CN117756868A - 一种嘧啶锁核酸的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种嘧啶锁核酸的合成方法。本发明从易获得的商品化原料出发，仅通过三步反应：氧化、羟醛缩合‑还原、环化，即可获得嘧啶锁核酸。本发明方法不包含任何保护/去保护操作，显著缩短了合成路线，且各步反应过程中使用常规试剂，条件也较温和。该方法适用性强，利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及核酸类似物领域，更具体地，涉及一种嘧啶锁核酸的合成方法。
背景技术
经过了40多年的发展，寡核酸治疗技术已经取得了巨大的临床成果。寡核酸药物发挥疗效得益于研究者对其整体化学结构的持续改造，通过对糖环，骨架及碱基的修饰，赋予寡核酸化合物结构以成药性(Kilanowska,A.,&Studzińska,S..In vivo and invitrostudies of antisense oligonucleotides–a review.RSCAdvances,10(57),34501–34516.)。到目前为止，寡核酸的修饰已发展了三代：第一代为骨架硫代修饰(PS)；第二代针对核糖环2’位修饰，包括2’-Ome、2’-F和2’-MOE；第三代则聚焦于锁核酸，即LNA(lockednucleicacids)。
LNA也被称为2’,4’-亚甲氧基桥核酸(bridged nucleic acids，BNA)，具有更强的化学稳定性。结构研究表明LNA/LNA双链可以提高碱基堆积作用，进而使得双链的结合能力加强。加入了LNA单体的寡核酸序列可大大提高与配对互补的RNA或DNA链的结合活性，单个LNA单体可提高杂交链的Tm值5-9摄氏度(Koshkin,A.A.,etal.LNA(Locked NucleicAcid):An RNA Mimic Forming Exceedingly Stable LNA:LNA Duplexes.Journal of theAmerican Chemical Society,120(50),13252–13253.)。LNA已经被广泛应用到寡核酸药物的研究和开发领域，已有多款相关药物进入到临床开发阶段(Crooke,S.T.,etal.Antisense technology:an overviewand prospectus.Nature Reviews DrugDiscovery,20(6),427–453)。
目前，LNA的化学合成方法主要有线性合成和汇聚式合成两种方法(Kaur,H.,etal.Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked NucleicAcid(LNA).Chemical Reviews,107(11),4672–4697.)，但二者都采用了较长的合成路线，合成过程中涉及对多个羟基的保护与去保护操作。由于对两个羟甲基进行区域选择性的保护难以控制，造成整体路线的合成效率低，成本昂贵，难以规模化生产。化学-酶催化反应策略(Sharma,V.K.,et al.Chemoenzymatic Convergent Synthesis of 2′-O,4′-C-Methyleneribonucleosides.The Journal of Organic Chemistry,79(13),6336–6341.)虽然在一定程度上解决了区域选择性问题，但是酶促反应对底物要求高，整体合成路线仍然没有摆脱步骤长，多保护基操作的问题，同样限制了其应用。有鉴于此，开发更为简便、经济适用的合成方法已成为该技术领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明开发了新型合成策略，从易获得的商品化原料出发，仅通过三步反应：氧化、羟醛缩合-还原、环化，即可获得目标产物。本发明方法不包含任何保护/去保护操作，显著缩短了合成路线，且各步反应过程中使用常规试剂，条件也较温和。该方法适用性强，利于工业化生产。
一方面，本发明提供一种嘧啶锁核酸化合物4的制备方法，其包括：
步骤i：在氧化体系中处理式1化合物，以得到式2化合物；
步骤ii：使用醛R2-CHO与式2化合物进行缩合，随后使用还原剂处理，以得到式3化合物；
步骤iii：使用碱处理式3化合物，得到化合物4；
其中，R1和R2分别独立地选自氢、卤素以及任选取代的：烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和芳烷基；其中所述取代基独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷氧基羰基、酰胺基、烷基酰胺基、羧基、烯基、炔基、烷氧基、烷基硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚环酰基、三烷基甲硅烷基中的一种或多种。
本发明中，所述烷基，单独或者在取代基中，具有1-10个碳原子，优选具有1-6个碳原子，或1-3个碳原子；所述烯基具有2-10个碳原子，优选具有2-6个碳原子，或2-4个碳原子；所述炔基具有2-10个碳原子，优选具有2-6个碳原子，或2-4个碳原子；所述环烷基具有3-10个碳原子，优选具有3-6个碳原子；所述芳基，单独或者在取代基中，具有6-14个碳原子，优选具有6-10个碳原子。
优选地，R1和R2分别独立地选自氢、卤素、C1-3烷基；
进一步优选地，R1和R2分别独立地选自氢或甲基；
进一步优选地，R1选自氢或甲基，R2为氢。
优选地，步骤i所述的氧化剂体系选自IBX、DCC/PPTS、草酰氯/TEA/DMSO或DMP中的任意一种；步骤i的氧化反应的反应溶剂选自DMSO、DMSO/二氯甲烷、二氯甲烷中的任意一种。
更优选的，步骤i的氧化反应的条件为以下之一：
a.DCC,PPTS,DMSO,rt；
b.(COCl)2,TEA,DMSO/DCM,-78℃ to rt；
c.IBX,DMSO,rt；
d.DMP,rt。
优选地，步骤ii的醛为甲醛、三聚甲醛或多聚甲醛中的任意一种。
步骤ii缩合时使用碱，优选的，使用的碱为DIPEA、TEA或碳酸钾中的任意一种；
步骤ii缩合时在有机溶剂中进行，优选的，使用的有机溶剂为DMF、DMSO、DMA、HMPA或水/DMF中的任意一种；
步骤ii所述的还原剂为NaBH4、LiBH4或NaBH3CN中的任意一种；
优选地，步骤iii所述的碱选自NaH、t-BuOK、t-BuONa、LiHMDS、NaHMDS、氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钾中的任意一种；更优选地，所述碱为NaH；
优选地，步骤iii的反应溶剂为DMF、DMA、DMSO、HMPA、NMP、THF或二氧六环中的任意一种；更优选地，所述反应溶剂为DMF；
优选地，步骤iii的反应温度为70-110℃，优选为80-100℃。
另一方面，本发明提供一种式2所述的化合物，
其中R1选自氢、卤素以及任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和芳烷基；其中取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷氧基羰基、酰胺基、烷基酰胺基、羧基、烯基、炔基、烷氧基、烷基硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚环酰基、三烷基甲硅烷基中的一种或多种。
优选地，R1选自氢、卤素、C1-3烷基；
进一步优选地，R1选自氢或甲基。
另一方面，本发明提供一种式3所述的化合物，
其中R1和R2分别独立地选自氢、卤素以及任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和芳烷基；其中取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷氧基羰基、酰胺基、烷基酰胺基、羧基、烯基、炔基、烷氧基、烷基硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚环酰基、三烷基甲硅烷基中的一种或多种。
优选地，R1和R2分别独立地选自氢、卤素、C1-3烷基；
进一步优选地，R1和R2分别独立地选自氢或甲基；
更进一步优选地，R1选自氢或甲基，R2为氢。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更清楚、明确，通过以下实施例对本发明进行进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明的具体实施方式，以使本领域的技术人员能够理解本发明，但不用于限制本发明的保护范围。本发明的具体实施方式中，未作特别说明的技术手段或方法等为本领域的常规技术手段或方法等。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
表1
实施例1化合物2a及2b的制备
向烧瓶中加入化合物1a(4.8g，0.02mol)，然后依次加入DMSO(20mL)和IBX(8.4g，0.03mol)。反应物室温下搅拌12小时，TLC检测反应完全，冷冻干燥除去DMSO，向残留物中加水(50mL)，搅拌，过滤，滤液经冷冻干燥后所得产物2a直接用于下一步反应。MS(ESI)caledfor C10H10N2O5[M+H2O+H]+257.1,found 257.1。
将化合物1a替换为化合物1b，通过反应制备得到化合物2b，不经纯化直接用于下一步反应。MS(ESI)caled for C9H8N2O5[M+H2O+H]+243.1,found 243.1。
实施例2氧化合成条件筛选
表2
本实施例中所使用的筛选条件见表2，所有的筛选反应均使用化合物1a，使用HPLC-MS监控反应并计算产物转化率。结果显示，采用的多种氧化体系均可以实现本发明氧化反应。
实施例3化合物3a及3b的制备
将实施例1所得产物2a加入到烧瓶中，加入DMF(80mL)，福尔马林(37％甲醛水溶液，8.2mL，5equiv.)和DIPEA(17.5mL，5equiv.)。混合物在50℃下搅拌24小时，降至室温，反应瓶下加冰浴，向反应瓶中缓慢加入NaBH4(1.0g)。反应液室温下搅拌30分钟，减压浓缩，所得残留物用水溶解，用C18反相硅胶柱层析纯化(水：甲醇＝95:5)，得到化合物3a。MS(ESI)caled for C11H14N2O6[M+H]+271.1,found 271.1。
将化合物2a替换为化合物2b，通过相同的反应和后处理条件，制备得到化合物3b。MS(ESI)caled for C10H12N2O6[M+H]+257.1,found 257.0。
实施例4羟醛缩合-还原合成条件筛选
表3
a：加水的体积同实施例3中福尔马林的体积
本实施例中所使用的筛选条件见表3，所有的筛选反应均使用化合物2a。使用HPLC-MS监控反应并计算产物转化率。结果显示，使用不同的反应条件，虽然收率有所变化，但均可制备得到化合物3a。
实施例5化合物4a及4b的制备
将实施例3所得产物3a加入到烧瓶中，加入无水DMF(100mL)，搅拌溶解，快速加入NaH(1.44g)。反应物在90℃下搅拌10小时，LCMS检测反应完全后加水淬灭反应。反应液经加压浓缩，残留物用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝15:1)，得到化合物4a(2.54g，按照实施例1，3的条件，三步总收率47％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.33(s,1H),7.65(d,J＝1.1Hz,1H),5.65(d,J＝4.3Hz,1H),5.41(s,1H),5.19(t,J＝5.6Hz,1H),4.13(s,1H),3.91(d,J＝4.4Hz,1H),3.81(d,J＝7.4Hz,1H),3.73(d,J＝5.5Hz,2H),3.63(d,J＝7.4Hz,1H),1.78(s,3H)..13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.3,150.6,134.8,106.2,89.0,86.1,79.4,71.2,68.4,56.3,12.6.MS(ESI)caled for C11H14N2O6[M+H]+271.1,found 271.2.
将化合物3a替换为化合物3b，通过相同的反应和后处理条件制备得到化合物4b(0.72g，按照实施例1，3的条件，三步总收率28％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.35(s,1H),7.75(d,J＝8.1Hz,1H),5.67(d,J＝4.3Hz,1H),5.62(dd,J＝1.9,8.1Hz,1H),5.41(s,1H),5.15(t,J＝5.5Hz,1H),4.14(s,1H),3.87(d,J＝4.4Hz,1H),3.82(d,J＝7.8Hz,1H),3.74(d,J＝5.5Hz,2H),3.63(d,J＝7.8Hz,1H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.40,150.74,139.71,100.91,88.97,86.81,79.36,71.08,68.71,56.02.MS(ESI)caled for C10H12N2O6[M+H]+257.1,found 257.0.
应当指出，本发明用个别实施方案进行了特别描述，但在不脱离本发明原理的前提下，本领域普通技术人可对本发明进行各种形式或细节上的改进，这些改进也落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种嘧啶锁核酸化合物4的制备方法，其包括：
步骤i：在氧化体系中处理式1化合物，以得到式2化合物；
步骤ii：使用醛R2-CHO与式2化合物进行缩合，随后使用还原剂处理，以得到式3化合物；
步骤iii：使用碱处理式3化合物，得到化合物4；
其中，R1和R2分别独立地选自氢、卤素以及任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和芳烷基；其中所述取代基独立地选自卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷氧基羰基、酰胺基、烷基酰胺基、羧基、烯基、炔基、烷氧基、烷基硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚环酰基、三烷基甲硅烷基中的一种或多种。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，R1和R2分别独立地选自氢、卤素、C1-3烷基。
3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，R1和R2分别独立地选自氢或甲基；优选地，R1选自氢或甲基，R2为氢。
4.权利要求1所述嘧啶锁核酸化合物4的制备方法，其中步骤i所述的氧化剂体系选自IBX、DCC/PPTS、草酰氯/TEA/DMSO或DMP中的任意一种；氧化反应的反应溶剂选自DMSO、DMSO/二氯甲烷、二氯甲烷中的任意一种。
5.权利要求1所述嘧啶锁核酸化合物4的制备方法，其中步骤ii的醛为甲醛、三聚甲醛或多聚甲醛中的任意一种。
6.权利要求1所述嘧啶锁核酸化合物4的制备方法，其中步骤ii缩合时使用碱，优选的，使用的碱为DIPEA、TEA或碳酸钾中的任意一种；
步骤ii缩合时在有机溶剂中进行，优选的，使用的有机溶剂为DMF、DMSO、DMA、HMPA或水/DMF中的任意一种。
7.权利要求1所述嘧啶锁核酸化合物4的制备方法，步骤ii所述的还原剂为NaBH4、LiBH4或NaBH3CN中的任意一种。
8.权利要求1所述嘧啶锁核酸化合物4的制备方法，其中步骤iii所述的碱选自NaH、t-BuOK、t-BuONa、LiHMDS、NaHMDS、氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钾中的任意一种；优选地，所述碱为NaH；
步骤iii的反应溶剂为DMF、DMA、DMSO、HMPA、NMP、THF或二氧六环中的任意一种；优选地，所述反应溶剂为DMF。
9.一种式2所述的化合物，
其中R1选自氢、卤素以及任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和芳烷基；其中取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷氧基羰基、酰胺基、烷基酰胺基、羧基、烯基、炔基、烷氧基、烷基硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚环酰基、三烷基甲硅烷基中的一种或多种；
优选地，R1选自氢、卤素、C1-3烷基；
进一步优选地，R1选自氢或甲基。
10.一种式3所述的化合物，
其中R1和R2分别独立地选自氢、卤素以及任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和芳烷基；其中取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、烷氧基羰基、酰胺基、烷基酰胺基、羧基、烯基、炔基、烷氧基、烷基硫基、烷基亚磺酰基、芳基亚环酰基、三烷基甲硅烷基中的一种或多种；
优选地，R1和R2分别独立地选自氢、卤素、C1-3烷基；
进一步优选地，R1和R2分别独立地选自氢或甲基；
更进一步优选地，R1选自氢或甲基，R2为氢。
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