JPH09268196A - （６−４）光産物のカップリングユニット及びそれを含むｄｎａの製造法 - Google Patents
（６−４）光産物のカップリングユニット及びそれを含むｄｎａの製造法Info
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- JPH09268196A JPH09268196A JP8136272A JP13627296A JPH09268196A JP H09268196 A JPH09268196 A JP H09268196A JP 8136272 A JP8136272 A JP 8136272A JP 13627296 A JP13627296 A JP 13627296A JP H09268196 A JPH09268196 A JP H09268196A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ＤＮＡが紫外線に曝されると、隣接するピリ
ミジン塩基が損傷をおこして（６−４）光産物が生ず
る。本発明では（６−４）光産物を含む長鎖のＤＮＡ
を、高収率で、かつ副生成物を含まないものを提供す
る。 【解決手段】 下記式（Ｉ） 〔式中、Ｒ１は保護基を；Ｒ２は−ＣＨ３又は−ＣＨ２
ＣＨ２−ＣＮを；Ｒ３は−ＰＨ（Ｏ）−Ｏ−又はＰ（Ｒ
５、Ｒ６）を；Ｒ５はＲ２の表わす基を；Ｒ６はジメチ
ルアミノ基、モルホリン−１−イル基、ピロリジン−１
−イル基又は２，２，６，６−テトラメチルピペリジン
−１−イル基を；表す〕を有する（６−４）光産物のカ
ップリングユニットを合成し、さらにこれを含むＤＮＡ
を合成した。
ミジン塩基が損傷をおこして（６−４）光産物が生ず
る。本発明では（６−４）光産物を含む長鎖のＤＮＡ
を、高収率で、かつ副生成物を含まないものを提供す
る。 【解決手段】 下記式（Ｉ） 〔式中、Ｒ１は保護基を；Ｒ２は−ＣＨ３又は−ＣＨ２
ＣＨ２−ＣＮを；Ｒ３は−ＰＨ（Ｏ）−Ｏ−又はＰ（Ｒ
５、Ｒ６）を；Ｒ５はＲ２の表わす基を；Ｒ６はジメチ
ルアミノ基、モルホリン−１−イル基、ピロリジン−１
−イル基又は２，２，６，６−テトラメチルピペリジン
−１−イル基を；表す〕を有する（６−４）光産物のカ
ップリングユニットを合成し、さらにこれを含むＤＮＡ
を合成した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体内のＤＮＡが
紫外線に曝されて生成する、塩基部に損傷を有する（６
−４）光産物及びこの損傷を有するＤＮＡの合成に関す
る。このようなＤＮＡの損傷は、遺伝子の突然変異を引
き起こし、細胞の死や癌化の原因となる。このような危
険性にもかかわらず、通常正常な遺伝情報の伝播が維持
されるのは、生物が細胞内にいくつかのＤＮＡ修復系を
有しているためである〔J. Biol. Chem., 270, 15915-1
5918 (1995）〕。本発明の方法により合成される（６−
４）光産物及びそれを含むＤＮＡは、ＤＮＡの損傷及び
修復の機構解明の研究に利用できるのみならず、この損
傷ＤＮＡを検出する抗体などの臨床検査薬として有用で
ある。
紫外線に曝されて生成する、塩基部に損傷を有する（６
−４）光産物及びこの損傷を有するＤＮＡの合成に関す
る。このようなＤＮＡの損傷は、遺伝子の突然変異を引
き起こし、細胞の死や癌化の原因となる。このような危
険性にもかかわらず、通常正常な遺伝情報の伝播が維持
されるのは、生物が細胞内にいくつかのＤＮＡ修復系を
有しているためである〔J. Biol. Chem., 270, 15915-1
5918 (1995）〕。本発明の方法により合成される（６−
４）光産物及びそれを含むＤＮＡは、ＤＮＡの損傷及び
修復の機構解明の研究に利用できるのみならず、この損
傷ＤＮＡを検出する抗体などの臨床検査薬として有用で
ある。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡが紫外線に曝されると、ピリミジ
ン塩基が並んだ部分に２種類の重要な損傷が生ずる。一
つはｃｉｓ−ｓｙｎシクロブタンピリミジンダイマーの
生成であり、もう一つはピリミジン（６−４）ピリミド
ン光産物（以下、（６−４）光産物という）の生成であ
る。（６−４）光産物を含むＤＮＡは次の構造を有し、
高い頻度で変異を起こすことが知られている〔Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 88, 9685-9689 (1991), J. Mol.
Biol., 235, 465-471 (1994)〕。
ン塩基が並んだ部分に２種類の重要な損傷が生ずる。一
つはｃｉｓ−ｓｙｎシクロブタンピリミジンダイマーの
生成であり、もう一つはピリミジン（６−４）ピリミド
ン光産物（以下、（６−４）光産物という）の生成であ
る。（６−４）光産物を含むＤＮＡは次の構造を有し、
高い頻度で変異を起こすことが知られている〔Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 88, 9685-9689 (1991), J. Mol.
Biol., 235, 465-471 (1994)〕。
【０００３】
【化２５】
【０００４】従来、これらＤＮＡの損傷や修復の実験に
は、紫外線を照射したプラスミドＤＮＡが用いられてい
るが、紫外線によりホルムアミドピリミジン類を含む多
種の損傷が生じることが報告されており〔Biochemistr
y, 34, 737-742 (1995)〕、詳細な研究のためには、特
定の一個所に特定の損傷を有するＤＮＡを用いることが
必要である。
は、紫外線を照射したプラスミドＤＮＡが用いられてい
るが、紫外線によりホルムアミドピリミジン類を含む多
種の損傷が生じることが報告されており〔Biochemistr
y, 34, 737-742 (1995)〕、詳細な研究のためには、特
定の一個所に特定の損傷を有するＤＮＡを用いることが
必要である。
【０００５】これまでに報告されている損傷ＤＮＡの調
製法は、隣接ピリミジンを一個所のみに含む非常に短い
ＤＮＡ断片に紫外線を照射し、その反応混合物の中から
（６−４）光産物を含む目的物をＨＰＬＣにより精製す
るものであった〔J. Biol. Chem., 268, 11143-11151
(1993）〕。しかし、この方法には次のような欠点があ
るため実用的ではない。第一に、この方法で得られるＤ
ＮＡには鎖長と塩基配列に大きな制約があり、長さは１
０量体程度が限界であった。第二に、目的物の収率が極
めて低く、かつ（６−４）光産物が近紫外線に当たり異
性化したDewar 異性体を含みその分離が困難であること
である〔J. Biol. Chem., 268, 11143-11151 (199
3）〕。
製法は、隣接ピリミジンを一個所のみに含む非常に短い
ＤＮＡ断片に紫外線を照射し、その反応混合物の中から
（６−４）光産物を含む目的物をＨＰＬＣにより精製す
るものであった〔J. Biol. Chem., 268, 11143-11151
(1993）〕。しかし、この方法には次のような欠点があ
るため実用的ではない。第一に、この方法で得られるＤ
ＮＡには鎖長と塩基配列に大きな制約があり、長さは１
０量体程度が限界であった。第二に、目的物の収率が極
めて低く、かつ（６−４）光産物が近紫外線に当たり異
性化したDewar 異性体を含みその分離が困難であること
である〔J. Biol. Chem., 268, 11143-11151 (199
3）〕。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、（６−４）
光産物のカップリングユニットを合成し、これを用いる
ことによって（６−４）光産物を含むＤＮＡを合成する
方法を提供する。この新規合成法により従来法の問題点
はすべて解決され、特定の位置に（６−４）光産物を含
む任意の長さと塩基配列を有するＤＮＡを高収率で合成
できるようになった。
光産物のカップリングユニットを合成し、これを用いる
ことによって（６−４）光産物を含むＤＮＡを合成する
方法を提供する。この新規合成法により従来法の問題点
はすべて解決され、特定の位置に（６−４）光産物を含
む任意の長さと塩基配列を有するＤＮＡを高収率で合成
できるようになった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の（６−４）光産
物のカップリングユニットは、次の構造式を有する。
物のカップリングユニットは、次の構造式を有する。
【０００８】
【化２６】
【０００９】〔式中、Ｒ1 は保護基を表し、Ｒ2 はメチ
ル基又は２−シアノエチル基を表し、Ｒ3 は
ル基又は２−シアノエチル基を表し、Ｒ3 は
【化２７】
【００１０】（Ｒ5 はメチル基又は２−シアノエチル基
を表し、Ｒ6 は−Ｎ（Ｒ′）（Ｒ″）基又はＮ−モルホ
リノ基、Ｎ−ピロリジニル基もしくは２，２，６，６−
テトラメチル−Ｎ−ピペリジル基を表し、Ｒ′及びＲ″
はそれぞれ低級アルキル基を表す）を表す〕
を表し、Ｒ6 は−Ｎ（Ｒ′）（Ｒ″）基又はＮ−モルホ
リノ基、Ｎ−ピロリジニル基もしくは２，２，６，６−
テトラメチル−Ｎ−ピペリジル基を表し、Ｒ′及びＲ″
はそれぞれ低級アルキル基を表す）を表す〕
【００１１】Ｒ1 の保護基としては、ＤＮＡの合成に用
いられるものが使用できるが、最も一般的に用いられて
いる４，４′−ジメトキシトリチル基の外、４−メトキ
シトリチル基、９−フェニルキサンテン−９−イル基が
使用できる。
いられるものが使用できるが、最も一般的に用いられて
いる４，４′−ジメトキシトリチル基の外、４−メトキ
シトリチル基、９−フェニルキサンテン−９−イル基が
使用できる。
【００１２】Ｒ2 としては２−シアノエチル基が好まし
い。
い。
【００１３】Ｒ3 は
【００１４】
【化２８】
【００１５】のＨ−ホスホネート又はホスホルアミダイ
トを用いることにより、ＤＮＡの合成が可能であるが、
Ｒ5 が２−シアノエチル基であり、Ｒ6 が−Ｎ（Ｒ′）
（Ｒ″）基である２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキ
ルホスホルアミダイトが好ましい。ここでＮ，Ｎ−ジア
ルキルとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル、Ｎ−ジエチル、
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピ
ルなどが挙げられる。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルホスホルアミダイトが最も好ましい。
トを用いることにより、ＤＮＡの合成が可能であるが、
Ｒ5 が２−シアノエチル基であり、Ｒ6 が−Ｎ（Ｒ′）
（Ｒ″）基である２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキ
ルホスホルアミダイトが好ましい。ここでＮ，Ｎ−ジア
ルキルとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル、Ｎ−ジエチル、
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピ
ルなどが挙げられる。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルホスホルアミダイトが最も好ましい。
【００１６】式（Ｉ）のカップリングユニットは、次の
工程により合成される。
工程により合成される。
【００１７】（１）式（II）
【００１８】
【化２９】
【００１９】（式中、Ｒ2 はメチル基又は２−シアノエ
チル基を表し、Ｒ7 はレブリニル基又はｔ−ブチルジメ
チルシリル基を表す）で示されるチミジン２量体に紫外
線を照射して、式（III)
チル基を表し、Ｒ7 はレブリニル基又はｔ−ブチルジメ
チルシリル基を表す）で示されるチミジン２量体に紫外
線を照射して、式（III)
【００２０】
【化３０】
【００２１】（式中、Ｒ2 及びＲ7 は前述と同じ）で示
される保護された（６−４）光産物を得る。
される保護された（６−４）光産物を得る。
【００２２】Ｒ7 としては、レブリニル基が好ましい。
式（II）の３′−レブリニル〔チミジニル（３′−
５′）チミジン〕（２−シアノエチル）リン酸トリエス
テルの合成法は、Nucleic Acid Res., 18, 7279-7286
(1990）に記載されている。この式（II）の化合物はリ
ンの不斉に起因する２種類の立体異性体が存在するが、
異性体又はその混合物を用いてもよい。
式（II）の３′−レブリニル〔チミジニル（３′−
５′）チミジン〕（２−シアノエチル）リン酸トリエス
テルの合成法は、Nucleic Acid Res., 18, 7279-7286
(1990）に記載されている。この式（II）の化合物はリ
ンの不斉に起因する２種類の立体異性体が存在するが、
異性体又はその混合物を用いてもよい。
【００２３】ＵＶ−クロスリンカー中で、後記化合物
（１）を含むアセトニトリル水溶液に紫外線（主として
２５４nm）を照射すると、ＨＰＬＣによる分析で保持時
間の短い３２６nmに吸収極大をもつ２つの生成物のピー
クが検出され、これらのピークは３０J/cm2 の照射量で
ほぼ最大となる。そこで上記溶液を用いて光反応を行
い、逆相分配クロマトグラフィーにより精製して、保護
された（６−４）光産物を得る。この生成物は既に報告
されている〔J. Biol. Chem., 257, 13535-13543 (198
2）〕（６−４）光産物に特有の紫外線吸収スペクトル
を有しており、ＮＭＲ及びマススペクトルも一致した。
（１）を含むアセトニトリル水溶液に紫外線（主として
２５４nm）を照射すると、ＨＰＬＣによる分析で保持時
間の短い３２６nmに吸収極大をもつ２つの生成物のピー
クが検出され、これらのピークは３０J/cm2 の照射量で
ほぼ最大となる。そこで上記溶液を用いて光反応を行
い、逆相分配クロマトグラフィーにより精製して、保護
された（６−４）光産物を得る。この生成物は既に報告
されている〔J. Biol. Chem., 257, 13535-13543 (198
2）〕（６−４）光産物に特有の紫外線吸収スペクトル
を有しており、ＮＭＲ及びマススペクトルも一致した。
【００２４】（２）次に、式（III)の（６−４）光産物
の５′−ＯＨ基に保護基Ｒ1 を導入して、式（IV）
の５′−ＯＨ基に保護基Ｒ1 を導入して、式（IV）
【００２５】
【化３１】
【００２６】（式中、Ｒ1 は保護基を表し、Ｒ2 及びＲ
7 は前述と同じ）の化合物を得る。
7 は前述と同じ）の化合物を得る。
【００２７】保護基Ｒ1 として４，４′−ジメトキシト
リチル基を導入するには、４，４′−ジメトキシトリチ
ルクロリドが用いられる。
リチル基を導入するには、４，４′−ジメトキシトリチ
ルクロリドが用いられる。
【００２８】（３）次に、３′−ＯＨ基の保護基Ｒ7 を
脱保護して、式（Ｖ）
脱保護して、式（Ｖ）
【００２９】
【化３２】
【００３０】（式中、Ｒ1 及びＲ2 は前述と同じ）の化
合物を得る。
合物を得る。
【００３１】保護基Ｒ7 を脱保護するには、Ｒ7 がレブ
リニル基である場合はアンモニアでも除去できるが、Ｒ
2 の２−シアノエチル基がはずれるのを防ぐために、ヒ
ドラジンを用いる方が好ましい。Ｒ7 がｔ−ブチルジメ
チルシリルである場合はフッ素イオンで除去できるが、
（６−４）光産物が一部分解される。
リニル基である場合はアンモニアでも除去できるが、Ｒ
2 の２−シアノエチル基がはずれるのを防ぐために、ヒ
ドラジンを用いる方が好ましい。Ｒ7 がｔ−ブチルジメ
チルシリルである場合はフッ素イオンで除去できるが、
（６−４）光産物が一部分解される。
【００３２】（４）最後に、３′−位のＲ7 基が除去さ
れた式（Ｖ）の化合物に
れた式（Ｖ）の化合物に
【００３３】
【化３３】
【００３４】（式中、Ｒ5 及びＲ6 は前述と同じ）を反
応させるか、又は式（Ｖ）の化合物にトリ（１，２，４
−トリアゾール−１−イル）ホスフィンを反応させた後
加水分解して、３′−ＯＨ基にＲ3 を導入して目的の式
（Ｉ）のカップリングユニットを得る。
応させるか、又は式（Ｖ）の化合物にトリ（１，２，４
−トリアゾール−１−イル）ホスフィンを反応させた後
加水分解して、３′−ＯＨ基にＲ3 を導入して目的の式
（Ｉ）のカップリングユニットを得る。
【００３５】式（Ｉ）の（６−４）光産物を含むＤＮＡ
は、ＤＮＡ合成機を用いて次の工程により製造される。
は、ＤＮＡ合成機を用いて次の工程により製造される。
【００３６】（１）固相担体に結合した、式（VI）
【００３７】
【化３４】
【００３８】〔式中、Ｒ1 は前述と同じ、Ｂは次式
【００３９】
【化３５】
【００４０】（Ｒ8 は保護基）を表す〕は、塩基部が保
護された４種のヌクレオシド、すなわち、デオキシアデ
ノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン又はチ
ミジンを意味し、保護基Ｒ1 をトリクロロ酢酸などによ
り常法により除去した式（ＶＩＩ）
護された４種のヌクレオシド、すなわち、デオキシアデ
ノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン又はチ
ミジンを意味し、保護基Ｒ1 をトリクロロ酢酸などによ
り常法により除去した式（ＶＩＩ）
【００４１】
【化３６】
【００４２】（式中、Ｂは前述と同じ）のヌクレオシド
が出発原料となる。
が出発原料となる。
【００４３】ここに保護基Ｒ8 としては、ｔ−ブチルフ
ェノキシアセチルの外にイソプロピルフェノキシアセチ
ル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジノなど
がほぼ同様に使用される。
ェノキシアセチルの外にイソプロピルフェノキシアセチ
ル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジノなど
がほぼ同様に使用される。
【００４４】式（VII)で示されるヌクレオシドに、式
（VIII）
（VIII）
【００４５】
【化３７】
【００４６】（式中、Ｒ1 、Ｒ3 及びＢは前述と同じ）
で示されるヌクレオチドを反応させる。ヌクレオチドが
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルホスホルアミダ
イトである場合は、この反応はテトラゾールの存在下で
行われ、テトラゾールにより活性化されたホスホルアミ
ダイトが５′−ＯＨ基と反応し、次いで沃素のような酸
化剤と反応させることにより５価のリン酸トリエステル
となる。またヌクレオチドがＨ−ホスホネートである場
合は、ピバロイルクロリドの存在下で活性化され、式
（VIII）のヌクレオチドと繰り返し反応させた後に沃素
と反応させることができる。
で示されるヌクレオチドを反応させる。ヌクレオチドが
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルホスホルアミダ
イトである場合は、この反応はテトラゾールの存在下で
行われ、テトラゾールにより活性化されたホスホルアミ
ダイトが５′−ＯＨ基と反応し、次いで沃素のような酸
化剤と反応させることにより５価のリン酸トリエステル
となる。またヌクレオチドがＨ−ホスホネートである場
合は、ピバロイルクロリドの存在下で活性化され、式
（VIII）のヌクレオチドと繰り返し反応させた後に沃素
と反応させることができる。
【００４７】この式（VIII）のヌクレチドとの反応を繰
り返すことにより、Ｂが同一又は異なる式（IX）
り返すことにより、Ｂが同一又は異なる式（IX）
【００４８】
【化３８】
【００４９】（式中、Ｒ9 は水素原子、メチル基又は２
−シアノエチル基を表し、ｍは１〜３０を表し、Ｒ1 は
前記と同じ）で示されるオリゴヌクレオチドを得る。
−シアノエチル基を表し、ｍは１〜３０を表し、Ｒ1 は
前記と同じ）で示されるオリゴヌクレオチドを得る。
【００５０】（２）次に、式（IX）のオリゴヌクレオチ
ドは、トリクロロ酢酸と反応させて保護基Ｒ1 を脱離し
た後、式（Ｉ）の（６−４）光産物のカップリングユニ
ットと反応させて、式（Ｘ）
ドは、トリクロロ酢酸と反応させて保護基Ｒ1 を脱離し
た後、式（Ｉ）の（６−４）光産物のカップリングユニ
ットと反応させて、式（Ｘ）
【００５１】
【化３９】
【００５２】（式中、Ｒ1 、Ｒ9 、Ｂ及びｍは前述と同
じ）で示される（６−４）光産物を含むオリゴヌクレオ
チドを得る。
じ）で示される（６−４）光産物を含むオリゴヌクレオ
チドを得る。
【００５３】（３）更に鎖長伸長反応のため、前記
（２）の方法と同様に、式（Ｘ）のオリゴヌクレオチド
の保護基Ｒ1 を脱離した後、式（VIII）のヌクレオチド
を反応させて、式（XI）
（２）の方法と同様に、式（Ｘ）のオリゴヌクレオチド
の保護基Ｒ1 を脱離した後、式（VIII）のヌクレオチド
を反応させて、式（XI）
【００５４】
【化４０】
【００５５】（式中、Ｒ1 、Ｒ9 、Ｂ及びｍは前述と同
じ、ｎは１〜３０を表す）で示される目的の（６−４）
光産物を含む長鎖オリゴヌクレオチドを得る。
じ、ｎは１〜３０を表す）で示される目的の（６−４）
光産物を含む長鎖オリゴヌクレオチドを得る。
【００５６】（４）式（XI）のオリゴヌクレオチドは、
保護基Ｒ1 をトリクロロ酢酸ではずした後、アンモニア
水で処理することにより、保護基Ｒ9 及びＲ8 を除去す
ると共に、固体担体からはずして、式（ＸＩＩ）
保護基Ｒ1 をトリクロロ酢酸ではずした後、アンモニア
水で処理することにより、保護基Ｒ9 及びＲ8 を除去す
ると共に、固体担体からはずして、式（ＸＩＩ）
【００５７】
【化４１】
【００５８】（式中、Ｂ′は
【００５９】
【化４２】
【００６０】を表し、ｍ及びｎは前述と同じ）で示され
る（６−４）光産物を含むＤＮＡを製造する。
る（６−４）光産物を含むＤＮＡを製造する。
【００６１】
【発明の効果】上記の方法で得られた生成物をＨＰＬＣ
で分析したところ、従来法で調製した（６−４）８−ｍ
ｅｒ〔ｄ（ＧＴＡＴ（６−４）ＴＡＴＧ〕と完全に一致
する３２６nmに吸収極大を有するピークが主生成物とし
て得られた。これを分取により精製したところ、収量は
６．８Ａ260 ユニット（０．１０μmol)であり、この結
果は従来法の約８倍の収率で得られたことを示した。ま
た一部をDewar 異性体を含む８−ｍｅｒに変換して分析
したところ、この合成法では精製前の混合物中にDewar
異性体の不純物が全く含まれていないことが明らかにな
った。
で分析したところ、従来法で調製した（６−４）８−ｍ
ｅｒ〔ｄ（ＧＴＡＴ（６−４）ＴＡＴＧ〕と完全に一致
する３２６nmに吸収極大を有するピークが主生成物とし
て得られた。これを分取により精製したところ、収量は
６．８Ａ260 ユニット（０．１０μmol)であり、この結
果は従来法の約８倍の収率で得られたことを示した。ま
た一部をDewar 異性体を含む８−ｍｅｒに変換して分析
したところ、この合成法では精製前の混合物中にDewar
異性体の不純物が全く含まれていないことが明らかにな
った。
【００６２】この方法により、（６−４）光産物を含む
長鎖の（６−４）３０−ｍｅｒ〔ｄ（ＣＴＣＧＴＣＡＧ
ＣＡＴＣＴ（６−４）ＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡＧ
ＴＧ〕を合成した。結果は、（６−４）８−ｍｅｒと同
様、長波長側に吸収極大を有するピークが主生成物とし
て得られ、このものは陰イオン交換カラムを用いた分析
では、（６−４）光産物を含まない３０−ｍｅｒと全く
同じ保持時間に溶出された。分取精製の後得られた純粋
な（６−４）３０−ｍｅｒの収量は、６．０Ａ260 ユニ
ットであった。
長鎖の（６−４）３０−ｍｅｒ〔ｄ（ＣＴＣＧＴＣＡＧ
ＣＡＴＣＴ（６−４）ＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡＧ
ＴＧ〕を合成した。結果は、（６−４）８−ｍｅｒと同
様、長波長側に吸収極大を有するピークが主生成物とし
て得られ、このものは陰イオン交換カラムを用いた分析
では、（６−４）光産物を含まない３０−ｍｅｒと全く
同じ保持時間に溶出された。分取精製の後得られた純粋
な（６−４）３０−ｍｅｒの収量は、６．０Ａ260 ユニ
ットであった。
【００６３】
【実施例】薄層クロマトグラフィーはクロロホルム−メ
タノールを展開溶媒として、Kieselgel ６０Ｆ254 プレ
ート（Merck)上で行った。カラムクロマトグラフィーに
はWakogel Ｃ−２００又はＣ−３００（和光純薬工業）
を用いた。
タノールを展開溶媒として、Kieselgel ６０Ｆ254 プレ
ート（Merck)上で行った。カラムクロマトグラフィーに
はWakogel Ｃ−２００又はＣ−３００（和光純薬工業）
を用いた。
【００６４】紫外可視スペクトルはBeckman ＤＵ−６４
分光光度計を用いて測定した。
分光光度計を用いて測定した。
【００６５】1Ｈ−ＮＭＲはテトラメチルシラン又は３
−（トリメチルシリル）プロパンスルホン酸ナトリウム
を内部標準とし、BrukerＡＭ５００又はＤＭＸ６００を
用いて測定した。31Ｐ−ＮＭＲはリン酸トリメチルを内
部標準とし、BrukerＤＰＸ３００を用いて測定した。
−（トリメチルシリル）プロパンスルホン酸ナトリウム
を内部標準とし、BrukerＡＭ５００又はＤＭＸ６００を
用いて測定した。31Ｐ−ＮＭＲはリン酸トリメチルを内
部標準とし、BrukerＤＰＸ３００を用いて測定した。
【００６６】質量分析（ＦＡＢＨＲＭＳ）はJEOLＪＭＳ
−ＡＸ５００又はＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａを用いて測定し
た。
−ＡＸ５００又はＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａを用いて測定し
た。
【００６７】オリゴヌクレオチドの合成はApplied Bios
ystems３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上で行っ
た。
ystems３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上で行っ
た。
【００６８】ＨＰＬＣにはGilsonの装置を用い、分析は
Waters９９６フォトダイオードアレイ検出器を用いて行
った。逆相分析用カラムとしてWatersμBondasphere Ｃ
１８３００Å（内径３．９mm×長さ１５０mm）、逆相分
取用カラムとしてWatersμBondapakＣ１８（内径７．８
mm×長さ３００mm）、陰イオン交換分析用として東ソー
ＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−２ＳＷ（内径４．６mm×長
さ２５０mm）を使用した。移動相として、逆相の場合に
は０．１M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（pH７．
０）中アセトニトリル、陰イオン交換の場合には２０％
アセトニトリル水中ギ酸アンモニウムの濃度勾配を用い
た。
Waters９９６フォトダイオードアレイ検出器を用いて行
った。逆相分析用カラムとしてWatersμBondasphere Ｃ
１８３００Å（内径３．９mm×長さ１５０mm）、逆相分
取用カラムとしてWatersμBondapakＣ１８（内径７．８
mm×長さ３００mm）、陰イオン交換分析用として東ソー
ＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−２ＳＷ（内径４．６mm×長
さ２５０mm）を使用した。移動相として、逆相の場合に
は０．１M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（pH７．
０）中アセトニトリル、陰イオン交換の場合には２０％
アセトニトリル水中ギ酸アンモニウムの濃度勾配を用い
た。
【００６９】実施例１
【００７０】
【化４３】
【００７１】３′−レブリニル〔チミジリル（３′−
５′）チミジン〕（２−シアノエチル）リン酸トリエス
テル（１）
５′）チミジン〕（２−シアノエチル）リン酸トリエス
テル（１）
【００７２】
【化４４】
【００７３】はNucleic Acids Res., 18, 7279-7286 (1
990)に従って合成した。１mMの化合物（１）を含む２０
％アセトニトリル水の溶液１５０mlを氷冷したアルミの
トレイ（２３cm×３２cm）に入れ、ＵＶ−クロスリンカ
ー（フナコシＦＳ−１５００）中で２時間紫外線を照射
した（紫外線量は約３０J/cm2)。この操作を２３回繰り
返すことにより得られた３．４５L の溶液を濃縮し、２
回に分けてＣ１８シリカゲル（Waters PreparativeＣ１
８ １２５Å）のカラム（内径１．５cm×長さ２８cm）
を用いた逆相分配クロマトグラフィーにより精製した。
アセトニトリルの濃度勾配（１０〜２５％）により溶出
されたピークをＨＰＬＣで分析し、溶媒を留去すること
によりガラス状の標記化合物（２）を得た。
990)に従って合成した。１mMの化合物（１）を含む２０
％アセトニトリル水の溶液１５０mlを氷冷したアルミの
トレイ（２３cm×３２cm）に入れ、ＵＶ−クロスリンカ
ー（フナコシＦＳ−１５００）中で２時間紫外線を照射
した（紫外線量は約３０J/cm2)。この操作を２３回繰り
返すことにより得られた３．４５L の溶液を濃縮し、２
回に分けてＣ１８シリカゲル（Waters PreparativeＣ１
８ １２５Å）のカラム（内径１．５cm×長さ２８cm）
を用いた逆相分配クロマトグラフィーにより精製した。
アセトニトリルの濃度勾配（１０〜２５％）により溶出
されたピークをＨＰＬＣで分析し、溶媒を留去すること
によりガラス状の標記化合物（２）を得た。
【００７４】収量０．３９ｇ（０．５５mmol、１６％） ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝５：１） Ｒf
０．３５ ＵＶ（Ｈ2 Ｏ） λmax ３２４nm（ε＝７．３×１０3)1 H-NMR (500MHz, D2O)δ8.07(s, 1H, pT H6), 6.52(d,
J=6.07Hz, 1H, pT H1'), 6.19(d, J=7.40Hz, 1H, Tp H
1'), 5.54(m, 1H, pT H3'), 5.15(s, 1H, Tp H6), 4.38
(m, 2H, -OCH2CH2CN), 4.33(m, 1H, pT H4'), 4.02(m,
1H, Tp H4'), 3.96(m, 1H, Tp H3'), 3.86(m, 2H, pT H
5'), 3.77(m, 2H, Tp H5'), 3.15(m, 1H,pT H2'), 2.95
(br s, 4H, -OCH2CH2CN, -OCOCH2CH2CO-), 2.84(m, 1H,
pT H2"), 2.65(m, 2H, -OCOCH2CH2CO-), 2.36(m, 1H,
Tp H2'), 2.32(s, 3H, pT -CH3),2.24(s, 3H, -COCH3),
1.75(s, 3H, Tp, -CH3), 1.68(m, 1H, Tp H2").31 P-NMR (121.5MHz,ピリジン-d5)δ-3.72ppm ＦＡＢＨＲＭＳ ｍ／ｚ６９７．１９９０（Ｍ-,Ｃ28Ｈ
36Ｏ14Ｎ5 Ｐ６９７．１９９６）
０．３５ ＵＶ（Ｈ2 Ｏ） λmax ３２４nm（ε＝７．３×１０3)1 H-NMR (500MHz, D2O)δ8.07(s, 1H, pT H6), 6.52(d,
J=6.07Hz, 1H, pT H1'), 6.19(d, J=7.40Hz, 1H, Tp H
1'), 5.54(m, 1H, pT H3'), 5.15(s, 1H, Tp H6), 4.38
(m, 2H, -OCH2CH2CN), 4.33(m, 1H, pT H4'), 4.02(m,
1H, Tp H4'), 3.96(m, 1H, Tp H3'), 3.86(m, 2H, pT H
5'), 3.77(m, 2H, Tp H5'), 3.15(m, 1H,pT H2'), 2.95
(br s, 4H, -OCH2CH2CN, -OCOCH2CH2CO-), 2.84(m, 1H,
pT H2"), 2.65(m, 2H, -OCOCH2CH2CO-), 2.36(m, 1H,
Tp H2'), 2.32(s, 3H, pT -CH3),2.24(s, 3H, -COCH3),
1.75(s, 3H, Tp, -CH3), 1.68(m, 1H, Tp H2").31 P-NMR (121.5MHz,ピリジン-d5)δ-3.72ppm ＦＡＢＨＲＭＳ ｍ／ｚ６９７．１９９０（Ｍ-,Ｃ28Ｈ
36Ｏ14Ｎ5 Ｐ６９７．１９９６）
【００７５】実施例２
【００７６】
【化４５】
【００７７】実施例１で得た化合物（２）３５２mg（５
０４μmol)をピリジン６mlに溶解し、４，４′−ジメト
キシトリチルクロリド４２７mg（１．２６mmol）を加え
て室温で撹拌した。３時間後、少量のメタノールを加え
て濃縮し、クロロホルム３０mlを加えて水洗した後、溶
媒を留去した。残渣をシリカゲルのカラム（生成物は３
％メタノール：クロロホルムで溶出された）で精製し、
溶媒を留去してＲf ０．３０（クロロホルム：メタノー
ル＝１０：１）の泡状物質（３）を得た。
０４μmol)をピリジン６mlに溶解し、４，４′−ジメト
キシトリチルクロリド４２７mg（１．２６mmol）を加え
て室温で撹拌した。３時間後、少量のメタノールを加え
て濃縮し、クロロホルム３０mlを加えて水洗した後、溶
媒を留去した。残渣をシリカゲルのカラム（生成物は３
％メタノール：クロロホルムで溶出された）で精製し、
溶媒を留去してＲf ０．３０（クロロホルム：メタノー
ル＝１０：１）の泡状物質（３）を得た。
【００７８】収量４２１mg（４２１μmol 、収率８４
％） ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝１０：１） Ｒf
０．３０1 H-NMR (600MHz, アセトン-d6)δ(ppm)9.55(s, 1H, -NH
-), 7.78(s, 1H, pT H6), 7.56(d, J=7.31Hz, 2H, 芳香
環), 7.43(d, J=5.94Hz, 2H,芳香環), 7.42(d,J=5.93H
z, 2H,芳香環), 7.36(dd, J=7.80, 7.80Hz, 2H, 芳香
環), 7.26(dd, J=7.34, 7.34Hz, 1H, 芳香環), 6.93(d,
J=8.94Hz, 4H,芳香環), 6.61(dd, J=5.05, 7.39Hz, 1
H, pT H1'), 6.28(dd, J=1.66, 8.73Hz, 1H, Tp H1'),
5.44(m, 1H,pT H3'), 5.09(s, 1H, Tp H6), 4.70(s, 1
H, -OH), 4.16-4.01(m, 6H, pT H4',H5', H5", Tp H3',
-OCH2CH2CN), 3.96(m, 1H, Tp H4'), 3.81(s, 6H, -OC
H3),3.60(dd, J=2.11, 10.71Hz, 1H, Tp H5'), 3.30(d
d, J=7.03, 10.72Hz, 1H, TpH5"), 3.05(m, 1H, pT H
2'), 2.89-2.77(m, -OCH2CH2CN, -OCOCH2CH2CO-), 2.62
(m, 1H, pT H2"), 2.57(m, 2H, -OCOCH2CH2CO-), 2.14
(m, 1H, Tp H2'), 2.13(s, 3H, -COCH3), 1.99(s, 3H,
pT -CH3), 1.67(s, 3H, Tp -CH3), 1.61(m, 1H,Tp H
2").31 P-NMR (121.5MHz,アセトン-d6)δ-3.53ppm
％） ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝１０：１） Ｒf
０．３０1 H-NMR (600MHz, アセトン-d6)δ(ppm)9.55(s, 1H, -NH
-), 7.78(s, 1H, pT H6), 7.56(d, J=7.31Hz, 2H, 芳香
環), 7.43(d, J=5.94Hz, 2H,芳香環), 7.42(d,J=5.93H
z, 2H,芳香環), 7.36(dd, J=7.80, 7.80Hz, 2H, 芳香
環), 7.26(dd, J=7.34, 7.34Hz, 1H, 芳香環), 6.93(d,
J=8.94Hz, 4H,芳香環), 6.61(dd, J=5.05, 7.39Hz, 1
H, pT H1'), 6.28(dd, J=1.66, 8.73Hz, 1H, Tp H1'),
5.44(m, 1H,pT H3'), 5.09(s, 1H, Tp H6), 4.70(s, 1
H, -OH), 4.16-4.01(m, 6H, pT H4',H5', H5", Tp H3',
-OCH2CH2CN), 3.96(m, 1H, Tp H4'), 3.81(s, 6H, -OC
H3),3.60(dd, J=2.11, 10.71Hz, 1H, Tp H5'), 3.30(d
d, J=7.03, 10.72Hz, 1H, TpH5"), 3.05(m, 1H, pT H
2'), 2.89-2.77(m, -OCH2CH2CN, -OCOCH2CH2CO-), 2.62
(m, 1H, pT H2"), 2.57(m, 2H, -OCOCH2CH2CO-), 2.14
(m, 1H, Tp H2'), 2.13(s, 3H, -COCH3), 1.99(s, 3H,
pT -CH3), 1.67(s, 3H, Tp -CH3), 1.61(m, 1H,Tp H
2").31 P-NMR (121.5MHz,アセトン-d6)δ-3.53ppm
【００７９】実施例３
【００８０】
【化４６】
【００８１】実施例２で得られた化合物（３）２３９mg
（２３９μmol)をピリジン２．５mlに溶解し、これにヒ
ドラジン−水和物１１６μl のピリジン：酢酸＝３：２
溶液３．０mlを加えて室温で撹拌した。５分後、氷冷下
アセトン１．０mlを加えてクロロホルム３０mlで希釈
し、１％重曹水で洗浄して硫酸ナトリウムで乾燥した
後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラム（生成物
は５％メタノール：クロロホルムで溶出された）で精製
し、溶媒を留去してＲf ０．１０（クロロホルム：メタ
ノール＝１０：１）のガラス状の化合物（４）
（２３９μmol)をピリジン２．５mlに溶解し、これにヒ
ドラジン−水和物１１６μl のピリジン：酢酸＝３：２
溶液３．０mlを加えて室温で撹拌した。５分後、氷冷下
アセトン１．０mlを加えてクロロホルム３０mlで希釈
し、１％重曹水で洗浄して硫酸ナトリウムで乾燥した
後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラム（生成物
は５％メタノール：クロロホルムで溶出された）で精製
し、溶媒を留去してＲf ０．１０（クロロホルム：メタ
ノール＝１０：１）のガラス状の化合物（４）
【００８２】
【化４７】
【００８３】(1Ｈ−ＮＭＲでレブリニル基の消失を確
認）を得た（収量１８４mg、２０４μmol 、収率８５
％）。これをピリジン２．０mlに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルエチルアミン１４２μl （８１６μmol)と２
−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホ
ルアミダイト９１μl(４０８μmol)を加えて室温で撹拌
した。３０分後、酢酸エチルを加えて２％重曹水と飽和
食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去
した。残渣をシリカゲルのカラム（生成物は０．１％ピ
リジンを含む２％メタノール：クロロホルムで溶出され
た）で精製し、溶媒を留去した後クロロホルムに溶解し
てペンタン中に滴下した。この沈殿をクロロホルムに再
度溶解し、溶媒を留去して泡状物質の標記物質（５）を
得た。
認）を得た（収量１８４mg、２０４μmol 、収率８５
％）。これをピリジン２．０mlに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルエチルアミン１４２μl （８１６μmol)と２
−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホ
ルアミダイト９１μl(４０８μmol)を加えて室温で撹拌
した。３０分後、酢酸エチルを加えて２％重曹水と飽和
食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去
した。残渣をシリカゲルのカラム（生成物は０．１％ピ
リジンを含む２％メタノール：クロロホルムで溶出され
た）で精製し、溶媒を留去した後クロロホルムに溶解し
てペンタン中に滴下した。この沈殿をクロロホルムに再
度溶解し、溶媒を留去して泡状物質の標記物質（５）を
得た。
【００８４】収量１４９mg（１３５μmol 、収率６６
％） ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝１０：１） Ｒf
０．４１1 H-NMR (600MHz, ピリジン-d5)δ(ppm)8.47(s, 1H, -N
H), 7.93(s, 1H, pT H6), 7.85(d, J=6.73Hz, 1H,芳香
環), 7.83(d, J=6.26Hz, 1H,芳香環), 7.71(d, J=7.37H
z, 2H,芳香環), 7.69(d, J=7.25Hz, 2H,芳香環), 7.48
(dd, J=7.74, 7.74Hz, 2H, 芳香環), 7.33(dd, J=7.05,
7.05Hz, 1H, 芳香環), 7.07(d, J=5.38Hz,4H,芳香環),
6.86(br s, 1H, pT H1'), 6.82(d, J=7.42Hz, 1H, Tp
H1'), 5.02(m, 1H, pT H3'), 4.37(m, 1H, Tp H3'), 4.
34-4.20(m, 5H, Tp H4', pT H4', -OH, -OCH2CH2CN),
3.95(m, 2H, Tp H5', -OCH2CH2CN ×1/2*), 3.75(s, 6
H, -OCH3), 3.72(m, 2H, Tp H5", -OCH2CH2CN ×1/2*),
3.61(m, 2H, -CH(CH3)2), 3.12-2.92(m, 6H, pT 2', H
5', -OCH2CH2CN×2), 2.89*, 2.80*(m, 1H, pT H5"),
2.72*, 2.62*(m, 1H, pT H2"), 2.36*, 2.32*(s, 3H, p
T -CH3), 2.27(m, 1H, TpH2'), 2.14(m, 1H, Tp H2"),
1.96(s, 3H, Tp -CH3), 1.17(d, J=7.00Hz, 6H,-CH(C
H3)2), 1.16(d, J=7.00Hz, 6H, -CH(CH3)2). ただし、* は異性体を表す。31 P-NMR (121.5MHz,ピリジン-d5)δ145.78, -4.16, -4.
44ppm
％） ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝１０：１） Ｒf
０．４１1 H-NMR (600MHz, ピリジン-d5)δ(ppm)8.47(s, 1H, -N
H), 7.93(s, 1H, pT H6), 7.85(d, J=6.73Hz, 1H,芳香
環), 7.83(d, J=6.26Hz, 1H,芳香環), 7.71(d, J=7.37H
z, 2H,芳香環), 7.69(d, J=7.25Hz, 2H,芳香環), 7.48
(dd, J=7.74, 7.74Hz, 2H, 芳香環), 7.33(dd, J=7.05,
7.05Hz, 1H, 芳香環), 7.07(d, J=5.38Hz,4H,芳香環),
6.86(br s, 1H, pT H1'), 6.82(d, J=7.42Hz, 1H, Tp
H1'), 5.02(m, 1H, pT H3'), 4.37(m, 1H, Tp H3'), 4.
34-4.20(m, 5H, Tp H4', pT H4', -OH, -OCH2CH2CN),
3.95(m, 2H, Tp H5', -OCH2CH2CN ×1/2*), 3.75(s, 6
H, -OCH3), 3.72(m, 2H, Tp H5", -OCH2CH2CN ×1/2*),
3.61(m, 2H, -CH(CH3)2), 3.12-2.92(m, 6H, pT 2', H
5', -OCH2CH2CN×2), 2.89*, 2.80*(m, 1H, pT H5"),
2.72*, 2.62*(m, 1H, pT H2"), 2.36*, 2.32*(s, 3H, p
T -CH3), 2.27(m, 1H, TpH2'), 2.14(m, 1H, Tp H2"),
1.96(s, 3H, Tp -CH3), 1.17(d, J=7.00Hz, 6H,-CH(C
H3)2), 1.16(d, J=7.00Hz, 6H, -CH(CH3)2). ただし、* は異性体を表す。31 P-NMR (121.5MHz,ピリジン-d5)δ145.78, -4.16, -4.
44ppm
【００８５】実施例４ （６−４）８−ｍｅｒ 実施例３で得た化合物（５）の１４３mg（１３０μmol)
をアセトニトリル１．０mlに溶解してＤＮＡシンセサイ
ザーに取付け、０．２μmol のデオキシグアノシン−Ｃ
ＰＧカラムを用いてｄ（ＧＴＡＴ（６−４）ＴＡＴＧ）
を合成した。化合物（５）のカップリングのみの反応時
間を２０分とした。合成終了後、オリゴヌクレオチドが
結合した固相担体を２８％アンモニア水約２mlの中に浸
し、室温で放置した。２時間後、溶液を濾過してアンモ
ニア水を留去し、蒸留水１．０mlに溶解して一部を逆相
ＨＰＬＣで分析した。３２６nmに吸収極大をもつ主生成
物が７〜１１％アセトニトリルの２０分間の濃度勾配で
保持時間１１．２分に溶出された。このピークは光産物
をもたない８−ｍｅｒ（ｄ（ＧＴＡＴＴＡＴＧ））に紫
外線を照射することにより得られた３２６nmに吸収極大
をもつ生成物と完全に一致した。この生成物を逆相ＨＰ
ＬＣで分取することにより精製し、６．８Ａ260 ユニッ
トの目的物が得られた。
をアセトニトリル１．０mlに溶解してＤＮＡシンセサイ
ザーに取付け、０．２μmol のデオキシグアノシン−Ｃ
ＰＧカラムを用いてｄ（ＧＴＡＴ（６−４）ＴＡＴＧ）
を合成した。化合物（５）のカップリングのみの反応時
間を２０分とした。合成終了後、オリゴヌクレオチドが
結合した固相担体を２８％アンモニア水約２mlの中に浸
し、室温で放置した。２時間後、溶液を濾過してアンモ
ニア水を留去し、蒸留水１．０mlに溶解して一部を逆相
ＨＰＬＣで分析した。３２６nmに吸収極大をもつ主生成
物が７〜１１％アセトニトリルの２０分間の濃度勾配で
保持時間１１．２分に溶出された。このピークは光産物
をもたない８−ｍｅｒ（ｄ（ＧＴＡＴＴＡＴＧ））に紫
外線を照射することにより得られた３２６nmに吸収極大
をもつ生成物と完全に一致した。この生成物を逆相ＨＰ
ＬＣで分取することにより精製し、６．８Ａ260 ユニッ
トの目的物が得られた。
【００８６】実施例５ （６−４）３０−ｍｅｒ （６−４）８−ｍｅｒと同様の方法で、ｄ（ＣＴＣＧＴ
ＣＡＧＣＡＴＣＴ（６−４）ＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴ
ＣＡＧＴＧ）を合成した。一部を逆相ＨＰＬＣで分析す
ると、３２７nmに吸収極大をもつ主生成物が７〜１３％
アセトニトリルの２０分間の濃度勾配で保持時間１２．
５分に溶出された。このものは陰イオン交換ＨＰＬＣで
分析すると光産物を含まない３０−ｍｅｒ（ｄ（ＣＴＣ
ＧＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡＧ
ＴＧ））と完全に一致した。この生成物を逆相ＨＰＬＣ
で分取することにより精製し、６．０Ａ260 ユニットの
目的物が得られた。
ＣＡＧＣＡＴＣＴ（６−４）ＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴ
ＣＡＧＴＧ）を合成した。一部を逆相ＨＰＬＣで分析す
ると、３２７nmに吸収極大をもつ主生成物が７〜１３％
アセトニトリルの２０分間の濃度勾配で保持時間１２．
５分に溶出された。このものは陰イオン交換ＨＰＬＣで
分析すると光産物を含まない３０−ｍｅｒ（ｄ（ＣＴＣ
ＧＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＧＴＣＡＧ
ＴＧ））と完全に一致した。この生成物を逆相ＨＰＬＣ
で分取することにより精製し、６．０Ａ260 ユニットの
目的物が得られた。
Claims (8)
- 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 〔式中、Ｒ1 は保護基を表し、Ｒ2 はメチル基又は２−
シアノエチル基を表し、Ｒ3 は 【化２】 （Ｒ5 はメチル基又は２−シアノエチル基を表し、Ｒ6
は−Ｎ（Ｒ′）（Ｒ″）基又はＮ−モルホリノ基、Ｎ−
ピロリジニル基もしくは２，２，６，６−テトラメチル
−Ｎ−ピペリジル基を表し、Ｒ′及びＲ″は、それぞれ
低級アルキル基を表す）を表す〕で示される（６−４）
光産物のカップリングユニット。 - 【請求項２】 Ｒ1 が４，４′−ジメトキシトリチル基
であり、Ｒ2 が２−シアノエチル基であり、Ｒ3 が２−
シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルホスホルアミダイト
基である、請求項１のカップリングユニット。 - 【請求項３】 式（Ｖ） 【化３】 （式中、Ｒ1 は保護基を表し、Ｒ2 はメチル基又は２−
シアノエチル基を表す）で示される化合物に、 【化４】 （式中、Ｒ5 はメチル基又は２−シアノエチル基を表
し、Ｒ6 は−Ｎ（Ｒ′）（Ｒ″）基又はＮ−モルホリノ
基、Ｎ−ピロリジニル基もしくは２，２，６，６−テト
ラメチルピペリジル基を表し、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ
低級アルキル基を表す）で示される化合物を反応させる
か、又は式（Ｖ）で示される化合物にトリ（１，２，４
−トリアゾール−１−イル）ホスフィンを反応させた後
加水分解する、請求項１の式（Ｉ）の（６−４）光産物
のカップリングユニットを製造する方法。 - 【請求項４】 （１）式（II） 【化５】 （式中、Ｒ2 はメチル基又は２−シアノエチル基を表
し、Ｒ7 はレブリニル基又はｔ−ブチルジメチルシリル
基を表す）で示されるチミジン２量体に紫外線を照射し
て、式（III) 【化６】 （式中、Ｒ2 及びＲ7 は前述と同じ）で示される、（６
−４）光産物を得、 （２）次に５′−ＯＨ基を保護して、式（IV） 【化７】 （式中、Ｒ2 及びＲ7 は前述と同じ、Ｒ1 は保護基を表
す）の化合物とし、 （３）次に、３′−ＯＨの保護基Ｒ7 を脱保護して、式
（Ｖ） 【化８】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 は前述と同じ）の化合物を得、 （４）これに、 【化９】 （式中、Ｒ5 はメチル基又は２−シアノエチル基を表
し、Ｒ6 は−Ｎ（Ｒ′）（Ｒ″）基又はＮ−モルホリノ
基、Ｎ−ピロリジニル基もしくは２，２，６，６−テト
ラメチル−Ｎ−ピペリジル基を表し、Ｒ′及びＲ″はそ
れぞれ低級アルキル基を表す）で示される化合物を反応
させるか、又は式（Ｖ）で示される化合物にトリ（１，
２，４−トリアゾール−１−イル）ホスフィンを反応さ
せた後加水分解する、請求項１の式（Ｉ）の（６−４）
光産物のカップリングユニットを製造する方法。 - 【請求項５】 Ｒ1 が４，４′−ジメトキシトリチル基
であり、Ｒ2 が２−シアノエチル基であり、Ｒ3 が２−
シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルホスホルアミダイト
基であり、Ｒ7 がレブリニル基である、請求項３又は４
のカップリングユニットを製造する方法。 - 【請求項６】 固相担体に結合した式（IX） 【化１０】 （式中、Ｒ1 は保護基を表し、Ｂは 【化１１】 を表し、Ｒ8 は保護基を表し、Ｒ9 は水素原子、メチル
基又は２−シアノエチル基を表し、ｍは１〜３０を表
す）で示されるオリゴヌクレオチドの保護基Ｒ1 を脱保
護し、これに式（Ｉ） 【化１２】 〔式中、Ｒ1 は前述と同じ、Ｒ2 はメチル基又は２−シ
アノエチル基を表し、Ｒ3 は 【化１３】 （Ｒ5 はメチル基又は２−シアノエチル基を表し、Ｒ6
は−Ｎ（Ｒ′）（Ｒ″）基又はＮ−モルホリノ基、Ｎ−
ピロリジニル基もしくは２，２，６，６−テトラメチル
−Ｎ−ピペリジル基を表し、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ低
級アルキル基を表す）を表す〕で示される（６−４）光
産物のカップリングユニットを反応させ、これを酸化す
る、式（Ｘ） 【化１４】 （式中、Ｒ1 、Ｒ9 、Ｂ及びｍは前述と同じ）で示され
る（６−４）光産物を含むオリゴヌクレオチドを製造す
る方法。 - 【請求項７】 固相に結合した式（VII) 【化１５】 （式中、Ｂは 【化１６】 を表し、Ｒ8 は保護基を表す）で示されるヌクレオシド
に、式（VIII） 【化１７】 〔式中、Ｒ1 は保護基を表し、Ｒ3 は 【化１８】 （Ｒ5 はメチル基又は２−シアノエチル基を表し、Ｒ6
は−Ｎ（Ｒ′）（Ｒ″）基又はＮ−モルホリノ基、Ｎ−
ピロリジニル基もしくは２，２，６，６−テトラメチル
−Ｎ−ピペリジル基を表し、Ｒ′及びＲ″はそれぞれ低
級アルキル基を表す）を表す〕で示されるヌクレオチド
を反応させ、これを酸化し、これを繰り返して、式（I
X） 【化１９】 （式中、Ｒ1 及びＢは前述と同じ。Ｒ9 は水素原子、メ
チル基又は２−シアノエチル基を表し、ｍは１〜３０を
表す）で示されるオリゴヌクレオチドを得、 （２）次に保護基Ｒ1 を脱離した後、式（Ｉ） 【化２０】 （式中、Ｒ2 はメチル基又は２−シアノエチル基を表
し、Ｒ1 及びＲ3 は前述と同じ）で示される（６−４）
光産物のカップリングユニットを反応させ、これを酸化
して、式（Ｘ） 【化２１】 （式中、Ｒ1 、Ｒ9 、Ｂ及びｍは前記と同じ）で示され
る（６−４）光産物を含むオリゴヌクレオチドを得、 （３）次に保護基Ｒ1 を脱離した後、前記式（VIII）で
示されるヌクレオチドを反応させ、これを酸化し、これ
を繰り返して、式（XI） 【化２２】 （式中、Ｒ1 、Ｒ9 、Ｂ及びｍは前記と同じ。ｎは１〜
３０を表す）で示される（６−４）光産物を含む長鎖オ
リゴヌクレオチドを得、 （４）次に保護基Ｒ1 をはずした後、アンモニア水で処
理することにより、保護基Ｒ9 及びＲ8 を除去すると共
に、固体担体からはずして、式（XII) 【化２３】 （式中、Ｂ′は 【化２４】 を表し、ｍ及びｎは前述と同じ）で示される（６−４）
光産物を含むＤＮＡを製造する方法。 - 【請求項８】 Ｒ1 が４，４′−ジメトキシトリチル基
であり、Ｒ3 が２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル
ホスホルアミダイト基であり、Ｒ8 がｔ−ブチルフェノ
キシアセチル基であり、Ｒ9 が２−シアノエチル基であ
る、請求項６又は７の（６−４）光産物を含むＤＮＡを
製造する方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8136272A JPH09268196A (ja) | 1996-01-31 | 1996-05-30 | （６−４）光産物のカップリングユニット及びそれを含むｄｎａの製造法 |
| US08/783,986 US5874568A (en) | 1996-01-31 | 1997-01-15 | Coupling unit of (6-4) photoproduct, process for preparing the same, process for preparing oligonucleotide containing (6-4) photoproduct by using the same and process for preparing DNA containing (6-4) photoproduct by using the same |
| CA002195364A CA2195364A1 (en) | 1996-01-31 | 1997-01-17 | Coupling unit of (6-4) photoproduct, process for preparing the same, process for preparing oligonucleotide containing (6-4) photoproduct by using the same and process for preparing dna containing (6-4) photoproduct by using the same |
| EP97100962A EP0787740A3 (en) | 1996-01-31 | 1997-01-22 | Coupling unit of (6-4)photoproduct, process for preparing the same, process for preparing oligonucleotide containing (6-4) photoproduct by using the same and process for preparing DNA containing (6-4) photoproduct by using the same |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-15236 | 1996-01-31 | ||
| JP1523696 | 1996-01-31 | ||
| JP8136272A JPH09268196A (ja) | 1996-01-31 | 1996-05-30 | （６−４）光産物のカップリングユニット及びそれを含むｄｎａの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09268196A true JPH09268196A (ja) | 1997-10-14 |
Family
ID=26351357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8136272A Pending JPH09268196A (ja) | 1996-01-31 | 1996-05-30 | （６−４）光産物のカップリングユニット及びそれを含むｄｎａの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5874568A (ja) |
| EP (1) | EP0787740A3 (ja) |
| JP (1) | JPH09268196A (ja) |
| CA (1) | CA2195364A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2836145B1 (fr) * | 2002-02-20 | 2004-07-02 | Centre Nat Rech Scient | Precurseurs de phosphoramidites, phosphoramidites obtenus et leur utilisation dans la preparation d'oligonucleotides renfermant des lesions photochimiques |
| US20040058886A1 (en) * | 2002-08-08 | 2004-03-25 | Dharmacon, Inc. | Short interfering RNAs having a hairpin structure containing a non-nucleotide loop |
| KR101084008B1 (ko) | 2008-10-07 | 2011-11-16 | 웅진코웨이주식회사 | 좌변기용 비데의 노즐 어셈블리 및 그 제어방법 |
-
1996
- 1996-05-30 JP JP8136272A patent/JPH09268196A/ja active Pending
-
1997
- 1997-01-15 US US08/783,986 patent/US5874568A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-01-17 CA CA002195364A patent/CA2195364A1/en not_active Abandoned
- 1997-01-22 EP EP97100962A patent/EP0787740A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2195364A1 (en) | 1997-08-01 |
| EP0787740A3 (en) | 1998-02-11 |
| US5874568A (en) | 1999-02-23 |
| EP0787740A2 (en) | 1997-08-06 |
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