인하는 재발'은 예를 들어 재발한 조직의 악성 종양 세포에서의 악성 종양 항원을 조사함으로써 확인할 수 있다.
상기 악성 종양 재발 억제제는 면역 치료를 수행한 악성 종양을 갖는 대상에 투여하기 위해 사용할 수 있다. 장기적인 재발 억제를 목적으로, 면역 치료를 수행한 날로부터 100일 이후에 면역 치료를 수행한 악성 종양을 갖는 대상에 투여하기 위해 사용할 수도 있다.
본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제는 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하고 있을 수도 있다. 또한, 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제로서 이용하기 위한 설명서를 포함할 수도 있다. 또한, 본건 증강제 또는 유도제나 본건 악성 종양 재발 억제제에 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하여 의약 조성물로 할 수도 있다. 이하, '본건 증강제와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 의약 조성물', '본건 유도제와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 의약 조성물' 및 '본건 악성 종양 재발 억제제와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 의약 조성물'을 합쳐 '본건 의약 조성물'이라고도 한다. 상기 첨가제로서는 생리 식염수, 완충 생리 식염수, 세포 배양 배지, 덱스트로스, 주사용 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합, 안정제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 방부제, 등장화제, 충전제 및 윤활제를 들 수 있다.
본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물은 당업자에게 이미 알려진 방법을 이용하여, 악성 종양의 치료 또는 재발 억제를 필요로 하는 피검체에 투여할 수 있으며, 투여 방법으로서는 정맥내, 종양내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내, 활액낭내, 두엽내, 수강내 및 지주막하(뇌척수액)에 대한 주사를 들 수 있다.
본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물은 1일 4회, 3회, 2회 또는 1회, 1일 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 주 1회, 7일 간격, 8일 간격, 9일 간격, 주 2회, 월 1회 또는 월 2회 독립적으로 투여하는 방법을 들 수 있다.
본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물의 투여량은 피험체의 연령, 성별, 건강 및 체중 등에 의해 적절히 결정할 수 있다. 예를 들어, 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포인 경우에는, 인간 성인에 대해, 체중 1kg당 1×103~1×109개, 바람직하게는 1×104~1×108개, 보다 바람직하게는 1×105~1×107개를 들 수 있다. 또한, 핵산 송달 매체가 종양 용해성 바이러스인 경우에는, 인간 성인에 대해, 투여당 약 102~1010 플라크 형성 단위(PFU), 바람직하게는 105~106 플라크 형성 단위(PFU)를 들 수 있다.
본 명세서에서의 악성 종양으로서는, 고형 악성 종양일 수도 혈액 악성 종양일 수도 있으며, 신경교종, 멜라노마, 악성 중피종, 선암, 편평 상피암, 선편평 상피암, 미분화 암, 대세포 암, 소세포 암, 피부암, 갑상선암, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 두경부암, 경부암, 자궁암, 간장암, 신장암, 췌장암, 비장암, 폐암, 기관암, 기관지암, 대장암, 결장암, 소장암, 위암, 식도암, 담관암, 담낭암, 정소암, 난소암, 뇌종양 등의 암이나, 골 조직, 연골 조직, 지방 조직, 근 조직, 혈관 조직 및 조혈 조직의 암 외에, 연골육종, 유잉육종, 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 골육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 간모세포종(hepatoblastoma), 수모세포종(medulloblastoma), 신아세포종(nephroblastoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 췌모세포종(pancreatoblastoma), 흉막 폐모세포종(pleuropulmonary blastoma), 망막모세포종(retinoblastoma) 등의 아세포종이나, 배세포 종양이나, 림프종이나, 백혈병, 골수종을 들 수 있다.
본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물은 다른 항종양제와 병용하여 이용할 수 있다. 또한, 본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물을 이용하는 방법과 방사선에 의한 암 치료법을 조합할 수도 있다. 상기 다른 항종양제로서는, 시클로포스파미드, 벤다무스틴, 이포스파미드, 다카바진 등의 알킬화약, 펜토스타틴, 플루다라빈, 클라드리빈, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토푸린, 에노시타빈 등의 대사 길항약, 리툭시맙, 세툭시맙, 트라스투주맙 등의 분자 표적약, 이매티닙, 제피티닙, 엘로티닙, 아파티닙, 다사티닙, 수니티닙, 트라메티닙 등의 키나아제 저해제, 보르테조밉 등의 프로테아좀 저해제, 시클로스포린, 타크로리무스 등의 칼시뉴린 저해약, 이다르비신, 독소루비신, 마이토마이신 C 등의 항암성 항생 물질, 이리노테칸, 에토포시드 등의 식물 알칼로이드, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴 등의 플래티넘 제제, 타목시펜, 비칼루타미드 등의 호르몬 요법약, 인터페론, 니볼루맙, 펨브로리주맙 등의 면역 제어약을 들 수 있다.
상기 본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물과 다른 항암제를 병용하여 이용하는' 방법으로서는, 다른 항암제를 이용하여 처리하고, 그 후 본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물을 이용하는 방법이나, 본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물과 다른 항암제를 동시에 이용하는 방법이나, 본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물을 이용하여 처리하고, 그 후 다른 항암제를 이용하는 방법을 들 수 있다. 또한, 본건 증강제 또는 유도제, 본건 악성 종양 재발 억제제 또는 본건 의약 조성물과 다른 항암제와 병용한 경우에는, 암 치료 효과가 보다 향상되는 동시에, 각각의 투여 횟수 또는 투여량을 줄임으로써 각각에 의한 부작용을 저감시키는 것이 가능해진다.
본 명세서에서 인용된 학술 문헌, 특허 출원 등의 참고 문헌은 그 전체가 각각 구체적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로서 원용된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위가 이들 예시로 한정되는 것은 아니다.
(항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 및 항인간 CD20 CAR 발현 T세포의 제작)
후술하는 실시예에서 이용하는 '항인간 CD20 CAR, 마우스 IL-7 및 마우스 CCL19를 발현하는 T세포(항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포: 이하의 실시예 또는 도면에서 '7×19'라고도 함)' 및 '항인간 CD20 CAR 발현 T세포: 이하의 실시예 또는 도면에서 'Conv.'라고도 함)'는 상기 특허 문헌 3 및 Tamada들의 문헌(Nature Biotechnology doi: 10. 1038/nbt. 4086)에 기재된 방법에 준거하여 제작했다. 이하, 제작 방법을 간결히 기재한다. 아울러, 상기 '항인간 CD20 CAR, 마우스 IL-7 및 마우스 CCL19를 발현하는 T세포'는 악성 종양 세포 항원을 인식하는 세포 표면 분자로서 항인간 CD20 CAR을 갖는 T세포이며, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 포함한다.
항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 우선, 미리 항인간 CD20 CAR을 코딩하는 핵산, 마우스 IL-7을 코딩하는 핵산 및 마우스 CCL19를 코딩하는 핵산을 함유하여, 항인간 CD20 CAR과 IL-7과 CCL19를 발현하는 pMSGV 벡터를 제작했다. 그 다음, 이와 같은 벡터를 CD90.1 양성(CD90.1+), CD90.2 음성(CD90.2-)의 콘제닉 마우스(Bar Harbor사 제품)의 비장 및 림프절로부터 Pan T Cell Isolation Kit II(Miltenyi Biotec사 제품)를 이용하여 마우스 생체로부터 분리한 마우스 T세포에 레트로바이러스를 이용해 도입하여 제작했다. 한편, 항인간 CD20 CAR을 발현하는 T세포(항인간 CD20 CAR 발현 T세포)는 미리 항인간 20 CAR을 발현하는 pMSGV 벡터를 제작하고, 이와 같은 벡터를 상기 분리한 마우스 T세포에 레트로바이러스를 이용해 도입하여 제작했다. 아울러, 유전자 도입 없는 상기 분리한 마우스 T세포(non-transducted T cells)는 이하의 실시예 또는 도면에서 'non-transducted'라고도 한다. 여기서, 상기와 같이 분리한 마우스 T세포에 항인간 CD20 CAR을 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산을 도입하기 위해 레트로바이러스 벡터인 pMSGV 벡터를 이용하고 있다. 때문에, 상기 각각의 핵산을 도입한 마우스 T세포를 배양하여 증식한 경우에는, 마우스 T세포질 내에 레트로바이러스 벡터를 포함하고 있는 것도 있지만, 대개는 마우스 T세포에서 항인간 CD20 CAR을 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산이 게놈에 편입된다. 마우스 T세포에서 항인간 CD20 CAR을 코딩하는 핵산, IL-7을 코딩하는 핵산 및 CCL19를 코딩하는 핵산이 게놈에 편입된 경우에는, 항인간 CD20 CAR, IL-7 및 CCL19는 도입한 외래 재조합 컨스트럭트로부터 발현하게 된다.
T세포의 배양에는 10% 우태아 혈청(Fetal calf serum: FCS, 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스트렙토마이신, 50μM의 2 메르캅토 에탄올, 25mM의 HEPES, 2mM의 L-글루타민을 첨가한 RPMI-1640 배지를 이용했다.
[실시예 1]
<T세포의 국소적 존재>
CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 항종양 효과를 조사하기 위해, 종양 조직에서, 투여한 도너 T세포와 동일하게 숙주(recipient) 유래의 내재성 T세포가 종양 조직에 침윤하고 있는지 여부를 조사했다. 우선, 7-10주령의 C57BL/6 마우스(SLC사 제품)에 2.5×106개의 3LL-hCD20(인간 CD20을 발현하도록 유전자 재조합을 수행한 마우스 폐암 유래 세포 3LL)을 피하 접종했다(0일째). 그 후 7일째에 항암제인 시클로포스파미드(CPA: 100mg/kg)를 복강내 투여했다. 10일째에, CD90.1 양성(CD90.1+), CD90.2 음성(CD90.2-) 콘제닉 마우스로부터 생성한 1×106개의 상기 항인간 CD20 CAR 발현 T세포, 상기 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포, 혹은 유전자 도입 없는 상기 분리한 마우스 T세포를 정맥내 투여했다. 19일째에, 종양 조직을 마우스로부터 적출 제거했다. 프라이머리 염색에서, 비오틴 표지한 항CD90.1 항체(clone OX-7 BioLegend사 제품: 도너 T세포에 결합) 및 항CD3 항체(clone 17A2: Tonbo biosciences사 제품: 도너 T세포와 리시피언트의 내재성 T세포 둘다에 결합)의 조합을 이용하고, 세컨드 염색으로서 Alexa Fluor488 접합 스트렙트아비딘(Thermo Fisher Scientific사 제품: green) 및 Alexa Fluor647 접합 항랫트 IgG2b(Abcam사 제품: red)를 이용했다. 핵은 DAPI(Thermo Fisher Scientific사 제품: blue)로 염색했다. 현미경에 의한 관찰은 400배로 수행했다. 결과를 도 1 (a)에 나타낸다. 세컨드 염색에 의해, 비오틴 표지한 항CD90.1 항체가 결합한 세포는 녹색으로, 항CD3 항체가 결합한 세포는 적색으로 나타나기 때문에, 도너 T세포인 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 황색(녹색+적색: CD90.1++CD3+)으로, 리시피언트의 내재성 T세포는 적색(CD90.1-+CD3+)이었으나, 도 1 (a)에서는 그레이 스케일로 나타낸다.
또한, 도 1 (a)에 의해 표지된 각 포지티브 영역을 Hybrid Cell Count program(KEYENCE사 제품)을 이용하여 정량한 결과를 도 1 (b)에 나타낸다. 도 1 (b)에서, 흑색 칼럼은 리시피언트(호스트)의 내재성 T세포(도 1 (a) 우측도에서의 적색)의 면적, 흰색 칼럼은 투여한 도너 T세포(도 1 (a) 우측도에서의 황색)의 면적을 나타낸다. 도 1 (a), (b)에 의해, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 투여한 경우에는, 투여한 T세포뿐만 아니라, 리시피언트(호스트)의 내재성 T세포도 종양 국소에서의 집적이 증강하고 있다는 것, 다시 말하면, 종양 국소에 IL-7 및 CCL19를 분비시킴으로써 내재성 T세포도 종양 국소에서의 집적이 증강하고 있다는 것이 명백해졌다.
[실시예 2]
<항종양 효과에서의 T세포의 관여>
C57BL/6 마우스에 2.5×106개의 3LL-hCD20을 피하 접종했다(0일째). 그 후 3일째에 CD90.1 양성(CD90.1+), CD90.2 음성(CD90.2-) 콘제닉 마우스로부터 생성한 1×106개의 항인간 CD20 CAR 발현 T세포(Conventional: Conv.) 혹은 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(7×19)를 정맥내 투여했다. 내재성 T세포에 발현하는 CD90.2(Thy1.2)에 대한 항체인 항CD90.2 항체(anti-CD90.2: 본 발명자들이 ATCC로부터 구입한 하이브리도마를 이용하여 제작)를 1일째부터 2회/주 정도 복강내 투여했다. 투여량은 첫 2회는 1mg/마우스로 하고, 그 후에는 0.5mg/마우스로 했다. 각각의 군(n=5)의 14일째의 종양 부피의 mean±SD를 도 2에 나타낸다. ○는 각각의 마우스의 값을 나타낸다.
도 2에 나타내는 바와 같이, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 투여한 경우에는 악성 종양의 증식이 억제되었으며, 항종양 효과가 극히 높아 종양이 소실되었으나, 항CD90.2 항체를 투여함으로써 항종양 효과가 50% 정도 저감되었다. 따라서, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 항종양 효과에는, 리시피언트의 내재성 T세포도 관여하고 있다는 것, 다시 말하면, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 항종양 효과는 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 자신뿐만 아니라 리시피언트의 내재성 T세포가 크게 관여하고 있다는 것이 명백해졌다.
[실시예 3]
<리시피언트의 내재성 T세포의 메모리화>
항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 도너의 CAR-T세포 및 내재성 T세포의 메모리 기능 획득 및 메모리 기능을 갖는 세포의 증가에 대해, 메모리 세포의 마커인 CD44 및 CD62L에 의해 평가했다.
C57BL/6 마우스에 2.5×106개의 3LL-hCD20을 피하 접종했다(0일째). 그 후 3일째에 CD90.1 양성(CD90.1+), CD90.2 음성(CD90.2-) 콘제닉 마우스로부터 생성한 1×106개의 상기 항인간 CD20 CAR 발현 T세포(Conv.) 혹은 상기 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(7×19)를 정맥내 투여했다. 28일째에, 비장 세포를 채취하여 다음 해석에 이용했다.
도너 T세포는 CD90.1 양성 세포(CD90.1+), 리시피언트 T세포는 CD90.2 양성 세포(CD90.2+)로 동정했다. CD4 양성 및 CD8 양성 T세포에서의 메모리 T세포 마커(CD44 및 CD62L) 및 CAR의 발현은 유세포 분석으로 수행했다. 점 도표(dot plot) 또는 히스토그램의 수치는 각각의 게이트에서의 세포의 비율을 나타낸다. 결과를 도 3에 나타낸다.
또한, 메모리화 기능, 즉 자극에 대한 반응성 획득을 IFN-γ의 생산에 의해 조사했다. 우선, 28일째에 채취한 비장 세포를 마이토마이신 C(쿄와하코키린사(Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) 제품)로 90분, 37℃에서 처리한 3LL-hCD20 또는 hCD20을 발현하지 않은 그 친주 3LL과 공배양하여 자극했다. IFN-γ의 생산은 세포내 사이토카인 염색에 의해 조사했다. 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에서, (a)의 히스토그램에서의 수치는 CD90.1 양성 도너 T세포에서의 IFN-γ 포지티브 세포의 비율을 나타낸다. 도 4에서, (b)는 CD90.2 양성의 내재성 CD8 양성 T세포에서의 IFN-γ 양성 세포를 유세포 분석으로 검출한 결과를 나타낸다. 점 도표의 수치는 각각의 4분면에서의 세포의 비율을 나타낸다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 항인간 CD20 CAR 발현 T세포(Conv.)를 투여한 경우에는, CD90.2 게이트 세포(리시피언트의 내재성 T세포)에서 센트럴 메모리 T세포(메모리 T세포 마커인 CD44 양성 및 CD62L 양성 세포)가 CD4 양성 세포에서 5.5%, CD8 양성 세포에서 24.8%였다. 한편, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(7×19)를 투여한 경우에는, CD90.2 게이트 세포(리시피언트의 내재성 T세포)에서 센트럴 메모리 T세포가 CD4 양성 세포에서 6.76%, CD8 양성 세포에서 49.2%였으며, 모두 센트럴 메모리 T세포의 비율이 증가했다. 따라서, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(7×19)를 투여함으로써, 즉 IL-7과 CCL19를 하나의 세포로부터 분비시킴으로써, 리시피언트의 내재성 T세포를 활성화하는 동시에, 리시피언트의 내재성 T세포를 센트럴 메모리 T세포에 분화 유도하여, 센트럴 메모리 T세포의 수를 증가시키는 동시에 비장 세포군에서의 센트럴 메모리 T세포의 비율을 증가시킬 수 있다는 것이 명백해졌다. 다시 말하면, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포의 유도제나, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포의 증강제로서 이용할 수 있다는 것이 명백해졌다.
한편, CD90.1 게이트 세포(도너 T세포)에서 센트럴 메모리 T세포가 CD4 양성 세포에서 75.8%, CD8 양성 세포에서 90.7%였으며, 도너 T세포 자신도 센트럴 메모리 T세포에 유도되어 있는 것이 확인되었다. 아울러, Conv.에서 CD90.1 게이트 세포가 0%였으며, CD90.1 양성 세포가 검출되지 않은(n. d.) 것은, Conv.에서는 IL-7과 CCL19를 발현시키지 않아 CAR 발현 T세포의 생존율이 낮기 때문이다.
또한, 도 4에 나타내는 바와 같이, 3LL의 자극에 의해, 도너 세포에서 CD4 양성 세포에서는 90.5%, CD8 양성 세포에서는 93.6%가 IFN-γ를 생산했다. 또한, 리시피언트의 내재성 T세포(CAR-T 발현 없음)에서도, CD4 양성 세포에서 Conv.에서는 0.957%임에 반해, 7×19에서는 14.9%의 세포가 IFN-γ를 생산했다. 따라서, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에 의해 IL-7과 CCL19를 분비시킴으로써, 도너 T세포 및 리시피언트 세포가 모두 자극에 의해 IFN-γ를 생산하였으며, 메모리 기능을 획득했다는 것이 명백해졌다.
[실시예 4]
<T세포 수용체의 유전자 발현 패턴의 변화>
T세포의 에피토프 다양성을 조사하기 위해, CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 처리 전후의 T세포 수용체(TCR) 레퍼토리의 변화를 조사했다. DBA/2 마우스(n=5)에 5×105개의 P815-hCD20(인간 CD20을 발현하도록 유전자 재조합을 수행한 마우스 비만 세포종 P815)을 피하 접종했다(0일째). 그 후 10일째에 시클로포스파미드(CPA: 100mg/kg) 및 1×106개의 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 정맥내 투여하여 종양을 치료했다. P815 종양 세포 투여로부터 140일째에, 상기에 의해 종양을 치료하여 근치한 마우스(종양 거절 마우스: Tumor-rejected mice)로부터 비장 세포를 채취하고, 셀 소터(SH800: 소니사(Sony Corporation 제품)로 소트한 CAR 양성 T세포 또는 CAR 음성 T세포를 증식하기 위해 4일간 P815-hCD20 또는 hCD20을 발현하지 않은 친주(hCD20 음성: hCD20-) P815와 함께 배양했다. 그 후, TCR 레퍼토리 해석을 위해, CD8 양성 및 CAR 양성(CD8+CAR+) 또는 CD8 양성 및 CAR 음성(CD8+CAR-) 포퓰레이션을 유세포 분석기로 소트했다. 컨트롤로서, 마우스에 투입하기 전의 CD8 양성 및 CAR 양성, 또는 CD8 양성 및 CAR 음성 포퓰레이션을 소트했다. TCR 레퍼토리는 차세대 시퀀서로 해석하고, α 및 β사슬에서의 V 및 J 영역의 사용 빈도를 3-D 그래프로 나타냈다. 결과를 도 5a-d, 도 6a-d에 나타낸다. 도 5a-d는 α사슬, 도 6a-d는 β사슬이며, 또한 도 5a, b, 도 6a, b는 각 세포 투입 전, 도 5c, d, 도 6c, d는 각 세포 투입 후이다. 도면에서의 좌상의 수치는 1-Pielou 균등도 지수 (a higher number indicates a less diversity)로 산출한 diversity indexes를 나타내며, 수치가 낮을수록 다양성이 높은 것을 나타낸다.
아울러, T세포 수용체는 T세포의 세포막 위에 발현하고 있는 항원 수용체 분자이다. α사슬과 β사슬 또는 γ사슬과 δ사슬로 이루어지는 헤테로 이량체로서 존재하고 있으며, 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC) 분자에 결합한 항원 분자를 인식함으로써 T세포를 활성화하는 것이 알려져 있다.
도 5a-d, 도 6a-d에서의 diversity indexes로부터 명백한 바와 같이, α사슬, β사슬 모두 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 투여에 의해 diversity indexes 값이 증가했다. 따라서, 투여한 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포뿐만 아니라, 리시피언트의 내재성 T세포도 TCR의 다양성이 저하되었으며, 종양 국소에서 IL-7 및 CCL19를 분비하는 동시에 종양 세포를 파괴함으로써 종양 항원에 대해 메모리 기능을 갖는 것으로 생각되는 T세포가 선택적으로 증가했다는 것이 명백해졌다.
[실시예 5]
<종양의 재발 억제-1>
동물을 이용한 암 재발 모델을 다음 방법으로 수행했다. 우선, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포로 처리한 마우스에서, 리시피언트 T세포의 종양 특이적 메모리 응답을 조사했다. 7-10주령의 암을 가지고 있는 마우스(DBA/2:n=4: SLC사 제품)에 5×105개의 P815-hCD20을 피하 접종했다. 그 후 10일째에 항암제인 시클로포스파미드(CPA: 100mg/kg)를 복강내 투여했다. 14일째에, 1×106개의 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 정맥내 접종했다. P815-hCD20을 접종 후 140일째에, 종양을 치료하여 근치한 마우스(tumor-rejected mice) 또는 컨트롤의 나이브 마우스(naive mice)에 대해, P815-hCD20 또는 hCD20을 발현하지 않은 친주의 P815를 좌우 옆구리에 각각 접종했다. 종양의 부피는 2회/주 측정했다. 결과를 도 7a에 나타낸다. 또한, 상기 P815-hCD20 대신 3LL-hCD20 또는 hCD20을 발현하지 않은 친주의 3LL을 접종한 C57BL/6 마우스를 이용하여 동일한 해석을 수행했다. 결과를 도 7b에 나타낸다. 아울러, 친주의 P815 및 3LL은 인간 CD20을 발현하지 않기 때문에, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 세포 표면 분자가 특이적으로 인식하는 악성 종양 항원을 갖지 않는 악성 종양 세포가 된다.
도 7a에서의 가로축은 나이브 마우스에 대해서는 최초로 P815-hCD20 또는 P815를 투여한 날(0일)로부터의 일수, 종양을 치료하여 근치한 마우스에서는 최초 P815-hCD20 접종 후 140일째에 재차 P815-hCD20을 접종한 날(0일)로부터의 일수이다. 또한, 도 7b에서의 가로축은 나이브 마우스에 대해서는 최초로 3LL-hCD20 또는 3LL을 접종한 날(0일)로부터의 일수, 종양을 치료하여 근치한 마우스에서는 재차 3LL-hCD20을 접종한 날(0일)로부터의 일수이다. 도 7a, 7b에서의 세로축은 종양의 부피(mm3)이다.
도 7a, 7b의 하단에 나타내는 바와 같이, 종양을 치료하여 근치한 마우스(tumor-rejected mice)에서 P815-hCD20 또는 3LL-hCD20을 접종한 경우에는 종양이 형성되지 않았다. 즉, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포로 종양을 치료함으로써, CAR이 인식하는 항원을 갖는 종양 세포에서 기인하는 종양의 재발을 억제할 수 있다는 것이 명백해졌다. 또한, 놀랍게도, 도 7a, 7b의 상단에 나타내는 바와 같이, 종양을 치료하여 근치한 마우스에서 세포 표면에 CD20을 갖지 않는 친주의 P815 또는 3LL을 접종한 경우, 종양의 형성이 나이브 마우스와 비교해 현저히 억제되었다. 즉, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포로 처리함으로써, CAR이 인식하는 항원을 갖지 않는 종양 세포에서 기인하는 종양의 형성, 다시 말하면 CAR이 인식하는 항원을 갖지 않는 종양 세포에서 기인하는 종양 재발도 억제할 수 있다는 것이 명백해졌다. 이와 같이, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 투여함으로써 투여 대상의 면역 기능에 영향을 주어, CAR의 표적 항원을 발현하지 않은 친주의 종양에 대해서도 투여 대상은 장기적으로 계속해서 거절하여 재발을 억제하는 것에 대해서는, CAR-T세포의 표적 분자 특이적 반응성이라는 관점에서 예상 밖이었다. 상기 실시예 4에서의 T세포 수용체의 유전자 발현 패턴의 변화의 결과와 맞추어 보면, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 투여에 의해 종양 세포의 파괴가 일어나고, 그 결과로 종양 세포가 원래 갖는 종양 항원에 대해 리시피언트의 내재성 T세포가 반응하여, 장기 메모리 기능이 유도된 것으로 생각된다. 즉, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 투여에 의해 종양 세포를 파괴하는 동시에 종양 국소에서 IL-7 및 CCL19를 분비함으로써, 극히 효율적으로 Epitope Spreading 현상을 유도하고, 메모리 기능을 유도 및 증강함으로써 악성 종양의 재발을 억제하는 것으로 생각된다. 아울러, 상기 암 재발 모델에서는, 처음에 P815-hCD20, P815, 3LL-hCD20 및 3LL을 피하에 접종하고, 140일째에는 상기 각각의 세포를 좌우 옆구리에 각각 접종했다. 때문에, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 투여에 의해, 단순히 악성 종양의 재발을 억제했을 뿐만 아니라, 악성 종양의 전이를 억제한다고도 생각된다. 따라서, 항인간 CD20 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 '악성 종양 전이 억제제'로서도 이용 가능할 것으로 생각된다.
[실시예 6]
<종양의 재발 억제-2>
종양의 재발 억제 효과를 확인하기 위해, 인간 악성 흉막 중피종 세포주를 마우스에 투여하여 종양을 형성시키고, 그 후 항인간 메소텔린 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 투여 유무에 따른 143일간의 종양 재발 유무를 조사했다. 구체적인 실험 프로토콜을 도 8에 나타낸다. 또한, 도 8에서의 'ACC-MESO1-GFP-Luc', '항메소텔린 CAR 발현 T세포', '항메소텔린 CAR 발현 T세포'의 조제 방법, T세포의 활성화 방법은 이하와 같다.
(ACC-MESO1-GFP-Luc주의 제작)
아이치현 암센터 연구소 세키도 요시타카 선생님에게서 분여 받은 메소텔린 양성 종양 세포주인 인간 악성 중피종 세포주 ACC-MESO1에 렌티바이러스를 이용해 녹색 형광 단백질-루시페라아제(GFP-Luc)의 유전자 도입을 수행했다.
day 0에 96 well plate에 1×103 cells/well로 ACC-MESO1을 파종했다. 배지는 10% FBS 첨가 RPMI1640(Gibco사 제품)을 사용했다. day 1에 발광 세포 제작용 렌티바이러스 입자인 RediFect Red-FLuc-GFP(PerkinElmer사 제품)를 MOI 100으로 가해 형질 도입을 시작했다. 그 때 유전자 도입 효율을 높이기 위해, Hexadimethrine Bromide(Sigma-aldrich사 제품)를 최종 농도 4μg/mL가 되도록 배지에 가했다. 바이러스 첨가 24시간 후(day 2)에 바이러스를 포함하는 배지를 제거하고 배지의 교환을 수행했다. 배양 계속 후, GFP를 발현하는 세포만을 SH800(SONY사 제품)으로 소팅하여, ACC-MESO1-GFP-Luc주로 했다.
(항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포 및 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포의 제작)
항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포 및 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포(conventional CAR 발현 T세포)는 일본 특허출원 제2017-247109호 및 국제 공개 제2016/056228호 팜플렛에 기재된 방법을 바탕으로 제작했다. 간결하게 기재하면, 서열 번호 3에 나타내는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 서열 번호 4에 나타내는 링커의 아미노산 서열과 서열 번호 5에 나타내는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열로 이루어지는 항인간 메소텔린 단일사슬 항체, 인간 CD8 막 관통 영역 및 인간 CD28-4-1BB-CD3ζ 세포내 시그널 모티프를 순차 구비한 제3세대 CAR 컨스트럭트(서열 번호 6)를 제작했다. 이와 같은 컨스트럭트의 C말단에 서열 번호 1에 나타내는 인간 IL-7과, 이에 계속되는 서열 번호 7에 나타내는 피코르나바이러스 유래의 2A 펩타이드(F2A), 서열 번호 2에 나타내는 인간 CCL19, 및 헤르페스 바이러스 유래 티미틴 키나아제 유전자(HSV-tk)를 순차 구비한 컨스트럭트를 제작하고, pMSGV1 레트로바이러스 발현 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))에 삽입하여 인간 IL-7/CCL19 및 HSV-tk를 발현하는 pMSGV1 레트로바이러스 발현 벡터를 제작했다. 얻어진 pMSGV1 레트로바이러스 발현 벡터를 레트로바이러스에 의해 마우스 T세포에 도입하여 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포를 제작했다. 마찬가지로, 상기 인간 IL-7/CCL19 및 HSV-tk를 발현하는 pMSGV1 레트로바이러스 발현 벡터 대신 상기 항인간 메소텔린 단일사슬 항체, 인간 CD8 막 관통 영역 및 인간 CD28-4-1BB-CD3ζ 세포내 시그널 모티프를 순차 구비한 제3세대 CAR 컨스트럭트를 발현하는 pMSGV1 레트로바이러스 발현 벡터를 레트로바이러스에 의해 마우스 T세포에 도입하여 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포(conventional 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포)를 제작했다. 시그널 펩타이드는 서열 번호 8에 나타내는 시그널 펩타이드를 이용했다.
(T세포의 활성화)
day 0에 정상인 도너로부터 채취한 2×106개의 말초혈 단핵구를 레트로네크틴 25μL/mL(타카라 바이오사 제품)와, 항인간 CD3 단일 클론 항체 5μg/mL(invitrogen사 제품, 5μg/mL)를 고층화시킨 세포 배양용 6 well 플레이트에서, IL-2 200IU/mL(Peprotech사 제품)와 함께 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양을 시작했다. 배양액에는 OpTmizer CTS(Gibco사 제품)에 L-글루타민 2mM(Gibco사 제품), 1% 페니실린-스트렙토마이신(와쿄쥰야쿠코교사(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 제품) 및 훈기존(Fungizone) 2.5μg/mL(브리스톨 마이어스 스퀴브사(Bristol-Myers Squibb Company) 제품)를 가한 것을 이용했다. 3일간 배양하고, day 3에 T세포가 활성화되어 형태 변화가 일어난 것을 현미경하에서 확인했다.
(종양의 재발 관찰)
우선, day 0에 8주령의 암컷 NSG 면역 부전 마우스에 대해 2×106 cells/mouse로 상기 ACC-MESO1-GFP-Luc를 흉강내 투여했다. day 1에 In vivo 이미징 시스템(in vivo imaging system: IVIS)을 이용하여 흉강내에의 종양 생착을 확인했다. day 1에 정상 도너의 말초혈 단핵 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cells: PBMC)로부터 제작하여 동결 보존한 상기 conventional CAR 발현 T세포, 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포 및 상기 방법으로 활성화한 T세포를 해동했다. 상기 conventional 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포와 상기 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포의 CAR 발현율은 각각 49.6%, 32.5%였기 때문에, conventional 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포에 상기 활성화 T세포를 가하고 양자의 CAR 발현율을 맞춘 후, 1×105 cells의 상기 conventional 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포를 투여하는 군(N=5), 1×105 cells의 상기 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포를 투여하는 군(N=5)을 준비했다. conventional 항인간 메소텔린 CAR 발현 T세포 및 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포의 투여는 꼬리 정맥에서 정맥내 투여로 수행했다. 또한, day 3 이후, IVIS를 이용한 종양 형광 강도의 측정(발광량: Total Flux(photons/sec)을 수행했다. 결과를 도 9a, b에 나타낸다. 또한, 상기 결과에서의 투여로부터의 일수와 마우스의 생존율의 관계를 그래프화한 것을 도 10에, 투여로부터의 일수와 토탈 형광량(photons/second)의 관계를 그래프화한 것을 도 11에 나타낸다. 도 9a, b, 도 10 및 도 11에서, 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포를 투여한 것을 '7×19 CAR-T'로 나타내고, conventional 항메소텔린 CAR 발현 T세포를 투여한 것을 'Conventional CAR-T'로 나타냈다. 아울러, 본 실시예 6에서는 내재성 T세포가 결손되어 있는 NSG 면역 부전 마우스를 리시피언트로서 사용했기 때문에, 리시피언트의 내재성 T세포의 영향은 제거되어 있으며, 투여한 항인간 메소텔린 CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포 자체의 효과를 평가하게 된다.
도 9a, b, 도 10 및 도 11에 나타내는 바와 같이, day 21 무렵에는 7×19 CAR-T, Conventional CAR-T 모두 종양 형광 강도가 거의 관찰되지 않았다. 7×19 CAR-T에서는, 그 후 day 143까지 종양 형광이 관찰되지 않아, 재발이 완전히 억제되고 있다는 것이 확인되었다. 한편, Conventional CAR-T에서는 day 45부근부터 종양 형광이 관찰되기 시작하여, day 115에는 종양 형광 강도가 높아지고, day 129에는 1마리 사망하였으며, day 143에는 나머지 4마리도 사망했다. 따라서, CAR-IL-7-CCL19 발현 T세포의 투여, 즉 종양 국소에서 IL-7 및 CCL19를 분비하는 동시에 종양 세포를 파괴함으로써 악성 종양의 재발을 억제할 수 있다는 것이 명백해졌다.
[실시예 7]
<리시피언트의 내재성 T세포의 메모리화>
상기에서는 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자로서 CAR을 갖는 T세포를 이용했지만, CAR 대신 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자로서 T세포 수용체(TCR)를 갖는 T세포를 이용하여 리시피언트의 내재성 T세포의 메모리화를 조사했다.
(P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포의 제작)
P815의 종양 항원인 P1A에 특이적인 TCR, 마우스 IL-7, 마우스 CCL19 및 GFP를 발현하는 T세포의 제작은 상기 특허 문헌 3에 기재된 방법에 준거하여 수행했다. 간결히 기재하면 이하와 같다.
마우스 IL-7(정지 코돈 없음)과 이에 계속되는 피코르나바이러스 유래의 2A 펩타이드(F2A), 마우스 CCL19를 코딩하는 IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편을 인공 합성했다(라이프 테크놀로지(Life Technologies)사 제품). 상기에서 합성한 IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편을, F2A-eGFP 서열을 갖는 pMSGV 레트로바이러스 발현 벡터(상기 특허 문헌 3)의 멀티 클로닝 사이트에 제한 효소(NCOI 및 ECORI) 처리 및 라이게이션에 의해 삽입하여, IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP DNA 단편(서열 번호 9)을 포함하는 pMSGV 벡터(IL-7×CCL19-eGFP 발현 벡터)를 얻었다. 또한, 컨트롤로서 eGFP를 포함하고, IL-7 및 CCL19를 포함하지 않는 pMSGV 벡터(eGFP 컨트롤 벡터)를 제작했다. 아울러, 서열 번호 9에서, 1~462번째 염기가 IL-7(1~75번째 염기는 IL-7의 시그널 서열), 463~537번째 염기가 F2A, 538~861번째 염기가 CCL19(538~612번째 염기는 CCL19의 시그널 서열), 868~942가 F2A, 946~1662번째 염기가 eGFP를 코딩하는 핵산, 1663~1665번째 염기가 정지 코돈이다.
Y. Liu로부터 입수한 H-2Ld 구속성 P815의 종양 항원인 P1A에 특이적인 TCR을 발현하는 트랜스제닉 마우스(Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X. -F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189:811.)로부터 비장 세포를 채취하고, 비장 세포 유래의 P815의 종양 항원인 P1A에 특이적인 TCR을 발현하는 마우스 T세포(P1A 특이적 TCR-T세포)를 얻었다. 그 다음, IL-7×CCL19-eGFP 발현 벡터 및 eGFP 컨트롤 벡터를 도입한 레트로바이러스를 제작하고, 상기 P1A 특이적 TCR-T세포를 포함하는 비장 세포(3×106개/웰)를 P1A 펩타이드로 48시간 활성화한 세포에 형질 도입하여, P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포(7×19 P1A-CTL) 또는 P1A 특이적 TCR/eGFP 발현 T세포(conv. P1A-CTL)를 얻었다. 각 발현 벡터의 형질 도입은 서로게이트 마커(surrogate marker)로서 eGFP를 검출하는 유세포 분석 해석에 의해 확인했다. 얻어진 각각의 T세포의 eGFP의 발현 레벨은 모든 실험에서 70~80%였다.
P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포 또는 P1A 특이적 TCR/eGFP 발현 T세포 각각으로 마우스를 처리한 경우의 비장 세포에서의 CD8+GFP+ 세포의 비율 및 CD8+GFP+ 세포 절대수를 유세포 분석으로 해석한 결과를 도 12 (a), (b)에 나타낸다. 비장 세포에서 P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포로 처리한 경우에는, CD8+GFP+ 세포의 비율 및 CD8+GFP+ 세포 절대수가 증가한 것이 확인되었다.
그 다음, naive BDA/2 마우스의 CD8+ 비장 세포 및 P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포로 처리한 마우스의 CD8+GFP- 또는 CD8+GFP+ 비장 세포에서의 CD44의 발현을 유세포 분석으로 해석한 결과를 도 13 (a), (b)에 나타낸다. 도 13 (a)는 대표적인 CD44+ 세포의 세포수, 도 13 (b)는 CD44+ 세포의 비율을 나타낸다. 도 13 (a), (b)에 나타내는 바와 같이, 투여한 T세포(GFP+ gated)뿐만 아니라, 리시피언트의 내재성 T세포(GFP- gated)도 CD44+의 비율이 naive T세포와 비교해 2배 이상 증가했다. 따라서, P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포는 리시피언트의 내인성 T세포를 메모리화하는 작용, 즉 리시피언트의 내인성 T세포의 메모리 기능을 유도하여, 리시피언트의 내인성 T세포의 메모리 기능을 증강하는 작용을 갖는 것이 확인되었다.
또한, 메모리화의 기능, 즉 자극에 대한 반응성 획득을 확인하기 위해, IFN-γ의 생산에 의해 조사했다. T세포를 비장 세포로부터 자기(磁氣)로 단리하고, P815로 처리한 점막형 비만 세포(Mucosal mast cell: MMC)와 5일간 정도 공배양했다. 배지의 상청 내 IFN-γ의 농도를 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)에 의해 검출한 결과를 도 14에 나타낸다. 도 14에 나타내는 바와 같이, P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포는 IFN-γ의 생산이 많은 것이 확인되었다. 따라서, P1A 특이적 TCR/IL-7/CCL19/eGFP 발현 T세포는 리시피언트의 내재성 T세포의 항종양 활성을 향상시키는 것이 확인되었다. 이로부터, 리시피언트에서 재발 억제 효과를 유도하는 것으로 생각되었다.
[실시예 8]
<IL-7 및 CCL19를 발현하는 바이러스>
상기에서는 핵산 송달 매체로서 면역 담당 세포를 이용했으나, 종양 국소에 IL-7 및 CCL19가 분비되면 면역 담당 세포를 이용하지 않아도 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포를 증강하는 것이나, 악성 종양 재발을 억제하는 것이 가능할 것이다. 이에, 핵산 송달 매체로서 면역 담당 세포 대신 바이러스를 이용하여 해석을 수행했다.
(마우스 IL-7 및 마우스 CCL19를 발현하는 유전자 재조합 백시니아 바이러스의 제작)
마우스 IL-7 및 마우스 CCL19를 발현하는 유전자 재조합 백시니아 바이러스는 상기 특허 문헌 3 및 국제 공개 제2011/125469호 팜플렛에 기재된 방법에 준거하여, 이하의 방법으로 제작했다. pTagBFP-N 벡터(FP172, Evrogen사)의 DNA를 주형으로 하여, 2개의 프라이머(5'-ATG GCC GGA CCG GCC ACC GGT CGC CAC CAT GAG CGA G-3': 서열 번호 10)와 (5'-TCG AAT TCG CTA GCG GCC GCT TAA TTA AGC TTG TGC CCC AG-3': 서열 번호 11)에 의해, 청색 형광 단백질(Blue Fluorescent Protein: BFP) 유전자 영역을 증폭했다. 그 PCR 산물을 제한 효소 SfiI와 EcoRI로 절단하고, 이를 pTK-SP-LG 벡터(국제 공개 제2011/125469호 팜플렛)의 동일한 제한 효소 부위에 클로닝하여, 합성 백시니아 바이러스 프로모터(Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66(1):135-138)하에 BFP를 연결한 pTK-SP-BFP를 구축했다. 그 다음, pAmCyan1-N1 벡터(타카라 바이오사 제품)를 제한 효소 AgeI와 NotI로 절단하고, 그 형광 단백질 AmCyan1 단편을 pTK-SP-BFP의 동일한 제한 효소로 처리한 부위에 클로닝하여, pTK-SP-AmCyan1을 구축했다.
마우스 IL-7과 이에 계속되는 피코르나바이러스 유래의 2A 펩타이드(F2A), 마우스 CCL19, F2A, eGFP를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 pMSGV 플라스미드(상기 특허 문헌 3)를 제한 효소 BamHI로 절단하고 Blunt 처리 후, NcoI로 절단하여 얻은 마우스 IL-7-F2A-마우스 CCL19-F2A-eGFP 단편을, pTK-SP-AmCyan1을 제한 효소 NheI로 절단하고 Blunt 처리 후, NcoI로 절단한 부위에 클로닝하여, 트랜스퍼 벡터 플라스미드 pTK-SP-마우스 IL-7-F2A-마우스 CCL19-F2A-eGFP를 구축했다.
pGL4.20(프로메가사(Promega Corporation) 제품)의 DNA를 주형으로 하여, 2개의 프라이머(5'-GCT CCG GAC GCC ACC ATG GAA GAT GCC AAA AAC-3'(서열 번호 12)와 5'-GCG AAT TCC ACG GCG ATC TTG CCG CCC TTC T-3'(서열 번호 13))에 의해 반딧불이 루시페라제 유전자 영역을 증폭했다. 그 PCR 산물을 제한 효소 BspEI 및 EcoRI로 절단하여 얻은 Luc 단편, 및 pTK-SP-마우스 IL-7-F2A-마우스 CCL19-F2A-eGFP를 제한 효소 EcoRI와 BsrGI로 절단하여 얻은 eGFP의 일부를 포함하는 단편을 동시에, pTK-SP-마우스 IL-7-F2A-마우스 CCL19-F2A-eGFP를 제한 효소 BspEI와 BsrGI로 절단한 부위에 클로닝하여, 트랜스퍼 벡터 플라스미드 pTK-SP-Luc-F2A-eGFP를 구축했다.
도 15 (a), (b)에 나타내는 바이러스 게놈을 갖는 재조합 백시니아 바이러스의 회수를 위해, 6 well 디쉬에 80% 컨플루언트(confluent)로 배양된 CV1 세포에 백시니아 바이러스(LC16mO)를 MOI=0.02~0.1로 감염시키고, 실온에서 1시간 흡착 후, FuGENE HD(프로메가사 제품)와 혼합한 트랜스퍼 벡터 플라스미드 DNA(pTK-SP-마우스 IL-7-F2A-마우스 CCL19-F2A-eGFP 또는 pTK-SP-Luc-F2A-eGFP)를 메뉴얼에 따라 세포에 첨가하여 편입시키고, 37℃에서 2~5일간 배양했다. 세포를 회수하여 동결 융해 후, 소니케이션(sonication) 처리하고, 거의 컨플루언트된 BSC1 세포에 적절히 희석하여 접종하고, 0.8% 메틸셀룰로오스를 포함하는 Eagle MEM, 5% FBS 배지를 가하고, 37℃에서 2~5일간 배양했다. 배지를 제거하고, BFP 발현 플라크를 팁의 끝으로 긁어내, Opti-MEM 배지(Invitrogen사 제품)에 부유시켰다. BSC1 세포로 다시 3회 이상 이 조작을 반복하여, 플라크 순화했다. 플라크 순화 후에 채취한 플라크 부유액을 소니케이션 후, 그 200μL로부터 High Pure Viral Nucleic Acid Kit(Roche사 제품)를 이용해 메뉴얼에 따라 게놈 DNA를 추출하고, PCR에 의한 스크리닝에 제공했다. 2개의 프라이머(5'-ATT TCT CCG TGA TAG GTA TCG ATG-3'(서열 번호 14)와 5'-AAC GGT TTA CGT TGA AAT GTC C-3' 서열 번호 15)에 의해 PCR를 수행하고, 소정 크기의 PCR 프로덕트가 검출된 클론에 대해, PCR 프로덕트의 염기 서열을 다이렉트 시퀀스에 의해 확인했다. 염기 서열에 문제가 없는 바이러스 클론을 선택하여, A549 세포로 증폭시킨 후, RK13 세포로 바이러스 역가(virus titer)를 측정하고, 유전자 재조합 백시니아 바이러스 LC16mO TK-SP-마우스 IL-7-F2A-마우스 CCL19-F2A-eGFP(TK-ICE: 도 15 (a)) 또는 LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP(TK-LE: 도 15 (b))로서 이하의 실험에 제공했다.
A549 세포(1×105 세포/well) 또는 CT26 세포(5×104 세포/well)를 24 well 플레이트에 파종하여 37℃ 배양 후, TK-ICE 또는 TK-LE를 A549 세포 MOI=0.1 또는 CT26 세포 MOI=10으로 각각 감염시키고(n=3), 감염으로부터 24, 48, 72시간 후에 세포를 형광 현미경(올림푸스사 제품)으로 관찰을 수행하고(도 16), 상청을 회수했다. 각 24, 48, 72시간 후에 회수한 상청을 100배 희석하고, DuoSet ELISA Mouse IL-7(R&D Systems사 제품 DY407), DuoSet ELISA Mouse CCL-19(R&D Systems사 제품 DY440) 및 DuoSet Ancillary Reagent Kit2(R&D Systems사 제품 DY008)에 의해 상청 0.5mL 내의 IL-7 및 CCL19의 분비량을 측정했다. 측정 결과를 도 17에 나타낸다.
도 16, 17에 나타내는 바와 같이, 감염 24, 48, 72시간의 A549 세포 및 CT26 세포에서의 eGFP 형광 발현은 TK-ICE와 TK-LE에서 동일한 정도였으며, A549 세포에서는 감염 48시간 후에는 거의 모든 세포에서 검출되었고, CT26 세포에서는 시간이 경과함에 따라 eGFP 형광의 발현이 증가했다. 또한, A549 세포 및 CT26 세포에서, TK-ICE를 감염시킨 경우에는 감염 24시간 후부터 IL-7 및 CCL19는 검출되었고, A549 세포에서는 감염 48시간 후에는 거의 플래토(plateau)에 이르렀으며, CT26 세포에서는 시간이 경과함에 따라 상승했다. 한편, TK-LE를 감염시킨 경우에는 IL-7 및 CCL19는 검출 한계 이하였다. 상기 결과로부터, TK-ICE는 종양 세포를 파괴하는 동시에, IL-7, CCL19를 분비하는 것이 확인되었다.
[실시예 9]
<항종양 효과>
상기 실시예 8에 의해, 상기에서 제작한 유전자 재조합 백시니아 바이러스 TK-ICE는 종양 세포에 감염하여 암세포를 파괴하는 동시에, IL-7 및 CCL19를 분비하는 것이 확인되었다. 이에, 유전자 재조합 백시니아 바이러스 TK-ICE의 항종양 효과를 조사했다.
도 18에 나타내는 바와 같이 마우스 대장암 CT26 세포(5×105 세포)를 BALB/c마우스의 양복부의 피하에 이식해 성장시켰다. 그 다음, 각 유전자 재조합 백시니아 바이러스(3-5×107 플라크 형성 단위(PFU))를 총 3회(0, 2, 4일), 양복부에 형성한 종양 중 큰 것을 선택하여, 그 선택한 종양 내에 투여하고, 이후 양복부의 종양 지름 측정에 의해 바이러스의 항종양 효과를 검토했다. 아울러, 1회째 투여 전의 투여측 종양은 43~102mm3, 비투여측 종양은 24~82mm3였다. 결과를 도 19에 나타낸다.
도 19의 결과로부터, IL-7과 CCL19를 발현하지 않는 TK-LE 투여군(N=7)에서는, PBS 투여군(N=8)에 비해 투여측 종양에서는 종양의 증식을 억제하고 있었지만, 비투여군에서는 종양에 대한 억제 효과는 보이지 않았다. 이에 반해, IL-7 및 CCL19를 발현하는 TK-ICE 투여군(N=4)에서는, PBS 투여군(N=4)에 비해 투여측 종양뿐만 아니라 비투여측 종양에서도 종양 증식의 억제가 보였다. 아울러, 도시하지 않았지만, TK-LE가 감염한 종양 세포에서 발현하는 발광 효소(루시페라아제)를, 기질(루시페린)을 투여하여 발광 유무를 확인함으로써 비침습적으로 바이러스를 검출하는 방법에 의해, 한쪽 배측의 종양에 투여한 유전자 재조합 백시니아 바이러스가 다른쪽 배측의 종양까지 이동하는 일은 없다는 것을 확인했다. 따라서, TK-ICE에 의한 종양 세포의 파괴와 함께 종양 국소에서의 IL-7 및 CCL19의 분비에 의해, 투여 대상의 종양 면역이 야기되는 동시에 내재성 T세포의 메모리 기능이 증강됨으로써, 투여측 종양의 소실뿐만 아니라 비투여측 종양의 증식 억제가 확인되어, 해당 악성 종양의 재발을 억제하는 것으로 생각된다.
<110> YAMAGUCHI UNIVERSITY NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOTTORI UNIVERSITY <120> Enhancer of T cells or B cells with memory function, inhibitor of malignant tumor recurrence, and inducerr of T cells or B cells with memory function <130> 20IC20021 <150> JP 2017-196718 <151> 2017-10-10 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IL-7 AA <400> 1 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe 50 55 60 Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe 65 70 75 80 Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 85 90 95 Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala 115 120 125 Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu 130 135 140 Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu 145 150 155 160 Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu 165 170 175 His <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CCL19 AA <400> 2 Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser 20 25 30 Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr 35 40 45 Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr 50 55 60 Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu 65 70 75 80 Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg 85 90 95 Ser Ser <210> 3 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH07_aa <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 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Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu 100 105 110 Thr Val Leu Ser 115 <210> 6 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD8-hCD28-h4-1BB-hCD3 <400> 6 Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 35 40 45 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 50 55 60 Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn 65 70 75 80 His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 85 90 95 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 100 105 110 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val 115 120 125 Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 130 135 140 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 145 150 155 160 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser 165 170 175 Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr 180 185 190 Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys 195 200 205 Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn 210 215 220 Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu 225 230 235 240 Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 245 250 255 His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr 260 265 270 Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 275 280 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A_aa <400> 7 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide_aa <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala 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Claims (20)

  1. 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포, 바이러스, 혐기성 균, 리포좀, 간엽계 줄기세포(MSC) 및 나노 입자로부터 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포로의 집적능 또는 악성 종양 세포에서 특이적인 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포 상해능을 갖는 것을 특징으로 하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포이고, 상기 면역 담당 세포가 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 것을 특징으로 하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자가 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T세포 수용체(TCR)인 것을 특징으로 하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 면역 담당 세포가 T세포인 것을 특징으로 하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포가 센트럴 메모리 T세포인 것을 특징으로 하는, 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 투여 대상에서의 메모리 기능을 갖는 T세포 또는 B세포의 증강제와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 의약 조성물.
  10. 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 포함하는 악성 종양 재발 억제제.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포, 바이러스, 혐기성 균, 리포좀, 간엽계 줄기세포(MSC) 및 나노 입자로부터 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 하는 악성 종양 재발 억제제.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포로의 집적능 또는 악성 종양 세포에서 특이적인 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는 악성 종양 재발 억제제.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포 상해능을 갖는 것을 특징으로 하는 악성 종양 재발 억제제.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 면역 담당 세포이고, 상기 면역 담당 세포가 악성 종양 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 것을 특징으로 하는 악성 종양 재발 억제제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 악성 종양 세포 항원을 인식하는 세포 표면 분자를 갖는 면역 담당 세포이며, 상기 악성 종양 재발이 상기 세포 표면 분자가 특이적으로 인식하는 악성 종양 항원을 갖지 않는 악성 종양 세포에서 기인하는 악성 종양 재발인 것을 특징으로 하는 악성 종양 재발 억제제.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 악성 종양 세포 항원을 인식하는 세포 표면 분자가 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T세포 수용체(TCR)인 것을 특징으로 하는 악성 종양 재발 억제제.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 담당 세포가 T세포인 것을 특징으로 하는 악성 종양 재발 억제제.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 핵산 송달 매체가 종양 용해성 바이러스인 것을 특징으로 하는 악성 종양 재발 억제제.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 악성 종양 재발 억제제와 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 의약 조성물.
  20. 핵산 송달 매체, 인터루킨 7(IL-7)을 코딩하는 핵산 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19)를 코딩하는 핵산을 포함하는, 투여 대상에서의 T세포 또는 B세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제.
KR1020207009950A 2017-10-10 2018-10-09 메모리 기능을 갖는 t세포 또는 b세포의 증강제, 악성 종양 재발 억제제 및 t세포 또는 b세포에 메모리 기능을 유도하는 유도제 KR20200068661A (ko)

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