ES2388066T3 - Plantas con niveles nulos o reducidos de ácidos grasos saturados en sus semillas y aceite derivado de dichas semillas - Google Patents

Abstract

Planta de canola productora de semillas que contienen una fracción de aceite que comprende menos del 3,5% de saturados totales y entre el 70% y menos del 80% de ácido oleico, comprendiendo dicha planta al menos un polinucleótido incorporado de manera estable en su genoma que codifica una delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5 o una variante de la misma, presentando dicha variante una secuencia de aminoácidos que mantiene una identidad de secuencia igual o superior al 80% de la SEC ID nº 5 y presentando la misma actividad enzimática que la delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5, y siendo dichos saturados totales la suma de los ácidos grasos 16:0, 18:0, 20:0, 22:0 y 24:0.

Description

Plantas con niveles nulos o reducidos de ácidos grasos saturados en sus semillas y aceite derivado de dichas semillas.

Antecedentes de la invención

Los aceites de origen vegetal han sustituido gradualmente a los aceites y las grasas de origen animal como principal fuente de grasa alimentaria. Pese a ello, en la mayoría de los países industrializados, la ingesta de grasas saturadas sigue suponiendo entre el 15% y 20% del consumo total de calorías. En su esfuerzo por fomentar hábitos más saludables, el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) ha recomendado recientemente que las grasas saturadas supongan menos del 10% de la ingesta calórica diaria. Para facilitar la concienciación del consumidor, las actuales instrucciones de etiquetado emitidas por el USDA exigen ahora que el nivel total de ácidos grasos saturados sea inferior a 1,0 g por ración de 14 g para que un alimento pueda recibir la etiqueta de "Bajo contenido en grasas saturadas” (“low-sat”) e inferior a 0,5 g por ración de 14 g para recibir la etiqueta de “Sin grasas saturadas” (“no-sat”). Esto significa que el contenido en ácidos grasos saturados de los aceites vegetales tiene que ser inferior al 7% y al 3,5% para recibir las respectivas etiquetas de "bajo en" y "sin” grasas saturadas. Desde la emisión de estas directrices, la demanda por parte de los consumidores de aceites con bajo contenido en grasas saturadas ha experimentado un gran aumento. Hasta la fecha, dicha demanda se ha satisfecho fundamentalmente con el aceite de canola y, en mucha menor medida, con los aceites de girasol y de cártamo.

Las características del aceite, ya sea de origen vegetal o animal, dependen principalmente del número de átomos de carbono y de hidrógeno, así como del número y la posición de los enlaces dobles que comprenden las cadenas de ácidos grasos. La mayoría de los aceites vegetales están compuestos por cantidades variables de los ácidos grasos palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1), linoleico (18:2) y linolénico (18:3). De ordinario, el ácido palmítico y esteárico se denominan "saturados" porque sus cadenas de carbono están saturadas por átomos de hidrógeno y, por tanto, carecen de enlaces dobles; contienen el máximo número posible de átomos de hidrógeno. En cambio, los ácidos oleico, linoleico y linolénico, están formados por cadenas de ácido graso de 18 carbonos dotadas de uno, dos y tres enlaces dobles, respectivamente. El ácido oleico se considera normalmente un ácido graso monoinsaturado, mientras que el ácido linoleico y linolénico se consideran ácidos grasos polinsaturados. El Ministerio de Agricultura de Estados Unidos define los productos sin grasas saturadas (“no sat”) como todo aquel producto que contiene menos del 3,5% en peso de ácidos grasos saturados combinados (respecto a la cantidad total de ácidos grasos).

Las grasas insaturadas (monoinsaturadas y polinsaturadas) resultan beneficiosas, sobre todo cuando se consumen con moderación, pero, en cambio, las grasas saturadas y trans no lo son, puesto que elevan los niveles de colesterol LDL en la sangre. El colesterol ingerido con los alimentos también aumenta el colesterol LDL y puede contribuir a causar cardiopatías aun sin elevar las LDL. Por consiguiente, una alimentación sana requiere el consumo de alimentos con un bajo contenido en grasas saturadas, grasas trans y colesterol.

El valor para la salud de los niveles elevados de monoinsaturados, en particular del ácido oleico, como principal componente graso de la dieta, ha sido confirmado por estudios recientes. Se cree que las dietas de ese tipo reducen la incidencia de arteriosclerosis que provocan las dietas ricas en ácidos grasos saturados. En consecuencia, existe una necesidad de aceites vegetales comestibles con un alto contenido de ácidos grasos monoinsaturados. La mutagénesis de las semillas se ha utilizado para producir un aceite de semilla de colza con un contenido máximo de ácidos grasos saturados del 4% (Solicitud de patente internacional PCT, número de publicación WO 91/15578).

Más del 13% del suministro mundial de aceite comestible en 1985 se produjo a partir de la planta oleaginosa Brassica, denominada vulgarmente colza. Brassica es la tercera fuente más importante de aceite comestible, sólo superada por la soja y la palmera de aceite. Como la Brassica es capaz de germinar y crecer con temperaturas relativamente bajas, también es uno de los pocos cultivos oleaginosos comestibles comercialmente importantes que pueden cultivarse en las regiones agrícolas más frías, además de servir como cultivo de invierno en zonas más templadas. Asimismo, los aceites vegetales en general, y el aceite de colza en particular, son cada vez más utilizados en aplicaciones industriales debido a su potencial para ofrecer un rendimiento comparable al de los aceites sintéticos o minerales/ nafténicos, con la gran ventaja añadida de que son biodegradables.

El aceite de canola es el aceite vegetal con menor contenido en ácidos grasos saturados. "Canola" alude a la semilla de colza (Brassica) que contiene como máximo un 2 por ciento en peso de ácido erúcico (C22:1) respecto al contenido total de ácidos grasos por semilla (y preferiblemente como máximo un 0,5 por ciento en peso y, con mayor preferencia, básicamente el 0 por ciento en peso) y que produce, después de la molturación, una harina seca (con aire) que contiene menos de 30 micromoles por gramo de harina desgrasada (sin aceite). Estos tipos de semilla de colza se distinguen por su comestibilidad en comparación con variedades más tradicionales de la especie.

Los aceites vegetales se pueden modificar mediante métodos químicos. Este tipo de métodos se han utilizado para obtener un aceite para ensalada/cocina con un contenido de ácidos grasos saturados inferior al 3% aproximadamente (nº Pat. US 4 948 811); el aceite se puede formar a partir de una reacción química o por la separación física de los lípidos saturados. En dicha patente se hace una referencia general al uso de la "ingeniería genética" para conseguir un aceite de las características deseadas (véase la columna 3, línea 58 y siguientes), pero en ningún momento se ofrece una explicación detallada de cómo se puede modificar una planta oleaginosa concreta para disponer del aceite vegetal de las características deseadas.

La composición de ácidos grasos de los aceites vegetales se ha venido modificando típicamente por medio de las técnicas de mejora genética tradicionales. Estas técnicas utilizan el germoplasma existente como fuente de mutaciones naturales que alteran la composición de ácidos grasos. Tales mutaciones se descubren y se seleccionan utilizando el cribado adecuado, conjuntamente con la mejora posterior. Así, por ejemplo, se ha utilizado esta estrategia para reducir la cantidad de erucato, un ácido graso de cadena larga, en el aceite de colza (Stefansson, B. R. [1983] en High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils, Kramer J. K. G. et al., eds; Academic Press, New York; pp. 144-161), así como para aumentar la cantidad de oleato, un ácido graso monoinsaturado, en el aceite de maíz (solicitud de patente US nº Ser. 07/554.526).

En fecha reciente, se ha recurrido al empleo de mutágenos para aumentar el número de mutaciones a partir de las cuales poder seleccionar las características deseadas. Sin embargo, los mutágenos actúan por lo general inactivando o modificando genes que ya existen, lo cual provoca una pérdida o reducción de una función particular. Así pues, la introducción de una nueva característica mediante mutagénesis, conlleva a menudo la pérdida de algún carácter existente. Además, conseguir los objetivos deseados con mutágenos suele ser una empresa incierta. Tanto es así, que son contados los tipos de composiciones modificadas de ácidos grasos logradas de este modo en aceites vegetales. Un ejemplo de mutación "creada" que afecta a la composición de ácidos grasos es la disminución de los ácidos grasos polinsaturados en el aceite de colza, en concreto del linoleato y el linolenato, acompañada de un aumento del ácido graso monoinsaturado oleato (Auld, M., et al., [1992] Crop Sci. en prensa). Otro ejemplo consiste en la disminución de los ácidos grasos saturados en ese mismo tipo de aceite (Solicitud de patente internacional PCT, número de publicación WO 91/15578). Con todo, la bioquímica de la síntesis del aceite de semillas es compleja y no se conoce con precisión: varios mecanismos podrían contribuir a los cambios en las composiciones de los ácidos grasos observados en el aceite de colza (Solicitud de patente internacional PCT, número de publicación WO 91/15578). El uso de la mutagénesis para provocar tales cambios es, en esencia, aleatorio e inespecífico.

La posibilidad de modificar la composición de ácidos grasos mediante ingeniería genética podría permitir, en teoría, la introducción precisa y controlada de genes o de productos génicos deseables. De ese modo, se podrían introducir en las plantas nuevos caracteres completamente independientes de los genes existentes, o bien inactivar o modificar genes seleccionados. No obstante, uno de los requisitos básicos para utilizar con efectividad la ingeniería genética con vistas a modificar las composiciones de ácidos grasos consiste en disponer de un modelo bastante preciso de los mecanismos que regulan la síntesis y el metabolismo de los ácidos grasos en la célula vegetal.

La patente US n. º 6 495 738 (véase también WO 99/50430) muestra que los niveles de ácidos grasos saturados en el aceite de maíz y en las semillas de tabaco se puede alterar mediante la expresión de una delta-9 desaturasa de palmitato-CoA fúngica dentro de una célula vegetal. Con toda probabilidad, estas proteínas desaturan enzimáticamente las moléculas de palmitato-CoA, preferentemente eliminando dos átomos de hidrógeno y añadiendo un enlace doble entre el noveno y el décimo átomo de carbono de la fracción CoA de la molécula, generando así palmitoleico-CoA (16:1 delta-9). El palmitoleico-CoA acaba incorporándose en el aceite de la semilla, disminuyendo los niveles totales de ácidos grasos saturados del mismo. El nivel total de ácidos grasos saturados del aceite de maíz, con un valor promedio en torno al 13,9%, no cumple las actuales directrices de etiquetado antes señaladas. Es más, el maíz no se suele considerar una planta oleaginosa como la soja, la canola, el girasol y similares. De hecho, el aceite producido y extraído del maíz se considera un subproducto del proceso de molturación húmeda utilizado para la extracción del almidón. Por esta razón, existe poco interés en modificar los niveles de ácidos grasos saturados del aceite de maíz.

Se ha postulado que en las semillas oleaginosas la síntesis de ácidos grasos tiene lugar fundamentalmente en el plastidio, y que los ácidos grasos recién sintetizados se exportan al citoplasma, donde son utilizados para la síntesis de los triglicéridos, que acontece en las membranas del retículo endoplasmático.

El principal producto de la síntesis de los ácidos grasos es el palmitato (16:0), que al parecer es alargado de manera eficiente hasta convertirse en estearato (18:0). Todavía en el plastidio, los ácidos grasos saturados pueden ser entonces desaturados por la acción de una enzima llamada delta-9 desaturasa, que introduce uno o varios enlaces dobles de carbono. En concreto, el estearato puede ser rápidamente desaturado por una enzima delta-9 desaturasa plastídica convirtiéndose así en oleato (18:1). De hecho, el palmitato también puede ser desaturado y convertido en palmitoleato

(16:1) merced a la delta-9 desaturasa plastídica, pero este ácido graso sólo aparece en cantidades ínfimas (0-0,2%) en la mayoría de aceites vegetales.

En definitiva, los principales productos de la síntesis de ácidos grasos en el plastidio son el palmitato, el estearato y el oleato. En la mayoría de aceites, el oleato es el principal ácido graso sintetizado, mientras que los ácidos grasos saturados se hallan en porcentajes mucho menores.

La desaturación ulterior de los ácidos grasos vegetales en el citoplasma tras su salida del plastidio parece estar restringida al oleato, que puede ser desaturado y convertido en linoleato (18:2) y linolenato (18:3). Dependiendo de la planta, el oleato puede ser modificado aún más por elongación (hasta 20:1, 22:1 y/o 24:1) o por la adición de grupos funcionales. Estos ácidos grasos, junto con los ácidos grasos saturados palmitato y estearato, pueden entonces incorporarse a los triglicéridos.

La enzima vegetal delta-9 desaturasa es soluble. Está localizada en el estroma del plastidio y emplea como sustratos los ácidos grasos recién sintetizados esterificados a ACP, predominantemente estearil-ACP. Esto contrasta con la enzima delta-9 desaturasa de levadura, que, ubicada en la membrana del retículo endoplasmático, (RE, o microsómica), utiliza ácidos grasos esterificados a Co-A como sustratos, y desatura los ácidos grasos saturados palmitato y estearato. Las patentes US nº 5 723 595 y 6 706 950 conciernen a una desaturasa vegetal.

El gen de la delta-9 desaturasa de levadura ha sido aislado de Saccharomyces cerevisiae, clonado y secuenciado (Stukey, J. E. et al., J. Biol. Chem. 264:16537-16544 [1989]; Stukey, J. E. et al., J. Biol. Chem. 265:20144-20149 [1990]). Este gen también ha sido utilizado para transformar la misma cepa de levadura en condiciones en las que aparentemente está sobreexpresado, y bajo las cuales genera un aumento de la acumulación de lípidos de reserva en las células transformadas de la levadura, según indica la microscopía de fluorescencia con Rojo Nilo como tinción para los triglicéridos (Pat. US nº 5 057 419). La composición de ácidos grasos no se caracterizó. Esta referencia contiene una discusión general acerca del uso de la información extraída del gen aislado de la delta-9 desaturasa de levadura para, en primer lugar, aislar otros genes desaturasa de la levadura, o de otros organismos, y después reintroducirlos en una levadura o en una planta bajo ciertas condiciones. Se ha especulado que esto podría desembocar en una expresión elevada con el fin de modificar el aceite producido y su composición de ácidos grasos.

Posteriormente, se describió que el gen de la delta-9 desaturasa de levadura había sido introducido en tejido foliar de tabaco (Polashcok, J. et al., FASEB J. 5:A11157 [1991]) y que al parecer se había expresado en dicho tejido. Además, se logró expresar este gen en el tomate. Véase Wang et al., J. Agric Food Chem. 44:3399-3402 (1996); y C. Wang et al., Phytochemistry 58:227-232 (2001). Si bien se han descrito algunos aumentos de ciertos insaturados y descensos de ciertos saturados tanto en el tabaco como en el tomate, está claro que ninguna de estas especies son cultivos oleaginosos. Este gen de levadura también se ha introducido en Brassica napus (véase la patente US n. º 5 777 201). Aunque se ha descrito una reducción del palmitato y el estearato (saturados) y un aumento del palmitoleato y el oleato (insaturados) (véanse las Tablas 1a y 1b en el Ejemplo 7 de la citada patente), esta referencia se discute con más detalle al principio del apartado de Exposición detallada, más adelante. WO 00/11012 y la patente US n. º 6 825 335 se refiere a un gen sintético de desaturasa de levadura destinado a ser expresado en una planta, en la que el gen comprende un dominio desaturasa y un dominio cyt b5. El apartado de Antecedentes de tales referencias analiza en detalle la síntesis de los ácidos grasos.

Las características de rendimiento, ya sean alimentarias o industriales, de un aceite vegetal dependen notablemente de su perfil de ácidos grasos, esto es, de las especies de ácidos grasos presentes en el aceite y de las cantidades relativas y absolutas de cada una de ellas. Si bien se conocen varias relaciones entre el perfil de ácidos grasos y las características de rendimiento, muchas se ignoran. Pese a ello, el tipo y la cantidad de insaturación presente en un aceite vegetal repercuten tanto en las aplicaciones alimentarias como industriales.

El aceite de canola estándar contiene aproximadamente de un 8-12% de ácido linolénico, lo que lo sitúa en una categoría similar al aceite de soja en lo que concierne a estabilidad oxidativa y, a la postre, también del sabor. La estabilidad oxidativa del aceite de canola se puede mejorar de diversas formas, como por ejemplo hidrogenándolo para reducir la cantidad de insaturación, añadiéndole antioxidantes, o mezclándolo con otro aceite o aceites dotados de mayor estabilidad oxidativa. Por ejemplo, la mezcla del aceite de canola con aceites con bajo contenido en ácido linolénico, como el de girasol, reduce el nivel de 18:3 mejorando su estabilidad. No obstante, estos tratamientos aumentan forzosamente el gasto de aceite y pueden acarrear otras complicaciones: por ejemplo, la hidrogenación tiende a aumentar tanto el nivel de ácidos grasos saturados como el grado de insaturación trans, consecuencias indeseables en las aplicaciones alimentarias.

Hay disponibles aceites con alto contenido en oleico, pero, además del posible gasto añadido de estos aceites premium, los aceites vegetales procedentes de cultivos explotados por sus niveles muy elevados de ácido oleico pueden resultar inadecuados para los usos industriales porque retienen niveles bastante elevados de ácidos grasos polinsaturados, principalmente de ácido linoleico y/o linolénico. Tales aceites pueden seguir siendo adecuados para aplicaciones alimentarias, incluso como aceites para cocinar, pero en las condiciones más rigurosas que exigen las aplicaciones industriales pueden tener una estabilidad oxidativa inadecuada. Incluso la adición de antioxidantes puede no bastar para que dichos aceites alcancen los niveles de estabilidad oxidativa requeridos en las aplicaciones industriales; esto probablemente sea consecuencia de los niveles de ácido linolénico de tales aceites, un ácido extremadamente sensible a la oxidación.

La estabilidad oxidativa es importante en las aplicaciones industriales para prolongar la vida de los lubricantes en condiciones de calor y presión, así como en presencia de subproductos químicos. En tales aplicaciones, el ácido linolénico y, en menor medida, el ácido linoleico, son de nuevo los principales responsables de la deficiente estabilidad oxidativa.

A tenor de lo anterior, sería deseable obtener una variedad de Brassica napus que siendo agronómicamente viable produjese un aceite de semillas con el nivel suficiente de estabilidad oxidativa para posibilitar su uso en aplicaciones alimentarias, y que además fuera lo suficientemente estable por sí solo, o, dependiendo de la aplicación concreta, respondiera suficientemente a los antioxidantes, para ser útil en aplicaciones industriales.

La solicitud de patente europea EP 323753, la patente US n. º 5 840 946, y la patente US n. º 5 638 637 conciernen a un aceite de colza con un contenido de oleico del 80-90% (en peso, del contenido total de ácidos grasos) y como máximo un 2% de ácido erúcico. El contenido de ácido oleico se mejoró mediante técnicas de mutagénesis. Las reivindicaciones de la patente US n. º 5 840 946 especifican que el aceite también tiene un contenido máximo de ácido erúcico del 2%, y un contenido mínimo de ácido alfa-linolénico del 3,5%, así como un contenido de ácidos grasos saturados en forma de ácido esteárico y palmítico que no supera el 7%. Estas patentes se refieren a mutagénesis seguida de selección.

Las patentes US n. º 5 387 758, 5 434 283 y 5 545 821 se refieren a semillas de colza que contienen de 2-4% de ácido esteárico y palmítico combinados (en peso), y un contenido máximo de ácido erúcico de aproximadamente el 2% en peso. Se utilizaron técnicas de mutagénesis para reducir el contenido de ácido esteárico y palmítico.

La solicitud internacional WO 92/03919 y las patentes US n. º 5 668 299, 5 861 187 y 6 084 157 se refieren a semillas, plantas y aceites de colza que contienen perfiles alterados de ácidos grasos. Se mencionan varios de estos perfiles, todos los cuales contemplan un contenido máximo de ácido erúcico de en torno al 2%, combinado con un contenido de ácido palmítico que oscila aproximadamente entre el 7% y 12%, de ácido linoleico del 14% al 20% aproximadamente, de ácido esteárico de alrededor del 0,8% hasta alrededor del 1,1%, y de ácido alfa-linolénico de un 7% aproximadamente hasta alrededor del 9%, así como ciertos rangos de saturados acordes con las indicaciones de la FDA. Estas patentes

definen los ácidos grasos saturados y los "saturados FDA” como la suma de los ácidos láurico (C12:0), mirístico (C14:0),

palmítico (C16:0) y esteárico (C18:0).

La solicitud internacional WO 93/06714 y las patentes US n. º 6 270 828, 6 562 397, 6 680 396 y 6 689 409 conciernen a aceite y semillas de canola con glucosinolatos reducidos (y por tanto, un contenido reducido de azufre), así como a un contenido de ácido alfa-linolénico de entre el 2% y el 7%, aproximadamente.

La patente US n. º 6 169 190 se refiere a aceite obtenido a partir de semillas de canola con un contenido de ácido graso oleico de aproximadamente 71-77% y un contenido de ácido linolénico inferior al 3% aproximadamente. También se reivindican relaciones de oleico:linolénico de entre 34-55.

Las patentes US nº 6 063 947 y 5 850 026 reivindican aceite extraído de semillas de canola, plantas de canola relacionadas y métodos de producción del aceite, en los cuales el aceite posee un contenido de ácido oleico superior aproximadamente al 80% (alrededor de 86-89%), un contenido de ácido linoleico aproximadamente de entre 2% y 6%, un contenido de ácido alfa-linolénico inferior al 2,5% (aproximadamente 1-2%), y un contenido de ácido erúcico inferior aproximadamente al 2% (después de la hidrólisis). Estos patentes se refieren a la inhibición específica en la semilla de la expresión génica de la oleato desaturasa microsómica (delta-12 desaturasa que convierte el ácido oleico en ácido linoleico) y la linoleato desaturasa microsómica (delta-15 desaturasa que convierte el ácido linoleico en ácido alfalinolénico).

La patente US n. º 5 952 544 reivindica fragmentos de un plastidio vegetal o una enzima desaturasa de ácidos grasos delta-15 microsómica, que cataliza una reacción entre los carbonos 15 y 16.

Las patentes US n. º 4 627 192 y 4 743 402 se refieren a semillas y aceite de girasol con un contenido de ácido oleico de aproximadamente 80-94% (respecto al contenido total de ácidos grasos de los mismos) y un relación de linoleicooleico inferior aproximadamente a 0,09. Estas plantas de girasol se obtuvieron mediante técnicas de mejora genética tradicionales.

El documento WO 2003002751 se refiere al uso de genes de cinasas y similares para alterar el fenotipo del aceite de las plantas.

La capacidad de los genes de la delta-9 desaturasa para alterar de manera significativa (y deseable) el perfil de ácidos grasos de cultivos oleaginosos ya de por sí beneficiosos, en particular para reducir los niveles de grasas saturadas sin afectar negativamente otros aspectos de la planta y del aceite, es impredecible.

Breve sumario de la invención

Gracias al uso de un gen de delta-9 desaturasa en canola (Brassica), se logró una sorprendente reducción de los ácidos grasos saturados en semillas de la planta canola. La presente invención incluye canola capaz de producir tales aceites y semillas. La invención también proporciona semillas de dichas plantas cuyos aceites poseen características y perfiles de ácidos grasos particularmente ventajosos, que no se habían conseguido hasta el momento. En algunas formas de realización preferidas, una planta preferida comprende al menos dos copias de un gen de delta-9 desaturasa. Las semillas producidas por tales plantas sorprendentemente no muestran los efectos del silenciamiento génico sino reducciones adicionales de los niveles totales de ácidos grasos saturados que resultan sorprendentes.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la consecución de una reducción superior al 60% de ácidos grasos saturados en Arabidopsis. Esta gráfica resume los datos de las semillas T2 y T3 de un solo evento de Arabidopsis.

La Figura 2 muestra una reducción de los "saturados" de hasta el 60-70% en semillas T2 de Arabidopsis procedentes de otros 18 transformantes. Los datos ilustrados en esta gráfica consisten en una combinación de los datos numéricos de la Tabla 8 y datos numéricos anteriores.

La Figura 3 muestra que las grasas saturadas se redujeron en más de un 43% en la canola Westar (reducción que alcanzó el 50% cuando se incluyó a 24:0).

La Figura 4A muestra un gráfico de barras que compara los saturados totales de semillas procedentes de varias plantas de canola que comprenden el Evento 36-11.19 en comparación con un control. Las Figuras 4B y 4C presentan los datos numéricos representados en el gráfico de barras.

La Figura 5A muestra un gráfico de barras que compara los saturados totales de semillas procedentes de varias plantas de canola que comprenden el Evento 218-11.30 en comparación con un control. Las Figuras 5B y 5C presentan los datos numéricos representados en el gráfico de barras.

Las Figuras 6A-F muestran los datos de medias semillas de las pruebas de campo con T3. Las Figuras 6A y 6B muestran claramente la reducciones de C16:0 y los aumentos de C16:1 en los eventos transgénicos en comparación con los nulos (eventos en los que el transgén se ha segregado fuera de la planta) y los controles naturales (líneas no transformadas). Las Figuras 6C y 6D muestran claramente las reducciones de C18:0 y los aumentos de C18:1 en los eventos transgénicos en comparación con los nulos y los controles naturales. Las Figuras 6E y 6F muestran claramente la reducciones de C20:0 y C22:0, respectivamente, en los eventos transgénicos en comparación con los nulos y los controles naturales.

Las Figuras 6G y 6H muestran claramente los cambios y la reducciones de C16:0, y los cambios y aumentos de C16:1 en los eventos transgénicos, en comparación con los nulos y los controles naturales. Las Figuras 6I y 6J muestran claramente los cambios y la reducciones de C18:0, así como los cambios y aumentos de C18:1 en los eventos transgénicos, en comparación con los nulos y los controles naturales. Las Figuras 6K y 6L muestran gráficos de barras similares para C18:2 y C18:3. La Figura 6M ilustra además reducciones en el total de saturados, en comparación con las líneas Nex 710 que resultan de por sí excelentes. La Figura 6N muestra las distribuciones correspondientes a 1000 semillas.

Las Figuras 7A y 7B ilustran los datos obtenidos con el protocolo del Ejemplo 16.

Las Figuras 8 y 9 son fotografías de dos geles con ADN de plantas F3, como se comenta en el Ejemplo 19.

Breve descripción de las secuencias

La SEC ID nº 1 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del marco abierto de lectura (ORF) correspondiente al gen de la delta-9 desaturasa optimizado para planta utilizado en la presente memoria.

La SEC ID nº 2 muestra la secuencia del ORF de la SEC ID nº 1 precedida por una secuencia Kozak y un sitio de clonación para BamHI (residuos 1-10), más un terminador de la traducción al final del ORF (residuos 1379-1381).

La SEC ID nº 3 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del cebador directo B delta-9 empleado para amplificar el gen delta-9.

La SEC ID nº 4 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del cebador inverso B delta-9 empleado para amplificar el gen delta-9.

La SEC ID nº 5 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID nº 1.

Descripción detallada de la invención

Gracias al uso de un gen de delta-9 desaturasa en la planta canola (Brassica), se logró una sorpredente reducción de los ácidos grasos saturados en semillas de dicha planta que dio como resultado niveles de ácidos grasos equiparables a la denominación “Sin grasas saturadas” (“no sat”). La presente invención incluye tales plantas y también proporciona semillas y aceites de las mismas, aceites que poseen unas características y perfiles de ácidos grasos particularmente ventajosos, que no se habían conseguido hasta el momento.

El gen de la delta-9-CoA desaturasa microsómica de Aspergillus nidulans se ejemplifica en la presente memoria. Esta delta-9 desaturasa es una enzima de membrana que cataliza la reacción de 16:0-CoA y 18:0-CoA a 16:1-CoA y 18:1CoA (añade un enlace doble en la posición delta-9). La presente invención produjo otra sorpresa en forma de una reducción beneficiosa de los niveles de otros ácidos grasos saturados, como C20:0, C22:0 y C24:0, a la par que un aumento de los niveles de insaturados C16:1 y C18:1 (con escasos o nulos incrementos de C18:2 y C18:3, o incluso reducciones de estos polinsaturados relativamente menos estables en ciertos casos). Hasta hoy, no está claro si esta sería una buena enzima (si el gen podría expresarse bastante, entre otros aspectos) en Brassica y en otras plantas de semillas oleaginosas "buenas", que ya poseen un perfil de ácidos grasos deseable, pero no óptimo (Por ejemplo, en el maíz sólo provocó una reducción del 10% en los saturados).

Como se menciona en el apartado de Antecedentes, dados los complejos perfiles de ácidos grasos y las vías metabólicas de los diferentes organismos y plantas, y la diferente maquinaria celular física de los mismos, aunque este gen y su enzima puedan ejercer un efecto en Brassica, no se puede esperar que los efectos resulten beneficiosos. Como se comenta en el citado apartado, los aumentos de uno o varios tipos de ácidos grasos beneficiosos causan a menudo descensos en otros ácidos grasos igualmente beneficiosos, así como penalizaciones agronómicas (otros efectos adversos manifiestos en las plantas modificadas). También resultó sorprendente que la invención pudiera practicarse sin observar efectos adversos en otras valiosas características agronómicas como el tamaño de la vaina, rendimiento de las semillas, tamaño de las semillas, rendimiento de aceite y similares. No hubo efectos adversos en las plantas homocigotas portadoras de un inserto transgénico simple. Algunos apilamientos homocigotos dobles (creados por el cruce de dos eventos transgénicos) mostraron un descenso en el número de vainas y el número de semillas; la causa se desconoce todavía. No obstante, la Tabla 27 contiene apilamientos (esto es, eventos con un aumento aparente del número de copias) que poseen rendimientos de semilla similares a los controles no transgénicos y también una composición acorde con la denominación “Sin grasas saturadas” ('no sat').

Otra razón de la impredictibilidad radica en las diferencias entre las desaturasas, extensivas incluso a las delta-9 desaturasas de levadura, hongo, planta o animal. Las diferencias en las desaturasas se pueden atribuir en parte a diferencias en las estructuras celulares de los organismos de origen de dichas desaturasas. Una desaturasa de levadura de la patente US n. º 5 777 201 se ha comentado antes en el apartado de Antecedentes. Esta es más larga que la desaturasa de Aspergillus ejemplificada en la presente memoria (510 aminoácidos frente a 455 aminoácidos). Además, sólo comparte una identidad aproximada del 52% sobre unos 400 aminoácidos (determinada mediante BLAST y BestFit, un programa de Smith-Waterman; ambos en EMBOSS). Las Tablas 1a y 1b del Ejemplo 7 de esa patente demuestran que las reducciones en los ácidos grasos saturados logradas con la desaturasa de levadura fueron mucho menores que las logradas con la presente invención por medio de la desaturasa de Aspergillus ejemplificada en canola. Varios son los factores que pueden barajarse para explicar el rendimiento relativamente menor de la desaturasa de levadura. Por ejemplo, la proteína podría ser intrínsecamente inestable en las plantas (mientras que la desaturasa de interés parece ser muy estable en canola). También podría haber diferencias en otras propiedades enzimáticas, como la eficiencia catalítica, afinidad por el sustrato, afinidad por cofactores y similares.

Si se compara con la desaturasa de cártamo de las patentes US n. º 5 723 595 y 6 706 950, la desaturasa de Aspergillus ejemplificada en la presente memoria es más larga (455 aminoácidos frente a 396 aminoácidos). La desaturasa de cártamo también se encuentra en el plastidio, mientras que la desaturasa de Aspergillus de la presente invención se halla en el RE/microsomas/compartimento citoplasmático. Es más, la desaturasa de cártamo emplea sustratos acil-ACP que encuentra en el plastidio, en cambio, la desaturasa de Aspergillus utiliza sustratos acil-CoA presentes en el compartimento citoplasmático. Por ello, en la presente invención, se desconoce si una fracción sustancial del conjunto de sustratos acil-CoA está disponible para la desaturasa de Aspergillus.

Por ello, suscitó una gran sorpresa el hecho de que la delta-9 desaturasa de interés fuera capaz de brindar plantas, semillas y aceite de canola dotadas de excelentes propiedades, en particular vinculadas a la mejora de las cualidades alimenticias del aceite. Con gran sorpresa, se logró una reducción superior al 60% de los ácidos grasos saturados en Arabidopsis, así como una reducción superior al 43% de esos mismos ácidos grasos en canola. De nuevo, es importante subrayar que estos resultados se obtuvieron en una planta que ya había ofrecido uno de los mejores perfiles de ácidos grasos de cualquier planta adecuada. Esta invención también se utilizó para conseguir perfiles y relaciones de ácidos grasos sorprendentes y ventajosos, como se muestra y se analiza detalladamente en páginas posteriores. Aunque el ácido esteárico se considera un ácido graso saturado, se ha descubierto que puede reducir el colesterol, de ahí que niveles relativamente elevados de ácido esteárico puedan ser beneficiosos. De manera similar, niveles relativamente altos de ácido araquidónico pueden ser deseables. Como se muestra en los datos de la presente memoria, el aceite obtenido de semillas de la invención posee perfiles ventajosos de estos dos ácidos grasos, además de niveles deseables de ácido vaccénico, por ejemplo. Los niveles ventajosos de estos ácidos grasos y/o de saturados totales aparecen en plantas dotadas de una altura y rendimiento adecuados que presentan otras características beneficiosas para las plantas de calidad comercial (sin plantas enanas, por ejemplo). En la presente memoria se presentan, a modo de ejemplo, datos de tales plantas de la invención.

Es preciso señalar que la invención no se limita a la desaturasa mostrada como ejemplo. Varias desaturasas y delta-9 desaturasas están disponibles en GENBANK, y se pueden realizar alineamientos de la secuencia con procedimientos estándar para observar y comparar las diferencias en las secuencias de las enzimas. Así pues, enzimas similares a la ejemplificada aquí se pueden utilizar según la invención.

Por ejemplo, la desaturasa de Aspergillus de interés tiene dos dominios. El primero de ellos (que ocupa aproximadamente los dos tercios amino-terminales de la molécula) es el dominio de la desaturasa, y el segundo (a grandes caracteres el tercio C-terminal de la molécula) es un dominio citocromo b5. Los residuos 62-279, por ejemplo, de la SEC ID n. º 5 se pueden alinear con los residuos 4-233 de la desaturasa de ácidos grasos gnl|CDD|25523 pfam00487, por ejemplo. Los residuos 332-407 de la SEC ID n. º 5 se pueden alinear con los residuos 1-74 de gnl|CDD|22935 pfam00173 (dominio citocromo b5). Los residuos 17-305 de la SEC ID nº 5 se pueden alinear con los residuos 3-288 del dominio de metabolismo lipídico de la desaturasa de ácidos grasos gnl|CDD|11113 COG1398 (OLE1). Los residuos 301-449 de la SEC ID n. º 5 se pueden alinear con los residuos 11-163 del CYB5 (citocromo b implicado en el metabolismo lipídico) de gnl|CDD|14396 COG5274. El dominio desaturasa de la SEC ID nº 5 carente del citocromo b5 podría ser funcional, ya que esta es la estructura general de las desaturasas plastídicas vegetales. Asimismo, se ha publicado una supuesta desaturasa microsómica de pino (LOCUS AF438199) que utiliza sustratos acil-CoA del compartimento citoplasmático, y que carece del dominio cyt b5. También sería posible cambiar el dominio citocromo b5 de Aspergillus por el de otro organismo, incluso uno procedente de una desaturasa citoplasmática vegetal. Estos dominios, o los segmentos que codifican uno o ambos, se pueden usar como sondas para definir las moléculas de la invención, tal y como se discute con más detalle abajo.

Por ello, los genes y las proteínas útiles según la invención no sólo incluyen las secuencias enteras que se ejemplifican específicamente aquí, sino también porciones, segmentos y/o fragmentos de dichas secuencias (incluidas deleciones internas y/o terminales de las moléculas enteras), variantes, mutantes, quimeras y fusiones de las anteriores. Las proteínas utilizadas en la invención pueden portar aminoácidos sustituidos siempre que conserven la actividad enzimática característica de las proteínas ejemplificadas específicamente en la presente memoria. Los genes "variantes" contienen secuencias de nucleótidos que codifican las mismas proteínas o proteínas equivalentes dotadas de una funcionalidad equivalente a la proteína ejemplificada. Los términos "proteínas variantes" y "proteína equivalente" aluden a proteínas que poseen la misma o básicamente la misma actividad enzimática que la delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID n. º 5. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la alusión a una secuencia "equivalente" atañe a las secuencias portadoras de sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que mejoran o que no afectan negativamente a la funcionalidad. Los fragmentos que conservan la funcionalidad también quedan englobados en esta definición. Los fragmentos y otros equivalentes que conservan la misma función o una función similar, como un fragmento correspondiente de una proteína ejemplificada quedan dentro del ámbito de la presente invención. Los cambios, como las sustituciones o adiciones de aminoácidos, pueden llevarse a cabo con diferentes fines, tales como aumentar (o reducir) la estabilidad de la proteína frente a las proteasas, sin disminuir material o sustancialmente su funcionalidad.

Se pueden construir fácilmente variaciones de genes utilizando, por ejemplo, técnicas ordinarias que provocan mutaciones puntuales. Además, la patente US nº 5 605 793, por ejemplo, describe métodos para generar una diversidad molecular adicional utilizando el reensamblaje de ADN después de una fragmentación al azar. Los genes variantes se pueden utilizar para producir proteínas variantes; se pueden emplear hospedadores recombinantes para producir las proteínas variantes. Utilizando esas técnicas de transposición de genes, se pueden construir genes y proteínas equivalentes que comprenden, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 residuos contiguos cualquiera (aminoácidos o nucleótidos) de cualquier secuencia ejemplificada en la presente memoria.

Se puede disponer de fragmentos de genes enteros recurriendo a exonucleasas o endonucleasas comerciales con procedimientos estándar. Por ejemplo, se pueden emplear enzimas como la Bal31 o la mutagénesis dirigida para eliminar nucleótidos de los extremos de tales genes. Asimismo, se pueden obtener genes que codifican fragmentos activos mediante diversas enzimas de restricción. O utilizar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas proteínas.

Está comprendido en el alcance de la invención tal como se muestra en la presente memoria que las proteínas de interés puedan estar truncadas y conserven pese a ello su actividad funcional. Por "proteína truncada" se entiende que una porción de la proteína sea escindida y que, aun así, siga presentando actividad enzimática después de la escisión. Con técnicas de biología molecular es posible producir proteínas escindidas donde las bases de ADN que las codifican se eliminan mediante la digestión con endonucleasas de restricción u otras técnicas disponibles para los expertos en la materia. Después del truncamiento, dichas proteínas se pueden expresar en sistemas heterólogos como Escherichia coli, baculovirus, sistemas de virus vegetales, levaduras y similares y después se someten a pruebas en insectos como se expone en la presente memoria para determinar la actividad. Es bien conocido por los expertos en la técnica que se pueden producir con éxito proteínas truncadas que conserven su actividad funcional a pesar de carecer de la secuencia entera. Se sabe que las toxinas de Bacillus thuringiensis se pueden utilizar en una forma truncada (toxina central). Véase, p. ej., Adang et al., Gene 36:289-300 (1985), "Characterized full-length and truncated plasmid clones of the crystal protein of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta". Se conocen otros ejemplos de proteínas truncadas que conservan su actividad insecticida, como la esterasa de hormona juvenil de insecto (patente US n. º 5 674 485 concedida a los Directores de la Universidad de California). Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "toxina" también incluye las formas truncadas que conservan su funcionalidad.

Las proteínas y genes destinados al uso según a la invención se pueden definir, identificar y/u obtener utilizando sondas de oligonucleótidos, por ejemplo. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables que pueden serlo en virtud de un marcaje adecuado o que pueden ser fluorescentes de por sí, tal y como se describe en la solicitud internacional nº WO 93/16094. Las sondas (y los polinucleótidos de la presente invención) pueden ser de ADN, ARN o PNA. Además de adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U, en las moléculas de ARN), las sondas (y los polinucleótidos) sintéticos de la presente invención también pueden contener inosina (una base neutra capaz de aparearse con las cuatro bases que a veces se utiliza en lugar de una mezcla de las cuatro bases en las sondas sintéticas). Por tanto, siempre que en la presente memoria se aluda a un oligonucleótido degenerado sintético, y se utilice genéricamente "N" o "n", "N" o "n" podrán corresponder a G, A, T, C, o bien a inosina. El uso de los códigos de ambigüedad en la presente memoria está en consonancia con las convenciones de nomenclatura de la IUPAC como en la presentación de la solicitud de interés (por ejemplo, R significa A o G, Y significa C o T, etc.).

Como en bien sabido por los expertos en la materia, si una sonda molecular se hibrida con una muestra de ácido nucleico, puede ser razonable pensar que la sonda y la muestra presenten una homología/similitud/identidad sustancial. Preferentemente, primero se realiza la hibridación del polinucleótido y después se realizan lavados en condiciones de baja, moderada o alta restrictividad (astringencia) mediante técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe por ejemplo en Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, pp. 169-170. Por ejemplo, tal y como se señala en esa referencia, se pueden conseguir condiciones de baja restrictividad lavando primero con (solución salina de citrato) SSC 2x /SDS 0,1% (dodecilsulfato sódico) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Normalmente se hacen dos lavados. Se puede conseguir más restrictividad disminuyendo la concentración de sal y/o elevando la temperatura. Por ejemplo, después del lavado descrito se pueden hacer dos lavados más con SSC 0,1x /SDS 0,1% durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente, seguidos por lavados con SSC 0,1x /SDS 0,1% durante 30 minutos cada uno a 55°C. Estas temperaturas se pueden utilizar con otros protocolos de hibridación y lavado citados en la presente memoria y como debería saber un experto en la técnica (por ejemplo, como sal se puede utilizar SSPE en lugar de SSC). La solución de lavado SSC 2x /SDS 0,1% se puede elaborar añadiendo 50 ml de SSC 20x y 5 ml de SDS 10% a 445 ml de agua. La solución SSC 20x se puede preparar combinando NaCl (175,3 g/0,150 M), citrato sódico (88,2 g/0,015 M) y agua, ajustando el pH a 7,0 con NaOH 10 N, y después enrasando el volumen hasta 1 litro. El SDS 10% se puede preparar disolviendo 10 g de SDS en 50 ml de agua autoclavada, diluyendo después hasta un volumen final de 100 ml.

La detección de la sonda proporciona un medio para determinar de una manera conocida si la hibridación se ha mantenido. Este tipo de análisis con sonda proporciona un método rápido para identificar los genes codificadores de toxinas de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos que se utilizan como sondas según la invención se pueden sintetizar utilizando un sintetizador de ADN y procedimientos estándar. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden utilizar como cebadores de PCR para amplificar los genes de la presente invención.

La hibridación con un polinucleótido determinado es una técnica a la que se puede recurrir para identificar, encontrar y/o definir las proteínas y los genes útiles según la presente invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, las condiciones "restrictivas" para la hibridación aluden a condiciones que consiguen el mismo o aproximadamente el mismo grado de especificidad de la hibridación que las condiciones descritas en la presente memoria. La hibridación de ADN inmovilizado en transferencias de Southern con sondas génicas específicas marcadas con 32P se puede realizar con métodos estándar (véase, p. ej., Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). En general, la hibridación y los lavados posteriores se llevan a cabo en condiciones que permiten la detección de las secuencias diana. En el caso de las sondas génicas de ADN bicatenario, la hibridación se puede llevar a cabo de un día para otro a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del ADN híbrido en SSPE 6x, solución de Denhardt 5x, SDS 0,1% y ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La temperatura de fusión se describe con la fórmula siguiente (Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas, and

F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285):

Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+] + 0,41(%G+C) – 0,61 (%formamida) - 600/longitud del ADN bicatenario en pares de bases.

Los lavados se llevan a cabo normalmente del modo siguiente:

1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1x, SDS 0,1% (lavado de restrictividad baja).

2) Una vez a Tm-20°C durante 15 minutos en SSPE 0,2x, SDS 0,1% (lavado de restrictividad moderada).

En el caso de las sondas de oligonucleótidos, la hibridación se puede llevar a cabo de un día para otro a 10-20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en 6x SSPE 6x, solución de Denhardt 5x, SDS 0,1% y ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La Tm de las sondas de oligonucleótidos se determinó con la siguiente fórmula: Tm (°C) = 2(número de pares de bases T/A) + 4(número de pares de bases G/C) (Suggs, S.V., T. Miyake, E.H. Kawashime, M.J. Johnson, K. Itakura, and R.B. Wallace [1981] ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693).

Los lavados se pueden llevar a cabo del modo siguiente:

1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1x, SDS 0,1% (lavado de restrictividad baja).

2) Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en SSPE 1x, SDS 0,1% (lavado de restrictividad

moderada).

En general, se puede alterar la sal y/o la temperatura para cambiar la restrictividad. Con un fragmento de ADN marcado de >70 bases o una longitud similar, se pueden utilizar las siguientes condiciones:

Baja: SSPE 1 ó 2x, temperatura ambiente Baja: SSPE 1 ó 2x, 42°C Moderada: SSPE 0,2x ó 1, 65°C Alta: SSPE 0,1x, 65°C.

La formación y la estabilidad de la molécula de ADN bicatenario depende de que exista una complementariedad sustancial entre las dos cadenas del híbrido y, como se ha señalado antes, se puede tolerar un cierto grado de desapareamiento. Por consiguiente, las secuencias de la sonda de la invención incluyen mutaciones (únicas y múltiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas, y combinaciones de las mismas, en la cual dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido diana de interés. Las mutaciones, inserciones y deleciones se pueden producir en una secuencia de polinucleótido dada de muchas maneras, y estos métodos son conocidos por una persona experta en la técnica. En el futuro, podrían aparecer nuevos métodos.

Debido a la degeneración/redundancia del código genético, varias secuencias de ADN pueden codificar las secuencias de aminoácidos reveladas en la presente memoria. Una persona experta en la materia sabrá crear secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas o básicamente las mismas enzimas. Estas secuencias variantes de ADN quedan englobadas en el ámbito de la presente invención.

La invención incluye, por ejemplo:

1) proteínas obtenidas de organismos silvestres;

2) variantes surgidas de mutaciones;

3) variantes diseñadas para hacer sustituciones conservadoras de aminoácidos; y

4) variantes producidas por fragmentación al azar y reensamblaje de una pluralidad de secuencias distintas que codifican las proteínas TC de interés (transposición de ADN). Véase p. ej. patente US nº 5 605 793.

Las secuencias de ADN que codifican las proteínas útiles según la invención pueden ser secuencias naturales, secuencias mutantes o secuencias sintéticas diseñadas para expresar una proteína predeterminada. Son especialmente útiles las secuencias de ADN diseñadas para expresarse abundantemente en plantas, mediante, por ejemplo, la elusión de señales de poliadenilación y el uso de codones preferidos en los vegetales.

En la presente memoria aparecen ciertas proteínas y genes específicamente a modo de ejemplo. Como estas proteínas y genes se citan meramente a título de ejemplo, debe ser evidente que la invención comprende el uso de proteínas variantes equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican equivalentes de las mismas) dotadas de una funcionalidad idéntica o similar a la de las proteínas ejemplificadas. Las proteínas equivalentes guardarán una semejanza (y/u homología) de aminoácidos con una enzima ejemplificada (o con un fragmento activo de la misma). Los polinucleótidos y las proteínas preferentes de la invención se pueden definir en términos de intervalos de identidad y/o similitud más estrechos. La identidad de la proteína enzimática es igual o superior al 80%, es decir un 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%, en comparación con la secuencia ejemplificada o sugerida en la presente memoria. Cualquier número de los citados en la secuencia anterior se puede utilizar para definir los límites superior e inferior. Por ejemplo, una proteína de la invención se puede definir por guardar una identidad del 8090% con, por ejemplo, la delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID n. º 5

A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza en la presente memoria, la identidad y/o similitud porcentual de dos ácidos nucleicos se determina con el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:22642268, modificado según Karlin y Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Este algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:402-410. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se lleva a cabo con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra =12. Se puede utilizar el Gapped BLAST del modo descrito en Altschul et al. (1997), Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se utilizan los parámetros por defecto de cada programa (NBLAST y XBLAST).Véase el sitio web de NCBI/NIH.

Para obtener alineaciones con huecos a efectos comparativos, se puede utilizar la función AlignX de Vector NTI Suite 8 (InforMax, Inc., North Bethesda, MD, EE.UU.), empleando los parámetros por defecto. Normalmente estos consisten en una penalización por apertura de hueco de 15, una penalización por extensión de hueco de 6,66, y un intervalo de penalización por separación de hueco de 8. De esta manera, se pueden alinear y comparar dos o más secuencias o bien utilizar otras técnicas bien conocidas en la técnica. Analizando estas alineaciones, se pueden identificar las zonas

relativamente conservadas y no conservadas de los polipéptidos de interés. Esto puede ser útil para, entre otras cosas, evaluar si puede ser tolerable un cambio en una secuencia polipeptídica mediante la modificación o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos.

La homología/similitud/identidad de los aminoácidos normalmente (pero no necesariamente) alcanzará su máximo en las regiones de la proteína responsables de su actividad o que estén implicadas en la determinación de las configuraciones tridimensionales que son responsables en última instancia de dicha actividad. A este respecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y cabe esperar que sean toleradas. Por ejemplo, esta sustituciones pueden suceder en regiones de la proteína que no son críticas para su actividad. El análisis de la estructura cristalina de una proteína y la modelización de la estructura proteica con métodos informáticos se pueden utilizar para descubrir las regiones de una proteína que pueden ser modificadas (mediante mutagénesis dirigida, transposición, etc.) para cambiar realmente las propiedades y/o aumentar la funcionalidad de la proteína.

También es posible cambiar diversas propiedades y características tridimensionales de la proteína sin afectar negativamente a la actividad/funcionalidad de la misma. Se puede esperar que las sustituciones conservadoras de aminoácidos resulten toleradas o no afecten negativamente a la configuración tridimensional de la molécula. Los aminoácidos se pueden clasificar en las categorías siguientes: no polares, polares sin carga, básicos y ácidos. Las sustituciones conservadoras en las cuales un aminoácido de una clase es sustituido por otro del mismo tipo quedan englobadas en el ámbito de la invención siempre que la sustitución no afecte negativamente a la actividad biológica del compuesto. La lista siguiente proporciona ejemplos de aminoácidos pertenecientes a cada clase.

Clase de aminoácido Ejemplos de aminoácidos

No polar Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp Polar sin carga Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Ácido Asp, Glu Básico Lys, Arg, His

En ciertos casos también se pueden hacer sustituciones no conservadoras. El factor crítico estriba en que tales sustituciones no deben deteriorar significativamente la actividad funcional/biológica/enzimática de la proteína.

Para conseguir una abundante expresión de los genes heterólogos en plantas, por ejemplo, puede ser preferible volver a modificar dichos genes para hacer que se expresen con más eficiencia en las células vegetales. Las secuencias se pueden diseñar para optimizar la expresión en vegetales en general, o se pueden diseñar para optimizar su expresión en un tipo concreto de planta. La canola es una de tales plantas en las que puede ser preferible rediseñar el gen o genes heterólogos antes de la transformación para aumentar el nivel de expresión del mismo o los mismos en ella. Por consiguiente, otro paso en el diseño de los genes que codifican una proteína fúngica, por ejemplo, consiste en rediseñar un gen heterólogo para facilitar su expresión óptima en un tipo distinto de organismo. Se puede encontrar una guía para la producción de genes sintéticos optimizados para la expresión en vegetales en, por ejemplo, la patente US nº 5 380

831. En la presente memoria se ejemplifica una secuencia optimizada para la expresión en vegetales como SEC ID nº 1 (que codifica la proteína de Aspergillus nidulans, como se muestra en la SEC ID nº 5).

Tal como se utiliza la presente memoria, toda referencia a proteínas y/o polinucleótidos "aislados", así como a proteínas "purificadas" se refiere a tales moléculas cuando no están asociadas con las demás moléculas con las que se encuentran en la naturaleza. Por tanto, la alusión a "aislado" y/o "purificado" entraña la implicación de la "mano del hombre" como se describe en la presente memoria. Así, por ejemplo, un polinucleótido (o "gen") de hongo de la invención introducido en una planta para que se exprese es un "polinucleótido aislado". De manera similar, una proteína de la presente invención que es producida por una planta es una "proteína aislada".

Una molécula "recombinante" se refiere a una molécula que ha sido recombinada. Cuando se haga referencia a una molécula de ácidos nucleicos, el término se referirá a una molécula que está comprendida dentro de las secuencias de ácidos nucleicos que se unen entre sí mediante técnicas de biología molecular. El término "recombinante" cuando se haga referencia a una proteína o a un polipéptido se referirá a una molécula de proteína que se produce utilizando una o varias moléculas recombinantes de ácidos nucleicos.

El término "heterólogo" cuando se refiera a una secuencia de ácidos nucleicos aludirá a una secuencia de nucleótidos que está ligada a, o es manipulada para quedar ligada a, una secuencia de ácidos nucleicos a la que no está unida en la naturaleza, o a la que está unida en un lugar distinto en la naturaleza. El término "heterólogo”, por tanto, indica que la molécula de ácido nucleico ha sido manipulada mediante ingeniería genética, es decir, por la acción humana. Por ello, un gen de la invención se pueden ligar funcionalmente a un promotor heterólogo (o a una "región reguladora de la transcripción" que significa una secuencia de nucleótidos capaz de mediar o modular la transcripción de una secuencia de nucleótidos de interés, cuando la región reguladora de la transcripción está ligada funcionalmente a la secuencia de interés). Los promotores heterólogos preferidos pueden ser promotores vegetales. Un promotor y/o una región

reguladora de la transcripción y una secuencia interés están "ligados funcionalmente” cuando las secuencias están

conectadas funcionalmente de modo que permiten que la transcripción de la secuencia de interés esté mediada o modulada por la región reguladora de la transcripción. En algunas formas de realización, para estar ligada funcionalmente, la región reguladora de la transcripción puede estar localizada en la misma hebra que la secuencia de interés. La región reguladora de la transcripción puede, en algunas formas de realización, preceder a la secuencia de interés. En tales formas de realización, la región reguladora de la transcripción puede preceder directamente a la secuencia de interés o puede haber secuencias intermedias entre ambas regiones. El ligamiento funcional de la región reguladora de la transcripción y la secuencia de interés puede requerir la unión de moléculas adecuadas, como proteínas activadoras transgénicas, a la región reguladora de la transcripción, y la invención por tanto engloba formas de realización en que se facilitan tales moléculas, ya sea in vitro o in vivo.

Existen diversos métodos para obtener las proteínas destinadas al uso de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos contra las proteínas reveladas en la presente memoria con el fin de identificar y aislar otras proteínas en una mezcla. En concreto, se pueden generar anticuerpos contra las porciones de las proteínas que son más constantes y diferentes de otras proteínas. Esos anticuerpos se pueden utilizar entonces para identificar específicamente proteínas equivalentes dotadas de la actividad característica mediante inmunoprecipitación, ensayo de enzimoinmunoabsorción (ELISA) o inmunotransferencia. Los anticuerpos contra las proteínas mostradas en la presente memoria, o contra las proteínas equivalentes, o fragmentos de dichas proteínas, se pueden preparar fácilmente con procedimientos ordinarios. Estos anticuerpos constituyen un aspecto de la presente invención.

Una proteína "procedente de" u "obtenible de" cualquiera de los aislamientos de interés referidos o sugeridos en la presente memoria significa que la proteína (o una proteína similar) se puede obtener de un aislamiento ejemplificado o de alguna otra fuente, como otra cepa fúngica o bacteriana, o una planta (por ejemplo, una planta manipulada para producir la proteína). "Derivado/a de" también tiene esta connotación, e incluye polinucleótidos (y proteínas) que se pueden obtener de un tipo determinado de hongo o bacteria, por ejemplo, en el cual el polinucleótido es modificado por la expresión en una planta, por ejemplo. Una persona experta en la técnica reconocerá fácilmente que, dada la revelación de un gen y proteína de hongo, se puede manipular genéticamente una planta para producir la proteína. Las preparaciones de anticuerpos, sondas de ácidos nucleicos (de ADN y ARN, por ejemplo), y similares se pueden preparar utilizando las secuencias de polinucleótidos y/o aminoácidos reveladas en la presente memoria y utilizarse para seleccionar y recuperar otros genes de proteínas en otras fuentes (naturales).

Los aceites de las semillas de la presente invención conservan un alto grado de estabilidad oxidativa pero contienen niveles más bajos de ácidos grasos saturados y niveles más elevados de ácidos grasos insaturados. Los aceites preferidos tienen un contenido total de ácidos grasos saturados inferior al 3,5%, un contenido de ácido oleico de al menos el 75% (y preferente y sorprendentemente de menos del 80%), y un contenido de ácidos grasos polinsaturados de menos del 20% (y más preferentemente de menos del 15%, con más preferencia de menos del 10%, y con mayor preferencia de menos del 9%). La presente invención también se puede utilizar para obtener una semilla de canola con un contenido total de ácidos grasos saturados (C:14, C:16, C:18, C:20, C:22 y C:24) de como máximo (y preferentemente menos de) 2,5% del contenido total de ácidos grasos, preferentemente con los intervalos de ácido oleico antes mencionados. Los niveles de 18:2 y 18:3, que contribuyen a la inestabilidad del aceite, no están elevados o están preferentemente reducidos (para las aplicaciones alimenticias). En las Figuras y Tablas facilitadas en la presente memoria se pueden obtener los valores de los intervalos de cualquiera de estos ácidos grasos concretos, y de cualquier combinación de los mismos, y en particular de uno o ambos de los polinsaturados C18.

La presente invención se puede utilizar para suministrar semillas de canola con características agronómicas de élite que producen un aceite refinado/desodorizado con menos de un 3,5% de ácidos grasos saturados totales. El aceite derivado de estas plantas se puede utilizar para formular varios productos finales, o se puede emplear solo como aceite de freír para productos "sin grasas saturadas" o "con bajo contenido en grasas saturadas".

A menos que se indique lo contrario, el contenido de ácidos grasos saturados de un conjunto dado de semillas de canola se puede determinar mediante procedimientos estándar en los cuales el aceite se extrae de las semillas triturándolas y extrayendo los ésteres metílicos de ácidos grasos por medio de la reacción con metanol e hidróxido sódico. El éster resultante se analiza para determinar el contenido de ácidos grasos por cromatografía de gases-líquidos utilizando una columna capilar que permita la separación en función del grado de insaturación y la longitud de la cadena. Este procedimiento analítico se describe, por ejemplo, en J. K. Daun et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 60: 1751-1754 (1983).

La composición de ácidos grasos de las semillas de canola se determinó del modo descrito más adelante por medio del análisis de media semilla, de semillas únicas/enteras, o bien de grupos de semillas. En el caso de los análisis de media semilla, se extrajo y se analizó un trozo de tejido de cotiledón del embrión; el resto de la semilla se guardó y se pudo hacer germinar si se quería. Aunque la técnica de la media semilla puede no ser del todo fiable a la hora de seleccionar mutaciones de ácidos grasos controladas y genéticamente estables (y el posterior mejoramiento y cruzamientos), la invención demuestra que los genes preferidos se pueden introducir y utilizar para crear líneas estables. A diferencia de las mutaciones no caracterizadas, es conocido en la técnica que un gen se puede introducir y mantener de manera estable en plantas. Por ello, el análisis descrito en la presente memoria demuestra la utilidad de los genes de interés y la posibilidad de conseguir un aceite de canola dotado de las características indicadas.

En semillas de líneas transgénicas derivadas del germoplasma comercial Nexera 710 (canola) se han conseguido niveles de ácidos grasos equivalentes a la designación de "sin saturados" (No sat). El nivel de carencia de grasas saturadas se definió como un contenido de ácidos grasos saturados combinados inferior al 3,5%. Además, se observó un contenido reducido de saturados tanto en la línea de canola Westar como en otra crucífera (Arabidopsis) con el mismo constructo de transformación. Resulta reseñable que los niveles de saturados en semillas sueltas descendieran hasta 2,6% ó 2,7% en algunas semillas. La invención también se puede utilizar para producir semillas con un contenido

0,5-1%
׽ total de saturados igual o inferior a 2,5%. Esto es importante porque el procesamiento del aceite puede añadir

al porcentaje de saturados totales, lo que significa que el aceite procesado todavía puede obtener el nivel de No Sat fijado por la FDA con procedimientos de análisis estándar. Disponer de este nivel de tolerancia no sólo permite soportar ciertos niveles de contaminación del equipo de análisis (por semillas con mayor contenido de saturados), especialmente si el operario de la planta no es cuidadoso al separar los lotes de semillas, sino que también permite cierto grado de variación en las condiciones de crecimiento en el campo (como las temperaturas altas, que tienden a crear más saturados) y la polinización cruzada por el polen procedente de canola ordinaria cultivada en campos vecinos (que diluye los genes deseables).

La Food and Drug Administration de Estados Unidos define "grasa saturada" como "La declaración del número de gramos de grasa saturada presentes en una ración definida como la suma de todos los ácidos grasos que no contienen enlaces dobles" 21 CFR 101.9(c)(2)(i). A menos que se indique otra cosa, esta es la definición utilizada en la presente memoria para "saturados totales" y "grasa saturada total". Una ración de un producto alimenticio se considera "sin grasa saturada" si el producto "contiene menos de 0,5 gramos de grasa total en una ración" 21 CFR 101.9(c)(2)(i). "Grasa total" se define como "La declaración del número de gramos de grasa total contenida en una ración definida como el total de ácidos grasos de lípidos y expresada como triglicéridos" 21 CFR 101.9(c)(2). Los "tamaños de ración" correspondientes a los diversos tipos de alimentos se definen en 21 CFR 101.12(b), el cual define una ración de aceite como 1 cucharada sopera o 15 ml. Tal como se utilizan en la presente memoria, se entiende que esto significa 14 gramos. Por tanto, el aceite de canola "sin grasas saturadas" (o el aceite de canola que contiene grasas no saturadas) se define en la presente memoria como un aceite de canola con menos de 0,5 gramos de grasa saturada total en una ración (14 gramos de aceite de canola que comprenden 14 gramos de grasa). En otras palabras, el aceite de canola "sin grasas saturadas" comprende menos del 3,57% de saturados totales (0,5 gramos de saturados totales divididos por 14 g de grasa total). A menos que se especifique otra cosa, todos los porcentajes de ácidos grasos de la presente memoria corresponden al porcentaje en peso del aceite del cual el ácido graso es un componente.

Como se muestra en la presente memoria, la invención se puede utilizar para obtener aceite de semillas de canola que comprende menos de un 3,57% de saturados totales. El aceite se puede obtener de las semillas de interés mediante procedimientos que son bien conocidos en la técnica, como se ha mencionado en los párrafos precedentes, y se puede analizar para averiguar el contenido con técnicas muy conocidas, incluidas las técnicas ejemplificadas en la presente memoria. A menos que se indique otra cosa, el análisis empleado para obtener los datos de los aceites de media semilla y de los aceites de campo se llevó a cabo con la reacción de transesterificación con catálisis básica (AOCS Ce 2-66, método alternativo). El protocolo es similar al protocolo de saponificación/esterificación ácida descrito en la presente memoria, excepto en que este último protocolo mide los lípidos totales, de los cuales la mayoría son los mismos ácidos grasos derivados de los triacilglicéridos detectados por la reacción de transesterificación con catálisis básica.

En el germoplasma comercial Nexera 710, los niveles de ácidos grasos 18:3, que contribuyen a la inestabilidad oxidativa, se mantuvieron relativamente inalterados. Por ello, la invención no sólo proporciona plantas y semillas con menos grasas saturadas, sino plantas y semillas que sorprendentemente mantienen otras características beneficiosas. Esto es, las plantas de la presente invención y los genes útiles según invención pueden ser utilizados, sorprendentemente, sin afectar de forma negativa a otras características ventajosas de las plantas.

En formas de realización preferidas, la presente invención proporciona plantas que comprenden más de una copia expresada del gen de la delta-9 desaturasa de la invención. Los resultados presentados en esta memoria demuestran que la expresión de múltiples copias de este gen mejoró sorprendentemente el perfil de ácidos grasos de las plantas de canola (los niveles de grasa saturada se redujeron drásticamente). Este hecho resulta sorprendente porque la técnica era hasta el momento impredecible en lo que concierne a la expresión de múltiples copias del mismo gen. El "silenciamiento génico" es un fenómeno conocido que desaconseja la inserción de copias múltiples (en distintos lugares del genoma, por ejemplo) de un gen heterólogo. Tampoco es lo más recomendable intentar obtener eventos de transformación múltiple. Por tanto, no había ninguna motivación para producir plantas que contuvieran más de un evento (dos, tres, cuatro o más) de delta-9 desaturasa. Tampoco se esperaba que tales plantas pudieran tener mejores características.

En la presente memoria se ejemplifican específicamente dos plantas crucíferas: Brassica napus (canola) y Arabidopsis. No obstante, como es sabido en la disciplina, se pueden usar otras especies de Brassica y otras crucíferas para, por ejemplo, mejorarlas genéticamente y desarrollar caracteres deseados en canola y similares. Otras plantas que pueden ser utilizadas según la invención son Brassica rapa, Brassica juncea, Brassica carinata, Brassica nigra y Brassica oleracea.

En formas de realización preferidas, los genes de la delta-9 desaturasa útiles según la invención están optimizados para la expresión en vegetales. La optimización ejemplificada en la presente memoria incluye introducir codones preferidos y una región del iniciador de la traducción Kozak, así como eliminar secuencias indeseadas. El gen está controlado por el promotor de la beta-faseolina (un potente promotor de proteínas de reserva en las semillas de dicotiledóneas).

Los promotores cuya expresión coincide con la síntesis de aceite (p. ej. ACP, elongasa) se pueden utilizar para reducir aún más los saturados, ya que la expresión se produce antes que en el caso de las proteínas de reserva. (Constructos anteriores de tabaco usaban los nanos 3' UTR, y constructos previos de maíz el promotor constitutivo de la ubiquitina-1 del maíz y nanos 3' UTR). Se pueden utilizar otros promotores de semillas de dicotiledóneas según la presente invención, como los promotores de vicilina, lectina, cruciferina, glicinina y conglicinina, los promotores de semillas vegetales mostrados en US20030005485 A1, promotores de elongasa en US20030159173 A1, y el promotor ACP que aparece en la patente US nº 5 767 363. Véase también, por ejemplo, US6100450A (específica de semillas, se expresa en el embrión, columna 8 línea 8); US20030159173A1 (promotor específico de semilla del apartado 0044; algunos ejemplos son USP, hordeína, ACP, napina, FatB3 y FatB4); WO9218634A1 (la introducción discute algunos promotores específicos de semillas de otras patentes, páginas 1 a 7; WO0116340A1 (la página 7, línea 13 proporciona una definición de un promotor "específico de semilla", que normalmente se expresa menos del 5% en otros tejidos; la página 10, líneas 19-29 discute las proteínas de reserva presentes en las semillas como albúminas, globulinas, vicilina y proteínas similares a legúmina, oleosinas que no actúan como reserva, promotores asociados con el metabolismo de los ácidos grasos como ACP, saturasas, desaturasas, elongasas); WO2003014347A2 (definición del promotor págs. 23-25: preferiblemente 2x mayor para específico de semilla); US20030233677A1 (el apartado 0033 proporciona ejemplos de "promotor de semillas " [napina, ACCasa, albúmina 2S, faseolina, oleosina, zeína, glutelina, almidón sintasa, enzima ramificante del almidón]); WO2003092361A2 (la página 15 proporciona la definición de "promotor"; la parte superior de la página 17 contiene ejemplos de promotor y referencias de patentes (sólo proteínas de reserva) como zeínas, proteínas de reserva 7S, proteína de la nuez de Brasil, proteína sin fenilalanina, albúmina, beta-conglicinina, 11S, alfahordotionina, arcelina, lectinas, glutenina); US20030148300 A1 (véase la Reivindicación 8, incluido el promotor de napina, promotor de faseolina, promotor del inhibidor de tripsina de soja, promotor de ACP, promotor de estearoil-ACP desaturasa, promotor 7S de la soja, promotor de oleosina, promotor de conglicinina, promotores de oleosina, promotores de proteína abundante en la embriogénesis, promotores de globulina del embrión, arcelina 5, promotor de napina, y el promotor de quitinasa ácida); patente US nº 5 777 201 (columna 6, líneas 30-50, promotores constitutivos, promotores regulados por la semilla y/o por el desarrollo p. ej. genes de biosíntesis vegetal de lípidos con ácidos grasos [ACP, aciltransferasas, desaturasas, proteínas de transferencia de lípidos] o promotores de semillas [napina, cruciferina, conglicinina, lectinas] o promotores inducibles [luz, calor, heridas]).

Los plastidios de las plantas superiores constituyen una diana atractiva para las técnicas de ingeniería genética. Se ha conseguido la transformación del cloroplasto (un tipo de plastidio) y es ventajosa. Véanse p. ej. las patentes US n. º 5 932 479, 6 004 782 y 6 642 053. Véanse también las patentes US n. º 5 693 507 y 6 680 426. Las ventajas de la transformación del genoma de cloroplasto incluyen: potencial seguridad ambiental, porque los cloroplastos transformados sólo se heredan por vía materna y por tanto no son transmitidos a través del polen a otras plantas; la posibilidad de conseguir un elevado número de copias de genes foráneos; y reducción en los costes energéticos para la planta, porque la importación de proteínas a los cloroplastos, que consume mucha energía, se reduce.

Los plastidios vegetales (cloroplastos, amiloplastos, elaioplastos, etioplastos, cromoplastos, etc.) son los principales centros biosintéticos que, además de la fotosíntesis, son responsables de la producción de numerosos compuestos importantes desde el punto de vista industrial como son aminoácidos, carbohidratos complejos, ácidos grasos y pigmentos. Los plastidios proceden de un precursor común conocido como proplastidio; por tanto, los plastidios de una determinada especie vegetal comparten la misma dotación genética.

Los plastidios de la mayoría de las plantas se heredan por vía materna y, por consiguiente, a diferencia de los genes heterólogos que se expresan en el núcleo, los genes heterólogos que se expresan en los plastidios no se diseminan a través del polen. Por tanto, un carácter introducido en el plastidio de una planta no se transmitirá a sus parientes silvestres. Esto supone una ventaja a la hora de modificar genéticamente las plantas para conferirles tolerancia o resistencia a condiciones naturales o químicas, como la tolerancia a herbicidas, ya que estos caracteres no se transmitirán a los parientes silvestres.

El genoma plastídico (plastoma) de las plantas superiores es una molécula circular de ADN bicatenario de 120-160 kb que puede estar presente en número de 1900-50 000 copias por célula foliar (Palmer, 1991). En general, las células vegetales contienen 500-10 000 copias de un genoma circular pequeño de 120-160 kilobases, y cada molécula del mismo contiene una gran repetición invertida (de aproximadamente 25 kb). Por tanto, es posible manipular genéticamente las células vegetales para que contengan hasta 20 000 copias de un gen particular de interés, con lo que se podría llegar a generar niveles muy elevados de expresión de un gen foráneo.

Los aceites derivados de las semillas de la presente invención son aplicables y se pueden adaptar especialmente a usos industriales y diversos usos alimentarios. Aparte del aceite de cocina, la invención también incluye productos "sin grasas saturadas" como patatas fritas y similares (véase la patente US nº 6 689 409, que reivindica una composición de alimento frito que comprende patatas y un aceite de canola; la presente invención, no obstante, se puede utilizar para mejorar las composiciones descritas en la patente US nº 6 689 409).

Las plantas de la invención se pueden cruzar con otras plantas para conseguir diversas combinaciones deseables de características y caracteres. Incluso, se pueden refinar las mejoras cruzando las plantas de interés, por medio de una técnica de mejora conocida y otras fuentes ventajosas de germoplasma como otras líneas de canola dotadas de otros caracteres y características beneficiosas. Otro ejemplo consistiría en cruzarlas con una línea portadora de una delta-9 desaturasa plastídica.

Por ello, la presente invención se puede utilizar para conseguir menos del 3,5% de ácidos grasos saturados totales en el aceite comercial en condiciones ambientales variables (y menos del 3% de ácidos grasos saturados totales en el aceite

5 de semillas primarias). Esto se puede conseguir sin reducir la calidad y la cantidad de las proteínas de reserva, sin aumentar la fibra indigerible en la harina de canola, y sin impacto negativo en el rendimiento de semillas por superficie (o de otros caracteres agronómicos deseables).

A continuación se expone una lista de los nombres comunes de los ácidos grasos, tal y como se utilizan en la presente

10 memoria, junto con su número de átomos de carbono y enlaces dobles. Las grasas saturadas no contienen ningún enlace doble (0).

Tabla 1.

Número de átomos de carbono Número de enlaces dobles

Nombre

por molécula por molécula

Láurico 12 0 Mirístico 14 0 Palmítico 16 0 Palmitoleico 16 1 Esteárico 18 0 Oleico* 18 1 Vaccénico** 18 1 Linoleico 18 2 Alfa-linolénico 18 3 Araquidónico 20 0 Eicosenoico (o araquídico) 20 1 Behénico 22 0 Erúcico 22 1 Lignocérico 24 0 Nervónico 24 1

* = enlace doble en la posición delta-9 ** = enlace doble en la posición delta-11

A menos que se señale específicamente, los términos "un" y "el" significan "al menos uno" tal y como se utilizan en la 15 presente memoria.

A continuación se muestran ejemplos que ilustran los procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deberían considerarse como excluyentes. Todos los porcentajes corresponden a peso y todos los porcentajes de mezcla de disolventes se expresan en volumen a menos que se indique otra cosa.

Ejemplo 1 – Reconstrucción del gen de la delta-9 desaturasa

Un gen de la delta-9 desaturasa de la presente invención se rediseñó para facilitar la expresión en vegetales. El nuevo diseño consistió en el cambio de la secuencia de Aspergillus nidulans con codones de traducción preferidos por los

25 vegetales, introducción de sitios únicos para enzimas de restricción y eliminación de secuencias indeseadas y de alguna estructura secundaria. El gen rediseñado fue sintetizado por Operon, Inc. La secuencia del marco abierto de lectura correspondiente a este polinucleótido se facilita aquí como SEC ID nº 1. La secuencia del ORF precedida por una secuencia Kozak y un sitio de clonaje para BamHI (caps), más un terminador de la traducción al final del ORF (caps), se facilita en la SEC ID nº 2.

Ejemplo 2 – Construcción del vector de transformación vegetal de la delta-9 desaturasa

El fragmento génico BamHI-BstEll se clonó en un vector entre el promotor de la beta-faseolina Pv y el 3' UTR de la betafaseolina Pv (pPhas-UTR). Este constructo se denominó pOIL. El fragmento formado por el promotor-gen-UTR se

35 eliminó de pOIL mediante la digestión con NotI, se redondearon sus extremos para hacerlos romos y se insertó en el sitio romo Pmel del vector pOEA1. El vector final se denominó pPD9-OEA1.

Ejemplo 3 – Transformación vegetal con el pPD9-OEA1

40 El vector plasmídico pPD9-OEA1 se transformó en Agrobacterium tumefaciens (cepa C58GV3101 [C58C1RifR] pMP90 [GmR]. Koncz and Schell, Mol. Gen. Genet [1986]). A continuación, se obtuvieron las plantas portadoras de la delta 9desaturasa transformándolas con Agrobacterium tumefaciens.

Arabidopsis se transformó con el método de inmersión, un procedimiento bien conocido en la técnica. Las plantas se

45 autofecundaron y las semillas secas se recogieron para someterlas al análisis de FAME (ésteres metílicos de ácidos grasos).

El protocolo utilizado para la transformación de canola corresponde al descrito por Katavic (Katavic, Campbell, L., Friesen, L., Palmer, D., Keller, W., and Taylor, D.C. [1996], Agrobacterium-mediated genetic transformation of selected high erucic acid B. napus cultivars, 4th Canadian Plant Tissue Culture and Genetic Engineering Conference, Saskatoon, SK, June 1-4,1996), con modificaciones para la línea Nexera de DAS. Se obtuvieron cortes de hipocotilo de plantones de 6 días de B. napus, cv Westar o Nexera 710 y se cultivaron en medio de iniciación de callo antes de proceder a la transformación. El día de la transformación, los hipocotilos se coincubaron con un cultivo de Agrobacterium portador del plásmido pPD9-OEAl con el gen del carácter, de modo que el fragmento de ADN plasmídico que incluía el gen de delta 9-desaturasa se incorporó al cromosoma de la célula. Después de un periodo de co-cultivo, los hipocotilos se transfirieron al medio de iniciación del callo que contenía glufosinato amónico como agente de selección. Se obtuvo tejido del callo sano y resistente y se transfirió repetidamente a medio de selección fresco durante aproximadamente 12 a 16 semanas. Las plantas se regeneraron y se transfirieron a cámaras de crecimiento Conviron. Después se autofecundaron para obtener las semillas. Si las plantas transgénicas eran estériles, se cruzaban con polen de líneas Nexera 710 no modificadas. Por último, las semillas secas se recogieron para practicar el análisis de FAME.

Ejemplo 4 – Proceso de clasificación del evento de canola, y resumen de los resultados de canola

A menos que se indique lo contrario, se usaron los siguientes procedimientos para obtener las semillas de canola Nex 710/Delta-9, cuyos datos se presentan en los ejemplos siguientes.

En general, hubo cuatro etapas principales para desarrollar, seleccionar o clasificar eventos: clasificación inicial de eventos transgénicos, clasificación de las semillas T1 y T2, clasificación de las plantas T1 o T2, y clasificación de los eventos por rendimiento en el campo. Los callos transformados se regeneraron primero en plantas T0.

Para la clasificación inicial, se analizaron 107 supuestos transgénicos mediante las características agronómicas y transferencia Southern (simple o complejo, esto es, con más de 3 copias). Se analizaron varias semillas por evento. Se determinaron los saturados de las semillas T1, la relación C16:1/C16:0 (para deducir la eficiencia catalítica), así como la segregación de los fenotipos bioquímicos. Partiendo de estos datos y de la disponibilidad de semillas (momento, cantidad), se sembró un pequeño subgrupo de semillas.

Para clasificar las semillas T1 y T2 (unos pocos eventos se avanzaron una generación), se efectuó un análisis de medias semillas y se identificaron los posibles homocigotos. A partir de estos datos, se seleccionaron medias semillas de las poblaciones segregantes para el crecimiento en invernadero.

La siguiente etapa principal consistió en la clasificación de las plantas T1 o T2 (unos pocos eventos se avanzaron una generación). Se realizaron transferencias Southern para determinar la complejidad de la integración del transgén. También se determinó la cigosidad con ensayos INVADER (Third Wave Technologies, Inc.). Estos datos se usaron para seleccionar las semillas aptas para las pruebas de campo.

En los estudios en invernadero de T1, se sometieron 30 semillas por evento al análisis de media semilla. Se usó canola Nex 710 como control comercial. Todos los individuos del evento se muestrearon para analizar la cigosidad y determinar el número de copias alélicas de Delta-9 y PAT. Después se efectuó una PCR y un análisis de la indolacetamida hidrolasa (IAAH; un marcador negativo puntuable o seleccionable). A todos los individuos del evento se les pintaron las hojas con herbicida para determinar la relación de segregación de PAT. A continuación se efectuó un análisis Southern en aquellos individuos que se acercaban a un perfil "sin grasas saturadas" y eran IAAH positivos y homocigotos para PAT y Delta-9.

Estos se utilizaron después para el análisis de T2 (se aplicó el análisis de media semilla a 100 semillas de cada una de las plantas indicadas). INVADER se usó para comprobar el número de copias y ver si el evento estaba segregando para D9 y PAT. La técnica del pintado foliar se usó para comprobar si las líneas estaban segregando para PAT. Sobre la base de los datos de las medias semillas y de los resultados de INVADER, LP e IAAH-positivo se recabaron datos de los ácidos grasos de grupos de 10 semillas seleccionadas de las plantas.

La cuarta etapa principal consistió en clasificar los eventos según el rendimiento en el campo (plantas T2 o semillas T3, análisis de plantas T2 o T3, y después de semillas T3 o T4). Se efectuó un amplio muestreo de los eventos transgénicos. Se analizaron las características agronómicas, la cigosidad y los resultados de las transferencias Southern. También se efectuó un análisis de los aceites de las semillas por lotes. A partir de estos datos, se seleccionaron los eventos destinados a cruzamiento para aumentar la dotación del gen.

Para avanzar líneas a los estudios de campo se utilizaron los siguientes criterios de selección. 224 líneas (incluidas las nulas) de 23 eventos (6 réplicas/entrada) se evaluaron en planteles replicados en 3 lugares. Se plantaron 6 eventos T3 y 17 T2. La selección de las líneas/eventos destinados al campo se realizó en función del número de inserción y el análisis de media semilla seguido de un análisis de los ácidos grasos de 10 semillas obtenidas a bulto de cada planta. El intervalo porcentual de saturados totales de las líneas seleccionadas osciló aproximadamente entre 3,3-4,5%. Para proseguir el desarrollo, se seleccionaron los siguientes eventos T3:

Tabla 2A

Evento Número de copias nº de líneas probadas en el campo 218-11.30 2 D9:2 PAT 45 36-11.19 2 D9:2 PAT 7 31a-3.30.01 1 D9:1 PAT 15 146-11.19 3 D9:1 + PAT parcial 23 159a-11.19 2 D9:2 PAT 19 69-11.19 2 D9:2 PAT 20

Para proseguir el desarrollo, se seleccionaron los siguientes eventos T2: 5

Tabla 2B

Evento Número de copias nº de líneas probadas en el campo 146-11.19 nd (no determinado) 6 149-11.30 nd 8 15-11.19 nd 4 224-11.30 3 D9:2.5 PAT 10 226-11.30 nd 4 230-11.30 nd 2 250-11.19 nd 5 267-11.19 nd 5 284-11.19 nd 8 309-11.30 nd 2 32-11.30 nd 3 324-11.30 nd 8 43-11.19 nd 5 43b-11.30 2 D9:2 PAT 10 57-11.30 nd 5 68-11.30 2 D9:2 PAT 8 96a-6.15 nd 2

Las pruebas de campo se llevaron a cabo del modo siguiente. Las evaluaciones agronómicas se hicieron del modo

10 indicado en un ejemplo posterior para confirmar que la Delta-9 (D9) no comportaba ninguna penalización agronómica. Se recogieron 15 muestras de tejido foliar para el análisis INVADER de 28 de las líneas T3 más prometedoras (más hnos.-nulos) para una verificación adicional del número de copias y averiguar si las líneas estaban segregando para PAT. Se escogieron las líneas D9 que contenían menos del 3,5% de saturados totales.

15 Se tomaron 10 muestras de tejido para transferencia Southern de las 3 líneas T2 más prometedoras, escogidas por contener menos del 3,5% de saturados totales. Todas las plantas de las que se extrajeron las muestras de tejido se habían autofecundado. El análisis de ácidos grasos se determinó a partir de 10 semillas a bulto de plantas autofecundadas (455 muestras), y 1 gramo de muestra de semillas a granel de filas OP (1445).

20 Los "mejores" eventos T4 son los siguientes:

Tabla 3A

Evento Número de copias nº de líneas probadas en el campo 218-11.30 2 D9:2 PAT 9 36-11.19 2 D9:2 PAT 2 146-11.19 3 D9:1 + PAT parcial 4 159a-11.19 2 D9:1 PAT 1 69-11.19 2 D9:2 PAT 3

25 Los "mejores" eventos T3 son los siguientes:

Tabla 3B

Evento Número de copias nº de líneas probadas en el campo 149-11.30 nd (no determinado) 3 43b-11.30 2 D9:2 PAT 1 57-11.30 nd 2 284-11.19 nd 2

30 En general, no se observó ninguna penalización agronómica importante vinculada a la Delta-9, y algunas líneas

exhibieron un aumento de alrededor del 10% en el peso de la semilla. Los resultados agronómicos se analizan con más detalle en el Ejemplo 18. Las observaciones generales referentes a las distribuciones de cada uno de los ácidos grasos se comentan más adelante en los Ejemplos 11-13. En las Tablas 4-7 se resumen los datos medios de los saturados totales (TSAT), cambios % en TSAT, y los cambios % de ciertos ácidos grasos en los eventos 218-11.30, 36-11.19, y

5 69-11.19. Por lo general, se observaron reducciones del ~30% al ~40% en los TSAT, respecto a las plantas sib-null (hermanas-nulas) y naturales (wild-type, WT). No obstante, más abajo se comentan otras mejoras aún mayores y la posibilidad de hacer más cruces, por ejemplo.

Tabla 4. Saturados totales (TSAT) medios de todas las líneas del Evento 218-11.30 en 3 lugares distintos

Auto Evento N C16:0 % C16:1 % C18:0 % C18:1 % C18:2 % C18:3 % % Saturados Totales Totales Totales Totales Totales Totales totales

Nulo 94 3,75 0,38 1,67 76,57 11,65 2,50 6,62

#218-11.30 217 3,10 1,40 0,68 79,11 10,89 2,29 4,37

%Wt 86% 385% 38% 101% 105% 98% 66% %Nulo 83% 365% 40% 103% 93% 92% 66%

Fecundación abierta Nulo 3 3,70 0,47 1,65 78,07 10,65 2,40 6,45 Wt Control 88 3,60 0,36 1,79 78,19 10,37 2,34 6,60 #218-11.30 123 3,07 1,23 0,74 80,17 10,15 2,22 4,42

%Wt 85% 338% 41% 103% 98% 95% 67% %Nulo 83% 263% 45% 103% 95% 92% 68%

Tabla 5. Cambios % en los saturados totales (TSATS) C16:0, C16:1, C18:0 y C18:1 vs. Nulos y controles Nex 710 WT

% TSAT vs % C16:0 % C16:1 % C18:0

Evento Línea C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 TSAT Nulo WT Vs N Vs N Vs N 218-11.30(TS) 1361 2,87 1,31 0,64 80,23 4.04 39 37 22 317 61 218-11.30(TS) 1319 2,88 1,41 0,62 79.53 4.09 38 37 20 248 62 218-11.30(TS) 1304 2,95 1,33 0,60 79.16 4.10 38 36 18 230 63 218-11.3 0(TS) 1500 2,95 1,31 0,63 79.58 4.11 38 36 18 224 61 218-11.30(TS) 1405 3,04 1,40 0,60 80,44 4.17 37 35 16 245 63 218-11.30(TS) 1370 3,02 1,38 0,66 80,24 4.24 36 34 17 240 59 218-11.30(TS) 1369 3,03 1,30 0,65 79.44 4.25 36 34 16 220 59

218-11.30(T) 1370 2,96 1,20 0,77 80,28 4.31 31 33 18 196 53

218-11.30(T) 1405 3,01 1,19 0,71 78.65 4.31 31 33 17 193 56

218-11.30(N) 1299 3,62 0,41 1,61 78.10 6.26 . 218-11.30(NS) 1299 3,70 0,32 1,65 77.56 6.52 . . Nex 710 3,58 0,35 1,75 77.87 6.45

Tabla 6. Cambios % en los saturados totales (TSATS) C16:0, C16:1, C18:0 y C18:1 vs. Nulos y controles Nex 710 WT

% TSAT % % % vs C16:0 C16:1 C18:0

Evento Línea C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 TSAT WT Vs N Vs N Vs N 36-11.19(T) 1099 2,93 1,23 0,77 78.85 4.30 32 33 16 322 55

36-11.19(N) 1127 3,49 0,29 1,70 77.14 6.36 • Nex 710 3,58 0,35 1,75 77.87 6.45

20 Tabla 7. Cambios % en los saturados totales (TSATS) C16:0, C16:1, C18:0 y C18:1 vs. Nulos y controles Nex 710 WT

% TSAT vs % C16:0 % C16:1 % C18:0

Evento Línea 06:0 06:1 08:0 08:1 TSAT WT Vs N Vs N Vs N 69-11.19(T) 1538 3,05 1,05 0,71 80,70 4,21 34 35 15 223 59 69-11.19(T) 1529 3,02 1,02 0,72 80,61 4,24 33 34 16 213 58 69-11.19(T) 1534 3,09 1,02 0,73 80,45 4,29 32 34 14 213 57

69-11.19(N) 1604 3,58 0,33 1,72 78.45 6,34 ••• • • Nex 710 3,58 0,35 1.75 77.87 6,45 . . .

Ejemplo 5 – Caracterización molecular de las plantas

25 Se tomaron muestras foliares para el análisis de ADN a fin de verificar la presencia de los transgenes mediante PCR y análisis Southern, y en algunas ocasiones para confirmar la expresión de la proteína PAT mediante ELISA.

5A. Protocolo para el análisis PCR de la delta-9 desaturasa. Se utilizaron los dos cebadores siguientes:

Delta-9 directo B:̘ 5' TGA GTT CAT CTC GAG TTC ATG 3' (SEC ID nº 3) Delta-9 inverso B:̘ 5' GAT CCA ACA ATG TCT GCT CC 3' (SEC ID nº 4)

Esta pareja de cebadores dan un fragmento de ~1380 pb al amplificar el gen delta-9.

En este análisis se utilizó el siguiente protocolo de ciclado con un termociclador MJ Tetrad:

1.

94°C, 2 minutos

2.

94°C, 1 minutos

3.

50°C, 2 minutos

4.

72°C, 3 minutos, + 5 segundos / extensión del ciclo

5.

Repetición 25 veces de los pasos 2-4

6. 4°C hasta listo para el análisis, o al menos 2 minutos 5B. Protocolo de extracción del ADN genómico de la planta para el análisis Southern. El equipo utilizado fue el DNeasy Plant Maxi Kit de Qiagen, y se siguió el protocolo del fabricante con los siguientes cambios aplicados a la parte de la elución. El tampón AE se diluyó 1:10 con agua de calidad ADN (Fisher nº BP561-1). Se hicieron dos eluciones con 0,75 ml de tampón AE diluido y precalentado a 65°C. El ADN se hizo precipitar con isopropanol y se lavó con etanol al 70%. El sedimento de ADN se resuspendió en 100 µl de tampón TE 1X. Se cuantificó la concentración de ADN. El ADN

se repartió en alícuotas de 6 µg que se ajustaron hasta un volumen final de 40 µl. Finalmente, las muestras se almacenaron a -20°C. 5C. Análisis de FAME (síntesis directa de FAME en las semillas con H2SO4 en metanol) El protocolo para el análisis de FAME fue el siguiente. Especificaciones de la CG Cromatógrafo de gases: Hewlett-Packard 6890 con puertos de inyección dobles y detectores de ionización por llama

dobles. Sistema de datos: HP Chemstation, Leap Technologies, Carrboro, NC 27510, PAL System. Columna: columna capilar J&W, DB-23, 60 m x 0,25 mm de d.i. con un espesor de la micropelícula de 0,15, temperatura

máxima operativa 250°C. Número de catálogo: 122-2361.

Perfil de temperatura: tiempo de equilibrado: 1 minuto. Temperatura inicial: 50°C. Tiempo inicial: 3 minutos. Tasa de incremento: 40°C/minuto. Temperatura final: 240°C. Tiempo final: 7,25 minutos. Procedimientos de FAME para Arabidopsis. Añadir 100 µl (50 µg) de Patrón 15:0 en un tubo de vidrio limpio de 16x125

mm (Solución madre de patrón interno: 500 µg/ml de C15:0 TAG en cloroformo:isopropanol 2:1). Secar el patrón en

atmósfera de nitrógeno con evaporación en baño maría a 55°C. Una vez seco, añadir 2 ml de H2SO4 metanólico 1N con DMP 2% (para 100 ml: 95,22 ml de metanol, 2,772 ml de H2SO4, 2 ml de DMP = 2,2-dimetoxipropano). Calentar el tubo a 85°C.

Pesar ~5 mg de semillas de Arabidopsis en un tubo de vidrio limpio de 16x125 mm y anotar el peso exacto.

Para destruir las lipasas, añadir H2SO4 metanólico caliente con patrón al tubo que contiene las semillas, y dejar incubar durante 15 minutos a 85°C. Dejar enfriar el vial a ~50°C, y después triturar las semillas con una mano de vidrio en un mortero pequeño. Transferir de nuevo la muestra al tubo e incubar durante al menos una hora en atmósfera de nitrógeno a 85°C. Enfriar el

vial en hielo. Añadir primero 0,5 ml de NaCl 0,9%, a continuación 250 µl de Patrón 17:0 en hexano (0,1335 mg/ml de solución madre de éster metílico). Vortear, centrifugar a 1000 g durante 5 minutos. Transferir 100-200 µl con una pipeta Pasteur a un vial de 1,5 ml con punta cónica (0,5 ml). Inyectar 5 µl en el CG. Procedimiento de FAME para canola. Añadir 100 µl (50 µg) de Patrón 15:0 en un tubo de vidrio limpio de 16x125 mm

(Solución madre de patrón interno: 500 µg/ml de C15:0 TAG en cloroformo:isopropanol 2:1). Secar el patrón en atmósfera de nitrógeno con evaporación en baño maría a 55°C.

Una vez seco, añadir 2 ml de H2SO4 metanólico 1N con DMP 2% (para 100 ml: 95,22 ml de metanol, 2,772 ml de 5 H2SO4, 2 ml de DMP = 2,2-dimetoxipropano). Calentar el tubo a 85°C.

Pesar una semilla de canola en un tubo limpio y anotar el peso exacto.

Para destruir las lipasas, añadir la muestra de semillas al tubo que contiene el patrón con H2SO4 metanólico caliente, 10 incubar durante 15 minutos a 85°C.

Dejar enfriar el vial a ~50°C, y después triturar las semillas con una mano de vidrio.

Incubar al menos durante 1 hora en atmósfera de N2 a 85°C.

15 Enfriar el vial en hielo. Añadir primero 0,5 ml de NaCl 0,9%, a continuación 250 µl de Patrón 17:0 en hexano (0,1335 mg/ml de solución madre de éster metílico). Vortear, centrifugar a 1000 g durante 5 minutos.

Transferir 100-200 µl con una pipeta Pasteur a un vial de 1,5 ml con punta cónica (0,5 ml). 20 Inyectar 5 µl en el CG.

Ejemplo comparativo 6 – Resultados de Arabidopsis

25 Los resultados iniciales se ilustran en la Figura 1, y muestran una reducción superior al 60% de los ácidos grasos saturados. También se consiguió más cantidad de 16:1 (5,9% por ejemplo) que de 16:0 (4,4%).

Aceite sin grasas saturadas obtenido mediante la estrategia de la Δ9-CoA-desaturasa

30 Análisis de FAME

Se analizaron las semillas T2 de aproximadamente 18 transformantes adicionales. Estos datos (véanse la Tabla 8 y la Figura 2) muestran una reducción de "saturados" de hasta el 60-70%. Esta es una reducción mayor si cabe de los ácidos grasos saturados que la evidenciada en los datos iniciales señalados (véase Figura 1). Es importante señalar

35 que la generación T2 todavía se estaba segregando y, por ello, cabe esperar líneas con un rendimiento aún mejor en las siguientes generaciones. Esto es cierto para todas las generaciones T1, T2, T3 y otras generaciones iniciales (incluidas las líneas de canola) como se describe en otros apartados de la presente memoria, hasta que el caracter quede fijado y la línea acabe siendo homocigota para el transgén (Se produjeron líneas y plantas estables con los caracteres fijados; se describen en los ejemplos siguientes).

Tabla 8.

16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1? ? ? ? 22:0 22:1 24:0 Tot Sats

WT1

7,8 0,2 3,2 11,2 27,3 21,4 2,8 20,1 2,3 0,7 0,0 0,4 2,4 0,1 14,4

TF-21

7,2 0,3 3,3 14,4 27,9 18,0 2,5 21,4 2,1 0,5 0,0 0,4 2,0 0,0 13,3

WT1-3

7,2 0,2 3,0 12,1 26,5 21,9 2,6 20,8 2,3 0,7 0,0 0,4 2,3 0,0 13,2

WT1-2

6,9 0,2 2,9 13,7 27,5 20,9 2,5 20,2 2,1 0,6 0,0 0,4 2,2 0,0 12,7

TF-10

5,5 3,0 2,0 19,5 28,7 18,4 1,3 17,9 1,6 0,4 0,0 0,3 1,3 0,0 9,1

TF-18

6,1 1,9 1,4 18,0 29,0 19,0 0,9 19,6 1,9 0,5 0,0 0,2 1,5 0,0 8,7

TF-13

4,7 2,2 1,6 19,9 27,9 19,1 1,3 19,2 1,8 0,4 0,0 0,3 1,5 0,0 7,9

TF-22

4,6 2,6 1,6 20,2 27,9 18,6 1,3 19,4 1,7 0,4 0,0 0,3 1,5 0,0 7,8

TF-12

5,5 2,1 1,2 18,6 28,4 20,1 0,8 19,4 1,8 0,5 0,0 0,2 1,5 0,0 7,6

TF-17

3,4 1,1 1,9 19,5 27,5 17,3 1,8 22,8 2,0 0,5 0,0 0,5 1,8 0,0 7,5

TF-14

5,0 2,1 1,4 18,8 27,3 21,4 1,0 19,2 1,7 0,5 0,0 0,0 1,6 0,0 7,4

TF-8

3,2 0,9 1,6 19,0 25,3 18,7 1,8 24,7 2,0 0,5 0,0 0,0 2,2 0,0 6,6

TF-19

4,1 2,7 1,0 20,7 28,4 19,9 0,8 18,8 1,7 0,4 0,0 0,2 1,4 0,0 6,0

TF-20

4,4 2,8 0,6 20,2 28,8 19,7 0,5 19,3 1,7 0,4 0,0 0,1 1,4 0,0 5,7

TF-7

5,0 2,9 0,0 20,8 27,5 25,8 0,0 15,3 1,3 0,0 0,0 0,0 1,4 0,0 5,0

TF-6

3,4 1,6 0,7 22,4 27,9 17,9 0,7 21,4 1,9 0,4 0,0 0,0 1,7 0,0 4,8

TF-11

3,4 2,7 0,6 22,4 28,8 19,7 0,5 18,5 1,6 0,4 0,0 0,2 1,3 0,0 4,7

Los valores corresponden a una sola preparación de muestra y un análisis en CG (sin promedios).

TF-21 se comporta como una planta natural (no transformada); entre las explicaciones posibles se barajan el silenciamiento génico o el escape no transgénico (selección inadecuada con el herbicida glufosinato)

"?" indica que la identidad del pico reflejado en el cromatograma CG es dudosa o desconocida.

Ejemplo 7 – Datos de Westar

Protocolos similares a los descritos en el Ejemplo 5C se aplicaron a líneas de canola derivadas de la conocida canola "Westar". Como se ilustra en la Figura 3, las grasas saturadas indicadas se redujeron más de un 43%, reducción que alcanzó el 50% cuando se incluyó 24:0.

Ejemplo 8 – Datos de ejemplo de Nexera 710

Protocolos similares a los descritos en otros puntos de la presente memoria se aplicaron a líneas de canola derivadas de la conocida canola comercial de élite "Nexera 710". Los saturados totales se calcularon con la metodología comentada en la presente memoria que se indica más adelante.

Los saturados totales resultan de la suma de los ácidos grasos 16:0 + 18:0 + 20:0 + 22:0 + 24:0. En la Tabla 9 se presentan algunos niveles notables de saturados en semillas sueltas. Los perfiles de los aceites se presentan en forma de valores mol%. El valor mol% incorpora al cálculo el peso molecular de cada ácido graso concreto. Utiliza la masa de un ácido graso concreto (área del pico, o el mismo valor usado para calcular directamente el % de ácido graso), dividido por el peso molecular correspondiente a ese ácido graso.

Tabla 9

Semillas

Nivel de saturados

Evento 5 11.19 semilla #6

3,1%

Evento 5 11.19 #8

2,7%

Evento 113a 11.19 #4

3,4%

Evento 113a 11.19 #8

3,2%

Evento 147 11.19 #3

3,0%

Evento 147 11.19 #7

2,6%

Evento 36a 11.19 semilla

2,7%

Evento (9)3 11.30

3,3%

Se analizaron los perfiles de las semillas que presentaban los valores más bajos de saturados totales (semillas 113a

11.19 #4,113a 11.19 #8, 511.19 #6 y 511.19 #8). Los valores correspondientes al germoplasma Nexera 710 sin modificar proceden del mismo análisis de FAME. Las plantas crecieron en una cámara de crecimiento Conviron, de modo que los valores reales de mol% podrían diferir de las semillas crecidas en el campo. En general, las plantas transgénicas manifestaron una reducción en 16:0, 18:0 y 20:0, y aumentos en 16:1. Los niveles de 18:0 en general descendieron, pasando de un promedio del 1,4% (superior 2,08%, inferior 0,81%) en Nexera 710 a un promedio del 0,1% (superior 0,6%, inferior 0%) en material transgénico seleccionado. Asimismo, los niveles de 16:0 descendieron desde un promedio de 4,6% (superior 5,12% a inferior 4%) hasta 3,0% (superior 3,41% a inferior 2,63%). De forma similar, los niveles de 20:0 descendieron desde un promedio de 0,5% en Nexera 710 a 0% en los transgénicos seleccionados. Los niveles de 16:1, que eran indetectables en Nexera 710, aumentaron a un promedio de 2,3% (superior 2,71% a inferior 1,72%) en los transgénicos. Los niveles medios de 18:3 aumentaron ligeramente en la pequeña población transgénica, pero el intervalo de los valores se solapó con el de las muestras de Nexera 710 sin modificar. Esto resultados se pueden resumir del modo siguiente:

Tabla 10

Ácido graso

Nexera 710 Material transgénico seleccionado

20:0

Promedio 0,5% 0%

18:0

Promedio 1,4% (superior 2,08%, inferior 0,81%) Promedio 0,1% (superior 0,6%, inferior 0%)

16:0

Promedio 4,6% (superior 5,12% a inferior 4%) Promedio 3,0% (superior 3,41% a inferior 2,63%)

16:1

Indetectable Promedio 2,3% (superior 2,71 % a inferior 1,72%)

Ejemplo 9 – Otros datos de canola

Protocolos similares a los descritos en otros puntos de la presente memoria se aplicaron a otras líneas de canola derivadas de la conocida canola comercial de élite "Nexera 710". El total de saturados y el porcentaje en peso de cada tipo de ácido graso se calculó con la metodología señalada en la presente memoria.

Las Figuras 4A-C y 5A-C muestran resultados representativos de los Eventos 36-11.19 y 218-11.30, respectivamente, que demuestran la reducción de los niveles de ácidos grasos saturados que puede obtenerse poniendo en práctica la presente invención. Si se efectúan otras manipulaciones de acuerdo con la invención, es posible incluso reducir aún más los niveles de las grasas saturadas mostradas a título de ejemplo. Todos estos datos se obtuvieron de plantas transgénicas de canola autofecundadas del modo indicado.

En resumen, el análisis de las medias semillas T2 de las plantas crecidas en invernadero del Evento 36-11.19, arrojó un

porcentaje de grasas saturadas totales de tan sólo 2,57%. Por lo que respecta a los saturados totales en semillas enteras T3, procedentes de plantas crecidas en invernadero, el porcentaje fue de apenas el 3,66%. Los resultados se representan gráficamente en la Figura 4A (los datos numéricos se incluyen en las Figuras 4B y 4C). En el caso de las plantas crecidas en invernadero del Evento 218-11.30, el análisis de medias semillas T2 reveló un contenido total de saturados de apenas el 3,37%. Los resultados aparecen representados gráficamente en la Figura 5A (datos numéricos en las Figuras 5B y 5C). Como referencia, en condiciones de campo NATREON manifestó, en promedio, un total de saturados del 6,5%.

Aplicando nuevas mejoras de acuerdo con la invención (como tandas adicionales de autofecundación, cruces con otras líneas superiores, aumento del número de copias del gen de la desaturasa [ya sea mediante transformación adicional, nuevos cruces de mejora, y similares], cambiando el momento de expresión de la desaturasa, y mutagénesis), se pueden conseguir reducciones aún mayores de los niveles totales de grasas saturadas.

Ejemplo 10 – Análisis de otros datos de canola – Reducción porcentual de las grasas saturadas totales

Los datos presentados en el Ejemplo 9 se pueden usar en varios cálculos para ilustrar diversos aspectos de la presente invención. Por ejemplo, se puede calcular la reducción en porcentaje de las grasas saturadas totales dividiendo primero los saturados totales de una planta dada por los saturados totales de la línea control, y después restándolo a 100%. Ejemplos de tales reducciones, facilitados por la presente invención, se muestran abajo. Los resultados se pueden redondear a la cifra más cercana (no decimal).

Tabla 11

Evento (y generación) Total Saturados (TS) TS control % Reducción 218-11.30 (T2) 2,71 6,36 57,4% 36-11.19 (T2) 2,57 6,44 ~60%

Todas las cifras mostradas en cualquiera de las gráficas, figuras, tablas o comentadas de otra manera en la presente memoria se pueden utilizar como valores extremos para definir los límites de la presente invención. De igual forma, todos los cálculos hechos con cualquiera de estas cifras, como los que aparecen antes y los que se comentan detalladamente más adelante, se pueden utilizar para definir los límites de la presente invención. Las tablas 12-12 muestran más resultados y cálculos representativos, correspondientes a las Líneas con Eventos 218-11.30, 36-11.19 y 69-11.19.

Tabla 12. Evento 218-11.30 Selecciones de HS para cruzamiento

% ↓ TSAT VS

% ↓C16:0 % ↑C16:1 % ↓C18:0

Línea

C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 TSAT Nulo WT Vs N Vs N Vs N

2193HS50

2,05 1,54 0,33 81,34 2,66 54 53 43 611 75

2193HS9

2,27 1,76 0,27 75,02 2,81 51 50 37 709 79

2193HS22

2,31 1,31 0,29 81,16 2,87 50 49 36 505 78

2193HS23

2,29 1,47 0,28 77,17 2,89 50 49 36 577 79

2195(N)

3,60 0,22 1,32 76,25 5,75 • • • • •

Nex 710

3,33 0,18 1,51 77,39 5,61 • • • • •

Tabla 13. Event

o 36-11.1 9 Selecci ones de HS para cruzamiento

% ↓ TSAT VS

% ↓C16:0 % ↑C16:1 % ↓C18:0

Línea

C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 TSAT Nulo WT Vs N Vs N Vs N

1099HS3

1,95 1,76 0,52 81,92 2,92 51 48 45 1018 61

1099HS8

2,19 2,05 0,40 77,81 2,97 50 47 39 1201 70

1099HS17

2,11 1,73 0,42 80,16 2,99 50 47 41 1000 69

1099HS11

2,13 1,73 0,45 79,30 3,00 49 47 40 998 66

1099HS43

2,18 1,72 0,41 77,88 3,01 49 46 39 991 69

1127(N)

3,57 0,16 1,34 74,21 5,92 • • • • •

Nex 710

3,33 0,18 1,51 77,39 5,61 • • • • •

Tabla

14. Evento 69-11.1 9 Selecci ones de HS para cruzamiento

% ↓ TSAT VS

% ↓C16:0 % ↑C16:1 % ↓C18:0

Línea

C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 TSAT Nulo WT Vs N Vs N Vs N

1538HS23

1,88 2,20 0,34 79,56 2,64 55 53 49 1101 74

1538HS26

2,18 1,60 0,29 77,55 2,81 52 50 41 776 78

1538HS4

2,20 1,71 0,35 80,17 2,90 51 48 41 831 73

1538HS36

2,17 1,49 0,37 78,24 2,93 50 48 41 713 72

1604(N)

3,70 0,18 1,29 78,12 5,88 . . . . .

% ↓ TSAT VS % ↓C16:0 % ↑C16:1 % ↓C18:0

Nex 710 3,33 0,18 1,51 77,39 5,61 . . . . .

Ejemplo 11 – Análisis de otros datos de canola – Perfiles detallados de los ácidos grasos

De nuevo, las Figuras 4A-C y 5A-C contienen algunos resultados representativos que muestran los perfiles de ácidos grasos de varias plantas portadoras de los eventos 218-11.30 y 36-11.19. En general, esto resultados demuestran que no sólo los niveles de 16:0 y 18:0 se reducen drásticamente (propiciando un aumento de los niveles de insaturados), sino que los niveles de 20:0, 22:0 y 24:0 también se ven reducidos de forma ventajosa, sorprendente e inesperada. En algunos casos, también se redujeron los niveles de 18:2 y 18:3, lo cual mejora la estabilidad oxidativa del aceite mejorado. Asimismo, cualquiera de los relaciones sugeridas arriba (como 16:0-16:1,18:0-18:1 y, por ejemplo, 18:0[20:0+22:0+24:0]) se puede utilizar para definir resultados ventajosos derivados de la puesta en práctica de la invención. Con la aplicación de la invención también se lograron sorprendentes reducciones porcentuales combinadas en el total de C20:0 + C22:0 + C24:0. Por tanto, la invención proporciona plantas dotadas de unos perfiles de ácidos grasos ventajosos y mejorados, tal y como se ejemplifica en la presente memoria. La aplicación de otras mejoras según la invención permitiría obtener mayores reducciones en los saturados, aumentos de los "no saturados", y mejores relaciones.

Por ejemplo, por medio de diversos cálculos con los datos mostrados en la Figura 5C y la Figura 4B, se pueden demostrar los logros de la presente invención. Los datos de muestras de la Figura 5C y la Figura 4B se presentan en la tabla siguiente. Para cada evento aparece la cantidad de los diferentes ácidos grasos, y entre paréntesis se muestran los valores de las plantas control pertinentes.

Tabla 15

Evento (y generación)

C20:0 (control) C22:0 (control) C24:0 (control)

218-11.30 (T2)

0,11 (0,62) 0,12 (0,32) 0,03 (0,14)

36-11.19 (T3)

0,32 (0,64) 0,15 (0,42) 0,04 (0,21)

Si analizamos el evento 218-11.30, la contribución total a los saturados de los componentes C20:0, C22:0 y C24:0 representa el 1,08% en el control, pero dichos componentes disminuyen favorablemente hasta el 0,26% en la línea de canola de la invención. Esto supone una reducción superior a cuatro veces en tales saturados. De manera similar, se puede considerar cada componente por separado. De nuevo en el evento 218-11.30, el componente C20:0 supone el 0,62% en el control/natural, mientras que en la línea vegetal de la invención se reduce aproximadamente 5,6 veces (hasta un 0,11%). El componente C22:0 se reduce aproximadamente 2 2/3 veces: 0,12% en la línea vegetal portadora de la d-9 desaturasa, que desciende desde el 0,32% presente en la línea control que carece del gen de la desaturasa. El C24:0 se reduce aproximadamente 4 2/3 veces, pasando del 0,14% al 0,03%.

En el Evento 36 (ó 36-11.19), dos líneas presentan contenidos respectivos de C20:0, C22:0 y C24:0 del 0,32, 0,15 y 0,04, y 0,30, 0,14 y 0,07. En comparación con el control que presentó 0,64, 0,42 y 0,21, ambas líneas contenían aproximadamente la mitad de C20:0, y al menos tres veces menos de C22:0 y C24:0. Destaca que la primera línea citada presenta una reducción superior a 5x en C24:0.

Pronto resulta evidente que se pueden hacer un gran número de cálculos similares con cualquiera de las otras líneas de la presente invención, referente a cualquiera de los ácidos grasos preferidos. Estas ilustraciones no se deben considerar excluyentes, y cualquiera de dichas nuevas reducciones y relaciones se pueden usar para definir la presente invención.

Ejemplo 12 – Otros datos de medias semillas de generaciones posteriores

Otros análisis de FAME en medias semillas se exponen en la Tabla 16. Esta figura muestra valores sumamente bajos de saturados totales: del 2,64% en una generación T3 y del 2,66% en una generación T4. La Tabla 17 muestra el número de copias de genes de la D-9 desaturasa presentes en las líneas respectivas (véase ID de la muestra en la Tabla 16 y la columna ID en la Tabla 17). Los efectos del número de copias se analizan con más detalle abajo en los Ejemplos 14 y 19.

Tabla 16.

Análisis de FAME en medias semillas - % del aceite total

EVENTO

Generación ID de la muestra : C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3

69-11.19 (HL)

T3 03TGH01538HS23 nd 0.04 1,88 2,20 0,34 79,56 9,43 3,29

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02193HS50 nd 0,05 2,05 1.54 0,33 81.34 9,85 2,77

69-11.19 (HL)

T3 03TGH01538HS26 nd 0,05 2,18 1,60 0,29 77,55 11,78 4,01

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02193HS9 nd nd 2,27 1,76 0,27 75,02 14,44 3,08

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02193HS22 0,01 0,05 2,31 1,31 0,29 81,16 10,30 2,72

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02193HS23 0,01 0,06 2,29 1,47 0,28 77,17 13,57 3,15

69-11.19 (HL)

T3 03TGH01538HS4 nd 0,03 2,20 1,71 0,35 80,17 10,19 3,07

36-11.19 (HL)

T3 03TGH01099HS3 nd 0,04 1,95 1,76 0,52 81,92 8,61 3,03

69-11.19 (HL)

T3 03TGH01538HS36 nd 0,04 2,17 1,49 0,37 78,24 11,54 3,39

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02193HS2 nd 0,06 2,31 1,60 0,30 77,39 13,23 2,98

69-11.19 (HL)

T3 03TGH01538HS40 nd 0,03 2,26 1,46 0,38 79,75 10,51 3,44

36-11.19 (HL)

T3 03TGH01099HS8 nd 0,05 2,19 2,05 0,40 77,81 12,22 2,86

36-11.19 (HL)

T3 03TGH01099HS17 nd 0,06 2,11 1,73 0,42 80,16 10,37 2,73

36-11.19 (HL)

T3 03TGH01099HS11 nd 0,06 2,13 1,73 0,45 79,30 10,98 3,04

36-11.19 (HL)

T3 03TGH01099HS43 nd 0,06 2,18 1,72 0,41 77,88 12,09 3,06

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02194HS37 nd 0,06 2,25 1,34 0,44 83,00 8,52 2,50

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02194HS27 nd 0,08 2,31 1,26 0,41 79,74 11,23 3,22

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02194HS17 nd 0,06 2,30 1,34 0,40 79,75 11,15 3,19

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02194HS2 nd 0,06 2,25 1,22 0,44 81,50 9,84 2,79

218-11.30 (HL)

T4 03TGH02194HS15 nd 0,07 2,35 1,32 0,40 78,85 12,00 3,29

218-11.30 (N)

T4 03TGH02195HS3 0,01 0,06 3,60 0,23 1,37 76,94 12,52 2,69

218-11.30 (N)

T4 03TGH02195HS9 nd 0,05 3,33 0,17 1,35 77,76 12,01 2,86

218-11.30 (N)

T4 03TGH02195HS13 nd 0,06 3,76 0,21 1,13 76,48 13,23 2,62

218-11.30 (N)

T4 03TGH02195HS16 0,01 0,05 3,31 0,20 1,35 75,89 13,05 3,82

218-11.30 (N)

T4 03TGH02195HS19 nd 0,06 4,02 0,27 1,43 74,20 14,43 2,90

36-11.19 (N)

T3 03TGH01127HS1 nd 0,05 3,46 0,18 1,42 74,06 14,50 3,69

36-11.19 (N)

T3 03TGH01127HS2 nd 0,06 3,53 0,14 1,30 73,14 15,34 3,37

36-11.19 (N)

T3 03TGH01127HS4 nd 0,06 3,74 0,16 1,29 71,92 16,49 3,38

36-11.19 (N)

T3 03TGH01127HS8 nd 0,04 3,59 0,14 1,28 75,09 13,69 2,67

36-11.19 (N)

T3 03TGH01127HS18 nd 0,04 3,55 0,18 1,41 76,85 12,00 2,67

WT Control

M94S010HS6 nd 0,06 3,36 0,17 1,45 76,60 12,52 3,36

WT Control

M94S010HS12 nd 0,06 3,19 0,21 1,58 74,56 13,88 4,31

WT Control

M94S010HS15 nd 0,03 3,37 0,16 1,62 78,68 10,07 3,26

WT Control

M94S010HS17 nd 0,05 3,21 0,19 1,54 77,37 12,21 2,97

WT Control

M94S010HS18 nd 0,07 3,54 0,18 1,37 79,73 9,91 2,35

69-11.19(N)

T3 03TGH01604HS2 nd 0,06 3,77 0,15 1,19 80,15 9,04 2,60

69-11.19(N)

T3 03TGH01604HS6 nd 0,05 3,74 0,24 1,22 75,57 13,27 3,23

69-11.19(N)

T3 03TGH01604HS8 nd 0,05 3,66 0,11 1,35 80,52 8,74 2,64

69-11.19(N)

T3 03TGH01604HS9 nd 0,04 3,88 0,21 1,32 77,33 11,40 2,67

69-11.19(N)

T3 03TGH01604HS15 nd 0,05 3,48 0,21 1,37 77,05 12,00 3,38

Tabla 17

nº copias según Southern

ID

Proyecto Evento Generación D-9 PAT

03TGH02193HS50

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02193HS9

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02193HS22

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02193HS23

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1,5 o 2

03TGH02193HS2

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02194HS37

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02194HS27

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02194HS17

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02194HS2

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02194HS15

TG03D9-62 218-11.30 (HL) T4 1 1,5 o 2

03TGH02195HS9

TG03D9-62 218-11.30 (N) T4 0 0

03TGH02195HS13

TG03D9-62 218-11.30 (N) T4 0 0

03TGH02195HS16

TG03D9-62 218-11.30 (N) T4 0 0

M94S010HS15

TG03D9-62 WT Control 0 0

M94S010HS15

TG03D9-62 WT Control 0 0

03TGH01099HS3

TG03D9-62 36-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01099HS8

TG03D9-62 36-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01099HS17

TG03D9-62 36-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01099HS11

TG03D9-62 36-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01099HS43

TG03D9-62 36-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01127HS2

TG03D9-62 36-11.19 (N) T3 0 0,

03TGH01127HS4

TG03D9-62 36-11.19 (N) T3 0 0

03TGH01127HS8

TG03D9-62 36-11.19 (N) T3 0 0

03TGH01538HS23

TG03D9-62 69-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01538HS26

TG03D9-62 69-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01538HS4

TG03D9-62 69-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01538HS36

TG03D9-62 69-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01538HS40

TG03D9-62 69-11.19 (HL) T3 2 1,5

03TGH01604HS6

TG03D9-62 69-11.19(N) T3 0 0

03TGH01604HS8

TG03D9-62 69-11.19(N) T3 0 0

03TGH01604HS9

TG03D9-62 69-11.19(N) T3 0 0

M94S010HS15

TG03D9-62 WT Control 0 0

M94S010HS15

TG03D9-62 WT Control 0 0

Ejemplo 13 – Otro análisis de los datos de medias semillas del Ejemplo 12, y otros datos que muestran cambios

de los ácidos grasos, aumentos de los insaturados y disminución de los saturados

Los datos de medias semillas de las pruebas de campo con T3 se representaron gráficamente para ilustrar varias

10 comparaciones de los contenidos de ácidos grasos con los datos de "saturados totales". Las Figuras 6A y 6B muestran claramente la reducciones de C16:0 y los aumentos de C16:1 en los eventos transgénicos en comparación con los nulos (eventos con una inserción no funcional) y los controles naturales (líneas no transformadas). Las Figuras 6C y 6D muestran con claridad las reducciones de C18:0 y los aumentos de C18:1 en los eventos transgénicos en comparación con los nulos y los controles naturales. Las Figuras 6E y 6F muestran claras reducciones de C20:0 y C22:0,

15 respectivamente, en los eventos transgénicos en comparación con los nulos y los controles naturales.

Resultados similares, obtenidos con los datos discutidos en el Ejemplo 4, también se ilustran con gráficos de barras. Las Figuras 6G y 6H muestran claramente cambios y reducciones de C16:0, y cambios y aumentos de C16:1 en los eventos transgénicos, en comparación con los nulos y los controles naturales. Las Figuras 6I y 6J muestran claramente

20 cambios y reducciones de C18:0, y cambios y aumentos de C18:1 en los eventos transgénicos, en comparación con los nulos y los controles naturales. Las Figuras 6K y 6L muestran gráficos de barras similares para C18:2 y C18:3.

Las gráficas analizadas arriba y la Figura 6M también ilustran a las claras la sorprendente reducción de los saturados totales en comparación con las líneas Nex 710 que ya resultan excelentes de por sí. La Figura 6N muestran las

25 distribuciones para 1000 semillas.

Ejemplo 14 – Reducción de los niveles de grasas saturadas con múltiples genes de Delta-9 desaturasa

Los resultados de los aumentos observados en el invernadero y las pruebas de campo sugieren que existe una relación 30 entre la reducción de los saturados totales y el número de copias de la delta-9 desaturasa de Aspergillus.

14A: Protocolo de análisis FAME para la clasificación de eventos y efecto del número de copias del transgén Preparación de la muestra

1.

Pesar las semillas una a una y colocarlas en una placa madre de plástico.

2.

Añadir 2 bolas de 1/8" a cada pocillo

3.

Colocar la placa madre en un dispensador automático de líquidos Hamilton:

añadir 400 µl de heptano con patrón interno (C11:0) y de sustitución (C15:0 FAEE) y después añadir 100 µl de metóxido sódico (.5N)

4.

Tapar la placa y homogeneizar en un pulverizador Geno-grinder durante 5 minutos (1x @ 500)

5.

Cambiar los tapones de la placa

6.

Colocar la tapa de la placa con un tapete de goma (sellado extra). Cerrar la tapa con cinta adhesiva de electricista negra y retirar el fondo de la placa madre para exponer los viales

7.

Colocar la placa en el vórtex/calentador durante 15 min. a 37°C/60 rpm (llenar los pocillos del vórtex con arena)

8.

Centrifugar la placa a 3500 rpm durante 2 min.

9.

Volver a colocar la tapa del fondo y retirar la tapa/tapones. Transferir 350 µl de la capa superior a una nueva placa con el dispensador Hamilton.

10.

A continuación, añadir 400 µl de heptano con patrón interno (IS) y de sustitución a la placa de extracción.

11.

Repetir los pasos 5 a 10 dos veces más (3 transferencias en total)

12.

Mantener la placa de extracción en el Hamilton al acabar la última transferencia. Transferir 50 µl del extracto al inserto de vidrio montado en el bloque de aluminio que debe contener 450 µl de heptano con C11

13.

Inyectar en el CG

Análisis por CG/FID

Parámetros de CG: Inyección de 1 µl sin fraccionamiento por muestra

Columna

DB23, 15 metros, 0,25 mm de D.I. y 0,15 µm de espesor de película

Parámetros de CG

Programada de temperatura del horno

70°C mantenidos durante 2,15 min (sin fraccionamiento) 70°C - 150°C a 25°C min, 150°C - 180°C a 5°C min, 180°C - 220°C a 25°C min, 220°C mantenidos durante 2 min.

Temperatura del inyector - 230°C Temperatura del detector - 240°C Gas auxiliar - Nitrógeno a 25 ml/min. Combustible para el FID – aire a 400 ml/min., hidrógeno a 40 ml/min Inyector delantero: tiempo de purga 1 min. Flujo de purga 35 ml/min Inyector posterior: tiempo de purga 2,15 min. Flujo de purga 35 ml/min. Presión de entrada delantera: 1,0 ml/min – flujo constante Presión de entrada posterior: 1,0 ml/min – flujo constante Tiempo de proceso – 14,95 minutos,

Flujos – flujo de helio constante a 1 ml/min

5 Secuencia de adquisición

Se fraccionaron 96 muestras entre la columna delantera y posterior para minimizar la acumulación en el liner. La lista de muestras consta de 5 métodos de inyección correspondientes al tipo de muestra inyectada. Las primeras 5 muestras inyectadas son siempre:

1.

Matriz

2.

Matriz

3.

Patrón 1

4.

Control positivo de canola

15 5. Reactivo de blanco 6-27. Muestras de canola

33. Patrón 2 34-54. Muestras de canola

55. Patrón 3

20 Cada lista comprende 3 eventos de 16 muestras (48 muestras).

El patrón contiene en total 25 ppm de FAME, distribuidos del modo siguiente:

Tabla 18

FAME

Concentración (ppm) Añadido a la calibración

C14:0

0,25 Sí

C16:0

1 Sí

C18:0

0,75 Sí

C18:1

15 Sí

C18:2

3 Sí

C18:3

1,25 Sí

C20:0

0,75 Sí

C20:1

0,25 Sí

C22:0

0,75 Sí

C22:1

1,25 No

C24:0

0,75 Sí

25 14B: Análisis preliminar por transferencia Southern para conocer el número aproximado de copias

El protocolo de preparación del ADN utilizado para tales fines fue el siguiente. Se digirieron aproximadamente 6 microgramos de ADN con HindIII y el ADN digerido se hizo correr en un gel de agarosa al 0,75%. La transferencia a una 30 membrana de nailon cargada positivamente y la hibridación se efectuaron conforme a protocolos habituales (Maniatis, Roche Applied Science, Inc.). La sonda consistió en un producto de PCR marcado con DIG (kit de Roche Applied Science, Inc.) derivado del gen de la delta-9 desaturasa de Aspergillus. Los lavados se hicieron por duplicado durante 5 minutos a temperatura ambiente con SSC 2x/SDS 0,1%, y después dos veces más con 65+C SSC 0,1x/SDS 0,1%. Las bandas hibridadas se visualizaron con el kit de detección por luminiscencia DIG según las instrucciones del fabricante

35 (Roche Applied Science, Inc.). Las bandas de hibridación se contaron y las muestras transgénicas se describieron inicialmente como “simples” si mostraban de 1 a 3 bandas o "complejas" si contenían más de 3 bandas.

14C: Comparación del número de copias del gen y reducción de los ácidos grasos saturados en los eventos transgénicos 40 Las definiciones siguientes son aplicables a la Tabla:

nº análisis con CG/FID

Número de semillas individuales que han sido analizadas

nº semillas con relación C16:1 WT <10%

Número de semillas con una relación C16:1/C16:0*100 inferior al 10%

nº semillas con relación C16:1 intermedia

Número de semillas con una relación C16:1/C16:0*100 superior al 10% (interpretadas como hemicigotas por el fenotipo de FAME)

nº semillas con relación C16:1 más alta

Número de semillas con la relación C16:1/C16:0*100 más alto (interpretadas como homocigotas por el fenotipo de FAME)

nº análisis con CG/FID

Número de semillas individuales que han sido analizadas

Relación de saturados en WT

Relación de FA saturados en las semillas naturales para ese evento particular. Si no está disponible (interpretado como un evento complejo por el fenotipo de FAME), se usó el promedio de nulos del 7,5%. Naturales: semillas individuales cuya relación sat:insat es <10%, que es similar a las semillas del evento nulo.

Relación de saturados en transgénicos

Relación de FA saturados en las semillas homocigotas para ese evento particular. Si no estuvo disponible (evento complejo) se usó el promedio.

Reducción de saturados (%)

(FA saturados en naturales - FA saturados en transgénicas) / FA saturados en naturales de ese evento particular. Si los FA saturados en naturales no estaban disponibles (evento complejo) se utilizó el promedio de nulo (7,5%).

S

Evento “simple”, de 1 a 3 copias del transgén

PS

Probablemente un evento “simple“

C

Evento “complejo” con más de 3 copias del transgén

N

“Negativo”, sin transgenes detectados

Tabla 19.

ID de la planta

Análisis preliminar con transferencia Southern nº de semillas para el análisis de FAME con CG nº de semillas con relación C16:1 WT <10% nº de semillas con relación C16:1 intermedia nº de semillas con la relación C16:1 más alta Relación de saturados en WT Relación de saturados en transgénicos Reducción de la relación de saturados

152-11.30

C 16 2 12 2 9,6 3,4 64,6

230-11.30

C 16 2 13 1 9,8 3,5 64,4

235-11.19

C 16 0 16 0 7,5 3,4 54,9

75-11.30

S 16 5 9 2 9,0 4,1 54,6

147-11.19

C 15 3 8 4 8,1 3,8 53,4

68-11.30

C 16 1 15 0 9,1 4,4 51,5

222-11.30

C 16 3 11 2 8,5 4,2 50,8

57-11.30

C 16 5 10 1 8,4 4,2 50,0

284-11.19

S 16 3 8 5 7,1 3,5 49,9

108-11.30

S 16 0 16 0 7,5 3,9 48,5

15 lb-11.30

S 16 3 9 4 7,1 3,7 48,3

87b-l 1.19

C 15 7 5 3 7,7 4.1 47,6

171-11.30

C 16 0 16 0 7,5 4,0 46,5

43b-11.30

S 16 1 14 1 6,9 3,7 46,4

32-11.30

pS 16 1 12 3 9,5 5,1 46,1

145-11.19

S 16 0 16 0 7,5 4,1 45,6

232-11.30

C 16 0 16 0 7,5 4,1 45,1

96a-6.15

pS 16 2 11 3 9,1 5,0 45,0

115-11.30

C 16 9 4 4 8,1 4,5 44,5

250-11.19 '

S 16 7 7 2 6,2 3,5 43,5

52-(2)-11.30

pS 16 0 16 0 7,5 4,3 43,1

226-11.30

C 16 1 12 3 5,8 3,3 42,8

224-11.30

C 16 2 10 4 6,8 3,9 42,7

149-11.30

S 16 7 7 2 6,0 3,5 42,6

309-11.30

C 16 5 7 4 6,8 4,0 41,5

159a~11.19

S 16 8 8 0 8,0 4,7 41,3

114-11.30

C 16 0 16 0 7,5 4,5 40,4

5-11.19

C 16 1 15 0 7,3 4,4 40,0

294-11.19

C 16 0 16 0 7,5 4,5 40,0

(9)-3-l 1.30

S 16 6 7 3 7,9 4,8 39,8

210-11.19

S 16 7 4 4 7,8 4,8 39,1

15-11.19

pS 16 6 10 0 7,5 4,6 38,7

162a-11.30

S 16 10 6 0 7,9 4,9 38,6

72-11.19

S 16 13 3 0 7,0 4,3 37,8

324-11.30

S 16 1 9 6 6,1 3,8 37,2

162c-11.30

S 16 2 14 0 7,4 4,7 37,2

102-11.19

pS 16 4 10 2 7,6 4,8 36,1

126-11.30

S 16 4 9 3 8,3 5,3 35,7

322-11.30

S 16 1 9 6 5,7 3,8 32,6

249 (294)- 11.30

S 16 2 10 4 8,0 5,5 31,9

330-11.19

pS 16 3 12 1 6,2 4,2 31,8

Tabla 19.

ID de la planta

Análisis preliminar con transferencia Southern nº de semillas para el análisis de FAME con CG nº de semillas con relación C16:1 WT <10% nº de semillas con relación C16:1 intermedia nº de semillas con la relación C16:1 más alta Relación de saturados en WT Relación de saturados en transgénicos Reducción de la relación de saturados

138-11.30

pS 15 5 7 3 7,5 5,1 31,8

35b-11.30

S 16 1 12 3 7,1 4,9 31,5

218-11.30

S 16 0 16 0 7,5 5,2 30,9

146-11.19

S 16 2 8 6 6,4 4,4 30,9

175-11.30

S 16 6 8 2 7,2 5,1 28,7

69-11.19

S 16 4 9 3 7,0 5,0 28,3

311-11.30

C 16 0 16 0 7,5 5,4 28,3

162-.11.19

pS 16 9 7 0 6,6 4,8 27,4

350-11.19

pS 16 3 12 1 6,7 4,9 27,0

36-11.19

S 15 1 9 5 6,8 5,0 26,8

320-11.30

C 16 7 9 0 7,1 5,3 24,9

245-11.30

C 16 0 16 0 7,5 5,7 24,7

326-11.19

S 16 5 1 10 5,7 4,5 20,6

213-11.30

S 16 8 8 0 6,2 5,1 18,0

26-11.30

pS 16 8 7 1 7,8 7,4 5,0

209-11.19

S 16 16 0 0 7,9 7,9 0,0

5a-6.15

N 16 16 0 0 9,2 9,2 0,0

14a-6.15

N 13 13 0 0 8,2 8,2 0,0

14b-6.15

N 16 16 0 0 8,0 8,0 0,0

63-6.15

N 16 16 0 0 9,3 9,3 0,0

99a-6.15

N 16 16 0 0 9,2 9,2 0,0

99c-6.15

N 16 16 0 0 8,2 8,2 0,0

87a-11.19

N 16 16 0 0 7,9 7,9 0,0

35a-11.30

N 16 16 0 0 7,1 7,1 0,0

43a-11.30 1

N 15 15 0 0 7,4 7,4 0,0

76-11.30

N 16 16 0 0 7,5 7,5 0,0

La "Reducción de la relación de saturados" se usó para clasificar los eventos porque en general utilizó las semillas del mismo evento transgénico. Esta comparación directa ayuda reducir la variabilidad entre las plantas causadas por el cultivo de los tejidos y de las plantas en diferentes momentos.

5 Los datos anteriores muestran un aparente efecto de dosificación génica: cuantas más copias del transgén, mayor reducción de los ácidos grasos saturados. Por ejemplo, hay 57 plantas "no control". Estas 57 plantas se pueden dividir en tres grupos de 19 plantas. El conjunto superior de plantas (que muestran las mayores reducciones de saturados y los menores niveles de saturados) suponen 11 de los 19 eventos "complejos" (más de 3 copias del gen de la desaturasa).

10 Este conjunto contenía 8 de los 19 eventos caracterizados como “simple” o “probablemente simple”. El conjunto medio de 19 plantas sólo presentaba 6 de los 19 eventos "complejos" (13 de los 19 eventos "simples" o "probablemente simples"). Aún más, el tercer conjunto de 19 plantas (con, relativamente, las menores reducciones de saturados) sólo manifestó 3 eventos complejos, con 16 de los 19 eventos calificados como "simples" o "probablemente simples". Por tanto, las plantas con células portadoras de más de 3 copias de la desaturasa parecen presentar una mejor reducción

15 de los saturados que las plantas cuyas células sólo contienen 1 copia del gen.

Ejemplo 15 - Separación de los ácidos oleico y vaccénico

El ácido vaccénico es un C18:1 con el enlace doble en la posición delta-11. El ácido vaccénico se forma alargando el

20 C16:1 delta-9 fuera del plastidio. Este hecho es importante porque otros métodos analíticos citados en la presente memoria combinaron los picos del ácido oleico y vaccénico en una sola composición porcentual denominada "oleico". Es decir, que no hubo separación de los dos ácidos sino se indicaba como tal. Restando la contribución del ácido vaccénico, se demuestra pronto que la contribución porcentual del ácido oleico se mantiene, sorprendente y ventajosamente, en menos del 80% a la par que persiste la reducción de los saturados totales (a niveles calificables

25 como "Sin grasas saturadas" o "Bajo contenido en grasas saturadas"). Para demostrar esto se utilizaron dos tipos de análisis, como se indica en los dos ejemplos siguientes.

Ejemplo 16 – PNT para la extracción de las semillas de canola con Delta-9 y el análisis del ácido vaccénico

30 Las Figuras 7A y 7B exponen los datos obtenidos con el protocolo siguiente.

Preparación de la muestra

1.

Pesar las semillas una a una y colocarlas en una placa madre de plástico.

2.

Añadir 2 bolas de 1/8" a cada pocillo

3.

Colocar la placa madre en un dispensador automático de líquidos Hamilton:

añadir 400 µl de heptano con patrón interno (C11:0) y de sustitución (C15:0 FAEE) y después añadir 100 µl de metóxido sódico (.5N)

4.

Tapar la placa y homogeneizar en un pulverizador Geno-grinder durante 5 minutos (1x a 500)

5.

Cambiar los tapones de la placa

6.

Colocar la tapa de la placa con un tapete de goma (sellado extra). Cerrar la tapa con cinta adhesiva de electricista negra y retirar el fondo de la placa madre para exponer los viales

7.

Colocar la placa en el vórtex/calentador durante 15 min. a 37°C/60 rpm (los pocillos del vórtex deben contener esferas de vidrio)

8.

Centrifugar la placa a 3500 rpm durante 2 min.

9.

Volver a colocar la tapa del fondo y retirar la tapa/tapones. Transferir 350 µl de la capa superior a una nueva placa con el dispensador Hamilton.

10.

A continuación, añadir 400 µl de heptano con patrón interno (IS) y de sustitución a la placa de extracción.

11.

Repetir los pasos 5 a 10 dos veces más (3 transferencias en total)

12.

Mantener la placa de extracción en el Hamilton al acabar la última transferencia. Transferir 50 µl del extracto al inserto de vidrio montado en el bloque de aluminio que debe contener 450 µl de heptano con el patrón interno C11

13.

Inyectar en el CG

Análisis por CG/FID (diferente del perfil de FAME)

Parámetros de CG: Inyección de 1 µl sin fraccionamiento por muestra

Columna

BPX70 de SGE, 15 metros, 0,25 mm de D.I. y 0,25 µm de espesor de película

Parámetros de CG

Programada de temperatura del horno

70°C mantenidos durante 2,15 min (sin fraccionamiento) 70°C - 140°C a 25°C min, 140°C mantenidos durante 14 min, 140°C - 180°C a 10°C min, 180°C mantenidos durante 3 min 180°C - 220°C a 25°C min 220°C mantenidos durante 3 min. Temperatura del inyector - 230°C Temperatura del detector - 240°C Gas auxiliar - Nitrógeno a 25 ml/min. Combustible para el FID – aire a 400 ml/min., hidrógeno a 40 ml/min Inyector delantero: tiempo de purga 1 min. Flujo de purga 35 ml/min Inyector posterior: tiempo de purga 2,15 min. Flujo de purga 35 ml/min. Presión de entrada delantera: 1,0 ml/min – flujo constante Presión de entrada posterior: 1,0 ml/min – flujo constante

Tiempo de proceso – 30,55 minutos,

Flujos – flujo de helio constante a 1 ml/min

5 Secuencia de adquisición

Se fraccionaron 96 muestras entre la columna delantera y posterior para minimizar la acumulación en el liner. La lista de muestras consta de 5 métodos de inyección correspondientes al tipo de muestra inyectada. Las primeras 5 muestras inyectadas son siempre:

1.

Matriz

2.

Matriz

3.

Patrón 1

4. Reactivo de blanco 15 5-32. Muestras de canola

33. Patrón 2 34-54. Muestras de canola

55. Patrón 3

20 Cada lista comprende 6 eventos de 8 muestras (1 semilla = 1 muestra) (48 muestras).

El patrón contiene en total 200 ppm de FAME, distribuidos del modo siguiente:

Tabla 20.

FAME

Concentración (ppm) Añadido a la calibración

C14:0

2 sí

C16:0

8 sí

C18:0

6 sí

C18:1

120 sí

C18:2

24 sí

C18:3

10 sí

C20:0

6 sí

C20:1

2 sí

C22:0

6 sí

C22:1

10 no

C24:0

6 sí

25 Ejemplo 17 – Análisis de la contribución del ácido vaccénico mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas/tiempo de vuelo

La Tabla 21 muestra los datos obtenidos con el protocolo siguiente. En la Tabla 21, se observa que en la T4 no se redujo el porcentaje de lípidos sino que éste se mantuvo en el 40,8% en la línea transgénica (igual que en la línea 30 control).

Tabla 21.

Evento

Generación D-9 PAT C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 Vacc 18:1 C18:2 C18:3

69-11.19 (HL)

T3 2 1,5 promedio 0* 2,3 1,6 0,4 78,6 3,1 9,2 3,4

69-11.19 (N)

T3 0 0 promedio 0,0 3,7 0,3 1,9 75,2 3,2 10,1 3,2

218-11.30 (HL)

T4 1 1,5 o 2 promedio 0,0 2,8 1,2 0,7 78,2 2,9 9,9 3,1

218-11.30 (N)

T4 0 0 promedio 0,0 3,9 0,3 1,8 74,4 3,1 10,8 3,3

Tabla 21. (continuación)

Evento

Generación D-9 PAT C20:0 C20:1 C22:0 C24:0 Porcentaje de lípidos Peso de semilla Aceite total (mg) % FA saturados

69-11.19 (HL)

T3 2 1,5 promedio 0,2 0,8 0,1 0,1 35,1 5,3 1,9 3,2

69-11.19(N)

T3 0 0 promedio 0,7 1,2 0,4 0,2 42,6 4,0 1,7 6,9

218-11.30 (HL)

T4 1 1,5 o 2 promedio 0,3 0,8 0,1 0,0 40,8 4,2 1,7 4,0

218-11.30 (N)

T4 0 0 promedio 0,7 1,2 0,4 0,2 40,8 4,0 1,6 6,9

*: El valor por defecto de todo valor inferior al límite de detección fue 0. Adquisición y procesamiento con HP Chemistry package.

Descripción del instrumental

Espectrómetro de masas con tiempo de vuelo Pegasus III de Leco conectado a un cromatógrafo de gases HP 6890. Autoinyector Combi Pal de CTC Analytics instalado en el HP 6890 con una jeringuilla de 10 µl.

Método de CG

Parámetros de la CG: Inyección de 1 a 3 µl sin fraccionamiento por muestra

Columna

SolGel Wax, 30 metros, 0,25 mm de D.I. y 0,25 µm de espesor de película

Parámetros de CG

Programada de temperatura del horno

70°C - 175°C a 25°C min, (sin fraccionamiento) 175°C mantenidos durante 25 min, 175°C - 230°C a 50°C min, 230°C mantenidos durante 3 min. Temperatura del inyector - 230°C Línea de transferencia - 300°C Inyector posterior: tiempo de purga 30 segundos. Flujo de purga 20 ml/min. Presión de entrada posterior: 2 ml/min – flujo constante

Tiempo de proceso – 33,3 minutos,

Flujos – flujo de helio constante a 2 ml/min

Espectrómetro de masas

Selección de masa:

Masa recogida de 50 a 600 amu Sesgo filamento: -70 V Fuente de iones: 225°C

Detector:

Voltaje del detector: 1600 V Tasa de adquisición: 10 espectros/s Retraso del solvente: 100 segundos

Fragmentación

ChromaTOF Software compila la fragmentación y los picos que muestran co-migración y deconvolución para mejorar la separación y la interpretación.

La identificación de los ácidos grasos se lleva a cabo mediante el tiempo de retención y la concordancia de la fragmentación con la solución patrón (véase abajo) inyectada en las mismas condiciones y/o en una buena concordancia con la base de datos NIST/EPA/NIH incluida en el software indicado.

El éster metílico del ácido vaccenoico, también conocido como éster metílico del ácido cis-11-octadecenoico, se identificó en el extracto de semillas de canola procesando un patrón de ácido vaccénico de Sigma (CAS: 506-17-2). El tiempo de retención es de 1207 segundos y produce una concordancia de 853 con el patrón y de 814 con la base de datos indicada arriba.

Composición del patrón inyectado:

Tabla 22

FAME

Concentración (ppm) Añadido a la calibración

C14:0

2 Sí

C16:0

8 Sí

C18:0

6 Sí

C18:1

120 Sí

C18:2

24 Sí

C18:3

10 Sí

C20:0

6 Sí

C20:1

2 Sí

C22:0

6 Sí

C22:1

10 No

C24:0

6 Sí

Proceso del éster metílico de vaccenoato: 5 El producto metilado se obtuvo con la metilación de 100 mg del ácido:

-

disolver 100 mg en 5 ml de MeOHCl 0,5 N (Supelco) en un vial de vidrio de 30 ml

10 -calentar 1 hora a 70°C en atmósfera de nitrógeno

-

tras dejar enfriar a temperatura ambiente añadir 5 ml de agua con NaCl 0,9%

-

separar el éster con hexano con tres extracciones consecutivas con el mismo (15 ml) 15

-

neutralizar el residuo ácido mezclando la fase orgánica con 15 ml de agua que contenga HNaCO3 al 2,5%

-

evaporar la capa orgánica en atmósfera de N2 hasta obtener un líquido aceitoso transparente en el RT

correspondiente al éster metílico de vaccenoato. 20

Ejemplo 18 – Conseguir plantas "Sin grasas saturadas" que conserven los caracteres agronómicos superiores

En diferentes campos se efectuaron mediciones agronómicas para comparar las plantas transgénicas y las controles. La conclusión fue que, en conjunto, las plantas transgénicas se comportaban de forma parecida y presentaban caracteres

25 similares a los controles Nex 710 (aparte de la gran mejora en los niveles de saturados). Por tanto, el o los transgenes de la invención no muestran un efecto negativo congruente sobre la salud de la planta. La Tabla 23 contiene un resumen de los caracteres y del sistema de evaluación. En los campos, ubicados en distintos lugares, se emplearon criterios diversos.

30 Las Tablas 24-27 muestran algunos resultados numéricos representativos. Abreviaturas utilizadas:

DTF = días hasta la floración EOF = días hasta el final de la floración HT = altura SC = recuentos de estériles DTM = días hasta la madurez LSV = vigor tardío LOD = encamado SD WT = peso de las semillas

La Tabla 24 muestra los datos agronómicos de las líneas del Evento nº 218-11.30. La Tabla 25 muestra los datos agronómicos de las líneas del Evento nº 36-11.19. La Tabla 26 muestra los datos agronómicos de las líneas del Evento 35 69-11.19. Lo anterior demuestra que la presente invención, conseguir una canola "sin grasas saturadas", es posible, y, sorprendentemente, sin afectar negativamente a otros caracteres agronómicos importantes.

Tabla 23.

Evaluaciones de campo Evaluación Momento Escala Detalles 1= germinación excelente, porte sano; 5=germinación y/o salud de la plántula muy

Vigor/Estableci-miento Con 3-4 hojas 1 a 5

deficiente 4-7 días después de la1-5 apenas detectable, 6-10 detectable por un ojo avezado, 11-15 perceptible por un

Tolerancia al herbicida 1 0 a 100%

pulverización cultivador, 15+ probable queja del cultivador, 100=todas las plantas de la parcela muertas10-14 días después de la

Tolerancia al herbicida 2 0 a 100% Igual que en la tolerancia al herbicida 1

pulverización Días hasta la floración nº días después de la

Cada 2-3 días 10% de las plantas presentaban al menos 1 flor abierta

(DTF) siembra Días hasta el final de lanº días después de la

Cada 2-3 días 95% de las plantas de la parcela habían acabado la floración

floración (EOF) siembra Llenado tardío de las

Altura de las plantas completamente erectas, coger un manojo de plantas del centro de la

Altura semillas cm

parcela y estirar para medir

Cambio de color del 30% de las vainas, o el momento óptimo de hilerado comercial. No Días hasta la madureznº días después de laobstante, deben abrirse varias vainas por parcela (de la mitad del racimo principal) para

Valorada cada 2-3 días

(DTM) siembra determinar si la madurez de las semillas se correlaciona con el color de la vaina (es decir, algunas variedades pueden mostrar un color verde aunque las semillas estén maduras).Resistencia al encamado

En la madurez 1 a 5 1= perfectamente erecta, 5= horizontal

(LODGE_RES) Es preciso utilizar un sistema de muestreo y peso para estandarizar el rendimiento pues el

Rendimiento gramos por parcela contenido de humedad varía; si no se dispone de este sistema, suponer que las muestrastienen un peso constante antes de registrar el rendimiento.Se llevó a cabo una evaluación visual del rendimiento agronómico general de la línea (es decir, capacidad potencial de rendimiento de la línea, patrón de ramificación, longitud ytamaño de la silicua). Se usó una escala de puntuación de 1-5, donde 1 = mejor y 5 = peoren el aspecto agronómico contando diez plantas/parcela

Vigor tardío (1-5): Justo antes de la madurezRecuentos estériles En la floración 100 % floración Anotar cualquier parcela o parcelas afectadas por una mala germinación o porte deficienteNotas Durante toda la estación de las plantas, inundación, o cualquier otro factor que pudiera alterar la precisión de las evaluaciones.

Tabla 24. Resumen de los datos económicos de las líneas con mejor rendimiento del Evento nº 218-11.30

Línea Evento DTF EOF HT SC DTM LSV LOD SD WT % NULO % NEX 7101361(TS) #218-11.30 45 70 100 0 90 2 2 3,20 98 93 1319(TS) #218-11.30 44 70 98 0 90 2 1 3,23 98 94 13Q4(TS) #218-11.30 46 72 110 Q 90 2 1 3,45 105 101 1500(TS) #218-11,30 45 71 103 0 91 3 1 3,12 95 91 1405(TS) #218-11.30 45 72 109 0 91 2 1 3,05 93 89 1370(TS) #218-11.30 44 70 106 0 90 2 1 3,41 104 99 1369(TS) #218-11.30 44 70 102 0 91 2 1 3,33 102 97

1370(T) #218-11.30 44 70 106 0 90 2 1 3,41 104 99 1405(T) #218-11.30 45 72 109 0 91 2 1 3,05 93 89 1299(N) #218-11.30 43 69 98 0 90 1 1 3,28 • 96 Nex 710 42 67 100 0 88 2 1 3,43 ••

Tabla 25. Resumen de los datos económicos de las líneas con mejor rendimiento del Evento nº 36-11.19

Peso de 1000 semillas

Línea Evento DTF EOF HT SC DTM LSV LOD SD WT % NULO % NEX1099(T) 36-11.19 45 70 106 0 90 2 1 3,78 98 110 1127(N) 36-11.19 44 68 102 0 89 2 1 3,85 • 112 Nex 710 * 42 67 1000 88 2 1 3,43 •

Tabla 26. Resumen de los datos económicos de las líneas con mejor rendimiento del Evento nº 69-11.19

Peso de 1000 semillas Línea Evento DTF EOF HT SC DTM LSV LOD SD WT % NULO% NEX 710 1538 69-11.19 45 72 103 0 91 4 1 3,17 94 92 1529 69-11,19 45 71 112 0 91 3 1 3,41 101 99 1534 69-11.19 46 71 109 0 91 3 1 3,24 96 94

1604(N) 69-11.19 43 68 102 0 89 2 1 3,38 • 99

Nex 710 42 67 100 0 88 2 1 3,43 ••

Ejemplo 19 – Efecto de dosis que reduce aún más los saturados gracias a la inserción de múltiples copias de genes de δ-9 desaturasa

Este ejemplo demuestra que la acumulación de múltiples copias de genes de la δ-9 desaturasa ejerce un sorprendente efecto de dosis, que puede ser utilizado para reducir aún más el contenido de saturados en las plantas de semillas oleaginosas como canola. Si no se indica otra cosa, los datos corresponden de invernadero medidos con los procedimientos de FAME.

La Tabla 27 contiene los datos de ácidos grasos a bulto de 10 semillas F3 de Nex 710 nativa, los episodios simples (218, 36, 69), de cada uno de los paquetes de semillas F3 que se remontan a las plantas F2 que fueron seleccionadas a partir de los ensayos InVader. (Las dos últimas columnas de la Tabla 27 muestran el promedio aproximado de saturados totales de las plantas respectivas y la reducción promedio aproximada de los mismos, en comparación con el control Nex 710.) En esta generación no se usaron datos de los análisis Southern. A tenor de la expresión de saturados y de los ensayos InVader, se hizo una selección de supuestos apilamientos y supuestas hermanas así como de nulos que se reconfirmaron haciendo crecer las plantas F3 y volviendo a analizarlas con transferencias Southern.

Por ejemplo, aunque no se ha analizado estadísticamente, las muestras de las 41 líneas "apiladas" presentan un promedio de saturados totales del 3,5%. Las 21 líneas "simples" tienen un promedio de saturados totales del 3,84%.

La Tabla 28 contiene un resumen de los supuestos apilamientos F3, supuestos hermanos de los progenitores, y nulos que fueron replantados para confirmar el número de copias y la cigosidad. Se sospechó que las líneas denominadas TDN0400141, TDN0400142, TDN0400145, TDN0400155, TDN0400158 y TDN0400160 eran apilamientos homocigotos. Por su parte, las líneas TDN0400189, TDN0400143, TDN0400197, TDN0400167 y TDN0400184 se supusieron hermanos de los progenitores de los apilamientos. Las líneas TDN0400198 y TDN0400199 se avanzaron como nulos autofecundados de los apilamientos. TDN0400202, TDN0400204 y TDN0400208 son los eventos simples. Este material también está en estos momentos en el campo o se ha cosechado recientemente, y por ello todavía no están disponibles los datos de campo.

Las Figuras 8 y 9 son fotografías de dos geles con ADN de plantas F3. En esta fase hubo problemas similares con el aislamiento del ADN para el análisis Southern, así que de las 9 plantas entregadas, no todas aparecen en los geles. Según los geles, las líneas TDN0400141, TDN0400142 y posiblemente TDN0400158 (sólo 2 plantas) son apilamientos homocigotos. TDN0400145 todavía se está segregando para el evento 36, y TDN0400155 todavía se está segregando para el evento 69. La línea TDN0400160 parece tener una extraña segregación de bandas que podría indicar que se está segregando para los 3 eventos simples; esta línea será objeto de seguimiento. La planta nº 8 de este cruce presenta un nivel bajo de saturados, 2,6%, que concuerda con ser un triple apilamiento de alta cigosidad. Un análisis molecular adicional puede confirmar esto. En los geles no aparecen todas las líneas que se sospecha que son hermanas (líneas TDN0400184, TDN0400189 y TDN0400197 subrayadas en la columna de Evento de la Tabla 29, discutidas abajo). A tenor de los datos de ácidos grasos de una sola planta, parece que las 9 plantas de TDN0400184 (que podrían contener sólo el evento 218) presentaban niveles de saturados tan bajos como los supuestos apilamientos. Es decir, la tendencia que revelan los datos es que las plantas que contienen los eventos apilados muestran de forma uniforme una reducción significativa de los saturados en comparación con las plantas de la misma progenie que sólo contienen uno de los dos eventos transgénicos.

La Tabla 29 contiene los datos de ácidos grasos de grupos de 10 semillas de Nex 710, los eventos simples, y cada planta F4 suelta. Nueve plantas de cada supuesto apilamiento, nulo, evento simple y similares se volvieron a cultivar, se obtuvieron muestras de tejido para el análisis molecular y se dejó madurar las semillas de las mismas para analizar sus ácidos grasos.

Tabla 27. Tabla 27. Tabla 27.

Tabla 27 (continuación). Peso de

Nombre Pedigrí

semillas

Tabla 28.

GeneraSeguimiento Semillas

Nombre Pedigrí Fuente C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 TOTSAT

ción para confirmar: (g) TDN0400211 Nex 710 NEX 710 4,37 0,34 1,46 73,94 13,53 2,91 7,08 TDN0400202 69-11.19 TDN04-123 T7 2,97 1,59 0,47 79,3 10,86 2,85 3,86 TDN0400204 218-11.30 TDN04-128 T6 2,66 1,9 0,49 78,85 10,98 3,01 3,73 TDN0400208 36-11.19 TDN04-132 T6 2,51 1,95 0,58 79,45 10,73 2,52 3,69 TDN0400198 69-11.19/36-11.19(null) TDN04-133/P-116 F3 4,05 0,29 1,2 75,27 12,77 3,42 6,16 10,2 TDN0400199 69-11.19/218-11.30(null) TDN04-134/P11 F3 4,16 0,29 1,24 73,67 14,17 3,4 6,43 8,6

Apilamiento

TDN0400141 69-11.19/36-11.19 TDN04-133/P70 F3 2,24 2,36 0,32 80,3 9,3 3,23 3,1 1,3

homoApilamiento

TDN0400142 69-11.19/36-11.19 TDN04-133/P114 F3 2,15 2,38 0,3 79,89 9,77 3,17 3,02 4,8

homoApilamiento

TDN0400145 69-11.19/36-11.19 TDN04-133/P129 F3 2,34 2,09 0,37 81,23 9,12 2,7 3,07 5,8

homoApilamiento

TDN0400155 69-11.19/218-11.30 TDN04-134/P-32 F3 2,38 2,31 0,42 79,55 10,15 3,4 3,12 1,4

homoApilamiento

TDN0400158 69-11.19/218-11.30 TDN04-134/P-38 F3 2,2 2,36 0,29 80,14 9,44 3,36 3,05 3,2

homoApilamiento

TDN0400160 69-11.19/218-11.30 TDN04-134/P-48 F3 2,23 2,27 0,29 81,88 8,47 2,97 2,81 1,2

homo TDN0400189 218-11.30/36-11.19 TDN04-135/P-31 F3 2,69 1,65 0,55 80,3 10,07 2,78 3,7 homo 36 8,1 TDN0400143 69-11.19/36-11.19 TDN04-133/P121 F3 2,82 1,66 0,62 79,6 10,65 2,46 4,04 homo 69 8,5 TDN0400197 218-11.30/36-11.19 TDN04-135/P-88 F3 2,75 1,64 0,54 79,11 10,78 3,06 3,89 homo 218 8,0 TDN0400167 69-11.19/218-11.30 TDN04-134/P-119 F3 2,64 1,94 0,51 80,54 9,4 2,83 3,8 homo 218 7,2 TDN0400184 218-11.30/36-11.19 TDN04-135/P-112 F3 2,4 2,26 0,42 81,28 8,89 2,7 3,4 homo 218 9,0

Tabla 29. Genera-Población deNombre ción origen Nombre del Evento

Tabla 29.

Genera-

Población de origen Nombre del Evento

Nombre

ción

Tabla 29.

Genera-Nombre ción Población de origen Nombre del Evento

Table 29. Genera-Nombre ción Población de origen Nombre del Evento

Tabla 29. Genera-Nombre ción Población de origen Nombre del Evento

Tabla 29 (continuación). UnidadesPeso dede peso Nombre

de sem.

semillas

Tabla 29 (continuación). Unidadesde peso

Peso dede sem.

semillas

Nombre

Tabla 29 (continuación).

UnidadesPeso dede peso Nombre semillasde sem.

Tabla 29 (continuación). Unidadesde peso

Peso dede sem.

semillas

Nombre

Tabla 29 (continuación). UnidadesPeso dede peso Nombre semillasde sem.

Tabla 29 (continuación).

Lista de secuencias

<110> Dow AgroSciences LLC 5

<120> Plantas con niveles nulos o reducidos de ácidos grasos saturados en sus semillas y aceite derivado de dichas semillas

<130> DAS-119XCl PCT 10

<150> US 60/617,532

<151> 2004-10-08

<160> 5 15

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1365 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de ácidos nucleicos del marco abierto de lectura correspondiente al gen de la delta-9 desaturasa25 optimizado para vegetales

<400> 1

<210> 2

<211> 1381

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ORF de la SEC ID nº 1 precedido por una secuenica Kozak y un sitio de clonación para BamHI, más un

terminador de la traducción al fina del ORF 10

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (10)

<223>

Secuencia Kozak y sitio de clonación para BamHI 15

<220>

<221> misc_feature

<222> (1379)..(1381)

<223>

Terminador de la traducción 20

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de Delta-9

<400> 3 tgagttcatc tcgagttcat g 21

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de Delta-9

<400> 4 gatccaacaa tgtctgctcc 20

<210> 5

<211> 455

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína codificada por la secuencia de ácidos nucleicos del marco abierto de lectura correspondiente al gen de la delta-9 desaturasa optimizado para vegetales

<400> 5

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Planta de canola productora de semillas que contienen una fracción de aceite que comprende menos del 3,5% de saturados totales y entre el 70% y menos del 80% de ácido oleico, comprendiendo dicha planta al menos un polinucleótido incorporado de manera estable en su genoma que codifica una delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5 o una variante de la misma, presentando dicha variante una secuencia de aminoácidos que mantiene una identidad de secuencia igual o superior al 80% de la SEC ID nº 5 y presentando la misma actividad enzimática que la delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5, y siendo dichos saturados totales la suma de los ácidos grasos 16:0, 18:0, 20:0, 22:0 y 24:0.

2. 2.

   Planta según la reivindicación 1, en la que dicha fracción de aceite comprende del 70% al 78% de ácido oleico.

3. 3.

   Planta según la reivindicación 1, en la que dicha fracción de aceite comprende como máximo un 3% de ácido linolénico.

4. 4.

   Planta según la reivindicación 1, en la que dicha fracción de aceite comprende del 70% al 78% de ácido oleico y como máximo un 3,5% de ácido linolénico.

5. 5.

   Semillas producidas por la planta de canola según la reivindicación 1, en las que las semillas comprenden menos del 3,5% de saturados totales y entre el 70% y menos del 80% de ácido oleico y comprenden al menos un polinucleótido incorporado de manera estable en su genoma que codifica una delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5 o una variante de la misma, presentando dicha variante una secuencia de aminoácidos que mantiene una identidad de secuencia igual o superior al 80% de la SEC ID nº 5 y presentando la misma actividad enzimática que la delta-9 desaturasa de Aspergillus nidulans de la SEC ID nº 5

6. 6.

   Planta de canola según la reivindicación 1, en la que dicha fracción de aceite presenta como máximo un 2,7% de saturados totales.

7. 7.

   Semillas de canola según la reivindicación 5, que contienen una fracción de aceite que comprende como máximo un 2,7% de saturados totales.

8. 8.

   Planta según la reivindicación 1, en la que dicha planta tiene al menos 100 cm de altura y un peso medio de semilla superior a 3 mg.

   Reducción >60% de los ácidos grasos saturados. -> En el mejor de los casos más de 16:1 (5,9%) que de 16:0 (4,4%)

   FIG. 1

   Como WT Con expresión de delta-9

   FIG. 2

   Tres plantas transgénicas derivadas de un callo, todas positivas en el Southern, el patrón de Southern indica un evento.Análisis de FAME en semillas sueltas de la generación T1 (-> T2 en Arabidopsis).

   En el mejor de los casos, reducción del 43% en los saturados (50% cuando se incluye 24:0)

   FIG. 3

   FIG. 4A

   Datos de ácidos grasos

   Datos de ácidos grasos

   T2 Datos GHT3 datos de semillas enteras de GH

   HS

   218-11.30 T3 Ácido graso, Datos de grupos de 10 semillas seleccionadas 218-11.30 T3 Ácido graso, Cantidad de Datos de grupos de 10semillas semillas seleccionadas

   218-11.30 T2 Datos sobre ácido graso, Datos de HS

   Canola Delta-9 F3 Progenie de los cruces de eventos superiores69_11.19 x 36_11.19 digestión con EcoRI Sonda=Delta-95-02-05 GS FIG. 8 Canola Delta-9 F3 Progenie de los cruces de eventos superiores69_11.19 x 218_11.30 digestión con EcoRI Sonda=Delta-95-2-05 GS FIG. 9