JPS6028985A - オリゴヌクレオチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は５′末端炭素原子にリン酸基を有するオリゴヌ
クレオチドの製造法に係り、さらに詳しくは、酸で選択
的に脱離しうる保護基を有するリン酸基を５′末端炭素
原子に導入した保護ヌクレオチドと、予め固相法で連結
したヌクレオシド−ポリマー複合体またはヌクレオチド
−ポリマー複合体とを縮合剤の存在下に縮合して５′末
端炭素原子がリン酸化されたオリゴヌクレオチドを製造
する方法に関する。

近年ＤＮＡの化学合成技術の進歩にはめざましいものが
あり、特に固相合成技術の進歩により合成に要する時間
は大幅に短楠され、リンカ−アダプター、ミックスプロ
ーブ、プライマーあるいは遺伝子ＤＮＡフラグメント等
の合成が容易に行なわれるようになり、　ＤＨｋの化学
合成は遺伝子組換え技術の中で重要な役割を果している
。

このようにして化学合成されたヌクレオチドオリゴマー
は通常その５１末端炭素原子はリン酸化されていないの
で、これらのヌクレオチドオリゴマーをＤＮＡ　リガー
ゼを用いて他のＤＮＡの３１側に連結する場合は、予め
５′末端炭素原子をリン酸化しておく必要がある。５１
末端炭素原子をリン酸化する方法としてはポリヌクレオ
チドキナーゼとアデノシン−５′−三リン酸（ＡＴｐ　
）により酵素的にリン酸化する方法が一般的に用いられ
ている。しかし、この方法では５′末端炭素原子を完全
にリン酸化することは困難であり、一般的には、リン酸
化率は７０〜８０％位と考えられている。かかる反応液
からリン酸化されていないヌクレオチドオリゴマーを除
くのは容易ではないので、通常はリン酸化されていない
ヌクレオチドオリゴマーを含んだまま連結反応に使用し
ているため、これが連結反応を生ぜず、このため収率が
悪（なり必ずしも効率的な方法とはいえない。従って５
末端炭素原子が完全にリン酸化−されたヌクレオチドオ
リゴマーを容易に化学合成できればリガーゼによる連結
の際酵素によるリン酸化を省略できるばかりでなく、反
応収率も向上することが期待できる。５′末端炭素原子
にリン酸基を有するヌクレオチドオリゴマーの効率的合
成法の確立が望まれる理由がここにある。

一方５′末端炭素原子にリン酸基を有するヌクレオチド
オリゴマーを化学的に合成する方法としては、液相法に
よる方法が知られており、例えばテトラヘドロンｅレタ
ーズ２２．１４６３（１９８１）、ヌクレイツク・アシ
ツズ・リサーチ１０．２３３７（１９８２）等に記載さ
れている。

これらの方法は、予め全ての官能基を保護したヌクレオ
チドオリゴマーを液相法で合成した後、５１末端炭素原
子の水酸基の保護基を選択的に脱離し、これにヒドロキ
シベンゾトリアゾール等で活性化したリン酸化剤を作用
させて５１末端炭素原子をリン酸化する方法である。こ
の方法は大駄合成には適しているが必ずしも一般的な方
法とはいい難い。なぜならば通常は少量のヌクレオチド
オリゴマーを短時間に効率良く合成することが必要とさ
れるからである。

このような状況に鑑み、本発明者らは５′末端炭素原子
が完全にリン酸化されたオリゴヌクレオチドを同相法を
用いて効率良く合成する方法について検討を重ねた結果
本発明を完成した。

即ち本発明は一般式 〔式中Ｘは酸で選択的に脱離しうる保護基を表を表わし
、ｍは０または１以上の重合度を表わす整数を表わし、
Ｂは少なくともアミノ基が保護されたアデニン、グアニ
ンもしくはシトシンの残プルまたはチミン残基を表わし
、Ｒ１は水酸基の保護基を表わす〕で表わされる５′炭
素原子がリン酢化された保護ヌクレオチドと、一般式〔
式中Ｒ８は式 を表わし、ｎは０または１以上の重合度を表わす整数を
表わし、ＹはＯＯに結合したアミノ基またはイミ７基含
有ポリマー残基を表わし、ＢおよびＲｚは前述したとお
りである〕で表わされるヌクレオシド−ポリマー複合体
またはヌクレオチド−ポリマー複合体とを、縮合剤の存
在下で縮合させることにより一般式 〔式中Ｘ　＊　Ｒｚ　、　Ｂ　、　ｍ　、　ｎおよびＹ
は前述したとおりである〕で表わされるオリゴヌクレオ
チドを製造する方法にある。

本発明において使用する上記一般式（ｉ）で表ヌクレオ
チドは、予め５１炭素原子に結合した水酸基を保護し、
３１炭素原子にリン酸基を導入し、そのリン酸基のＯＨ
を保勲したヌクレオチドを原料として用い例えば下記反
応式によって合成することができ４ ０ＯＮＯ！Ｈ８ （５） 上記式中ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を表わす。

上記式（７）の化合物は一般式（Ｉ）ｊｊおいてＲ１を
表わす式（ＩＩ）の基においてｍが０の場合即ちヌクレ
オチドモノマーを表わす。なお上記ｍが１以上を表わす
式（ＩＩ）の基が結合した一般式（Ｉ）のヌクレオチド
例えばダイマーは上記式（７）の化合物に上記式（２）
の化合物をトリメチルベンゼンスルホニルニトロトリア
ゾリド（ＭＳＮＴ）の存在下縮合させることにより下記
反応式によって合成することができる。

０ＯＮＯｘｌｋ ＯＨ 上記式（９）の化合物がｍが１である一般式（Ｉ）で表
わされるダイマーヌクレオチドである。上記反応を繰返
すことにより所望重合度即ち式（ｌｌ〕の基においてｍ
が更に２，３．−−−−−を表わす一般式（１）の５１
末端炭素原子がリン酸化された保禮ヌクレオチドを得る
ことかできる。

本発明−により固相合成において使用する一般式〔川〕
で表わされるヌクレオシド−ポリマー複合体マタはヌク
レオチド−ポリマー複合体は、不溶性担体として公知の
材料、例えばシリカゲル、ポリスチレン、アクリルアミ
ド等を用い、これらの担体に予め公知の方法でアミノ基
を導入した後、ヌクレオチドの３’　−ＯＨをサクシニ
ル化等で保護した保護ヌクレオシドと公知の方法でアミ
ド結合またはイミド結合させて例えば下記反応式に従っ
て合成することができる。

ＩＩ （１０）　（１１） ジ＝ （１２） ０ （１６） ここで化合物（１６）が一般式（Ｉｌｌ）においてＲｓ
を表わす式（ＩＶ）中のｎが１である場合のヌクレオチ
ド−ポリマー複合体を表わす。上記反応を組合せること
により所望の重合度即ち、ｎ＝２．３．−−−−一のヌ
クレオチド−ポリマー複合体を得ることができる。

本発明は前述した一般式（１）の保護ヌクレオチドと、
一般式（ＩＩｌ）のヌクレオシド−ポリマー複合体また
はヌクレオチド−ポリマー複合体を同相法で縮合剤の存
在下で結合させるのであるが、このとき使用しうる縮合
剤としては公知の縮合剤を使用でき、例えばメシチレン
スルホニルニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ）、）リイソ
プロピルベンゼンスルホニルテトラゾリド（Ｔｐｓｒｅ
）、トリイソプ゛ロピルベンゼンスルホニルイミダゾリ
ド（ＴＰＳＮ工）等があり、これらは単独でも二種以上
の混合物の形でも使用できる。

本発明による方法を実施するに当っては上記縮合剤の存
在下一般式（Ｉ）の保護ヌクレオチドを、一般式（Ｉｎ
）の同相であるヌクレオシド−ポリマー複合体またはヌ
クレオチド−ポリマー複合体に対して過剰になるようζ
こ使用するとよい。

例えば一般式（ｌｉｔ）のスクレオシドーポリマー複合
体またはヌクレオチド−ポリマー複合体１モルに対して
、一般式（１）の保護ヌクレオチドを２〜１０モル過剰
使用するのかよい。反応は一般に２０℃〜６０℃の温度
、好ましくは４０℃〜５０℃の温度で、１０〜６０分、
好ましくは２０〜３０分反応させる。

反応は一般に溶媒中に一般式（１）の保護ヌクレオチド
を溶かした液に、一般式（ＩＩＩ）のヌクレオシド−ま
たはヌクレオチド−ポリマー複合体を分散させて行なう
。使用しうる溶媒としては例えばピリジンが用いられる
。用いる量は、可能な限り少量を用いるが一般には（Ｉ
）の濃度が０．１〜０．２　Ｍ　濃度になるように使用
する。なお当然のことながらこの反応は無水反応である
から使用する溶媒はもちろん綜合に供する化合物等は脱
水したものを用いる必要がある。縮合剤の使用量は、〔
１〕に対してモル比で３〜５倍后を用いるのが好ましい
。

かくすることＩこよって一般式（Ｖ）で表わされる本発
明の目的とするオリゴヌクレオチドを合成できる。

本発明方法を実施するに当って、一般式〔１〕の保護ヌ
クレオチド詔よび一般式（ＩＩＩ）のヌクレオシド−ま
たはヌクレオチド−ポリマー複合体中に存在する官能性
基、例えばアミノ基、カルボニル基、リン酸基等は適当
に反応に介入しないよう保循しておく必要がある。例え
は前記Ｂで表わされるアデニン、グアニン、シトシン、
その他の中のアミン基の保護基としてはアシル基カ好ま
しく、カルボニル基の保護基としてはジフェニルカルバ
モイル基が好ましく、ヌクレオチド結合を形成する分子
内ヌクレオチドリン酸基の保護基および５′炭素原子に
結合したリン酸基中のｏｕｉとしては例えばＯ−クロロ
フェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−ニトロフェニ
ル基等が好ましく、３′末端炭素原子に結合したリン酸
基中のＯＨ保護基（Ｒ１）としては、選択的脱離し易い
保護基が好ましく、例えばシアノエチル基、アニリド基
、アニシデート基が好ましい。

一方本発明の一般式（Ｉ）の保護ヌクレオチドの５′炭
素原子に結合したリン酸基の酸で選択的に脱離しつる保
護基（Ｘ）としては、例えはモルホリノ基が好ましい。

このモルホリフ基の導入には、一般式（１）のヌクレオ
チドを形成するに当り、その原料ヌクレオシドまたはヌ
クレオチドの５′炭素原子に結合したＯＨ基を、例えば
リン酸化剤として０−クロロフェニルホスホロジクロリ
デート、ｐ−クロロフェニルホスホロジクロリデートま
たはｐ−ニトロフェニルホスホロジクロリデート等を用
い、これらを予め１−ヒドロキシベンゾトリアゾールま
たはＩＨ−１１２゜４−トリアゾールで活性化した後、
ヌクレオシドまたはヌクレオチドの５′−水酸基にリン
酸を結合させ、次に無水モルホリンを反応させることに
より５′位置番ζモルホリノ基で保護されたリン酸基を
導入することができる。

本発明方法によって製造される一般式（Ｖ）のオリゴヌ
クレオチドは、次の如く処理することによって、リン酸
付加リンカ−、アダプターあるいは遺伝子ＤＮＡのフラ
グメントとして使用できる。

即ち一般式（Ｖ）で示されるオリゴヌクレオチドから保
護基ＸおよびＹで示されるポリマー残基部分、分子内リ
ン酸基の保護基の脱離を行なう。

例えば始めに０．５Ｍのテトラメチルグアニジン−ピリ
ジンアルドキシム混液中で処理することによってポリマ
ー部分を脱離し、かつ分子内のヌクレオチドリン酸基の
保護基の脱離を行なう。次に水酸化アンモニウム中で処
理することによりアミノ基、カルボニル基等に結合した
アシル基等の保護基を除去する。通常この段階でゲルｆ
過によって本発明の方法の反応中に形成されることのあ
る低分子区分を除去するとよい。

次に得られた生成物を通常ｐＨ２付近の酸で処理するこ
とによって５′−リン酸基の保護基００例えばモルホリ
ノ基を脱離除法することができる。

かくして得られた生成物の精製は例えばイオン交換クロ
マトグラフィまたは逆相クロマトグラフィで処理し、必
要とあればこれを繰返すことによって行なうことかでき
る。

かくして得られた精製物が５′末端炭素原子にリン酸基
が結合した目的生成物であるか否かの検定には、種々の
方法が使用しつるが、一般には酸またはアルカリホスフ
ァターゼで５１−リン酸基の除去を行ない、その前後の
イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＯ）パタ
ーンを比水ピリジン５　ｍ　ｍｏｌの混合液に溶解した
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール５．　Ｏｍ　ｍｏｌ
の溶液を滴下し、その後室温で１．５時間攪拌した。こ
の反応液を、予め１０ゴの無水ＯＨｓ　ＯＮに溶解して
氷冷した上記化合物（２）　０．５　ｍ　ｍｏｌに加え
、室温にて３０分攪拌した。この反応混合物に１．０ｍ
ｍｏｌの無水モルホリンを加え、室温にて１．５時間攪
拌し反応させた。この間反応の進行はシリカゲル薄層ク
ロマトグラフィで追跡した。反応終了後反応混合物を２
５艷の０ＨＯＩｓで稀釈し、等量の０、１　ｍｏｌ　濃
度のトリエチルアンモニウムビカーボネー）（ＴＩＤＡ
Ｂ）緩動液で洗浄後、有機層を分取し、水洗し、脱水後
濃縮してシリカゲルカラムクロマトグラフィに供した。

溶離液としてＯＨ０１゜中のＯＨ，ＯＨ量を順次増加さ
せた混合液を用いて溶出し、目的化合物として上記（６
）の化合物を集め、濃°縮−乾固した。収量は２００〜
で収率５３％であった。構造はＮＭＲおよび工Ｒで確認
した。

参考例　２ 参考例１において使用した化合＠Ａ　（２）の代りに下
記化合物 υ ０　＝　Ｐ−＝　０ＯＮＯ！Ｈ１ ＯＲ’ （ｂｚＯはＮ−ベンゾイルシトシン残基を示）０．５ｍ
ｍｏｌを使用して同様に反応させ処理して下記化合物（
６）を得た。

Ｏ＝　Ｐ　０ＯＮＯ，Ｉ（ｓ ＯＲ’ 収量は２２０　＋＋ｖ、収率は５２％であった。

参考例　３ 参考例１において使用した化合物（２）の代りに下記化
合物 ０ ■ Ｑ　＝＝　Ｐ　−０ＯＮＯ＊Ｈｓ 具１ （ｉｂＧはＮ−インブチリルグアニン残基を示す）０．
５ｍｍｏｌを用いて同様に反応させ、処理して下記化合
物（６）を得た。

Ｏ＝Ｐ−０ＯＮＯｘＨｓ ０Ｒ’ 収量は１５０〜、収率３５％であった。

参考例　４ 参考例ｉにおいて使用した化合物（２）の代りに下記化
合物 ０　＝Ｐ−ｏｏＮａ、Ｈ６ １゜ Ｒ （ｂｚＡはＮ−ベンゾイルアデニン残基を示す）Ｑ、５
ｍｍｏｌを用いて同様に反応させ、処理して下記化合物
（６）を得た。

Ｏ＝＝Ｐ−０ＯＮＯ！Ｈａ ＯＲ’ 収量はＩＢｏｍｙ、収率は４１％であった。

参考例　５ 反応式 ％式％ （１） （１ （５） （６） ＤＭ’［’ｒ　ニジメチルトリチル基 ’ｔｂａ：ｍ−インブチリルグアニル残基ＤＰＯニジフ
ェニルカルバモイルクロリドＤＰ＝ジフェニルカルバモ
イル基 ＢＴ：ベンゾトリアゾール基 上記化合物（１）５００　Ｗ　（０，５７ｍｍｏυを３
−の無水ピリジンに溶解し、氷水中で冷却しつつジフェ
ニルカルバモイルクロリド２６４ｑ（１、１４ｍｍｏｌ
）を加えた後、０℃で攪拌しつつジインプロピルエチル
アミン０．１５＋ｄ（０，８６ｍ　ｍｏｌ）を滴下した
。薄層クロマトグラフィにてインブチリルグアニル残基
のカルボニル基のジフェニルカルバモイル化即ち上記（
１つの化合物の生成を確認し、１時間後に反応を停止し
、クロロホルムで稀釈し、０．１　ｍｏｌ　７４４度の
ＴＥ！ＡＢ緩衝液で洗い、次いで水洗後、有機？３を分
取し、脱水濃縮した。濃縮液をトルエンで共沸させた後
塩化メチレン１０　ｔｈｅに溶解し、３％ベンゼンスル
ホン酸（メタノール溶液）８−を０℃で攪拌下に加え、
ジメトキシトリチル基の脱離を行な−った。薄層クロマ
トグラフィで反応の終了を確認した後、５％重炭酸ナト
リウム水溶液１０ｍｇを加えて一反応を停止させた。

反応混合物から塩化メチレンで２回抽出し、抽出液を０
．１ｍｏ１濃度のＴＲ１ＡＢ緩衝液で洗浄し、次いで水
洗し、有機層を分取後、脱水し、濃縮し、シリカゲルの
カラムに吸着させた。次いでクロロホルム−メタノール
混合溶液を溶離剤として使用して溶出せしめ、上記化合
物（２）を得た。

このものはシラツブであり、収量２５４　ｍｙ　（０、
３５ｍｍｏｌ　）を得た。

上記化合物１００町（０，１４ｍｍｏｌ）を用い参考例
１と同様に処理して、上記化合物（６）７７■（０，Ｏ
Ｉ８ｍｍｏｌ）を得た。このものはシラツブであった。

参考例　６　前記化合物（８）の製造 反１心式 ％式％（２） （８） 参考例３で得られた化合物５００　＝ｖ　（０，５２ｍ
ｍｏｌ）に２−のピリジン−トリエチルアミン−水（３
：１：１）混合液を加え、室温で１０分放置して０ＮＯ
ｊＨｉ基を脱離させて上記（７）の化合物を得た。その
後溶媒を溜去し、ピリジン共沸を２回行な−った後上記
化合物（２）　３８０　ｑ（０，４３ｍｍｏｌ）を加え
てピリジン共沸した後、無水ピリジン７、５　ｔｒｉ％
ＭＳＮＴ２５５　＊　（０，８６ｍｍｏｌ）を加えて室
温で攪拌した。３０分後止記化合物（２）の消失および
化合物（８）の生成を薄層クロマトグラフィで確認した
後、５０％ピリジン水溶液を水冷下に加えて反応を停止
させた。生成物を塩化メチレンで抽出後、有機層をＴＥ
ＡＥ緩衝液で洗浄した後水洗し、脱水し、溶媒を溜去し
た。残渣をシリカゲルカラムで精製して上記目的化合物
（８）　６９１岬（０，３９ｍｍｏ１）を得た。

次にこの生成物の一部を用いて保護基を脱離せしめ、精
製し、その構造を調査した。即ち上記生成物約２０μｍ
ｏｌに０．５ｍｏｌ濃度のテトラメチルグアニジンービ
リジンアルバキシム（ＴＭＧ　−ＰＡＯ）の５０％ジオ
キサン溶液５ｆｆｉ７！を加え、２０℃で２４時間攪拌
して分子内の保護基を除去した。これを逆相シリカゲル
カラムにより、５％から２０％までのアセトニトリルの
４度勾配で溶出し、ｐ−二トロフェノールの後に溶出さ
れる区分を集めて濃縮した。濃縮物に０．５　ｍｌのピ
リジンおよび１０−の濃アンモニア水を加え、密栓して
５０“°Ｃで５時間保持し、アシル基を除去した。これ
を濃縮乾固し、稀塩酸でｐＨ２とし、室温で２時間放置
してモルホリフ基を除去した。

アンモニア水で中和後、ＤＥＡＩ！！セルロースカラム
により、Ｑ、Ｑ５ｍｏｌ濃度からｌ　ｍｏｌ　濃度のＴ
ＫＡＢ緩衝液の濃度勾配で溶出し、目的区分を集めて濃
縮乾固した。

保護基を脱離し、精製した上記ダイマーの−ｍ　ヲ０．
１　ｍｏｌｉｌ１度のアンモニウムアセテートＨ？ｌｊ
液（１）Ｈ５，０）中で３０℃でニュクレアーゼｐ、（
ヤマサ醤油社製）を作用させて完全酵素分解した後、セ
ルロース薄層クローアトグラフィプレートにスポットし
、ブタノール−酢酸−水（５：２：３）で展開した。紫
外線照射で検出したところ生成物は、デオキシグアノシ
ン−５′−リン酸と、デオキシチミジン−５１−リン酸
のみが検出されたことから、合成したダイマーは上記（
８）のとおりの構造を有することが確認された。

以下に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例　１　ｄ（ｐＯＡＡＧＯＴＴＧ）ｐＨ１ｎ４　Ｉ
ｌｌリンカ−の合成公知の手段で合成した下記式 （式［Ｆ］はポリスチレン残基を示す）を有するヌクレ
オシド−ポリスチレン（１００μｍｏｌ／ｊｉｂの比で
結合）５μｍｏ１分、をガラスフィルターを取付けた小
さいカラムに入れ、　ＯＨＩ　ＯＬｌで膨潤させた後、
１　％　ＴＯＡ　（０Ｈ１０１ｓ中）で上記ＤＭＴ　ｒ
基を除去し、ＯＨ，０１，で、次いでピリジンで洗浄後
、これに予め０１０．１（、基を除去した下記ダイマー
０＝Ｐ−ＯＨ ＯＲ’ （以下ＴＴと称する）２５”Ｆを加え、ピリジン共沸し
た後、縮合剤としてＭＳＮＴ２５〜および触媒としてニ
トロトリアゾール（ＮＴ）５Ｍｆを加え、更に無水ピリ
ジン０．３−を加えて冨封後、４５１“Ｃのオープン中
で２５分間保持した。ピリジンで洗浄後、０．２−の無
水＃酸、０．１　ｍｏｌ　ｔａ度のジメチルアミノピリ
ジンのピリジン溶ｉ　１．５　ｄを加え、室温で５分間
反応させ、未反応の水酸基をアセチル化した。ピリジン
で洗浄し、次にＯＨＩ　ｄｌｇで洗浄し、ＴＴの縮合・
２完了させた。

同様の操作を繰返してＧｏ、ＡＡを順次縮合せしめ、最
後に参考例２で得られた生成物を縮合させた。縮合反応
終了後、０．５　ｍｏｌ　ｅ４度のＴＭＧ−ＰＡＯ（５
０％ジオキサン中）ｌｔｎｌを加えて、３０℃で４０時
間攪拌した。担体をＰ別した後、濃縮シ、濃厚アンモニ
ア水１０−、ピリジン０，５−を加えて、５５℃で５時
間保ち、ａ縮後バイオゲルＰ　−６ＤＧで脱塩濃縮した
。残漬を稀塩酸でｐＨ２とし、室温に２時間保持してモ
ルホリノ基を除去した。アンモニア水で中和後ＤＭＡ］
１！ドーヨーパール６５０Ｂ（直径１．　ＯＸ　３０　
ｃｍ　）のカラムにかけ、７ｍｏｌ濃度の尿素を含む０
．０５＋ｎｏｌｉｍ度ノ１−　！Ｊ　Ｘ［酸緩衝液（１
＞Ｈ７，８）中、Ｑ、１ｍｏｌ＋ｉｐ度から０．３　ｍ
ｏｌ　ｆＪ度のＭａｉｌの濃度勾配で溶出し、２６０ｍ
ｍの吸光度を測定して最も高塩濃度で溶出されるピーク
を集めて脱塩濃縮して３９Ａ２６゜ユニットの目的物を
得た。これＧｉ逆相シリカゲルＨ３ＬＯにュクレオシル
５０ｘａ、直径４，６×１５０ｗｎ）およびアニオン交
換ＨＰＬＯ（ＴＳＫ　ｇｅｌＤｘＡｌＤ　−２Ｓｗ、　
４．６Ｘ　２５０＋ｍ）で番よ番よ′単一のピークを示
した。次にＴ　４　ＤＮＡリガー廿とＡＴＰの存在下に
自己結合がおこることおよび結合したリンカ−が制限酵
素Ｐｓｔｌで切断されることをポリアクリルアミドゲル
電気泳動Ｉこより確認した。さらにポリヌクレオチドキ
ナーゼの交換反応を利用し、５１末端リン酸を３２Ｆで
ラベルした後、２次元ホモクロマトグラフィを行な０そ
の塩基配列が正しいことを確認した。

実施例　２　ｃｌ（ｐＧＧＡＡＴＴＯＧ）ｐＦｉａｏＲ
−［リンカ−の合成公知の手段で合成した下記式 ０ （式中［Ｆ］はポリスチレン残基を表わす）で表わされ
るヌクレオシド−ポリスチレン（１００μｍｏ１／　１
１、以下ａ−レジンという）１０．ｃ＋ｍｏ１を担体と
し、実施例１の２倍のスケールでＴｏ　。

ＡＴ　、　ＧＡの順１こ各ダイマーを縮合した。

これを２等分して一方には参考例３で得られた生成物を
、他方には参考例５で得られた生成物をそれぞれ縮合し
た。それぞれを保護基を脱離後精製した結果最後の縮合
に参考例３の生成物を用いた場合２．８Ａ２６ｏユニツ
トの目的物が得られ、参考例５の生成物を用いた場合に
は４６Ａ２６゜ユニットの目的物が得られた。純度およ
び生物活性は実−施例１と同様の方法で確認した。

実施例　３　ｄ（ｐＧＯＴＧＯＡＧｏ）ｐＰｓｔ　ｌリ
ンカ−の合成実施例１と同様の方法で０−レジン（５μ
ｍｏｌ）を担体とし、Ｇ　、　ＯＡ　、　ＴＧの順に各
ヌクレオチドを結合させた。最後に参考例６で得られた
生成物を結合させ、保護基を脱離した後精製して３８Ａ
２６ｏユニツ計の目的物を得た。純度および生物活性は
実施例１と同様の方法で確認した。

その結果を第１図〜第３図に示す。第１図はイオン交換
ＨＰＩ、Ｏで分析したときの溶出パターンを示す。図中
矢印は脱リン酸後の溶出位置を示す。

分析条件は下記のとおりである。

カラム：　ＴＳＫゲル−ＤＩＩＡ］！！　２　ＳＷ　（
４，６Ｘ　２５０閣）Ａ液からＢ液への直線濃度勾配 流速：ｌ−７分 検出：２５４ｍｍの吸光度測定 第２図はｐａｓｔ　ｌ　リンカ−の塩基配列を２次元ホ
モクロマトグラフィにより分析したときのオートラジオ
ダラムを示す。第３図はｐｐｓｔｌリンカ−をＤＮＡリ
ガーゼとＡＴＰでセルフリゲーションを行ない、更にこ
の反応生成物に制限酵素ＰｓｔＩを作用させたときのポ
リアクリルアミドゲル電気泳動のパターンを示す。左側
のレーンはセルフリゲーションのパターンを示し、右側
のレーンはセルフリゲーションした生成物に制限酵素Ｐ
ｓｔ　ｌを作用させたときのパターンを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３のｐＰ＋＋ｔ　（リンカ−のイオン交
換ＨＰＬＯのパターンを示し、第２図はその２次元ホモ
クロマトグラフィによるオートラジオダラムを示し、第
３図はそのセルフリゲーションお−よび制限酵素による
切断のポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。 特許出願人　責酒造株式会社 第１図 第２図 ３２ρＧ 第３図 左　：　セルフリケーション ；ｆｉ：　セルフリケーション十制限Ｍ未Ｐｓｔｌ特許
庁長官若杉和夫殿 の表示　昭和５８年特許願第１３７１８９号の名称 オリゴヌクレオチドの製造法 をする者 との関係　特許出願人 へ＼＼ 埋入 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）明細書第１０頁の反応式中、（１）の化合物の式
を下記の如く訂正する。 （１）」 Ｃ）同第１０頁の反応式中、（２）の化合物の式を下記
の如く訂正する。 （２）」 （Ｊ同第１１頁の反応式中（ωの化合物の式を下記の如
く訂正する。 （５）」 （４）同第１１頁の反応式中、（６）の化合物の式を下
記の如く訂正する。 「 （６）」 （５）同第１２頁の反応式中、（８）の化合物の式を下
記の如く訂正する。 ［ （８）」 （６）同第１６頁の反応式中、（１）の化合物の式を下
記の如く訂正する。 （１）」 （７）同＄２２頁第３行「水酸化アンモニウム中」を「
アンモニア水中」と訂正する。 ０３）同第２４頁の反応式中、Ｃ２）の化合物の式を下
記の如く訂正する。 「 ０＝Ｐ−ＱＣ，Ｈ，ＣＮ ＯＲ’ （２）　１ （９）同第２４頁の反応式中、（５）の化合物の式を下
記の如く訂正する。 ０＝Ｐ−ＯＲ’ ■ ＱＣ，Ｈ，０Ｎ （５）」 ０（ト）第２４頁の反応式中、（６）の化合物の式を下
記の如く訂正する。 ■ ｏ＝ｐ−ＱＣ，Ｈ，ＣＮ ＯＨ２ （６〕」 ＯＤ同第２６頁第２行の化合物の式を下記の如く訂正す
る。 ■ ０＝Ｐ−ＱＣ２Ｈ４ＣＮ 島・ 」 ０の同第２６頁第６行の化合物の式を下記の如く訂正す
る。 「 「 ０＝ｐ−ＱＣ２Ｈ，ＣＮ ＯＲ’ 」 ０３）同第２８頁第１行の化合物の式を下記の如く訂正
する。 「 ０＝Ｐ−ＱＣ，Ｈ，ＣＮ 嬶 」 ０１０同第２７頁第５行の化合物の式を下記の如く訂正
する。 「 ０＝Ｐ−ＱＣ，Ｈ４０Ｎ ＯＲ’ 」 （１５）同第２８頁第１行の化合物の式を下記の如く訂
正する。 ［ ０＝Ｐ−ＱＣ，Ｈ，ＣＮ ＯＲ’ 」 ０６）同第２８頁第５行の化合物の式を下記の如く訂正
する。 ［ 」 （１つ同第２９頁の反応式中、（１）の化合物の式を下
記の如く訂正する。 「 （１）」 （１８）同第２９頁の反応式中、（１′）の化合物の式
を下記の如く訂正する。 ［ １ ０　＝　Ｐ　−ＱＣ，Ｈ，ＣＮ ＯＲ’ （１′） 」 ０９）同第２９頁や１反応式中、（２）の化合物の式を
下記の如く訂正する。 （２）」 （２０）同第３０頁の反応式中、（５）の化合物の式を
下記の如く訂正する。 「 Ｑ＝＝ｐ−ＱＣ，Ｈ，ＣＮ ＯＲ’ （５） 」 （２０同第３０頁の反応式中、（６）の化合物の式を下
記の如く訂正する。 ■ Ｑ＝ｐ−ＱＣ，Ｈ，ＣＭ ＯＲ’ （６〕 」 Ｃ２Ｚ）同第３２頁の反応式中、（支））の化合物の式
を下記の如く訂正する。 「 ０＝Ｐ−ＱＣ，Ｈ４ＣＮ ＯＲ’ （２） 」 （２■同第３３頁の反応式中、（８）の化合物の式を下
言己の如く訂正する。 Ｑ＝Ｐ−ＱＣ，Ｈ，ＣＮ ０Ｒ’ （８）」 ＠同第３４頁第１１行「ビリジンアルレノ（キシム」ん
「ピリジンアルドキシム」と訂正スル。 ■同第３６頁下より第２行「ＣＮＣ＊１ｈ基」を「Ｃ，
Ｈ４ＣＮ基」と訂正する。 Ｇ！６）同第３８頁第１３行「ｐｌｌｔ　Ｉ　Ｊを［Ｈ
ｌｎｄ　ＩＪと訂正する。 ＠同第３８頁第１６行ｒ　３２　ｐ　Ｊヲｒ　Ｐｓ２Ｊ
ＩＴ正する。 （至）第１図を添付の如く訂正する。 ７、添付書類目録 （９図　面（第１図）　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 〔式中Ｘは醗で選択的に脱離しつる保護基を表わし、Ｒ
   □は式 を秀わ１．−ｍ口０すたけ１ｂ）＃−の雷ろ廖九実もす
   整数を表わし、Ｂは少なくともアミ７基が保護されたア
   デニン、グアニンもしくはシトシンの残基またはチミン
   残基を表わし、Ｒ１は水酸基の保護基を表わす〕で表わ
   される５′炭素原子がリン酸化された保護ヌクレオチド
   と、一般式を表わし、ｎはＯまたは１以上の重合度を表
   わす整数を表わし、Ｙは００に結合したアミノ基または
   イミノ基含有ポリマー残基を表わし、ＢおよびＲ１は前
   述したとおりである〕で表わされるヌクレオシド−ポリ
   マー複合体またはヌクレオチド−ポリマー複合体とを、
   縮合剤の存在下で縮合させることを特徴とする一般式 〔式中、Ｘ　、　Ｒ１、Ｂ　、　ｍ　、　ｎおよびＹは
   前述したとおりである〕で表わされるオリゴヌクレオチ
   ドの製造法。