JPH06506700A - 鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体 - Google Patents

鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体

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JPH06506700A JP5504888A JP50488893A JPH06506700A JP H06506700 A JPH06506700 A JP H06506700A JP 5504888 A JP5504888 A JP 5504888A JP 50488893 A JP50488893 A JP 50488893A JP H06506700 A JPH06506700 A JP H06506700A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成お よび直接標識化のための機能性担体 核酸断片のDNAまたはRNAへのハイブリダイゼーションおよび蛍光色素また は親和性基などによるそれらの非放射性標識化と組み合わせたそれらの鋳型依存 性酵素的伸長に関する技術は、生体医用分野におけるオリゴヌクレオチドの多く の応用の基礎である。これらは、例えば、サンガー(S anger)のジデオ キシ法に従う標識プライマーによる核酸の配列決定または核酸診断用薬に関連す るポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用を含む。非放射性標識法は、放射性同 位体の取り扱いおよび放射性同位体による汚染の問題ならびにそれらの貯蔵およ び廃棄の困難さを回避するので、一般に、かかる目的のため好ましい。
非放射性標識化基(labelling group)の導入は、原則的には、 化学的または酵素的手段によって達成できる。これに関連して、オリゴヌクレオ チド鎖自体の合成は、一般に、化学的手段によって行われると仮定しなければな らない。したがって、例えば、デオキシヌクレオチジルーターミナルトランスフ ェラーゼによって触媒された5−ブロモ−dUTP [ヌークリアサイディズ・ アンド・ヌークリアタイディズ(Nucleosides & Nucleot ides)8.805−813 (1989)]、]ビオチンーdUTP[ヌー クリイソク・アシッズ・リサーチ(Nucleic Ac1dsRes、)16 .4077−4095 (1988)]または]ジゴキシゲ=ンーdUTP[B iol、 Chew、 Hoppe 5eyler 371.917−927  (1990)]とオリゴヌクレオチドを反応させることによる次なる酵素標識化 は、さらなる処理段階の必要性によって、最初から複雑である。しかしながら、 とりわけ、これは、通常、オリゴヌクレオチド鎖の3°末端を越える、構造的に 修飾されたヌクレオシド−5゛トリリン酸による伸長であることに注意すべきで ある。この工程では、(鋳型に依存して)1を超えるヌクレオチド単位が、通常 、3°末端に自動的に結合し、その結果、この方法で標識されたオリゴヌクレオ チドは、最初から、全ての鋳型依存性鎖伸長のために使用することはできない。
デオキシリボヌクレオチドは、液塩基に、糖残基に、またはヌクレオチド間結合 (リン酸結合)で適当な基を導入することによって、化学的手段により非放射性 標識され得る。現在、これは、はとんどもっばら、オリゴヌクレオチドの合成お よびプロセノノングの間またはその後に行われる。この方法では、オリゴヌクレ オチド鎖のs’−on末端[ヌークリイック・アシッズ・リサーチ(Nucle icAcid Res、 ) 14.6227−6245 (1986);ヌー クリイソク・アノッズ・リサーチ14.7985−7994 (1986)]、 5′末端または内部の液塩基[ヌークリイソク・アシッズ・リサーチ15.31 31−3139 (1987)二′)ヤーナル・オブ・オーガニック・ケミスト リー(J 、 Org、 Che+a、 ) 55.5931−5933 (1 990)]あるいは]5′−末端リン酸基ヌークリイック・アンノズ・リサーチ 18.4355−4360 (1990)]またはヌクレオチド間リン酸基[ヌ ークリアサイディズ・アンド・ヌークリアタイディズ(Nucleosides  & Nucleotides) ]、 01303−306 (1991)] が置換される。はとんどの標識化反応は、鎖の化学的合成後の反応によって行わ れる。
この場合、反応相手は、比較的不安定なオリゴヌクレオチド鎖であり、その結果 、副反応の危険性がかなりある。場合によっては、標識化基は、適当なアミドホ スファイト誘導体を試薬として使用することによって導入される。かがる試薬は 、通常、あまり安定ではなく、限定された期間、溶液中に貯蔵することができる だけである。最近、オリゴヌクレオチド鎖の3’−OH末端での基の導入を可能 にするCPG担体が開示された(ベルモント(BelIl○nt)、カリフォル ニア、第188頁)。
しかしながら、3°−OH末端は、さらなる鎖伸長に対してこれらの基によって ブロックされており、その結果、この方法で標識されたオリゴヌクレオチドは、 鋳型依存性ポリメラーゼ反応用プライマーとしては考えられない。今まで、鋳型 依存性ポリメラーゼ反応のために使用される全てのオリゴヌクレオチドについて 、もっばら、5°−末端標識オリゴヌクレオチドが使用された。この場合、一方 では、内部標識化基がハイブリダイゼーションを妨害し、他方では、これがこの 位置に非生物的置換基を含有する場合は、鋳型依存性ポリメラーゼが3°末端を 越えてプライマーを伸長しないと思われた。
驚くべきことに、本発明者らは、デオキシオリゴヌクレオチドがDNAポリメラ ーゼによるプライマーとしても受け入れられ、それらが3′−末端塩基に蛍光色 素などの標識化基を含有する場合でさえ、ポリヌクレオチドに取り込まれること を見いだした。この場合、それらは、5゛−末端標識化基をりえられたプライマ ーと同一の能力を取り込む。本発明者らは、オリゴヌクレオチド合成の間または その後に、適当な官能基を与えられたアミドホスファイト誘導体の使用を必要と せずに、オリゴヌクレオチド配列が標識形態で得られ、使用され得るというこの 発見に基づいて、好ましいプロセスを開発した。
したがって、本発明は、高分子担体に結合した標識化基によって修飾されたモノ ヌクレオシド、末端標識オリゴヌクレオチドの合成のための該モノヌクレオシド の使用ならびにポリメラーゼ触媒連鎖伸長用プライマーとしてのこれらのオリゴ ヌクレオチドの使用に関する。
本発明は、化学的オリゴヌクレオチド合成のための固相または液相としての標識 比相の生成および使用に基づ匂 標識比相は、以下に記載のとおり、それらの機能性化のタイプによって、オリゴ ヌクレオチド鎖の最初の部分に、自体が標識化基またはその前駆体である1また は数個の置換基を結合する高分子担体と解される。置換基は、オリゴヌクレオチ ド合成および標識比相からのオリゴヌクレオチドの切断の後、その3’−0f1 基がポリメラーゼによる鋳型依存性鎖伸長のために遊離することによって結合さ れる。この場合の担体は、いずれが所望の、非架橋または架橋重合体ならびに有 機または無機物質、好ましくは、ポリスチレン誘導体、シリカゲルまたはCPG (controlled pore glass)、あるいは好適なアンカー基 の存在によって(好ましくはスペーサーを介して)ヌクレオシドまたはヌクレオ チドに結合することができるポリエチレングリコールの可溶性誘導体、例えば、 化学的オリゴヌクレオチド合成について一般的なこれらの担体などである。
本発明の定義内の標識比相は、標識化基を与えられたヌクレオシドもしくはヌク レオチドまたはその誘導体もしくは前駆体に非ヌクレオシド・スペーサーを介し て結合する前記タイプの担体を記すために使用される。この場合、モノヌクレオ シドが好ましい。
使用できる非ヌクレオシド・スペーサーは、例えば、「長鎖アルキルアミン」ス ペーサーなどの、ヌクレオシドおよびヌクレオチドおよび担体を結合するための 化学的オリゴヌクレオチド合成における通常のリンカ−である[オリゴヌークリ アタイド、ンンセシス、ア・プラクティカル・アプローチ(Oligonucl eotide。
5ynthesis、 A practical approach) ;エム ・ジエイ・ゲイト(M、 J 、 Ga1t)、アイ・アール・エル・プレス( IRL Press)1984 オックスフォード]。
本発明の定義内のアンカー基は、他の化学化合物を水性媒体または有機溶媒中で 共有結合することができる担体の化学的基である。好ましいアンカー基は、アミ ノ基、ヒドロキシル基、またはメルカプト基である。NH,が特に好ましい。
標識化基なる語は、オリゴヌクレオチド鎖自体に対して固有ではない固相または 液相で合成さ第1たオリゴヌクレオチドに特定の構造的性質を与えることができ る、標識比相に固定されたヌクレオシドと共有結合し、所望により、スペーサー を介して結合し5た全ての置換基を意味する。非放射性標識化基が好ましい。好 ましくは、蛍光基、発光基、抗原基または親和性媒介基および錯体形成基である 。
さらにまた、所望により保護形管であってもよい、標識結合能を有するアミノ基 などのこれらの基も含むと解される。広い意味では、例えば、オリゴヌクレオチ ド鎖の置換基として、D N AもしくはRNA Cまたはタンパク)を特異的 に結合または切断する能力によってオリゴヌクレオチドの可能な治療用途を可能 にするこtlらの基も、本発明の定義内の標識化基と称する。特に好ましい標識 化基は、フルオし/セイン、ジゴキ/ゲニンおよびビオチンなどのハブテンであ る。ハブテンは、七〇自体では免疫応答を起こさないが、巨大分子担体に結合し た後は免疫応答を起こず、5009/mo1未満の分子量を有する免疫学的反応 性化学化合物である。
本発明の定義内のオリゴヌクレオチドは、生物学的ヌクレオチド単位からなる配 列、ならびに全体的または部分的に、生物学的DNAもしくはRNAと比較して 構造的に修飾された構築用ブロック(building block)および/ または修飾されたヌクレオチド間結合からなる配列と解される。
該標識比相の使用によって、文献で公知の方法に従い、および文献で公知のシン ソン(synthon)を使用して、自動化プロセスで、本発明のオリゴヌクレ オチドを製造することもできる。これは、文献で公知の方法と同様に、標識比相 によって導入された標識化基に加えて、同一の型または別の型の標識化基が合成 の間にオリゴヌクレオチド鎖におけるいずれか池の所望の位置で導入される場合 を排除しない。しかしながら、標識比相で合成されたオリゴヌクレオチドは、単 に通常の生物学的核酸構築用ブロックであり得るだけである。
該オリゴヌクレオチドは、所望の配列の3゛から5゛末端に合成されるのが好ま しい。適当なシンソンを使用する場合(実施例を参照)、別法としては、核塩基 が本発明の定義内の標識化基と置換される1または数個のヌクレオシドを3′末 端で使用する合成を、所望の担体上で5°から3°末端に行うこともできる。
本発明のオリゴヌクレオチドを製造するために、アンカー基(好ましくは、アミ ノ基)を有する担体を、好ましくは3゛ヒドロキシル基で活性化され、かつ、他 の反応性基(例えば、5°OHおよび核塩基の主要アミノ基)が通常の手段で保 護されているモノヌクレオシドと反応させる。このモノヌクレオシドは、好まし くは、塩基のアミノ基上または塩基に結合したさらなる置換基上に、末端標識化 基、好ましくは保護された反応性基を有するスペーサーを有する。
このヌクレオシドが合成されるべきオリゴヌクレオチドの他のモノヌクレオシド 単位中で生じない基を該塩基上に含有する場合、この塩基で、完成したオリゴヌ クレオチドを選択的に標識することができる。
次いで、5°−〇−保護基(例えば、ジメトキントリチル)は、好ましくはスペ ーサーを介して担体に結合した保護モノヌクレオシドを含有する、この方法で製 造された標識比相から切断される。次いで、従来技術から公知のオリゴヌクレオ チド合成は、好ましくは、所望のヌクレオチド配列が達成されるまで、ホスホロ アミダイトによるヌクレオチド構築用ブロックの結合を介する固相法によって標 識比相で行われる。
該合成の後、標識オリゴヌクレオチド鎖は、所望により保護基を遊離し、標識化 基まt:はそれらの前駆体がオリゴヌクレオチド鎖の3゛末端に(それらが他の 位置に結合していた場合にはその位置にも)残存するような方法で高分子から切 断される。
標識比相が単に標識化基の前駆体を含有する場合、または、合成の間に3゛位に 標識化基の前駆体が導入されるだけの場合、これは、次なる工程で、実際の標識 化基に変換されなければならない。
本発明の定義内の3゛末端で標識されたオリゴヌクレオチドは、DNAまたはR NAポリメラーゼによって触媒された鋳型依存性重合でプライマーとして使用す ることができる。このために、種々の鋳型依存性ポリメラーゼ反応の変形につい て文献に開示されている通常の反応条件を使用することができる(例えば、EP −A O200362)。
例えば、−末鎖DNAの配列分析のために、本発明に従って、3゛位がフルオレ セインで標識化されたプライマーを使用することが可能であった。配列決定は、 フ7/レマノア°カンパニー (Pharmacia Company) (P harmacia−LKBAutoprimer” 5ynthesis Ki t (27−9290−01))の作業指示に従って、エフ・サンが−(F、  S anger)ら[ブロノーディングズ・オブ・ナシジナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ(Proc、 Natl、 Acad、  Sci。
USA)74.5463−5467 (1977)]のジデオキシ法にしたがっ て行うことができる。この方法では、実施例4に従って、pUc19−DNAの 約500塩基までおよびタコのDNA D3の配列を解読することができた。
同様にかなり長い配列を解読させるM]、3mp18の配列決定を実施例5に記 載する。
例えば、文献から公知の指示に従って、各々、3゛位がフルオレセインで標識さ れた実施例6に記載のオリゴヌクレオチドブライマーを(非標識リバースプライ マーと一緒に)使用することによって、二本鎖M13mp18RF DNAの1 41および145塩基の断片を増幅することができた。ゲル電気泳動後、臭化エ チジウム染色によって、増幅したDNA断片を可視化した。フルオレセイン残基 の存在を蛍光測定で検出した。
本発明の定義内の標識オリゴヌクレオチドを得るための標識比相の使用は、これ らの相がメリイフィールド合成用の固相または液相どしてオリゴヌクレオチドの 合成を可能にするだけではなく、同時に、安定な標識化試薬の特徴を有するとい う点で特に優れている。したがって、従来、オリゴヌクレオチド合成の間または その後に使用しなければならなかった池の標識化試薬を使用する必要がない。
かかる標識化試薬は、しばしば、特に、それらがアミドポスファイト試薬である 場合、制限された安定性を有するだけである。さらに、標識比相を使用すると、 さらなる試薬または合成段階を必要とせずに、自動化法でオリゴヌクレオチド鎖 の実際の合成を慣用的に行うことが可能であるということが特に優れている。か くして、標識化基の導入が必要な、全てでな(でも必須の段階は、オリゴヌクレ オチド合成の開始前に移される。
かくして、標識比相1バッチで、3゛末端で適当な標識ヌクレオシド(または数 個の適当なヌクレオシド)を有する種々の所望の配列を生成することが可能であ る。これに対して、従来、例えば、PCR診断薬用の一連の配列決定プライマー またはアンブリマー(ampli■er)がらの個々のオリゴヌクレオチドを別 々に標識することが必要であった。かくして、標識比相およびそれによって得ら れた3′標識オリゴヌクレオチドの使用は、プライマーとして3°末端標識オリ ゴヌクレオチドを使用する鋳型依存性ポリメラーゼ反応、特に、サンガーによる 配列決定反応またはPCHに基づくこれら全ての方法の合理化を可能にする。
これは、n個の配列決定プライマー1組を非放射性標識するために、少なくとも n個の標識化反応または標識化段階がもはや必要とされず、代わりに4つの標識 比相だけであるということの結果である。不安定なベアリング(TおよびCと1 1AおよびGとU)を利用すると、必要なものは、2つの標識比相に減少する。
標識比相の生成の間の標識化反応のためになおも必要なものを考慮すると、オリ ゴヌクレオチドの標識化に必要な労力は、約2/n〜4 / nに減少する。こ れは、例えば種々の配列のプライマー約1oo個1組の生成について、欅識化労 カの96〜98%を省くことができる。例えば、大きな配列決定法のためにプラ イマー100011が必要な場合、節約は、99.6〜99.8%に減少する。
第1図は、トシルで修飾したデオキシシチジン担体の合成、修飾オリゴヌクレオ チドの放出、およびリポータ−基(この場合、フルオレセイン)との反応を示す 。
第2図は、デオキシアデノシンおよびデオキシグアノシンに関する同様の方法を 示す。
第3図は、ハロゲン化されたヌクレオシド誘導体で開始される、スペーサーを( すでに)含有するデオキシウリジン担体の合成を示す。
第4図aは、プライマーRPによるpUCDNAの配列決定に関する。
第4図すは、プライマーAによるpUCDNAの配列決定に関する。
第4図Cは、プライマーBによるpU])NAの配列決定に関する。
第5図aは、プライマーI〕によるM13 DNAの配列決定に関する。
第5図すは、プライマーEによるM13DNAの配列決定に関する。
本発明を、以下の実施例によってさらに詳細に説明する。
a)デオキシシチジン担体(第1図) 無水ピリジン(20,l)中、塩化トリメチルシリル(2,5璽i!、20■m ol)と2゛−デオキシンチジン・塩酸塩(1,32g、5−順l)を撹拌しつ つ1時間反応させる。次いで、該反応混合物を、水分を除去しつつ、蒸発によっ て体積的15Illに濃縮し、次いで、p−トルエンスルボニルクロリド(]、 、9g、10■■of) ヲ添加する。良く密封した反応容器を乾燥器中60℃ で一晩貯蔵する。該混合物の薄暮クロマドグフィーによる試験は、出発物質の完 全な転換を示す。ジクロロメタン(50麿l)の添加によって反応体積を増加さ せ、次いで、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(60a/)と−緒に振盪すること によって有機相を抽出する。水性層をジクロロメタン(20+/)で2回抽出す る。合わせた抽出物を水ジエツト式真空中で濃縮し、ピリジンで体積を約15+ +t!にする。これに濃アンモニア水溶液(15@l)を添加し、薄層クロマド グフィーによって脱シリル化の進行をモニターする。4時間後、該反応は、定量 的になる。次いで、減圧下、反応混合物を濃縮し、次いで、得ら4また4−N− p−トルエンスルホニル−2°−デオキシシチジン粗製生成物を、無水ピリジン (3X2(b/)を用いた蒸発処理によって濃縮し、次いで、無水ピリジン(2 0a/)に再度溶解する。4.4“−ジメトキシトリチルクロリド(1,70f 、5關o1)を添加する。薄層クロマドグフィーによ、てトリチル化反応を観察 し、該反応は、2時間以内に終了する。該反応混合物をジクロロメタン(50+ +/)および065M炭酸水素す1−リウム水溶液(50冨1> +こ分配する 。水性層を、さらにジクロロメタン(2x5c)++gで抽出し、6機抽出物を 無水硫酸すトリウムで乾燥し、次いで、濃縮する。溶離剤としてジクロロメタン /メタノールを用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィー精製に付した後 、純粋な5°−0−ジメトキシトリチル−,4−N−p−i・ルエンスルホニル ー2゛−デオキシノチジンを得る。該生成物をベンゼン(20a/)に溶解し、 冷凍し、オイルポンプ式真空中で凍結乾燥する。純粋な生成物を白色固体物質と して単離する。2.5209、収率73.7%。
ab)5°−〇−ジメトキントリチルー4−N−p−トルエンスルホニル−2゛ 無水ジクロロメタン中トリエチルアミン(0,14sl、1mmol)と−緒に 、5′−〇−ジメトキントリチルー4−N−p−1−ルエンスルホニルー2゛− デオキシノチジン(128mw、0.187m5ol)、無水コハク酸(50m g、0.5mmol)および4−N、N−ジメチルアミノピリジ:/(DMA) ’、319.0.02m−ol) ’fi:、水分を除去しつつ撹拌する。薄層 クロマドグフィーによる分析は、反応が2時間以内で終了することを示す。該反 応混合物を炭酸水素すl・リウム水溶液(10,1)およびジクロロメタン(L owl)に分配する。水性層をジクロロメタン(2X10m1)で再抽出し、合 わせた抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで、濃縮する。残存する粗製 生成物を1.4−ジオキサン(3sl)に溶解し、冷凍し、次いで、オイルポン プ式真空下で凍結乾燥する。所望の生成物は、白色固体物質として形成する:1 65my、収率99%。
ジイソプロピルエチルアミン(2sl、 11.5■■ol)の存在下、無水ジ クロロメタン(10@l)中で5’−0−ジメトキシトリチル−4−N−p−ト ルエンスルホニル−2°−デオキ/ンチジン(1,368g、2m5ol)を電 磁撹拌器で撹拌し、次いで、水分を除去しつつ、前記混合物にN、N−ジイソプ ロピルアミノ−(2−ノアノエトキノ)−クロロホスフィン(0゜535m1. 2.40閣順l)を添加する。該反応は、TLC分析によって示すことができる ように、約15分以内に定量的になる1、メタノール(0,1m1)の添加によ って該反応を停止し、次いで、該反応混合物にジクロロメタン(30肩l)を添 加し、炭酸水素ナトリウム水溶液(20s+/)と−緒に振盪することによって 抽出する。該水性相をジクロロメタン(2X10■l)で再抽出し、合わせた抽 出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥する。
粗製生成物を、溶離剤として最終組成10:85:5(体積)を有するn−ヘキ サン−アセトン−トリエチルアミンの混合物を使用して、ノリ力ゲル力うム上で クロマトグラフィーに付して精製する。ベンゼン(20諺/)からの凍結乾燥に よって、所望の純粋な生成物を白色粉末として単離する。
5′−0−)メトキノトリチル−4−N−p−トルエンスルホニル−2゛−デオ キシノチジン(205厘9.03■−ol)のピリジン75m/中溶液に無水2 .2’ −(エチレンジオキシ)−ジエチルアミノ(1,21/、12+nol )を添加する。反応容器をしっかりと密封し、50℃のオーブン中に一装置く。
室温に冷却した後、反応混合物を水15*lおよびジクロロメタン7.5slで 抽出する。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発によって濃縮する。ジク ロロメタン/メタノールの勾配嫂を使用してシリカゲルクロマトグラフィーによ ってさらなる精製を行う。
燦色泡秋物17019(理論収量の85%)を得る。
5°−0−ジメトキシトリチル−4−N−(2,2(−エチレンジオキジ)−ジ エチルアミノ)−2′−デオキシノチジン(6619,0,01mwol)をD MF 1yaiに溶解する。これにホウ酸ナトリウムS衝岐(IM、、pH9, 2)0.1slおよびフルオレセインイソチオシアネート(38冨す、0 、0 1. ssu>1)を添加する。暗所中、室温で一晩、該調製物を放置する。該 反応混合物をホウ駿ナトリウム緩衝液(IQml)およびジクロロメタン(10 @l)で抽出する。乳濁液を遠心によって解乳化し、有機相を分離する。抽出を 再度2回繰り返す。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾液を蒸発によ って濃縮し、該生成物を、アセトンおよび炭酸水素ナトリウム飽和水溶液の混合 物を使用して、リバースカラムクロマトグラフィー(メルク(Merk)、RP −2シリカゲル)によって精製する。生成物11.9−9を橙色の油状物として 得る。
b)デオキシアデノシン担体(第2図)ba)6−N−1)−トルエンスルホニ ル−2′−デオキシアデノシンの合成デオキシアデノシン(1,15g、40冒 園of)を、毎回無水ピリジンlQ*/と一緒に3回共蒸留に付し、次いで、ピ リジン(120寓l)中、塩化トリメチルシリル(4sl、32+mol)と− 緒に室温で1時間攪拌する。次いで、該混合物を、水分を除去しつつ、蒸発によ って約1001/の体積に濃縮する。p−トルエンスルホニルクロリド 0g、9 3關o1)を添加し、水分を除去しつつ、還流させながら60℃で5 0時間撹拌する。反応をモニターするために試料を採取し、濃アンモニアで脱シ リル化しく約2時間)、回転蒸発機に付し、ジクロロメタン中に取る。薄層クロ マドグフィー(移動溶媒塩化メチレン/メタノール−9・1)による試験は、完 全な変換が得られないことを示す,したがって、分解生成物が増加するとすぐに 該反応を停止する。ジクロロメタン(100./)の添加によって反応体積が増 加し、次いで、該混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(250,tりと一緒 に振盪することによって抽出し、水性相をジクロロメタン(2X50■l)で再 抽出する。
有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、次いで、水ジエツト式真空中で蒸発して 、体積を約100+7!に濃縮する。濃アンモニア水溶液(100m/)を添加 し、脱シリル化の経過を、薄層クロマドグフィーによってモニターする;該反応 は、4時間後に終了する。多くの分解生成物を形成するので、粗製生成物を、シ リカゲル(Merck 7734 )および溶離剤として塩化メチレン/メタノ ール(10: 1)を用いて重力力ラム上で精製する。
6−N−p−トルエンスルホニル−2゛−デオキシアデノシン(4,0g、98 ■1IlO1)を無水ピリジン(3X15++/)と−緒に共蒸留に付し、次い で、ピリジン(50,/)中に取り、アルゴン下、4,4゛−ジメトキシトリチ ルクロリド(3゜75g、l1m+aol)を添加する。薄層クロマドグフィー によるモニターリングは、該反応が2時間後に終了することを示す。ジクロロメ タン(5(b/)を添加し、該混合物を、0.5M炭酸水素ナトリウム溶液と一 緒に振盪することによって抽出する。水性相をジクロロメタン(2X50ml) で再抽出し、合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、回転蒸発機に付す 。この方法で得られた粗製生成物を、溶離剤として塩化メチレン/メタノールを 使用してシリカゲルカラム(Merck H60)上でクロマトグラフィーに付 して精製する。
bc)5’−0−DMTr−6−N−p−トルエンスルホニル−2°−デオキシ 1fノシンー3’ O−モノコハク酸のトリエチルアンモニウム塩の合成5’  −0−I)MTr−6−N−1’) −トルエンスルホニル=−2゛−デオキシ アデノシン(200叩、0.28mmo1)、無水コハク酸(70鳳9、Q、7 mmol)、4−N。
N−ジメチルアミノピリジン(I)MAP、4.5++9.0.03ms+ol )および無水トリエチルアミン(0,2冒/S1.4關01)を無水塩化メチレ ンに溶解し、室温で2時間撹拌する。次いで、反応混合物を炭酸水素ナトリウム 水溶液(1,01/)およびジクロロメタン(10@/)に分配し、水性相をジ クロロメタン(2X101/)で再抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで 乾燥し、回転蒸発機に付す。この方法で得られた生成物を精製せずにさらに処理 する。
5′−〇−ジメトキシトリチルー8−ブロモ−2′−デオキシアデノシン(10 0冒9.0.151+mol)のピリジンQ、5諺1’中溶液に無水2.2−( エチレンジオキシ)−ジエチルアミン(0,5m1)を添加する。反応容器をし っかりと密封し、70℃のオーブンに一晩貯蔵する。実施例ad)における5’ −0−ジメトキシトリチル−4−N−2,2°−(エチレンジオキシ)−ジエチ ルアミノ)−2゛−デオキシンチジンについての方法と同様に、さらに処理し、 精製する。
be)5’−0−ジメトキシトリチル−8−8−(フルオロ上イン−4−イル) チオウレイド−2,2’−(エチレンジオキシ)−ジエチルアミノ)−2°−デ オキシ1fノシンの合成 5°−0−′)メトキシトリチル−8−N−(2,2°−(エチレンジオキシ) −ジエチルアミノ)−2゛−デオキシアデノシン(82叩、0.12■■ol) をDMF 1麿lに溶解する。これにホウ酸ナトリウム緩衝液(IM、pH9, 2)0.1mlおよびフルオレセインイソチオノアネート(47吋、0.12+ +mol)を添加する。暗所中、室温で一晩、該調製物を放置する。反応混合物 をホウ酸ナトリウム緩衝液(1,0++1)およびジクロロメタン(10■l) で抽出する。該乳濁液を遠心によって解乳化し、有機相を分離する。抽出をさら に2回繰り返す。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾液を蒸発によっ て濃縮し、次いで、該生成物をアセトンと炭酸水素ナトリウム飽和水溶液の混合 物を使用してリバースカラムクロマトグラフィー(メルク(Merck)、RP −2シリカゲル)に付して精製する。橙色油状物として生成物97w9を得る。
C)デオキシグアノシン担体 bb)と同様に5’ −0−DMTr−2−N−p −トルエンスルホニル−2 ′−デオキシグアノシンの合成を行う(第2図)。
d)デオキシウリジン担体(第3図) da)5′−0−ジフトキントリチル−5−ブロモ−2゛−デオキシウリジンの 5−ブロモ−2°−デオキシウリジン(4,09,13mmol)を無水ピリジ ン(:3X15肩l)と−緒に共蒸発に[1し、次いで、ピリジン(50,1) 中に取り、アルボンド、4,4゛−ジメトキシトリチルクロリド(4,889、 ■4,3龍o1)を添加する。W4層クロマ]・グツイーによるモニターリング は、2時間後に該反応が終了することを示す。ジクロロメタン(50@/)を添 加し、該混合物を、05M炭酸水素ナトリウム溶液と一緒に振盪することによっ て抽出する。水性相を7゛クロl]メタン(2X50+w/)で再抽出し、合わ せた有機抽出物を硫酸ナトリウノ、で乾燥し、回転蒸発機に1」す3、この方法 で得られた粗製生成物を、溶離剤として塩化Iブート2パ2.・′メタノールを 使用してシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーに付して精製する。
水分を除去しつつ、無水エタノール(10瀝l)に5°−0−ジメトキシトリチ ル−=5−プロ七−2゛−デオキシウリシン(07g、12mmol)を溶解す る。乾燥2.2’−(エチl/ン、′1キン)−ジエチルアミノ(0,7露11 48囃■01)を添加し、!tI混合物を還流させながら24時間加勢する。次 いで、真空蒸発によって乾固するまで該溶液を濃縮する。ジクロロメタン(30 ,/)に油状残留物を取り、IIJ?1のジアミンのほとんどを除去するために 、塩化カリウム飽和溶液(2X30m/)で抽出する。有機相を硫酸すl・リウ ムで乾燥し、回転蒸発機に付す。さらに〕ンアミ〉を除去するために、残留物を 少量の水(2〜3 ml)に温浸する。水を除去して庚棄する。該生成物を、粉 末状コンンステンノーを示すまで、デシケータ−中、オイルポンプ式真空下で五 酸化リンにより乾燥する。
空気のノ1荏在下、無水ジクロロメタン(3冒l)中、室温で一晩、好適な方法 で保護したコハク酸ヌクレオシドのトリエチルアンモニウム塩(0,185−m ol。
例えば、実施例1bc)、担体(1,09)、N、N−ジシクロへキンルカルボ ジミン(200重り、1鷲曽01)、4−N、N−ジメチルアミノピリジン(D MAP、61g、0 、05 mmol)、トリエチルアミン(0,07@/、 0.5閣−ol)を振盪する。次いで、担体を濾去し、ジクロロメタン(50d )で洗浄し、マスキング反応のために、ジクロロメタン(2++1)中、無水酢 酸(0,35@tり、トリエチルアミン(]麿ml、DMPA (12mq)と −緒にフラスコ中に移し、2時間反応させる。担体を濾去し、ジクロロメタン、 メタノール、ジクロロメタンおよびジエチルエーテル(各々25m1)で連続し て洗浄し、重量が一定に維持されるまで、デシケータ−中、オイルポンプ式真空 下で乾燥する。
18μl1ol/g(またはアデノシン誘導体の場合、26μ■ol/g)の充 填量で、前記指示に従って、5゛−0−ジメトキシトリチル−4−N−p−トル エンスルホニル−2゛−デオキシンチジン(または−アデノシン)を有するLC AA−CPG 500A担体を生成する。
5′−〇−ジメトキシトリチルーp−トルエンスルホニル−2゛−デオキシヌク レオシド−3°−0−モノコハク酸のトリエチルアンモニウム塩(0,186醜 ■ol)、LCAA−CPG 500A (ピアース・カラム= −(Pier ce Company)、10009)、N、N“−ジシクロへキンルカルポジ イミド(200吋、1lmol)、4−N、N−ジメチルアミノピリジン(DM AP、6諺9.0.05m■ol)およびトリエチルアミン(0,07m1.0 .5l−ol)を、水分を除去しつつ、室温で一晩、注意して機械的に撹拌する 。担体を濾去し、ジクロロメタン(50@/)で洗浄し、未反応ヒドロキシル基 をマスキングするために、反応フラスコ中に移し、乾燥ジクロロメタン(2ml )中の無水酢酸(0,35麿l)、トリエチルアミン(1冒り、DMA P ( 12++v)と−緒に2時間振盪する。担体を濾去し、ジクロロメタン、メタノ ール、ジクロロメタンおよびジエチルエーテル(各々25@l)で連続して洗浄 し、重量が一定に維持されるまで、デシケータ−中、オイルポンプ式真空下で乾 燥する。文献に開示された方法に従って、酸による処理の後、少量の担体試料を 使用して行うジメトキシトリチルカチオンの分光光度測定によって担体の充填量 を決定し、アゾシン誘導体については、18μ■ol/lであり、アデノシン誘 導体については、26μmol/gである。
アミノ基を有する別の担体(例えばCPG 1400)について、該反応を同様 に行う。
5゛−〇−ジメトキシトリチルー8−(8−フルオレセイン−4−イル)チオウ レイド−2,2−(エチレンジオキシ)−ジエチルアミノ)−2′−デオキシア デノンン(55−9,0,Q 5m5ol)をジクロロメタン/ピリジン(1: 1.3.5m/)に溶解し、次いで、トリエチルアミン(0,3厘l)、4−N 、N−ジメチルアミノピリジン(DMAP、1.219)および無水コハク酸( 20019)を添加する。暗所中、室温で一晩、反応させる。次いで、該反応混 合物を蒸発によって濃縮し、ジクロロメタン/炭酸水素子トウリム水溶液で抽出 する。硫酸ナトリウムで乾燥した後、有機相を蒸発によって濃縮し、ピリジンと 一緒に共蒸発に付す。この方法で得た粗製生成物にLCAA−CPG 500° A(30019、ピアース・カンパニー (Pierce Company)  )、DMAP (619)、トリエチルアミ:/(0,0711)、ジシクロヘ キシルカルボジイミド(DCCI、200■g)およびジクロロメタン(1,5 ,/)を添加する。該反応混合物を室温で一晩振盪し、担体を濾去し、ジクロロ メタン、メタノールおよびジエチルエーテルで洗浄する。その後、誘導体形成し た担体を丸底フラスコ中に移し、無水酢酸(0,5/)、ピリジン(1m/)、 DMA P (1211g)およびジクロロメタン(5ml)を添加する。3時 間後、担体を濾去し、洗浄し、デシケータ−中、オイルポンプ式真空下で乾燥す る。担体の充填量は、アゾシン誘導体については、19.6μmaL/gであり 、シチジン誘導体については、19.5μsol/gである。
これらの担体を用いて、実施例5に記載のプライマー〇およびプライマーEを合 成した。
好適な担体(0,2μ■ol)およびホスホロアミダイトを使用する製造者のプ ロトコールに従って、ファルマシア・エルケイビー・カンパニー(Pharma cia LKB Company) (スウェーデン)がらのGene Ass embler Plusを使用して、オリゴヌクレオチドを合成する。エッペン ドルフ反応容器中、室温で濃アンモニア水溶液による処理によって、1時間以内 に担体がらオリゴヌクレオチドを切断する。S peed −vacエバポレー ター中で、プールした溶液を濃縮乾固する。部分的に脱保護したオリゴヌクレオ チドに無水2.2−(エチレンジオキシ)−ジエチルアミン(100μl)を添 加し、該反応容器を閉じ、超音波洛中、室温でオリゴヌクレオチドを溶解する( 5〜10分)。80℃のインキュベーター中に反応溶液を一装置く。p−トルエ ンスルホニル基を除いて完全に脱保護された生成物をアミン溶液から沈殿させる 。反応容器を遠心し、該溶液を注意して除去する。
無水エタノール(100μl)を添加し、超音波浴によって沈殿物を洗浄しく5 〜10分)、次いで遠心する。上清を廃棄し、洗浄工程を1回繰り返す。5pe edvacエバポレーター中で粗製生成物の沈殿物を乾燥し、次いで、さらなる 実験に使用する。
フルオレセイン残基のオリゴヌクレオチドへの導入方法は、ファルマシア・エル ケイビー・カンバー−−(Pharmacia LKB Company) ( Pharsacia−LKBAutoprimer” 5ynthesis K it (27−9290−01))のプロトコールと実質的に同じである。精製 していないオリゴヌクレオチドの沈殿物を0.15Mホウ酸ナナトリウム緩衝液 pH9,2)(100μl)に溶解し、新しく調製したフルオレセインイソチオ ノアネート異性体1(1mg)の無水ジメチルスルホキシド(30Ill)中溶 液を添加する。暗所中、室温で4〜20時間、該反応を行い、実質的に同一の結 果を有する。該反応混合物をNAP−10カラム(ファルマシアーエルケイビー (Pha+vacia−LKB))に適用し、再蒸留水(pH8〜9.5、アン モニアで調節)で洗浄する。オリゴヌクレオチドを含有するフラクション(1, 3mlりをプールし、所望の標識オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル 電気泳動(20%、7M尿素)またはHP L Cによって単離し、UV−Vi s分光計によって特徴付けする。アナリティカル・バイオケミストリー(Ana l。
B 1ochet )、165.442−441 (1987)に従って、ヘビ 毒ホスホジェステラーゼ/アルカリ性つ/ホスファターゼによる切断を行う。
製造者のプロトコールに従って、ファルマシア・エルケイビー・カンパニー(P harwacja−LKB Cos+pany) (スウェーデン)からのGe ne AssemblerPlusを使用する好適なホスホロアミダイトにより 、オリゴヌクレオチドを合成する。担体としてフルオレセイン−デオキシヌクレ オチドにより誘導体形成したLCAA−CPG 500 A担体(10−9,0 ,2μl1ol)を使用する。ファルマノア(P harIIacia)の標準 的なプロトコールと同様に、合成したオリゴヌクレオチドの切断およびさらなる プロセッシングを行う。ポリアクリルアミドゲル電気泳動(20%、7M尿素) または逆相HP L Cによって、さらなる精製を行う。
実施例4 DNAポリメラーゼによって触媒化された鋳型依存性鎖伸長における3゛−末端 標識オリゴヌクレオチドの使用 一例として、以下の修飾オリゴヌクレオチドを使用して配列決定の研究を行った プライマーA・5’−CAGGAAACAGCTATAGX 配列番号1ブライ v−B : 3−XAGGAAACAGCTATGAC配列番号2(3a、bに 従って、両方のプライマーを調製した。)X=フルオレセインで標識したシチジ ン。
参照物質として、通常の方法で5゛−位でアミノリンカ−と反応さ也力り、フル オレセインで標識した同様のプライマーを使用した(プライマーRP)(ファル マンア°カンパニー(Pharmacia Company)の指示)。研究さ れるべきDNAとして、pUc19およびタコDNA (D3)を使用した。
ファルマノア・カンパニー(Pharwacia Company)の作業指示 に従って、サンガージデオキシ法によって全てのプライマーについて配列決定を 行う。pUC19DNAに対する配列決定の結果を第4図a、bおよびCに示す 。
以下のプライマーを使用して、同様に配列決定した。
プライ7− C: 5−TTTCACACAGGAAACAGCTATGY 配 列i1号3Y=フルオレセインで標識したアデノシン。
配列決定研究のために2種類の万能M13配列決定プライマーを使用したニプラ イマーD:5’−TTGTAAAACGACGGCCY 配列番号4(3cに従 って調製した) ブライv−E:5′−AAAACGACGGCCAGTGX 配列11号5(3 cに従って両方のプライマーを調製した)Y=フルオレセインで標識化したアデ ノシン。
X=フルオレセインで標識化したシチジン。
研究されるべきDNAとしてM13■p18(ファルマシア・カンパニー(Ph armacia Co、))を使用した。
ファルマシア・カンパニーの作業指示(T7配列決定キット)に従って、サンガ ージデオキシ法によって両方のプライマーについての配列決定を行った。配列決 定の結果を第5図aおよびbに示す。
配列表 配列番号、1 配列の長さ 】7塩基 配列の型 ヌクレオチド 鏑の数ニー末鎖 トポロジー 直鎖状 配列の特徴 3゛末端でフルオレセイン標識化したC配列 CAGGAAΔCAG CTATAGC17配列番号 2 配列の長さ 】7塩基 配列の〒 ヌクレオチド 鏑の数 −末鎖 トポロジー 直鎖状 配列の特徴・3°末端でフルオレセイン標識化したC配りす CAGTATCGΔCAAAGGAC17配列番号 3 配列の長さ 23塩基 配列の型 ヌクレオチド 鎖の数・−末鎖 トポロジー l]!鎖状 配列の特徴−5゛末端でフルオレセイン標識化したA配列 AGTATCGACA AA(1;GACACACTTT 23配列番号・4 配列の長さ=17塩基 配列の型・ヌクレオチド 鎖の数ニー末鎖 トポロジー・直鎖状 配列の特徴・3′末端でフルオレセイン標識化したA配列 TTGTAAAACG ACGGCCΔ 17配列番号・5 配列の長さ=17塩基 配列の型・ヌクレオチド 鎖の数ニー末鎖 トポロジー・直鎖状 配列の特徴=3′末端でフルオレセイン標識化したC配列 AAAACGACGG CCAGTGC17F’IG (” r工G2 F工G3 Fjg、4a (′<−L II) 参照ブライ7−RPI:よるpuc DN A(7)配列決定Fig、4a (パートI)°参照プライ7−RPによるpu c DNAの配列決定Fiq、4ヒ(パート■)、プライマー八によるpuc  DNAの配列決定Fig、4b(パート■) プライマーAによるpuc DN Aの配列決定Fig、4c(パートl)ニプライマーBによるpUCDNAの配 列決定Fig、4c (パート■) ブライv−BによるplJc DNAの配 列決定Fig、5a(′<−ト■) プ5イマーD1.−ヨルM13s+p1. 8ノ配列S定(実1ifN5)rig、5a(パート■)・ブライ7−Dによる M13mp18の配列決定(実施例5)Fig、5b(パートl)・プライマー EによるM13諧plBの配列決定(実施例5)Fig、5b(パート■) プ ライマーEによるM13++p18の配列決定(実施例5)手続補正書

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.標識化基を与えられたヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその誘導体も しくは前駆体がアンカー基を介して共有結合されることを特徴とする高分子担体 。
  2. 2.ヌクレオシド、ヌクレオシドまたはその誘導体もしくは前駆体がその3′− ヒドロキシル基を介して相のアンカー基に結合される請求項1記載の担体。
  3. 3.標識化基が核塩基に結合される請求項1記載の担体。
  4. 4.3′末端ヌクレオチド標識オリゴヌクレオチドの合成のための請求項1記載 の高分子担体の使用。
  5. 5.3′末端に所定の数および型のデオキシヌクレオシドまたはりボヌクレオシ ド、デオキシ−またはリボヌクレオチドまたはその誘導体もしくは前駆体を有す ることを特徴とする、少なくとも1つの標識化基を含有するオリゴヌクレオチド 。
  6. 6.DNAまたはRNAポリメラーゼによって触媒される鋳型依存性反応におけ るプライマーとしての請求項5記載のオリゴヌクレオチドの使用。
  7. 7.反応が酵素的核酸配列決定法の一部である請求項6記載の使用。
  8. 8.反応がポリメラーゼ連鎖反応の一部である請求項6記載の使用。
  9. 9.プライマーがその3′末端に標識化基を与えるヌクレオシドを含有すること を特徴とする、プライマーの鋳型核酸ヘのハイブリダイゼーシヨン、次いで、そ の3′末端で開始されるプライマーの酵素的伸長による標識核酸の製造方法。
  10. 10.請求項1記載の担体がさらなるモノヌクレオシド単位との結合によって延 長されることを特徴とする、高分子担体上での化学的合成による末端ヌクレオチ ド標識オリゴヌクレオチドの製造方法。
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