BR122024000362A2

BR122024000362A2 - Anticorpos monoclonais, kit para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, processo para medir pd-l1 membranoso em células tumorais isoladas e uso do anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo

Info

Publication number: BR122024000362A2
Application number: BR122024000362-7A
Authority: BR
Inventors: John P. Cogswell; Stacie M. Goldberg; Ashok K. Gupta; Maria Jurekunkel; Xi Tao Wang; Jon M. Wigginton
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2024-04-02

Abstract

A presente invenção refere-se ao uso de anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que interrompe a interação entre Programmed Death-1 (PD-1) e Programmed Death Ligand-1 (PD-L1) e de um anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe o Antígeno-4 de Linfócitos T Citotóxicos (CTLA-4) em imunoterapia e no tratamento de câncer. A presente invenção refere-se ainda a processos de seleção de indivíduos para tratamento com anticorpo anti-PD-1, bem como a anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a um polipeptídeo de PD-L1 e a kits compreendendo os anticorpos de acordo com a presente invenção no tratamento de câncer.

Description

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente U.S. Provisório N°. 61/647.442, depositado em 15 de maio de 2012 e do Pedido de Patente U.S. Provisório N°. 61/790.747, depositado em 15 de março de 2013, cujos conteúdos são incorporados aqui através desta como referência em sua totalidade.

[0002] Ao longo de todo este pedido de patente, várias outras publicações são referidas entre parêntese por nome do autor e data ou por Patente N°. ou Publicação de Patente N°. Citações completas para estas publicações podem ser encontradas no final do relatório descritivo imediatamente precedendo as reivindicações. As descrições destas publicações são incorporadas aqui em suas totalidades como referência dentro deste pedido de patente com a finalidade de descrever de forma mais completa o estado da técnica que é conhecido pelos peritos aqui como da data da invenção descrita e reivindicada aqui. Entretanto, a citação de uma referência aqui não deve ser interpretada como um reconhecimento de que tal referência é a técnica anterior para a presente invenção.

Campo da Invenção

[0003] Esta invenção refere-se a métodos para imunoterapia de um paciente com câncer que compreendem a administração ao paciente de anticorpos que interrompem a via de sinalização de PD-1/PD- L1. Um biomarcador pode ser utilizado como parte deste tratamento para a identificação de pacientes adequados para imunoterapia e para a previsão da eficácia de tratamento anti-PD-1.

Antecedente da Invenção

[0004] Cânceres humanos carregam numerosas alterações genéticas e epigenéticas, que geram neoantígenos que podem ser potencialmente reconhecidos pelo sistema imunológico (Sjoblom e outros, 2006). O sistema imunológico adaptativo, compreendido de linfócitos T e B, possui potencial anticâncer poderoso, com uma ampla capacidade e uma especificidade extraordinária de responder a diversos antí- genos de tumor. Adicionalmente, o sistema imunológico demonstra plasticidade considerável e um componente de memória. A armação bem sucedida de todos estes atributos do sistema imunológico adapta- tivo tornaria a imunoterapia única entre todas as modalidades de tratamento de câncer. Entretanto, embora uma resposta imunológica endógenapara câncer seja observada em modelos e pacientes pré- clínicos, esta resposta é ineficiente e cânceres estabelecidos são vistos como "próprios"e tolerados pelo sistema imunológico. Contribuindo para esta condição de tolerância, os tumores podem explorar vários mecanismos distintos para subverter ativamente a imunidade antitumor. Estes mecanismos incluem sinalização de células T disfuncional (Mizoguchi e outros, 1992), células reguladoras supressoras (Faccia- bene e outros, 2012) e coopção de "pontos de verificação do sistema imunológico" endógenos, que servem para modular para menos a intensidade de respostas imunológicas adaptativas e para proteger tecidos normais de danos colaterais, por tumores para escapar da destruição imunológica (Topalian e outros, 2011; Mellman e outros, 2011).

[0005] Até recentemente, a imunoterapia para câncer concentrou esforços substanciais sobre abordagens que aumentam respostas imunológicas antitumor através da transferência adotiva de células efe- toras ativadas, imunização contra antígenos relevantes ou fornecimen- to de agentes estimuladores do sistema imunológico não específicos tais como citocinas. Na última década, entretanto, esforços intensivos para o desenvolvimento de inibidores específicos da via de ponto de verificação imunológica começaram a fornecer novas abordagens imunoterapêuticas para o tratamento de câncer, incluindo o desenvolvimento de um anticorpo (Ab), ipilimumab (YERVOY®), que se liga a e inibe o Antígeno-4 de Linfócitos T Citotóxicos (CTLA-4) para o tratamento de pacientes com melanoma avançado (Hodi e outros, 2010) e, como descrito aqui, o desenvolvimento de Abs que bloqueiam a via de PD-1 inibidora.

[0006] O Programmed Death-1 (Morte Programada-1, PD-1) é um receptor do ponto de verificação imunológica importante expresso por células T e B ativadas e medeia a imunossupressão. O PD-1 é um membro da família de receptores CD28, que inclui CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 e BTLA. Dois ligantes de glicoproteína de superfície celular para PD-1 foram identificados, Programmed Death Ligand-1 (PD- L1) e Programmed Death Ligand-2 (PD-L2), que são expressos sobre células apresentadoras de antígeno bem como muitos cânceres humanos e foi mostrado que regulam para menos a ativação de células T e a secreção de citocinas após a ligação ao PD-1 (Freeman e outros, 2000; Latchman e outros, 2001). Ao contrário do CTLA-4, o PD-1 funciona primariamente nos tecidos periféricos onde células T ativadas podem encontrar os ligantes PD-L1 (B7-H1) e PD-L2 (B7-DC) imunos- supressores expressos por células tumorais e/ou do estroma (Flies e outros, 2011; Topalian e outros, 2012a). A inibição da interação PD- 1/PD-L1 medeia atividade antitumor potente em modelos pré-clínicos (Patentes U.S. N°s. 8.008.449 e 7.943.743) e o uso de inibidores de Ab da interação PD-1/PD-L1 para o tratamento de câncer entrou em testes clínicos (Brahmer e outros, 2010; Topalian e outros, 2012b; Brah- mer e outros, 2012; Flies e outros, 2011; Pardoll, 2012; Hamid e Car- vajal, 2013).

[0007] A promessa do campo emergente de medicina personalizadaé que avanços na farmacogenômica irão crescentemente customizar agentes terapêuticos para subpopulações definidas e, em última análise, pacientes individuais com a finalidade de aumentar a eficácia e minimizar os efeitos adversos. Os sucessos recentes incluem, por exemplo, o desenvolvimento de mesilato de imatinib (GLEEVEC®), um inibidor de proteína tirosina quinase que inibe a tirosina quinase bcr- abl, para tratar leucemia mielogênica crônica positiva para o cromossomo Philadelphia (CML); crizotinib (XALKORI®) para tratar os 5% dos pacientes com cânceres pulmonares de células que não são pequenas em estágio tardio que expressam um gene de linfoma quinase anaplá- sico (ALK) mutante; e vemurafenib (ZELBORAF®), um inibidor da proteína B-RAF mutada (V600E-BRAF) que é expressa em aproximadamente a metade de tumores de melanoma. Entretanto, ao contrário do desenvolvimento clínico de agentes de molécula pequena que se direcionam a mutações de ativação distintas encontradas em populações com câncer selecionadas, um desafio particular na imunoterapia para câncer tem sido a identificação de biomarcadores de prognóstico com base no mecanismo para possibilitar a seleção de pacientes e guiar o controle do tratamento vigente. Os avanços na validação da expressão de PD-L1 como um biomarcador para a seleção de pacientes para imunoterapia anti-PD-1 são descritos aqui.

Sumário da Invenção

[0008] A presente descrição fornece um método para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente que interrompe, reduz ou suprime a sinalização partindo de um imunorregulador inibidor. Em modalidades preferidas, o agente é um Ab. Em outras modali- dades preferidas, o imunorregulador inibidor é um componente da via de sinalização de PD-1/PD-L1. Em modalidades preferidas adicionais, o Ab interrompe a interação entre PD-1 e PD-L1. Em certas modalidades, o Ab é um Ab anti-PD-1 da invenção ou um Ab anti-PD-L1 da invenção. Em modalidades preferidas, o Ab anti-PD-1 da invenção é ni- volumab (BMS-936558) e o Ab anti-PD-L1 da invenção é BMS- 936559. Em certas modalidades, o indivíduo foi pré-tratado para o câncer. Em outras modalidades, o câncer é um câncer avançado, me- tastático e/ou refratário. Em modalidades preferidas, a administração do Ab ou da porção que se liga ao antígeno do mesmo ao indivíduo induz uma resposta clínica durável no indivíduo.

[0009] Esta descrição fornece ainda um método para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a seleção de um indivíduo que é um candidato adequado para imunote- rapia, a seleção compreendendo (i) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor, (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular e (iii) a seleção do indivíduo como um candidato adequado com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular excede um nível de limiar predeterminado; e (b) a administração de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente que interrompe a sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1, por exemplo, um Ab anti-PD-1 ou um Ab anti-PD-L1, ao indivíduo selecionado.

[0010] A descrição fornece ainda um método para o tratamento de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a seleção de um indivíduo que não é adequado para imunoterapia com um agente que interrompe a sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1, por exemplo, um Ab anti-PD-1 ou um Ab anti-PD-L1, a seleção com-preendendo (i) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; e (iii) a seleção do indivíduo que não é adequado para a dita imunoterapia com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular é menor que um nível de limiar predeterminado; e (b) a administração de um padrão de cuidado terapêutico sem ser um agente que interrompe a sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1 ao indivíduo selecionado.

[0011] Em adição, a descrição fornece um método para a seleção de um paciente com câncer para imunoterapia com um agente que interrompe a sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1, por exemplo, um Ab anti-PD-1 ou um Ab anti-PD-L1, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a análise da amostra de tecido de teste para determinar a proporção de células na mesma que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; (c) a comparação da proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular com uma proporção de limiar predeterminada; e (d) a seleção do paciente para imunoterapia com base em uma avaliação de que PD-L1 é expresso nas células da amostra de tecido de teste.

[0012] Esta descrição fornece ainda um método para a previsão da efetividade terapêutica de um agente que interrompe a sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1, por exemplo, um Ab anti-PD-1 ou um Ab anti-PD-L1, para o tratamento de um paciente com câncer, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a análise da amostra de tecido de teste para determinar a proporção de células na mesma que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; (c) a comparação da proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular com um valor de limiar predeterminado; e (d) a previsão da efetividade terapêutica do agente, em que se a proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular exceder a proporção de limiar é previsto que o agente é eficiente no tratamento do paciente e em que se a proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular for abaixo da proporção de limiar é previsto que o agente não é eficiente no tratamento do paciente.

[0013] A presente descrição fornece ainda um método para a de-terminação de um regime imunoterapêutico que compreende um agente que interrompe a sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1, por exemplo, um Ab anti-PD-1 ou um Ab anti-PD-L1, para o tratamento de um paciente com câncer, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendocélulas tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a análise da amostra de tecido de teste para determinar a proporção de células na mesma que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; (c) a comparação da proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular com uma proporção de limiar predeterminada; e (d) a determinação de um regime imunoterapêutico que compreende o agente com base na determinação de que a proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular excede a proporção de limiar predeterminada.

[0014] Em certas modalidades dos métodos descritos aqui, a amostra de tecido de teste é uma amostra fixada com formalina e incrustada em parafina (FFPE). Em certas outras modalidades, a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular é conseguida através da coloração imunohistoquímica (IHC) da amostra FFPE. Em modalidades preferidas, o mAb 28-8 ou 5H1 é utilizado em um ensaio de IHC automatizado para se ligar ao PD-L1 sobre a superfície das células na amostra de tecido de teste. Em modalidades preferidas de qualquer um dos métodos divulgados aqui, o câncer é melanoma (MEL), carcinoma de célula renal (RCC), câncer pulmonar de células que não são pequenas (NSCLC) escamosas, NSCLC não escamosas, câncer color- retal (CRC), câncer de próstata resistente à castração (CRPC), carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço, carcinomas do esôfago, de ovário, do trato gastrointestinal e de mama ou uma malignidade hematológica tal como mielo- ma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Ho- dgkin/linfoma de células B mediastinais primárias e leucemia mielogê- nica crônica.

[0015] Esta invenção fornece adicionalmente um mAb ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um antígeno de PD-L1 humano expresso na superfície das células em uma amostra de tecido FFPE. Em modalidades preferidas, o mAb ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo não se liga a um antí- geno de PD-L1 citoplasmático na amostra de tecido FFPE. Em outras modalidades preferidas, o Ab monoclonal (mAb) é o mAb de coelho designado 28-8, 28-1, 28-12, 29-8 ou 20-12 ou o mAb de camundongo designado 5H1.

[0016] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes partindo da descrição detalhada e dos exemplos a seguir que não devem ser interpretados como limitantes. Os conteúdos de todas as referências citadas, incluindo artigos científicos, relatórios em periódicos, entradas no GenBank, patentes e pedidos de patentes citados ao longo de todo este relatório descritivo são expressamente incorporados aqui como referência.

Breve Descrição das Figuras

[0017] Figuras 1A-1C. Competição cruzada entre 5C4 e outros mAbs anti-PD-1 HuMab pela ligação ao PD-1 humano (hPD-1) expresso nas células CHO. A, o fragmento Fab de 5C4 bloqueou substancialmente a ligação dos mAbs 5C4 por si só, bem como a ligação de 2D3 e 7D3; B, o fragmento Fab de 5C4 bloqueou substancialmente a ligação do mAb 4H1; C, o mAb 5C4 bloqueou substancialmente a ligação do mAb 17D8.

[0018] Figuras 2A-2F. Competição cruzada de mAbs anti-hPD-L1 humanos conjugados com FITC pela ligação ao PDF-L1 humano (hPD-L1) expresso nas células CHO. A, A ligação de 10H10 marcado foi parcialmente bloqueada por 10A5, 11E6 e 13G4 e foi significativamente bloqueada por si só; B, A ligação de 3G10 marcado foi significativamente bloqueada por cada um dos Abs anti-PD-L1 testados exceto 10H10; C, A ligação de 10A5 marcado foi significativamente bloqueada por cada um dos Abs anti-PD-L1 testados exceto 10H10; D, A ligação de 11E6 marcado foi significativamente bloqueada por cada um dos Abs anti-PD-L1 testados exceto 10H10; e E, A ligação de 12A4 marcado foi significativamente bloqueada por cada um dos Abs anti-PD-L1 testados exceto 10H10; e F, A ligação de 13G4 marcado foi significativamente bloqueada por cada um dos Abs anti-PD-L1 testados exceto 10H10.

[0019] Figura 3. Inibição competitiva cruzada da ligação do mAb 12A4 biotinilado às células ES-2 pelos mAbs anti-hPD-L1 humanos. A fluorescência de biotina-12A4 ligado é representada graficamente contra a concentração de HuMabs para hPD-L1 não marcados.

[0020] Figura 4. Gráfico de radar que mostra a atividade do mAb anti-PD-1 em pacientes com melanoma refratário ao tratamento (MEL). Um gráfico representativo de alterações na carga tumoral ao longo do tempo demonstra o curso de tempo de alteração na soma dos diâmetros mais longos de lesões alvos, comparada com a linha de base, em 27 pacientes com MEL tratados com 5C4 em uma dose de 1,0 mg/kg. Na maioria dos pacientes que atingiram uma resposta objetiva (OR), as respostas eram duráveis e evidentes no final do ciclo 3 (6 meses) de tratamento (linha tracejada vertical). As regressões de tumor seguirampadrões de resposta convencionais bem como "relacionados ao sistema imunológico", tal como redução prolongada na carga tumoral na presença de novas lesões.

[0021] Figura 5. Atividade de mAb anti-PD-1 em paciente com RCC metastático. A regressão parcial de RCC metastático em um paciente com 57 anos de idade tratado com 5C4 a 1 mg/kg é ilustrada. Este paciente tinha sofrido anteriormente cirurgia radical e tinha de-senvolvidodoença progressiva após receber sunitinib, temsirolimus, sorafenib e pazopanib. As setas mostram regressão de tumor recorrente no campo operatório.

[0022] Figuras 6. Atividade de mAb anti-PD-1 em paciente com MEL metastático. Uma resposta completa de MEL metastático é ilustrada em um paciente com 62 anos de idade tratado com 5C4 a 3 mg/kg, associado com vitiligo. (i) Tomografia computadorizada pré- tratamento, metástase de nódulos linfáticos inguinais (seta); (ii) após 13 meses de tratamento. Metástases numerosas no tecido subcutâneo e no retroperitônio também regrediram completamente (não mostrado). O vitiligo se desenvolveu após 6 meses de tratamento; fotografias tira- das em 9 meses sob luz visível (iii) e luz ultravioleta (iv). Biópsias de pele com imunohistoquímica para o fator de transcrição associado à micro-oftalmia (MITF) mostram melanócitos (setas) na junção epiderme-derme na pele normal (v) e melanócitos raros (vi) ou ausentes (vii) na pele parcialmente ou completamente afetada pelo vitiligo.

[0023] Figura 7. Atividade de mAb anti-PD-1 em paciente com NSCLC metastático. Uma resposta parcial é ilustrada em um paciente com NSCLC metastático (histologia não escamosa) tratado com 5C4 a 10 mg/kg. As setas mostram a progressão inicial nas lesões pulmonares seguida pela regressão (padrão de resposta "relacionada ao sis-temaimunológico").

[0024] Figuras 8A e 8B. Correlação entre a expressão de PD-L1 de tumor e a resposta clínica anti-PD-1. A expressão de PD-L1 na superfície de células tumorais pré-tratamento, que é determinada por IHC sobre espécimes incrustados em parafina fixados com formalina, se correlaciona com OR para o bloqueio de PD-1. Quarenta e dois indivíduos com cânceres avançados incluindo melanoma, câncer pulmonar de células que não são pequenas, câncer colorretal, câncer de célula renal e câncer de próstata resistente à castração (n=18, 10, 7, 5 e 2, respectivamente) foram estudados. A, Havia uma correlação significativa de expressão de PD-L1 na superfície de células tumorais com resposta clínica objetiva. Nenhum paciente com tumores negativos em relação a PD-L1 sofreu uma OR. B, Exemplos de análise de IHC com o mAb anti-PD-L1 5H1 são mostrados em uma metástase de nódulos linfáticos de melanoma (parte superior), um espécime de nefrectomia de câncer de célula renal (centro) e uma metástase cerebral de adenocarcinoma pulmonar (parte inferior). Tudo com aumento original de 400X. As setas indicam uma de muitas células tumorais em cada espécime com coloração de membrana de superfície para PD-L1. O asterisco indica um glomérulo normal no espécime de nefrectomia, que é negativo para coloração de PD-L1.

[0025] Figura 9. Comparação gráfica da ligação dos mAbs 28-8 e 5H1 ao antígeno de PD-L1 em tecidos tumorais através da análise de histoscore. O mAb de coelho 28-8 exibia histoscores mais altos em 7 de 10 amostras testadas.

[0026] Figuras 10A-10D. Gráfico de radar que mostra a atividade de mAb anti-PD-L1 em pacientes com MEL e NSCLC refratários ao tratamento. Gráficos representativos demonstram o curso de tempo da carga tumoral da lesão alvo ao longo do tempo em pacientes com MEL tratado com BMS-936559 em doses de 1 (A), 3 (B), 10 mg/kg (C) e em pacientes com NSCLC tratado a 10 mg/kg (D). Na maioria de pacientes que atingiram ORs, as respostas eram duráveis e eram evidentes no final do ciclo 2 (3 meses) de tratamento, independentemente da dose ou do tipo de tumor. As regressões de tumor seguiram padrões de resposta convencionais bem como "relacionados ao sistema imunoló- gico".

[0027] Figura 11. Resposta completa em um paciente com melanoma tratado com BMS-936559 a 3 mg/kg. Os círculos indicam um aumento inicial no tamanho de nódulos pulmonares em 6 semanas e 3 meses seguido pela regressão completa em 10 meses (padrão de res-posta"relacionada ao sistema imunológico").

[0028] Figura 12. Resposta completa em um paciente com melanoma tratado com BMS-936559 a 1 mg/kg. Este paciente desenvolveu uma metástase cerebral isolada 3 meses após o início do tratamento que foi tratada de forma bem sucedida tratado com radiocirurgia este- reotáxica. Uma resposta parcial na doença abdominal (circulada) foi observada em 8 meses, sem evidência de doença em 15 meses.

[0029] Figura 13. Resposta parcial em um paciente com NSCLC (histologia não escamosa) tratado com BMS-936559 a 10 mg/kg. Ob-servar a resposta na doença na pleura pulmonar direita e no fígado.

[0030] Figuras 14A e 14B. Atividade clínica de pacientes com MEL que receberam um regime concorrente de nivolumab e ipilimumab. A, Gráficos de radar representativos mostram alterações partindo da linha de base na carga tumoral, medida como a soma de produtos de diâmetros perpendiculares de todas as lesões alvos, em pacientes que receberam o regime concorrente de 1 mg/kg de nivolumab + 3 mg/kg de ipilimumab, a MTD. Os triângulos indicam a primeira ocorrência de uma nova lesão. B, Um gráfico de queda d’água (waterfall) representativo mostra a porcentagem máxima de resposta nas lesões alvos de linha de base em pacientes que receberam o regime concorrente.

[0031] Figura 15. Regressões de tumor de um paciente com MEL com 52 anos de idade que recebeu um regime concorrente de 1 mg/kg de nivolumab + 3 mg/kg de ipilimumab. Este paciente apresentava lin- fadenopatia no pescoço, mediastinal, axilar, abdominal e pélvica ex-tensiva,nódulos pulmonares bilaterais, metástese do intestino delgado, implantes peritoneais e nódulos subcutâneos difusos. A lactato de- sidrogenase (LDH) da linha de base estava em 2,25 x o limite superior do normal, a hemoglobina era de 9,7 g/dL e os sintomas incluíam náusea e vômito. Dentro de 4 semanas de tratamento a LDH se normalizou, os sintomas melhoraram (o apetite aumentou, a náusea diminuiu) e as lesões cutâneas estavam regredindo. Nas verificações em 12 semanas, havia uma redução notável em todas as áreas de doença. As setas indicam a localização de doença metastática.

[0032] Figuras 16A-16C. Atividade clínica de pacientes com MEL que receberam vários regimes concorrentes de nivolumab e ipilimu- mab. Gráficos de radar representativos mostram alterações partindo da linha de base na carga tumoral, medida como a soma de produtos de diâmetros perpendiculares de todas as lesões alvos, em pacientes que receberam um regime concorrente de 0,3 mg/kg de nivolumab + 3 mg/kg de ipilimumab (A), 3 mg/kg de nivolumab + 1 mg/kg de ipilimu- mab (B) ou 3 mg/kg de nivolumab + 3 mg/kg de ipilimumab (C). Os tri-ângulos indicam a primeira ocorrência de uma nova lesão.

[0033] Figura 17. Regressões de tumor de um paciente com MEL com 61 anos de idade que recebeu um regime concorrente de 0,3 mg/kg de nivolumab + 3 mg/kg de ipilimumab. O paciente apresentava MEL em estágio IV (M1c) de um sítio primário desconhecido, metastá- tico para o estômago e para o mesentério. A lactato desidrogenase era de 225 e hemoglobina era de 9,6 g/dL após uma transfusão recente. Doze semanas após o início do tratamento de estudo, uma tomografia computadorizada mostrou uma redução de 86% na carga de doença volumosa.

[0034] Figuras 18A-18C. Atividade clínica de pacientes com MEL que receberam um regime sequenciado de nivolumab e ipilimumab. Gráficos de radar representativos mostram alterações partindo da linha de base na carga tumoral, medida como a soma de produtos de diâmetros perpendiculares de todas as lesões alvos, em pacientes que receberam um regime sequenciado de 1 mg/kg de nivolumab (A) ou 3 mg/kg de nivolumab (B) após terapia prévia com ipilimumab. Os triângulos indicam a primeira ocorrência de uma nova lesão. C, Um gráfico de queda d’água (waterfall) representativo mostra a porcentagem máxima de resposta nas lesões alvos de linha de base em pacientes que receberam um regime sequenciado; "*" representa pacientes que tiveramprogressão radiográfica com antes do tratamento com ipilimumab.

Descrição Detalhada da Invenção

[0035] A presente invenção refere-se a métodos para imunoterapia de um indivíduo afligido com doenças tal como câncer ou uma doença infecciosa, cujos métodos compreendem a administração ao indivíduo de uma composição que compreende uma quantidade terapeutica- mente eficiente de um composto ou um agente que potencializa uma resposta imunológica endógena, estimulando a ativação da resposta endógena ou inibindo a supressão da resposta endógena. Mais espe-cificamente, esta descrição fornece métodos para potencializar uma resposta imunológica endógena em um indivíduo afligido com câncer de forma a tratar dessa maneira o paciente, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente, tal como um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo, que interrompe ou inibe a sinalização partindo de um imunorregulador inibidor. Em certas modalidades, o imunorregula- dor inibidor é um componente da via de sinalização de PD-1/PD-L1. Consequentemente, certas modalidades da invenção fornecem métodos para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer, cujos métodos compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que interrompe a interação entre o receptor de PD-1 e seu ligante, PD-L1. Em certas modalidades preferidas, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo se liga especificamente ao PD-1. Em outras modalidades preferidas, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo se liga especificamente ao PD-L1. Certas modalidades compreendem o uso de um Ab anti-PD-1 que está em combinação com outro agente anticâncer, preferencialmente um Ab anti- CTLA-4, para tratar câncer. Em certas outras modalidades, o indivíduo é selecionado como adequado para imunoterapia em um método que compreende a medida da expressão na superfície de PD-L1 em uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, por exemplo, a determinação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular e a seleção do paciente para imunoterapia com base em uma avaliação de que PD-L1 é expresso sobre a superfície das células na amostra de tecido de teste.

Termos

[0036] Com a finalidade de que a presente descrição possa ser mais facilmente entendida, certos termos são definidos primeiro. Como utilizado neste pedido de patente, exceto quando for expressamente fornecido o contrário aqui, cada um dos termos a seguir deve ter o sig-nificado apresentado abaixo. Definições adicionais são apresentadas ao longo de todo o pedido de patente.

[0037] "Administração"refere-se à introdução física de uma composição que compreende um agente terapêutico a um indivíduo, utilizando qualquer um dos vários métodos e sistemas de fornecimento conhecidos pelos versados na técnica. As vias de administração preferidas para os Abs da invenção incluem vias de administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, espinhal ou outra parenteral, por exemplo, através de injeção ou infusão. A expressão "administração parenteral" como é utilizada aqui significa modos de administração sem ser administração entérica e tópica, geralmente através de injeção e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intrasternal, bem como eletro- poração in vivo. Alternativamente, um Ab da invenção pode ser administradoatravés de uma via não parenteral, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, de forma intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica. A administração também pode ser realizada, por exemplo, uma vez, um grande número de vezes e/ou ao longo de um ou mais períodos estendidos.

[0038] Um "evento adverso" (EA) como é utilizado aqui é qualquer sinal desfavorável e geralmente não pretendido ou indesejável (incluindo uma descoberta em laboratório anormal), sintoma ou doença associada com o uso de um tratamento médico. Por exemplo, um evento adverso pode estar associado com a ativação do sistema imunológico ou a expansão de células do sistema imunológico (por exemplo, células T) em resposta a um tratamento. Um tratamento médico pode ter um ou mais EAs associados e cada EA pode ter o mesmo ou um nível diferente de gravidade. Referência aos métodos capazes de "alterar eventos adversos" significa um regime de tratamento que diminui a incidência e/ou a gravidade de um ou mais EAs associados com o uso de um regime de tratamento diferente.

[0039] Um "anticorpo" (Ab) deve incluir, sem limitação, uma imu- noglobulina de glicoproteína que se liga especificamente a um antíge- no e compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. Cada cadeia H compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios constantes, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio constante, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdividas em regiões de hipervariabili- dade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denomi- andas regiões estruturais (FR). Cada uma de VH e VL compreende três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal car- bóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos Abs podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeito componente (C1q) do sistema do complemento clássico.

[0040] Os anticorpos tipicamente se ligam especificamente ao seu antígeno cognato com alta afinidade, refletida por uma constante de dissociação (KD) de 10-5até 10-11 M-1 ou menor. Qualquer KD maior que aproximadamente 10-4 M-1é geralmente considerada como indi-candoligação não específica. Como é utilizado aqui, um Ab que "se liga especificamente" a um antígeno refere-se a um Ab que se liga ao antígeno e antígenos substancialmente idênticos com alta afinidade, que significa possuir uma KD de 10-7 M ou menor, preferencialmente de 10-8 M ou menor, ainda mais preferencialmente 5 x 10-9 M ou menor e mais preferencialmente entre 10-8 M e 10-10 M ou menor, mas não se liga com alta afinidade a antígenos não relacionados. Um antígeno é "substancialmente idêntico"a certo antígeno se este exibir um alto grau de identidade de sequência ao certo antígeno, por exemplo, se este exibir pelo menos 80%, pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 97% ou ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade de sequência em relação à sequência do certo antígeno. Com a finalidade de exemplo, um Ab que se liga especificamente ao PD-1 humano também pode ter reatividade cruzada com antígenos de PD-1 de certas espécies de primatas, mas não pode reagir de forma cruzada com antígenos de PD-1 de certas espécies de roedores ou com um antígeno sem ser PD-1, por exemplo, um antígeno de PD-L1 humano.

[0041] Uma imunoglobulina pode derivar de qualquer um dos isoti- pos comumente conhecidos, incluindo, mas não limitados a IgA, IgA secretor, IgG e IgM. As subclasses de IgG também são bem conhecidas pelos versados na técnica e incluem, mas não estão limitadas a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. "Isotipo" refere-se à classe ou à subclasse de Ab (por exemplo, IgM ou IgG1) que é codificada pelos genes de região constante de cadeia pesada. O termo "anticorpo" in- clui, com a finalidade de exemplo, tanto Abs que ocorrem naturalmente quanto que não ocorrem naturalmente Abs; Abs monoclonais e poli- clonais; Abs quiméricos e humanizados; Abs humanos ou não humanos; Abs sintéticos inteiros; e Abs de cadeia isolada. Um Ab não humano pode ser humanizado através de métodos recombinantes para reduzir sua imunogenicidade no ser humano. Quando não for expressamente citado e a não ser que o contexto indique o contrário, o termo "anticorpo" inclui ainda um fragmento de ligação ao antígeno ou uma porção que se liga ao antígeno de qualquer uma das imunoglobulinas mencionadas anteriormente e inclui um fragmento ou uma porção monovalente e divalente e um Ab de cadeia isolada.

[0042] Um "anticorpo isolado" refere-se a um Ab que é substancialmente livre de outros Abs que possuem especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um Ab isolado que se liga especificamente ao PD-1 é substancialmente livre de Abs que se ligam especificamente a antígenos sem ser PD-1). Um Ab isolado que se liga especificamente ao PD-1 pode, entretanto, ter reatividade cruzada com outros antíge- nos, tais como moléculas de PD-1 de espécies diferentes. Além disso, um Ab isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou reagentes químicos. Por comparação, um ácido nucleico "isolado" refere-se a uma composição de ácido nucleico de objetivo que é notavelmente diferente, isto é, possui uma identidade química, natureza e utilidade distintivas, dos ácidos nucleicos como estes existem na natureza. Por exemplo, um DNA isolado, ao contrário do DNA nativo, é uma porção independente de um DNA nativo e não uma parte integral de um complexo estrutural maior, o cromossomo, encontrado na natureza. Adicionalmente, um DNA isolado, ao contrário do DNA genômico nativo, pode tipicamente ser utilizado em aplicações ou métodos para os quais o DNA genômico nativo é inadequado, por exemplo, na forma de um iniciador de PCR ou uma sonda de hibridização para, entre ou- tras coisas, medir a expressão gênica e detectar genes de biomarca- dores ou mutações para o diagnóstico de doença ou para a avaliação da eficácia de um agente terapêutico. Um ácido nucleico isolado pode ser purificado de forma a ficar substancialmente livre de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, utilizando técnicas padronizadas bem conhecidas na técnica. Os exemplos de ácidos nucleicos isolados incluem fragmentos de DNA genômico, DNA amplificado através de PCR, cDNA e RNA.

[0043] O termo "anticorpo monoclonal" ("mAb") refere-se a uma preparação de moléculas de Ab de composição molecular singular, isto é, moléculas de Ab cujas sequências primárias são essencialmenteidênticas e que exibe uma única especificidade de ligação e afinidade por um epitopo particular. Um mAb é um exemplo de um Ab isolado. Os mAbs podem ser produzidos por técnicas de hibridoma, recom- binantes, transgênicas ou outras conhecidas pelos peritos na técnica.

[0044] Um anticorpo "humano" (HuMAb) refere-se a um Ab que possui regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais quanto de CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Além disso, se o Ab contiver uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imuno- globulina de linhagem germinativa humana. Os Abs humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica ao gene in vitro ou através de mutação somática in vivo). Entretanto,não é pretendido que o termo "anticorpo humano", como é utilizado aqui, inclua Abs em que as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas dentro das sequências estruturais humanas. Os ter mos Abs "humanos" e Abs "completamente humanos"são utilizados de forma sinônima.

[0045] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um Ab em que parte, maioria ou todos os aminoácidos fora dos domínios de CDR de um Ab não humano são substituídos por aminoácidos correspondentes derivados de imunoglobulinas humanas. Em uma modalidade de uma forma humanizada de um Ab, parte, maioria ou todos os aminoácidos fora dos domínios de CDR foram substituídos por aminoácidos de imunoglobulinas humanas, enquanto que parte, maioria ou todos os aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de CDR são inalterados. Pequenas adições, deleções, inserções, substituições ou modificações de aminoácidos são permissíveis contanto que estas não anulem a capacidade do Ab de se ligar a um antígeno particular. Um Ab "humanizado"mantém uma especificidade antigênica similar àquela do Ab original.

[0046] Um "anticorpo quimérico"refere-se a um Ab em que as regiões variáveis são derivadas de uma espécie e as regiões constantes são derivadas de outra espécie, tal como um Ab em que as regiões variáveis são derivadas de um Ab de camundongo e as regiões constantessão derivadas de um Ab humano.

[0047] Uma "porção que se liga ao antígeno"de um Ab (também chamada de um "fragmento de ligação ao antígeno") refere-se a um ou mais fragmentos de um Ab que mantêm a capacidade de se ligar es-pecificamente ao antígeno ligado pelo Ab inteiro.

[0048] Um "câncer"refere-se a um grupo amplo de várias doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células anormais no corpo. A divisão e o crescimento celular desregulado resultam na for-mação de tumores malignos que invadem tecidos vizinhos e podem também sofrer metástase para partes distintas do corpo através do sistema linfático ou da corrente sanguínea.

[0049] Uma "resposta imunológica"refere-se à ação de uma célula do sistema imunológico (por exemplo, linfócitos T, linfócitos B, células natural killer (NK), macrófagos, eosinófilos, mastócitos, células dendrí- ticas e neutrófilos) e macromoléculas solúveis produzidas por qualquer uma destas células ou pelo fígado (incluindo Abs, citocinas e comple-mento) que resulta no direcionamento seletivo, na ligação a, em danos a, na destruição de e/ou na eliminação do corpo de um vertebrado de agentes patogênicos invasores, células ou tecidos infectados com agentes patogênicos, células cancerosas ou outras anormais ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células ou tecidos humanos anormais.

[0050] Um "imunorregulador" refere-se a uma substância, um agente, uma via de sinalização ou um componente da mesma que regula uma resposta imunológica. "Regulação", "modificação"ou "modulação"de uma resposta imunológica refere-se a qualquer alteração em uma célula do sistema imunológico ou na atividade de tal célula. Tal regulação inclui o estímulo ou a supressão do sistema imunológico que pode ser manifestado por um aumento ou um decréscimo no número de vários tipos de células, um aumento ou um decréscimo na atividade destas células ou quaisquer outras alterações que podem ocorrer dentro do sistema imunológico. Foram identificados imunorre- guladores tanto inibidores quanto estimuladores, dos quais alguns podem ter função aprimorada no microambiente do câncer.

[0051] O termo "imunoterapia" refere-se ao tratamento de um indivíduo afligido com ou em risco de contrair ou de sofrer uma recorrência de, uma doença através de um método que compreende indução, aprimoramento, supressão ou modificação de outra maneira de uma resposta imunológica. "Tratamento" ou "terapia" de um indivíduo refere-se a qualquer tipo de intervenção ou processo realizado no ou à administração de um agente ativo ao indivíduo com o objetivo de re verter, aliviar, melhorar, inibir, retardar ou prevenir o início, a progressão, o desenvolvimento, a gravidade ou a recorrência de um sintoma, uma complicação, um estado de saúde ou indícios bioquímicos associados a uma doença.

[0052] "O aumento da potência de uma resposta imunológica en-dógena"significa o aumento da efetividade ou da potência de uma resposta imunológica existente em um indivíduo. Este aumento na efe-tividade e na potência pode ser conseguido, por exemplo, através da superação dos mecanismos que suprimem a resposta imunológica en-dógenado hospedeiro ou através do estímulo dos mecanismos que aumentam a resposta imunológica endógena do hospedeiro.

[0053] Um "valor de limiar predeterminado", que se refere à expressão de PD-L1 na superfície celular, refere-se à proporção de células em uma amostra de tecido de teste que compreende células tumo- rais e células inflamatórias que se infiltram no tumor acima da qual a amostra é classificada como sendo positiva em relação à expressão de PD-L1 na superfície celular. Para a expressão na superfície celular analisada por IHC com o mAb 28-8, o valor de limiar predeterminado para células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular varia desde pelo menos aproximadamente 0,01% até pelo menos aproximadamente 20% do número total de células. Em modalidades preferidas, o valor de limiar predeterminado para células que expressam PD- L1 sobre a superfície celular varia desde pelo menos aproximadamente 0,1% até pelo menos aproximadamente 10% do número total de células. Mais preferencialmente, o valor de limiar predeterminado é de pelo menos aproximadamente 5%. Ainda mais preferencialmente, o valor de limiar predeterminado é de pelo menos aproximadamente 1% ou na faixa de 1-5%.

[0054] O receptor de "Programmed Death-1 (PD-1)" refere-se a um receptor imunoinibidor que pertence à família de CD28. O PD-1 é expresso predominantemente sobre células T previamente ativadas in vivo e se liga a dois ligantes, PD-L1 e PD-L2. O termo "PD-1" como é utilizado aqui inclui PD-1 humano (hPD-1), variantes, isoformas e es-pécies homólogas de hPD-1 e análogos que possuem pelo menos um epitopo em comum com hPD-1. A sequência de hPD-1 completa pode ser encontrada sob o N°. de Acesso do GenBank U64863.

[0055] O "Programmed Death Ligand-1 (PD-L1)" é um dos dois ligantes de glicoproteína de superfície celular para PD-1 (o outro sendo PD-L2) que regulam para menos a ativação de células T e a secreção de citocina após a ligação ao PD-1. O termo "PD-L1" como é utilizado aqui inclui PD-L1 humano (hPD-L1), variantes, isoformas e espécies homólogas de hPD-L1 e análogos que possuem pelo menos um epitopo em comum com hPD-L1. A sequência de hPD-L1 completa pode ser encontrada sob o N°. de Acesso do GenBank Q9NZQ7.

[0056] Uma "via de transdução de sinal" ou "via de sinalização" refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham uma função na transmissão de um sinal partindo de uma porção de uma célula para outra porção da célula. Um "receptor de superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas que ficam localizados na superfície de uma célula e são capazes de receber um sinal e de transmitir tal sinal ao longo da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um receptor de superfície celular da presente invenção é o receptor de PD-1, que fica localizado na superfície de células T ativadas, células B ativadas e células mieloides e transmite um sinal que resulta em um decréscimo nos linfócitos que se infiltram no tumor e um decréscimo na proliferação de células T. Um "inibidor" de sinalização refere-se a um composto ou um agente que antagoniza ou reduz o início, a recepção ou a transmissão de um sinal, seja tal sinal estimulador ou inibidor, através de qualquer componente de uma via de sinalização tal como um receptor ou seu ligante.

[0057] Um "indivíduo"inclui qualquer ser humano ou animal não humano. O termo "animal não humano" inclui, mas não está limitado a, vertebrados tais como primatas não humanos, ovinos, cachorros, gatos, coelhos e furões, roedores tais como camundongos, ratos e porquinhos da Índia, espécies de aves tais como frangos, anfíbios e répteis. Em modalidades preferidas, o indivíduo é um mamífero tal como um primate não humano, ovino, cachorro, gato, coelho, furão ou roedor. Em modalidades mais preferidas, o indivíduo é um ser humano. Os termos, "sujeito", "paciente" e "indivíduo" são utilizados de forma intercambiável aqui.

[0058] Uma "quantidade terapeuticamente eficiente" ou uma "dosagem terapeuticamente eficiente" de um fármaco ou agente terapêutico, tal como um Ab da invenção, é qualquer quantidade do fármaco que, quando utilizado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico, protege um indivíduo contra o início de uma doença ou promove regressão de evidenciada por um decréscimo na gravidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e na duração de períodos livres de sintomas da doença ou uma prevenção de danos ou incapacidade devida à aflição da doença. A capacidade de um agente terapêutico de promover regressão da doença pode ser avaliada utilizando uma variedade de métodos conhecidos pelo versado, tal como em indivíduos humanos durante testes clínicos, em sistemas de modelo com animais de previsão da eficácia in humanos ou através da avaliação da atividade do agente em ensaios in vitro.

[0059] Com a finalidade de exemplo, um agente anticâncer promove a regressão do câncer em um indivíduo. Em modalidades preferidas, uma quantidade terapeuticamente eficiente do fármaco promove a regressão do câncer até o ponto de eliminação do câncer. "Promoção da regressão do câncer"significa que a administração de uma quantidade eficiente do fármaco, isoladamente ou em combinação com um agente antineoplásico, resulta em uma redução no crescimento ou no tamanho do tumor, na necrose do tumor, um decréscimo na gravidade de pelo menos um sintoma da doença, um aumento na frequência e duração de períodos livres de sintomas da doença ou uma prevenção de danos ou incapacidade devida à aflição da doença. Em adição, os termos "efetivo" e "efetividade" em consideração a um tratamento incluem tanto efetividade farmacológica quanto segurança fisiológica. A efetividade farmacológica refere-se à capacidade do fár- maco de promover regressão do câncer no paciente. Segurança fisiológica refere-se ao nível de toxicidade ou outros efeitos fisiológicos adversos no nível celular, de órgãos e/ou de organismo (efeitos adversos) que resultam da administração do fármaco.

[0060] Com a finalidade de exemplo para o tratamento de tumores, uma quantidade terapeuticamente eficiente do fármaco preferencialmente inibe o crescimento celular ou o crescimento do tumor em pelo menos aproximadamente 20%, mais preferencialmente em pelo menos aproximadamente 40%, ainda mais preferencialmente em pelo menos aproximadamente 60% e ainda mais preferencialmente em pelo menos aproximadamente 80% em relação a indivíduos não tratados. Em outras modalidades preferidas da invenção, a regressão de tumor pode ser observada e continuada durante um período de pelo menos aproximadamente 20 dias, mais preferencialmente pelo menos apro-ximadamente 40 dias ou ainda mais preferencialmente pelo menos aproximadamente 60 dias. Apesar destas últimas medidas de efetivi-dadeterapêutica, a avaliação de fármacos imunoterapêuticos também tem que levar em consideração padrões de resposta "relacionada ao sistema imunológico".

[0061] Um padrão de resposta "relacionada ao sistema imunológi- co" refere-se a um padrão de resposta clínica frequentemente obser- vado em pacientes com câncer tratados com agentes imunoterapêuti- cos que produzem efeitos antitumor através da indução de respostas imunológicas específicas para câncer ou através da modificação de processos imunológicos nativos. Este padrão de resposta é caracterizado por um efeito terapêutico benéfico que acompanha um aumento inicial na carga tumoral ou o aparecimento de novas lesões, que na avaliação de agentes quimioterapêuticos tradicionais seria classificado como progressão da doença e seria sinônimo de com falha do fárma- co. Consequentemente, a avaliação apropriada de agentes imunotera- pêuticos pode requerer o monitoramento durante longo período dos efeitos destes agentes sobre a doença alvo.

[0062] Uma quantidade terapeuticamente eficiente de um fármaco inclui uma "quantidade profilaticamente eficiente", que é qualquer quantidade do fármaco que, quando administrado isoladamente ou em combinação com um agente antineoplásico a um indivíduo em risco de desenvolver um câncer (por exemplo, um indivíduo que possui um estado de saúde pré-maligno) ou de sofre uma recorrência de câncer, inibe o desenvolvimento ou a recorrência do câncer. Em modalidades preferidas, a quantidade profilaticamente eficiente previne o desenvolvimento ou a recorrência do câncer completamente. "Inibição"do desenvolvimento ou da recorrência de um câncer significa a diminuição da probabilidade do desenvolvimento ou da recorrência de câncer ou a prevenção do desenvolvimento ou da recorrência do câncer completamente.

[0063] Uma "célula inflamatória que se infiltra no tumor"é qualquer tipo de célula que tipicamente participa de uma resposta inflamatória em um indivíduo e que se infiltra no tecido tumoral. Tais células incluemlinfócitos que se infiltram no tumor (TILs), macrófagos, monócitos, eosinófilos, histiócitos e células dendríticas.

[0064] O uso da alternativa (por exemplo, "ou") deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das mesmas das alternativas. Como é utilizado aqui, os artigos indefinidos "um" ou "uma" devem ser entendidos como se referindo a "um(a) ou mais" de qualquer componente citado ou enumerado.

[0065] Os termos "aproximadamente" ou "compreendendo essencialmente de" referem-se a um valor ou uma composição que está dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor ou a composição particular que é determinada por um versado na técnica, que dependerá em parte de como o valor ou a composição é medida ou determinada, isto é, as limitações do sistema de medida. Por exemplo, "aproximadamente" ou "compreendendo essencialmente de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desvio padrão para a prática na técnica. Al-ternativamente,"aproximadamente" ou "compreendendo essencialmente de" pode significar uma faixa de até 20%. Além disso, particularmente em relação a sistemas ou processos biológicos, os termos podem significar até uma ordem de grandeza ou até 5 vezes um valor. Quando valores ou composições particulares são fornecidos no pedido de patente e nas reivindicações, a não ser que seja citado o contrário, o significado de "aproximadamente" ou "compreendendo essencialmente de" deve ser assumido como estando dentro de uma faixa de erro aceitável para tal valor ou composição particular.

[0066] Como descrito aqui, qualquer faixa de concentração, faixa de porcentagem, faixa de proporção ou faixa de números inteiros deve ser entendida como incluindo o valor de qualquer número inteiro dentro da faixa citada e, quando apropriado, frações dos mesmos (tais como um décimo e um centésimo de um número inteiro), a não ser que seja citado o contrário.

[0067] Vários aspectos da invenção são descritos em maiores detalhes nas subseções a seguir.

Anticorpos da Invenção

[0068] Os Abs da presente invenção incluem uma variedade de Abs que possuem propriedades estruturais e funcionais descritas aqui, incluindo ligação em alta afinidade a PD-1 ou PD-L1, respectivamente. Estes Abs podem ser utilizados, por exemplo, como Abs terapêuticos para tratar indivíduos afligidos com doença ou como reagentes em ensaios para diagnóstico para detectar seus antígenos cognatos. Os mAbs humanos (HuMAbs) que se ligam especificamente ao PD-1 (por exemplo, se ligam a PD-1 humano e podem reagir de forma cruzada com PD-1 de outras espécies, tal como macaco cinomolgo) com alta afinidade foram discutidos na Patente U.S. N°. 8.008.449 e os HuMAbs que se ligam especificamente ao PD-L1 com alta afinidade foram divulgados na Patente U.S. N°. 7.943.743. Os Abs da invenção incluem, mas não estão limitados a, todos os Abs anti-PD-1 e anti-PD-L1 divulgados nas Patentes U.S. Nos. 8.008.449 e 7.943.743, respectivamente. Outros mAbs anti-PD-1 foram descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.808.710, 7.488.802 e 8.168.757 e na Publicação PCT N°. WO 2012/145493 e os mAbs anti-PD-L1 foram descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s. 7.635.757 e 8.217.149, na Publicação U.S. N°. 2009/0317368 e nas Publicações PCT Nos. WO 2011/066389 e WO 2012/145493. Até a extensão na qual estes mAbs anti-PD-1 e anti-PD- L1 exibem as propriedades estruturais e funcionais divulgadas aqui para os anticorpos da invenção, estes também são incluídos como anticorpos da invenção.

Anticorpos Anti-PD-1 da Invenção

[0069] Foi demonstrado que cada um dos HuMAbs anti-PD-1 divulgados na Patente U.S. N°. 8.008.449 exibia uma ou mais das características a seguir: (a) se liga ao PD-1 humano com uma KD de 1 x 10-7 M ou menor, que é determinada por ressonância de plasmon de superfície utilizando um sistema de biossensor Biacore; (b) não se liga substancialmente a CD28, CTLA-4 ou ICOS humano; (c) aumenta a prolife- ração de células T em um ensaio de Reação de Linfócitos Mistos (MLR); (d) aumenta a produção de interferon-Y em um ensaio de MLR; (e) aumenta a secreção de IL-2 em um ensaio de MLR; (f) se liga ao PD-1 humano e ao PD-1 de macaco cinomolgo; (g) inibe a ligação de PD-L1 e/ou de PD-L2 a PD-1; (h) estimula respostas de memória específicas para o antígeno; (i) estimula respostas de Ab; e (j) inibe o crescimento de células tumorais in vivo. Os Abs anti-PD-1 da presente invenção incluem mAbs que se ligam especificamente ao PD-1 humano e exibem pelo menos uma, preferencialmente pelo menos cinco, das características anteriores.

[0070] A Patente U.S. N°. 8.008.449 exemplifica sete HuMAbs an- ti-PD-1: 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 (também referido aqui como nivolumab ou BMS-936558), 4A11, 7D3 e 5F4. Moléculas de DNA isoladas que codificam as regiões variáveis de cadeias pesadas e leves destes Abs foram sequenciadas, partindo das quais as sequências de aminoáci- dos das regiões variáveis foram deduzidas. As sequências de aminoá- cidos de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 e 5F4 são fornecidas aqui como SEQ ID N°s. 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente. As sequências de aminoácidos de VL de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 e 5F4 são fornecidas aqui como SEQ ID N°s. 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14, respectivamente.

[0071] Os Abs anti-PD-1 preferidos da presente invenção incluem os HuMAbs anti-PD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 e 5F4. Estes Abs preferidos se ligam especificamente ao PD-1 humano e compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 1 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 8; (b) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 2 e uma região variável de cadeia leve humana que com-preende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a se-quência apresentada na SEQ ID N°: 9; (c) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 3 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoá- cidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 10; (d) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 4 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 11; (e) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 5 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 12; (f) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 6 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 13; ou (g) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 7 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 14.

[0072] Dado que cada um destes Abs podem se ligar ao PD-1, as sequências de VH e VL podem ser "misturadas e combinadas" para cri- ar outros Abs anti-PD-1 da invenção. A ligação ao PD-1 de tais Abs "misturados e combinados" pode ser testada utilizando ensaios de li-gação, por exemplo, ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), western blots, ensaios radioimunológicos e análise de Biaco- re que são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a Patente U.S. N°. 8.008.449). Preferencialmente, quando cadeias de VH e VL são misturadas e combinadas, uma sequência de VH proveniente de um pareamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência de VH estruturalmente similar. Similarmente, preferencialmente uma sequência de VL proveniente de um pareamento de VH/VL particular é substituída por uma de sequência de VL estruturalmente similar. Consequentemente, os Abs anti-PD-1 da invenção incluem um mAb isolado ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°s. 1,2, 3, 4, 5, 6 e 7 e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°s. 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14, em que o Ab se liga especificamente ao PD-1, preferencialmente ao PD-1 humano.

[0073] Os domínios de CDR dos Abs anteriores foram delineados utilizando o sistema de Kabat e estes Abs também podem ser definidos por combinações de suas 3 CDRs de cadeia pesada e 3 de cadeia leve (ver a Patente U.S. N°. 8.008.449). Uma vez que cada um destas Abs podem se ligar ao PD-1 e a especificidade de ligação ao antígeno é fornecida primariamente pelas regiões de CDR1, CDR2 e CDR3, as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de VK podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDRs de Abs diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada Ab tenha que conter CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e CDR1, CDR2 e CDR3 de Vk) para criar outros Abs anti-PD-1 que também constituem os Abs da invenção. A ligação ao PD-1 de tais Abs "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos anteriormente (por exemplo, ELISAs, western blots, ensaios ra- dioimunológicos e análise de Biacore).

[0074] Os Abs da invenção também incluem Abs isolados que se ligam especificamente ao PD-1 e compreendem uma região variável de cadeia pesada derivada de uma imunoglobulina de cadeia pesada de linhagem germinativa particular e/ou uma região variável de cadeia leve derivada de uma imunoglobulina de cadeia leve de linhagem ger- minativa particular. Especificamente, em certas modalidades, os Abs da invenção incluem Abs isolados que compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 3-33 ou 4-39 e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VK L6 ou L15. As sequências de aminoácidos das regiões de VH e VK codificadas pelos genes de linhagem germinativa de VH 3-33, VH 4-39, Vk L6 e Vk L15 são fornecidas na Patente U.S. N°. 8.008.449.

[0075] Como é utilizado aqui, um Ab pode ser identificado como compreendendo uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve que é "derivada de" uma imunoglobulina de linhagem germinativa humana particular através da comparação da sequência de aminoáci- dos do Ab humano às sequências de aminoácidos codificadas por genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e da seleção da sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana que é mais próxima em sequência (isto é, maior porcentagem de identidade de sequência) à sequência do Ab humano. Um Ab humano que é "derivado de" uma imunoglobulina de linhagem germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácidos quando comparado com a sequência de linhagem germinativa, devido, por exemplo, a mutações somáticas que ocorrem naturalmente ou introdução intencional de mutação direcionada ao sítio. Entretanto, um Ab humano selecionadoé geralmente pelo menos 90% idêntico em sequência de amino- ácidos a uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o Ab humano como sendo humano quando comparado com as sequências de aminoácidos de imunoglo- bulina de linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências de linhagem germinativa murina). Em certos casos, um Ab humano pode ser pelo menos 95% ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico em sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

[0076] Em certas modalidades, a sequência de um Ab humano derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana particular exibirá não mais que 10 diferenças de aminoácidos partindo da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em outras modalidades, o Ab humano pode exibir não mais que 5 ou ainda não mais que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácidos partindo da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

[0077] Os Abs preferidos da invenção também incluem Abs isolados ou porções que se ligam ao antígeno dos mesmos que compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende ami- noácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa de VH 3-33 humana e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa de VK L6 humana; ou (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma se-quência de linhagem germinativa de VH 4-39 humana e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados conse-cutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa de Vk L15 humana. Os exemplos de Abs que possuem uma VH e uma Vk derivadas de sequências de linhagem germinativa de VH 3-33 e Vk L6, respectivamente, incluem 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 e 7D3. Os exemplos de Abs que possuem regiões de VH e Vk derivadas de sequências de linhagem germinativa de VH 4-39 e Vk L15, respectivamente, incluem 4A11 e 5F4.

[0078] Ainda em outras modalidades, os Abs anti-PD-1 da invenção compreendem regiões variáveis de cadeias pesadas e leves que possuem sequências de aminoácidos que são altamente similares ou homólogas às sequências de aminoácidos dos Abs anti-PD-1 preferidos descritos aqui, em que o Ab mantém as propriedades funcionais dos Abs anti-PD-1 preferidos da invenção. Por exemplo, os Abs da invenção incluem mAbs que compreendem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°s. 1,2, 3, 4, 5, 6 e 7 e a região variável de cadeia leve compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID N°s. 8, 9, 10, 11, 12, 13 e 14. Em outras modalidades, as sequências de amino- ácidos de VH e/ou VL podem exibir pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade em relação às sequências apresen- tadas anteriormente.

[0079] Como é utilizada aqui, a porcentagem de identidade de sequência (também referida como a porcentagem de homologia de sequência) entre duas sequências (sequências de aminoácidos ou de nucleotídeos) é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências em relação ao comprimento das sequências comparadas (isto é, % de identidade = número de posições idênti- cas/número total de posições que serão comparadas x 100), levando em consideração o número de quaisquer espaços e o comprimento de cada tal espaço, introduzido para maximizar o grau de identidade de sequência entre as duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas utilizando algoritmos matemáticos que são bem conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, a Patente U.S. N°. 8.008.449).

[0080] Os anticorpos que possuem sequências de aminoácidos muito similares provavelmente possuem essencialmente as mesmas propriedades funcionais em que as diferenças de sequências são mo-dificações conservativas. Como utilizado aqui, "modificações de se-quências conservativas" referem-se a modificações de aminoácidos que não afetam significativamente as características de ligação do Ab que contém a sequência de aminoácidos. Tais modificações conserva- tivas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. As substituições de aminoácidos conservativas são substituições em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Assim, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das regiões de CDR de um Ab da in-venção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeias laterais e o Ab alterado pode ser testado em relação à função mantida utilizando ensaios funcionais que são bem conhecidos na técnica. Consequentemente, certas modalidades dos Abs anti-PD-1 da invenção compreendem regiões variáveis de cadeias pesadas e leves cada uma compreendendo domínios de CDR1, CDR2 e CDR3, em que um ou mais destes domínios de CDR compreendem aminoácidos ligados consecutivamente que possuem sequências que são as mesmas que as sequências de CDR dos Abs anti-PD-1 preferidos descritos aqui (por exemplo, 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 ou 5F4) ou modificações conservativas das mesmas e em que os Abs mantêm as propriedades funcionais desejadas dos Abs anti-PD-1 preferidos da invenção.

[0081] Adicionalmente, é bem conhecido na técnica que a CDR3 de cadeia pesada é o determinante primário de especificidade de ligação e de afinidade de um Ab e que vários Abs podem ser gerados de forma previsível possuindo as mesmas características de ligação baseadas em uma sequência de CDR3 comum (ver, por exemplo, Klimka e outros, 2000; Beiboer e outros, 2000; Rader e outros, 1998; Barbas e outros, 1994; Barbas e outros, 1995; Ditzel e outros, 1996; Berezov e outros, 2001; Igarashi e outros, 1995; Bourgeois e outros, 1998; Levi e outros, 1993; Polymenis e Stoller, 1994; e Xu e Davis, 2000). As publicações anteriores demonstram que, em geral, uma vez que uma sequência de CDR3 de cadeia pesada de certo Ab é definida, a variabilidade nas outras cinco sequências de CDR não afeta enormemente a especificidade de ligação de tal Ab. Assim, os Abs da invenção que compreendem 6 CDRs podem ser definidos através da especificação da sequência de um domínio de CDR3 de cadeia pesada.

[0082] Os Abs anti-PD-1 da invenção também incluem Abs isolados que se ligam especificamente ao PD-1 humano e competem de forma cruzada pela ligação ao PD-1 humano com qualquer um dos HuMAbs 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 e 5F4. Assim, os Abs anti- PD-1 da invenção incluem Abs isolados ou porções que se ligam ao antígeno dos mesmos que competem de forma cruzada pela ligação ao PD-1 com um Ab de referência ou uma porção que se liga ao antí- geno de referência do mesmo que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 1 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 8; (b) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 2 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 9; (c) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 3 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 10; (d) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 4 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 11; (e) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 5 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 12; (f) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 6 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 13; ou (g) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 7 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 14.

[0083] A capacidade dos Abs de competir de forma cruzada pela ligação a um antígeno indica que estes Abs se ligam à mesma região de epitopo (isto é, o mesmo epitopo ou um sobreposto ou adjacente) do antígeno e impedem de forma espacial a ligação de outros Abs que competem de forma cruzada a tal região particular do epitopo. Assim, a capacidade de um Ab de teste de inibir de forma competitiva a ligação, por exemplo, de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 ou 5F4, ao PD- 1 humano demonstra que o Ab de teste se liga à mesma região de epi- topo do PD-1 humano que 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 ou 5F4, respectivamente. Todos os Abs isolados que se ligam à mesma região de epitopo de PD-1 humano como faz HuMAb 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 ou 5F4 são incluídos entre os Abs da invenção. É esperado que estes Abs que competem de forma cruzada possuam similar propriedades funcionais muito similares em virtude de sua ligação à mesma região de epitopo de PD-1. Por exemplo, foi mostrado que os mAbs anti-PD-1 que competem de forma cruzada 5C4, 2D3, 7D3, 4H1 e 17D8 possuem propriedades funcionais similares (ver a Patente U.S. N°. 8.008.449 nos Exemplos 3-7). Quanto maior o grau de competição cruzada, mais similares serão as propriedades funcionais. Adicionalmente, os Abs que competem de forma cruzada podem ser facilmente identificados com base em sua capacidade de competir de forma cruzada com 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 ou 5F4 em ensaios de ligação ao PD-1 padronizados. Por exemplo, a análise de Biacore, os ensaios de ELISA ou a citometria de fluxo pode ser utilizada para de- monstrar a competição cruzada com os Abs da invenção (ver, por exemplo, os Exemplos 1 e 2).

[0084] Em certas modalidades, os Abs que competem de forma cruzada pela ligação ao PD-1 humano com ou se ligam à mesma região de epitopo de PD-1 humano que, 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 ou 5F4 são mAbs. Para a administração a pacientes humanos, estes Abs que competem de forma cruzada são preferencialmente Abs quiméricosou mais preferencialmente Abs humanizados ou humanos. Tais mAbs humanos podem ser preparados e isolados como descrito na Patente U.S. N°. 8.008.449. Os dados fornecidos no Exemplo 1 mostram que 5C4 ou um fragmento Fab do mesmo compete de forma cruzada com cada um de 2D3, 7D3, 4H1 ou 17D8 pela ligação ao hPD-1 expresso na superfície de uma célula, indicando que todos os cinco mAbs anti-PD-1 se ligam à mesma região de epitopo de hPD-1 (Figuras 1A-1C).

[0085] Um Ab anti-PD-1 da invenção pode ser adicionalmente preparado utilizando um Ab que possui uma ou mais das sequências de VH e/ou VL divulgadas aqui como material de partida para engenheirar um Ab modificado, cujo Ab modificado pode ter propriedades alteradas partindo do Ab inicial. Um Ab pode ser engenheirado através da modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões estruturais. Adicionalmente ou alternativamente, um Ab pode ser engenheirado através da modificação de resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do Ab. As modificações específicas nos Abs incluem enxerto de CDR, mutação específica para o sítio de resíduos de aminoácidos dentro das regiões de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VK para dessa maneira aprimorar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do Ab, mutação específica para o sítio de resíduos de aminoácidos dentro das regiões estruturais de VH e/ou VK para diminuir a imunogenicidade do Ab, mo-dificações dentro da regiãod de Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do Ab, tais como meia-vida no soro, fixação do complemento, ligação ao receptor de Fc e/ou citotoxicidade celular dependente do antígeno e modificação química tal como peguila- ção ou alteração nos padrões de glicosilação para aumentar ou para diminuir a meia-vida biológica (por exemplo, no soro) do Ab. Os exemplos específicos de tais modificações e métodos de engenharia de Abs são descritos em detalhes na Patente U.S. N°. 8.008.449. Os Abs anti- PD-1 da invenção incluem todos tais Abs engenheirados que se ligam especificamente ao PD-1 humano e são obtidos através da modificação de qualquer um dos Abs anti-PD-1 descritos anteriormente.

[0086] Os Abs anti-PD-1 da invenção também incluem porções que se ligam ao antígeno dos Abs anteriores. Foi amplamente demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um Ab pode ser realizada por fragmentos de um Ab de comprimento completo. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "porção que se liga ao antígeno" de um Ab incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios de VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios de VH e CH1; e (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios de VL e VH de um único braço de um Ab.

[0087] Estes fragmentos, obtidos inicialmente através da proteólise com enzimas tais como papaína e pepsina, foram subsequentemente engenheirados dentro de fragmentos monovalentes e multivalentes de ligação ao antígeno. Por exemplo, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, estes po- dem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, por um peptídeo ligante sintético que possibilita que estes sejam produzidos na forma de uma única cadeia de proteína em que as regiões de VL e VH se pa- reiam para formar moléculas monovalentes conhecidas como fragmen-tosvariáveis de cadeia isolada (scFv). Os scFvs divalentes ou bivalentes (di-scFvs ou bi-scFvs) podem ser engenheirados através da ligação de dois scFvs dentro de uma cadeia peptídica isolada conhecidas como um scFv em tandem que contém duas regiões VH e duas VL. Dímeros de scFv e multímeros superiores também podem ser criados utilizando peptídeos ligantes de menos que 10 aminoácidos que são muito curtos para que as duas regiões variáveis se dobrem juntas, o que força os scFvs a se dimerizarem e produzirem diabodies ou formarem outros multímeros. Foi mostrado que os diabodies se ligam a seu antígeno cognato com afinidade muito mais alta que os scFvs correspondentes, que possuem constantes de dissociação até 40 vezes menores que os valores de KD para os scFvs. Ligantes muito curtos (< 3 aminoácidos) levam à formação de triabodies trivalentes ou tetrabodies tetravalentes que exibem afinidades ainda mais altas por seus antí- genos que os diabodies. Outros variantes incluem minibodies, que são dímeros de scFv-CH3 e fragmentos de scFv-Fc maiores (dímeros de scFv-CH2-CH3) e ainda uma CDR isolada pode exibir função de ligação ao antígeno. Estes fragmentos de Ab são engenheirados utilizando técnicas recombinantes convencionais conhecidas pelos versados na técnica e os fragmentos são verificados em relação à utilidade da mesma maneira que são os Abs intactos. É pretendido que todos os fragmentos de Abs proteolíticos e engenheirados anteriores e variantes relacionados (ver Hollinger e Hudson, 2005; Olafsen e Wu, 2010, para mais detalhes) sejam abrangidos dentro do termo "porção que se liga ao antígeno" de um Ab. Anticorpos Anti-PD-L1 da Invenção

[0088] Foi mostrado que cada um dos HuMAbs anti-PD-L1 divulgados na Patente U.S. N°. 7.943.743 exibe uma ou mais das características a seguir (a) se liga ao PD-L1 humano com uma KD de 1 x 10-7 M ou menor; (b) aumenta a proliferação de células T em um ensaio de Reação de Linfócitos Mistos (MLR); (c) aumenta a produção de interfe- ron-Y em um ensaio de MLR; (d) aumenta a secreção de IL-2 em um ensaio de MLR; (e) estimula respostas de Ab; (f) inibe a ligação de PD- L1 ao PD-1; e (g) reverte o efeito supressor de células reguladoras T sobre células efetoras de células T e/ou células dendríticas. Os Abs anti-PD-L1 da presente invenção incluem mAbs que se ligam especificamente ao PD-L1 humano e exibem pelo menos uma, preferencialmente pelo menos quatro, das características anteriores.

[0089] A Patente U.S. N°. 7.943.743 exemplifica dez HuMAbs anti- PD-1: 3G10, 12A4 (também referido aqui como BMS-936559), 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4. Moléculas de DNA isoladas que codificam as regiões variáveis de cadeias pesadas e leves destes Abs foram sequenciadas, partindo das quais as sequências de aminoácidos das regiões variáveis foram deduzidas. As sequências de aminoácidos de VH de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4 são mostradas nas SEQ ID NOs. 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24, respectivamente, enquanto que suas sequências de aminoácidos de VL são mostradas nas SEQ ID NOs. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34, respectivamente.

[0090] Os Abs anti-PD-L1 preferidos da presente invenção incluem os HuMAbs anti-PD-L1 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4. Estes Abs preferidos se ligam especificamente ao PD-L1 humano e compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 15 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos liga- dos consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 25; (b) uma região variável de cadeia pesada humana que com-preende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a se-quência apresentada na SEQ ID N°: 16 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 26; (c) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende ami- noácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 17 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 27; (d) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 18 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 28; (e) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 19 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 29; (f) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 20 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 30; (g) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende ami- noácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 21 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 31; (h) uma região vari ável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 22 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 32; (i) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 23 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 33; ou (j) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 24 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 34.

[0091] Dado que cada um destes Abs pode se ligar ao PD-L1, as sequências de VH e VL podem ser "misturadas e combinadas" para criar outros Abs anti-PD-L1 da invenção. A ligação ao PD-L1 de tais Abs "misturados e combinados" pode ser testada utilizando ensaios de li-gação, por exemplo, ELISAs, western blots, ensaios radioimunológicos e análise de Biacore que são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a Patente U.S. N°. 7.943.743). Preferencialmente, quando as cadeias de VH e VL são misturadas e combinadas, uma sequência de VH de um pareamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência de VH estruturalmente similar. Similarmente, preferencialmente uma sequência de VL de um pareamento de VH/VL particular é substituída por uma sequência de VL estruturalmente similar. Consequentemente, os Abs da invenção também incluem um mAb ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo, que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs. 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados conse-cutivamente que possuem a sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, em que o Ab se liga especificamente ao PD-L1, preferencialmente ao PD-L1 humaN°.

[0092] Os domínios de CDR dos HuMAbs anti-PD-L1 anteriores foram delineados utilizando o sistema de Kabat e estes Abs também podem ser definidos por combinações de suas 3 CDRs de cadeia pesada e 3 de cadeia leve (ver a Patente U.S. N°. 7.943.743). Uma vez que cada um destes Abs pode se ligar ao PD-L1 e a especificidade de ligação ao antígeno é fornecida primariamente pelas regiões de CDR1, CDR2 e CDR3, as sequências de VH de CDR1, CDR2 e CDR3 e as sequências de VK de CDR1, CDR2 e CDR3 podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDRs de Abs diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada Ab tenha que conter uma CDR1, CDR2 e CDR3 de VH e uma CDR1, CDR2 e CDR3 de Vk) para criar outros Abs anti-PD-1 que também constituem os Abs da invenção. A ligação ao PD-L1 de tais Abs "misturados e combinados" pode ser testada utilizando, por exemplo, ELISAs, western blots, ensaios radioimunológicos e análise de Biacore.

[0093] Os anticorpos da invenção também incluem Abs que se ligam especificamente ao PD-L1 e compreendem uma região variável de cadeia pesada derivada de uma imunoglobulina de cadeia pesada de linhagem germinativa particular e/ou uma região variável de cadeia leve derivada de uma imunoglobulina de cadeia leve de linhagem ger- minativa particular. Especificamente, em certas modalidades, os Abs da invenção incluem Abs que compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 1-18, 1-69, 1-3 ou 3-9 e/ou uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma se-quência de linhagem germinativa humana de VK L6, L15, A27 ou L18. As sequências de aminoácidos das regiões de VH e VK codificadas pelos genes de linhagem germinativa de VH 1-18, VH 1-3, VH 1-69, VH39, VK L6, VK L15 e VK A27 são fornecidas na Patente U.S. N°. 7.943.743.

[0094] Os Abs preferidos da invenção incluem Abs isolados ou porções que se ligam ao antígeno dos mesmos que compreendem: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 1-18 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma se-quência de linhagem germinativa humana de Vk L6; (b) uma região va-riável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados conse-cutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 1-69 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de Vk L6; (c) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germi- nativa humana de VH 1-3 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de Vk L15; (d) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 1-69 e uma região variável de cadeia leve que compre-endeaminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VK A27; (e) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH39 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VK L15; ou (f) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 3-9 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados conse-cutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VK L18.

[0095] Um exemplo de um Ab que possui uma VH e uma VK derivadas das sequências de linhagem germinativa de VH 1-18 e de VK L6, respectivamente, é 3G10. Os exemplos de Abs que possuem regiões de VH e VK derivadas de sequências de linhagem germinativa de VH169 e de VK L6, respectivamente, incluem 12A4, 1B12, 7H1 e 12B7. Um exemplo de um Ab que possui uma VH e uma VK derivadas de sequências de linhagem germinativa de VH 1-3 e de VK L15, respectivamente, é 10A5. Os exemplos de Abs que possuem regiões de VH e VK derivadas de sequências de linhagem germinativa de VH 1-69 e de VK A27, respectivamente, incluem 5F8, 11E6 e 11E6a. Um exemplo de um Ab que possui uma VH e uma VK derivada de sequências de linhagem germinativa de VH 3-9 e de VK L15, respectivamente, é 10H10. Um exemplo de um Ab que possui uma VH e uma VK derivadas de sequências de linhagem germinativa de VH 1-3 e de VK L15, respectivamente, é 10A5. Um exemplo de um Ab que possui uma VH e uma VK derivadas de sequências de linhagem germinativa de VH 3-9 e de VK L18, respec-tivamente,é 13G4.

[0096] Em certas modalidades, os Abs anti-PD-L1 da invenção compreendem regiões variáveis de cadeias pesadas e leves que pos-suemsequências de aminoácidos que são altamente similares ou ho-mólogas às sequências de aminoácidos dos Abs anti-PD-L1 preferidos descritos aqui, em que o Ab mantém as propriedades funcionais dos Abs anti-PD-L1 mencionados anteriormente da invenção. Por exemplo, os Abs da invenção incluem mAbs que compreendem uma região variávelde cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs. 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 e 24 e a região variável de cadeia leve compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34. Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos de VH e/ou de VL podem exibir pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade em relação às sequências apresentadas anteriormente.

[0097] Certas modalidades dos Abs anti-PD-L1 da invenção com-preendemregiões variáveis de cadeias pesadas e leves cada uma compreendendo domínios de CDR1, CDR2 e CDR3, em que um ou mais destes domínios de CDR compreendem aminoácidos ligados consecutivamente que possuem sequências que são as mesmas que as sequências de CDR dos Abs anti-PD-L1 preferidos descritos aqui (por exemplo, 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4) ou modificações conservativas das mesmas e em que os Abs mantêm as propriedades funcionais desejadas dos Abs anti-PD-L1 preferidos da invenção.

[0098] Com base na evidência de que a CDR3 de cadeia pesada é o determinante primário de especificidade de ligação e afinidade de um Ab, é geralmente verdadeiro que uma vez que a sequência de CDR3 de cadeia pesada de certo Ab é definida, a variabilidade nas outras cinco sequências de CDR não afetará muito a especificidade de ligação de tal Ab. Consequentemente, os Abs anti-PD-L1 da invenção incluem Abs isolados que compreendem 6 CDRs, em que os Abs são definidos através da especificação da sequência de um domínio de CDR3 de cadeia pesada.

[0099] Os Abs anti-PD-L1 da invenção também incluem Abs isolados que se ligam especificamente ao PD-L1 humano e competem de forma cruzada pela ligação ao PD-L1 humano com qualquer um dos HuMAbs 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4. Assim, os Abs anti-PD-L1 da invenção incluem Abs isolados ou porções que se ligam ao antígeno dos mesmos que competem de forma cruzada pela ligação ao PD-L1 com um Ab de referência ou uma porção que se liga ao antígeno de referência do mesmo que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreendeaminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 15 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 25; (b) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 16 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 26; (c) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 17 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoá- cidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 27; (d) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuema sequência apresentada na SEQ ID N°: 18 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamenteque possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 28; (e) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 19 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 29; (f) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 20 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 30; (g) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 21 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoá- cidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 31; (h) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 22 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 32; (i) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 23 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 33; ou (j) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 24 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 34.

[00100] A capacidade de um Ab de competir de forma cruzada com qualquer um de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4 pela ligação ao PD-L1 humano demonstra que tal Ab se liga à mesma região de epitopo de cada um de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4, respectivamente. Todos os Abs isolados que se ligam à mesma região de epitopo de PD-L1 humano que se liga o HuMAb 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 ou 13G4 são incluídos entre os Abs da invenção. É esperado que estes Abs que competem de forma cruzada tenham propriedades funcionais muito similares em virtude de sua ligação à mesma região de epitopo de PD-L1. Por exemplo, foi mostrado que os mAbs que competem de forma cruzada anti-PD-L1 3G10, 1B12, 13G4, 12A4 (BMS-936559), 10A5, 12B7, 11E6 e 5F8 possuem propriedades funcionais similares (ver a Patente U.S. N°. 7.943.743 nos Exemplos 311), enquanto que o mAb 10H10, que se liga a uma região de epitopo diferente, se comporta diferentemente (Patente U.S. N°. 7.943.743 no Exemplo 11). Quanto maior o grau de competição cruzada, mais similares serão as propriedades funcionais. Adicionalmente, os Abs que competem de forma cruzada podem ser identificados em ensaios de ligação ao PD-L1 padronizados, por exemplo, análise de Biacore, ensaios de ELISA ou citometria de fluxo, que são bem conhecidos pelos versados na técnica. Em modalidades preferidas, os Abs que competem de forma cruzada pela ligação ao PD-1 humano com ou se ligam à mesma região de epitopo de PD-L1 humano que, 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 ou 13G4 são mAbs, preferenci-almente Abs quiméricos ou mais preferencialmente Abs humanizados ou humanos. Tais mAbs humanos podem ser preparados e isolados como descrito na Patente U.S. N°. 7.943.743.

[00101] Os dados fornecidos no Exemplo 2 mostram que cada um dos HuMAbs anti-PD-L1 5F8, 7H1, 1B12, 3G10, 10A5, 11E6, 12A4, 12B7 e 13G4, isto é, todos os HuMAbs testados exceto 10H10, bloqueou substancialmente a ligação dos mAbs 3G10, 10A5, 11E6, 12A4 e 13G4 às células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) expressando células com PD-L1. O HuMAb 10H10 bloqueou substancialmente a ligação apenas dele mesmo às células CHO/PD-L1. Estes dados mostram que 3G10, 10A5, 11E6, 12A4 e 13G4 competem de forma cruzada com todos os HuMAbs testados, exceto para 10H10, pela ligação à mesma região de epitopo de PD-L1 humano (Figuras 2A-F).

[00102] Os dados fornecidos no Exemplo 3 mostram que a ligação de HuMAb 12A4 às células de carcinoma de ovário ES-2 expressando células com PD-L1 foi substancialmente bloqueada pelo próprio 12A4 e por 1B12 e 12B7 e foi moderadamente até significativamente bloqueada pelos mAbs 5F8, 10A5, 13G4 e 3G10, mas não foi bloqueada pelo mAb 10H10. Estes dados, bastante coerentes com os dados no Exemplo 2, mostram que 12A4 por si só e 2 outros HuMabs, 12B7 e 1B12, substancialmente competem de forma cruzada com 12A4 pela ligação à mesma região de epitopo, possivelmente o mesmo epitopo, de PD-L1 humano; 5F8, 10A5, 13G4 e 3G10, exibem um nível de competição cruzada significativo, mas inferior com 12A4, sugerindo que estes mAbs podem ser ligar a epitopos que se sobrepõem ao epi- topo 12A4; enquanto que 10H10 não compete de forma cruzada de forma alguma com 12A4 (Figura 3), sugerindo que este mAb se liga a uma região de epitopo diferente de 12A4.

[00103] Os Abs anti-PD-L1 da invenção também incluem Abs enge- nheirados partindo de Abs que possuem uma ou mais das sequências de VH e/ou de VL divulgadas aqui, cujos Abs engenheirados podem ter propriedades alteradas partindo dos Abs iniciais. Um Ab anti-PD-L1 pode ser engenheirado através de uma variedade de modificações que são descritas anteriormente para a engenharia de Abs anti-PD-1 modificados da invenção.

[00104] Os Abs anti-PD-L1 da invenção também incluem Abs isolados selecionados em relação à sua capacidade de se ligar ao PD-L1 em espécimês de tecido incrustados em parafina fixados em formalina (FFPE). O uso de amostras FFPE é essencial para a análise de acom-panhamento em longo prazo da correlação entre a expressão de PD- L1 em tumores e o prognóstico ou a progressão da doença. Ainda, estudos sobre a medida da expressão de PD-L1 foram frequentemente conduzidos em espécimes congelados por cauas da dificuldade de isolar Abs anti-PD-L1 humanos que podem ser utilizados para corar PD- L1 em espécimes FFPE por IHC em geral (Hamanishi e outros, 2007) e, em particular, Abs que se ligam especificamente ao PD-L1 membra- noso nestes tecidos. O uso de Abs diferentes para corar PD-L1 em tecidos congelados versus FFPE e a capacidade de certos Abs de distinguir as formas membranosas e/ou citoplasmáticas de PD-L1, podem ser responsáveis por alguns dos dados discrepantes relatados na literatura correlacionando a expressão de PD-L1 com o prognóstico da doença (Hamanishi e outros, 2007; Gadiot e outros, 2011). Esta descrição fornece vários mAbs de coelho que se ligam com alta afinidade especificamente ao PD-L1 humano membranoso em amostras de tecido FFPE que compreendem células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor.

[00105] Os mAbs anti-hPD-L1 de coelho e de camundongo foram produzidos como descrito no Exemplo 9. De quase 200 multiclones de Ab verificados, foi observado que apenas dez Abs de multiclones de coelho detectam especificamente a forma membranosa de PD-L1 e os cinco multiclones principais (designados Nos. 13, 20, 28, 29 e 49) foram subsequentemente subclonados. O clone que produziu a detecção mais robusta especificamente de PD-L1 membranoso, o clone de coelho 28-8, foi selecionado para os ensaios de IHC. As sequências das regiões variáveis do mAb 28-8 são apresentadas nas SEQ ID NOs. 35 e 36, respectivamente. As sequências dos domínios de CDR de cadeias pesadas e leves do mAb 28-8, que são descritas utilizando o sistema de Kabat, são apresentadas nas SEQ ID NOs. 37-42. Os clones de coelho 28-1, 28-12, 29-8 e 20-12 eram os melhores mAbs seguintes em termos de detecção robusta de PD-L1 membranoso em tecidos FFPE.

[00106] Os Abs anti-PD-L1 da invenção também incluem porções que se ligam ao antígeno dos Abs anteriores, incluindo Fab, F(ab’)2 Fd, Fv e scFv, di-scFv ou bi-scFv e fragmentos scFv-Fc, diabodies, triabo- dies, tetrabodies e CDRs isoladas (ver Hollinger e Hudson, 2005; Ola- fsen e Wu, 2010, para mais detalhes). Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam os Anticorpos da Invenção

[00107] Outro aspecto da presente descrição refere-se a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam qualquer um dos Abs da invenção. Estes ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado de células ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências in- trônicas. Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico é um cDNA.

[00108] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos utilizandotécnicas de biologia molecular padronizadas. Para os Abs expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados partindo de camundongos transgênicos que carregam genes de imunoglobulina humana como descrito adicionalmente a seguir), os cDNAs que codifi- cam as cadeias leves e pesadas do Ab produzido pelo hibridoma podem ser obtidos através da amplificação por PCR padronizada ou através de técnicas de clonagem de cDNA. Os ácidos nucleicos que codificam os Abs obtidos partindo de uma biblioteca de genes de imu- noglobulina (por exemplo, utilizando técnicas de exibição em fagos) podem ser recuperados partindo da biblioteca.

[00109] As moléculas de ácido nucleico preferidas da invenção são aquelas que codificam as sequências de VH ede VK dos HuMAbs anti- PD-1, 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 e 5F4 (divulgados na Patente U.S. N°. 8.008.449) e aquelas que codificam as sequências de VH e de Vk dos HuMAbs anti-PD-L1, 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4 (divulgados na Patente U.S. N°. 7.943.743). Um DNA isolado que codifica a região de VH pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento completo através da ligação de forma operacional do DNA que codifica VH com outra molécula de DNA que codifica as regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3), cujas sequências são conhecidas na técnica e podem ser obtidas através da amplificação por PCR padronizada. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas é preferencialmente uma região constante de IgG1 ou IgG4. Similarmente, um DNA isolado que codifica a região de VL pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento completo através da ligação de forma operacional do DNA que codifica VL com outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve (CL), cuja sequência é conhecida na técnica e pode ser obtida através da amplificação por PCR padronizada. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante Kappa ou lambda, mas mais preferencialmente é uma região constante Kappa. Composições Farmacêuticas

[00110] Os anticorpos da presente invenção podem ser constituídos em uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, que contém um Ab ou uma combinação de Abs ou porção(ões) que se li- ga(m) ao antígeno dos mesmos e um veículo farmaceuticamente acei-tável. Como é utilizado aqui, um "veículo farmaceuticamente aceitável"inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúgicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Preferencialmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, através de injeção ou infusão). Uma composição farmacêutica da invenção pode incluir um ou mais sais, antioxidante, aquosos e não aquosos veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsifi- cantes e agentes de dispersão.

[00111] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a resposta desejada ótima, por exemplo, uma resposta terapêutica ou efeitos adversos mínimos. Para a administração de um Ab anti-PD-1 ou anti-PD-L1, a dosagem varia desde aproximadamente 0,0001 até aproximadamente 100 mg/kg, geralmente desde aproximadamente 0,001 até aproximadamente 20 mg/kg e mais geralmente desde apro-ximadamente 0,01 até aproximadamente 10 mg/kg, do peso corporal do indivíduo. Preferencialmente, a dosagem fica dentro da faixa de 0,1-10 mg/kg de peso corporal. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,1, 0,3, 1, 3, 5 ou 10 mg/kg de peso corporal e mais preferencialmente, 0,3, 1, 3 ou 10 mg/kg de peso corporal. A programação de dosagemé tipicamente planejada para atingir exposições que resultam na ocupação do receptor (RO) prolongada com base nas propriedades farmacocinéticas típicas de um Ab. Um exemplo de regime de tratamento envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez ao mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três até 6 meses. A dosagem e a programação podem mudar durante um curso de tratamento. Por exemplo, a programação de dosagem pode compreender a administração do Ab: (i) a cada duas semanas em ciclos de 6 semanas; (ii) a cada quatro semanas durante seis dosagens, então a cada três meses; (iii) a cada três semanas; (iv) 3-10 mg/kg de peso corporal uma vez seguidos por 1 mg/kg de peso corporal a cada 2-3 semanas. Considerando que um Ab de IgG4 tipicamente possui uma meia-vida de 2-3 semanas, um regime de dosagem preferido para um Ab anti-PD-1 ou anti-PD-L1 da invenção compreende 0,3-10 mg/kg de peso corporal, preferencialmente 3-10 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente 3 mg/kg de peso corporal através de administração intravenosa, com o Ab sendo fornecido a cada 14 dias em ciclos de até 6 semanas ou 12 semanas até resposta completa ou doença progressiva confirmada.

[00112] Em alguns métodos, dois ou mais mAbs com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada Ab administrado se encaixa dentro das faixas indicadas. O anticorpo é geralmente administrado em várias ocasiões. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanais, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensais, a cada três meses ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares como é indicado através da medida dos níveis de Ab no sangue para o antíge- no alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de Ab no plasma de aproximadamente 11000 µg/mL e em alguns métodos de aproximadamente 25-300 µg/mL.

[00113] Alternativamente, o Ab pode ser administrado na forma de uma formulação de liberação controlada, em cujo caso uma administração menos frequente é necessária. A dosagem e a frequência vari- am dependendo da meia-vida do Ab no paciente. Em geral, os Abs humanos mostram a meia-vida mais longa, seguidos por Abs humani-zados, Abs quiméricos e Abs não humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo do fato do tratamento ser profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é tipicamente administrada em intervalos relativa-mente infrequentes durante um período de tempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Nas aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é algumas vezes necessária até a progressão da doença é reduzida ou terminada e preferencialmente até o paciente mostrar melhora parcial ou completa de sintomas da doença. Depois disso, o paciente pode receber a administração de um regime profilático.

[00114] Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de forma a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficiente para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, uma composição e um modo de administração particular, sem ser desne-cessariamentetóxica para o paciente. O nível de dosagem seleciona-dodependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção em-pregadas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que será empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e o histórico médico prévio do paciente que será tratado e fatores similares bem conhecidos nas ar-tesmédicas. Uma composição da presente invenção pode ser admi-nistradaatravés de uma ou mais vias de administração utilizando uma ou mais de uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Como será considerado pelo versado na técnica, a via e/ou o modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Usos e Métodos da Invenção

[00115] Os Abs, as composições de Ab, os ácidos nucleicos e os métodos da presente invenção possuem numerosas utilidades in vitro e in vivo incluindo, por exemplo, métodos para determinar e quantificar a expressão de PD-1 ou PD-L1 que compreendem a ligação dos Abs aos polipeptídeos alvos ou a medida da quantidade de ácido nucleico que codifica estes polipeptídeos e um método para imunoterapia de um indivíduo afligido com uma doença que compreende a administração ao indivíduo de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente terapêutico que inibe a sinalização partindo de um imunorregulador inibidor. Em modalidades preferidas do último método, o imunorregulador inibidor é um componente da via de sinalização de PD-1/PD-L1 e o agente terapêutico interrompe a sinalização desta via. Mais preferencialmente, o agente terapêutico é um Ab que interfere com a interação entre PD-1 e PD-L1. Em certas modalidades preferidas deste método, o Ab se liga especificamente ao PD-1 e bloqueia a interação de PD-1 com PD-L1 e/ou PD- L2. Em outras modalidades preferidas, o agente terapêutico é um Ab que se liga especificamente ao PD-L1 e bloqueia a interação de PD-L1 com PD-1 e/ou B7-1 (CD80). Assim, esta descrição fornece métodos para potencializar uma resposta imunológica em um indivíduo que compreende a administração de um Ab anti- PD-1 e/ou um anti-PD-L1 com a finalidade de interromper a interação entre PD-1 e PD-L1 e métodos de tratamento de doenças mediados por tal potencialização da resposta imunológica. Quando Abs para PD-1 e para PD-L1 são administrados juntos, os dois podem ser administrados sequencialmente em qualquer ordem ou simultaneamente. Em certos aspectos, esta descrição fornece métodos de modificação de uma resposta imunoló- gica em um indivíduo que compreendem a administração ao indivíduo de um Ab anti-PD-1 e/ou um anti-PD-L1 da invenção ou porção que se liga ao antígeno do mesmo, de forma que a resposta imunológica no indivíduo seja modificada. Preferencialmente, a resposta imunológica é potencializada, intensificada, estimulada ou regulada para mais. Em modalidades preferidas, os Abs da presente invenção são Abs humanos.

[00116] Os indivíduos preferidos incluem pacientes humanos que necessitam de aprimoramento de uma resposta imunológica. Os mé-todosimunoterapêuticos divulgados aqui são particularmente adequados para o tratamento de pacientes humanos que possuem um distúrbio que pode ser tratado pelo aumento da potência de uma resposta imunológica mediada por células T. Em certas modalidades, os métodossão empregados para o tratamento de indivíduos afligidos com uma doença causada por um agente infeccioso. Em modalidades preferidas, os métodos são empregados para o tratamento de indivíduos afligidos com ou em risco de ser afligidos com um câncer.

Imunoterapia para Câncer

[00117] Foi mostrado que o bloqueio da interação PD-1/PD-L1 po-tencializa respostas imunológicas in vitro (Patentes U.S. Nos. 8.008.449 e 7.943.743; Fife e outros, 2009) e medeia a atividade antitumor pré-clínica (Dong e outros, 2002; Iwai e outros, 2002). Entretanto, as interações moleculares potencialmente bloqueadas por estes dois Abs não são idênticas: os Abs anti-PD-1 da invenção interrompem PD-1/PD-L1 e potencialmente as interações PD-1/PD-L2; em contraste, enquanto que os Abs anti-PD-L1 da invenção também interrompem as interações PD-1/PD-L1, estes não bloqueiam as interações PD- 1/PD-L2, mas, ao invés disso, podem interromper a interação de PD- L1/CD80 independente de PD-1, que também foi mostrada como regu- lando para menos as respostas de células T in vitro e in vivo (Park e outros, 2010; Paterson e outros, 2011; Yang e outros, 2011; Butte e outros, 2007; Butte e outros, 2008). Assim, é possível que entre estes pareamentos de ligante-receptor variados, interações diferentes podem dominar em tipos de câncer diferentes, contribuindo para perfis de atividade dissimilares para os dois Abs.

[00118] A interrupção da interação PD-1/PD-L1 por Abs antagonistas pode aumentar a resposta imunológica para células cancerosas em um paciente. O PD-L1 não é expresso em células humanas normais, mas é abundante em uma variedade de cânceres humanos (Dong e outros, 2002). A interação entre PD-1 e PD-L1 enfraquece as respostas de células T que são manifestadas por um decréscimo nos linfócitos que se infiltram no tumor (TILs) e um decréscimo na proliferação mediada por receptor de células T, resultando na anergia, na exaustão ou na apoptose de células T e na evasão imunológica pelas células cancerosas (Zou e Chen, 2008; Blank e outros, 2005; Konishi e outros, 2004; Dong e outros, 2003; Iwai e outros, 2002). A supressão imunológica pode ser revertida através da inibição da interação local entre PD-L1 e PD-1 utilizando um Ab anti-PD-1 e/ou um anti-PD-L1. Estes Abs podem ser utilizados isoladamente ou em combinação para inibir o crescimento de tumores cancerosos. Em adição, qualquer um ou ambos estes Abs podem ser utilizados em associação com outros agentes imunogênicos e/ou anticâncer incluindo citocinas, quimioterapias para câncer padronizadas, vacinas, radiação, cirurgia ou outros Abs.

Imunoterapia de Pacientes com Câncer Utilizando um Anticorpo Anti- PD-1

[00119] Esta descrição fornece um método para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma composição que compreende uma quanti- dade terapeuticamente eficiente de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que interrompe a interação de PD-1 com PD- L1 e/ou PD-L2. Esta descrição fornece ainda um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que interrompe a interação de PD-1 com PD-L1 e/ou PD-L2 em uma quantidade eficiente para inibir o crescimento das células tumorais. Em modalidades preferidas, o indivíduo é um ser humano. Em outras modalidades preferidas, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo é um Ab anti-PD-1 da invenção ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. Em certas modalidades, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo é de um isotipo IgG1 ou IgG4. Em outras modalidades, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo é um mAb ou uma porção que se liga ao antí- geno do mesmo. Em modalidades adicionais, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo é um Ab quimérico, humanizado ou humano ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. Em modalidades preferidas para o tratamento de um paciente humano, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo é um Ab humano ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo.

[00120] Os testes clínicos descritos nos Exemplos empregavam o HuMAb anti-PD-1, nivolumab (designado 5C4 na Patente U.S. N°. 8.008.449), para tratar câncer. Embora 5C4 tenha sido selecionado como o Ab principal para ser inserido na clínica, é notável que vários Abs anti-PD-1 da invenção compartilham com 5C4 propriedades funcionais que são importantes para a atividade terapêutica de 5C4, incluindo a ligação de alta afinidade especificamente ao PD-1 humano, o aumento na proliferação de células T, a secreção de IL-2 e a produção de interferon-Y em um ensaio de MLR, a inibição da ligação de PD-L1 e/ou de PD-L2 a PD-1 e a inibição do crescimento de células tumorais in vivo. Além disso, certos dos Abs anti-PD-1 da invenção, 17D8, 2D3, 4H1 e 7D3 são estruturalmente relacionados ao 5C4 pelo fato de que compreendem regiões de VH ede VK que possuem sequências derivadas de sequências de linhagem germinativa de VH 3-33 e de VK L6, respectivamente. Em adição, 5C4, 2D3, 7D3, 4H1 e 17D8 competem todos de forma cruzada pela ligação à mesma região de epitopo de hPD-1 (Exemplo 1). Assim, a caracterização pré-clínica de nivolumab e outros HuMAbs anti-PD-1 indica que os métodos de tratamento de câncer fornecidos aqui podem ser realizados utilizando Abs diferentes selecionados do gênero amplo de Abs anti-PD-1 da invenção.

[00121] Consequentemente, certas modalidades dos métodos de imunoterapia divulgados aqui compreendem a administração a um pa-ciente de um Ab anti-PD-1 ou porção que se liga ao antígeno do mesmo que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 3-33 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de Vk L6 ou (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH439 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de Vk L15.

[00122] Em certas outras modalidades, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo que é administrada ao paciente compete de forma cruzada pela ligação ao PD-1 com um Ab de referência ou uma porção que se liga ao antígeno de referência do mesmo que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 1 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 8; (b) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende ami- noácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 2 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 9; (c) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados conse-cutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 3 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoá- cidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 10; (d) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 4 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 11; (e) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 5 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 12; (f) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 6 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 13; ou (g) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 7 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 14. Em modalidades preferidas, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo compete de forma cruzada pela ligação ao PD-1 com nivolumab.

[00123] Em certas modalidades dos métodos de imunoterapia divulgados aqui, o Ab anti-PD-1 ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo administrada ao paciente compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 1 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende ami- noácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 8; (b) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 2 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 9; (c) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 3 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 10; (d) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 4 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 11; (e) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 5 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 12; (f) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 6 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 13; ou (g) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 7 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 14. Em modalidades preferidas, o Ab anti-PD-1 ou a porção que se liga ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoáci- dos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 4 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 11. Em outras modalidades preferidas, o Ab anti-PD-1 é nivolumab.

[00124] Em certas modalidades dos presentes métodos, o Ab anti- PD-1 é formulado para administração intravenosa. Em modalidades preferidas, o Ab é administrado de forma intravenosa em uma dose de 3 mg/kg ao longo de 60 minutos a cada 2 semanas. Tipicamente, o tratamento é continuado enquanto o benefício clínico é observado ou até a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra.

[00125] Nos testes clínicos de imunoterapia anti-PD-1 descritos nos Exemplos a seguir, ORs intrigantes com respostas clínicas duráveis, mesmo em pacientes fortemente pré-tratados, foram observadas ao longo de vários tipos de tumores incluindo uma proporção substancial de pacientes com NSCLC, MEL e RCC e em vários sítios de metásta- se incluindo fígado, pulmão, nódulos linfáticos e osso. MEL e RCC são considerados como sendo neoplasmas imunogênicos, que foram pre-viamente demonstrados como sendo capazes de responder à imunote- rapia para câncer, por exemplo, interferon-alfa e interleucina-2 tanto em MEL quanto em RCC (Eton e outros., 2002; Coppin e outros, 2005; McDermott e Atkins, 2006) e Ab anti-CTLA-4 em MEL (Hodi e outros, 2010). Em pacientes com MEL, ORRs significativas foram observadas com nivolumab ao longo de doses diferentes de 0,1, 0,3, 1, 3 ou 10 mg/kg com uma taxa de resposta geral de aproximadamente 31% e similarmente ORRs comparáveis de aproximadamente 30% foram observadas em pacientes com RCC tratados com doses de nivolumab de 1 ou 10 mg/kg (ver o Exemplo 7). Em contraste, a imunoterapia teve historicamente sucesso mínimo em câncer de pulmão. Esta falta de sucesso foi atribuída ao fato de NSCLC ser "não imunogênico"(ver, por exemplo, Holt e Disis, 2008; Holt e outros, 2011). A capacidade do câncer de pulmão de impedir o sistema imunológico resulta de vários fatores, incluindo a secreção de citocinas imunossupressoras, a perda de expressão de antígeno do complexo de histocompatibilidade principal e a coopção de vias inibidoras de células T (Dasanu e outros, 2012; Marincola e outros, 2000; Brahmer e outros, 2012).

[00126] Apesar da eficácia limitada da imunoterapia observada his-toricamente em câncer de pulmão e dos diversos mecanismos empre-gados pelas células de câncer de pulmão para evasão do ataque pelo sistema imunológico, várias vacinas de células tumorais (por exemplo, belagenpumatucel-L, uma vacina de célula inteira que bloqueia a ação de TGF-ß2) e vacinas à base de antígeno (por exemplo, uma vacina de EGF humoral e vacinas que incorporam uma proteína de fusão MAGE-A3 ou porções do antígeno MUC1 associado a tumor) que aumentam a imunidade antitumor específica para o antígeno estão sendo avaliadas em testes clínicos (Holt e outros, 2011; Shepherd e outros, 2011; Dasanu e outros, 2012; Brahmer e outros, 2012). Entretanto, embora tais vacinas específicas para o antígeno tenham mostrado al-guma promessa para o tratamento de NSCLC, Holt e outros (2011) observaram que testes envolvendo intervensões imunoterapêuticas não específicas falharam em aprimorar os resultados em NSCLC, que indicaram uma necessidade de combiná-las com vacinas específicas para o antígeno. Estes autores expressaram a visão de que uma imu- noterapia verdadeiramente eficaz de NSCLC não somente resultaria da implementação de estratégias tanto para aumentar a imunidade antitumor quanto para agir contra a imunossupressão mediada por tumor e concluíram que as respostas imunológicas inexistentes ou nascentes fracas nos pacientes com NSCLC tornam improvável que o estímulo não específico do sistema imunológico ou a remoção da imu- nossupressão produzisse alterações nos resultados clínicos.

[00127] Assim, os resultados relatados aqui com NSCLC são parti-cularmente impressionantes, inesperados e surpreendentes. Em paci-entes com NSCLC, as ORs foram observadas em doses de nivolumab de 1, 3 ou 10 mg/kg com taxas de resposta de 3%, 24% e 20%, res-pectivamente (ver o Exemplo 7). As ORs foram observadas ao longo das histologias de NSCLC: 9 capazes de resposta de 54 escamosas (17%) e 13 de 74 não escamosas (18%). Este nível de atividade observado com nivolumab em pacientes com NSCLC com terapia prévia significativa (54% com 3 linhas de terapia prévia) e ao longo das histologiasé sem precedentes, especialmente nos pacientes com histologia escamosa (cf. Gridelli e outros, 2008; Miller, 2006) e fornece uma dinâmica de benefício/risco muito favorável em relação à eficácia e à segurança comparada àquela de padrão de cuidado existente.

[00128] Em certas modalidades dos presentes métodos de imunote- rapia, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para NSCLC escamosas ou não escamoso avançado localmente ou metastático após terapia à base de platina (independentemente da manutenção) e outro tratamento. Em outras modalidades, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para NSCLC escamosas ou não escamoso avançado lo-calmente ou metastático após a falha da terapia à base de platina e outro regime de quimioterapia prévio. Em modalidades adicionais, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para NSCLC escamosas ou não escamoso avançado localmente ou metastático após a falha de duas linhas de terapia das quais uma tem que incluir regime à base de platina. Ainda em modalidades adicionais, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para NSCLC escamosas ou não escamoso avançado localmente ou metastático após pelo menos uma quimioterapia prévia, após a falha de pelo menos uma terapia à base de platina prévia ou após a progressão para pelo menos uma terapia dupla de platina. Em todos os métodos de imunoterapia divulgados aqui, o tratamento pode ser continuado enquanto for observado benefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra.

Durabilidade de respostas clínicas para anti-PD-1 em pacientes com câncer pré-tratados fortemente

[00129] A função crítica da via de PD-1 na supressão da imunidade antitumor, primeiramente revelada em modelos de laboratório, foi agora validada em estudos clínicos. Como descrito aqui, a monoterapia com fármacos que bloqueiam PD-1 (nivolumab) ou seu ligante principal PD-L1 (BMS-936559) pode mediar a regressão em pacientes com cânceres avançados refratários ao tratamento. A taxa de resposta objetiva (ORR) em pacientes com NSCLC fortemente pré-tratados recebendo Ab anti-PD-1, incluindo pacientes com histologia escamosa, é surpreendente e inesperada, uma vez que as terapias de salvamento padronizadas historicamente mostram benefício modesto nestes pacientes (Scagliotti e outros, 2011). Como são medidas através de RECIST padronizado neste estudo, as ORs tinha duração longa, com du- rações de resposta medianas de aproximadamente 18 meses em 22 de 129 capazes de resposta ((ver o Exemplo 7). Em adição, padrões de regressão de tumor coerentes com padrões de resposta relacionada ao sistema imunológico foram observados.

[00130] Estas descobertas estabeleceram a via de PD-1 como um novo foco terapêutico na oncologia (Pardoll, 2012; Topalian e outros, 2012c; Hamid e Carvajal, 2013). No presente estudo, em que 54% dos pacientes tinham doença progressiva após 3 ou mais regimes sistêmicosprévios, uma análise preliminar foi conduzida até março de 2013. Esta análise atualizada apoiou e reforçou os dados obtidos e as conclusões atingidas partindo das análises anteriores de fevereiro de 2012. Assim, ORs convencionais ou estabilização de doença prolongada foi documentada em pacientes com NSCLC (17% e 10%, respectivamente), MEL (31%, 7%) e RCC (29%, 27%), ao longo de todas as doses testadas (ver o Exemplo 7). Adicionalmente, 13 pacientes (4%) manifestaram padrões de resposta "relacionada ao sistema imunológi- co"não convencionais como descrito anteriormente com terapia anti- CTLA-4, dos quais vários foram sustentados (Sharma e outros, 2011).

[00131] A durabilidade de ORs ao longo de vários tipos de câncer em pacientes tratados com o Ab anti-PD-1 é particularmente notável. As análises atualizadas novamente ressaltaram a durabilidade da ati-vidadeclínica em pacientes tratados com nivolumab, que não era ge-ralmente observada com quimioterapia ou inibidores de molécula pe-quenaaté agora, mas tinha sido observada em alguns pacientes com melanoma avançado recebendo imunoterapias, incluindo ipilimumab e interleucina-2 em dose alta (Topalian e outros, 2011; Hodi e outros, 2010). A persistência de regressões parciais de tumor após a descon- tinuação do fármaco sugere que o bloqueio de PD-1 restaurou o equilíbrio imunológico entre o tumor e o hospedeiro e o benefício de OS pode em última análise provar ser significativamente mais longo do que foi medido até agora. Um acompanhamento adicional é necessário para determinar a durabilidade final de regressão de tumor e a es-tabilização da doença em pacientes nestes testes clínicos.

[00132] De forma significativa, a regressão de tumor de objetivo durável e a estabilização da doença induzidas por nivolumab em pacientes fortemente pré-tratados com NSCLC, MEL e RCC avançados se traduzem nos resultados de sobrevivência que superam os dados históricos para estas populações de pacientes tratadas com quimioterapia convencional e/ou tratamentos com inibidor de tirosina-quinase (TKI). No NSCLC, as taxas de sobrevivência de 1 e 2 anos eram de 42% e 14%, respectivamente, com OS mediana de 9,2 e 10,1 meses em pacientes com cânceres escamosos e não escamosos, respectivamente (ver o Exemplo 7). Este alto nível de eficácia é especialmente impressionante uma vez que 54% destes pacientes receberam 3 ou mais terapiasprévias. Além disso, devido ao fato de que o acompanhamento de muitos pacientes com câncer de pulmão era relativamente limitado, estes números podem ser alterados à medida que os dados se desenvolvem. Historicamente, agentes quimioterapêuticos 2L para câncer de pulmão (isto é, docetaxel e pemetrexed) atingiram uma OS mediana de 7,5-8,3 meses e taxas de sobrevivência em um ano de aproximadamente 30% (Shepherd e outros, 2000; Hanna e outros, 2004). Em uma população 2L/3L, pacientes tratados com erlotinib tiveram uma sobrevivência mediana de 6,7 meses, versus 4,7 meses em pacientes tratados com placebo (Shepherd e outros, 2005). Nenhuma terapia é aprovada atualmente para uso em câncer de pulmão além do ajuste de 3L e há dados mínimos para comparar a sobrevivência nesta população de pacientes, exceto em revisões retrospectivas com sobrevi-vênciasmedianas relatadas de 5,8-6,5 meses e sobrevivências em 1 ano de 25% (Girard e outros, 2009; Scartozi e outros, 2010).

[00133] Em pacientes com MEL tratados com nivolumab, uma OS mediana de 16,8 meses foi atingida, com taxas de sobrevivência de referência de 62% (1 ano) e 43% (2 anos) (ver o Exemplo 7). Os resul-tados de sobrevivência em pacientes com melanoma pré-tratados sus-tentaram as recentes aprovações da FDA de ipilimumab e vemurafe- nib. Em um teste em fase 3 recente envolvendo pacientes com melanoma com pelo menos um tratamento prévio para doença metastática, ipilimumab aumentou a OS mediana de 6,4 para 10,1 meses, comparado com uma vacina de peptídeo gp100 (Hodi e outros, 2010). Em testes em fase 2 de ipilimumab em pacientes previamente tratados, taxas de sobrevivência em 2 anos variavam desde 24,2-32,8% (Lebbe e outros, 2012). A OS mediana em pacientes previamente tratados com melanoma mutante para BRAF envolvidos em uma fase 2 longa de vemurafenib era de 15,9 meses e a sobrevivência em 1 ano era de 58% (Sosman e outros, 2012).

[00134] Consequentemente, em certas modalidades, a imunotera- pia com Ab anti-PD-1 é indicada como monoterapia para MEL avançado localmente ou metastático após a terapia com dacarbazina (inde-pendentemente da manutenção) e outro tratamento. Em outras moda-lidades, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para MEL avançado localmente ou metastático após a falha da terapia à base de da- carbazina. Em modalidades adicionais, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para MEL avançado localmente ou metastático após a falha de duas linhas de terapia das quais uma tem que incluir um regime à base de dacarbazina. Ainda em modalidades adicionais, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para MEL avançado localmente ou metastático após pelo menos uma quimioterapia prévia, após a falha de pelo menos uma terapia prévia à base de dacarbazina ou após a progressão pelo menos para terapia com dacarbazina. Em todos os métodos de imunoterapia divulgados aqui, o tratamento pode ser continuado enquanto for observado benefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra.

[00135] Nos pacientes com RCC tratados com nivolumab, entre os quais 45% receberam 3 ou mais terapias prévias e 71% receberam terapia antiangiogênica prévia, a OS mediana foi atingida em 22 meses (como dos dados de análise de março de 2013). Taxas de sobrevivência de referência de 70% (1 ano) e 50% (2 ano) foram observadas (ver o Exemplo 7). Em um teste em fase 3 recente envolvendo pacientes com câncer renal cuja doença progrediu após a terapia antian- giogênica, o everolimus foi comparado com o placebo: a OS mediana era de 14,8 versus 14,4 meses, respectivamente (Motzer e outros, 2008; Motzer e outros, 2010). Um teste em Fase 3 recente comparando sorafenib a temsirolimus em uma população de câncer renal refratáriopara sunitinib produziu uma OS mediana de 16,6 e 12,3 meses, respectivamente (Hutson e outros, 2012). Assim, como com NSCLC e MEL, o tratamento de uma população de pacientes com RCC fortementepré-tratados com nivolumab produziu uma OS mediana consideravelmente mais longa (> 22 meses) do que o tratamento de uma população menos refratária com terapias de padrão de cuidado. Testes em Fase 3 controlados com pontos finais de sobrevivência esperadosestão em andamento em NSCLC, MEL e RCC (NCT01673867, NCT01721772, NCT01642004, NCT01668784 e NCT01721746 (ver Teste clínicos Website, http://www.clinicaltrials.gov). É esperado que os resultados provenientes destes testes demonstrem adicionalmente a alta eficácia de e a durabilidade de respostas a, nivolumab nestes cânceres comparado com terapias de padrão de cuidado.

[00136] Em certas modalidades, a imunoterapia com Ab anti-PD-1 é indicada como monoterapia para RCC avançado localmente ou metas- tático após a terapia com um TKI antiantiogênico ou um inibidor de mTOR (independentemente da manutenção) e um outro tratamento. Em outras modalidades, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para RCC avançado localmente ou metastático após a falha de terapia com um TKI antiantiogênico ou um inibidor de mTOR. Em modalidades adicionais, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para RCC avançado localmente ou metastático após a falha de duas linhas de terapia das quais uma tem que incluir um TKI antiantiogênico ou um inibidor de mTOR. Ainda em modalidades adicionais, o Ab anti-PD-1 é indicado como monoterapia para RCC avançado localmente ou metas- tático após pelo menos uma quimioterapia prévia, após a falha de pelo menos uma terapia à base de TKI antiangiogênico ou de inibidor de mTOR prévia ou após a progressão para pelo menos uma terapia com um TKI antiantiogênico ou um inibidor de mTOR. A imunoterapia anti- PD-1 pode ser continuada enquanto for observado benefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra.

[00137] De forma notável, a OS em pacientes com câncer de pulmão, melanoma e câncer renal recebendo nivolumab era consideravelmente mais longa que PFS. Estes resultados refletem aqueles relatados para ipilimumab (Hodi e outros, 2010) e refletem a observação de que o aumento inicial de tumor ou o aparecimento de novas lesões em alguns pacientes recebendo bloqueio de ponto de verificação imu- nológica pode evoluir para a estabilização ou a regressão da doença. Estas descobertas sugerem que a sobrevivência livre de progressão pode não ser um ponto final ótimo para a determinação da eficácia de nivolumab e outros agentes nesta classe.

[00138] Os dados divulgados aqui que demonstram a alta eficácia, durabilidade e aplicabilidade ampla de imunoterapia anti-PD-1 para o tratamento de câncer levaram o nivolumab a ser testado por tipos de câncer adicionais. Por exemplo, com base de que a expressão aumen-tada de PD-L1 foi relatada com várias malignidades hematológicas e pode prevenir que a resposta imunológica do hospedeiro exerça um impacto benéfico sobre as células malignas, um teste para confirmar a capacidade de nivolumab de mediar a atividade antitumor em pacientes com malignidades hematológicas (mieloma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin/linfoma de células B mediastinais primárias e leucemia mielogênica crônica) foi iniciador (NCT01592370). O nivolumab também está sendo testado como uma monoterapia no carcinoma hepatocelular avançado (NCT01658878).

[00139] Em resumo, os resultados de imunoterapia anti-PD-1 divulgados aqui são notáveis pelo menos nos três aspectos a seguir. Em primeiro lugar, foi mostrado que a eficácia de anti-PD-1 supera os dados de eficácia históricos para pacientes em tratamentos de padrão de cuidado para câncer. De forma notável, esta eficácia foi demonstrada em pacientes em populações fortemente pré-tratadas em que aproxi-madamente metade dos pacientes tinha doença progressiva após 3 ou mais regimes sistêmicos prévios. Tais pacientes, afligidos com cânce-resavançados, metastáticos e/ou refratários, são notoriamente difíceis de serem tratados. Consequentemente, esta descrição fornece métodos para imunoterapia de um paciente afligido com um câncer avançado, metastático e/ou refratário, cujo método compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que interrompe a interação de PD-1 com PD-L1 e/ou PD-L2. Em certas modalidades de qualquer um dos métodos terapêuticos divulgados aqui, o indivíduo foi pré-tratado para o câncer; por exemplo, o indivíduo tinha passado por pelo menos one, duas ou três linhas de terapia prévias para câncer.

[00140] Em segundo lugar, foi mostrado que os presentes métodos terapêuticos eram aplicáveis a um gênero amplo de cânceres diferentes. Com base na descoberta surpreendente de que mesmo um câncer"não imunogênico"tal como NSCLC (Holt e outros, 2011) e cânce- res difíceis de tratar tais como cânceres de ovário e gástricos (bem como outros cânceres testados, incluindo MEL, RCC e CRC) são receptivos ao tratamento com anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 (ver os Exemplos 7 e 14), esta descrição geralmente fornece métodos para imuno- terapia de um paciente afligido com praticamente qualquer um de uma faixa muito ampla de cânceres.

[00141] Em terceiro lugar, foi mostrado que o tratamento com um Ab anti-PD-1 ou anti-PD-L1 produz atividade clínica impressionantementedurável em pacientes com câncer. Consequentemente, esta descrição fornece métodos imunoterapêuticos de indução de uma respostaclínica durável em um paciente com câncer que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que interrompe a interação de PD-1 com PD-L1 e/ou PD-L2. Em modalidades preferidas de qualquer um dos métodos terapêuticos descritos aqui, a resposta clínica é uma resposta durável.

[00142] Como é utilizada aqui, uma resposta "durável" é uma res-postaterapêutica ou clínica que excede a taxa de OS mediana prevista em uma população de pacientes. A taxa de OS mediana prevista varia com cânceres diferentes e populações de pacientes diferentes. Em certas modalidades, uma resposta durável excede a taxa de OS mediana prevista na população de pacientes relevante em pelo menos 10%, preferencialmente em pelo menos 20%, mais preferencialmente em pelo menos 30% e ainda mais preferencialmente em pelo menos 50%. Um benefício principal de abordagens imunoterapêuticas com base na via de bloqueio de PD-1 pode ser a restauração funcional de células T exauridas com produção durante longo prazo de células T de memória que pode manter a vigilância imunológica e inibir o crescimento do tumor durante períodos de tempo prolongados se estendendo a muitos anos, mesmo na ausência de terapia continuada (Kim e Ahmed, 2010). Na verdade, estudos de acompanhamento durante longo período de tempo em pacientes após cessar a terapia com nivolu- mab confirmaram que um paciente com CRC sofreu uma resposta completa que era contínua após 3 anos; um paciente com RCC sofreu uma resposta parcial que durou 3 anos fora da terapia, que se converteu para uma resposta completa que era contínua em 12 meses; e um paciente com melanoma atingiu uma resposta parcial que era estável durante 16 meses fora da terapia e a doença recorrente foi tratada de forma bem sucedida com nova indução da terapia anti-PD-1 (Lipson e outros, 2013).

Respostas clínicas relacionadas com o sistema imunológico

[00143] Tornou-se evidente que os critérios de resposta convencional podem não avaliar adequadamente a atividade de agentes imuno- terapêuticos porque a doença progressiva (através de avaliação radio- gráfica inicial) não necessariamente reflete a falha terapêutica. Por exemplo, foi mostrado que o tratamento com o Ab anti-CTLA-4, ipi- limumab, produz quatro padrões de resposta distintos, dos quais todos eram associados com sobrevivência favorável: (a) redução nas lesões de linha de base, sem novas lesões; (b) doença estável durável (em alguns pacientes seguida por um declínio constante lento na carga tumoral total); (c) resposta após um aumento na carga tumoral total; e (d) resposta na presença de novas lesões. Consequentemente, para avaliar de forma apropriada os agentes imunoterapêuticos, os efeitos em longo prazo sobre a doença alvo têm também que ser capturados. Sob este aspecto, critérios de respostas relacionadas ao sistema imu- nológico sistemáticas (irRC) que levam em consideração um aumento inicial na carga tumoral e/ou o aparecimento de novas lesões e que buscam melhorar a caracterização de padrões de resposta relacionada ao sistema imunológico, foram propostos (Wolchok e outros, 2009). Embora o impacto total destes padrões de resposta não convencionais ainda precise ser definido em testes aleatórios de nivolumab com pontos finais de sobrevivência, as presentes observações são rememora- tivas de descobertas com ipilimumab em que uma extensão significativa de OS foi observada em pacientes tratados (Hodi e outros, 2010; Robert e outros, 2011).

[00144] O perfil de risco/benefício total da imunoterapia anti-PD-1 é também favorável, com uma baixa incidência de eventos adversos re-lacionados ao fármaco mais graves (AEs; > grau 3), os eventos espe-cíficos observados até agora sendo coerentes com outros agentes imunoterapêuticos.Isto sugere que a imunoterapia anti-PD-1 pode ser fornecida em um cenário de paciente de ambulatório com cuidado de suporte mínimo.

Espectro amplo de cânceres tratáveis por imunoterapia anti-PD-1

[00145] Os dados clínicos apresentados aqui demonstram que a imunoterapia com base no bloqueio de PD-1 não é limitada a somente tipos de tumores "imunogênicos", tais como MEL e RCC, mas se estende a tipos de tumores não geralmente considerados como sendo capazes de resposta imunológica, incluindo NSCLC. Os sucessos inesperados com NSCLC metastático refratário ao tratamento ressaltam a possibilidade de que qualquer neoplasma pode ser "imunogêni- co" no contexto da modulação imunológica apropriada e sugerem que o bloqueio de PD-1 como uma abordagem imunoterapêutica é amplamenteaplicável ao longo de uma faixa muito distinta de tipos de tumores. Assim, os cânceres que podem ser tratados utilizando os Abs anti- PD-1 da invenção também incluem cânceres que tipicamente são capazes de responder à imunoterapia bem como cânceres que foram tradicionalmente considerados como não imunogênicos. Os exemplos não limitantes de cânceres preferidos para tratamento incluem NSCLC, MEL, RCC, CRC, CRPC, HCC, carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço, carcinomas do esôfago, de ovário, do trato gas trointestinal e de mama e uma malignidade hematológica. Embora o NSCLC não seja geralmente considerado como capaz de responder à imunoterapia, os dados divulgados aqui demonstram de forma inesperada que os NSCLCs tanto escamosos quanto não escamosos são capazes de responder ao tratamento com um Ab anti-PD-1. Adicionalmente, a descrição fornece o tratamento de malignidades refratárias ou recorrentes cujo crescimento pode ser inibido utilizando um Ab anti-PD-1 da invenção.

[00146] Os exemplos de cânceres que podem ser tratados utilizando um Ab anti-PD-1 nos métodos da presente invenção, com base nas indicações de aplicabilidade muito ampla da imunoterapia anti-PD-1 fornecida aqui, incluem câncer de fígado, câncer de osso, câncer pan- creático, câncer de pele, câncer da cabeça e do pescoço, câncer de mama, câncer de pulmão, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer renal, câncer de útero, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer de útero, carcinoma das trompas de faló- pio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, linfoma sem ser de Hodgkin, cancer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, linfoma linfocítico, câncer da bexi-ga,câncer do rim ou do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma do SNC primário, angiogê- nese de tumor, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco encefálico, adenoma de pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de célula escamosa, cânceres induzidos pelo ambiente incluindo aqueles induzidos por asbestos, malignidades hematológicas incluindo, por exemplo, mieloma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin/linfoma de células B mediastinais primárias, linfomas sem ser de Hodgkin, linfoma mieloide agudo, leucemia mielogênica crônica, leucemia linfoide crônica, linfoma folicular, linfoma de células B grande difuso, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes imunoblásticas, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma de células do manto, leucemia linfoblástica aguda, micose fungoide, linfoma de células grandes anaplásticas, linfoma de células T e linfoma linfoblástico T precursor e quaisquer combinações dos ditos cânceres. A presente invenção também é aplicável para o tratamento de cânceres metastáticos.

Usos médicos de Abs anti-PD-1

[00147] Um aspecto desta invenção é o uso de qualquer Ab anti- PD-1 ou porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção para a preparação de um medicamento para a inibição da sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1 de forma a dessa maneira potencializar uma resposta imunológica endógena em um indivíduo afligido com câncer. Outro aspecto é o uso de qualquer Ab anti-PD-1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção para a preparação de um medicamento para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer que compreende a interrupção da interação entre PD-1 e PD-L1. Estes usos para a preparação de medicamentos são amplamente aplicáveis à faixa completa de cânceres divulgados aqui. Em modalidades preferidas destes usos, os cânceres incluem NSCLC escamosas, NSCLC não escamosas, MEL, RCC, CRC, CRPC, HCC, carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço e carcinomas do esôfago, de ovário, do trato gastrointestinal e de mama e uma malignidade hematológica. Esta descrição fornece ainda usos médicos de qualquer Ab anti- PD-1 ou porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção correspondendo a todas as modalidades dos métodos de tratamento empregando um Ab anti-PD-1 descrito aqui.

[00148] A descrição fornece ainda um Ab anti-PD-1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção para uso no tratamento de um indivíduo afligido com câncer que compreende o aumento da potência de uma resposta imunológica endógena no indivíduo através da inibição da sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1. A descrição fornece ainda um Ab anti-PD-1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção para uso na imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer que compreende a interrupção da interação entre PD- 1 e PD-L1. Estes Abs podem ser utilizados no aumento da potência de uma resposta imunológica endógena contra ou na imunoterapia da faixa completa de cânceres divulgados aqui. Em modalidades preferidas, os cânceres incluem NSCLC escamosas, NSCLC não escamosas, MEL (por exemplo, MEL maligno metastático), RCC, CRC, CRPC, HCC, carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço e carcinomas do esôfago, de ovário, do trato gastrointestinal e de mama e uma malignidade hematológica.

Terapia de Combinação Incluindo Anticorpos Anti-PD-1

[00149] Enquanto foi mostrado aqui que a monoterapia com Abs anti-PD-1 e anti-PD-L1 aumenta significativamente a sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão, melanoma, câncer de rim e potencialmente outras malignidades, dados pré-clínicos indicam que combi-nações de tratamentos sinérgicos com base na via de bloqueio de PD- 1 poderiam ter efeitos ainda mais potentes. A avaliação clínica de nivo- lumab combinado com ipilimumab (anti-CTLA-4), cujo mecanismo de ação é similar mesmo que ainda distinto daquele do nivolumab (Parry e outros, 2005; Mellman e outros, 2011; Topalian e outros, 2012c), está em andamento e resultados provenientes de um teste em Fase 1 são fornecidos aqui (ver, também, NCT01024231; NCT01844505; NCT01783938; Wolchok e outros, 2013a; Wolchok e outros, 2013b; Hodi e outros, 2013). Também foram iniciados estudos clínicos que envolvem a administração de nivolumab em combinação com vacinas para melanoma (NCT01176461, NCT01176474; Weber e outros, 2013), com lirilumab (BMS-986015), um Ab anti-KIR de IgG4 humano, em pacientes com tumores sólidos avançados (NCT01714739; Sanborn e outros, 2013), com citocinas, por exemplo, IL-21, em pacientes com tumores sólidos avançados ou metastáticos (NCT01629758; Chow e outros, 2013), com fármacos quimioterapêuticos, por exemplo, com quimioterapia dupla à base de platina em pacientes que nunca receberam quimioterapia com NSCLC (NCT01454102; Rizvi e outros, 2013) e terapias direcionadas com moléculas pequenas em pacientes com RCC metastático (NCT01472081; Amin e outros, 2013).

[00150] Em certos aspectos, esta descrição refere-se à combinação de um Ab anti-PD-1 com tratamentos de câncer diferentes, incluindo regimes quimioterapêuticos, radiação, cirurgia, privação de hormônio e inibidores da angiogênese, para o tratamento de vários cânceres. O bloqueio de PD-1 também pode ser eficientemente combinado com um agente imunogênico, por exemplo, uma preparação de células cancerosas, antígenos de tumor purificados (incluindo proteínas, peptídeos recombinantes e moléculas de carboidrato), células apresentadoras de antígeno tais como células dendríticas que carregam antígenos associados a tumor, células transfectadas com genes que codificam citoci- nas de estimulação imunológica (He e outros, 2004) e/ou outro Ab imunoterapêutico (por exemplo, um Ab anti-CTLA-4, anti-PD-L1 e/ou anti-LAG-3). Os exemplos não limitantes de vacinas para tumor que podem ser utilizadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tais como peptídeos de gp100, antígenos de MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase ou células tumorais transfectadas para expressarem a citocina GM-CSF. Combinação de Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 para tratar melanoma avançado

[00151] Dado que os pontos de verificação imunológica são não redundantes e podem inibir a ativação, a proliferação e a função efeto- ra de células T dentro de nódulos linfáticos e/ou do microambiente do tumor e com base em dados pré-clínicos de que a combinação de anti- CTLA-4 e anti-PD-1 tinha um efeito antitumor mais forte em modelos de tumor em camundongos que qualquer Ab isoladamente (ver a Pa-tenteU.S. N°. 8.008.449), a hipótese de que o bloqueio combinado de CTLA-4 e PD-1 poderia produzir atividade antitumor maior que agen-tes isolados foi testada em um teste clínico em pacientes com MEL (Exemplo 15).

[00152] Embora não formalmente comparado neste estudo, o regime de nivolumab/ipilimumab concorrente, que compreendia ORRs atingidas que excediam as taxas atingidas com nivolumab (Exemplo 7) ou ipilimumab isoladamente (Hodi e outros, 2010). De forma mais importante, as respostas rápidas e profundas foram atingidas em uma porção substancial de pacientes tratados, uma resposta de tumor "pro- funda" se referindo a uma resposta nas lesões alvos caracterizada por uma redução de 80% ou mais partindo das medidas da linha de base por avaliação radiográfica. No presente estudo, a maioria dos pacientes capazes de resposta, incluindo alguns com carga tumoral extensiva e volumosa, atingiu > 80% de regressão de tumor no momento da avaliação inicial do tumor. Particularmente impressionante era a observação de que 31% de pacientes que podiam ser avaliados em relação à resposta tratados com regimes concorrentes (que compreendem (i) uma programação de dosagem de indução com administração combinada dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 seguida pela administração do Ab anti-PD-1 isoladamente e (ii) uma programação de dosagem de manutenção que compreende a administração combinada menos frequente dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4) demonstravam > 80% de regressão de tumor na semana 12. Na MTD para o regime concorrente, todos os 9 pacientes capazes de resposta demonstravam > 80% de regressão de tumor com 3 CRs. Em contraste, na experiênciaclínica até agora, < 3% dos pacientes com MEL que receberam ni- volumab ou ipilimumab a 3 mg/kg atingiram uma CR (Exemplo 7; Hodi e outros, 2010). Assim, a atividade geral desta combinação de imuno- terapia neste teste em fase 1 preliminar se compara de forma muito favorável àquela de outros agentes aprovados ou que estão sendo desenvolvidos para melanoma avançado, incluindo os inibidores direcionados de quinases ativadas (Chapman e outros, 2011). Uma vantagem adicional desta combinação é a durabilidade de resposta que é demonstrada no presente estudo bem como testes de imunoterapia em prazo mais longo com nivolumab (como descrito aqui) e ipilimumab (Wolchok e outros, 2013d).

[00153] Estes dados iniciais sugerem que respostas rápidas de uma magnitude maior podem ser atingidas em pacientes tratados com uma combinação de nivolumab/ipilimumab comparada com a experiência histórica de qualquer um dos agentes isoladamente. As respostas eram geralmente duráveis e foram observadas ainda em pacientes cujo tratamento foi terminado precocemente por causa da toxicidade. Os pacientes capazes de resposta incluíam aqueles com LDH elevado, doença de M1c e carga tumoral multifocal volumosa. Similar aos relatosprévios em relação à monoterapia com ipilimumab ou com nivolu- mab, ORRs convencionais podem não capturar completamente o espectro de atividade clínica e o benefício potencial em pacientes trata-dos com o regime de nivolumab/ipilimumab concorrente em que um número de pacientes sofreu SD em longo prazo ou padrões não con-vencionais de resposta relacionada ao sistema imunológico. Na verdade, ainda entre os 7 pacientes no regime concorrente com SD > 24 semanas ou irSD > 24 semanas como a melhor resposta, 6 demonstravam regressão de tumor significativa de pelo menos 19% e o sétimo paciente teve a carga tumoral reduzida após SD prolongada. Uma experiência prévia com monoterapia de bloqueio de ponto de verificação apoia a observação de que alguns pacientes podem sobreviver durante períodos estendidos de tempo com SD como a melhor OR, dando credibilidade à hipótese de que o reestabelecimento da fase de equilíbrio da vigilância imunológica é um resultado desejável (Screiber e outros, 2011).

[00154] A observação de que os pacientes podem atingir ORs quando tratados sequencialmente com nivolumab após ipilimumab prévio indica que a falta de resposta ao bloqueio de CTLA-4 não impede o benefício clínico proveniente do bloqueio de PD-1 e apoia ainda a natureza não redundante destas vias coinibidoras. De forma notável, os dados divulgados aqui (Exemplo 8) sugerem uma associação entre a ocorrência de resposta e a expressão de PD-L1 de tumor em pacientes recebendo nivolumab e dados anteriores revelam uma correlação entre OS e aumentos na ALC periférica em pacientes tratados com ipilimumab (Berman e outros, 2009; Ku e outros, 2010; Postow e outros, 2012; Delyon e outros, 2013). No presente estudo da combinação de nivolumab/ipilimumab, respostas clínicas foram observadas em pacientes independentemente da contagem de linfócitos ou da expressão na linha de base de PD-L1 de tumor (Exemplo 17), sugerindo que a resposta imunológica gerada pela terapia de combinação possui características únicas comparadas com qualquer monoterapia. Embora os dados sugiram que a expressão na linha de base de PD-L1 de tumor e a contagem de linfócitos podem ser menos relevantes no ajuste dos regimes de combinação ativos capazes de induzir regressão de tumor rápida e pronunciada, é também notável que um Ab anti-PD-L1 diferente (mAb 28-8 de coelho versus mAb 5H1 de camundongo) foi utilizado em um ensaio de IHC diferente para medir a expressão de PD-L1 no estudo da terapia de combinação comparado com o estudo de monoterapia com nivolumab. Em adição às alterações no ensaio de IHC e no Ab, os resultados diferentes também podem refletir diferenças em amostras de biópsia e heterogeneidade de tumor. A utilidade da expressão de PD-L1 como um biomarcador para eficácia anti-PD-1 será adicionalmente avaliada de forma previdente em estudos em fase 3 aleatórios (ver, por exemplo, NCT01721772, NCT01668784 e NCT01721746).

[00155] O espectro de eventos adversos observados entre pacientes tratados com o regime concorrente era qualitativamente similar à experiência com a monoterapia com nivolumab ou com ipilimumab, embora a taxa de AEs tenha aumentado em pacientes tratados com a combinação. AEs relacionados ao tratamento de graus 3-4 foram observados em 53% dos pacientes tratados com o regime de nivolu- mab/ipilimumab concorrente, comparados com as taxas históricas de 20% em pacientes tratados com monoterapia com ipilimumab (Hodi e outros, 2010) e 17% em pacientes tratados com nivolumab isolada- mente (Exemplo 5) em uma dose de 3 mg/kg. Nos grupos de regime sequenciado, 18% dos pacientes sofreram AEs relacionados ao tratamento de graus 3-4. Os AEs sofridos pelos pacientes tratados com os regimes concorrentes e sequenciados eram controláveis e/ou geralmentereversíveis utilizando algoritmos de tratamento existentes.

[00156] De forma coletiva, estes resultados sugerem que o nivolu- mab e o ipilimumab podem ser administrados concorrentemente com um perfil de segurança controlável e levando a respostas clínicas duráveis. Respostas para tumor clínicas mais rápidas e mais profundas foram observadas em pacientes tratados com a combinação comparadas com as respostas obtidas com qualquer agente isoladamente.

[00157] Como dos dados de limite clínico de fevereiro de 2013 para o estudo descrito no Exemplo 15, dos 52 indivíduos no regime concor-rente que podiam ser avaliados em relação à resposta, 21 (40%) tinham uma OR por critérios da World Health Organization modificada (mWHO) (Wolchok e outros, 2009). Em 2 indivíduos adicionais (4%), havia uma OR não confirmada. No Grupo 1 (0,3 mg/kg de nivolumab mais 3 mg/kg de ipilimumab), 3 de 14 indivíduos que podiam ser avaliados tinham uma OR por mWHO (ORR: 21%, incluindo 1 CR e 2 PRs). No Grupo 2 (1 mg/kg de nivolumab mais 3 mg/kg de ipilimumab), 9 de 17 indivíduos que podiam ser avaliados tinham uma OR por mWHO (ORR: 53%; incluindo 3 CRs e 6 PRs). No Grupo 2a (3 mg/kg de nivo- lumab mais 1 mg/kg de ipilimumab), 6 de 15 indivíduos que podiam ser avaliados em relação à resposta tinham uma OR por mWHO (ORR: 40%; incluindo 1 CR e 5 PRs). No Grupo 3 (3 mg/kg de nivolumab mais 3 mg/kg de ipilimumab), 3 de 6 indivíduos que podiam ser avaliados tinham uma resposta objetiva por mWHO (ORR: 50%, incluindo 3 PRs). Com base nestes dados, a invenção divulgada aqui inclui um método para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer que compreende a administração ao indivíduo de: (a) um Ab ou uma por- ção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe PD-1; e (b) um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe CTLA-4; cada Ab sendo administrado em uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg de peso corporal em um regime concorrente que compreende: (i) uma programação de dosagem de indução que compreende a administração combinada dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 10 doses, seguidas pela administração do Ab anti-PD-1 isoladamente em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 12 doses; seguida por (ii) uma programação de dosagem de manutenção que compreende a administração combinada dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 8, 12 ou 16 semanas ou pelo menos uma vez por trimestre, para pelo menos 4, 6, 8, 10, 12 ou 16 doses ou por enquanto for observadobenefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra.

[00158] Em certas modalidades deste método, a programação de dosagem de manutenção compreende a administração combinada de até 4, 6, 8, 10, 12 ou 16 doses dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4. Em outras modalidades, o regime concorrente compreende: (i) uma pro-gramação de dosagem de indução que compreende a administração combinada dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou uma vez ao mês, para 2, 4, 6 ou 8 doses, seguidas pela administração do Ab anti-PD-1 isoladamente em uma frequência de dosagem de uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou uma vez ao mês, para 2, 4, 6, 8 ou 12 doses; seguida por (ii) uma programação de dosagem de manutenção que com- preende a administração combinada dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de uma vez a cada 8, 12 ou 16 se-manas ou uma vez por trimestre, para 4, 6, 8, 10, 12 ou 16 doses ou por enquanto for observado benefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra. Em certas outras modalidades, cada um dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 é individual-mente administrada em uma dosagem de 0,1, 0,3, 0,5, 1, 3, 5, 10 ou 20 mg/kg. Em modalidades adicionais, a dosagem de cada um dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 é mantida constante durante a programação de dosagem de indução e a programação de dosagem de manu-tenção. Ainda em outras modalidades, os Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 são administrados nas dosagens a seguir: (a) 0,1 mg/kg de Ab anti- PD-1 e 3 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (b) 0,3 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 3 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (c) 1 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 3 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (d) 3 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 3 mg/kg de Ab anti- CTLA-4; (e) 5 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 3 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (f) 10 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 3 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (g) 0,1 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 1 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (h) 0,3 mg/kg de Ab an- ti-PD-1 e 1 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (i) 1 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 1 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (j) 3 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 1 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; (k) 5 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 1 mg/kg de Ab anti-CTLA- 4; ou (l) 10 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 1 mg/kg de Ab anti-CTLA-4.

[00159] No protocolo descrito no Exemplo 15, o regime de dosagem de 3 mg/kg de nivolumab mais 3 mg/kg de ipilimumab excedia a MTD (embora combinações com ipilimumab e outros Abs anti-PD-1 possam ter uma MTD maior ou menor), enquanto que tanto o Grupo 2 (1 mg/kg de nivolumab mais 3 mg/kg de ipilimumab) quanto o Grupo 2a (3 mg/kg de nivolumab mais 1 mg/kg de ipilimumab) tinham atividade clínica similar. Em adição, a maioria de respostas à combinação de nivo- lumab e ipilimumab ocorria nas primeiras 12 semanas. Dada a incerte- za do fato de que o ipilimumab administrado após a semana 12 contribui para o benefício clínico e o fato de que a programação aprovada pela U.S. Food and Drug Administration (FDA) e pela European Medicines Agency (EMA) para ipilimumab é a cada 3 semanas para um total de quatro doses, em uma modalidade preferida o Ab anti-CTLA-4 é administrado durante a programação de dosagem de indução uma vez a cada 3 semanas para um total de 4 doses. Foi mostrado que o tratamento de monoterapia com nivolumab em 3 mg/kg a cada duas semanasaté a progressão estava associado a respostas duráveis (Exemplos 4-7) e foi mostrado que uma programação de dosagem de manutenção que compreende a administração de nivolumab a cada 12 semanas era eficaz (Exemplo 15). Assim, começando na semana 12, que é após completar as quatro doses de nivolumab e ipilimumab combinados, o nivolumab em 3 mg/kg pode ser administrado a cada 2 até pelo menos 12 semanas até a progressão. Consequentemente, em modalidades preferidas do método de regime concorrente, os Abs anti- PD-1 e anti-CTLA-4 são administrados em dosagens de: (a) 1 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 3 mg/kg de Ab anti-CTLA-4; ou (b) 3 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 1 mg/kg de Ab anti-CTLA-4 e o regime concorrente compreende ainda: (i) uma programação de dosagem de indução que compreende a administração combinada dos Abs anti-PD-1 e anti- CTLA-4 em uma frequência de dosagem de uma vez a cada 3 semanas para 4 doses, seguidas pela administração do anti-PD-1 isoladamente em uma frequência de dosagem de uma vez a cada 3 semanas para 4 doses; seguida por (ii) uma programação de dosagem de manutenção que compreende a administração combinada dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de uma vez a cada 2 até 12 ou mais semanas para até 8 doses ou por enquanto for observado benefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra.

[00160] A análise de resposta à exposição da monoterapia com ni- volumab ao longo das faixas de dosagem de 1 mg/kg to 10 mg/kg re-vela atividade clínica similar (Exemplo 7) enquanto que a análise de resposta à exposição de 0,3 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg da monoterapia com ipilimumab demonstrou maior atividade com aumento na dose em um teste em fase 2 (Wolchok e outros, 2010). Portanto, uma dose de 3 mg/kg de ipilimumab (Grupo 2) pode ser mais clinicamente impac- tante que a seleção de 3 mg/kg de nivolumab (Grupo 2a). Assim, em modalidades mais preferidas do método de regime concorrente, os Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 são administrados em dosagens de 1 mg/kg de Ab anti-PD-1 e 3 mg/kg de Ab anti-CTLA-4.

[00161] Em certas modalidades dos presentes métodos, os Abs an- ti-PD-1 e anti-CTLA-4 são formulados para administração intravenosa. Em certas outras modalidades, quando os Abs anti-PD-1 e anti-CTLA- 4 são administrados em combinação, estes são administrados dentro de 30 minutos de intervalo um do outro. Qualquer Ab pode ser administrado primeiro, isto é, em certas modalidades, o Ab anti-PD-1 é administrado antes do Ab anti-CTLA-4, enquanto que em outras modalidades, o Ab anti-CTLA-4 é administrado antes do Ab anti-PD-1. Tipicamente, cada Ab é administrado de forma intravenosa ao longo de um período de 60 minutos. Em modalidades adicionais, os Abs anti- PD-1 e anti-CTLA-4 são administrados concorrentemente, misturados na forma de uma composição única em uma formulação farmaceuti- camente aceitável para administração concorrente ou concorrentemente na forma de composições separadas com cada Ab em uma formulação farmaceuticamente aceitável.

[00162] Os dados divulgados no Exemplo 7 demonstram que a imunoterapia com nivolumab produzia atividade clínica significativa em pacientes com MEL que eram incapazes de resposta à terapia prévia com ipilimumab. Consequentemente, esta descrição fornece um méto- do de regime sequenciado para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, o indivíduo tendo sido previamente tratado com um Ab anti-CTLA-4, cujo método compreende a administração ao indivíduo de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe PD-1 em uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg de peso corporal e em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada semana, pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para até 6 a até 72 doses ou por enquanto for observado benefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra. Em certas modalidades deste método, a administração do Ab anti-PD-1 ao indivíduo é iniciada dentro de 1-24 semanas após o último tratamento com o Ab anti-CTLA-4. Em outras modalidades, a administração do Ab anti-PD-1 ao indivíduo é iniciada dentro de 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ou 24 semanas após o último tratamento com o Ab anti- CTLA-4. Em modalidades preferidas, a administração do Ab anti-PD-1 é iniciada dentro de 4, 8 ou 12 semanas após o último tratamento do indivíduo com o Ab anti-CTLA-4. Certas modalidades do método compreendem a administração do Ab anti-PD-1 em uma dosagem de 0,120 mg/kg, por exemplo, 0,1, 0,3, 0,5, 1, 3, 5, 10 ou 20 mg/kg. Em modalidades preferidas, o Ab anti-PD-1 é administrado em uma dosagem de 1 ou 3 mg/kg. Em certas modalidades, o regime sequenciado compreende a administração do Ab anti-PD-1 ao indivíduo em uma frequência de dosagem de uma vez a cada semana, uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou uma vez ao mês para 6 até 72 doses ou por enquanto for observado benefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra. Em modalidades preferidas, o anti-PD-1 é administrado em uma dosagem de 1 ou 3 mg/kg em uma frequência de dosagem de uma vez a cada 2 semanas para até 48 do ses. Em outras modalidades preferidas, o Ab anti-PD-1 é formulado para administração intravenosa.

[00163] Em certos aspectos de qualquer um dos presentes métodos de regimes concorrentes ou sequenciados, o tratamento produz pelo menos um efeito terapêutico escolhido de uma redução no tamanho e/ou crescimento de um tumor, eliminação do tumor, redução no nú-mero de lesões metastáticas ao longo do tempo, resposta completa, resposta parcial e doença estável. Com base no espectro amplo de cânceres em que o nivolumab mostrou ter resposta clínica, os presentesmétodos de terapia de combinação também são aplicáveis a diversoscânceres. Os exemplos de cânceres que podem ser tratados através destes métodos incluem câncer de fígado, câncer de osso, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça e do pescoço, câncer de mama, câncer de pulmão, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer renal, câncer de útero, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago,câncer de testículo, câncer de útero, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, linfoma sem ser de Hodgkin, cancer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoi- de, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasma do SNC, linfoma do SNC primário, angiogênese de tumor, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco encefálico, adenoma de pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de célula escamosa, cânceres induzidos pelo ambiente incluindo aqueles induzidos por asbestos, malignidadeshematológicas incluindo, por exemplo, mieloma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin/linfoma de células B medias- tinais primárias, linfomas sem ser de Hodgkin, linfoma mieloide agudo, leucemia mielogênica crônica, leucemia linfoide crônica, linfoma linfocí- tico, linfoma folicular, linfoma de células B grande difuso, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes imunoblásticas, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma de células do manto, leucemia linfoblástica aguda, micose fungoide, linfoma de células grandes anaplásticas, linfoma de células T e linfoma linfoblástico T precursor e quaisquer combinações dos ditos cânceres. A presente invenção também é aplicável ao tratamento de cânceres metastáticos, refratários ou recorrentes. Em modalidades preferidas, o câncer que será tratado é escolhido de MEL, RCC, NSCLC escamosas, NSCLC não escamosas, CRC, CRPC, OV, GC, HCC, PC, carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço, carcinomas do esôfago, do trato gastrointestinal e da mama e uma malignidade hematológica. Em modalidades mais preferidas, o câncer é MEL.

[00164] Em certas modalidades, o indivíduo foi pré-tratado para o câncer. Por exemplo, o paciente pode ter sido tratado com 1 ou 2 ou mais regimes sistêmicos prévios do tipo descrito aqui como agentes terapêuticos de padrão de cuidado. Em certas outras modalidades, o câncer é um câncer avançado, recorrente, metastático e/ou refratário. Em modalidades preferidas, o tratamento com regime concorrente ou sequenciado induz uma resposta clínica durável no indivíduo. Em modalidades preferidas, o indivíduo é um ser humano, o Ab anti-PD-1 inibe PD-1 humano e o Ab anti-CTLA-4 inibe CTLA-4 humano.

[00165] O Ab anti-PD-1 utilizado nos presentes métodos pode ser qualquer Ab anti-PD-1 terapêutico da invenção. Em modalidades pre-feridas, o Ab anti-PD-1 é um mAb, que pode ser um Ab quimérico, humanizado ou humano. Em certas modalidades, o Ab anti-PD-1 com-preende os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 na região variável de cadeia pesada e os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 na região vari- ável de cadeia leve de 17D8, 2D3, 4Hl, 5C4 (nivolumab), 4A11, 7D3 ou 5F4, respectivamente, como descrito e caracterizado na Patente U.S. N°. 8.008.449. Em modalidades adicionais, o Ab anti-PD-1 compreende as regiões variáveis de cadeias pesadas e leves de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 (nivolumab), 4A11, 7D3 ou 5F4, respectivamente. Em modalidades adicionais, o Ab anti-PD-1 é 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 (nivo- lumab), 4A11, 7D3 ou 5F4. Em modalidades preferidas, o Ab anti-PD-1 é nivolumab.

[00166] Os anticorpos anti-CTLA-4 da presente invenção se ligam ao CTLA-4 humano de forma a interromper a interação de CTLA-4 com um receptor de B7 humano. Devido ao fato de que a interação de CTLA-4 com B7 transduz um sinal que leva à inativação de células T que carregam o receptor de CTLA-4, a interrupção da interação eficientemente induz, intensifica ou prolonga a ativação de tais células T, dessa maneira induzindo, aprimorando ou prolongando uma resposta imunológica. Os Abs anti-CTLA-4 são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.051.227, 7.034.121 nas Publicações Pedidos de Patentes PCT Nos. WO 00/37504 e WO 01/14424. Um exemplo de Ab anti-CTLA-4 clínico é o mAb humano 10D1 (agora conhecido como ipilimumab e comercializado como YERVOY®) que é divulgado na Patente U.S. N°. 6.984.720. Em certos aspectos de qualquer um dos presentesmétodos, o Ab anti-CTLA-4 é um mAb. Em certas outras modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em modalidades preferidas, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumab.

[00167] Esta descrição fornece ainda o uso de um Ab anti-PD-1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo em combinação com um Ab anti-CTLA-4 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo para a preparação de um medicamento coadministrado para o trata-mento de um indivíduo afligido com um câncer em um regime concor- rente, em que os Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 são cada um administrados em uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg de peso corporal e ainda em que o regime concorrente compreende: (i) uma programação de dosagem de indução que compreende a administra-ção combinada dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 12 doses, seguidas pela administração do Ab anti-PD-1 isoladamente em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 10 doses; seguida por (ii) uma programação de dosagem de manutenção que compreende a administração combinada dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 8, 12 ou 16 semanas ou pelo menos uma vez por trimestre, para até 4, 6, 8, 10, 12 ou 16 doses ou por enquanto for observado benefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra. A descrição fornece usos da combinação de Abs anti- PD-1 e anti-CTLA-4 para a preparação de medicamentos coadminis- trados correspondendo a todas as modalidades dos métodos de tratamento empregando estes Abs descritos aqui e são amplamente aplicáveis à faixa completa de cânceres divulgados aqui.

[00168] A descrição fornece ainda um Ab anti-PD-1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo para uso em combinação com um Ab anti-CTLA-4 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer em um regime concorrente, em que os Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 são cada um administrados em uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg de peso corporal e ainda em que o regime concorrente compreende: (i) uma programação de dosagem de indução que compreende a administração combinada dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 12 doses, seguidas pela administração do anti-PD-1 isoladamente em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 10 doses; seguida por (ii) uma programação de dosagem de manutenção que compreende a administração combinada dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 8, 12 ou 16 semanas ou pelo menos uma vez por trimestre, para até 4, 6, 8, 10, 12 ou 16 doses ou por enquanto for observadobenefício clínico ou até que a toxicidade não controlável ou a progressão da doença ocorra.

[00169] Os métodos para a seleção de uma população de pacientes e para a seleção de um paciente como adequado para imunoterapia com a combinação de anti-PD-1 e anti-CTLA-4 utilizando os métodos de regimes concorrentes ou sequenciados de previsão da eficácia da combinação de Ab, com base em um ensaio com biomarcador de PD- L1 são realizados como descrito para monoterapia anti-PD-1, até a extensão que este biomarcador é aplicável à terapia de combinação com Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4.

[00170] A descrição fornece adicionalmente um kit para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, o kit compreendendo: (a) uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg de peso corporal de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe PD-1; (b) uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe CTLA-4; e (c) instruções para a utilização da combinação dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA- 4 em qualquer um dos métodos de regimes concorrentes. Em certas modalidades, algumas das dosagens dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 são misturadas dentro de uma única formulação farmacêutica para administração concorrente. Em outras modalidades, as dosagens dos Abs anti-PD-1 e anti-CTLA-4 são formuladas na forma de composições separadas com cada Ab em uma formulação farmaceuticamente aceitável.

[00171] A descrição fornece ainda um kit para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, o kit compreendendo: (a) uma dosa-gem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg de peso corporal de um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe PD-1; e (b) instruções para a utilização do Ab anti-PD- 1 em qualquer um dos métodos de regimes sequenciados.

[00172] Um bloqueio de PD-1 e CTLA-4 combinado também pode ser adicionalmente combinado com tratamentos padronizados de cân-cer. Por exemplo, um bloqueio de PD-1 e CTLA-4 combinado pode ser eficientemente combinado com regimes quimioterapêuticos, por exemplo, combinação adicional com dacarbazina ou IL-2, para o tratamento de MEL. Nestes casos, pode ser possível reduzir a dose do reagente quimioterapêutico. O raciocínio lógico científico por trás do uso combinado do bloqueio de PD-1 e CTLA-4 com quimioterapia é que a morte celular, que é uma consequência da ação citotóxica da maioria dos compostos quimioterapêuticos, deve resultar níveis au-mentados de antígeno de tumor na via de apresentação de antígeno. Outras terapias de combinação que podem resultar na sinergia com um bloqueio de PD-1 e CTLA-4 combinado através de morte celular incluem radiação, cirurgia ou privação de hormônio. Cada um destes protocolos cria uma fonte de antígeno de tumor no Hospedeiro. Os inibidores da angiogênese também podem ser combinados com um bloqueio de PD-1 e CTLA-4 combinado. A inibição de angiogenesis leva à morte celular do tumor, que também pode ser uma fonte de antígeno de tumor que será alimentada para dentro das vias de apresentação de antígeno do hospedeiro. Imunoterapia de Pacientes com Câncer Utilizando um Anticorpo Anti- PD-L1

[00173] O PD-L1 é o ligante de PD-1 primário regulado para mais dentro de tumores sólidos, onde este pode inibir a produção de citoci- nas e a atividade citolítica de células T CD4+ e CD8+ que se infiltram no tumor positivas para PD-1, respectivamente (Dong e outros, 2002; Hino e outros, 2010; Taube e outros, 2012). Estas propriedades tornam o PD-L1 um alvo promissor para imunoterapia para câncer. Os testes clínicos de imunoterapia anti-PD-L1 descritos nos Exemplos demonstram pela primeira vez que o bloqueio por mAb do ligante inibidor imunológico, PD-L1, produz tanto regressão tumor durável (> 24 semanas) quanto estabilização da doença prolongada em pacientes com NSCLC, MEL, RCC e OV metastáticos, incluindo aqueles com terapia prévia extensiva. O HuMAb anti-PD-L1 humano, BMS-936559, tinha um perfil de segurança favorável geral em doses até e incluindo 10 mg/kg, como é evidente partindo da baixa incidência (9%) dos AEs relacionados ao fármaco de graus 3-4. Estas descobertas são coerentes com o fenótipo autoimune brando observado em camundongos PD-L1-/- (Dong e outros, 2004) e a hiperproliferação mais grave observada em camundongos CTLA-4-/- em relação a camundongos PD-1-/- (Phan e outros, 2003; Tivol e outros, 1995; Nishimura e outros, 1999). A maior parte das toxicidades associadas à administração de anti-PD- L1 em pacientes era relacionada ao sistema imunológico, sugerindo efeitos no alvo. O espectro e a frequência de eventos adversos de interesse especial (AEOSIs) são de alguma maneira diferentes entre an- ti-PD-L1 e anti-CTLA-4, enfatizando a biologia distinta destas vias (Ribas e outros, 2005). As reações de infusão foram observadas com BMS-936559, embora estas fossem brandas na maioria dos pacientes. Colite grave, um AE relacionado ao fármaco observado em pacientes tratados com ipilimumab (Beck e outros, 2006), era observada infre-quentemente com anti-PD-L1.

[00174] Como observado anteriormente para imunoterapia anti-PD- 1, outra característica importante da terapia anti-PD-L1 é a durabilida-de de respostas ao longo de vários tipos de tumores. Isto é particularmentenotável considerando a doença avançada e o tratamento prévio de pacientes no presente estudo. Embora não comparada diretamente, esta durabilidade parece maior que aquela observada com a maioria das quimioterapias e inibidores de quinases utilizados para tratar estes cânceres.

[00175] Devido ao fato de que as células T do sangue periférico expressam PD-L1, é possível avaliar o RO in vivo por BMS-963559 como uma medida farmacodinâmica. O RO mediano era de 65,8%, 66,2% e 72,4% para as doses testadas. Enquanto que estes estudos fornecem uma avaliação direta e evidência de envolvimento do alvo em pacientes tratados com BMS-936559, as relações entre RO no sangue periférico e o microambiente tumor permanecem pouco entendidas.

[00176] Com base nos dados clínicos divulgados aqui, esta descrição fornece um método para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um Ab anti-PD-L1 da invenção ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. A descrição fornece ainda um método de inibição do crescimento de células tumorais em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de um Ab anti-PD-L1 da invenção ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. Em modalidades preferidas, o indivíduo é um ser humano. Em certas modalidades, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo é de um isotipo IgG1 ou IgG4. Em outras modalidades, o Ab ou a porção que se liga ao an- tígeno do mesmo é um mAb ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. Em modalidades adicionais, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo é um Ab quimérico, humanizado ou humano ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. Em modalidades preferidas para o tratamento de um paciente humano, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo é um Ab humano ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo.

[00177] Os testes clínicos descritos nos Exemplos empregavam o HuMAb anti-PD-L1 BMS-936559 para tratar câncer. Embora o BMS- 936559 (designado HuMAb 12A4 na Patente U.S. N°. 7.943.743) tenha sido selecionado como o Ab anti-PD-L1 principal para inserção na clínica, é notável que vários Abs anti-PD-L1 da invenção compartilham com 12A4 propriedades funcionais que são importantes para a atividade terapêutica de 12A4, incluindo a ligação de alta afinidade especificamente ao PD-L1 humano, o aumento na proliferação de células T, a secreção de IL-2 e a produção de interferon-Y em um ensaio de MLR, a inibição da ligação de PD-L1 ao PD-1 e a reversão do efeito supressor de células reguladoras T sobre células efetoras de células T e/ou células dendríticas. Além disso, certos dos Abs anti-PD-L1 da invenção, a saber, 1B12, 7H1 e 12B7 são estruturalmente relacionados ao 12A4 pelo fato de que compreendem regiões de VH e de VK que possuem sequências derivada de sequências de linhagem germinativa de VH 1-69 e de Vk L6, respectivamente. Em adição, pelo menos 12B7, 3G10, 1B12 e 13G4 competem de forma cruzada com 12A4 pela ligação à mesma região de epitopo de hPD-L1, enquanto que 5F8 e 10A5 podem ser ligar à mesma região de epitopo ou uma sobreposta que o 12A4 (Exemplos 2 e 3). Assim, a caracterização pré-clínica de 12A4 e outros HuMAbs anti-PD-L1 indica que os métodos de tratamento de câncer fornecidos aqui podem ser realizados utilizando qualquer um do gênero amplo de Abs anti-PD-L1 da invenção.

[00178] Consequentemente, esta descrição fornece métodos de imunoterapia que compreendem a administração a um paciente de um Ab anti-PD-L1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que compreende (a) uma região variável de cadeia pesada que compreen-deaminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 1-18 e uma região variável de cadeia leve que compreende amino- ácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VK L6; (b) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 1-69 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de Vk L6; (c) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 1-3 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de Vk L15; (d) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 1-69 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de Vk A27; (e) uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 3-9 e uma região variável de cadeia leve que compre- ende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VK L15; ou (f) uma região variável de cadeia pesada que compreendeaminoácidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VH 3-9 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoá- cidos ligados consecutivamente que possuem uma sequência derivada de uma sequência de linhagem germinativa humana de VK L18.

[00179] Em certas modalidades, o Ab anti-PD-L1 ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo administrada ao paciente compete de forma cruzada pela ligação ao PD-L1 com um Ab de referência ou uma porção que se liga ao antígeno de referência do mesmo que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreendeaminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 15 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 25; (b) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 16 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 26; (c) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 17 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoá- cidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 27; (d) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 18 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados con- secutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 28; (e) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 19 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 29; (f) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 20 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 30; (g) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 21 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoá- cidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 31; (h) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 22 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 32; (i) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 23 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 33; ou (j) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 24 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 34. Em modalidades preferidas, o Ab ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo compete de forma cruzada pela ligação ao PD-1 com um Ab de referência ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo de referência que compreende uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoáci- dos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 16 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 26.

[00180] Em certas modalidades preferidas dos métodos de imuno- terapia divulgados aqui, o Ab anti-PD-L1 ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo administrada ao indivíduo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoáci- dos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 15 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 25; (b) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 16 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende amino- ácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 26; (c) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 17 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 27; (d) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 18 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 28; (e) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende ami- noácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apre-sentada na SEQ ID N°: 19 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 29; (f) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 20 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 30; (g) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 21 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 31; (h) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 22 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 32; (i) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende ami- noácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 23 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 33; ou (j) uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 24 e uma região variável de cadeia leve humana que compre-ende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 34. Em modalidades mais preferidas, o Ab anti-PD-L1 ou a porção que se liga ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada humana que compreende aminoáci- dos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 16 e uma região variável de cadeia leve humana que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 26. Espectro amplo de cânceres tratáveis por imunoterapia anti-PD-L1

[00181] A atividade clínica de anti-PD-L1 em pacientes com NSCLC avançado, similar à atividade de anti-PD-1 nestes pacientes, era sur-preendente e inesperada uma vez que o NSCLC foi considerado como sendo pouco capaz de responder a terapias à base do sistema imuno- lógico (Holt e Disis, 2008; Holt e outros, 2011). Os presentes dados clínicos obtidos com BMS-936559, um Ab anti-PD-L1 da invenção, substanciam e estendem a evidência obtida utilizando o Ab anti-PD-1 de que a imunoterapia com base em bloqueio de PD-1 não é aplicável somente aos tipos de tumores "imunogênicos", tais como MEL e RCC, mas também é eficiente com uma faixa ampla de cânceres, incluindo NSCLC metastático refratário ao tratamento, que geralmente não são considerados como sendo capazes de resposta imunológica. Os cânceres preferidos que podem ser tratados utilizando os Abs anti-PD-L1 da invenção incluem MEL (por exemplo, melanoma maligno metastáti- co), RCC, NSCLC escamosas, NSCLC não escamosas, CRC, câncer de ovário (OV), câncer gástrico (GC), câncer de mama (BC), carcinoma pancreático (PC) e carcinoma do esôfago. Adicionalmente, a invenção inclui malignidades refratárias ou recorrentes cujo crescimento pode ser inibido utilizando os Abs anti-PD-L1 da invenção.

[00182] Consequentemente, os exemplos de cânceres que podem ser tratados utilizando um Ab anti-PD-L1 nos métodos da invenção, com base nas indicações de aplicabilidade muito ampla de imunotera- pia anti-PD-L1 fornecidas aqui, incluem câncer de osso, câncer de pele, câncer da cabeça e do pescoço, câncer de mama, câncer de pul mão, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer renal, câncer de útero, câncer de próstata resistente à castração, câncer de cólon, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer de útero, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, carcinomas do ovário, do trato gastrointestinal e de mama, Doença de Hodgkin, linfoma sem ser de Hodgkin, cancer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, leucemias crônicas ou agudas incluindo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, tumores sólidos da infância, linfoma linfocítico, câncer da bexiga, câncer do rim ou do ureter, carcinoma da pelve renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma do SNC primário,angiogênese de tumor, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco encefálico, adenoma de pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epider- moide, câncer de célula escamosa, linfoma de células T, mieloma múltiplo,cânceres induzidos pelo ambiente incluindo aqueles induzidos por asbestos, cânceres metastáticos e quaisquer combinações dos ditos cânceres. A presente invenção também é aplicável para tratamento de cânceres metastáticos.

Terapia de combinação com Abs anti-PD-L1

[00183] Opcionalmente, os Abs para PD-L1 podem ser combinados com um agente imunogênico, por exemplo, uma preparação de células cancerosas, antígenos de tumor purificados (incluindo proteínas, pep- tídeos recombinantes e moléculas de carboidrato), células apresentadoras de antígeno tais como células dendríticas que carregam antíge- nos associados a tumor e células transfectadas com genes que codificam citocinas de estimulação imunológica (He e outros, 2004). Os exemplos não limitantes de vacinas para tumor que podem ser utilizadas incluem peptídeos de antígenos de melanoma, tais como peptí- deos de gp100, antígenos de MAGE, Trp-2, MART1 e/ou tirosinase ou células tumorais transfectadas para expressarem a citocina GM-CSF. O bloqueio de PD-L1 também pode ser eficientemente combinado com tratamentos padronizados de câncer, incluindo regimes quimioterapêu- ticos, radiação, cirurgia, privação de hormônio e inibidores da angio- gênese, bem como outro Ab imunoterapêutico (por exemplo, um Ab anti-PD-1, anti-CTLA-4 ou anti-LAG-3).

Usos de Abs anti-PD-L1

[00184] Esta descrição fornece o uso de qualquer Ab anti-PD-L1 ou porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção para a prepa-ração de um medicamento para a inibição da sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1 de forma a dessa maneira potencializar uma res-postaimunológica endógena em um indivíduo afligido com câncer. Estadescrição fornece ainda o uso de qualquer Ab anti-PD-L1 ou porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção para a preparação de um medicamento para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer que compreende a interrupção da interação entre PD-1 e PD-L1. A descrição fornece usos médicos de qualquer Ab anti-PD-L1 ou porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção correspondendo a todas as modalidades dos métodos de tratamento empregando um Ab anti-PD-L1 descritos aqui.

[00185] Esta descrição fornece ainda um Ab anti-PD-L1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção para uso no tratamento de um indivíduo afligido com câncer que compreende o aumento da potência de uma resposta imunológica endógena em um indivíduo afligido com câncer através da inibição da sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1. A descrição fornece ainda um Ab anti-PD-L1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção para uso na imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer que compreende a interrupção da interação entre PD-1 e PD-L1. Estes Abs podem ser utilizados no aumento da potência de uma resposta imunológica endógena contra ou na imunoterapia da faixa completa de cânceres divulgados aqui. Em modalidades preferidas, os cânceres incluem MEL (por exemplo, MEL maligno metastático), RCC, NSCLC escamosas, NSCLC não escamosas, CRC, câncer de ovário (OV), câncer gástrico (GC), câncer de mama (BC), carcinoma pancreático (PC) e carcinoma do esôfago.

Validação da Imunoterapia para Câncer através do Bloqueio de Ponto de Verificação Imunológica

[00186] Uma implicação importante da atividade clínica de bloqueio de ponto de verificação imunológica é que respostas imunológicas en-dógenassignificativas a antígenos de tumor são geradas e estas respostas podem ser montadas de forma terapêutica para mediar a re-gressão clínica de tumor após a inibição do ponto de verificação. Na verdade, há evidência de que ligantes inibidores tal como PD-L1 são induzidos em resposta ao ataque imunológico, um mecanismo denominadoresistência adaptativa (Gajewski e outros, 2010; Taube e ou-tros, 2012). Este mecanismo potencial de resistência imunológica por tumores sugere que a terapia direcionada para PD-1/PD-L1 poderia ser sinérgica com outros tratamentos que aumentam a imunidade antitumor endógena. Estudos de acompanhamento verificaram que os pacientes continuam a demonstrar controle do tumor após a interrupção do bloqueio da via de PD-1/PD-L1 (Lipson e outros, 2013). Tal controle de tumor pode refletir uma resposta imunológica antitumor persistente e a produção de memória imunológica eficiente para possibilitar o controle prolongado do crescimento do tumor.

[00187] Os dados divulgados aqui sobre o teste clínico de Abs que bloqueiam o receptor imunorregulador, PD-1 e também de Abs que bloqueiam um de seus ligantes cognatos, PD-L1, são sem precedentes. Estes dados constituem a maior experiência clínica até agora com a imunoterapia para câncer direcionada para a via de PD-1 e o primeiro relato que descreve especificamente a segurança, a tolerabilidade e a atividade clínica inicial de um agente direcionado para anti-PD-L1. Estas descobertas mostram que tanto anti-PD-1 quanto anti-PD-L1 possuem perfis favoráveis de segurança geral e fornecem evidência clara de atividade clínica ao longo de diversos cânceres, incluindo NSCLC, um tumor não historicamente considerado capaz de responder à imunoterapia, bem como tumores conhecidos por responderem à imunoterapia, incluindo MEL, RCC e OV. Assim, estes dados validam fortemente a via de PD-1/PD-L1 como um alvo importante para intervenção terapêutica no câncer.

[00188] As similaridades notáveis observadas entre os padrões de atividade clínica obtidos com os mAbs anti-PD-1 e anti-PD-L1 e entre os tipos de tumores analisados até agora, validam a importância geral da via de sinalização de PD-1/PD-L1 na resistência imunológica de tumor e como um alvo para intervenção terapêutica. Embora as interações moleculares bloqueadas por estes dois Abs não sejam idênticas, foi claramente demonstrado aqui que, independentemente de detalhes dos mecanismos, Abs tanto anti-PD-1 quanto anti-PD-L1 da invenção são eficientes no tratamento de pacientes afligidos com uma ampla variedade de cânceres.

Doenças Infecciosas

[00189] Outros métodos da invenção são utilizados para tratar pacientes que foram expostos a toxinas ou agentes patogênicos particula-res. Por exemplo, outro aspecto desta descrição fornece um método de tratamento de uma doença infecciosa em um indivíduo que com-preende a administração ao indivíduo de um Ab anti-PD1 ou um anti- PD-L1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo, da invenção de forma que o indivíduo é tratado para a doença infecciosa. Preferencialmente, o Ab é um Ab anti-PD-1 ou PD-L1 humano de seres humanos (tal como qualquer um dos Abs humanos descritos aqui). Alternativamente, o Ab é um Ab quimérico ou humanizado.

[00190] Similar à sua aplicação em tumores como discutido anteriormente, o bloqueio de PD-1 ou de PD-L1 mediado por Ab pode ser utilizado isoladamente ou como um adjuvante, em combinação com vacinas, para aumentar a potência de uma resposta imunológica a agentes patogênicos, toxinas e/ou antígenos próprios. Os exemplos de agentes patogênicos para os quais esta abordagem terapêutica pode ser particularmente útil incluem agentes patogênicos para os quais não há atualmente vacina eficiente ou agentes patogênicos para os quais as vacinas convencionais são menos que completamente eficientes. Estes incluem, mas não estão limitados a HIV, Hepatite (A, B e C), Influenza, Herpes, Giárdia, Malária, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. O bloqueio de PD-1 e/ou de PD-L1 é particularmenteútil contra infecções estabelecidas por agentes tal como HIV que apresenta antígenos alterados ao longo do curso de uma infecção. Novos epitopos sobre estes antígenos são reconhecidos como estranhos no momento da administração de anti-PD-1 ou PD-L1 humano, provocando assim uma forte resposta de células T que não é reduzida por sinais negativos ao longo da via de PD-1/PD-L1.

[00191] Nos métodos anteriores, o bloqueio de PD-1 ou de PD-L1 pode ser combinado com outras formas de imunoterapia tal como tra-tamento com citocina (por exemplo, administração de interferons, GM- CSF, G-CSF ou IL-2).

Kits

[00192] Ainda dentro do âmbito da presente invenção estão kits, incluindo kits farmacêuticos, que compreendem um Ab anti-PD-1 e/ou um anti-PD-L1 da invenção ou uma combinação de um Ab anti-PD-1 e um anti-CTLA-4, para usos terapêuticos e kits para diagnóstico que compreendem um Ab anti-PD-L1 da invenção para a análise da ex-pressão de PD-L1 membranoso como um biomarcador para a seleção de pacientes para imunoterapia ou para a previsão da eficácia de um agente imunoterapêutico. Os kits tipicamente incluem um rótulo indicando o uso pretendido do conteúdo do kit e instruções para uso. O termo rótulo inclui qualquer material escrito ou gravado fornecido sobre ou com o kit ou que acompanha de outra maneira o kit. Em certas modalidades de um kit farmacêutico, os Abs anti-PD-1 e/ou anti-PD-L1 podem ser embalados junto com outros agentes terapêuticos na forma de dosagem unitária. Em certas modalidades de um kit para diagnóstico, o Ab anti-PD-L1 pode ser embalado junto com outros reagentes para a realização de um ensaio para detectar e/ou quantificar a expressão de PD-L1.

[00193] Em certas modalidades preferidas, o kit farmacêutico compreende o HuMAb anti-PD-1 humano, nivolumab. Em outras modali-dades preferidas, o kit farmacêutico compreende o HuMAb anti-PD-L1 humano, BMS-936559. Ainda em outras modalidades preferidas, o kit farmacêutico compreende o HuMAb anti-CTLA-4 humano, ipilimumab. Em certas modalidades preferidas, o kit para diagnóstico compreende o mAb anti-PD-L1 humano de coelho, 28-8, que compreende as regiões de VH ede VK cujas sequências de aminoácidos são apresentadas nas SEQ ID NOs. 35 e 36, respectivamente. Em outras modalidades preferidas, o kit para diagnóstico compreende o mAb anti-PD-L1 humano murino, 5H1 (Dong e outros, 2002).

Biomarcador de PD-L1 para a Previsão da Eficácia Anti-PD-1

[00194] Um desafio particular na imunoterapia para câncer tem sido a identificação de biomarcadores de prognóstico com base no meca-nismo para possibilitar a seleção de pacientes e guiar o controle em tratamento. Os dados divulgados nos Exemplos a seguir indicam que a expressão de PD-L1 na superfície celular nos tumores é um marcador molecular útil para a previsão da eficácia de e para a seleção de pacientes para, imunoterapia com anti-PD-1 e potencialmente outros inibidores de pontos de verificação imunológica.

[00195] Há relatos conflitantes na literatura em relação às implicações clínicas de PD-L1 ser expresso em tumores. Vários estudos con-cluíram que a expressão de PD-L1 em tumores se correlaciona com um prognóstico ruim para o paciente. Ver, por exemplo, Hino e outros (2010) (MEL); Hamanishi e outros (2007) (OV); Thompson e outros (2006) (RCC). Estas descobertas podem ser ponderadas com base de que a interação de PD-L1 sobre células tumorais e PD-1 sobre células T ajuda a anular as respostas imunológicas direcionadas contra o tumor, resultando na evasão imunológica das células T específicas para o tumor (Blank e outros, 2005). Entretanto, em contraste com os estudos anteriores, Gadiot e outros (2011) e Taube e outros (2012) relataram recentemente que a expressão de PD-L1 em tumores de melanoma se correlaciona com uma tendência em direção à melhor sobrevivência. Estes dados aparentemente contraditórios podem refletir os números relativamente pequenos de pacientes analisados, os subtipos histológicos diferentes estudados ou as metodologias diferentes utilizadas, por exemplo, o uso de Abs diferentes para corar PD-L1, o uso de material congelado versus incrustado em parafina para IHC e a detecção de coloração de PD-L1 membranoso ou citoplasmático. Taube e outros (2012) observaram que o PD-L1 é uma molécula transmem- brana do tipo I e levantaram a hipótese de que embora a presença de PD-L1 citoplasmático possa representar armazenamentos intracelulares deste polipeptídeo que pode ser distribuído para a superfície celularapós estímulo apropriado, é a expressão de PD-L1 na superfície celular que é biologicamente relevante como um biomarcador potencial para a previsão de resposta clínica para o bloqueio de PD-1. Ver, também, Brahmer e outros (2010), que descreve uma evidência preliminar, obtida em um tamanho de amostra pequeno de apenas 9 paci-entes, de uma correlação entre a expressão de PD-L1 membranoso e a eficácia anti-PD-1. Os dados descritos nos Exemplos a seguir sobre o uso da expressão de PD-L1 membranoso como um biomarcador para eficácia anti-PD-1, que foram obtidos partindo da análise de uma amostra muito maior, substanciam a hipótese de que a expressão de PD-L1 pode ser utilizada como um biomarcador para a previsão de resposta clínica anti-PD-1 e para a seleção de pacientes para identificar candidatos adequados para imunoterapia com um Ab anti-PD-1. Embora a utilidade deste biomarcador tivesse sido demonstrada para a seleção de pacientes para ou para a previsão da resposta clínica para, imunoterapia anti-PD-1, a expressão de PD-L1 também pode ser potencialmente aplicável mais amplamente como um biomarcador associado para outros tipos de inibidores de imunorreguladores inibidores.

[00196] Especificamente, a expressão de PD-L1 membranoso foi analisada utilizando um protocolo de IHC automatizado e um Ab anti- hPD-L1 de coelho. De forma impressionante, no conjunto de dados iniciais analisados (ver o Exemplo 8), nenhum paciente com tumores negativos em relação a PD-L1 na superfície celular (MEL, NSCLC, CRC, RCC e CRPC) sofreu um ou seguiu o tratamento com o Ab anti- PD-1, nivolumab. Em contraste, a expressão na superfície celular de PD-L1 sobre células tumorais em biópsias pré-tratamento pode estar associada a uma maior taxa de OR entre os pacientes tratados com nivolumab. Embora a expressão de PD-L1 nas células tumorais possa ser controlada por vias oncogênicas constitutivas, esta também pode refletir "resistência imunológica adaptativa" em resposta a uma respostaimunológica antitumor endógena, parte da resposta inflamatória de um hospedeiro, que pode permanecer sob controle a não ser que seja liberada pelo bloqueio da via de PD-1/PD-L1 (Taube e outros, 2012). Este conceito emergente de resistência imunológica adaptativa na imunologia de câncer sugere que ligantes inibidores tal como PD-L1 são induzidos em resposta ao ataque imunológico (Gajewski e outros, 2010; Taube e outros, 2012). Uma implicação importante da atividade clínica de bloqueio de ponto de verificação imunológica como descrito aqui é que respostas imunológicas endógenas significativas a antíge- nos de tumor são geradas e estas respostas podem ser montadas de forma terapêutica para mediar a regressão clínica de tumor após a inibição do ponto de verificação. Este mecanismo potencial de resistênciaimunológica por tumores sugere que a terapia direcionada para PD-1/PD-L1 poderia ter efeito sinérgico com outros tratamentos que aumentam a imunidade antitumor endógena.

Avaliação da Expressão na Superfície Celular de PD-L1 por IHC Automatizada

[00197] Como descrito nos Exemplos, um método de IHC automatizado foi desenvolvido para a avaliação da expressão de PD-L1 sobre a superfície das células em espécimes de tecido FFPE. Esta descrição fornece métodos para a detecção da presença de antígeno de PD-L1 humano em uma amostra de tecido de teste ou para a quantificação do nível de antígeno de PD-L1 humano ou da proporção de células na amostra que expressam o antígeno, cujos métodos compreendem o contato da amostra de teste e uma amostra de controle negativo, com um mAb que se liga especificamente ao PD-L1 humano, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o Ab ou a porção do mesmo e o PD-L1 humano. Preferencialmente, as amostras de tecido de teste e de controle são amostras FFPE. É então detectada a formação de um complexo, em que uma diferença na formação de complexo entre a amostra de teste e a amostra de controle negativo é indicativa da presença de antígeno de PD-L1 humano na amostra. Vá- rios métodos são utilizados para quantificar a expressão de PD-L1.

[00198] Em uma modalidade particular, o método de IHC automatizado compreende: (a) a extração da parafina e a reidratação das seções de tecido montadas em um autocolorador; (b) a recuperação do antígeno utilizando uma câmara de extração do revestimento e tampão com pH 6, aquecida a 110°C for 10 min; (c) o ajuste dos reagentes sobre um autocolorador; e (d) a corrida no autocolorador para incluir etapas de neutralização da peroxidase endógena no espécime de tecido; de bloqueio de sítios de ligação de proteínas não específicos sobre as lâminas; de incubação das lâminas com Ab primárrio; de incubação com um agente de bloqueio pós-primário; de incubação com NovoLink Polymer; de adição de um substrato cromogênico e de revelação; e de contracoloração com hematoxilina.

[00199] Para a avaliação da expressão de PD-L1 em amostras de tecido tumoral, um patologista examina o número de células tumorais PD-L1+ na membrana em cada campo sobre um microscópio e estima mentalmente a porcentagem de células que são positivas, então tira uma média das mesmas para chegar na porcentagem final. As intensidades de coloração diferentes são definidas como 0/negativa, 1+/fraca, 2+/moderada e 3+/forte. Tipicamente, os valores percentuais são primeiramente atribuídos às memórias de dados (buckets) 0 e 3+ e então as intensidades 1+ e 2+ intermediárias são consideradas. Para tecidos altamente heterogêneos, o espécime é dividido em zonas e cada zona é classificada separadamente e então combinada em um único conjunto de valores percentuais. As porcentagens de células negativas e positivas para as intensidades de coloração diferentes são determinadas partindo de cada área e um valor mediano é fornecido para cada zona. Um valor de porcentagem final é fornecido ao tecido para cada categoria de intensidade de coloração: negativa, 1+, 2+ e 3+. A soma de todas as intensidades de coloração precisa ser 100%.

[00200] A coloração também é avaliada nas células inflamatórias que se infiltram no tumor tais como macrófagos e linfócitos. Na maioria dos casos os macrófagos servem como um controle positivo interno uma vez que a coloração é observada em uma grande proporção de macrófagos. Embora não haja necessidade de 3+ intensidade, uma ausência de coloração de macrófagos deve ser levada em considera-ção para descartar qualquer falha técnica. Os macrófagos e os linfóci- tos são avaliados em relação à coloração da membrana plasmática e somente registrados para todas as amostras como sendo positivos ou negativos para cada categoria de célula. A coloração é também caracterizada de acordo com uma designação de célula imunológica de tumor fora/dentro. "Dentro" significa que a célula imunológica está dentro do tecido tumoral e/ou nos limites da região de tumor sem ficarem fisicamente intercaladas entre as células tumorais. "Fora" significa que não há associação física com o tumor, as células imunológicas sendo encontradas na periferia associadas com tecido conjuntivo ou qualquer adjacente associado.

[00201] Em certas modalidades destes métodos de classificação, as amostras são classificadas por dois patologistas que trabalham in-dependentemente e os escores são subsequentemente consolidados. Em certas outras modalidades, a identificação de células positivas e negativas é classificada utilizando software apropriado.

[00202] Um histoscore é utilizado como uma medida mais quantitativa dos dados de IHC. O histoscore é calculado como a seguir: Histoscore = [(% de tumor x 1 (intensidade baixa)) + (% de tumor x 2 (intensidade média)) + (% de tumor x 3 (intensidade alta)]

[00203] Para determinar o histoscore, o patologista estima a porcentagem de células coradas em cada categoria de intensidade dentro de um espécime. Devido ao fato de que a expressão da maioria dos biomarcadores é heterogênea o histoscore é uma representação mais verdadeira da expressão total. A faixa de histoscore final é de 0 (sem expressão) até 300 (expressão máxima).

[00204] Um meio alternativo de quantificação da expressão de PD- L1 em uma amostra de tecido de teste IHC é determinar o escore de inflamação ajustado (AIS) o escore definido como a densidade de inflamação multiplicada pela porcentagem de expressão de PD-L1 pelas células inflamatórias que se infiltram no tumor (Taube e outros, 2012).

Imunoterapia para Câncer com Anti-PD-1 que Compreende uma Etapa de Seleção de Pacientes

[00205] Esta descrição fornece ainda um método para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a seleção de um indivíduo que é um candidato adequado para imunote- rapia, por exemplo, administração de um Ab anti-PD-1, a seleção compreendendo (i) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatóriasque se infiltram no tumor, (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular e (iii) a seleção do indivíduo como um candidato adequado com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular excede um nível de limiar predeterminado; e (b) a administração ao indivíduo selecionado de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente que inibe a sinalização partindo de um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1.

[00206] Há evidência de que a expressão de PD-L1 membranoso é um substituto para uma resposta imunológica antitumor endógena que faz parte da resposta inflamatória de um hospedeiro (Gajewski e outros, 2010; Taube e outros, 2012). Consequentemente, a expressão na superfície celular de PD-L1 em tumores e/ou células inflamatórias no microambiente do tumor pode ser um marcador não somente para a seleção de pacientes com câncer que se beneficiariam do tratamento com um Ab anti-PD-1, mas também para o tratamento com um Ab anti- PD-L1 bem como tratamentos que se direcionam para as vias inibido- ras do imunorregulador sem ser a via de PD-1/PD-L1. Por exemplo, a expressão na superfície celular de PD-L1 em tumores e/ou células inflamatóriasque se infiltram no tumor pode ser utilizada como um marcador para a identificação ou para a seleção de pacientes com câncer adequados que se beneficiariam da imunoterapia com agentes, incluindo Abs, que se direcionam e interrompem ou inibem a sinalização partindo de, pontos de verificação imunológica tais como PD-L1, Antí- geno-4 de Linfócitos T Citotóxicos (CTLA-4), Atenuador de Lifócitos B e T (BTLA), Domínio-3 da Imunoglobulina e da Mucina de células T (TIM-3), Gene de Ativação de Linfócitos-3 (LAG-3), Receptor similar à Imunoglobulina Killer (KIR), Receptor G1 similar à Lectina de células Killer (KLRG-1), Receptor de Células Natural Killer 2B4 (CD244) e CD160 (Pardoll, 2012; Baitsch e outros, 2012). Em certas modalidades preferidas, o imunorregulador inibidor é um componente da via de sinalização de PD-1/PD-L1. Em outras modalidades preferidas, o imu- norregulador inibidor é um Ab anti-PD-1 da invenção. Ainda em outras modalidades preferidas, o imunorregulador inibidor é um Ab anti-PD- L1 da invenção.

[00207] Onde quaisquer métodos de imunoterapia que compreendem a análise da expressão de PD-L1, isto é, empregando um bio- marcador de expressão de PD-L1, forem descritos a seguir como compreendendo a seleção de um paciente que é ou não adequado para imunoterapia anti-PD-1 ou como compreendendo a administração de um Ab anti-PD-1 para finalidades imunoterapêuticas, deve ser en-tendido que estes métodos se aplicam mais amplamente à seleção de um paciente que é ou não adequado para imunoterapia com ou para a administração de um inibidor de, um imunorregulador inibidor (por exemplo, CTLA-4, BTLA, TIM3, LAG3 ou KIR) ou um componente ou um ligante do mesmo. Adicionalmente, em qualquer um dos métodos que compreendem a medida da expressão de PD-L1 em uma amostra de tecido de teste, deve ser entendido que a etapa que compreende o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente é uma etapa opcional. Isto é, em certas modalidades o método inclui esta etapa e em outras modalidades, esta etapa não é incluída no método.Também deve ser entendido que em certas modalidades preferidas a etapa de "avaliação"para identificar ou para determinar o número ou a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular é realizada através de um método transformativo de análise em relação à expressão de PD-L1, por exemplo, através da realização de um ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) ou um ensaio de IHC. Em certas outras modalidades, nenhuma etapa transformativa é envolvida e a expressão de PD-L1 é avaliada, por exemplo, através da revisão de um relatório dos resultados de teste de um laboratório. Em certas modalidades, as etapas dos métodos até e incluindo, a avaliação da expressão de PD-L1 fornecem um resultado intermediário que pode ser fornecido a um médico ou outro praticante da medicina para uso na seleção de um candidato adequado para imunoterapia e/ou administração de um agente imunoterapêutico ao paciente. Em certas modalidades, as etapas que fornecem o resultado intermediário podem ser realizadas por um praticante da medicina ou por alguém que atua sob a direção de um praticante da medicina. Em outras modalidades, estas etapas são realizadas por um laboratório independente ou por uma pessoa independente tal como um técnico de laboratório.

[00208] A descrição fornece ainda um método para o tratamento de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a seleção de um indivíduo que não é adequado para o tratamento com um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, imunote- rapia com Ab anti-PD-1, a seleção compreendendo (i) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 na superfície das células; e (iii) a seleção do indivíduo que não é adequado para imunoterapia com um inibidor de um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular é menor que um nível de limiar predeterminado; e (b) a administração de um padrão de cuidado terapêutico sem ser um inibidor de um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, ao indivíduo selecionado.

Medida de expressão de PD-L1

[00209] Em certas modalidades de qualquer um dos presentes métodos, a proporção de células que expressam PD-L1 é avaliada através da realização de um ensaio para determinar a presença de RNA de PD-L1. Em modalidades adicionais, a presença de RNA de PD-L1 é determinada por RT-PCR, hibridização in situ ou proteção da RNase. Em outras modalidades, a proporção de células que expressam PD-L1 é avaliada através da realização de um ensaio para determinar a presença do polipeptídeo de PD-L1. Em modalidades adicionais, a presença do polipeptídeo de PD-L1 é determinada por imunohistoquímica (IHC), ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), obtenção de imagens in vivo ou citometria de fluxo. Em modalidades preferidas, a expressão de PD-L1 é analisada por IHC. A citometria de fluxo pode ser particularmente adequada para a análise de expressão de PD-L1 em células de tumores hematológicos. Em modalidades preferidas de todos estes métodos, a expressão na superfície celular de PD-L1 é analisada utilizando, por exemplo, IHC ou obtenção de imagens in vivo.

[00210] As técnicas de obtenção de imagens forneceram ferramentas importantes na pesquisa e no tratamento de câncer. Desenvolvi-mentos recentes em sistemas obtenção de imagens moleculares, incluindo tomografia com emissão de pósitrons (PET), tomografia com-putadorizada com emissão de fótons isolados (SPECT), obtenção de imagens por refletância de fluorescência (FRI), tomografia mediada por fluorescência (FMT), obtenção de imagens por bioluminescência (BLI), microscopia confocal de varredura com laser (LSCM) e microscopia com multifótons (MPM), provavelmente serão precursores ainda maiores do uso destas técnicas na pesquisa de câncer. Alguns destes sistemas de obtenção de imagens moleculares permitem que os médicos não somente vejam onde um tumor está localizado no corpo, mas também que visualizem a expressão e a atividade de moléculas, células e processos biológicos específicos que influenciam no comportamento e/ou na capacidade de resposta do tumor a fármacos terapêuticos (Condeelis e Weissleder, 2010). A especificidade do Ab, acoplada com a sensibilidade e a resolução de PET, torna a obtenção de imagens por immunoPET particularmente atraentes para o monitoramento e para a análise da expressão de antígenos nas amostras de tecido (McCabe e Wu, 2010; Olafsen e outros, 2010). Em certas modalidades de qualquer um dos presentes métodos, a expressão de PD-L1 é analisada por obtenção de imagens por immunoPET.

[00211] Em certas modalidades de qualquer um dos presentes métodos, a proporção de células em uma amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 é avaliada através da realização de um ensaio para determinar a presença do polipeptídeo de PD-L1 sobre a superfície das células na amostra de tecido de teste. Em certas modalidades, a amostra de tecido de teste é uma amostra de tecido FFPE. Em certas modalidades preferidas, a presença do polipeptídeo de PD-L1 é determinada por ensaio de IHC. Em modalidades adicionais, o ensaio de IHC é realizado utilizando um processo automatizado. Em modalidades adicionais, o ensaio de IHC é realizado utilizando um mAb anti- PD-L1 para se ligar ao polipeptídeo de PD-L1.

Abs que se ligam especificamente ao PD-L1 expresso na superfície celular em tecidos FFPE

[00212] Um Ab pode ser ligar a um antígeno em tecidos frescos, mas falham completamente em reconhecer o antígeno em uma amostra de tecido FFPE. Acredita-se que este fenômeno, bem conhecido na técnica, seja devido primariamente à ligação cruzada intra- e intermo- lecular de polipeptídeos induzidos pela fixação com formalina, que altera o epitopo reconhecido pelo Ab (Sompuram e outros, 2006). Em adição, vários fatores conhecidos por influenciarem a coloração no tecido FFPE, incluindo tempo de fixação variável, período de fixação inadequado, diferenças no fixador utilizado, processamento do tecido, clone e diluição de Ab, recuperação do antígeno, sistema de detecção e interpretação dos resultados utilizando pontos de limiares diferentes são variáveis importantes que podem afetar a antigenicidade do tecido e as medidas de IHC (Bordeaux e outros, 2010). Em particular, uma falta de Abs anti-PD-L1 humanos que coram PD-L1 em espécimes FFPE foi notada na técnica (Hamanishi e outros, 2007). Taube e outros (2012) e Gadiot e outros (2011) também relataram dificuldades na identificação de Abs anti-PD-L1 que se ligam especificamente ao PD- L1 em tecidos FFPE e resultados de testes incoerentes sobre os mesmos Abs. A análise dos presentes inventores de cinco Abs anti- hPD-L1 disponíveis comercialmente mostra que estes Abs falharam em distinguir células FFPE expressando PD-L1 das células que não expressavam PD-L1 (ver o Exemplo 9, Tabela 7). Assim, os resultados contraditórios relatados por grupos diferentes sobre as implicações da expressão de PD-L1 para prognóstico de um tumor podem, em parte, refletir as capacidades diferenciais dos Abs anti-PD-L1 utilizados para detectar o polipeptídeo de PD-L1 em amostras de tecido FFPE. Consequentemente, com a finalidade de detectar hPD-L1 sobre a superfície das células utilizando um ensaio de IHC sobre tecidos FFPE, há uma necessidade de Abs anti-hPD-L1 que se ligam especificamente ao PD-L1 expresso na superfície celular em amostras de tecido FFPE.

[00213] Esta descrição fornece um mAb ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um antígeno de PD-L1 expresso na superfície celular em uma amostra de tecido FFPE. Em modalidades preferidas, o mAb ou a porção que se liga ao antíge- no do mesmo não se liga a um polipeptídeo de PD-L1 citoplasmático na amostra de tecido FFPE ou exibe um nível muito baixo de ligação residual. Em certas outras modalidades, a presença ou a ausência de ligação especificamente a um polipeptídeo de PD-L1 expresso na superfície celular ou um citoplasmático é detectada por coloração imu- nohistoquímica. Em certos aspectos preferidos da invenção, o mAb ou a porção que se liga ao antígeno é um Ab de coelho ou uma porção do mesmo. Em outras modalidades preferidas, o mAb é o mAb de coelho designado 28-8, 28-1, 28-12, 29-8 ou 20-12. Em modalidades mais preferidas, o mAb é o mAb de coelho designado 28-8 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. Em modalidades adicionais, o mAb é um Ab que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 35 e uma região variável de cadeia leve (V K) que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 36. Em outras modalidades, o mAb compreende os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 em uma VH que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 35 e os domínios de CDR1, CDR2 e CDR3 em uma VKque possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 36.

[00214] É sabido na técnica que os Abs de coelho possuem certas vantagens em relação aos Abs murinos. Por exemplo, os Abs de coe-lho geralmente exibem reconhecimento de epitopo mais diverso, melhor resposta imunológica para epitopos de tamanho pequeno e espe-cificidade e afinidade mais altas comparados com os Abs murinos (ver, por exemplo, Fischer e outros, 2008; Cheang e outros, 2006; Rossi e outros, 2005). Por exemplo, a dominância imunológica menor e o repertório de células B maior do coelho resultam em maior reconhecimento de epitopo comparado com os Abs murinos. Adicionalmente, a alta especificidade e o reconhecimento de novos epitopos de anticorpos de coelho traduzem o sucesso com o reconhecimento de modificações pós-tradução (Epitomics, 2013). Em adição, muitos alvos de proteína relevantes para a transdução de sinal e para doença são altamente conservados entre camundongos, ratos e seres humanos e podem, portanto, ser reconhecidos como antígenos próprios por um camundongo ou um rato hospedeiro, tornando-os menos imunogêni- cos. Este problema é evitado através da produção de Abs em coelhos. Além disso, em aplicações em que dois Abs específicos para o antíge- no são necessários, é mais conveniente ter os Abs vindos de duas espécies diferentes. Assim, por exemplo, é mais fácil "multiplexar" um Ab de coelho tal como 28-8 com outros Abs (provavelmente sendo Abs murinos uma vez que os melhores Abs de marcação imunológica são Abs murinos) que pode marcar células imunológicas que também expressam PD-L1 (por exemplo, macrófagos e linfócitos). Consequentemente, os mAbs anti-hPD-L1 de coelho, por exemplo, 28-8, são particularmente adequados para ensaios de IHC para a detecção de PD-L1 expresso na superfície em amostras de tecido FFPE e potencialmente possuem vantagens distintas em relação aos Abs murinos, tal como 5H1.

[00215] Como descrito no Exemplo 9, um grande número (185) de multiclones de Ab provenientes de imunizações tanto de coelho quanto de camundongo foi verificado e apenas dez multiclones de Ab de coelho, mas nenhum de Ab de camundongo, detectaram especificamente a forma membranosa de hPD-L1. Após verificação extensiva adicional através de várias rodadas de IHC, 15 subclones de coelho purificados foram selecionados com base em sua especificidade e intensidade de coloração (ver a Tabela 5). Após a caracterização adicional dos anticorpos para determinar sua afinidade de ligação e competição cruzada por ressonância de plasmon de superfície, bem como verificação por IHC nos tecidos FFPE, o mAb 28-8 foi selecionado como o Ab com a melhor combinação de ligação ao PDF-L1 membranoso com alta afinidade e especificidade e pouca coloração residual.

[00216] Em certos aspectos desta invenção, o mAb ou a porção que se liga ao antígeno compete de forma cruzada com o mAb 5H1 de camundongo pela ligação ao PD-L1, o que indica que estes anticorpos se ligam à mesma região de epitopo de PD-L1. Em certos outros aspectos, o mAb ou a porção que se liga ao antígeno do mesmo não compete de forma cruzada com o mAb 5H1 de camundongo pela ligação ao PD-L1, indicando que estes não se ligam à mesma região de epitopo de PD-L1.

[00217] A descrição fornece ainda ácidos nucleicos que codificam todos os Abs anti-hPD-L1 de coelho ou porções dos mesmos divulga-das aqui.

Métodos imunoterapêuticos que compreendem a medida da expressão de PD-L1 na superfície celular

[00218] A disponibilidade de Abs de coelho que se ligam com alta afinidade especificamente ao PD-L1 membranoso em espécimes de tecido FFPE facilita métodos que compreendem uma etapa de detecção do polipeptídeo de PD-L1 sobre a superfície das células em amostras de tecido FFPE. Consequentemente, esta descrição fornece ainda um método para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a seleção de um indivíduo que é um candidato adequado para imunoterapia, a seleção compreendendo: (i) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste FFPE obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular por IHC utilizando um Ab anti-PD-L1 humano de coelho, por exemplo, mAb 28-8, para se ligar ao PD-L1; e (iii) a seleção do indivíduo como um candidato adequado com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular excede um nível de limiar predeterminado; e (b) a administração de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, ao indivíduo selecionado.

[00219] Em certas modalidades de métodos que empregam IHC para analisar a expressão de PD-L1 em tecidos FFPE, um ensaio de IHC automatizado é utilizado. O processo de IHC automatizado é realizado sobre um autocolorador e compreende: (a) a extração da parafina da amostra FFPE com xileno e reidratação da amostra; (b) a recuperação do antígeno utilizando uma câmara de extração do revesti-mento; (c) o bloqueio dos sítios de ligação de proteína não específicos através da incubação com um Protein Block; (d) a incubação da amostra com um Ab anti-PD-L1 primário; (e) a adição de um Ab secundário conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) polimérico; (f) a detec- ção do Ab secundário ligado que compreende a coloração com um cromogênio de 3,3’-diaminobenzidina (DAB); e/ou (g) a contracolora- ção com hematoxilina. Este processo de IHC automatizado foi otimizadoatravés da minimização do número de etapas, da otimização dos tempos de incubação e da seleção de Abs primários, do bloqueio e da detecção de reagentes que produzem coloração específica forte com um baixo nível de coloração residual. Em modalidades preferidas deste ensaio de IHC automatizado, o Ab anti-PD-L1 primário é o mAb 28-8 de coelho ou o mAb 5H1 murino. Em certas modalidades desta invenção, este ensaio de IHC e qualquer outro ensaio de IHC descrito aqui para medir a expressão de PD-L1, podem ser utilizados como parte de um método de imunoterapia. Em outras modalidades, qualquer um dos métodos de IHC descritos aqui é utilizado independentemente de qualquer processo terapêutico que requera a administração de um agente terapêutico, isto é, unicamente como um método de diagnóstico para analisar a expressão de PD-L1.

[00220] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos de imunoterapia descritos aqui, o Ab administrado ao indivíduo selecionadoé qualquer Ab anti-PD-1 ou anti-PD-L1 ou porção que se liga ao antígeno do mesmo da invenção. Em certas modalidades preferidas, o indivíduo é um ser humano. Em outras modalidades preferidas, o Ab é um Ab humano ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo. Em modalidades mais preferidas, o Ab anti-PD-1 é nivolumab e o Ab anti- PD-L1 é BMS-936559. Em certas outras modalidades, o Ab anti-PD-1 é um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que compete de forma cruzada com nivolumab pela ligação ao PD-1 e o Ab anti-PD-L1 é um Ab ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que compete de forma cruzada com BMS-936559 pela ligação ao PD- L1. Em certas modalidades preferidas, o câncer que será tratado é selecionado do grupo que consiste em MEL, RCC, NSCLC escamosas, NSCLC não escamosas, CRC, câncer de próstata resistente à castração CRPC, HCC, carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço, carcinomas do esôfago, de ovário, do trato gastrointestinal e de mama e uma malignidade hematológica.

[00221] Em certas modalidades dos métodos divulgados, o limiar predeterminado é baseado em uma proporção de (a) células tumorais, (b) células inflamatórias que se infiltram no tumor, (c) células inflamatórias particulares que se infiltram no tumor, por exemplo, TILs ou ma- crófagos ou (d) uma combinação de células tumorais e células inflamatóriasque se infiltram no tumor, em uma amostra de tecido de teste que expressa PD-L1 sobre a superfície celular. Em certas modalidades, o limiar predeterminado é de pelo menos 0,001% de células tu- morais expressando PD-L1 membranoso que é determinado por IHC. Em outras modalidades, o limiar predeterminado é de pelo menos 0,01%, preferencialmente pelo menos 0,1%, mais preferencialmente pelo menos 1% de células tumorais expressando PD-L1 membranoso, que é determinado por IHC. Em certas modalidades, o limiar predeterminadoé de pelo menos 5% de células tumorais expressando PD- L1 membranoso que é determinado por IHC. Em certas modalidades, o limiar predeterminado é de pelo menos 0,01%, pelo menos 0,1%, pelo menos 1% ou pelo menos 5% de células tumorais expressando PD-L1 membranoso que é determinado por IHC e/ou uma única célula inflamatória que se infiltra no tumor expressando PD-L1 membranoso que é determinado por IHC. Em certas outras modalidades, o limiar predeterminado é de pelo menos 0,01%, pelo menos 0,1%, pelo menos 1% ou pelo menos 5% de uma célula inflamatória que se infiltra no tumor expressando PD-L1 membranoso que é determinado por IHC. Em certas outras modalidades, o limiar predeterminado é de pelo menos 0,01%, pelo menos 0,1%, pelo menos 1% ou pelo menos 5% de um linfócito que se infiltra no tumor expressando PD-L1 membranoso que é determinado por IHC. Em certas outras modalidades, o limiar predeterminado é de pelo menos 0,01%, pelo menos 0,1%, pelo me-nos 1% ou pelo menos 5% de um macrófago que se infiltra no tumor expressando PD-L1 membranoso que é determinado por IHC. Ainda em outras modalidades, o limiar predeterminado é de pelo menos uma única célula tumoral ou uma única célula inflamatória que se infiltra no tumor expressando PD-L1 membranoso que é determinado por IHC. Preferencialmente, a expressão de PD-L1 é analisada por IHC automatizado utilizando mAb 28-8 ou 5H1 como o Ab primário.

[00222] Esta descrição fornece ainda um método para o tratamento de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a verificação de um grande número de indivíduos para identificar um indivíduo que não é um candidato adequado para imunoterapia que compreende a administração de um agente que inibe um imunorregu- lador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, ao indivíduo, a verificação compreendendo: (i) opcionalmente o fornecimento de amostras de tecido de teste provenientes do grande número de indivíduos, as amostras de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de testes que expressam PD-L1 na superfície das células; e (iii) a seleção do indivíduo como um candidato que não é adequado para imunoterapia com base em uma avaliação de que a proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície das células na amostra de tecido de teste do indivíduo fica abaixo de um nível de limiar predeterminado; e (b) a administração de um padrão de cuidado terapêutico sem ser um agente que inibe um imunor- regulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, ao indivíduo selecionado.

[00223] Esta descrição fornece ainda um método para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a verificação de um grande número de indivíduos para identificar um indivíduo que é um candidato adequado para imunoterapia, a verificação compreendendo: (i) opcionalmente o fornecimento de amostras de tecido de teste provenientes do grande número de indivíduos, as amostras de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatóriasque se infiltram no tumor; (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de testes que expressam PD-L1 na superfície das células; e (iii) a seleção do indivíduo como um candidato que é adequado para imunoterapia com um agente que inibe um imu- norregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular excede um nível de limiar predeterminado; e (b) a administração de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente do dito agente ao indivíduo selecionado.

[00224] Esta descrição fornece adicionalmente um método para o tratamento de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compre-ende: (a) a verificação de um grande número de indivíduos para identificar um indivíduo que é um candidato adequado para o tratamento, a verificação compreendendo: (i) opcionalmente o fornecimento de amostras de tecido de teste provenientes do grande número de indiví-duos, as amostras de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de testes que expressam PD-L1 na superfície das células, em que o indivíduo é identificado como um candidato adequado para imunoterapia com Ab anti-PD-1 se a proporção de células na amostra de tecido que expressam PD-L1 sobre a superfície celular exceder um nível de limiar predeterminado e o indivíduo é identificado como um candidato que não é um candidato adequado para imunoterapia com Ab anti-PD-1 se a proporção de cé- lulas na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular ficar abaixo de um nível de limiar predeterminado; e (b) a administração de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente que inibe um imunorregula- dor inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, ao indivíduo identificado como um candidato adequado para imunoterapia com Ab anti-PD-1 ou (c) a administração de um padrão de cuidado terapêutico sem ser o dito agente ao indivíduo identificado como não sendo um candidato adequado para imunoterapia com Ab anti-PD-1.

[00225] Um aspecto desta invenção é um método para imunotera- pia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a determinação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular está acima de um nível de limiar predeterminado; e (c) com base em tal determinação a administração de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, ao indivíduo. Outro aspecto da invenção é um método para o tratamento de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a determinação do fato de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular está abaixo de um nível de limiar predeterminado; e (c) com base em tal determinação a administração de um padrão de cuidado terapêutico sem ser um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, ao indivíduo.

[00226] Ainda outro aspecto da invenção é um método para imuno- terapia de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a determinação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; (c) a seleção de um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, como um tratamento para o indivíduo com base no reconhecimento de que um Ab anti-PD-1 é eficiente em pacientes cuja amostra de tecido de teste contém uma proporção de células acima de um nível de limiar predeterminado que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; e (d) a administração de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente do dito agente ao indivíduo. Em outra modalidade, esta descrição fornece um método para o tratamento de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a determinação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; (c) a seleção de um padrão de cuidado terapêutico sem ser um agente que inibe um imunor- regulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, como um tratamento para o indivíduo com base no reconhecimento de que o dito agente não é eficiente em pacientes nos quais a proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular na amostra de tecido de tes te fica abaixo de um nível de limiar predeterminado; e (d) a administração do padrão de cuidado terapêutico ao indivíduo.

[00227] Esta descrição fornece ainda um método de seleção de uma imunoterapia para um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a análise das células de uma amostra de tecido de teste que compreende células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor para avaliar a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1; e (b) com base em uma avaliação de que a proporção de células que expressam PD-L1 membrano- so está acima de um nível de limiar predeterminado, a seleção de uma imunoterapia que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, para o indivíduo. A descrição fornece ainda um método de seleção de um tratamento para um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende: (a) a análise das células de uma amostra de tecido de teste que compreende células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor para avaliar a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1; e (b) com base em uma avaliação de que a proporção de células que expressam PD-L1 membranoso fica abaixo de um nível de limiar predeterminado, a seleção de um tratamento de padrão de cuidado sem ser um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, para o indivíduo.

[00228] Em adição, esta descrição fornece um método para o tratamento de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende a administração ao indivíduo de uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficiente de um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, o indívuo tendo sido selecionado com base em que a proporção de células em uma amostra de tecido de teste do indivíduo que expressam PD-L1 é determinada como excedendo um nível de limiar predeterminado, em que a amostra de tecido de teste compreende células tumorais e célulasinflamatórias que se infiltram no tumor. Esta descrição fornece ainda um método para o tratamento de um indivíduo afligido com câncer, cujo método compreende a administração ao indivíduo de um tratamento de padrão de cuidado sem ser um agente que inibe um imunor- regulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, o indívuo tendo sido selecionado com base em que a proporção de células em uma amostra de tecido de teste do indivíduo que expressam PD-L1 é determinada como estando abaixo de um nível de limiar predeterminado, em que a amostra de tecido de teste compreende células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor.

[00229] Esta descrição fornece ainda um método para a seleção de um paciente com câncer para imunoterapia com um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a análise da amostra de tecido de teste para determinar a proporção de células na mesma que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; (c) a comparação da proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular com uma proporção de limiar predeterminada; e (d) a seleção do paciente para imunoterapia com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam superfície PD-L1 fica acima do nível de limiar predeterminado.

[00230] Em qualquer um dos métodos descritos aqui que compreendem uma etapa para a avaliação da expressão de PD-L1, a amostra de tecido de teste pode ser uma amostra de tecido FFPE e o polipep- tídeo de PD-L1 sobre a superfície celular é detectado por IHC utilizan- do um Ab anti-PD-L1, por exemplo, mAb 28-8 ou 5H1.

[00231] Em adição, em qualquer método em que uma imunoterapia é selecionada ou administrada com base em uma avaliação de que a proporção de células em uma amostra de tecido de teste do indivíduo expressa PD-L1 em um nível acima de um nível de limiar predeterminado, se segue que pode ser realizado um método de tratamento complementar em que um tratamento de padrão de cuidado sem ser a imunoterapia é selecionado ou administrado com base em uma avaliação de que a proporção de células em uma amostra de tecido de teste do indivíduo expressa PD-L1 em um nível abaixo do nível de limiar predeterminado.

[00232] Esta descrição fornece ainda um método para a previsão da efetividade terapêutica de um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, para o tratamento de um paciente com câncer, cujo método compreende: (a) opcionalmente o for-necimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a análise da amostra de tecido de teste para determinar a proporção de células na mesma que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; (c) a comparação da proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular com um valor de limiar predeterminado; e (d) a previsão da efetividade terapêutica do dito agente, em que se a proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular exceder a proporção de limiar é previsto que o agente é eficiente no tratamento do paciente e em que se a proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular for abaixo da proporção de limiar é previsto que o agente não é eficiente no tratamento do paciente.

[00233] Esta descrição fornece ainda um método para a determinação de um regime imunoterapêutico que compreende um agente que inibe um imunorregulador inibidor, por exemplo, um Ab anti-PD-1, para o tratamento de um paciente com câncer, cujo método compreende: (a) opcionalmente o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (b) a análise da amostra de tecido de teste para determinar a proporção de células na mesma que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; (c) a comparação da proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular com uma proporção de limiar predeterminada; e (d) a determinação de um regime imunotera- pêutico que compreende o dito agente com base na determinação de que a proporção de células que expressam PD-L1 sobre a superfície celular excede a proporção de limiar predeterminada.

Padrões de Cuidados Terapêuticos

[00234] Vários dos métodos de tratamento descritos aqui compreendem a administração de um padrão de cuidado terapêutico a um paciente. Como é utilizado aqui, um "padrão de cuidado terapêutico" é um processo de tratamento, que inclui um fármaco ou uma combinação de fármacos, terapia de radiação (RT), cirurgia ou outra intervenção médica que é reconhecida por praticantes da medicina como apropriada, aceita e/ou amplamente utilizada para certo tipo de paciente,doença ou circunstância clínica. As terapias de padrão de cuidado para tipos diferentes de câncer são bem conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, a National Comprehensive Cancer Network (NCCN), uma aliança dos 21 centros de câncer principais nos EUA, publica as NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN GUIDELINES®) que fornecem informação atualizada detalhada sobre os tratamentos de padrão de cuidado para uma ampla variedade de cânceres (ver NCCN GUIDELINES®, 2013). Com a finalidade de exemplo, os tratamentos de padrão de cuidado para MEL, RCC e NSCLC são resumidos a seguir.

Melanoma

[00235] MEL é um tumor maligno de melanócitos, as células que produzem melanina encontradas predominantemente na pele. Embora menos comum que outros cânceres de pele, é o mais perigoso dos cânceres de pele se não diagnosticado precocemente e causa a maio-ria (75%) das mortes por câncer de pele. A incidência de MEL é crescente em todo o mundo em populações caucasianas, especialmente onde as pessoas com baixas quantidades de pigmentação na pele recebemexposição à luz ultravioleta excessiva proveniente do sol. Na Europa, a taxa de incidência é < 10-20 por população de 100.000; nos EUA 20-30 por 100.000; e na Austrália, onde a incidência mais alta é observada, 50-60 por 100.000 (Garbe e outros, 2012). MEL é responsável por aproximadamente 5% de todos os novos casos de câncer nos Estados Unidos da América (EUA) e a incidência continua a aumentar em quase 3% por ano. Isto se traduz em uma estimativa de 76.690 novos casos nos EUA em 2013 com 9.480 mortes associadas (Siegel e outros (2013)).

[00236] Para MEL in situ(estágio 0) ou em estágio inicial (Estágios I-II), a extirpação cirúrgica é o tratamento primário. Em geral, o prog-nóstico é excelente para pacientes com doença localizada e tumores de 1,0 mm ou menos de espessura, com taxas de sobrevivência em 5 anos de mais de 90% (NCCN GUIDELINES®, 2013 - Melanoma). Quando a extirpação cirúrgica não é possível para o melanoma in situ devido à comorbidez ou à localização do tumor sensível cosmetica- mente, imiquimod tópico e radioterapia são emergentes como trata-mentos, especialmente para lentigo maligna. Os agentes quimiotera- pêuticos para o tratamento de MEL incluem dacarbazina, temozolomi- da e imatinib para melanoma com uma mutação c-KIT, interleucina-2 em dose alta e paclitaxel com ou sem carboplatina. Entretanto, estes tratamentos têm sucesso modesto, com taxas de resposta abaixo de 20% nos cenários de primeira linha (1L) e de segunda linha (2L).

[00237] Para pacientes com melanomas localizados com mais de 1,0 mm de espessura, as taxas de sobrevivência variam de 50-90%. A probabilidade de envolvimento nodal regional aumenta com a espessura crescente do tumor. Com MEL em Estágio III (nódulos clinicamente positivos e/ou doença em trânsito), as taxas de sobrevivência em 5 anos variam de 20-70%. De longe o mais letal é o MEL em Estágio IV em que a sobrevivência em longo prazo em pacientes com melanoma metastático distante é menor que 10% (NCCN GUIDELINES®, 2013 - Melanoma).

[00238] Não há consenso sobre os melhores tratamentos para MEL metastático, embora uma variedade de tratamentos incluindo cortes para liberar as bordas, injeções intralesionais, ablação a laser, radiação e bioquimioterapia (combinação de quimioterapia e agentes bioló-gicos tais como interferon-alfa e IL-2) esteja sendo investigada. O panorama terapêutico para MEL metastático observou recentemente melhorasdrásticas com o desenvolvimento de novos fármacos tais como vemurafenib e ipilimumab. O vemurafenib especificamente inibe a sinalização por uma quinase intracelular mutada, BRAF, que está presente em aproximadamente 50% dos pacientes com MEL metastático. Em testes clínicos, o vemurafenib forneceu uma sobrevivência livre de progressão (PFS) estimada de 5,3 meses em pacientes positivos para a mutação BRAF versus meramente 1,6 mês para dacarbazina e uma OS mediana de 15,9 meses para vemurafenib versus 5,6-7,8 meses para dacarbazina (Chapman e outros, 2011; Sosman e outros, 2012). O ipilimumab é um HuMAb que inibe o receptor do ponto de verificação imunológica, CTLA-4 e dessa maneira estimula uma resposta imunológica de células T. O ipilimumab, com ou sem uma vacina pep- tídica de glicoproteína 100 (gp100), melhorou a OS mediana em paci- entes com MEL metastático tratado previamente para 10,0-10,1 meses quando comparada com 6,4 meses entre pacientes recebendo gp100 isoladamente (Hodi e outros, 2010). Além destes dois agentes, nenhum outro agente demonstrou um benefício de OS em um estudo aleatório em Fase 3. A dacarbazina é aprovada pela FDA e a EMA para o tratamento de MEL metastático com um taxa relatada de resposta objetiva de 5-20% e uma OS mediana de aproximadamente 6,4 meses, mas estas respostas têm vida curta. Outros fármacos tais como temozolomida e fotemustina não resultaram em melhora significativa na sobrevivência quando comparados com dacarbazina. A IL-2 também foi aprovada pela FDA para o tratamento de MEL metastático uma vez que esta está associada com uma taxa de resposta de 1520% incluindo 4-6% de respostas completas que podem ser duráveis, mas está associada com toxicidades significativas incluindo hipotensão,arritmias cardíacas e edema pulmonar. Detalhes adicionais sobre os tratamentos de padrão de cuidado para melanoma são fornecidos por Garbe e outros (2012) e o NCCN GUIDELINES®, 2013 - Melanoma. Apesar da aprovação recente do ipilimumab e do vemurafenib para MEL avançado, há ainda uma grande necessidade não satisfeita de pacientes que progrediram para a terapia com anti-CTLA-4 e um inibidor de BRAF (dependendo da condição de BRAF) ou pacientes com MEL do tipo selvagem com BRAF que não pode ser operado ou me- tastático que não foi previamente tratado. A taxa de sobrevivência em 5 anos para o MEL em estágio tardio é atualmente de apenas 15%. Carcinoma de Célula Renal

[00239] O RCC é o tipo de câncer renal mais comum em adultos, responsável por aproximadamente 90% dos tumores renais e 80-90% destes são tumores de células claras (NCCN GUIDELINES®, 2013 - Kidney Cancer). Também é o mais letal de todos os tumores genitouri- nários. 65.150 pacientes estimados serão diagnosticados com câncer renal e 13.680 irão morrer da doença nos Estados Unidos da América em 2013 (Siegel e outros (2013)).

[00240] Para o RCC clinicamente localizado (Estágios IA e IB), a amputação cirúrgica, inclusive a nefrectomia radical e uma cirurgia poupadora de néfrons, é uma terapia eficaz. A nefrectomia parcial geralmentenão é adequada para os pacientes com tumores avançados localmente (Estágios II e III), em cujo caso é preferida a nefrectomia radical. Quando o tumor estiver confinado ao parênquima renal, a taxa de sobrevivência em 5 anos é de 60-70%, porém é diminuída consideravelmente no Estágio IV da doença no qual as metástases estão difundidas. O RCC em Estágio IV é relativamente resistente à RT e à quimoterapia, embora os pacientes possam se beneficiar de cirurgia e de nefrectomia citorredutora antes da terapia sistêmica ser recomendada para os pacientes com metástase operáveis primárias e múltiplas que podem ser extraídas cirurgicamente.

[00241] Até recentemente, as citocinas IL-2 e IFNa eram os únicos tratamentos sistêmicos ativos para o RCC avançado ou metastático, ambos fornecendo ORRs relatadas de 5-27%. Entretanto, devido a cada um destes benefícios clínicos limitados ao agente e ao perfil substancial de toxicidade, os mais novos agentes visados substituíram amplamente as citocinas no tratamento de carcinoma de célula renal avançado ou metastático. O reconhecimento da importância de sinalização de fator alfa induzível para hipoxia (HIFa) na patogênese do agente de RCC de célula clara conduziu ao estudo bem difundido de duas classes de terapias direcionadas, inibidores de tirosina quinase (TKIs) antiangiogênicos e alvo de mamífero de inibidores de rapamici- na (mTOR) em tratamentos de 1L e de 2L (Mulders, 2009). O direcionamento da angiogenese é racional porque a ativação constitutiva de HIFa leva à regulação para mais ou à ativação de diversas proteínas inclusive do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), o que pode subsequentemente levar à proliferação do tumor e à formação da neovasculature. O direcionamento do percurso de mTOR é importante porque a ativação da corrente ascendente de PI3K/Akt/mTOR por meio de sinalização é um método pelo qual ocorre a ativação ou a regulação para mais do HIFa (Mulders, 2009). Os agentes que visam a angiogênese incluem TKIs do receptor de VEGF (VEGFr) (por exemplo, sorafenib, sunitinib, pazopanib, axitinib e tivozanib) e mAbs que se ligam ao VEGF (por exemplo, bevacizumab), enquanto os agentes que visam a via de mTOR incluem os inibidores de mTOR (por exemplo, everolimus e temsirolimus) (Mulders, 2009; NCCN GUIDELINES®, 2013 - Kidney Cancer). Entretanto, a maioria dos pacientes desenvolveresistência e a melhoria da OS somente foi apresentada em um teste em fase 3 em pacientes de baixo risco: temsirolimus apresentou um benefício estatisticamente significativo para a OS em pacientes com RCC avançado comparado com IFNa (10,9 meses versus 7,3 meses) (Hudes e outros, 2007). Everolimus também demonstrou uma melhoria de 2,1 meses em PFS mediano versus placebo, porém sem melhoria da OS (Motzer e outros, 2008). Entre os cinco agentes antiangiogêni- cos aprovados (sorafenib, sunitinib, bevacizumab, pazopanib e axiti- nib) e dois inibidores de mTOR aprovados (temsirolimus, everolimus), somente everolimus é aprovado especificamente para uso depois da falha de tratamento com terapia antiangiogênica. Nos EUA, o everoli- mus é indicado para o tratamento de RCC avançado depois da falha de tratamento com sunitinib ou sorafenib, enquanto que na Europa, o everolimus é mais amplamente indicado para pacientes com RCC avançado, cuja doença progrediu no ou depois do tratamento com terapia direcionada para VEGF.

Câncer Pulmonar de Células que Não São Pequenas

[00242] O NSCLC é a causa principal de morte por câncer nos EUA e no mundo todo, excedendo câncer de mama, de cólon e de próstata combinados. Nos EUA, 228.190 novos casos estimados de pulmão e dos brônquios serão diagnosticados nos EUA e umas 159.480 mortes irão ocorrer por causa da doença (Siegel e outros, 2013). A maioria dos pacientes (aproximadamente 78%) é diagnosticada com doença avançada/recorrente ou metastática. As metástases para a glândula suprarrenal de câncer de pulmão são a ocorrência comum, com aproximadamente 33% de pacientes possuindo tais metástases. As terapias para NSCLC melhoraram incrementalmente a OS, porém o benefício atingiu um patamar (OS mediana para os pacientes em estágio tardio é de apenas 1 ano). A progressão depois da terapia 1L ocorreu em quase todos estes indivíduos e a taxa de sobrevivência em 5 anos é apenas de 3,6% no cenário refratário. Desde 2005 até 2009, a taxa de sobrevivência global relativa em 5 anos para câncer de pulmão nos EUA era de 15,9% (NCCN GUIDELINES®, 2013 - Non-Small Cell Lung Cancer).

[00243] Cirurgia, RT e quimioterapia são as três modalidades usadas comumente para tratar pacientes com NSCLC. Como uma classe, os NSCLCs são relativamente insensíveis à quimioterapia e à RT, compararados com carcinoma de células pequenas. Em geral, para os pacientes com doença no Estágio I ou II, a amputação cirúrgica fornece a melhor chance de cura, com aumento da quimioterapia sendo usado tanto no pré-operatório como no pós-operatório. RT também pode ser utilizada como terapia adjuvante para pacientes com NSCLC operável, tratamento primário local ou como terapia paliativa para pacientes com NSCLC incurável.

[00244] Os pacientes com doença no Estágio IV que possuem um benefício de status de bom desempenho (PS) se beneficiam com qui-mioterapia. Muitos fármacos, inclusive agentes de platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina), agentes taxanos (por exemplo, paclitaxel, paclitaxel ligado à albumina, docetaxel), vinorelbina, vinblastina, eto- posídeo, pemetrexed e gemcitabina são úteis para o NSCLC no Estágio IV. As combinações que utilizam muitos destes fármacos produzem taxas de sobrevivência em 1 ano de 30% até 40% e são superiores aos agentes isolados. Terapias direcionadas específicas também foram desenvolvidas para o tratamento de câncer de pulmão avançado. Por exemplo, bevacizumab (AVASTIN®) é um mAb que bloqueia o fator de crescimento vascular endotelial A (VEGF-A). Erlotinib (TARCE- VA®) é um TKI de molécula pequena de fator de crescimento epidérmico (EGFR). Crizotinib (XALKORI®) é um TKI de molécula pequena que se direciona para ALK e MET e é utilizado para tratar NSCLC em pacientes que contenham o gene de fusão ALK mutado. Cetuximab (ERBITUX®) é um mAb que se direciona para o EGFR.

[00245] Há uma necessidade em particular não satisfeita entre os pacientes que possuem NSCLC de células escamosas (representando até 25% de todo o NSCLC) como há poucas opções de tratamento depois de terapia 1L. A quimioterapia com um único agente é o padrão de cuidado depois da progressão com quimioterapia dupla à base de platina (Pt-dubleto), resultando na OS mediana de aproximadamente 7 meses. Docetaxel permanece o tratamento de ponto de referência nesta linha de terapia embora erlotinib também possa ser utilizado com menos frequência. Também foi demonstrado que pemetrexed produz eficácia em resultados clinicamente equivalentes, porém com menos efeitos colaterais significativamente comparados com docetaxel no tratamento 2L de pacientes com NSCLC avançado (Hanna e outros, 2004). Nenhuma terapia é atualmente aprovada para uso em câncer de pulmão além do cenário em 3L. Pemetrexed e bevacizumab não são aprovados no NSCLC escamosas e terapias direcionadas molecularmente possuem aplicação limitada. A necessidade não satisfeita em câncer de pulmão avançada foi composta pela recente falha de Oncothyreon e Merck KgaA’s STIMUVAX® para melhorar a OS em um teste em fase 3, incapacidade de ArQule’s e inibidor de c-Met quinase da Daiichi Sankyo, tivantinib, para satisfazer pontos finais de sobrevivência, falha de Eli Lilly’s ALIMTA® em combinação com AVASTIN® da Roche para melhorar a OS em um estudo em estágio tardio e falha de Amgen e de Takeda Pharmaceutical em satisfazer pontos finais clínicos com o antagonista VEGF-R de molécula pequena, motesanib, testes em estágio tardio.

[00246] A presente invenção também é ilustrada pelos exemplos a seguir que não devem ser interpretados como adicionalmente limitan- tes. Os conteúdos de todas as referências citadas durante todo este pedido de patente são aqui expressamente incorporados como refe-rência.

EXEMPLO 1 Competição Cruzada entre HuMAbs Anti-PD-1 Pela Ligação às Células CHO que Expressam PD-1 humano

[00247] Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) transfectadas para expressar PD-1 humano (CHO/PD-1 células) foram incubadas com 10 µg/mL de fragmento Fab do anti-PD-1 HuMAb 5C4 ou do Ab de controle do isotipo IgG1 humano (hIgG1) durante 30 minutos a 4°C antes da adição dos HuMAbs anti-PD-1 2D3, 7D3 ou 4H1 a uma concentração de 0,2 µg/mL. A ligação de 4H1, 2D3 ou 7D3 às células CHO/PD-1 foi detectada por Ab específico para Fc-gama anti-hIgG1 de caprino conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC). No caso do ensaio de competição cruzada com 5C4 e 17D8, as células CHO/PD-1 foram incubadas com a molécula inteira de 5C4 antes da adição de 17D8 marcado com FITC. A ligação de 2D3, 7D3, 4H1 ou 17D8 às células CHO/PD-1 foi medida por análise citométrica utilizando um citômetro de fluxo FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA).

[00248] Os resultados são representados na Figura 1. Os dados mostram que o fragmento Fab de 5C4 bloqueou substancialmente a ligação dos mAbs 5C4 por si só, bem como a ligação de 2D3, 7D3 (Figura 1A) e 4H1 (Figura 1B), enquanto o mAb 5C4 inteiro bloqueou substancialmente a ligação de 17D8 (Figura 1C) às células CHO/PD-1 como medido por intensidade de fluorescência média (MFI) de coloração.

EXEMPLO 2 Competição cruzada entre HuMAbs Anti-PD-L1 pela Ligação às Células CHO que Expressam PD-L1 Humano

[00249] As células CHO transfectadas para expressar hPD-L1 (células CHO/PD-L1) foram incubadas com 10 µg/mL de cada um de dez mAbs humano anti-PD-L1 não conjugados (5F8, 7H1, 10H10, 1B12, 3G10, 10A5, 11E6, 12A4, 12B7 e 13G4) ou Ab de controle do isotipo IgG1 humano (hIgG1) durante 20 min a 4°C. 10H10 (A), 3G10 (B), 10A5 (C), 11E6 (D), 12A4 (E) ou 13G4 (F) conjugado com FITC foi adicionado às células até uma concentração final de 0,09 µg/mL (B, D), 0,27 µg/mL (A, C), 0,91 µg/mL (F) ou 2,73 µg/mL (E) durante 20 min adicionais a 4°C sem lavagem anterior do Ab não conjugado não ligado. Diferentes quantidades dos vários HuMAbs conjugados com FITC foram usadas devido às diferenças na eficiência de ligação depois da marcação e as quantidades ótimas destes HuMAbs conjuga-dos com FITC foram determinadas anteriormente por análise de titulação de dose de ligação às células CHO/PD-L1. A ligação de 10H10, 3G10, 10A5, 11E6, 12A4 ou 13G4 conjugado com FITC às células CHO/PD-L1 foi medida por citometria de fluxo.

[00250] Os resultados são representados na Figura 2. A ligação de 10H10 marcado foi parcialmente bloqueada por 10A5, 11E6 e 13G4, porém se bloqueou substancialmente apenas por si só (Figura 2A). Inversamente, 10H10 bloqueou substancialmente a ligação apenas por si só às células CHO/PD-L1. Cada um dos HuMAbs anti-PD-L1 5F8, 7H1, 1B12, 3G10, 10A5, 11E6, 12A4, 12B7 e 13G4 bloqueou substancialmente a ligação dos mAbs 3G10 (Figura 2B), 10A5 (Figura 2C), 11E6 (Figura 2D), 12A4 (Figura 2E) e 13G4 (Figura 2F) marcados às células CHO/PD-L1 como medido por MFI, embora os mAbs 5F8 e 13G4 geralmente bloqueassem a ligação do mAbs marcados até uma extensão ligeiramente menor.

EXEMPLO 3 Competição Cruzada entre mAbs Anti-PD-L1 Pela Ligação às Células de Carcinoma Ovariano que Expressam PD-L1 Humano

[00251] Os HuMAbs anti-PD-L1 5F8, 12B7, 3G10, 1B12, 13G4, 10H10, 10A5 e 12A4 e um Ab de controle de isotipo IgG1 humano (huIgG1) foram diluídos em série partindo de 10 µg/mL e incubados com células de carcinoma ovariano expressando hPD-L1 ES-2 durante 20 minutos a 4°C. Sem lavagem, foi adicionado o Ab 12A4 biotinilado a uma concentração final de 0,4 µg/mL durante 20 minutos adicionais a 4°C. Após a lavagem, foi detectato biotina-12A4 ligado utilizando reagentesecundário estreptavidina fluorescente-PE e medido por cito- metria de fluxo. A Figura 3 mostra a fluorescência de biotina-12A4 ligado comparada graficamente contra a concentração de HuMabs para hPD-L1 não marcados. A ligação de biotina-12A4 às células ES-2 foi substancialmente bloqueada por 12A4 por si só e por 1B12 e 12B7 e foi moderadamente a significativamente bloqueada por mAbs 5F8, 10A5, 13G4 e 3G10, porém não foi bloqueada por mAb 10H10.

EXEMPLO 4 Planejamento do Estudo Clínico em Fase 1 do Ab Anti-PD-1

[00252] Foi conduzido um estudo em Fase 1 para avaliar a segurança, a atividade antitumoral e a farmacocinética de um anti-PD-1 em pacientes com tumores sólidos avançados selecionados. O mAb anti- PD-1 humano, BMS-936558 (também referido aqui como nivolumab e na Patente U.S. N°. 8.008.449 como 5C4), foi administrado como uma infusão intravenosa a cada 2 semanas de cada ciclo de tratamento de 8 semanas. O status do tumor foi reavaliado depois de cada ciclo. Os pacientes continuaram o tratamento durante até 2 anos (12 ciclos), até que eles sofressem remissão completa, toxicidade inaceitável, progressão da doença ou deligamento consentido. Em pacientes que de outra maneira estavam clinicamente estáveis, o tratamento do estudo continuou além da progressão da doença inicial aparente até a progressão adicional ser observada como recomendado por critérios propostos de resposta imunológica (Wolchok e outros, 2009). Os pacientes com doença estável (SD) ou com uma resposta objetiva em andamento (OR: resposta completa [CR] ou resposta parcial [PR]) no final de tratamento foram acompanhados durante 1 ano e foi oferecido a estes novo tratamento durante 1 ano adicional na eventualidade de progressão.

Aumento da dose

[00253] Pacientes com melanoma avançado (MEL), câncer pulmonar de células que não são pequenas (NSCLC), carcinoma de célula renal (RCC), câncer de próstata resistente à castração (CRPC) e câncer colorretal (CRC) eram aceitáveis para matrícula. Grupos de 3-6 pacientes por nível de dose foram inscritos sequencialmente a 1,0, 3,0 e 10,0 mg/kg. O aumento da dose se prosseguiu até quando um mínimo de 3 pacientes completasse o período de avaliação de segurança (56 dias) no nível dado da dose, com toxicidade de limite de dose e menos do que um terço de pacientes. O aumento de dose intrapacien- tes não foi permitido.

Expansão do grupo

[00254] Uma dose máxima tolerada (MTD) não foi atingida. Inicialmente, 5 grupos de expansão de aproximadamente 16 pacientes cada foram inscritos a 10 mg/kg para MEL, NSCLC, RCC, CRPC e CRC. Com base em sinais de atividade iniciais e seguindo um hiato de 6,5 meses para emenda de protocolo, cada um dos grupos de expansão adicionais de aproximadamente16 pacientes foi inscrito para MEL (a 1,0 e 3,0 mg/kg, seguidos por grupos aleatórios para 0,1, 0,3 ou 1,0 mg/kg), NSCLC (grupos de histologia escamosa ou não escamosa distribuídos aleatoriamente para 1, 3 ou 10 mg/kg) e RCC (a 1,0 mg/kg). O aumento de dose intrapaciente até 1 mg/kg foi permitido para pacientes com MEL com doença progressiva depois de receberem 0,1 ou 0,3 mg/kg.

Pacientes

[00255] Os pacientes aceitáveis tiveram tumores sólidos avançados documentados; idade > 18 anos; expectativa de vida >12 semanas; status de desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group de < 2; doença mensurável por Critérios de Avaliação de Resposta em TumoresSólidos (RECIST), v1.0 com modificação (ver Topalian e outros, 2012b); funções hematológicas, hepáticas e renais adequadas e receberam 1-5 regimes de tratamento sistêmico anteriores. Foram inscritos pacientes com metástases no cérebro estáveis tratadas. Os critérios de exclusão incluíam um histórico de doença autoimune crônica, terapia anterior com Abs que modulam células T (por exemplo, anti-CTLA- 4, anti-PD-1, anti-PD-L1), condições que requerem medicações imu- nossupressoras e infecções crônicas (por exemplo, HIV, hepatite B ou C).

[00256] Um total de 296 pacientes com tumores sólidos avançados incluindo MEL (n=104), NSCLC (n=122), RCC (n=34), CRPC (n=17) e CRC (n=19) foi tratado com BMS-936558 durante 40 meses até fevereiro de 2012. Em março de 2013, 306 pacientes incluindo pacientes com câncer pulmonar de células que não são pequenas (n=129), melanoma (n=107), RCC (n=34), CRPC (n=17) e CRC (n=19) tinham sido tratados com BMS-936558 de outubro de 2008 até janeiro de 2012, todos com um mínimo de um ano de observação. Dois pacientes não receberam um ciclo de tratamento completo e não foram considerados avaliáveis em relação à resposta. A idade mediana era de 63 anos (faixa, 29-85). O escore de desempenho ECOG era 0 ou 1 em 98% de pacientes. A maioria dos pacientes foi fortemente pré-tratada, com 47% recebendo pelo menos 3 regimes anteriores. Terapias anteriores notáveis incluíam imunoterapia (64%) e inibidor de B-RAF (8%) em pacientes com MEL; quimioterapia à base de platina (94%) e inibidores de tirosina quinase (TKIs, 34%) em pacientes com NSCLC e nefrecto- mia (94%), imunoterapia (59%) e terapia antiangiogênica (74%) em pacientes com RCC. As características de linha base da população total tratada (N=306) eram similares àquelas da População de Eficácia (pacientes com resposta avaliável, N=270). Os detalhes sobre os pré- tratamentos em pacientes são fornecidos em Topalian e outros (2012b).

Análise estatística

[00257] As características da linha base e os eventos adversos para todos os pacientes tratados (N=306) e os resultados da eficácia para 270 pacientes com câncer de pulmão, melanoma e câncer renal como de março de 2013 são relatados. As populações com marcador farma- cocinético e molecular consistiam em pacientes tratados com dados disponíveis como da data de fevereiro de 2012 de análise preliminar. A População de Eficácia consistiu em pacientes de resposta avaliável que começaram o tratamento pelo menos 8 meses antes da data de análise. As medições de tumor foram coletadas depois de cada ciclo de tratamento (4 doses) por pesquisadores. As melhores respostas individuais objetivas com base nas medidas do tumor foram avaliadas pelo responsável por RECIST v1.0 modificado. A resposta objetiva foi confirmada em pelo menos uma avaliação sequencial de tumor. A resposta objetiva e as proporções de doença estável foram avaliadas com intervalos de confiança utilizando o método de Clopper-Pearson. Os pontos finais de tempo para evento incluindo PFS, OS, taxas de sobrevivência e duração de resposta, foram avaliados utilizando o método de Kaplan-Meier. Os AEs foram codificados utilizando Medical Dictionary for Regulatory Activities (MedDRA), versão 15.1. Os eventos adversos seletos com etiologias imunológicas potenciais, também referidos como "eventos adversos relacionados ao sistema imunológico"de "AEs de interesse especial" (AEOSIs), definidos como eventos adversos que requerem monitoração mais frequente e/ou uma intervenção única, foram identificados utilizando uma lista predefinida de termos MeDRA.As melhores ORs individuais eram derivadas de dados relatados por pesquisador por RECIST v1.0 modificado ou eram confirmadas em pelo menos uma avaliação de tumor sequencial e a taxa de OR (ORR={[CR + PR] + n} x 100) foi calculada.

EXEMPLO 5 Avaliações de Segurança em Pacientes Tratados com Anticorpo Anti- PD-1

[00258] As avaliações de segurança, inclusive exame clínico e avaliações laboratoriais, foram conduzidas em todos os pacientes tratados na linha base e intervalos regulares até 100 dias após a última administração de fármaco. A gravidade dos AEs foi classificada com base nos Critérios para Eventos adversos da Terminologia Comum NCI (NCI CTCAE), v3.0. Foi realizada tomografia computadorizada (CT) ou foram obtidas imagens por ressonância magnética para avaliação do tumor na linha base e depois de cada ciclo de tratamento.

[00259] Uma MTD não foi definida pelas doses de BMS-936558 testadas neste estudo, até a mais alta planejada de 10 mg/kg. Uma inten-sidade de dose relativa de BMS-936558 de 90% ou maior foi atingida em 87% dos pacientes (ver Topalian e outros, 2012b; Topalian e ou-tros, 2013, para detalhes). Os AEs foram codificados utilizando Medical Dictionary for Regulatory Activities (MedDRA), versão 14.1. Os AEOSIs foram identificados utilizando uma lista predefinida de termos de MeDRA. Quinze de 296 (5%) pacientes interromperam o tratamento devido aos AEs relacionados a BMS-936558. Como da data de fevereiro de 2012 de análise preliminar, 62 (21%) pacientes tinham morrido e até março de 2013, 195 pacientes (64%) tinham morrido, com progressão da doença sendo a causa mais comum de morte (Topalian e outros, 2012b; Topalian e outros, 2013).

[00260] Os eventos adversos mais comuns, sem levar em conta a casualidade incluíam fadiga, diminuição do apetite, diarreia, náusea, tosse, dispineia, constipação, vômito, erupção cutânea, pirexia e prurido (Topalian e outros, 2012b; Topalian e outros, 2013). Os AEs co-muns relacionados a BMS-936558 incluíam fadiga, erupção cutânea, diarreia, diminuição do apetite e náusea. A maioria dos eventos era de baixo grau, com AEs relacionados a fármaco de grau 3-4 observados em 41 de 296 (14%) pacientes. Os AEs relacionados ao tratamento (de qualquer grau) foram observados em 230 de 306 pacientes (75%), os mais comuns sendo fadiga, erupção cutânea, diarreia e prurido (Topalian e outros, 2013). O espectro, a frequência e a gravidade dos AEs relacionados a BMS-936558 eram geralmente similares ao longo dos níveis de dose testados, sem relação evidente à duração do tratamento. Cinquenta e dois de 306 pacientes (17%) experimentaram eventos adversos relacionados a tratamento de Grau 3-4, com fadiga (2%), pneumonia, linfopenia, diarreia, dor abdominal e hipofosfatemia (1% cada) sendo o mais comum. Os eventos adversos graves relacionados ao tratamento ocorreram em 42 de 306 pacientes (14%) (Topa- lian e outros, 2013).

[00261] Os AEOSIs relacionados a fármaco, com etiologias potenciais imunorrelacionadas, foram categorizados por envolvimento de órgão para fornecer uma estimativa mais precisa de frequência e incluíam pneumonia, vitiligo, colite, hepatite, hipofisite e tiroidite entre outras. Os eventos adversos seletos relacionados ao tratamento de qualquer grau foram observados em 140 de 306 pacientes (46%), os mais comuns sendo erupção cutânea (15%), diarreia (13%) e prurido (11%) (Tabela 2). Os eventos seletos relacionados ao tratamento de Grau 34 foram observados em 19 pacientes (6%).

[00262] Cinquenta e dois de 230 pacientes (23%) com eventos adversos relacionados ao fármaco necessitaram de controle com glico- corticoides sistêmicos e/ou outros agentes imunossupressores. Os AEOSIs hepáticos ou gastrintestinais foram controlados com interrup-ção de tratamento e, quando necessário, com administração de corti- costeroides. Entre pacientes tratados até esta data, estes AEs eram reversíveis em todos os casos. Os AEOSIs endócrinos eram controlados com terapia de substituição. Trinta e dois de 306 pacientes (11%) interromperam a terapia devido aos eventos adversos relacionados ao tratamento. A critério do médico que cuida do caso, os pacientes reiniciaram de forma bem sucedida o tratamento com BMS-936558. Vinte e um (40%) foram capazes de retomar a terapia com nivolumab depois de resolvida a questão da toxicidade.

[00263] Uma pneumonia relacionada ao fármaco (de qualquer grau) ocorreu em 12 de 306 (4%) pacientes (Topalian e outros, 2013). As apresentações clínicas estavam na faixa de desde anormalidades ra- diográficas em pacientes assintomáticos, até infiltrados pulmonares progressivos, difusos associados com sintomas (tosse, febre, dispi- neia). Uma pneumonia de grau 3-4 se desenvolveu em 4 pacientes (1%), dos quais 3 casos foram fatais (2 pacientes com NSCLC, 1 com CRC). Não foi observada relação evidente entre a ocorrência de pneumonia e o tipo de tumor, o nível de dose ou o número de doses recebidas. Em 9 de 12 pacientes, a pneumonia era reversível com a interrupção do tratamento e/ou imunossupressão (glicocorticoides, infliximab, micofenolato). Depois da morte mais recente associada à pneumonia em novembro de 2011, 79 pacientes continuaram a rece-ber nivolumab (média de 29 semanas, faixa de 2-69 semanas) sem outras mortalidades desta ou de outras causas relacionadas ao trata-mento.

EXEMPLO 6 Análises Farmacocinéticas/Farmacodinâmicas sobre o Anticorpo Anti- PD-1

[00264] Para análises farmacocinéticas (PK), foram coletadas amostras de sangue em série e as concentrações no soro de BMS- 936558 foram avaliadas quantitativamente utilizando ELISA. Para análisefarmacodinâmica (PD), foram isoladas células mononucleares do sangue periférico de pacientes na linha base e após o ciclo 1 para avaliar a ocupação do receptor (RO) de PD-1 por BMS-936558 nas células T CD3+ circulantes por citometria de fluxo (Brahmer e outros, 2010).

[00265] A concentração máxima de BMS-936558 foi observada em um Tmax médio de 1-4 horas depois do início da infusão. A PK de BMS- 936558 era linear com um aumento proporcional à dose em Cmax e AUC(0-14 d) na faixa de dose de 0,1-10 mg/kg (n=35). A PD de BMS- 936558 foi avaliada pela RO de PD-1 em células T circulantes. As PBMCs de 65 pacientes tratados com MEL com um ciclo de BMS- 936558 a 0,1-10 mg/kg bissemanalmente demonstraram ocupação média de moléculas de PD-1 em células T CD3+ circulantes por BMS- 936558 na faixa de 64%-70% (ver Topalian e outros, 2012b, para detalhes).

EXEMPLO 7 Eficácia Antitumor Exibida pelo Anticorpo Anti-PD-1 Dados analisados como os de fevereiro de 2012

[00266] A atividade clínica antitumor foi observada em todas as doses de BMS-936558 testadas. As ORs (CR ou PR confirmada) foram observadas em uma parte substancial de pacientes com NSCLC, MEL e RCC (Tabelas 1 e 2; Figura 4) e em vários locais de doença metastá- tica incluindo fígado, pulmão, nódulos linfáticos e ossos (Figuras 5-7 e não mostrado). As regressões de tumor seguiram padrões de resposta convencionais bem como "relacionados ao sistema imunológico", tal como redução prolongada na carga tumoral na presença de novas lesões. As melhores respostas individuais globais eram derivadas de dados relatados pelo pesquisador de acordo com RECIST v1.0 modificado ou foram confirmadas em pelo menos uma avaliação de tumor sequencial. Na ocasião da análise de dados, 2 pacientes com NSCLC que foram tratados com 10 mg/kg tiveram respostas não confirmadas e 8 pacientes adicionais (com MEL, NSCLC ou RCC) tinham uma redução persistente nas lesões alvos de linha de base na presença de novas lesões, (isto é, um padrão de resposta "relacionada ao sistema imunológico"). Nenhum destes pacientes foi categorizado como um capaz de resposta para a finalidade de cálculo de taxas de OR. Foram observadas respostas antitumor e/ou estabilização de doença prolongada em pacientes independentemente de terapias anteriores recebidas (ver resumo de intervalo livre de progressão para pacientes com OR e SD no Apêndice Suplementar 4 de Topalian e outros, 2012b).

[00267] Em pacientes com NSCLC, foram observadas 14 ORs nas doses de BMS-936558 de 1, 3 ou 10 mg/kg com taxas de resposta de 6%, 32% e 18%, respectivamente. Foram observadas ORs ao longo das histologias de NSCLC: 6 capazes de resposta de 18 escamosas (33%), 7 capazes de resposta de 56 não escamosas (13%) e 1 de 2 desconhecidos. Todos os 14 pacientes com ORs iniciaram o tratamento> 24 semanas antes da análise dos dados e destes, 8 tinham duração de resposta > 24 semanas (Tabela 1). Foi observada doença estável (SD) durando > 24 semanas em 5 (7%) de pacientes com NSCLC, todos com histologia não escamosa. Entre pacientes com MEL, foram observadas 26 ORs em doses na faixa de desde 0,1-10 mg/kg, com taxas de resposta na faixa de desde 19%-41% por nível de dose. No nível de dose de 3 mg/kg, foram observadas ORs em 7 de 17 (41%) pacientes. Dos 26 pacientes com MEL que atingiram uma OR, 17 iniciaram o tratamento > 1 ano antes da análise dos dados e destes, 13 pacientes tinham uma duração > 1 ano. Os 8 pacientes restantes com OR estavam no estudo < 1 ano e 6 tinham respostas na faixa de desde 1,9-5,6 meses. SD durando > 24 semanas foi observada em 6 (6%) pacientes. Em pacientes com RCC, ocorreram ORs em 4 de 17 (24%) pacientes tratados com uma dose de BMS-936558 de 1 mg/kg e 5 de 16 (31%) pacientes tratados com 10 mg/kg. Entre 8 pacientes com RCC com OR que iniciaram o tratamento > 1 ano antes da análise de dados, 5 (63%) tinham duração de OR > 1 ano. Foi observada SD durante> 24 semanas em 9 (27%) pacientes adicionais. Tabela 1. Atividade Clínica de BMS-936558 na População de Eficácia * (N=236)t como Avaliado até Fevereiro de 2012 A população de eficácia consiste em pacientes que podem ser avaliados em relação à resposta cujo tratamento foi iniciado pelo menos 8 meses antes da análise dos dados em fevereiro de 2012 e tinham doença mensurável na linha base e um dos seguintes: pelo menos 1 varredura em tratamento ou evidência clínica de progressão da doença ou morte. † CR representa resposta completa, MEL melanoma, NSCLC câncer pulmonar de células que não são pequenas, ORR taxa de resposta objetiva, PFSR taxa de sobrevivência livre de progressão, PR resposta parcial, RCC câncer de célula renal, SD doença estável, n número de pacientes. ‡ As taxas de resposta objetiva ({[CR + PR] ÷ n} × 100) foram calculadas com base nas respostas confirmadas com intervalos de confiança calculados utilizando o método de Clopper-Pearson. As respostas de pacientes individuais foram adjudicadas por RECIST v1.0 com modificação (ver Topalian e outros, 2012b). § A taxa de sobrevivência livre de progressão era a proporção de pacientes que não sofreu progressão e estavam vivos em 24 semanas calculada pela metodologia de Kaplan-Meier com intervalos de confiança utilizando o método de Greenwood. A Uma CR. **Um paciente com NSCLC que foi tratado no nível de dose de 3 mg/kg teve uma avaliação inicial de doença progressiva, subsequen-temente teve uma PR e foi classificado como um capaz de responder. Tabela 2. Duração de Respostas Objetivas a BMS-936558* como Avaliado até Fevereiro de 2012 * MEL representa melanoma, NA não aplicável, NSCLC câncer pulmonar de células que não são pequenas, RCC câncer de célula renal. cálculo de duração de resposta.

Dados analisados como os de março de 2013

[00268] Foram observadas respostas objetivas em pacientes com NSCLC (17%), MEL (31%) e RCC (29%), porém não com CRC ou CRPC. Foram observadas respostas em todas as doses testadas de nivolumab; taxas de resposta em pacientes com NSCLC que recebem 1 mg/kg, versus 3 ou 10 mg/kg, pareciam ter diminuído (3%, versus 24% e 20%, respectivamente) (Tabelas 3 e 4). Treze de 270 pacientes (4,8%) com histologias capazes de responder tinham padrões de respostanão convencionais que não satisfaziam os critérios de RECIST (por exemplo, redução persistente nas lesões alvos na presença de novas lesões ou regressão depois da progressão inicial) (Wolchok e outros, 2009). Pacientes adicionais manifestaram SD durante 24 semanas ou mais (10% de NSCLC, 7% de MEL, 27% de RCC). Sobrevivência prolongada, refletida por taxas de OS de ponto de referência de 1 e 2 anos, foi observada em cada uma das populações capazes de responder como a seguir: NSCLC, 42% e 14%; MEL, 62% e 43%; e RCC, 70% e 50% (Tabela 3). A OS mediana de 9,6 meses para câncer d pulmão (9,2 e 10,1 meses para histologias de NSCLC escamosas e não escamosas, respectivamente), 16,8 meses para MEL e mais de 22 meses para RCC; PFS médio era de 2,3 meses em NSCLC, 3,7 meses em MEL e 7,3 meses em RCC e duração média de resposta era de 74, 104 e 56 semanas, respectivamente (Tabela 4). Entre 16 capazes de responder que descontinuaram a terapia por razões sem ser progressão da doença e foram acompanhados durante pelo menos 24 semanas, 13 (81%) permaneceram em resposta no momento da análise (Figura 8). Tabela 3. Atividade Clínica de Nivolumab na População de Eficácia (N = 306)* como Avaliado até Março de 2013Nenhuma resposta objetiva foi observada em 19 pacientes com câncer colorretal ou 17 pacientes com câncer de próstata resistente à castração. † As taxas de resposta objetiva ({[CR + PR] ÷ n} × 100) foram calculadas com base nas respostas confirmadas com intervalos de confiança calculados utilizando o método de Clopper-Pearson. Respostas individuais do paciente foram adjudicadas por RECIST v1.0 com modificação (ver Métodos S1 e protocolo do estudo, NEJM.org). Tempo desde a primeira resposta até o tempo de progressão documentada, morte ou para dados verificados (representados por "+"), tempo até a última avaliação do tumor. ** Entre 129 pacientes com câncer pulmonar de células que não são pequenas, 1 tinha uma histologia desconhecida e não mostrou uma resposta objetiva. Outros tinham histologias escamosas ou não escamosas, como indicado. § NR, não atingido; o ponto do tempo em que a probabilidade de que o progresso daqueles capazes de responder cai abaixo de 50% não foi atingido devido ao número insuficiente de eventos e/ou de acompanhamento. ¶ Período insuficiente de acompanhamento. ? 1 CR foi observada em melanoma e 1 CR em câncer renal. # A sobrevivência global mediana não foi atingida em 22 meses, o tempo mais longo até a morte até agora em pacientes com câncer renal neste experimento. ^ NE, não pode ser estimado. Tabela 4. Atividade Clínica de Nivolumab por Nível de Dose como Avaliado até Março de 2013 As taxas de resposta objetiva ({[CR + PR] ÷ n} × 100) foram calculadas com base nas respostas confirmadas com intervalos de confiança calculados utilizando o método de Clopper-Pearson. As respostas individuais do paciente foram adjudicadas por RECIST v1.0 com modificação (ver Métodos S1 e protocolo de estudo, NEJM.org). † Tempo desde a primeira resposta até o tempo de progressão documentada, morte ou dados verificados (representados por "+"), tempo até a última avaliação do tumor. ‡ NR, não atingido; o ponto do tempo em que a probabilidade de que o progresso dos capazes de responder cai abaixo de 50% não foi atingido devido ao número insuficiente de eventos e/ou de acompanhamento. § 1 CR foi observada em melanoma e 1 CR em câncer dos rins. ¶ Cinco pacientes com progressão de tumor tiveram as doses aumentadas de desde 0,1 até 1,0 mg/kg e seis de 0,3 até 1,0 mg/kg. Nenhum destes pacientes respondeu à terapia. A sobrevivência mediana total não foi atingida em 22 meses, o tempo mais longo até a morte até agora em pacientes com câncer renal neste teste. ^ NE, não pode ser estimado. 166/206

EXEMPLO 8 Correlação entre a Expressão de PD-L1 Membranoso e a Resposta Anti-PD-1

[00269] A coloração por IHC de PD-L1 foi realizada em espécimes de tumor incrustados em parafina fixados em formalina (FFPE) pré- tratamento utilizando o mAb 5H1 anti-PD-L1 humano murino (Dong e outros, 2002) em um protocolo de IHC padronizado (Taube e outros, 2012; Supp. Materials). Em resumo, seções de FFPE de 5 µm montadas sobre lâminas de vidro foram desparafinizadas em xileno e a recuperação do antígeno foi realizada utilizando um tampão de Tris-EDTA, pH 9,0 a 120°C durante 10 min em uma Decloaking Chamber (Biocare Medical). A peroxidase endógena, a biotina e as proteínas foram bloqueadas (CAS system K1500, Dako; Avidin/biotin Blocking Kit, SP- 2001, Vector Laboratories; Serotec Block ACE) e o Ab 5H1 primário foi adicionado a uma concentração de 2 µg/mL e deixado incubar a 4°C durante 20 h. O Ab secundário (Anti-IgG1 de camundongo biotinilado, 553441 BD) foi aplicado a uma concentração de 1 µg/mL durante 30 minutos à temperatura ambiente (RT). O sinal foi então revelado com amplificação de acordo com o protocolo do fabricante (CAS system K1500, Dako). As seções foram contracoradas com hematoxilina, desidratadas em etanol e clareadas em xileno e foi aplicada uma lamínu- la.

[00270] A porcentagem de células tumorais exibindo coloração de superfície celular para PD-L1 foi avaliada por dois patologistas inde-pendentes que desconheciam os resultados do tratamento. A positivi- dade em relação ao PD-L1 foi definida por espécime por um limiar de expressão de 5% (Taube e outros, 2012; Thompson e outros, 2006) e em casos com vários espécimes, se algum espécime satisfizesse este critério. Um teste exato de Fisher foi aplicado para avaliar a associação entre a expressão de PD-L1 e a OR, observando-se, entretanto, que esta análise era baseada em parte em biópsias opcionais proveni-entes de um subconjunto não aleatório da população e o teste de uma hipótese estatística não foi pré-especificado.

[00271] Sessenta e um espécimes de tumor pré-tratamento provenientes de 42 pacientes (18 MEL, 10 NSCLC, 7 CRC, 5 RCC e 2 CRPC) foram analisados em relação à expressão de PD-L1 na superfície de células tumorais (Figura 8). Espécimes de biópsias provenientes de 25 de 42 pacientes eram positivos em relação à expressão de PD-L1 por IHC. Foi aplicado um teste exato de Fisher para avaliar a associação entre a expressão de PD-L1 e a OR em uma análise post- hoc. Entre os 42 pacientes com superfície-PD-L1+, 9 (36%) atingiram uma OR, enquanto que entre 17 pacientes com tumores PD-L1-, nenhum atingiu uma OR (Figura 8A). Assim, em um subconjunto de pacientes a expressão de PD-L1 na superfície celular sobre células tumo- rais em biópsias pré-tratamento está associada a uma maior taxa de OR entre pacientes tratados com BMS-936558, enquanto nenhum paciente com tumores negativos para PD-L1 documentados sofreram uma OR. Estes dados indicam que a expressão de PD-L1 do tumor é um marcador molecular que pode permitir a seleção do paciente para imunoterapia anti-PD-1.

EXEMPLO 9 Isolamento de mAbs de Coelho que Detectam o Antígeno hPD-L1 de Membrana em Tecidos FFPE

[00272] Os Abs de coelho contra o polipeptídeo de PD-L1 humano foram preparados por Epitomics, Inc. (Burlingame, CA) através da imunização de coelhos utilizando uma proteína de fusão de PD-L1 humano recombinante. Os títulos do antissoro foram avaliados utilizando ELISA direto padronizado com o antígeno hPD-L1 e ELISA de célula utilizando células transfectadas que superexpressam hPD-L1. Estes Abs também foram selecionados em relação à sua capacidade de se ligar ao PD-L1 por ensaio de IHC de seções de tecido FFPE. O coelho com o título de Ab mais alto foi selecionado para esplenecto- mia. Os linfócitos isolados do baço foram fundidos a células de mielo- ma em placas de 40 x 96 poços e selecionados por ELISA contra o antígeno de PD-L1 de imunização e por ELISA de célula contra células que superexpressam hPD-L1. Os clones positivos foram expandidos em placas de 24 poços e as seleções de confirmação foram conduzidas por ELISA direto e ELISA de célula. Os sobrenadantes (sups) de clones que eram específicos para o antígeno de seleção foram novamente selecionados por IHC.

[00273] Um conjunto de mAbs anti-hPD-L1 de camundongo também foi produzido por imunização de camundongos utilizando um protocolo similar àquele descrito acima para os mAbs de coelho.

[00274] De um total de 185 multiclones tanto de imunizações de coelho quanto de camundongo selecionados, apenas dez Abs de multiclone de coelho detectaram especificamente a forma membranosa de hPD-L1. Não foi descoberto nenhum dos subclones de camundongo purificados como detectando hPD-L1 da superfície da célula. Sessenta subclones dos cinco multiclones principais de coelho (designados N°s. 13, 20, 28, 29 e 49, cada um compreendendo 12 subclones) foram selecionados inicialmente por IHC em microarranjos de tecido de baixa densidade FFPE (TMAs), seguido pela confirmação e pela verificação da especificidade em 25 subclones limitados. Foi usada IgG de coelho como um controle negativo de isotipo e o mAb 5H1 (Dong e outros, 2002) foi usado como o controle positivo. A especificidade foi também verificada por ensaio de pré-absorção de antígeno. Ao longo de duas rodadas de IHC, os 15 subclones purificados a seguir foram selecionados como os Abs mais promissores em termos de especificidade e de intensidade de coloração: 13-1, 13-3, 13-7, 13-8; 20-5, 20-7, 20-12, 206; 28-1, 28-8, 28-12; 29-8; 49-5, 49-7 e 49-9. Os dados de imunorreati- vidade sobre estes Abs selecionados estão resumidos na Tabela 5. Tabela 5. Imunorreatividade de mAbs Anti-hPD-L1 de Coelho * Células CHO transfectadas de forma estável com PD-L1 vs. controle de CHO-S; t Os tecidos positivos em relação a PD-L1 incluíam placenta e um câncer pulmonar de células que não são pequenas; A expressão detecção até "muito alta" sugere melhor sensibilidade em detectar PD-L1 mem- branoso.

[00275] Ensaios adicionais foram realizados para melhor caracterizar os clones de Ab purificados, incluindo a determinação da afinidade de ligação e a competição cruzada entre os Abs (para identificar as regiões de epitopo em sobreposição versus diferentes) por ressonância de plasmon de superfície. Todos os Abs exibiram alta afinidade de ligação (KD < 10-9 M). Estes 15 clones purificados também selecionados novamente por IHC sobre TMA de baixa densidade de FFPE ou seções regulares contra vários tipos de células e de tecidos conhecidos como sendo positivos ou negativos em relação à expressão de PD-L1 na superfície celular. Foi usado IgG de coelho como controle do isotipo e foi usado mAb 5H1 como o controle positivo. À concentração alta (10 µg/mL), os clones 28-x e 49-x apresentarm níveis baixos a moderados de coloração residual em tecidos, enquanto os clones 13-x não exibiram coloração residual, que sugere que os 13-x clones possuem uma faixa dinâmica mais ampla. Os clones 20-x apresentaram vários graus de coloração residual que era principalmente citoplásmi- cos e difusos. O clone com a detecção mais robusta especificamente de PD-L1membranoso, o clone de coelho 28-8 (KD = 100 p M, que é determinada por SPR), foi selecionado como o Ab principal para ensaios subsequentes de IHC. Os mAbs 28-1, 28-12, 20-12 e 29-8 possuíam valores de KD de 130 pM, 94 pM, 160 pM e 1200 pM, respectivamente. As sequências das regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e variáveis cadeia leve (kappa) (V K) do mAb 28-8 são apresentadas nas SEQ ID NOs. 35 e 36, respectivamente. Foi demonstrado que o 28-8 Ab reconhece um epitopo diferente do mAb 5H1 de camundongo, com base na análise de SPR. Os clones 28-1, 28-12, 29-8 e 20-12 foram os melhores Abs seguintes em termos de detecção robusta de PD-L1 membranoso em tecidos FFPE. Embora o mAb 13-1 tivesse a melhor especificidade em termos de detecção de PD-L1membranoso, o nível de detecção máximo era menor do que aquele dos outros Abs principais. Um Western blotting também foi realizado com competição de antígeno mais/menos para verificar a especificidade dos Abs selecionados principais para PD-L1.

[00276] Foi comparada a ligação dos mAbs 5H1 e 28-8 ao PD-L1 membranoso em amostras de tecido teste FFPE que compreendem células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor pro-venientes de diferentes tipos de tumores. A expressão do PD-L1 membranoso foi avaliada utilizando o método de histoscore realizado por 2 patologistas independentes. Quatro tumores NSCLC, 2 MEL e 2 RCC foram corados com 28-8 a 2 mg/mL e 5H1 a 5 mg/mL. Os dados são tabelados na Tabela 6 e apresentados graficamente na Figura 9. O mAb de coelho 28-8 apresentou melhor detecção (histoscores mais altos) para 7 de 10 amostras utilizando 2,5 vezes menos Ab e somente em uma amostra o histoscore para 5H1 era ligeiramente mais alto do que para mAb 28-8. Tabela 6. Comparação dos mAbs 28-8 e 5H1 através da análise de histoscore

[00277] Taube e outros (2012) demonstraram por citometria de flu xo em células cultivadas que o mAb 5H1 se ligava à superfície da célula e a especificidade de ligação ao PD-L1 foi confirmada utilizando uma proteína de fusão PD-L1 para bloquear de forma competitiva a ligação do mAb 5H1 às seções de tecido. Estes autores também com- pararam o 5H1 com um Ab anti-hPD-L1, 4059 policlonal de coelho, descrito anteriormente por Gadiot e outros (2011) e descobriram que enquanto 5H1 apresentava um padrão de coloração da superfície da célula sobre amostras FFPE, o pAb 4059 demonstrava coloração cito- plasmática difusa. Adicionalmente, quando 5H1 foi comparado com pAb 4059 por análise de Western blot, o Ab 4059 se ligava a várias proteínas em lisados de células de melanoma além de uma proteína 50 kDa correspondente à massa esperada de PD-L1 glicosilado, em contraste com o 5H1 que detectava especificamente a banda de 50 kDa de PD-L1 glicosilado (Taube e outros, 2012). Contrário aos resultados de Taube e outros (2012) e aos resultados aqui divulgados (resumidos na Tabela 7), Gadiot e outros (2011) relataram que o mAb 5H1 produzia um alto nível de coloração residual em amostras de tecido FFPE, enquanto que eles descobriram que o pAb 4059 produzia coloração específica satisfatória de PD-L1 em amostras de FFPE. Trezeoutros Abs testados por Gadiot e outros (2011) não coravam tecidos FFPE, forneciam uma coloração residual alta ou não eram bloqueados por competição de proteina de fusão de PD-L1, realçando as dificuldades na obtenção de Abs anti-PD-L1 que se ligam especificamente ao PD-L1 em tecidos de FFPE.

[00278] No presente estudo, um ensaio de IHC automatizado (ver o Exemplo 10) foi usado para avaliar a ligação de diversos Abs anti-PD- L1 e 5H1 disponíveis comercialmente (Dong e outros, 2002) a amostras de tecido FFPE contendo várias células que expressam PD-L1. Os resultados, resumidos na Tabela 7, mostram que nenhum dos Abs dis-poníveis comercialmente testados reconheceu especificamente a ex-pressão de PD-L1 membranoso em tecidos humanos conhecidos como expressando PD-L1 ou como distinguindo claramente as células CHO que expressam PD-L1 versus as células CHO parentais não transfectadas que não expressavam PD-L1. A incapacidade do Ab (pAb) 4059 policlonal de se ligar ao PD-L1 membranoso reconhecido especificamente é corente com as descobertas de Taube e outros (2012). A ligação de 28-8 era similar àquela de 5H1 neste ensaio, embora a análise de histoscore sugira que o 28-8 funciona melhor do que o 5H1. Tabela 7. Ligação de mAbs a Amostras FFPE contendo Células que Expressam PD-L1 *Células CHO transfectadas de forma estável com PD-L1 vs. controle negativo de CHO-S parental; t Os tecidos positivos para PD-L1 incluíam amígdalas e/ou timo; mAb, Ab monoclonal de camundongo; pAb, Ab policlonal de coelho.

EXEMPLO 10 Desenvolvimento de Protocolo de IHC Automatizado para Avaliar a Expressão de PD-L1

[00279] Um protocolo de IHC automatizado foi desenvolvido para dosar a expressão de PD-L1 em espécimes FFPE. As seções de tecido (4 µm) foram montadas sobre lâminas, desparafinizada em um au- tocolorador (Leica) imergindo duas vezes durante 5 minutos em xileno e reidratando através da imersão duas vezes durante 2 min cada vez em EtOH a 100%, duas vezes em EtOH a 95% (v/v), uma vez em EtOH a 70% (v/v) e uma vez em água deionizada (dH2O). A recuperação do antígeno foi realizada utilizando uma câmara de extração de revestimento (Biocare Medical Decloaking Chamber Plus) e tampão Dako pH 6, aquecido até 110°C (P1) durante 10 min, então movendo para a próxima etapa (P2 FAN ON a 98°C; FAN OFF a 90°C). As lâminas foram resfriadas até a temperatura ambiente (RT) durante 15 min e enxaguadas com água durante aproximadamente 1 min.

[00280] Os reagentes foram colocados em um autocolorador (Bio- Genex i6000) e a área do tecido foi definida utilizando uma caneta pap. O ensaio de IHC, realizado utilizando o autocolorador no modo de pesquisa, compreendia as seguintes etapas: neutralização da peroxidase endógena utilizando Peroxidase Block (Leica) durante 10 min, seguido por enxágue 3 vezes com o tampão de lavagem de IHC (Da- ko); aplicação de Protein Block (Leica) às lâminas e incubação durante 10 min à temperatura ambiente, seguida por lavagem 3 vezes com tampão de lavagem; aplicação do Ab primário às lâminas (2 µg/mL) e incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, seguida pela lavagem 6 vezes com tampão de lavagem; adição de Post Primary Block (NovoLink Kit) às lâminas e incubação durante 30 min, seguida por lavagem 6 vezes com tampão de lavagem; adição de NovoLink Polymer (NovoLink Kit) às lâminas e incubação durante 30 min, seguida por lavagem 6 vezes com tampão de lavagem; adição dos substratos do cromogênio DAB (NovoLink Kit) e revelação durante 3 min, seguida por enxágue 5 vezes com dH2O à temperatura ambiente; contra- coloração com hematoxilina (NovoLink Kit) durante 1 min à temperatura ambiente, seguida por lavagem 3 vezes com dH2O por 5 vezes à temperatura ambiente. O Ab primário foi selecionado dos Abs anti-PD- L1 de coelho apresentados na Tabela 4; o mAb 28-8 era o Ab preferido. Como um controle negativo, foi usado IgG de coelho (Dako). As seções de tecido foram desidratadas utilizando um autocolorador Leica por lavagem uma vez durante 2 min em 70% de EtOH, duas vezes du-rante 2 min em EtOH a 95% e três vezes durante 2 min em EtOH 70%, então clareadas por lavagem três vezes durante 5 min em xileno. As seções foram montadas permanentemente com ° meio de montagem permount à lâmina, cobertas com lamínula e transferidas para uma capela para secar.

EXEMPLO 11 Planejamento do Estudo Clínico em Fase 1 sobre o Anticorpo Anti-PD- L1 Planejamento do Estudo

[00281] Foi conduzido um estudo em fase 1 para avaliar a segurança e a tolerabilidade de BMS-936559 (também citado neste caso e na Patente U.S. N°. 7.943.743 como 12A4) em pacientes com tumores sólidos avançados selecionados. Os objetivos secundários incluíam a avaliação inicial da atividade antitumoral de BMS-936559 e a avaliação farmacocinética. As medidas farmacodinâmicas foram incluídas com objetivos de exploração. Os pacientes foram tratados em ciclos de 6 semanas de BMS-936559 administrado como uma infusão intravenosa durante 60 minutos a cada 2 semanas nos dias 1, 15 e 29 de cada ciclo. Os pacientes continuaram o tratamento durante até 16 ciclos a não ser se eles sofressem toxicidade inaceitável, progressão da doença ou interrupção do tratamento consensual. Em alguns pacientes que eram clinicamente estáveis, o tratamento além da progressão inicial da doença foi permitido até que uma progressão adicional fosse confirmada.

Aumento da dose

[00282] Os pacientes com NSCLC, MEL, CRC, RCC, carcinoma ovariano (OV), gástrico (GC), de mama (BC) e pancreático (PC) avançados eram aceitáveis para se inscreverem. Utilizando um planejamento de titulação acelerada, a segurança foi avaliada a doses de 0,3, 1, 3 e 10 mg/kg. Um paciente foi inscrito em cada grupo sucessivo até que houvesse um AE relacionado ao fármaco > grau 2 durante o ciclo 1. Dois pacientes adicionais foram então inscritos naquele nível de dose e o estudo foi alterado para um planejamento 3+3 padronizado. O aumento ou a diminuição de dose intrapacientes não era permitida. A dose máxima tolerada (MTD) foi definida como a dose mais alta em que menos de um terço dos pacientes apresentou uma toxicidade limi- tante da dose.

Expansão do grupo

[00283] Inicialmente, 5 grupos de expansão (n=16/grupo) foram inscritos a 10 mg/kg para os pacientes com NSCLC, MEL, RCC, OV e CRC. Com base em sinais de atividade iniciais, os grupos de expansão adicional (até n=16/grupo) foram inscritos para MEL (a 1,0 e 3,0 mg/kg), NSCLC (grupos de histologia escamosa ou não escamosa distribuídos aleatoriamente para 1, 3 ou 10 mg/kg) e a 10 mg/kg para PC, BC e GC.

Pacientes

[00284] Era necessário que os pacientes tivessem NSCLC, MEL, RCC, OV, CRC, PC, GC ou BC avançado documentado e tivessem falhado em pelo menos uma terapia apropriada para tumor anterior para doença avançada/metastática (exceto para pacientes com PC ou GC que podiam nunca ter sido submetidos a tratamentos). Outros critérios de inclusão incluíam idade > 18 anos, expectativa de vida > 12 semanas, status de desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group de < 2, doença mensurável como definida por RECIST v1.0 e funções hematológicas, hepáticas e renais adequadas. Os pacientes com metástases cerebrais tratadas foi aceitos, se estáveis durante pelo menos 8 semanas. Os principais critérios de exclusão incluíam um histórico de doença autoimune ou de outras doenças que necessitem de medicação sistêmica com esteroides ou imunossupressores, tera- pia anterior com Abs moduladores de células T (incluindo anti-PD-1, anti-PD-L1 e anti-CTLA-4), histórico de HIV ou de hepatite B ou C ativa.

[00285] Neste estudo em andamento, 207 pacientes com NSCLC (n=75), MEL (n=55), CRC (n=18), RCC (n=17), OV (n=17), PC (n=14), GC (n=7) ou BC (n=4) foram tratados com BMS-936559 durante um período de 34 meses e são incluídos nos dados de segurança. A eficácia foi caracterizada em 160 pacientes com resposta avaliável. As características demográficas de linha base das populações de paciente totais e com resposta avaliável foram muito similares (Brahmer e outros, 2012). Entre os pacientes tratados, 86% tinham recebido quimioterapia anterior e 28% terapia imunológica ou biológica. As terapias anteriores por tipo de tumor incluíam imunoterapia (56%) e inibidor de B-RAF (9%) em pacientes com MEL; quimioterapia à base de platina (95%) e inibidores de tirosina quinase (TKIs; 41%) em pacientes com NSCLC e nefrectomia (94%), terapia antiangiogênica (82%) e imunote- rapia (41%) em pacientes com RCC (ver Brahmer e outros, 2012, para mais detalhes sobre pré-tratamentos dos pacientes).

Análise estatística

[00286] Todos os 207 pacientes que iniciaram o tratamento desde a data de análise foram usados para resumos de características de linha base e AEs. A população de eficácia consistia de 160 pacientes com resposta avaliável que iniciaram o tratamento pelo menos 7 meses antes da data de análise. Os AEs foram codificados utilizando MedDRA v14.1. As melhores respostas individuais totais eram derivadas de me-didasradiográficas de varredura de acordo com RECIST v1.0 modificado. As ORs foram confirmadas em pelo menos uma avaliação sequencial de tumor. Detalhes adicionais em relação aos métodos estatísticos são fornecidos em Brahmer e outros (2012).

EXEMPLO 12 Avaliações de Segurança em Pacientes Tratados com Anticorpo Anti- PD-L1

[00287] As avaliações de segurança (exame clínico e avaliações laboratoriais) foram conduzidas em todos os pacientes tratados na linha base e em intervalos regulares (semanalmente durante o ciclo 1 e bisemanalmente depois disso). A gravidade dos AEs foi classificada com base em NCI CTCAE, v3.0. A avaliação da doença por varreduras com tomografia computadorizada (CT) ou por obtenção de imagens por ressonância magnética foi realizada na linha base e antes de cada ciclo de tratamento.

[00288] Uma MTD não foi atingida até as doses mais altas testadas de 10 mg/kg de BMS-936559. A duração média da terapia era de 12 semanas (faixa de 2,0-111,1 semanas). Uma intensidade relativa de dose de > 90% foi atingida em 86% dos pacientes. Doze dos 207 pacientes (6%) interromperam o tratamento devido a um AE relacionado a BMS-936559 (ver Brahmer e outros, 2012, para detalhes).

[00289] Os AEs sem levar em conta a causalidade (qualquer grau) foram relatados em 188 de 207 pacientes. Os AEs relacionados a BMS-936559 avaliados por investigação foram observados em 126 de 207 (61%) pacientes. Os AEs relacionados a fármaco mais comuns eram fadiga, reações à infusão, diarreia, artralgia, erupção cutânea, náusea, prurido e cefaleia. A maioria dos eventos era de baixo grau com eventos relacionados a BMS-936559 de grau 3-4 observados em 19 de 207 (9%) pacientes (Brahmer e outros, 2012). O espectro, a frequência e a gravidade dos AEs relacionados a BMS-936559 eram similares ao longo dos níveis de dose, com a exceção das reações à infusão. Os AEOSIs relacionados ao fármaco, com etiologias potentiais imunorrelacionadas, foram observados em 81 de 207 (39%) dos pacientes e incluíam erupção cutânea, hipotiroidismo, hepatite e cada um de casos isolados sarcoidose, endoftalmite, diabetes melito e miaste- nia grave (Brahmer e outros, 2012). Estes AEs eram predominantemente de grau 1-2 e geralmente reversíveis com interrupção ou abandono do tratamento. Notavelmente, 9 pacientes foram tratados com corticosteroides para o controle dos AEs. Os AEs melhoraram ou foram resolvidos em todos os pacientes. Além disso, 4 destes 9 pacientes mantiveram o controle da doença apesar do tratamento com corti- costeroides. Os AEs endócrinos foram controlados com terapia de substituição e os pacientes reiniciaram o tratamento com BMS-936559 a critério do médico realizando o tratamento. As reações de infusão foram observadas em 21 de 207 (10%) pacientes, predominantemente a 10 mg/kg. Eram de grau 1-2 com a exceção de um evento de grau 3 a 10 mg/kg. As reações de infusão eram de modo geral rapidamente reversíveis com antihistaminas e antipiréticos e, em alguns casos, cor- ticosteroides. Um regime profilático com antihistaminas e antipiréticos foi implementado durante o estudo. Os pacientes com reações de infusão de grau 1-2 eram capazes de continuar o tratamento com BMS- 936559 com antihistaminas e antipiréticos profiláticos e a uma taxa de infusão reduzida. Os AEs graves relacionados a BMS-936559 ocorreram em 11 de 207 (5%) pacientes. Desde a data de análise dos dados, 45 pacientes (22%) morreram (Brahmer e outros, 2012); não foram observadas mortes relacionadas ao fármaco.

EXEMPLO 13 Análises Farmacocinéticas/Farmacodinâmicas sobre o Anticorpo Anti- PD-L1

[00290] Para as análises PK, foram coletadas amostras de sangue em série e as concentrações no soro de BMS-936559 foram avaliadas quantitativamente por ELISA. As células mononucleares de sangue periférico foram isoladas de pacientes na linha base e depois de um ciclo de tratamento para o ensaio de RO de PD-L1 por BMS-936559 em células T CD3-positivas circulantes via citometria de fluxo (Brahmer e outros, 2010).

[00291] As concentrações no soro de BMS-936559 aumentaram de uma maneira dependente da dose de 1-10 mg/kg (n=131). A média geométrica da área sob a curva (0-14 dias) para os níveis de dose de 1, 3 e 10 mg/kg eram de 2210, 7750 e 36620 µg/mLFora (coeficiente de variação [CV] 34-59%), respectivamente; a média geométrica das concentrações do pico nestes níveis de dose eram de 27, 83 e 272 µg/mL (CV 30-34%), respectivamente, depois da primeira dose. A meia vida de BMS-936559 foi avaliada partindo de dados farmacociné- ticos da população como aproximadamente de 15 dias. A RO de PD- L1 em linfócitos periféricos de sangue CD3-positivos foi avaliada em 29 pacientes com MEL no final de 1 ciclo de tratamento, a doses de BMS-936559 de 1-10 mg/kg. A RO mediana excedeu 65% para todos os grupos (Brahmer e outros, 2012).

EXEMPLO 14 Eficácia Antitumor Exibida pelo Anticorpo Anti-PD-L1

[00292] Cento e sessenta pacientes dos 207 tratados foram avaliados para resposta em fevereiro de 2012 e incluíam aqueles com NSCLC, MEL, CRC, RCC, OV e PC, porém não com GC ou BC. A atividadeclínica foi observada a todas as doses > 1 mg/kg (Brahmer e outros, 2012). As ORs (respostas confirmadas completa [CR] ou parcial [PR]) foram observadas em pacientes com MEL, NSCLC, RCC e OV (Tabela 8), como ilustrado por gráficos de radar representativos e to- mografia computadorizada (Figuras 10-13) e muitas ORs também eram duráveis (Tabela 9). Quatro pacientes adicionais apresentaram uma redução persistente em lesões alvos na presença de novas lesões, coerente com um padrão de resposta "relacionada ao sistema imunológico"; entretanto, para a finalidade de calcular as proporções de resposta, estes não foram categorizadas como capazes de responder. Foram observadas respostas antitumorais e/ou doenças estáveis prolongadas (SD) em pacientes com uma variedade de terapias anteriores recebidas. Foram observadas ORs ainda em pacientes com uma carga extensiva de doença metastática.

[00293] Em pacientes com MEL, houve 9 ORs através dos níveis de dose de 1, 3 e 10 mg/kg, com taxas de resposta de 6%, 29% e 19%, respectivamente. Três pacientes com MEL atingiram uma CR. Todos os 9 pacientes com MEL que sofreram OR iniciaram tratamento > 1 ano antes da análise dos dados; destes 5 apresentaram duração de resposta > 1 ano. Adicionalmente 14 pacientes com MEL (27%) possuíam SD durando > 24 semanas. Em pacientes com NSCLC, houve 5 ORs entre os níveis de dose de 3 e 10 mg/kg, com taxas de resposta de 8% e 16%, respectivamente. Havia ORs em pacientes com histologia não escamosa (n=4) ou escamosa (n=1). Todos os 5 capazes de responder com NSCLC iniciaram o tratamento > 24 semanas antes da análise dos dados; destes, 3 apresentaram respostas durante > 24 semanas. Seis pacientes com NSCLC adicionais apresentaram SD durante > 24 semanas. Havia 1 PR de 17 pacientes com OV (6% taxa de resposta) e 3 pacientes (18%) com SD durante > 24 semanas, todos à dose de 10 mg/kg. Em pacientes com RCC, houve ORs em 2 de 17 (12%) pacientes tratados a 10 mg/kg com respostas que duram 4 e 18 meses, respectivamente. Sete pacientes com RCC adicionais apresentaram SD durante > 24 semanas. Tabela 8. Atividade Clínica de BMS-936559 em 160 Pacientes, Resposta Avaliável* IC representa intervalos de confiança, MEL melanoma, RCC carcinoma de célula renal, NSCLC câncer pulmonar de células que não são pequenas, OV câncer ovariano, RCC carcinoma de célula renal, N/A não aplicável, ORR taxa de resposta objetiva (resposta completa + resposta parcial), SD doença estável e PFSR taxa de sobrevivência livre de progressão. * A população de eficácia consiste em pacientes de resposta avaliável que iniciaram o tratamento pelo menos 7 meses antes da data da análise e possuíam doença que pode ser medida em uma avalilação de tumor de linha base e pelo menos um dos seguintes: uma avaliação do tumor em estudo, progressão clínica ou morte. tInclui duas CRs. n Inclui uma CR. § As taxas de resposta objetiva ({[CR + PR] + n} x 100) são com base em respostas confirmadas apenas, com intervalos de confiança calculados utilizando o método de Clopper-Pearson. ** A taxa de sobrevivência livre de progressão era uma proporção de pacientes que não sofreram progressão e estavam vivos em 24 semanas, calculada pela metodologia de Kaplan-Meier, com intervalos de confiança utilizando o método de Greenwood. As respostas individuais de paciente foram adjudicadas por RECIST v1.0 com modificação (ver o protocolo de estudo em Brahmer e outros (2012) N Engl J Med (submetido) para informação adicional). Tabela 9. Duração de Respostas Objetiva para BMS-936559* * MEL representa melanoma, NSCLC câncer pulmonar de células que não são pequenas, RCC câncer de célula renal, OV câncer ovariano. t Tempo desde a primeira resposta até o tempo progressão documentada, morte ou para dados verificados (representados por +), tempo até a última avaliação do tumor. EXEMPLO 15 Planejamento do Estudo Clínico em Fase 1 sobre Anti-PD-1 mais Anti- CTLA-4 em MEL Avançado

Planejamento do Estudo

[00294] Neste estudo em fase 1, grupos de pacientes sucessivos foram tratados com doses cada vez maiores de nivolumab e ipilimu- mab intravenosas administradas concorrentemente (regime concorrente) e separadamente, dois grupos de pacientes tratados anteriormente com ipilimumab nivolumab recebidos isoladamente (regime sequenci- ado).

[00295] Para o regime concorrente, os pacientes receberam durante o período de indução nivolumab e ipilimumab a cada 3 semanas durante 4 doses, seguido por nivolumab isoladamente a cada 3 semanas durante 4 doses. O tratamento combinado continuou subsequentemente durante o período de manutenção a cada 12 semanas durante até 8 doses. Quando ambos os fármacos foram administrados juntos, o nivolumab foi administrado primeiro. Dentro de um grupo, as doses de nivolumab e de ipilimumab foram mantidas constantes durante os períodos de indução e de manutenção. O período de avaliação da toxicidade limitador da dose foi através da semana 9. As avaliações de tumor foram nas semanas 12, 18, 24 e 36 e então a cada 12 semanas depois disso.

[00296] No regime sequenciado, os pacientes tratados anteriormente com ipilimumab antes do início do estudo receberam nivolumab a cada 2 semanas durante até 48 doses. A terapia com nivolumab foi iniciada dentro de 4-12 semanas depois da monoterapia com ipilimu- mab. As avaliações do tumor foram na semana 8 e então a cada 8 semanas depois disso. As respostas do tumor foram adjudicadas utilizando mWHO e critérios imde mWHO imuno-relacionados para ambos os regimes.

[00297] Depois de completada a terapia, os pacientes sem confirmação da progressão da doença foram acompanhados durante até 2,5 anos. Os pacientes com CR, PR ou SD > 24 semanas e subsequente progressão da doença podiam ser retratados com o regime original. A avaliação de segurança foi realizada por protocolo. A gravidade de AEs foi classificada de acordo com os Critérios Comuns de Terminologia do National Cancer Institute para Eventos adversos, versão 3,0. Avaliação da doença, utilizando CT e/ou MRI quando apropriado, foi realizada por protocolo.

Aumento da dose e expansão do grupo

[00298] O estudo foi planejado inicialmente para avaliar o regime concorrente utilizando um planejamento padronizado 3 + 3 para a fase de aumento da dose, seguido por expansão do grupo até um total de até 16 pacientes na dose máxima tolerada ou na dose máxima administrada. O período de avaliação da toxicidade de limitação da dose (DLT) para aumento da dose foi de 9 semanas. O aumento da dose intrapaciente foi permitido e os pacientes que experimentarm DLT foram retirados da terapia. Os pacientes que se retiraram do estudo durante o período de avaliação de DLT por razões sem ser toxicidade relacionada ao fármaco podiam ser substituidos. O protocolo foi corrigido para permitir a expansão de qualquer grupo de regime concorrente durante o aumento da dose até N = até 12 pacientes. Dois grupos de regime sequenciados (6 a 16 pacientes cada) foram adicionados posteriormente; os pacientes foram tratados com nivolumab (1 mg/kg ou 3 mg/kg) depois que eles receberam ipilimumab antes. Pacientes

[00299] Os pacientes aceitáveis tinham 18 anos de idade e tiveram um diagnóstico de melanoma no estágio III ou IV mensurável, não res- selecionado; o status de desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group de 0-1, em que 0 é assintomático e 1 é fracamente sintomático; função adequada do órgão e expectativa de vida de > 4 meses. Os pacientes com metástase ativa, do sistema nervoso central não tratado; histórico de doença autoimune; terapia anterior com anti-corpos moduladores de célula T (excluindo ipilimumab para grupos de regime sequenciado); HIV ou hepatite B ou C foram excluidos.

[00300] Nos grupos de regime sequenciados, foi pedido aos pacientes que recebessem 3 doses anteriores de ipilimumab, com a última dose administrada dentro de 4-12 semanas de iniciação de nivolumab. Os pacientes com CR, progressão com evidências de deterioração clínica ou com um histórico de AEs de alto grau relacionado a ipilimumab foram excluídos (ver Wolchok e outros 2013a, para detalhes de protocolo).

[00301] Oitenta e seis pacientes foram tratados entre dezembro de 2009 e fevereiro de 2013, 53 com o regime concorrente e 33 com o regime sequenciado. As características de linha base do paciente são detalhadas em Wolchok e outros (2013a). No regime concorrente e sequenciado, 38% e 100% de pacientes, respectivamente, receberam terapia sistêmica anterior. A maioria dos pacientes tinha doença de M1c e >30% tinham lactato desidrogenase elevado no soro (LDH). A maioria dos pacientes se matriculou nos grupos de regime sequencia- do que demonstraram progressão radiográfica (73%) com antes do tratamento com ipilimumab.

Imunohistoquímica de PD-L1

[00302] A expressão de PD-L1 de pré-tratamento foi medida por IHC em espécimes de tumor FFPE utilizando o mAb anti-PD-L1 de coelho, 28-8 e um ensaio automatizado desenvolvido por Dako (Carpinteria, CA). A especificidade do Ab foi avaliada por western blotting contra a proteína PD-L1 recombinante e lisados de expressão de PD-L1 e linhas de célula de não expressão. Foi realizado um ensaio IHC com e sem competição de antígeno e uma avaliação de padrões de coloração em tecidos humanos normais. Foram testadas sensibilidade analítica, especificidade, capacidade de repetição, reprodutibilidade e ro- bustez do ensaio imunohistoquímico e satisfizeram todos os critérios de aceitação pré especificados. Dois patologistas, sem conhecer o re-sultado, leram independentemente e adjudicaram os escores para todos os espécimes clínicos. A amostra foi definida como PD-L1-positivo se 5% de células tumorais exibiram coloraçãoda membrana PD-L1 de qualquer intensidade em uma seção com 100 células que podem ser avaliadas.

Análise estatística

[00303] Todos os pacientes tratados (N=86) como em fevereiro de 2013 foram usados para descrever as características de linha base, segurança e contagem de linfócito absoluto (ALC) e análise de coloração de PD-L1. A População de Eficácia consistiu de 82 pacientes com resposta que pode ser avaliada que receberam pelo menos uma dose de terapia do estudo, possuíam doença que pode ser medida na linha base e one dos seguintes: > 1 avaliação do tumor em tratamento, progressão clínica ou morte antes da primeira avaliação do tumor em tratamento. Os AEs foram codificados utilizando-se MedDRA, versão 15,1. Foram identificados AEs seletos com etilogias imunológicas potenciais utilizando uma lista predefinida de termos MedDRA. As melhores respostas globais foram derivadas de maneira programática provenientes de medidas de tumor fornecidas pelo radiologista no local do estudo e pesquisadores por critérios de resposta de WHO modificado (mWHO) ou imunorrelacionada (Wolchok e outros 2009). Foram confirmadas respostas completas e parciais em pelo menos uma avaliação subsequente do tumor. Também foi realizada uma análise para avaliar a grandeza da redução em lesões alvos por avaliação radiográ- fica. A resposta foi caracterizada como profunda se uma redução 80% partindo das medidas de linha de base foi observada. As respostas não confirmadas como da data desta análise também foram incluídas em uma estimativa de atividade clínica agregada.

EXEMPLO 16 Avaliações de Segurança em pacientes com MEL Tratados com Anti-PD-1 plus Anti-CTLA-4

[00304] Para o regime concorrente (n=53), AEs de qualquer grau, independentemente de atribuição, foram observados em 98% dos pa-cientes. Os AEs relacionados ao tratamento foram observados em 93% de pacientes com as mais comuns sendo erupção cutânea (55%), prurido (47%), fadiga (38%) e diarreia (34%). AEs de grau 3-4, inde-pendentemente de atribuição, foram observados em 72% dos pacientes, enquanto que eventos relacionados a tratamento de grau 3-4 foram observados em 53%, com os mais comuns sendo elevação de lipase (13%), aspartato aminotransferase (13%) e alanina aminotransferase (11%). Seis de 28 (21%) pacientes tinham eventos relacionados a tratamento limitando a dose de grau 3-4. Os AEs graves relacionados a tratamento foram relatados em 49% de pacientes. AEs selecionados relacionados a tratamento comum de grau 3-4 incluiram eventos hepá-ticos (15%), gastrointestinais (9%) e renais (6%). Casos isolados de pneumonia e uveite foram observados, coerentes com experiência de históricos de monoterapia. Onze (21%) pacientes interromperam devido aos AEs relacionados ao tratamento.

[00305] O grupo 3 (3 mg/kg de nivolumab + 3 mg/kg de ipilimumab) excedeu a MTD (3 de 6 pacientes sofreram lipase elevada em grau 3-4 assintomática que persistiu durante 3 semanas). O grupo 2 (1 mg/kg de nivolumab + 3 mg/kg de ipilimumab) foi identificado como a MTD (uveite de grau 3, AST/ALT elevado de grau 3 em 1 paciente cada).

[00306] Para o regime sequenciado (n=33), AEs de qualquer grau, independentemente de atribuição, foram observados em 29 (88%) pa-cientes. Os AEs relacionados a tratamento foram observados em 24 (73%) pacientes, com os mais comuns incluindo prurido (18%) e elevação de lipase (12%). Os AEs de grau 3-4, independentemente de atribuição, foram observados em 11 (33%) pacientes, enquanto que os AEs relacionados a tratamento de grau 3-4 foram observados em 6 (18%) pacientes, com elevação de lipase como o evento mais comum (6%). Os AEs graves relacionados a tratamento foram relatados em 7 (21%) pacientes. Eventos endócrinos de grau 3-4 foram observados como AEs seletos relacionados a tratamento em 2 pacientes. Um paciente teve pneumonia de grau 2. Três (9%) pacientes desistiram devido aos AEs relacionados ao tratamento.

[00307] Tanto para os regimes concorrentes como sequenciados, os AEs relacionados a tratamento puderam ser controlados e geral-mentereversíveis com imunossupressores e/ou terapia de substituição (para endocrinopatias) por algoritmos estabelecidos anteriormente para ipilimumab (ver o encarte na embalagem de YERVOY®). Entre os 86 pacientes tratados no estudo, 28 dos 73 pacientes (38%) com eventos adversos relacionados a fármaco necessitaram controle com glicocor- ticoides sistemáticos. Três pacientes necessitarm terapia adicional com imunossupressores com infliximab (2 pacientes) ou micofenolata mofetil (1 paciente). Nenhuma morte relacionada ao tratamento foi relatada. Os detalhes adicionais de AEs e o seu controle são fornecidos em (Wolchok e outros 2013a).

EXEMPLO 17 Eficácia Exibida pela Combinação de Anti-PD-1 e Anti-CTLA-4 em pacientes com MEL

[00308] Foi observada atividade clínica tanto com os regimes con-correntes como sequenciados (Tabelas 10 e 11). Nos grupos de regime concorrente, foram observados critérios confirmando respostas objetivas (OR) por critérios de mWHO em 21 de 52 (40%; 95% de IC: 2755) pacientes com resposta que podia ser avaliada através de todas as doses. Depois da observação de diversos pacientes que demonstraram respostas principais (abordando CR), o número de pacientes com pelo menos 80% de redução de tumor, foi avaliado um limiar empírico escolhido porque ele representa um nível de regressão de tumor que se aproxima da resposta completa. Esta profundidade de resposta era incomum em estudos publicados de bloqueio de ponto de controle (Hodi e outros, 2010; Topalian e outros, 2012b). Dezesseis pacientes tinham redução de tumor > 80% a 12 semanas, incluindo 5 CRs (Tabela 10, Figuras 14A e 15-17). Além dos 21 pacientes com ou por critérios de mWHO, 4 pacientes experimentaram uma resposta objetiva por critérios de resposta imuno relacionados e 2 pacientes tinham respostas não confirmadas. Estes pacientes não foram incluídos no cálculo de ORRs. Para o regime concorrente, evidência global de atividade clínica (resposta convencional, não confirmada ou imuno relacionada ou SD > 24 semanas) foi observada em 65% (95% de IC: 51-78; Tabela 10) de pacientes. O impact profundo da combinação concorrente pode melhor apreciado no gráfico de queda d’água (Figura 14B). As respostas estavam em andamento entre 19 de 21 que reages, com durações na faixa de desde 6,1+ até 72,1+ semanas na ocasião da análise de dados (Tabela 12). Para pacientes tratados a MTD (grupo 2, 1 mg/kg de nivolumab + 3 mg/kg de ipilimumab) ou ocorrido em 9 de 17 (53%; 95% de IC: 28-77) pacientes, incluindo 3 CRs. Todos os 9 que reages conseguiram > 80% de redução do tumor em sua primeira avaliação programada em tratamento (Tabela 10 e Figura 14A).

[00309] Para os pacientes nos grupos sequenciado-de regime, 6 de 30 pacientes conseguiram ou (20%; 95% de IC: 8-39) incluindo 1 CR. Quatro (13%) pacientes conseguiram > 80% de redução do tumor a 8 semanas (Tabela 11 e Figura 18). Pacientes adicionais tiveram respostas imuno-relacionadas (n=3) ou não confirmadas (n=3). Quando objetivo, as respostas imuno-relacionadas ou não confirmadas ou SD > 24 semanas são consideradas, foi observada evidência de atividade clínica para o regime sequenciado em 43% (95% de IC: 26-63). O gráfico de queda d’água revela que os pacientes que não respondiam ao ipi- limumab anterior podem responder ao nivolumab subsequente (Figura 18C). Tabela 10. Atividade Clínica de Pacientes que receberam o regime concorrente de Nivolumab e Ipilimumab*CR representa resposta completa, PR resposta parcial, uPR resposta parcial não confirmada, irPR respostaparcial imunorrelacionada, SD doença estável, irSD doença estável imunorrelacionada. † Os pacientes com resposta que pode ser avaliada eram aqueles que receberam pelo menos uma dose de terapia do estudo, tinham doença que pode ser medida na linha base e um dos seguintes: 1) pelo menos uma avalia- ção do tumor em tratamento, 2) progressão clínica ou 3) morte antes da primeira avaliação do tumor em tratamento. ‡ Os pacientes que tinham uma PR depois de uma avaliação do tumor, porém não tinham tempo suficiente de acompanhamento para confirmação de PR inicial. § Os pacientes que tinham redução da lesão do tumor alvo na presença de novas lesões, coerentes com PR ou SD imunorrelacionadas. ¶ [(CR + PR) / Nº. de pacientes com resposta que pode ser avaliada] × 100. Os intervalos de confiança foram avaliados pelo método de Clopper-Pearson. ¦ [(CR + PR + uCR + uPR + irPR + SD =24 sem + irSD =24 sem) / Nº. de pacientes com resposta que pode ser avaliada] × 100. ** Dois pacientes adicionais no grupo 2 conseguiram =80% de redução do tumor em sua primeira avaliação programada, que foi conduzida depois da semana 12. Tabela 11. Atividade Clínica de Pacientes que receberam o Regime sequenciado de Nivolumab e Ipilimumab* CR representa resposta completa, PR resposta parcial, uPR resposta parcial não confirmada, irPR resposta parcial imunorrelacionada, SD doença estável, irSD doença estável imuno relacionada. † Os pacientes com resposta que pode estar avaliada eram aqueles que receberam pelo menos uma dose de terapia do estudo, tinham doença que podia ser medida na linha base e um dos seguintes: 1) pelo menos uma avaliação do tumor em tratamento, 2) progressão clínica ou 3) morte antes da primeira avaliação do tumor em tratamento. ‡ Pacientes que tinham uma PR depois de uma avaliação do tumor, porém não tinham tempo suficiente de acompanhamento para a confirmação da PR inicial. 194/206 196/206 Tabela 12. Duração de Respostas Objetivas confirmadas de Pacientes Individuais ,4+, 8,1+ 7 3 mg/kg de nivolumab + prior ipilimumab CR NA* PR NA* *

Avaliação de expressão de PD-L1 de tumor e contagem de linfócitos absolutos

[00310] A expressão de PD-L1 de tumor e as alterações no sangue periférico ALC foram exploradas como biomarcadores para monoterapia com nivolumab e ipilimumab, respectivamente (Topalian e outros, 2012b; Berman e outros, 2009; Ku e outros, 2010; Postow e outros, 2012; Delyon e outros, 2013). A expressão de PD-L1 de tumor foi caracterizada por coloração com IHC e alterações farmacodinâmicas em ALC de sangue periférico. Utilizando uma faixa > 5% para definir a po- sitividade de PD-L1, espécimes de tumor de 21 de 56 (38%) pacientes eram positivos para PD-L1. As ORs foram observadas em pacientes com tumores PD-L1-positivos (6/13) ou PD-L1-negativos (9/22) entre pacientes tratados com o regime concorrente (valor de P post-hoc > 0,99; teste exato de Fisher). Em grupos de regime sequenciado, um número numericamente mais alto de respostas globais foi observado em pacientes com amostras de tumor PD-L1-positivas (4/8) comparados com pacientes com tumores PD-L1-negativos (1/13), porém os números são pequenos.

[00311] Em contraste com as observações com monoterapia com ipilimumab, não foi detectada uma elevação coerente em ALC partindo da linha de base em pacientes tratados com a combinação concorrente ou em pacientes tratados com nivolumab após a terapia com ipi- limumab. Nos grupos de regime concorrente, os pacientes com um baixo ALC nas semanas 5 a 7 (< 1000 células^L) (Ku e outros, 2010) tinham similar ou (43%) comparado a pacientes com um ALC normal nas semanas 5 a 7 (40%). Similarmente, nos grupos de regime se- quenciado, 17% dos pacientes com baixo ALC tinham ou e 23% de pacientes com ALC normal ou alto tinham OR. Resumo da Listagem de Sequências REFERÊNCIAS Amin A e outros (2013) A phase 1 study of nivolumab (anti- PD-1; BMS-936558) in combination with sunitinib, pazopanib or ipili- mumab in patients (pts) with metastatic renal cell carcinoma (mRCC). Abstract at American Society of Clinical Oncology (ASCO) Annual Meeting, May 31-June 4, 2013, Chicago (in press). 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Claims

1. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que inter-rompe a interação entre Programmed Death-1 (PD-1) e Programmed Death Ligand-1 (PD-L1), caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, em que o anticorpo ou a porção que se liga ao antí- geno do mesmo se liga especificamente ao PD-1 ou ao PD-L1.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em melanoma, carcinoma de célula renal, câncer pulmonar de células que não são pequenas (NSCLC) escamosas, NSCLC não escamosas, câncer colorretal, câncer de próstata resistente à castração, câncer de ovário, câncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma pancreático, car-cinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço, carcinomas do esôfago, do trato gastrointestinal e da mama e uma malignidade he-matológica.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficiente do anticorpo ou da porção que se liga ao antígeno do mesmo compreende uma dose que varia desde 0,1 até 10,0 mg/kg do peso corporal que é formulada para administração em uma programação de dosagem de uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês.

4. Processo para seleção de um indivíduo para o tratamento com um anticorpo anti-PD-1, caracterizado pelo fato de que o processo compreende a seleção de um indivíduo que é um candidato adequado para imunoterapia, a seleção compreendendo: (i) o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; e (iii) a seleção do indivíduo como um candidato adequado com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular excede um nível de limiar predeterminado.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proporção de células que expressam PD-L1 é avali-adaatravés da realização de um ensaio para determinar a presença do polipeptídeo de PD-L1 sobre a superfície das células na amostra de tecido de teste.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido de teste é uma amostra de tecido incrustada em parafina fixada em formalina (FFPE).

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a presença do polipeptídeo de PD-L1 é determinada utilizando um ensaio de IHC automatizado.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o ensaio de IHC é realizado utilizando um anticorpo monoclonal anti-PD-L1 para se ligar ao polipeptídeo de PD-L1, em que o anticorpo monoclonal anti-PD-L1 é selecionado de 28-8, 28-1, 28-12, 29-8 e 5H1.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que o nível de limiar predeterminadoé 1% de células tumorais ou uma única célula inflamatória que se infiltra no tumor expressando PD-L1 de superfície celular que é determinado por IHC automatizada utilizando o mAb 28-8.

10. Processo para seleção de um indivíduo para o tratamento com um anticorpo anti-PD-1, caracterizado pelo fato de que o processo compreende a seleção de um indivíduo que não é adequado para imunoterapia com anticorpo anti-PD-1, a seleção compreendendo: (i) o fornecimento de uma amostra de tecido de teste obtida de um paciente com câncer do tecido, a amostra de tecido de teste compreendendo células tumorais e células inflamatórias que se infiltram no tumor; (ii) a avaliação da proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular; e (iii) a seleção do indivíduo que não é adequado para imunoterapia com anticorpo anti-PD-1 com base em uma avaliação de que a proporção de células na amostra de tecido de teste que expressam PD-L1 sobre a superfície celular é menor que um nível de limiar predeterminado.

11. Anticorpo monoclonal ou porção que se liga ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um polipeptídeo de PD-L1 expresso na superfície celular em uma amostra de tecido incrustada em parafina fixada em formalina (FFPE).

12. Anticorpo monoclonal ou porção que se liga ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção do mesmo compreende as regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 em uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 35 e as regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 em uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 36.

13. Anticorpo monoclonal ou porção que se liga ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou a porção do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende aminoácidos ligados con-secutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 35 e uma região variável de cadeia leve que compreende aminoácidos ligados consecutivamente que possuem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 36.

14. Uso de: (a) um anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe Programmed Death-1 (PD-1); e (b) um anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe o Antígeno-4 de Linfóci- tos T Citotóxicos (CTLA-4); caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, em que cada anticorpo é formulado para administração em uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg do peso corporal em um regime concorrente que compreende: (i) uma programação de dosagem de indução que compreende a administração combinada dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 10 doses, seguidas pela administração do anti-PD- 1 isoladamente em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 12 doses; seguida por (ii) uma programação de dosagem de manutenção que compreende a administração combinada dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 8, 12 ou 16 semanas ou pelo menos uma vez por trimestre, para pelo menos 4, 6, 8, 10, 12 ou 16 doses.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 são formulados para administração nas dosagens a seguir: (a) 0,1 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 3 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (b) 0,3 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 3 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (c) 1 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 3 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (d) 3 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 3 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (e) 5 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 3 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (f) 10 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 3 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (g) 0,1 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 1 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (h) 0,3 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 1 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (i) 1 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 1 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (j) 3 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 1 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; (k) 5 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 1 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4; ou (l) 10 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e 1 mg/kg de anticor po anti-CTLA-4.

16. Uso de um anticorpo ou uma porção que se liga ao an- tígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe PD-1, caracte-rizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, em que o anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo é formulado para administração em uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg do peso corporal e em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada semana, pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para até 6 até 72 doses, e em que o indivíduo foi previamente tratado com um anticorpo anti-CTLA-4.

17. Uso de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracteri-zado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 é nivolumab.

18. Uso de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracteri-zado pelo fato de que o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumab.

19. Anticorpo anti-PD-1 ou porção que se liga ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um indivíduo afligido com um câncer em um regime concorrente que compreende a administração combinada com um anticorpo anti-CTLA- 4 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo, em que os anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 são cada um administrados em uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg do peso corporal e adicionalmente em que o regime concorrente compreende: (i) uma programação de dosagem de indução que compreende a administração combinada dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 12 doses, seguidas pela administração do anti-PD- 1 isoladamente em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas ou pelo menos uma vez ao mês, para pelo menos 2, 4, 6, 8 ou 10 doses; seguida por (ii) uma programação de dosagem de manutenção que compreende a administração combinada dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 em uma frequência de dosagem de pelo menos uma vez a cada 8, 12 ou 16 semanas ou pelo menos uma vez por trimestre, para até 4, 6, 8, 10, 12 ou 16 doses.

20. Kit para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, caracterizado pelo fato de que o kit compreende: (a) uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg do peso corporal de um anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe PD-1; (b) uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg do peso corporal de um anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe CTLA-4; e (c) instruções para a utilização dos anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA-4 do processo de regime concorrente como definido na rei-vindicação 14.

21. Kit para o tratamento de um indivíduo afligido com um câncer, caracterizado pelo fato de que o kit compreende: (a) uma dosagem variando desde 0,1 até 20,0 mg/kg do peso corporal de um anticorpo ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a e inibe PD-1; e (b) instruções para a utilização do anticorpo anti-PD-1 no processo de regime sequenciado como definido na reivindicação 16.

22. Uso de um anticorpo anti-PD-1 ou uma porção que se liga ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para imunoterapia de um indivíduo afligido com câncer que compreende a interrupção da interação entre PD-1 e PD-L1.

23. Anticorpo anti-PD-1 ou uma porção que se liga ao antí- geno do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de um indivíduo afligido com câncer que compreende o aumento da potência de uma resposta imunológica endógena no indivíduo através da inibição da sinalização partindo da via de PD-1/PD-L1.

24. Anticorpo anti-PD-1 ou uma porção que se liga ao antí- geno do mesmo, caracterizado pelo fato de ser para uso na imunote- rapia de um indivíduo afligido com câncer que compreende a interrupção da interação entre PD-1 e PD-L1.

25. Invenção, caracterizada pelo fato de que é em qualquer forma de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso englo-badas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.