ES2966353T3 - Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes. - Google Patents
Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes.Info
- Publication number
- ES2966353T3 ES2966353T3 ES21152134T ES21152134T ES2966353T3 ES 2966353 T3 ES2966353 T3 ES 2966353T3 ES 21152134 T ES21152134 T ES 21152134T ES 21152134 T ES21152134 T ES 21152134T ES 2966353 T3 ES2966353 T3 ES 2966353T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleotide
- nucleotides
- labeled
- integer
- compounds
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 110
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 205
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 157
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 46
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 41
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 7
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 claims description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 6
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 27
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 106
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 65
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 65
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 description 40
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 34
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 30
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 26
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 26
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 26
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 26
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 25
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 24
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 24
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 24
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 24
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 21
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 101100173048 Mus musculus Mcat gene Proteins 0.000 description 20
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 18
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 14
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 238000003491 array Methods 0.000 description 8
- -1 nucleotide compound Chemical class 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 6
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 6
- MMNTZXRQPVRSSO-UHFFFAOYSA-N sulfamoylformic acid Chemical compound NS(=O)(=O)C(O)=O MMNTZXRQPVRSSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XNEPBOLHXBNNAO-UHFFFAOYSA-N 4-(2,3-dimethylindol-3-yl)butane-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCCS(O)(=O)=O)(C)C(C)=NC2=C1 XNEPBOLHXBNNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CNPIVEYAEOWQKB-UHFFFAOYSA-N 4-(3-bromopropoxy)phenol Chemical compound OC1=CC=C(OCCCBr)C=C1 CNPIVEYAEOWQKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 3
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZLRRTYBGLZDJC-UHFFFAOYSA-O OC1=CC=C(OCCC[N+]2=C(C(C3=CC=CC=C23)(C)C)C)C=C1 Chemical compound OC1=CC=C(OCCC[N+]2=C(C(C3=CC=CC=C23)(C)C)C)C=C1 WZLRRTYBGLZDJC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- DXGTUUQHTDOFFQ-UHFFFAOYSA-N [N].C1=CC=C2NC=CC2=C1 Chemical group [N].C1=CC=C2NC=CC2=C1 DXGTUUQHTDOFFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 208000015707 frontal fibrosing alopecia Diseases 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N methanol-d1 Chemical compound [2H]OC OKKJLVBELUTLKV-VMNATFBRSA-N 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- WPPDXAHGCGPUPK-UHFFFAOYSA-N red 2 Chemical compound C1=CC=CC=C1C(C1=CC=CC=C11)=C(C=2C=3C4=CC=C5C6=CC=C7C8=C(C=9C=CC=CC=9)C9=CC=CC=C9C(C=9C=CC=CC=9)=C8C8=CC=C(C6=C87)C(C=35)=CC=2)C4=C1C1=CC=CC=C1 WPPDXAHGCGPUPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 125000005017 substituted alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004426 substituted alkynyl group Chemical group 0.000 description 2
- HXJUTPCZVOIRIF-UHFFFAOYSA-N sulfolane Chemical compound O=S1(=O)CCCC1 HXJUTPCZVOIRIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- VEFLKXRACNJHOV-UHFFFAOYSA-N 1,3-dibromopropane Chemical compound BrCCCBr VEFLKXRACNJHOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBFCBQMICVOSRW-UHFFFAOYSA-N 1-phenylindole Chemical group C1=CC2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 YBFCBQMICVOSRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIYWOHBEPVGIQN-UHFFFAOYSA-N 1h-benzo[g]indole Chemical class C1=CC=CC2=C(NC=C3)C3=CC=C21 HIYWOHBEPVGIQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- LLTDOAPVRPZLCM-UHFFFAOYSA-O 4-(7,8,8,16,16,17-hexamethyl-4,20-disulfo-2-oxa-18-aza-6-azoniapentacyclo[11.7.0.03,11.05,9.015,19]icosa-1(20),3,5,9,11,13,15(19)-heptaen-12-yl)benzoic acid Chemical compound CC1(C)C(C)NC(C(=C2OC3=C(C=4C(C(C(C)[NH+]=4)(C)C)=CC3=3)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)=C1C=C2C=3C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 LLTDOAPVRPZLCM-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000004203 4-hydroxyphenyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FIZOAOKWJAZVQL-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-6-oxoheptane-1-sulfonic acid Chemical compound CC(=O)C(C)CCCCS(O)(=O)=O FIZOAOKWJAZVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SPVLESLQKJWHFH-UHFFFAOYSA-N Cl.O=CCC=O.NC1=CC=CC=C1.NC1=CC=CC=C1 Chemical compound Cl.O=CCC=O.NC1=CC=CC=C1.NC1=CC=CC=C1 SPVLESLQKJWHFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910006074 SO2NH2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005157 alkyl carboxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005227 alkyl sulfonate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- ZQUVDXMUKIVNOW-UHFFFAOYSA-N n,n'-diphenylmethanimidamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC=NC1=CC=CC=C1 ZQUVDXMUKIVNOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- 150000003003 phosphines Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical class [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
- C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
- C07D209/08—Indoles; Hydrogenated indoles with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
- C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/08—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines
- C09B23/083—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines five >CH- groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/10—The polymethine chain containing an even number of >CH- groups
- C09B23/105—The polymethine chain containing an even number of >CH- groups two >CH- groups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/102—Multiple non-interacting labels
Abstract
La presente divulgación se refiere a nuevos compuestos y su uso como marcadores fluorescentes. Los compuestos pueden usarse como marcadores fluorescentes para nucleótidos en aplicaciones de secuenciación de ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes
La presente descripción se refiere a los nuevos compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes. En particular, los compuestos pueden usarse como etiquetas fluorescentes para nucleótidos en solicitudes de secuenciación de ácido nucleico.
Antecedentes
Se hace referencia a varias publicaciones y documentos de patente en esta solicitud con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la cual pertenece esta descripción.
La detección no radiactiva de ácidos nucleicos utilizando marcadores fluorescentes es una tecnología importante en biología molecular. Muchos procesos empleados en la tecnología de ADN recombinante dependían anteriormente en gran medida del uso de nucleótidos o polinucleótidos marcados radiactivamente con, por ejemplo, P32 Los compuestos radiactivos permiten la detección sensible de ácidos nucleicos y otras moléculas de interés. Sin embargo, existen serias limitaciones en el uso de isótopos radiactivos, tal como su gasto, vida útil limitada y, lo más importante consideraciones de seguridad. Al eliminar la necesidad de marcadores radiactivos se mejora la seguridad mientras que se reduce el impacto ambiental y los costos asociados con, por ejemplo, la eliminación de reactivos. Los métodos susceptibles de detección fluorescente no radioactiva incluyen, por medio de ejemplo no limitante, secuenciación automática de ADN, métodos de hibridación, detección en tiempo real de productos de la reacción en cadena de la polimerasa e inmunoensayos.
Para muchas solicitudes, es conveniente emplear múltiples marcadores fluorescentes espectralmente distinguibles con el fin de lograr la detección independiente de una pluralidad de analitos superpuestos espacialmente. En tales métodos múltiples, el número de recipientes de reacción puede reducirse, al simplificar los protocolos experimentales y facilitar la producción de kits de reactivos específicos de la aplicación. En la secuenciación de ADN automatizada de múltiples colores, por ejemplo, la detección fluorescente múltiple permite el análisis de múltiples bases de nucleótidos en un solo carril de electroforesis, de esta manera aumenta el rendimiento sobre los métodos de un solo color y reduce las incertidumbres asociadas con las variaciones de movilidad electroforética entre carriles.
Sin embargo, la detección fluorescente múltiple puede ser problemática y existen una serie de factores importantes que restringen la selección de marcadores fluorescentes. Primero, puede ser difícil encontrar compuestos colorantes cuyos espectros de emisión se resuelvan espectralmente de forma adecuada en una solicitud dada. Además, cuando se usan varios colorantes fluorescentes juntos, para generar señales de fluorescencia en regiones espectrales distinguibles por excitación simultánea puede ser difícil, porque las bandas de absorción de los colorantes que pueden usarse para esto, generalmente están ampliamente separadas, por lo que es difícil lograr más o menos la eficiencia de excitación de fluorescencia igual incluso para dos colorantes. Muchos métodos de excitación usan fuentes de luz de alta energía como láseres y, por lo tanto, el colorante debe tener suficiente fotoestabilidad para resistir dicha excitación. Una consideración final de particular importancia en los métodos de biología molecular es la medida en la cual los colorantes fluorescentes deben ser compatibles con la química de los reactivos usados, tal como por ejemplo disolventes y reactivos de síntesis de ADN, tampones, enzimas polimerasas y enzimas ligasas.
A medida que la tecnología de secuenciación avanza, se ha desarrollado la necesidad de compuestos colorantes fluorescentes adicionales, sus conjugados de ácido nucleico y conjuntos de colorantes que satisfagan todas las restricciones anteriores y que sean particularmente adecuados para los métodos moleculares de alto rendimiento, tales como la secuenciación en fase sólida y similares.
Las moléculas de colorante fluorescente con propiedades de fluorescencia mejoradas, tales como intensidad de fluorescencia, la forma y la longitud de onda máxima de la banda de fluorescencia, pueden mejorar la velocidad y precisión de la secuenciación del ácido nucleico. La fuerte señal de fluorescencia es especialmente importante cuando las mediciones se realizan en tampones biológicos a base de agua y a altas temperaturas, ya que la intensidad de fluorescencia de la mayoría de los colorantes es significativamente menor en tales condiciones. Además, la naturaleza de la base a la cual se une un colorante también afecta el máximo de fluorescencia, la intensidad de la fluorescencia y otras propiedades del colorante espectral. Las interacciones específicas de secuencia entre las nucleobases y los colorantes fluorescentes pueden adaptarse mediante un diseño específico de los colorantes fluorescentes. Las optimizaciones de la estructura de los colorantes fluorescentes pueden mejorar la eficiencia de la incorporación de nucleótidos, reducir el nivel de errores de secuenciación y disminuir el uso de reactivos en, y por lo tanto, los costos de la secuenciación del ácido nucleico.
En la presente descripción se describen construcciones de polimetina mejoradas y su uso como marcadores de biomoléculas, particularmente como marcadores para nucleótidos usados en la secuenciación del ácido nucleico. Se pueden ver mejoras particulares en la eficiencia de la incorporación de nucleótidos marcados y la longitud y precisión de la secuencia de lectura obtenible mediante el uso de las nuevas construcciones fluorescentes. Las moléculas descritas a continuación son particularmente ventajosas en situaciones donde se usan fuentes de excitación de alta energía. La excitación de alta energía puede dar como resultado un grado de saturación de la energía, donde el número de fotones emitidos por los marcadores deja de ser lineal con un aumento en la energía de excitación. La saturación de la energía puede ser causada por efectos de enfriamiento molecular en relación con la estructura de los marcadores, o puede ser causada por marcadores que tienen una vida útil de fluorescencia más larga que la deseada, de manera que los marcadores pasan un período más largo de lo deseado en el estado excitado antes de emitir un fotón. Donde múltiples marcadores diferentes se usan en paralelo, tener uno de los marcadores que alcanza la saturación de la energía cuando otros marcadores continúan siendo más brillantes, hace que la diferenciación de los marcadores sea más difícil. Los marcadores descritos en la presente descripción son particularmente ventajosos para alcanzar la saturación de la energía a un nivel más alto que los correspondientes compuestos marcados de la técnica anterior. Los documentos WO2014/135221, WO2015/170102, US5486616, US4839265 y WO2007/020457 describen compuestos de la técnica. Resumen
La invención se define por las reivindicaciones.
De acuerdo con un primer aspecto, esta descripción proporciona compuestos de la fórmula (I) o formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Raí y Ra<2>es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente;
cada uno de Rcí y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido.
P puede ser uno; en cuyo caso los compuestos son de la fórmula (la) o formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
YesS, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente H, SO3", sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido.
P puede ser dos; en cuyo caso los compuestos son de la fórmula (Ib) o formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
YesS, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente H, SO3", sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido.
En ciertos ejemplos donde Ra1 o Ra2 es H; ya sea Rc1 o Rc2 puede ser un grupo del ácido alquilsulfónico. Los compuestos requieren uno o más sustituyentes de ácido sulfónico, de modo que al menos uno de Ra1 o Ra2 es SO3-o Ra1 o Ra2 es un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente, el anillo adicional tiene un SO3-o Rc1 o Rc2 es un grupo del ácido alquilsulfónico.
En ciertos ejemplos donde p es 2, Rc1 o Rc2 es un grupo del ácido alquilsulfónico.
En ciertos ejemplos, r es igual a 3.
En ciertos ejemplos, n es 1. El grupo OH de Z puede estar en la posición 4 en el anillo. En ciertos ejemplos, n es 0 y el anillo de fenilo no está sustituido. En ciertos ejemplos donde n es 0, Y es S u O (y no CH2).
En otra modalidad, los compuestos de la presente descripción se pueden conjugar con una variedad de fracciones de sustrato tales como, por ejemplo, nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, polipéptidos, carbohidratos, ligandos, partículas, células, superficies semisólidas (por ejemplo, geles) y superficies sólidas. La conjugación puede llevarse a cabo a través del grupo carboxilo C(=O)-X, que se puede convertir en una amida o un éster.
De acuerdo con un aspecto adicional de la descripción, por lo tanto, se proporcionan compuestos colorantes que comprenden grupos de enlace para permitir, por ejemplo, la unión covalente a tales fracciones de sustrato.
De acuerdo con un aspecto adicional, la descripción proporciona un compuesto de nucleósido o de nucleótido definido por la fórmula: N-L-Dye, en donde N es un nucleótido, L es una fracción enlazadora opcional y Dye es un compuesto fluorescente de acuerdo con la presente descripción.
En un aspecto adicional, la descripción proporciona métodos de secuenciación mediante el uso de los compuestos colorantes de la presente descripción.
De acuerdo con un aspecto adicional, la descripción también proporciona kits que comprenden compuestos colorantes (libres o en forma conjugada) que pueden usarse en varios ensayos inmunológicos, oligonucleótidos y ácidos nucleicos marcados y para la secuenciación de ADN por síntesis. En otro aspecto más, la descripción proporciona kits que comprenden 'conjuntos' de colorantes particularmente adecuados para ciclos de secuenciación por síntesis en una plataforma de instrumentos automatizada.
Un aspecto adicional de la descripción es la preparación química de los compuestos de la descripción.
Descripción detallada
Esta descripción proporciona nuevos compuestos particularmente adecuados para métodos de detección de fluorescencia y secuenciación por síntesis. Los compuestos que tienen una fracción indol N-fenilo son ventajosos en intensidad de fluorescencia, fotoestabilidad en comparación con análogos de N-alquilo y, por lo tanto, mejoran ciertas aplicaciones de secuenciación del ácido nucleico.
La invención se define por las reivindicaciones.
De acuerdo con un primer aspecto la descripción proporciona compuestos de la fórmula (I) o formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Raí y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido.
La descripción proporciona un compuesto de la fórmula (I) o formas mesoméricas del mismo:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Ra<1>y Ra<2>es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; y
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido, en donde al menos uno de Ra1 o Ra2 es SO3-o Ra1 o Ra2 es un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente, el anillo adicional tiene un SO3-, o Rc1 o Rc2 es un grupo de ácido alquilsulfónico.
La descripción proporciona un compuesto de la fórmula (I) o formas mesoméricas del mismo:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Ye s S , O0CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Raí y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; y
cada uno de Rcí y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido, en donde cuando n es 0, Y es S u O.
La descripción proporciona un compuesto de la fórmula (I) o formas mesoméricas del mismo:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Ye s S , O o C H<2>;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Raí y Ra<2>es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; y
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido, en donde al menos uno de Ra1 o Ra2 es SO3-o Ra1 o Ra2 es un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente, el anillo adicional tiene un SO3-o Rc1 o Rc2 es un grupo de ácido alquilsulfónico y en el que cuando n es 0, Y es S u O.
Las moléculas pueden contener una o más sulfonamidas o fracciones SO3- en la posición Ra. Ra<1>y/o Ra<2>pueden ser SO3- o sulfonamida. El otro Ra (Ra<1>o Ra<2>) puede ser independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente. Ra<1>o Ra<2>puede ser H. Ra<1>o Ra<2>puede ser SO3-. Ra<1>puede ser diferente a Ra2, por ejemplo, la estructura puede tener un solo grupo sulfonamida en Ra1y H como Ra2. Ra1 y Ra2 ambos pueden ser sulfonamida. La sulfonamida puede ser SO2NH2 o SO2NHR, donde R es un grupo alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido. Donde ni Ra<1>o Ra<2>es un SO3- o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente, luego Rc<1>o Rc<2>debe ser un grupo de ácido alquilsulfónico.
Ra1 o Ra2 puede ser otro anillo alifático, aromático o heterocíclico fusionado a carbonos adyacentes del anillo de indol. Por ejemplo, en tales casos cuando se fusiona un anillo aromático, el grupo final de colorantes puede representar una estructura de tipo
donde Rd puede ser H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxi, sulfonamida o ácido sulfónico. Por lo tanto, los colorantes de la descripción se pueden describir mediante la Fórmula (IC) o (ID) o formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y
Rd es H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxi, sulfonamida o ácido sulfónico.
Por lo tanto, los colorantes de la descripción se pueden describir mediante la Fórmula (IC) o (ID) o formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y
Rd es H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxi, sulfonamida o ácido sulfónico, en donde al menos uno de Ra1 o Ra2 es SO3- o Rd es SO3-o Rc1 o Rc2 es un grupo de ácido alquilsulfónico.
Por lo tanto, los colorantes de la descripción se pueden describir mediante la Fórmula (IC) o (ID) o formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Raí y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y
Rd es H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxi, sulfonamida o ácido sulfónico, en donde cuando n es 0, Y es S u O.
Por lo tanto, los colorantes de la descripción se pueden describir mediante la Fórmula (IC) o (ID) o formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente;
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido; y
Rd es H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxi, sulfonamida o ácido sulfónico, en donde al menos uno de Raí o Ra<2>es SO3- o Rd es SO3-o Rci o Rc<2>es un grupo de ácido alquilsulfónico y en donde cuando n es 0, Y es S u O.
En la fórmula (IC) o (ID), los anillos adicionales fusionados a átomos de carbono adyacentes del anillo de indol pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con ácido sulfónico o sulfonamida.
El grupo carboxi C(=O)-X o sus derivados está unido al átomo de nitrógeno indol mediante una cadena alquilo de longitud q, donde q es 1-5 carbonos o heteroátomos. La cadena puede ser (CH2)q donde q es 1-5. El grupo puede ser (CH2)aCOOH.
Las moléculas pueden contener uno o más fracciones alquilsulfonato en la posición Rc. Ya sea Rc1 y/o Rc2 puede ser alquil-SO3". El otro Rc (Rc1 o Rc2) puede ser independientemente alquilo o alquilo sustituido. Rc1 y Rc2 puede ser independientemente metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo o (CH2)tSO3H, donde t es 1-6. t puede ser 1-4. t puede ser 4. Rc1 y Rc2 puede ser un grupo alquilo sustituido. Rc1 y Rc2 puede contener una fracción COOH o -SO3H o sus derivados éster o amida.
En ciertas modalidades, cuando uno de Ra1 o Ra2 es SO3-y el otro de Ra1 o Ra2 es H o SO3-, ya sea Rc1 o Rc2 también puede ser un grupo de ácido alquilsulfónico.
El grupo COOH que se muestra como C(=O)-X puede actuar como una fracción enlazadora para una unión adicional o se une a una molécula adicional. Una vez que se produce la conjugación, el COOH o COO- se convierte en una amida o éster.
Los ejemplos de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con la fórmula (II) o (IIa) o las formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; y
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido.
Los ejemplos de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con la fórmula (II) o (IIa) o las formas mesoméricas de los mismos:
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Ra1 y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; y
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido, en donde cuando n es 0, Y es S u O.
Los ejemplos adicionales de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con la fórmula (IIIa) o (IIIb):
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
t es un entero de 1-6;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Raí y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; y
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido.
Los ejemplos adicionales de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con la fórmula (Illa) o (IIIb):
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
p es un entero de 1-2;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
t es un entero de 1-6;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo;
cada uno de Raí y Ra2 es independientemente H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; y
cada uno de Rc1 y Rc2 es independientemente alquilo o alquilo sustituido, en donde cuando n es 0, Y es S u O.
Los ejemplos adicionales de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con la fórmula (IVa) a (IVd):
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y m es un entero de 0-3;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces; Yes S, O0CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3;
X es O H u O ' o un conjugado de éster o amida del mismo;
Raí es H, SO3", sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; Rci es alquilo o alquilo sustituido; y
Rd es H, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, halógeno, carboxi, sulfonamida o ácido sulfónico. Los ejemplos adicionales de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con la fórmula (Va) a (Vd):
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y m es un entero de 0-3;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces; Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3; y
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo.
Los ejemplos adicionales de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con la fórmula (VIa) a (VId):
��
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y
m es un entero de 0-3;
q es un entero de 1-5;
alk es una cadena de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces;
t es un entero de 1-6;
Y es S, O o CH2;
Z es OH;
n es un entero 0-3; y
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo.
alk es una cadena alquilo, alquenilo o alquinilo de 1-5 átomos de carbono que contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces. Alk puede ser un grupo (CH2)r donde r es 1-5. Alk puede ser (CH2)3. Alternativamente, la cadena de carbono puede contener uno o más dobles enlaces o triples enlaces. La cadena puede contener un enlace -CH2-CH=CH-CH2-, opcionalmente con grupos adicionales CH2. La cadena puede contener un enlace -CH2-C=C-CH2, opcionalmente con grupos adicionales CH2.
En cualquiera de los ejemplos dados en las fórmulas VII a VIII; r puede ser igual a 3.
En cualquiera de los ejemplos dados en las fórmulas I a VIII; q puede ser igual a 5.
En cualquiera de los ejemplos dados en la fórmula III, fórmula VI o fórmula VII; t puede ser igual a 4.
En cualquiera de los ejemplos dados en las fórmulas I a VI; n puede ser igual a 1-3. En cualquiera de los ejemplos dados en las fórmulas I a VI; n puede ser igual a 1. En cualquiera de los ejemplos dados en las fórmulas I a VI; n puede ser un entero 0-1. Donde n es 1, el grupo OH de Z puede estar en cualquier posición del anillo. El grupo OH de Z puede estar en la posición 4. Donde n es 2 o 3, los grupos OH de Z pueden estar en cualquier posición en el anillo de fenilo.
En cualquiera de los ejemplos dados en las fórmulas I a VI; cuando n es cero, Y puede ser igual a O o S y no CH2. En cualquiera de los ejemplos dados en las fórmulas I a VI; Y puede ser igual a O.
En cualquiera de los ejemplos dados en las fórmulas I a VI; Y puede ser igual a O. Donde Y es O, n puede ser 0-3. Donde Y es CH2, n puede ser 1-3.
Los ejemplos adicionales de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con las fórmulas (VIIa) a (VIId):
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y m es un entero de 0-3;
q es un entero de 1-5;
r es un entero de 1-5;
t es un entero de 1-6; y
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo.
Los ejemplos adicionales de compuestos incluyen las estructuras de acuerdo con las fórmulas (VIIIa) a (VIIId):
en donde mCat+ o mAn- es un contraión cargado positivamente/negativamente orgánico o inorgánico y m es un entero de 0-3;
q es un entero de 1-5;
r es un entero de 1-5; y
X es OH u O- o un conjugado de éster o amida del mismo.
Un compuesto particularmente útil es un nucleótido u oligonucleótido marcado con un colorante como se describe en la presente descripción.
El nucleótido u oligonucleótido marcado puede tener el marcador unido al átomo de nitrógeno de indol a través de un grupo alquil-carboxi para formar una amida. El nucleótido u oligonucleótido marcado puede tener el marcador unido a la posición C5 de una base pirimidina o la posición C7 de una base 7-desaza purina a través de una fracción enlazadora. El nucleótido u oligonucleótido marcado también puede tener un grupo de bloqueo unido covalentemente al azúcar de la ribosa o desoxirribosa del nucleótido. El grupo de bloqueo puede unirse en cualquier posición en el azúcar de ribosa o desoxirribosa. En modalidades particulares, el grupo de bloqueo está en la posición 3' OH del azúcar de la ribosa o desoxirribosa del nucleótido.
En la presente descripción se proporcionan kits que incluyen dos o más nucleótidos en donde al menos un nucleótido es un nucleótido marcado con un compuesto de la presente descripción. El kit puede incluir dos o más nucleótidos marcados. Los nucleótidos se pueden marcar con dos o más marcadores fluorescentes. Dos o más de los marcadores pueden excitarse mediante el uso de una sola fuente de excitación, que puede ser un láser. Por ejemplo, las bandas de excitación para los dos o más marcadores pueden solaparse al menos parcialmente, de modo que la excitación en la región de solapamiento del espectro hace que ambos marcadores emitan fluorescencia. En modalidades particulares, la emisión de los dos o más marcadores ocurrirá en diferentes regiones del espectro de manera que se pueda determinar la presencia de al menos uno de los marcadores mediante la distinción óptica de la emisión.
El kit puede contener cuatro nucleótidos marcados, donde el primero de cuatro nucleótidos se marca con un compuesto como se describe en la presente descripción. En dicho kit, el segundo, tercero y cuarto nucleótidos pueden marcarse cada uno con un compuesto que es opcionalmente diferente del marcador en el primer nucleótido y opcionalmente diferente de los marcadores entre sí. Por lo tanto, uno o más de los compuestos pueden tener un máximo de absorbancia y/o un máximo de emisión distintos de manera que los compuestos se pueden distinguir de otros compuestos. Por ejemplo, cada compuesto puede tener un máximo de absorbancia y/o un máximo de emisión distinto de manera que cada uno de los compuestos se puede distinguir de los otros tres compuestos. Se debe entender que las partes del espectro de absorbancia y/o espectro de emisión distintos de los máximos pueden diferir y estas diferencias pueden explotarse para distinguir los compuestos. El kit puede ser de manera que dos o más de los compuestos tienen un máximo de absorbancia por encima de 600 nm. Los compuestos de la invención típicamente absorben luz en la región por encima de 640 nm. Los compuestos, nucleótidos o kits que se exponen en la presente descripción pueden usarse para detectar, medir o identificar un sistema biológico (que incluye, por ejemplo, procesos o componentes del mismo). Las técnicas ilustrativas que pueden emplear los compuestos, nucleótidos o kits incluyen secuenciación, análisis de expresión, análisis de hibridación, análisis genético, análisis de ARN, ensayo celular (por ejemplo, análisis de unión celular o función celular) o ensayo de proteínas (por ejemplo, ensayo de unión a proteínas o ensayo de actividad de proteínas). El uso puede ser en un instrumento automatizado para llevar a cabo una técnica particular, tal como un instrumento de secuenciación automatizada. El instrumento de secuenciación puede contener dos láseres que operan a diferentes longitudes de onda. En la presente descripción se describe un método para sintetizar compuestos de la descripción. Un compuesto de fórmula (X) y/o (X1), (X2) (X3) o (X4) o una sal del mismo puede usarse como material de partida para la síntesis de colorantes de polimetina simétricos o asimétricos:
o una sal de los mismos en donde Raí es H, SO3-, sulfonamida, halógeno o un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente; Rc1 es alquilo o alquilo sustituido; Ar es un grupo aromático y R es un grupo alquilo. Donde se muestran ejemplos específicos de 4-hidroxifenilo, otros grupos hidroxilo adicionales pueden estar sustituidos en el anillo en casos donde n es mayor que uno. r puede ser igual a 3.
En la presente descripción se describe un método para sintetizar compuestos de la descripción. Un compuesto de fórmula (X5) o una sal del mismo puede usarse como material de partida para la síntesis de colorantes de polimetina simétricos o asimétricos:
Como se usa en la presente descripción, el término "alquilo" se refiere a hidrocarburo C1-C20 y puede incluir anillos carbocíclicos no aromáticos C3-C10. En modalidades particulares, los grupos alquilo son alquilo C1-C6 que se refieren a radicales de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, saturados, que contienen entre uno y seis átomos de carbono, respectivamente. En casos particulares, los grupos alquilo pueden incluir uno o más grupos insaturados, y por lo tanto incluir alquenilo y alquinilo.
El término "halógeno" como se usa en la presente descripción se refiere a fluoro- (en adelante designado como F), cloro-(en adelante designado como Cl), bromo- (en adelante designado como Br) o yodo- (en adelante designado como I), y usualmente se refiere a la sustitución de un átomo de hidrógeno en un compuesto orgánico, esta sustitución es opcionalmente una sustitución completa para el hidrógeno.
El término "alquilo sustituido" se refiere a grupos alquilo, alquenilo o alquinilo como se definió anteriormente, donde pueden estar opcionalmente sustituidos adicionalmente con, pero no limitado a, halo, ciano, SO3-, SRa, ORa, NRbRc, oxo, CONRbRc, COOH y COORb. Ra, Rb y Rc pueden seleccionarse cada uno independientemente de H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido. Además, dicho alquilo sustituido, alquenilo sustituido y alquinilo sustituido pueden interrumpirse opcionalmente por al menos un heteroátomo o grupo seleccionado de O, NRb, S(O)t donde t es de 0 a 2, y similares. El alquilo sustituido también cubre un grupo tal como bencilo donde los grupos alquilo comprenden una fracción adicional arilo o arilo sustituido.
Los colorantes de acuerdo con la presente descripción pueden sintetizarse a partir de una variedad de diferentes materiales de partida, que incluyen los indoles sustituidos con N-propil-4-hidroxifeniléter. Los colorantes pueden hacerse simétricamente, de modo que el mismo indol está en ambos extremos de la cadena de polimetina, o asimétricamente, de manera que diferentes indoles están en cada extremo del cromóforo. Los métodos para preparar colorantes de polimetina se conocen bien en la técnica.
De acuerdo con un aspecto de la descripción, se proporcionan compuestos colorantes adecuados para la unión a fracciones de sustrato, que comprenden particularmente grupos de enlace para permitir la unión a fracciones de sustrato. Las fracciones de sustrato pueden ser prácticamente cualquier molécula o sustancia a la cual se puedan conjugar los colorantes de la descripción y, por medio de ejemplo no limitante, pueden incluir nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, carbohidratos, ligandos, partículas, superficies sólidas, polímeros orgánicos e inorgánicos, cromosomas, núcleos, células vivas y combinaciones o asociaciones de los mismos. Los colorantes pueden conjugarse mediante un enlazador opcional por una variedad de medios que incluyen atracción hidrófoba, atracción iónica y unión covalente. Particularmente, los colorantes se conjugan con el sustrato mediante unión covalente. Más particularmente, la unión covalente es por medio de un grupo de enlace.
La conjugación del compuesto colorante con el sustrato puede llevarse a cabo a través del grupo carboxilo COX, que puede convertirse en una amida o un éster.
Los colorantes de acuerdo con la presente descripción pueden incluir un grupo de enlace reactivo en una de las posiciones sustituyentes para la unión covalente del colorante a otra molécula. Los grupos de enlace reactivos son fracciones capaces de formar un enlace (por ejemplo, un enlace covalente o no covalente). En una modalidad particular, el enlazador puede ser un enlazador escindible. El uso del término "enlazador escindible" no pretende implicar que se requiere el enlazador completo para eliminarse. El sitio de escisión puede situarse en una posición en el enlazador que hace que parte del enlazador permanezca adherido al colorante y/o a la fracción de sustrato después del clivaje. Los enlazadores escindibles pueden ser, por medio de ejemplo no limitante, enlazadores escindibles electrofílicamente, enlazadores escindibles enzimáticamente, enlazadores escindibles nucleofílicamente, enlazadores fotoescindibles, escindibles bajo condiciones reductoras (por ejemplo, enlazadores que contienen disulfuro o azida), condiciones oxidativas, escindibles mediante el uso de enlances de seguridad-captura y escindibles por mecanismos de eliminación. El uso de un enlazador escindible para unir el compuesto colorante a una fracción de sustrato proporciona la opción de eliminar el marcador, por ejemplo, después de la detección, lo que evita de ese modo cualquier señal interferente en las etapas posteriores.
Se pueden encontrar grupos de enlaces útiles en el número de la publicación PCT WO2004/018493 ejemplos de los cuales incluyen enlazadores que pueden escindirse mediante el uso de fosfinas solubles en agua o catalizadores de metales de transición solubles en agua formados a partir de un metal de transición y ligandos al menos parcialmente solubles en agua. En solución acuosa, los últimos forman complejos de metales de transición al menos parcialmente solubles en agua. Dichos enlazadores escindibles pueden usarse para conectar bases de nucleótidos a marcadores tales como los colorantes expuestos en la presente descripción.
Los enlazadores particulares se pueden encontrar en el número de la publicación PCT WO2004/018493 tales como los que incluyen las fracciones de la fórmula:
(en donde X se selecciona del grupo que comprende O, S, NH y NQ en donde Q es un grupo alquilo C1-10 sustituido o no sustituido, Y se selecciona del grupo que comprende O, S, NH y N (alilo), T es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido y * indica dónde está conectado la fracción al resto del nucleótido o nucleósido).
En modalidades particulares, la longitud del enlazador entre un colorante fluorescente (fluoróforo) y una base guanina puede alterarse, por ejemplo, mediante la introducción de un grupo espaciador de polietilenglicol, de esta manera aumenta la intensidad de esta fluorescencia en comparación con el mismo fluoróforo unido a la base de guanina a través de otros enlaces conocidos en la técnica. Los enlazadores ilustrativos y sus propiedades se exponen en el número de solicitud de la patente GB 0517097.2, publicado como WO07020457. El diseño de los enlazadores, y especialmente de su mayor longitud, puede permitir mejoras en el brillo de los fluoróforos unidos a las bases guanina de los nucleótidos de guanosina cuando se incorporan a polinucleótidos como el ADN. Por lo tanto, cuando el colorante es para uso en cualquier método de análisis que emplea detección de un marcador de colorante fluorescente unido a un nucleótido que contiene guanina, puede ser ventajoso usar un enlazador que tenga un grupo espaciador de fórmula - ((CH2)2O)n- en donde n es un entero entre 2 y 50, por ejemplo, como se describe en el documento WO07020457.
La presente descripción proporciona además conjugados de nucleósidos y nucleótidos marcados con uno o más de los colorantes expuestos en la presente descripción (nucleótidos modificados). Los nucleósidos y nucleótidos marcados son útiles para marcar polinucleótidos formados por síntesis enzimática, tales como, por medio de ejemplo no limitante, en amplificación por PCR, amplificación isotérmica, amplificación en fase sólida, secuenciación de polinucleótidos (por ejemplo, secuenciación en fase sólida), reacciones de traducción de muesca y similares.
Los nucleósidos y nucleótidos pueden marcarse en sitios en el azúcar o la nucleobase. Como se conoce en la técnica, un "nucleótido" consiste en una base nitrogenada, un azúcar y uno o más grupos fosfato. En el ARN el azúcar es la ribosa y en el ADN es una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la ribosa. La base nitrogenada es un derivado de purina o pirimidina. Las purinas pueden ser adenina (A) o guanina (G), y las pirimidinas pueden sercitosina (C), timina (T) o en el contexto del ARN, uracilo (U). El átomo C-1 de la desoxirribosa está unido al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina. Un nucleótido es además un éster de fosfato de un nucleósido, con esterificación que ocurre en el grupo hidroxilo unido al C-3 o C-5 del azúcar. Los nucleótidos son usualmente mono, di o trifosfatos.
Un "nucleósido" es estructuralmente similar a un nucleótido, pero carece de las fracciones fosfato. Un ejemplo de un análogo de nucleósido sería uno en el que se une el marcador a la base y no hay ningún grupo fosfato unido a la molécula de azúcar.
Aunque la base se refiere usualmente como una purina o pirimidina, el experto apreciará que los derivados y análogos están disponibles los cuales no alteran la capacidad del nucleótido o nucleósido de experimentar el emparejamiento de bases de Watson-Crick. "Derivado" o "análogo" significa un compuesto o molécula cuya estructura núcleo es la misma que, o se parece mucho a la de un compuesto original, pero que tiene una modificación química o física, tal como un grupo lateral diferente o adicional, lo que permite que el nucleótido o nucleósido derivado se enlace a otra molécula. Por ejemplo, la base puede ser una desazapurina. En modalidades particulares, los derivados son capaces de experimentar el emparejamiento de Watson-Crick. "Derivado" y "análogo" también incluye, por ejemplo, un derivado sintético de nucleótido o nucleósido que tiene fracciones de base modificadas y/o fracciones de azúcar modificadas. Tales derivados y análogos se discuten en, por ejemplo, Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) and Uhlman y otros, Chemical Reviews 90:543-584, 1990. Los análogos de nucleótidos también pueden tener enlaces de fosfodiéster modificados que incluyen enlaces de fosforotioato, fosforoditioato, alquilfosfonato, fosforanilidato, fosforamidato y similares.
Un colorante se puede unir a cualquier posición en una base de nucleótidos, por ejemplo, a través de un enlazador. En modalidades particulares, el emparejamiento de bases de Watson-Crick todavía se puede llevar a cabo para el análogo resultante. Los sitios de marcado de nucleobases particulares incluyen la posición C5 de una base de pirimidina o la posición C7 de una base de 7-desaza purina. Como se describió anteriormente, se puede usar un grupo de enlace para unir covalentemente un colorante al nucleósido o nucleótido.
En modalidades particulares, el nucleósido o nucleótido marcado puede ser incorporable enzimáticamente y extensible enzimáticamente. En consecuencia, una fracción enlazadora puede tener una longitud suficiente para conectar el nucleótido al compuesto de manera que el compuesto no interfiera significativamente con la unión y el reconocimiento general del nucleótido por una enzima de replicación de ácido nucleico. Por lo tanto, el enlazador puede comprender además una unidad espadadora. El espaciador separa, por ejemplo, la base de nucleótidos de un sitio de escisión o marcador.
Los nucleósidos o nucleótidos marcados con colorantes de la descripción pueden tener la fórmula:
Donde Dye es un compuesto colorante de acuerdo con la presente descripción, B es una nucleobase, tal como, por ejemplo, uracilo, timina, citosina, adenina, guanina y similares, y L es un grupo de enlace opcional que puede o no estar presente. R' puede ser H, monofosfato, difosfato, trifosfato, tiofosfato, un análogo de éster de fosfato, - O- unido a un grupo que contiene fósforo reactivo u -O- protegido por un grupo de bloqueo. R" puede ser H, OH, una fosforamidita o un grupo de bloqueo 3'OH y R"' es H u OH.
Cuando R" es fosforamidita, R' es un grupo protector de hidroxilo escindible con ácido que permite el subsecuente acoplamiento de monómeros bajo condiciones de síntesis automatizadas.
En una modalidad particular, el grupo de bloqueo está separado e independiente del compuesto colorante, es decir, no está directamente unido a él. En una modalidad alternativa, el colorante puede comprender todo o parte del grupo de bloqueo 3'OH. Por lo tanto, R" puede ser un grupo de bloqueo 3'OH que puede comprender o no un compuesto colorante divulgado en la presente descripción.
En aún otra modalidad alternativa, no hay un grupo de bloqueo sobre el carbono 3' del azúcar pentosa y el colorante (o construcción de colorante y enlazador) unido a la base, por ejemplo, puede ser de un tamaño o estructura suficiente para actuar como un bloque para la incorporación de un nucleótido adicional. Por lo tanto, el bloqueo puede deberse a un impedimento estérico o puede deberse a una combinación de tamaño, carga y estructura, ya sea que el colorante se una o no a la posición 3' del azúcar.
Todavía en otra modalidad alternativa más, el grupo de bloqueo está presente en el carbono 2' o 4' del azúcar pentosa y puede ser de un tamaño o estructura suficiente para actuar como un bloque para la incorporación de un nucleótido adicional. El uso de un grupo de bloqueo permite controlar la polimerización, tal como detener la extensión cuando se incorpora un nucleótido modificado. Si el efecto de bloqueo es reversible, por ejemplo, por medio de ejemplo no limitante, al cambiar las condiciones químicas o al eliminar un bloqueo químico, la extensión se puede detener en ciertos puntos y luego permitir que continúe.
En otra modalidad particular, un grupo de bloqueo 3'OH comprenderá fracciones descritas en el documentoWO2004/018497. Por ejemplo, el grupo de bloqueo puede ser azidometilo (CH2N3) o alilo.
En una modalidad particular, un enlazador (entre colorante y nucleótido) y un grupo de bloqueo están presentes y son fracciones separadas. En modalidades particulares, el enlazador y el grupo de bloqueo son ambos escindibles bajo condiciones sustancialmente similares. Por lo tanto, los procesos de desprotección y desbloqueo pueden ser más eficiente, ya que sólo un único tratamiento se requerirá para eliminar el compuesto colorante y el bloqueo. Sin embargo, en algunas modalidades, un enlazador y un grupo de bloqueo no necesitan ser escindibles bajo condiciones similares, sino que son escindibles individualmente bajo condiciones distintas.
Esta descripción también abarca polinucleótidos que incorporan compuestos colorantes. Dichos polinucleótidos pueden ser ADN o ARN comprendidos respectivamente de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos unidos en un enlace fosfodiéster. Los polinucleótidos de acuerdo con la descripción pueden comprender nucleótidos de origen natural, nucleótidos de origen no natural (o modificados) distintos de los nucleótidos modificados de la descripción o cualquier combinación de los mismos, en combinación con al menos un nucleótido modificado (por ejemplo, marcado con un compuesto colorante) expuesto en la presente descripción. Los polinucleótidos de acuerdo con la descripción también pueden incluir enlaces de cadena principal no naturales y/o modificaciones químicas no nucleotídicas. También se contemplan estructuras quiméricas compuestas de mezclas de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos que comprenden al menos un nucleótido modificado de acuerdo con la descripción.
Los nucleótidos modificados (o nucleósidos) que comprenden un compuesto colorante de acuerdo con la presente descripción pueden usarse en cualquier método de análisis, tales como métodos que incluyen la detección de un marcador fluorescente unido a un nucleótido o nucleósido, ya sea solo o incorporado dentro o asociado con una estructura molecular más grande o conjugado. En este contexto, el término "incorporado en un polinucleótido" puede significar que el fosfato 5' está unido en un enlace fosfodiéster al grupo hidroxilo 3' de un segundo nucleótido (modificado o no modificado), que puede formar parte de una cadena polinucleotídica más larga. El extremo 3' de un nucleótido modificado expuesto en la presente descripción puede o no unirse en un enlace fosfodiéster al fosfato 5' de un nucleótido adicional (modificado o no modificado). Por lo tanto, en una modalidad no limitante, la descripción proporciona un método para detectar un nucleótido modificado incorporado en un polinucleótido que comprende: (a) incorporar al menos un nucleótido modificado de la descripción en un polinucleótido y (b) detectar el(los) nucleótido(s) modificado(s) incorporado(s) en el polinucleótido por la detección de la señal fluorescente del compuesto colorante unido a dicho(s) nucleótido(s) modificado(s).
Este método puede incluir: una etapa sintética (a) en la que uno o más nucleótidos modificados de acuerdo con la descripción se incorporan a un polinucleótido y una etapa de detección (b) en la que se detectan uno o más nucleótido(s) modificado(s) incorporado(s) en el polinucleótido al detectar o medir cuantitativamente su fluorescencia.
En una modalidad de la presente descripción, al menos un nucleótido modificado se incorpora en un polinucleótido en una etapa sintética por la acción de una enzima polimerasa.
Sin embargo, pueden usarse otros métodos para unir nucleótidos modificados a polinucleótidos, como por ejemplo síntesis química de oligonucleótidos o ligación de oligonucleótidos marcados a oligonucleótidos no marcados. Para ello, el término "incorporar", cuando se usa en referencia a un nucleótido y polinucleótido, puede abarcar la síntesis de polinucleótidos por métodos químicos, así como también métodos enzimáticos.
En una modalidad específica, se lleva a cabo una etapa sintética y puede comprender opcionalmente incubar una cadena de polinucleótidos molde con una mezcla de reacción que comprende nucleótidos modificados marcados fluorecentemente de la descripción. También se puede proporcionar una polimerasa bajo condiciones que permitan la formación de un enlace fosfodiéster entre un grupo hidroxilo 3' libre en una cadena de polinucleótido recocido a la cadena de polinucleótido molde y un grupo fosfato 5' en el nucleótido modificado. Por lo tanto, una etapa sintética puede incluir la formación de una cadena de polinucleótidos según lo dirigido por el emparejamiento de bases complementarias de nucleótidos a una cadena molde.
En todas las modalidades del método, la etapa de detección puede llevarse a cabo mientras que se hibrida la cadena de polinucleótidos en la que los nucleótidos modificados se incorporan a una cadena molde, o después de una etapa de desnaturalización en la que las dos cadenas se separan. Se pueden incluir etapas adicionales, por ejemplo, etapas de reacción química o enzimática o etapas de purificación, entre una etapa sintética y una etapa de detección. En particular, la cadena diana que incorpora el(los) nucleótido(s) modificados(s) puede aislarse o purificarse y luego procesarse adicionalmente o usarse en un análisis subsecuente. A manera de ejemplo, los polinucleótidos diana marcados con nucleótido(s) modificado(s) en una etapa sintética pueden usarse subsecuentemente como sondas o cebadores marcados. En otras modalidades, el producto de una etapa sintética expuesto en la presente descripción puede estar sujeto a etapas de reacción adicionales y, si se desea, el producto de estas etapas subsecuentes puede purificarse o aislarse.
Las condiciones adecuadas para una etapa sintética serán bien conocidas por aquellos familiarizados con las técnicas estándar de biología molecular. En una modalidad, una etapa sintética puede ser análoga a una reacción de extensión de cebador estándar mediante el uso de precursores de nucleótidos, incluidos los nucleótidos modificados expuestos en la presente descripción, para formar una cadena diana extendida complementaria a la cadena molde en presencia de una enzima polimerasa adecuada. En otras modalidades, una etapa sintética puede formar parte de una reacción de amplificación que produce un producto de amplificación bicatenario marcado comprendido por cadenas complementarias híbridas derivadas de la copia de las cadenas de polinucleótidos diana y molde. Otras etapas sintéticas ilustrativas incluyen traducción de muesca, polimerización por desplazamiento de cadena, marcado de ADN cebado aleatorio, etc. Una enzima polimerasa particularmente útil para una etapa sintética es una que es capaz de catalizar la incorporación de uno o más de los nucleótidos modificados expuestos en la presente descripción. Puede usarse una variedad de polimerasas de orígen natural o modificadas. A manera de ejemplo, puede usarse una polimerasa termoestable para una reacción sintética que se lleva a cabo mediante el uso de condiciones de termociclado, mientras que una polimerasa termoestable puede no ser deseable para reacciones de extensión de cebador isotérmicas. Las polimerasas termoestables adecuadas que son capaces de incorporar los nucleótidos modificados de acuerdo con la descripción incluyen aquellas descritas en los documentos WO 2005/024010 o WO06120433. En las reacciones sintéticas que se llevan a cabo a temperaturas más bajas, tales como 37 °C, las enzimas polimerasas no necesitan necesariamente ser polimerasas termoestables, por lo tanto, la elección de la polimerasa dependerá de una serie de factores como la temperatura de reacción, el pH, la actividad de desplazamiento de cadena y similares.
En modalidades específicas no limitantes, la descripción abarca métodos de secuenciación del ácido nucleico, resecuenciación, secuenciación del genoma completo, puntuación única de polimorfismo de nucleótidos, o cualquier otra aplicación que implique la detección del nucleótido o nucleósido modificado marcado con colorantes expuestos en la presente descripción cuando se incorporan en un polinucleótido. Cualquier otra variedad de solicitudes que se benefician del uso de polinucleótidos marcados con los nucleótidos modificados que comprenden colorantes fluorescentes puede usar nucleótidos o nucleósidos modificados marcados con colorantes expuestos en la presente descripción.
En una modalidad particular, la descripción proporciona el uso de nucleótidos modificados que comprenden compuestos colorantes de acuerdo con la descripción en una reacción de secuenciación por síntesis de polinucleótidos. La secuenciación por síntesis generalmente implica la adición secuencial de uno o más nucleótidos u oligonucleótidos a una cadena polinucleotídica en crecimiento en la dirección 5' a 3' mediante el uso de una polimerasa o ligasa con el fin de formar una cadena polinucleotídica extendida complementaria al ácido nucleico molde para ser secuenciado. La identidad de la base presente en uno o más de los nucleótidos añadidos se puede determinar en una etapa de detección o "formación de imágenes". La identidad de la base añadida puede determinarse después de cada etapa de incorporación de nucleótidos. La secuencia del molde se puede entonces inferir mediante el uso de reglas convencionales de emparejamiento de bases de Watson-Crick. El uso de los nucleótidos modificados marcados con colorantes expuestos en la presente descripción para la determinación de la identidad de una sola base puede ser útil, por ejemplo, en la puntuación de polimorfismos de un solo nucleótido, y tales reacciones de extensión de una sola base están dentro del alcance de esta descripción.
En una modalidad de la presente descripción, la secuencia de un polinucleótido molde se determina al detectar la incorporación de uno o más nucleótidos en una cadena emergente complementaria al polinucleótido molde que se secuenciará mediante la detección de marcador(es) fluorescente(s) unido(s) al nucleótido(s) incorporado(s). La secuenciación del polinucleótido molde puede cebarse con un cebador adecuado (o prepararse como una construcción de horquilla que contendrá el cebador como parte de la horquilla), y la cadena emergente se extiende paso a paso mediante la adición de nucleótidos al extremo 3' del cebador en una reacción catalizada por la polimerasa.
En modalidades particulares, cada uno de los diferentes nucleótidos trifosfatos (A, T, G y C) puede marcarse con un fluoróforo único y también comprende un grupo de bloqueo en la posición 3' para evitar la polimerización descontrolada. Alternativamente, uno de los cuatro nucleótidos puede estar sin marcar (oscuro). La enzima polimerasa incorpora un nucleótido en la cadena emergente complementaria al polinucleótido molde, y el grupo de bloqueo impide la incorporación adicional de nucleótidos. Cualquier nucleótido no incorporado se puede eliminar por lavado y la señal fluorescente de cada nucleótido incorporado se puede "leer" ópticamente por medios adecuados, como un dispositivo acoplado por carga que usa excitación láser y filtros de emisión adecuados. El grupo de bloqueo-3' y los compuestos colorantes fluorescentes se pueden eliminar (desproteger) (simultáneamente o secuencialmente) para exponer la cadena emergente para la incorporación adicional de nucleótidos. Típicamente, la identidad del nucleótido incorporado se determinará después de cada etapa de incorporación, pero esto no es estrictamente esencial. De manera similar, el documento de la Patente Estadounidense. No. 5,302,509 describe un método para secuenciar polinucleótidos inmovilizados sobre un soporte sólido.
El método, como se ejemplificó anteriormente, utiliza la incorporación de nucleótidos A, G, C y T bloqueados en 3' marcados fluorescentemente en una cadena en crecimiento complementaria al polinucleótido inmovilizado, en presencia de ADN polimerasa. La polimerasa incorpora una base complementaria al polinucleótido diana, pero el grupo de bloqueo-3' impide incorporación adicional. El marcaje del nucleótido incorporado puede entonces ser determinado y el grupo de bloqueo se elimina por escisión química para permitir que se produzca la polimerización adicional. El molde de ácido nucleico que se secuenciará en una reacción de secuenciación por síntesis puede ser cualquier polinucleótido que se desee secuenciar. El molde de ácido nucleico para una reacción de secuenciación comprenderá típicamente una región bicatenaria que tiene un grupo hidroxilo 3' libre que sirve como cebador o punto de inicio para la adición de nucleótidos adicionales en la reacción de secuenciación. La región del molde a secuenciar sobresaldrá de este grupo hidroxilo 3' libre en la cadena complementaria. La región sobresaliente del molde a secuenciar puede ser monocatenaria pero puede ser bicatenaria, dado que "se presenta una muesca" en la cadena complementaria a la cadena molde que se secuenciará para proporcionar un grupo OH 3' libre para el inicio de la reacción de secuenciación. En tales modalidades, la secuenciación puede proceder por desplazamiento de cadena. En ciertas modalidades, se puede agregar un cebador que lleva el grupo hidroxilo 3' libre como un componente separado (por ejemplo, un oligonucleótido corto) que se hibrida con una región monocatenaria del molde a secuenciar. Alternativamente, el cebador y la cadena molde a secuenciar pueden cada una formar parte de una cadena de ácido nucleico parcialmente autocomplementario capaz de formar un dúplex intramolecular, como por ejemplo una estructura de bucle en horquilla. Los polinucleótidos en horquilla y los métodos por los cuales se pueden unir a soportes sólidos se describen en los documentos publicados de solicitud internacional de números WO0157248 y WO2005/047301. Los nucleótidos se pueden agregar sucesivamente a un cebador en crecimiento, lo que resulta en la síntesis de una cadena de polinucleótidos en la dirección 5' a 3'. La naturaleza de la base que se ha agregado puede determinarse, particularmente pero no necesariamente después de cada adición de nucleótidos, lo que proporciona por lo tanto información de secuencia para el molde de ácido nucleico. Por lo tanto, se incorpora un nucleótido en una cadena de ácido nucleico (o polinucleótido) mediante la unión del nucleótido al grupo 3' hidroxilo libre de la cadena de ácido nucleico mediante la formación de un enlace fosfodiéster con el grupo fosfato 5' del nucleótido.
El molde de ácido nucleico a secuenciar puede ser ADN o ARN, o incluso una molécula híbrida compuesta de desoxinucleótidos y ribonucleótidos. El molde de ácido nucleico puede comprender nucleótidos de origen natural y/o no natural y enlaces de cadena principal naturales o no naturales, dado que estos no impiden la copia del molde en la reacción de secuenciación.
En ciertas modalidades, el molde de ácido nucleico que se secuenciará puede unirse a un soporte sólido mediante cualquier método de enlace adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mediante unión covalente. En ciertas modalidades, los polinucleótidos molde pueden unirse directamente a un soporte sólido (por ejemplo, un soporte basado en sílice). Sin embargo, en otras modalidades de la descripción, la superficie del soporte sólido puede modificarse de alguna manera para permitir la unión covalente directa de los polinucleótidos molde, o para inmovilizar los polinucleótidos molde a través de una multicapa de hidrogel o polielectrolito, que puede e sí mismo no estar unido covalentemente al soporte sólido.
Las matrices en las que los polinucleótidos se han unido directamente a soportes a base de sílice son aquellas que se describen, por ejemplo, en el documento WO00006770, en donde los polinucleótidos se inmovilizan en un soporte de vidrio por reacción entre un grupo epóxido colgante sobre el vidrio con un grupo amino interno en el polinucleótido. Además, los polinucleótidos se pueden unir a un soporte sólido por reacción de un nucleófilo a base de azufre con el soporte sólido, por ejemplo, como se describe en el documentoWO2005/047301. Un ejemplo todavía adicional de polinucleótidos molde con soporte sólido es cuando los polinucleótidos molde se unen al hidrogel soportado sobre soportes sólidos a base de sílice u otros soportes sólidos, por ejemplo, como se describe en los documentos WO00/31148, WO01/01143, WO02/12566, W003/014392, Patente Estadounidense. No. 6,465,178 y WO00/53812.
Una superficie particular a la cual pueden inmovilizarse los polinucleótidos molde es un hidrogel de poliacrilamida. Los hidrogeles de poliacrilamida se describen en las referencias citadas anteriormente y en el documento WO2005/065814.
Las moléculas de molde de ADN se pueden unir a perlas o micropartículas, por ejemplo como se describe en la Patente Estadounidense. No. 6,172,218. La unión a perlas o micropartículas puede ser útil para las aplicaciones de secuenciación. Se pueden preparar bibliotecas de perlas donde cada perla contiene diferentes secuencias de ADN. Bibliotecas y métodos ilustrativos para su creación se describen en Nature. 437, 376-380 (2005); Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005). La secuenciación de matrices de tales perlas mediante el uso de nucleótidos expuestos en la presente descripción está dentro del alcance de la descripción.
Los moldes que se van a secuenciar pueden formar parte de una "matriz" sobre un soporte sólido, en cuyo caso la matriz puede adoptar cualquier forma conveniente. Por lo tanto, el método de la descripción es aplicable a todos los tipos de matrices de alta densidad, que incluye las matrices de una sola molécula, las matrices agrupadas y las matrices de perlas. Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente descripción pueden usarse para secuenciar moldes sobre esencialmente cualquier tipo de matriz, que incluyen, pero no se limitan a las formadas por inmovilización de moléculas de ácido nucleico sobre un soporte sólido.
Sin embargo, los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la descripción son particularmente ventajosos en el contexto de la secuenciación de matrices agrupadas. En matrices agrupadas, distintas regiones en la matriz (a menudo denominadas sitios o características) comprenden múltiples moléculas de molde de polinucleótidos. Generalmente, las moléculas de polinucleótidos múltiples no se pueden resolver individualmente por medios ópticos y, en cambio, se detectan como un conjunto. En dependencia de cómo se forma la matriz, cada sitio en la matriz puede comprender múltiples copias de una molécula de polinucleótido individual (por ejemplo, el sitio es homogéneo para una especie de ácido nucleico de cadena sencilla o doble particular) o incluso copias múltiples de un pequeño número de diferentes moléculas de polinucleótidos (por ejemplo, copias múltiples de dos especies diferentes de ácido nucleico). Se pueden producir matrices agrupadas de moléculas de ácidos nucleicos mediante el uso de técnicas generalmente conocidas en la técnica. A manera de ejemplo, los documentos WO 98/44151 y WO00/18957, describen métodos de amplificación de ácidos nucleicos en donde tanto el molde como los productos de amplificación permanecen inmovilizados sobre un soporte sólido con el fin de formar matrices compuestas de grupos o "colonias" de moléculas de ácidos nucleicos inmovilizado. Las moléculas de ácidos nucleicos presentes en las matrices agrupadas preparadas de acuerdo con estos métodos son moldes adecuados para la secuenciación mediante el uso de los nucleótidos modificados marcados con los compuestos colorantes de la descripción.
Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente descripción también son útiles en la secuenciación de moldes en matrices de moléculas individuales. El término "matriz de molécula única" o "SMA", como se usa en la presente descripción, se refiere a una población de moléculas de polinucleótidos, distribuidas (o agrupadas) sobre un soporte sólido, en donde la separación de cualquier polinucleótido individual de todas las demás de la población es tal que es posible resolver individualmente las moléculas de polinucleótidos individuales. Las moléculas de ácidos nucleicos diana inmovilizadas sobre la superficie del soporte sólido pueden por lo tanto poder resolverse por medios ópticos en algunas modalidades. Esto significa que una o más señales distintas, cada una en representación de un polinucleótido, ocurrirá dentro del área resoluble del dispositivo de imagen particular usado.
Se puede lograr la detección de una sola molécula en donde el espacio entre las moléculas de polinucleótidos adyacentes en una matriz es de al menos 100 nm, más particularmente al menos 250 nm, aún más particularmente al menos 300 nm, incluso más particularmente al menos 350 nm. Por lo tanto, cada molécula es individualmente resoluble y detectable como un punto fluorescente de molécula única, y la fluorescencia de dicho punto fluorescente de molécula única también exhibe fotoblanqueamiento en una sola etapa.
Los términos "resuelto individualmente" y "resolución individual" se usan en la presente descripción para especificar que, cuando se visualiza, es posible distinguir una molécula en la matriz de sus moléculas vecinas. La separación entre las moléculas individuales sobre la matriz se determinará, en parte, por la técnica particular usada para resolver las moléculas individuales. Las características generales de las matrices de moléculas individuales se entenderán por referencia a las solicitudes publicadas WO00/06770 y WO 01/57248. Aunque un uso de los nucleótidos modificados de la descripción es en reacciones de secuenciación por síntesis, la utilidad de los nucleótidos modificados no se limita a tales métodos. De hecho, los nucleótidos pueden usarse ventajosamente en cualquier metodología de secuenciación que requiera la detección de marcadores fluorescentes unidos a nucleótidos incorporados en un polinucleótido.
En particular, los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la descripción pueden usarse en protocolos de secuenciación fluorescente automatizada, particularmente secuenciación fluorescente del ciclo coloranteterminador basado en el método de secuenciación de terminación de cadena de Sanger y colaboradores. Tales métodos generalmente usan enzimas y secuenciación de ciclo para incorporar didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia en una reacción de secuenciación de extensión del cebador. Los llamados métodos de secuenciación de Sanger y los protocolos relacionados (tipo Sanger) usan la terminación de cadena aleatoria con didesoxinucleótidos marcados.
Por lo tanto, la presente descripción también abarca nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes que son didesoxinucleótidos que carecen de grupos hidroxilo en las posiciones 3' y 2', dichos didesoxinucleótidos modificados son adecuados para su uso en métodos de secuenciación tipo Sanger y similares.
Los nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes de la presente descripción que incorporan grupos de bloqueo 3', serán reconocidos, también pueden ser útiles en los métodos de Sanger y protocolos relacionados, ya que el mismo efecto logrado mediante el uso de los nucleótidos didesoxi modificados puede lograrse mediante el uso de los nucleótidos modificados que tienen grupos de bloqueo 3'-OH: ambos evitan la incorporación de nucleótidos posteriores. Cuando se usan los nucleótidos de acuerdo con la presente descripción, y que tienen un grupo de grupo de bloqueo 3', se usarán en los métodos de secuenciación tipo Sanger, se apreciará que los compuestos colorantes o marcadores detectables unidos a los nucleótidos no necesitan estar conectados a través de enlazadores escindibles, ya que en cada instancia en la que se incorpora un nucleótido marcado de la descripción, no existen nucleótidos que necesitan ser incorporados subsecuetemente y por lo tanto, el marcador no necesita ser retirado del nucleótido.
La presente descripción también proporciona kits que incluyen nucleósidos y/o nucleótidos modificados marcados con colorantes. Tales kits generalmente incluirán al menos un nucleótido o nucleósido modificado marcado con un colorante expuesto en la presente descripción junto con al menos un componente adicional. Los componentes adicionales pueden ser uno o más de los componentes identificados en un método expuesto anteriormente o en la sección de Ejemplos a continuación. Algunos ejemplos no limitantes de componentes que pueden combinarse en un kit de la presente descripción se exponen a continuación.
En una modalidad particular, un kit puede incluir al menos un nucleótido o nucleósido modificado marcado con un colorante expuesto en la presente descripción junto con nucleótidos o nucleósidos modificados o no modificados. Por ejemplo, los nucleótidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la descripción pueden suministrarse en combinación con nucleótidos nativos o sin marcar, y/o con nucleótidos marcados con fluorescencia o cualquier combinación de los mismos. En consecuencia, los kits pueden comprender nucleótidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la descripción y nucleótidos modificados marcados con otros, por ejemplo, compuestos colorantes de la técnica anterior. Las combinaciones de nucleótidos pueden proporcionarse como componentes individuales separados (por ejemplo, un tipo de nucleótido por recipiente o tubo) o como mezclas de nucleótidos (por ejemplo, dos o más nucleótidos mezclados en el mismo recipiente o tubo).
Cuando los kits comprenden una pluralidad, particularmente dos, más particularmente cuatro, nucleótidos modificados marcados con un compuesto colorante, los diferentes nucleótidos pueden estar marcados con diferentes compuestos colorantes, o uno puede ser oscuro, sin compuestos colorantes. Cuando los diferentes nucleótidos están marcados con diferentes compuestos colorantes, una característica de los kits es que dichos compuestos colorantes son colorantes fluorescentes espectralmente distinguible. Como se usa en la presente descripción, el término "colorantes fluorescentes espectralmente distinguible" se refiere a los colorantes fluorescentes que emiten energía fluorescente a longitudes de onda que pueden distinguirse mediante un equipo de detección fluorescente (por ejemplo, una plataforma de secuenciación de ADN con base capilar comercial) cuando están presentes dos o más de estos colorantes en una muestra. Cuando dos nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes fluorescentes se suministran en forma de kit, una característica de algunas modalidades es que los colorantes fluorescentes espectralmente distinguible pueden excitarse a la misma longitud de onda, tal como, por ejemplo, por el mismo láser. Cuando cuatro nucleótidos modificados marcados con compuestos colorantes fluorescentes se suministran en forma de kit, una característica de algunas modalidades es que dos de los colorantes fluorescentes espectralmente distinguible pueden excitarse en una longitud de onda y los otros dos colorantes espectralmente distinguibles pueden excitarse en otra longitud de onda. Las longitudes de onda de excitación particulares son 532 nm, 630 nm a 700 nm, particularmente 660 nm.
En una modalidad, un kit incluye un nucleótido modificado marcado con un compuesto de la presente descripción y un segundo nucleótido modificado marcado con un segundo colorante en donde los colorantes tienen una diferencia en la absorbancia máxima de al menos 10 nm, particularmente de 20 nm a 50 nm. Más particularmente, los dos compuestos colorantes tienen desplazamientos de Stokes de entre 15-40 nm, donde el "desplazamiento de Stokes" es la distancia entre las longitudes de onda del pico absorción y del pico de emisión.
En una modalidad adicional, un kit puede incluir además otros dos nucleótidos modificados marcados con colorantes fluorescentes en donde los colorantes son excitados por el mismo láser a 488 nm a 550 nm, particularmente 532 nm. Los colorantes pueden tener una diferencia en la absorbancia máxima de al menos 10 nm, particularmente de 20 nm a 50 nm. Más particularmente, los dos compuestos colorantes pueden tener desplazamientos de Stokes de entre 20-40 nm. Aún más particularmente, los dos compuestos colorantes pueden tener un máximo de absorbancia diferente por debajo de 640 nm, particularmente por debajo de 600 nm. Los colorantes particulares que son espectralmente distinguibles de los colorantes de polimetina de la presente descripción y que cumplen los criterios anteriores son análogos de polimetina como se describe en el documento de Patente Estadounidense. No. 5,268,486 (por ejemplo, Cy3) o WO 0226891 (Alexa 532; Molecular Probes A20106) o polimetinas asimétricas como se describe en el documento de Patente Estadounidense. No. 6,924,372. Los colorantes alternativos incluyen análogos de rodamina, por ejemplo, tetrametil rodamina y análogos de la misma.
En una modalidad alternativa, los kits de la descripción pueden contener nucleótidos donde la misma base se marca con dos compuestos diferentes. Un primer nucleótido puede marcarse con un compuesto de la descripción. Un segundo nucleótido puede marcarse con un compuesto espectralmente distinto, por ejemplo, un colorante 'verde' que absorbe a menos de 600 nm. Un tercer nucleótido puede marcarse como una mezcla del compuesto de la descripción y el compuesto espectralmente distinto, y el cuarto nucleótido puede ser 'oscuro' y no contener marcador. En términos simples, por lo tanto, los nucleótidos 1-4 pueden marcarse como 'verde', 'rojo', 'rojo/verde' y oscuro. Para simplificar la instrumentación adicional, se pueden marcar cuatro nucleótidos con dos colorantes excitados con un solo láser y, por lo tanto, el marcado de los nucleótidos 1-4 puede ser 'rojo 1', 'rojo 2' 'rojo 1/rojo 2', y oscuro o 'verde 1', 'verde 2' verde 1/verde 2 'y oscuro.
Los nucleótidos pueden contener dos colorantes de la presente descripción. Los colorantes donde Ra1 o Ra2 es un anillo aromático adicional fusionado a carbonos adyacentes del anillo de indol que absorben a una longitud de onda más larga que donde los colorantes no tienen la conjugación aromática adicional. Un kit puede contener dos o más nucleótidos marcados con colorantes de la descripción. Un kit puede contener un nucleótido marcado con un compuesto de la descripción donde cada uno de Raí y Ra2 es independientemente H, SO3", sulfonamida o halógeno, y un nucleótido marcado con un compuesto de la descripción donde uno o ambos Ra1 y Ra2 es un anillo adicional fusionado a un átomo de carbono adyacente. Los kits pueden contener un nucleótido adicional donde el nucleótido se marca con un colorante que absorbe en la región de 520 nm a 560 nm. Los kits pueden contener además un nucleótido no marcado.
Los nucleótidos pueden contener dos colorantes de la presente descripción. Los colorantes donde p es uno absorben a una longitud de onda más corta que donde p es dos. Un kit puede contener dos o más nucleótidos marcados con colorantes de la descripción. Un kit puede contener un nucleótido marcado con un compuesto de la descripción donde p es uno, y un nucleótido marcado con un compuesto de la descripción donde p es dos. Los kits pueden contener un nucleótido adicional donde el nucleótido se marca con un tercer marcador. Los kits pueden contener además un nucleótido no marcado o un nucleótido marcado con un cuarto marcador.
Aunque los kits se ejemplifican anteriormente con respecto a las configuraciones que tienen diferentes nucleótidos que están marcados con diferentes compuestos colorantes, se entenderá que los kits pueden incluir 2, 3, 4 o más nucleótidos diferentes que tienen el mismo compuesto colorante.
En modalidades particulares, un kit puede incluir una enzima polimerasa capaz de catalizar la incorporación de los nucleótidos modificados en un polinucleótido. Otros componentes que se incluirán en tales kits pueden incluir tampones y similares. Los nucleótidos modificados marcados con colorantes de acuerdo con la descripción, y otros componentes de nucleótidos que incluyen mezclas de diferentes nucleótidos, pueden proporcionarse en el kit en una forma concentrada para diluirse antes de su uso. En tales modalidades, también se puede incluir un tampón de dilución adecuado. Nuevamente, uno o más de los componentes identificados en un método expuesto en la presente descripción pueden incluirse en un kit de la presente descripción.
Se nota que, como se usa en esta descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que expresa e inequívocamente se limite a una referente.
Detalles experimentales
Preparación de 4-(3-bromopropoxi)fenol
A una solución de hidroquinona (3 g; 27,2 mmol) en metanol (30 mL) se le añadió bajo N2 hidróxido de potasio (2 g; 35,4 mmol) y 1,3-dibromopropano (8,3 mL; 81,7 mmol). La reacción se agitó toda la noche a 65 °C. Luego, los volátiles se eliminaron al vacío y se añadió éter dietílico (30 mL). La capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio y agua (30 mL cada una). La capa orgánica se secó con sulfato de magnesio, se filtró y los volátiles se eliminaron al vacío. La suspensión beige resultante se purificó por cromatografía instantánea sobre gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo 70/30) al proporcionar 2,6 g de una suspensión blanca. Rendimiento: 41 %.<r>M<n>de protón (CDCls): 6,87-6,73 (4H, m, H-Ar); 5,36 (1H, s, OH); 4,04 (2H, t, J = 6,2 Hz); 3,60 (2H, J = 6,2 Hz); 2,28 (2H, q, J = 6,2 Hz, H-2). RMN C 13(CDCls) : 152,8; 149,6; 116,1; 116,0; 66,7; 34,4; 30,2.
Preparación de ácido 4- (2,3-dimetil-3H-indol-3-il)butano-1-sulfónico
La fenilhidrazina (8,6 mmol; 850 ^L) y el ácido 5-metil-6-oxoheptanosulfónico (7,2 mmol; 1,5 g) en ácido acético glacial (19 mL) se agitaron a 130 °C durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y el disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol 80/20) que proporciona 1,23 g de espuma de color amarillo pálido. Rendimiento: 61 %. EM (DUIS): E-: 280 (M-1); RMN de protón (D2O): 7,42 (1H, d, J = 7,8Hz, H-4); 7,27 (1H, t, J = 7,8Hz, H-5); 7,24 (1H, d, J = 7,8Hz, H-7); 7,17 (1H, t, J = 7,8Hz, H-6); 2,59 (2H, dd, J = 7,6; 8,9Hz, H-11); 2,21-2,13 (1H, m); 1,88-1,73 (2H,m, H-8); 1,52-1,43 (2H, m, H-10); 1,13 (3H, s, CH3 on C-3); 0,70-0,63 (1H, m, H-9a); 0,51-0,44 (1H, m, H-9b). R<mn>^<s^ o>): 190,8; 152,3; 143,7; 127,8; 125,7; 122,2; 118,6; 57,9; 50,5; 48,9; 35,6; 24,0; 22,5; 21,8; 14,8.
Preparación de 1 -(3-(4-hidroxifenoxi)propil)-2,3-dimetil-3-(4-sulfobutil)-3H-indol-1 -io
4-(3-bromopropoxi)fenol (1,90 mmol, 438 mg) y de ácido 4-(2,3-dimetil-3H-indol-3-il)butano-1-sulfónico (1,58 mmol, 504 mg) en sulfolano (2 mL) se agitaron a 120 °C durante 4,5 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se purificó directamente por cromatografía instantánea sobre gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol 65/35) que proporciona 329 mg de un aceite gris pálido. Rendimiento: 40 %. EM (DUIS): E-: 430 (M-1), E+: 432 (M+1); RMN de protón (TFA): 7,75-7,65 (4H, m, H-4/5/6/7); 6,98 (2H, d, J = 8,9 Hz, Har on phenyl); 6,85 (2H, d, J = 8,9 Hz, Har on phenyl); 4,82 (2H, bt, J = 6,6 Hz, H-12); 4,24-4,13 (2H, m, H-14); 3,69 (1H, s); 3,20-3,06 (2H, m, H-11); 2,91 (3H, s, CH3 on C-2); 2,63 2,52 (2H, m, H-13); 2,41-2,75 (2H,m, H-8); 1,90-1,83 (2H, m, H-10); 1,66 (3H, s, CH3 on C-3); 1,13-0,93 (2H, m, H-9). Preparación de 1-(3-(4-hidroxifenoxi) propil)-2,3,3-trimetil-3H-indol-1-io
Se agitaron el 4-(3-bromopropoxi)fenol (1,40 mmol, 324 mg) y trimetilindolenina (0,80 mmol, 129 ^L) en sulfolano (1 mL) a 120 °C durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se purificó directamente por cromatografía instantánea sobre gel de sílice (eluyente: diclorometano/metanol 90/10) que proporciona 260 mg de un aceite gris pálido. Rendimiento: 84 %. RMN de protón (MeOD): 7,06 (1H, d, J = 7,2 Hz, H-4); 7,00 (1H, bt, J = 7,8 Hz, H-5); 6,77-6,64 (5 H, m, H-6 y H-on fenil orto y meta); 6,58 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-7); 3,90 (2H, t, J = 5,8 Hz, H-8); 3,71 (2H, J = 6,5Hz, H-10); 2,04 (2H, bq, J = 6,1 Hz, H-9); 1,30 (6H, s, 2xCH3 en C-3). RMN C13 (MeOD): 162,7; 153,6; 152,3; 147,2; 138,6; 128,6; 122,7; 119,5; 116,8; 116,6; 116,5; 103,3; 66,8; 45,1; 39,7; 30,6; 27,5.
Preparación de AF670POPO
Esquema de síntesis del producto:
Procedimiento de síntesis del colorante:
El ácido 4-(2,3-dimetil-3H-indol-3-il) butano-1-sulfónico (204 mg, 400 ^mol) y el monoclorhidrato de malonaldehído Bis (fenilimina) (114 mg, 440 ^mol) se agitaron en una mezcla de ácido acético anhidrido/ácido acético (2/0,6 mL) a 100 °C durante 1,5 h. Se añadieron acetato de potasio (118 mg; 1,20 mmol) y la sal de benzindolio sulfonada X (193 mg; 400 ^mol). La mezcla de reacción se agitó a 100 °C por 3 h. Luego se enfrió a temperatura ambiente y se añadió éter dietílico (40 mL). Un sólido azul oscuro se estrelló. Se filtró, se lavó con éter dietílico extra (40 mL) y se disolvió en agua (25 mL) que contiene ~30 % de acetonitrilo. La solución azul oscuro resultante se filtró y se purificó por HPLC preparativa. Las fracciones principales coloreadas de azul (absorción máxima ~ 665 nm) se recogieron y los disolventes se eliminaron al vacío. EM (DUIS): E-: 869 (M-1); 434,1 (M-2/2).
Los colorantes DX-DX se prepararon de manera similar mediante el uso de materiales de partida apropiados
En la tabla 1, las propiedades espectrales de algunos colorantes preparados de esta manera (soluciones en agua, DO ~ 0,2) en comparación con parámetros similares del colorante analógo estructural conocido Std (Patente: P6240WO)
Preparación de AF550POPOS0
Esquema de síntesis del producto:
1-(3-(4-hidroxifenoxi) propil)-2,3,3-trimetil-3H-indol-1-io (150 mg, 385 ^mol) y N,N'-difenilformamidina (74 mg, 385 ^mol) se agitó en ácido acético anhidrido (2 mL) a 80 °C durante 2 h. Se añadieron ácido acético (0,5 mL), acetato de potasio (567 mg, 5,78 mmol) y la sal de indolio sulfonada X (166 mg; 385 ^mol). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C por 2,5 h. Luego los volátiles se eliminaron bajo presión reducida y se añadió éter dietílico (20 mL). Un sólido rojo oscuro se estrelló. Se filtró, se lavó con éter dietílico extra (20 mL) y se disolvió en agua (15 mL) que contiene ~5 % de acetonitrilo. La solución roja oscura resultante se filtró y se purificó por HPLC preparativa. Las fracciones principales coloreadas de rojo (absorción máxima ~ 550 nm) se recogieron y los disolventes se eliminaron al vacío. EM (DUIS):No acetiladoE-: 671,0 (M-1); E+: 673,3 (M+1); 774,4 (Et3N+ sal).
En la tabla 2, las propiedades espectrales de algunos colorantes preparados de esta manera (soluciones en agua, DO ~ 0,2) en comparación con parámetros similares de los colorantes analógos estructurales conocidos (Patente: P6240WO)
Conjugado de nucleótidos con colorante AF670POPO (FFA-AF670POPO)
Se añadieron DMA anhidro (3 mL), TSTU (18 mg; 58,8 ^mol) y Base de Hunig (0,05 mL) a la muestra seca del colorante AF670POPO (60 mg; 53,5 ^mol). Se desarrolló el éster activado de color azul. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. De acuerdo con la TLC (20 % de H2O en CH3CN) la activación se completó. Una vez completada la activación, la solución de 5 pppA-LN3 como una sal de trietilamonio (53 mg; 56,1 ^mol) en DMA/agua (0,5/0,3 mL) se añadió a la reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno por 18 h. El progreso del acoplamiento se verificó por TLC (20 % de H2O en acetonitrilo). La mezcla de reacción se enfrió hasta ~4 °C con un baño de hielo, luego se añadió una solución 10 de TEAB 0,1 M (5 mL) en agua y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se aplicó a la columna con ~ 25 g de suspensión de resina DEAE Sephadex en solución de TEAB 0,05 M en agua y lavada con TEAB (gradiente de concentración de 0,1 M a 1 M). Las fracciones coloreadas se recogieron y se evaporaron, luego se coevaporaron de nuevo con agua para eliminar más TEAB y aspirar a sequedad. El residuo se redisolvió luego en TEAB 0,1 M. Esta solución se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 nm de tamaño de poro en un frasco Corning 20. El producto se purificó por HPLC mediante el uso de una columna de fase reversa C18 con acetonitrilo-TEAB 0,1 M. Rendimiento del 74 % (basado en la densidad óptica de la solución mediante el uso del coeficiente de extinción estimado).
Conjugado de nucleótidos con colorante AF550POPOS0 (FFT-AF550POPOSO)
Se añadieron DMA anhidro (3 mL), TSTU (19 mg; 63,5 ^mol) y Base de Hunig (0,05 mL) a la muestra seca del colorante AF550POPOS0 (39 mg; 57,7 ^mol). Se desarrolló el éster activado de color rojo. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución de pppT-LN3 como una sal de trietilamonio (59 mg; 63,5 ^mol) en DMA/agua (0,5/0,3 mL) se añadió a la reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno por 18 h. El progreso del acoplamiento se verificó por TLC (20 % de H2O en acetonitrilo). La mezcla de reacción se enfrió hasta ~4 °C con un baño de hielo, luego se añadió una solución 10 de TEAB 0,1 M (5 mL) en agua y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se aplicó a la columna con ~ 25 g de suspensión de resina DEAE Sephadex en solución de TEAB 0,05 M en agua y lavada con TEAB (gradiente de concentración de 0,1 M a 1 M). Las fracciones coloreadas se recogieron y se evaporaron, luego se coevaporaron de nuevo con agua para eliminar más TEAB y aspirar a sequedad. El residuo se redisolvió luego en TEAB 0,1 M. Esta solución se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,2 nm de tamaño de poro en un frasco Corning 20. El producto se purificó por HPLC mediante el uso de una columna de fase reversa C18 con acetonitrilo-TEAB 0,1 M. Rendimiento del 48 % (basado en la densidad óptica de la solución mediante el uso del coeficiente de extinción estimado).
Descripción de las figuras
Figura 1 Los FFAs marcados con AF670POPO y sus análogos junto con ffA-NR650C5 se probaron en sistemas de secuenciación Illumina HiseqX modificados, en los que aumentaba la energía de excitación de ambos láseres (rojo y verde) en aproximadamente el 33 % se desplegó en el ciclo 101 y 251 para la lectura 1 y 2 respectivamente (véase las señales en la figura 1).
Figura 2 Inesperadamente, en el caso de ffA-NR650C5 (figura 2), se observó que las señales rojas no respondían proporcionalmente al cambio de energía del láser rojo. Consecuentemente, la forma de los diagramas de dispersión de separación de base se alteró en el ciclo 101. El círculo superior derecho está más cerca del círculo superior izquierdo, lo que significa que es más difícil distinguir entre los marcadores respectivos. Los fenómenos que ocurrieron indicaron que NR650C5 probablemente estaba fotosaturado o casi saturado a la densidad de la energía máxima usada en HiSeqX. Este cambio de diagrama de dispersión afecta negativamente la calidad de la secuencia. Curiosamente, con AF670POPO y sus análogos, se observó una mejora notable. Su señal se incrementó proporcionalmente con el cambio de densidad de la energía del láser. El diagrama de dispersión mantuvo sus separaciones y la forma del ciclo 100 al ciclo 101 cuando se desplegó la energía máxima (figura 2). El círculo superior derecho en la figura 2 está más alejado del círculo superior izquierdo que el círculo superior derecho en la figura 1. Por lo tanto, los marcadores están mejor separados en la figura 2.
Figura 3 En los análogos de 550 nm, fue interesante observar que la presencia de hidroxilo en el anillo de fenilo tiene un impacto perjudicial en la intensidad de fluorescencia (figura 3). La fluorescencia de AF550POPS0 sin el OH fenólico fue 3 veces más fuerte que el AF550POPOS0 que tiene el OH.
Figura 4 Estos nuevos análogos ofrecieron oportunidades para modular y optimizar la distribución del diagrama de dispersión para las aplicaciones de secuenciación. Por ejemplo, cuando T se marcó con AF550POPOS0 y A con una mezcla de AF670POPO y NR550S0, se logró un buen diagrama de dispersión cuadrado (figura 4a). Adicionalmente, el reemplazo de NR550S0 con AF550POPS0 para la A verde mostró un muy buen diagrama de dispersión cuadrado (figura 4b).
Figura 5 En base a estas nuevas propiedades, ffT-LN3-AF550POPOS0 y ffA-LN3-AF670POPO se emplearon para secuenciar un molde humana en un HiSeqX modificado. Se logró una secuenciación de 2x150 pb de alta calidad tasa de error <1 % para la lectura 1 y tasa de error <1,5 % para la lectura 2 (las principales métricas de secuencia se muestran en la figura 5). Los gráficos de dispersión obtenidos mediante el uso de los marcadores de la técnica anterior significaron que no se pudo completar una lectura de 2x150 pb.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES 1. Un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en:o formas mesoméricas de los mismos.
- 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es:o formas mesoméricas del mismo.
- 3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es:o formas mesoméricas del mismo.
- 4. Un nucleótido u oligonucleótido marcado con un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el marcador está unido mediante un enlace amida formado a partir del grupo COOH.
- 5. Un nucleótido u oligonucleótido marcado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el marcador está unido a la posición C5 de una base de pirimidina o a la posición C7 de una base de 7-deaza purina a través de una fracción enlazadora.
- 6. Un nucleótido u oligonucleótido marcado de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, que comprende además un grupo de bloqueo 3'OH unido covalentemente a la ribosa o al azúcar desoxirribosa del nucleótido.
- 7. Un kit que comprende dos o más nucleótidos en el que al menos un nucleótido es un nucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6.
- 8. Un kit de acuerdo con la reivindicación 7, en el que los nucleótidos marcados se excitan utilizando un único láser.
- 9. Un kit de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el primero de cuatro nucleótidos es un nucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 y el segundo, tercer, y cuarto nucleótidos están marcados cada uno con un compuesto diferente, en el que cada compuesto tiene un máximo de absorbancia distinto y cada uno de los compuestos se distingue de los otros tres compuestos.
- 10. Un kit de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende cuatro nucleótidos en el que el primero de los cuatro nucleótidos es un nucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, un segundo de los cuatro nucleótidos es un nucleótido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 4-6, un el tercer nucleótido lleva un tercer marcador y un cuarto nucleótido no está marcado (oscuro).
- 11. Un kit de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende cuatro nucleótidos en el que el primero de los cuatro nucleótidos es un nucleótido marcado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, un segundo de los cuatro nucleótidos es un nucleótido marcado de acuerdo con las reivindicaciones 4-6, un tercer nucleótido lleva una mezcla de dos marcadores y un cuarto nucleótido no está marcado (oscuro).
- 12. Uso de un nucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en secuenciación, análisis de expresión, análisis de hibridación, análisis genético, análisis de ARN o ensayos de unión a proteínas.
- 13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12 en un instrumento de secuenciación automatizado, en el que dicho instrumento de secuenciación automatizado comprende dos láseres que funcionan a diferentes longitudes de onda.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB1516987.3A GB201516987D0 (en) | 2015-09-25 | 2015-09-25 | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2966353T3 true ES2966353T3 (es) | 2024-04-22 |
Family
ID=54544111
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16775846T Active ES2783851T3 (es) | 2015-09-25 | 2016-09-26 | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes |
| ES21152134T Active ES2966353T3 (es) | 2015-09-25 | 2016-09-26 | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes. |
| ES20153408T Active ES2860630T3 (es) | 2015-09-25 | 2016-09-26 | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES16775846T Active ES2783851T3 (es) | 2015-09-25 | 2016-09-26 | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES20153408T Active ES2860630T3 (es) | 2015-09-25 | 2016-09-26 | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10982261B2 (es) |
| EP (3) | EP3831825B1 (es) |
| JP (1) | JP6750006B2 (es) |
| KR (1) | KR102053108B1 (es) |
| CN (1) | CN108290870B (es) |
| AU (1) | AU2016325587B2 (es) |
| BR (1) | BR112018006001A2 (es) |
| CA (1) | CA2998459C (es) |
| DK (3) | DK3663290T3 (es) |
| ES (3) | ES2783851T3 (es) |
| FI (1) | FI3831825T3 (es) |
| GB (1) | GB201516987D0 (es) |
| HK (1) | HK1252747A1 (es) |
| IL (1) | IL258256B (es) |
| MX (2) | MX2018003658A (es) |
| MY (1) | MY190837A (es) |
| NZ (1) | NZ740630A (es) |
| PL (3) | PL3663290T3 (es) |
| PT (3) | PT3663290T (es) |
| RU (1) | RU2696562C1 (es) |
| TW (1) | TWI701236B (es) |
| WO (1) | WO2017051201A1 (es) |
| ZA (1) | ZA201801687B (es) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201516987D0 (en) | 2015-09-25 | 2015-11-11 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| GB201716931D0 (en) | 2017-10-16 | 2017-11-29 | Illumina Cambridge Ltd | New fluorescent compounds and their use as biomarkers |
| NL2023327B1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-17 | Illumina Inc | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| WO2020178231A1 (en) | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Illumina, Inc. | Multiplexed fluorescent detection of analytes |
| EP3931263A1 (en) | 2019-03-01 | 2022-01-05 | Illumina Cambridge Limited | Exocyclic amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels |
| JP2023539411A (ja) | 2020-07-28 | 2023-09-14 | イルミナ ケンブリッジ リミテッド | 置換クマリン色素及び蛍光標識としての使用 |
| US20220195516A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Illumina Cambridge Limited | Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing |
| KR20240009435A (ko) | 2021-05-20 | 2024-01-22 | 일루미나, 인코포레이티드 | 합성에 의한 시퀀싱을 위한 조성물 및 방법 |
| US20220403450A1 (en) | 2021-06-03 | 2022-12-22 | Illumina Software, Inc. | Systems and methods for sequencing nucleotides using two optical channels |
| WO2023186815A1 (en) | 2022-03-28 | 2023-10-05 | Illumina Cambridge Limited | Labeled avidin and methods for sequencing |
| US20230313292A1 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-05 | Illumina Cambridge Limited | Chromenoquinoline dyes and uses in sequencing |
| AU2023246851A1 (en) | 2022-03-31 | 2024-01-18 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for improving sequencing signals |
| CA3222797A1 (en) | 2022-03-31 | 2023-10-05 | Ramesh NEELAKANDAN | Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group |
| US20230383342A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-11-30 | Illumina Cambridge Limited | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
| US20230416279A1 (en) | 2022-06-28 | 2023-12-28 | Illumina Cambridge Limited | Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing |
Family Cites Families (69)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB517097A (en) | 1937-12-10 | 1940-01-19 | Adrianus Kleijn | An improved apparatus for testing the quality of grain and flour |
| GB1020295A (en) | 1963-06-11 | 1966-02-16 | Ilford Ltd | Cyanine dyes production and use |
| SU432166A1 (ru) | 1972-02-21 | 1974-06-15 | Л. И. Киренска Н. И. Смоль нинова, А. В. Казымов, Т. Н. Скр бнева , И. И. Левкоев | Способ получения имидакарбощ1анинов, содержащих в 3- и з'-положениях сульфо(сульфато) алкильнь{е или сульфоаллильные группы |
| JPS62123454A (ja) | 1985-08-08 | 1987-06-04 | Fuji Photo Film Co Ltd | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| US5268486A (en) | 1986-04-18 | 1993-12-07 | Carnegie-Mellon Unversity | Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes |
| US4801392A (en) | 1987-07-02 | 1989-01-31 | The Mead Corporation | Magnetic recording compositions containing ionic dye compounds as initiators |
| DE3912046B4 (de) * | 1988-09-02 | 2004-03-25 | Carnegie Mellon University | Verfahren zum Markieren einer Komponente einer wäßrigen Flüssigkeit und lumineszenzphotostabiles Reaktionsprodukt |
| US5302509A (en) | 1989-08-14 | 1994-04-12 | Beckman Instruments, Inc. | Method for sequencing polynucleotides |
| JPH03105338A (ja) | 1989-09-19 | 1991-05-02 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| JPH06332104A (ja) | 1993-05-18 | 1994-12-02 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| US5846719A (en) | 1994-10-13 | 1998-12-08 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide tags for sorting and identification |
| US6291203B1 (en) | 1995-11-13 | 2001-09-18 | Molecular Probes, Inc. | Cyanine dyes that stain cells and mitochondria |
| US6159673A (en) | 1996-07-17 | 2000-12-12 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Oxonol compound, light-sensitive material and process for the synthesis of oxonol compound |
| DE69837913T2 (de) | 1997-04-01 | 2008-02-07 | Solexa Ltd., Saffron Walden | Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäure |
| US6348599B1 (en) | 1997-07-28 | 2002-02-19 | Nycomed Amersham Plc | Cyanine dyes |
| US6465178B2 (en) | 1997-09-30 | 2002-10-15 | Surmodics, Inc. | Target molecule attachment to surfaces |
| US6485944B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-11-26 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| JP4306960B2 (ja) | 1998-02-04 | 2009-08-05 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション | ジデオキシ色素ターミネーター |
| GB9812596D0 (en) * | 1998-06-11 | 1998-08-12 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Energy transfer assay method |
| JP2002521064A (ja) | 1998-07-30 | 2002-07-16 | ソレックサ リミテッド | アレイ生体分子およびシークエンシングにおけるその使用 |
| GB0002310D0 (en) | 2000-02-01 | 2000-03-22 | Solexa Ltd | Polynucleotide sequencing |
| DE19834745A1 (de) | 1998-08-01 | 2000-02-03 | Agfa Gevaert Ag | Strahlungsempfindliches Gemisch mit IR-absorbierenden, anionischen Cyaninfarbstoffen und damit hergestelltes Aufzeichnungsmaterial |
| AR021833A1 (es) | 1998-09-30 | 2002-08-07 | Applied Research Systems | Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico |
| US6391937B1 (en) | 1998-11-25 | 2002-05-21 | Motorola, Inc. | Polyacrylamide hydrogels and hydrogel arrays made from polyacrylamide reactive prepolymers |
| ES2216764T3 (es) | 1999-06-21 | 2004-11-01 | Surface Specialties Austria Gmbh | Resinas diluibles con agua, procedimiento para su preparacion y su utilizacion. |
| US6372813B1 (en) | 1999-06-25 | 2002-04-16 | Motorola | Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays |
| US6664061B2 (en) | 1999-06-25 | 2003-12-16 | Amersham Biosciences Ab | Use and evaluation of a [2+2] photoaddition in immobilization of oligonucleotides on a three-dimensional hydrogel matrix |
| EP1491591B1 (en) | 1999-07-02 | 2009-07-01 | Visen Medical, Inc. | New fluorescence cyanine labels containing a sulfamido linker arm |
| US6716994B1 (en) * | 2000-01-04 | 2004-04-06 | Applera Corporation | Mobility-Modifying Cyanine Dyes |
| AU2001279244A1 (en) | 2000-08-09 | 2002-02-18 | Motorola, Inc. | The use and evaluation of a (2+2) photocycloaddition in immobilization of oligonucleotides on a three-dimensional hydrogel matrix |
| EP2325263B1 (en) | 2000-09-29 | 2013-01-23 | Life Technologies Corporation | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
| EP1221465A1 (en) | 2001-01-03 | 2002-07-10 | Innosense S.r.l. | Symmetric, monofunctionalised polymethine dyes labelling reagents |
| JP2002226731A (ja) | 2001-01-31 | 2002-08-14 | Fuji Photo Film Co Ltd | 新規シアニン色素化合物及び該シアニン色素化合物を含む光情報記録媒体 |
| EP1560838B1 (en) | 2002-08-23 | 2009-05-13 | Illumina Cambridge Limited | Labelled nucleotides |
| EP3795577A1 (en) | 2002-08-23 | 2021-03-24 | Illumina Cambridge Limited | Modified nucleotides |
| DE10258150A1 (de) | 2002-12-10 | 2004-07-08 | Dyomics Gmbh | Hydrophile Marker auf der Basis von Benzopyrylo-Polymethinen |
| ITPZ20030002A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Giuseppe Caputo | Composti del tipo cianina aventi un braccio di legame alchinilico |
| GB0321306D0 (en) | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Solexa Ltd | Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues |
| US7750163B2 (en) | 2003-10-31 | 2010-07-06 | GE Healthcare U.K. Limited | Cyanine dye labelling reagents |
| GB0326073D0 (en) | 2003-11-07 | 2003-12-10 | Solexa Ltd | Improvements in or relating to polynucleotide arrays |
| EP2610315B1 (en) | 2003-12-05 | 2016-08-31 | Life Technologies Corporation | Methine-substituted cyanine dye compounds |
| EP2789383B1 (en) | 2004-01-07 | 2023-05-03 | Illumina Cambridge Limited | Molecular arrays |
| US7705150B2 (en) | 2004-02-04 | 2010-04-27 | Biosearch Technologies, Inc. | Cyanine dyes |
| EP1866387B1 (en) | 2005-03-09 | 2013-05-08 | Cepheid | Polar dyes |
| GB2434150B (en) * | 2005-04-22 | 2009-10-14 | Ge Healthcare Uk Ltd | Fluoro-substituted 2-methyl indolinium precursors of reactive fluorescence labelling water-soluble cyanine dyes |
| JP4990886B2 (ja) | 2005-05-10 | 2012-08-01 | ソレックサ リミテッド | 改良ポリメラーゼ |
| US7569695B2 (en) | 2005-05-24 | 2009-08-04 | Enzo Life Sciences, Inc. | Dyes for the detection or quantification of desirable target molecules |
| US7868157B2 (en) | 2005-07-07 | 2011-01-11 | Biosearch Technologies, Inc. | Water soluble fluorescent compounds |
| GB0517097D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Solexa Ltd | Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof |
| DK1792949T3 (da) | 2005-12-05 | 2010-12-06 | Dyomics Gmbh | Hydrofil markør på basis af diastereoisomere cyaniner |
| US7279296B2 (en) | 2005-12-16 | 2007-10-09 | General Electric Company | Compositions and methods for lipoprotein uptake assays |
| JP5475244B2 (ja) | 2007-03-30 | 2014-04-16 | 株式会社Ａｄｅｋａ | シアニン化合物、該化合物を用いた光学フィルター及び光学記録材料 |
| CN101343420B (zh) | 2007-07-12 | 2013-10-16 | 大连理工大学 | 一类不对称菁类荧光染料 |
| EP2223086B2 (en) | 2007-12-14 | 2016-06-01 | Biotium Inc. | Fluorescent compounds - labeling dyes |
| CN101723874B (zh) | 2008-10-31 | 2013-09-11 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 花菁类化合物及其在生物样品染色中的用途 |
| CN101750476B (zh) | 2008-12-08 | 2015-06-03 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 血液分析试剂及其使用方法 |
| WO2010096720A2 (en) * | 2009-02-19 | 2010-08-26 | Cornell University | Methods and compositions for altering photophysical properties of fluorophores via proximal quenching |
| JP2012524153A (ja) | 2009-04-17 | 2012-10-11 | ライコア インコーポレイテッド | 置換シアニン染料を用いた蛍光イメージング |
| US20100291706A1 (en) | 2009-05-15 | 2010-11-18 | Millipore Corporation | Dye conjugates and methods of use |
| US8906612B2 (en) | 2010-08-25 | 2014-12-09 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Scaffold-based polymerase enzyme substrates |
| EP2625281A2 (en) | 2010-10-06 | 2013-08-14 | EMD Millipore Corporation | Cyanine compounds, conjugates and method of use |
| WO2013041117A1 (en) | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Illumina Cambrigde Ltd. | Dyes for labelling molecular ligands |
| WO2013109859A1 (en) | 2012-01-20 | 2013-07-25 | Cornell University | Dye compositions, methods of preparation, conjugates thereof, and methods of use |
| JP2014113145A (ja) | 2012-11-19 | 2014-06-26 | Odc:Kk | 植物栽培用照明装置 |
| AU2013380645B2 (en) * | 2013-03-08 | 2018-03-15 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| US8809551B1 (en) | 2013-03-08 | 2014-08-19 | Illumina Cambridge Limited | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| EP3062825B1 (en) * | 2013-10-31 | 2022-08-24 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Near-infrared fluorescent contrast bioimaging agents and methods of use thereof |
| GB201408077D0 (en) | 2014-05-07 | 2014-06-18 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
| GB201516987D0 (en) | 2015-09-25 | 2015-11-11 | Illumina Cambridge Ltd | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |
-
2015
- 2015-09-25 GB GBGB1516987.3A patent/GB201516987D0/en not_active Ceased
-
2016
- 2016-09-26 PL PL20153408T patent/PL3663290T3/pl unknown
- 2016-09-26 MX MX2018003658A patent/MX2018003658A/es unknown
- 2016-09-26 FI FIEP21152134.9T patent/FI3831825T3/fi active
- 2016-09-26 ES ES16775846T patent/ES2783851T3/es active Active
- 2016-09-26 DK DK20153408.8T patent/DK3663290T3/da active
- 2016-09-26 PT PT201534088T patent/PT3663290T/pt unknown
- 2016-09-26 US US15/762,073 patent/US10982261B2/en active Active
- 2016-09-26 PL PL21152134.9T patent/PL3831825T3/pl unknown
- 2016-09-26 AU AU2016325587A patent/AU2016325587B2/en active Active
- 2016-09-26 TW TW105131115A patent/TWI701236B/zh active
- 2016-09-26 EP EP21152134.9A patent/EP3831825B1/en active Active
- 2016-09-26 ES ES21152134T patent/ES2966353T3/es active Active
- 2016-09-26 DK DK16775846.5T patent/DK3353166T3/da active
- 2016-09-26 WO PCT/GB2016/052986 patent/WO2017051201A1/en active Application Filing
- 2016-09-26 ES ES20153408T patent/ES2860630T3/es active Active
- 2016-09-26 PT PT211521349T patent/PT3831825T/pt unknown
- 2016-09-26 EP EP20153408.8A patent/EP3663290B1/en active Active
- 2016-09-26 CA CA2998459A patent/CA2998459C/en active Active
- 2016-09-26 NZ NZ740630A patent/NZ740630A/en unknown
- 2016-09-26 KR KR1020187011601A patent/KR102053108B1/ko active IP Right Grant
- 2016-09-26 DK DK21152134.9T patent/DK3831825T3/da active
- 2016-09-26 CN CN201680065460.XA patent/CN108290870B/zh active Active
- 2016-09-26 EP EP16775846.5A patent/EP3353166B1/en active Active
- 2016-09-26 JP JP2018513301A patent/JP6750006B2/ja active Active
- 2016-09-26 PT PT167758465T patent/PT3353166T/pt unknown
- 2016-09-26 PL PL16775846T patent/PL3353166T3/pl unknown
- 2016-09-26 BR BR112018006001A patent/BR112018006001A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-09-26 MY MYPI2018000370A patent/MY190837A/en unknown
- 2016-09-26 RU RU2018108872A patent/RU2696562C1/ru active
-
2018
- 2018-03-12 ZA ZA2018/01687A patent/ZA201801687B/en unknown
- 2018-03-20 IL IL258256A patent/IL258256B/en active IP Right Grant
- 2018-03-23 MX MX2022007933A patent/MX2022007933A/es unknown
- 2018-09-19 HK HK18112066.4A patent/HK1252747A1/zh unknown
-
2021
- 2021-03-03 US US17/191,390 patent/US11530439B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2966353T3 (es) | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes. | |
| ES2620423T3 (es) | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes | |
| ES2914688T3 (es) | Nuevos colorantes fluorescentes y sus usos como biomarcadores | |
| ES2924771T3 (es) | Compuestos de polimetino con desplazamientos de Stokes largos y su uso como marcas fluorescentes | |
| ES2856217T3 (es) | Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes | |
| BR112020026528B1 (pt) | Composto de cumarina substituído com amina exocíclica, nucleotídeo ou oligonucleotídeo, kit, método de sequenciamento e método para sintetizar o referido composto | |
| BR112019027614A2 (pt) | ligantes de braços pendentes curtos para nucleotídeos em aplicações de sequenciamento | |
| US11981955B2 (en) | Polymethine compounds and their use as fluorescent labels |