TWI763964B - 抗pd-l1抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及特異性結合PD-L1的新型抗體和抗體片段以及含有該抗體或抗體片段的組合物。此外,本發明涉及編碼該抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞,以及相關用途。此外,本發明涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。特別地,本發明涉及這些抗體和抗體片段與其它療法的聯合治療。
Description
本發明涉及特異性結合PD-L1的新型抗體和抗體片段以及含有該抗體或抗體片段的組合物。此外,本發明涉及編碼該抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞,以及相關用途。此外,本發明涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。特別地,本發明涉及這些抗體和抗體片段與其它療法,例如治療方式或治療劑的聯合治療。
程序性死亡配體1(PD-L1)是涉及在慢性感染、妊娠、組織同種異體移植、自身免疫性疾病和癌症期間抑制免疫系統應答的蛋白質。PD-L1藉由結合到表達於T細胞、B細胞和單核細胞的表面上的被稱為程序性死亡1(PD-1)的抑制性受體來調節免疫應答。PD-L1還藉由與另一種受體B7.1(也稱為B7-1或CD80)的相互作用負調節T細胞功能。PD-L1/PD-1和PD-L1/B7.1複合物的形成負調節T細胞受體信號傳導,導致隨後的T細胞活化的下調和抗腫瘤免疫活性的抑制。PD-L1在許多癌症中過表達,該癌症包括多種多樣的實體瘤,諸如膀胱腫瘤、乳腺腫瘤、結腸腫瘤、肺腫瘤、黑色素瘤、卵巢腫瘤、唾液腫瘤、胃腫瘤和甲狀
腺腫瘤。腫瘤細胞中的PD-L1過度表達可促進腫瘤侵襲,並且常常與不良預後相關。
因此,本領域仍然需要新的與PD-L1的結合更好且成藥性好的抗PD-L1抗體。
本文公開了與PD-L1結合的抗體分子。還提供了編碼該抗體或其抗體片段的核酸、用於產生抗體分子的表達載體、宿主細胞和方法。還提供包含抗PD-L1的抗體分子的免疫綴合物、多特異性或雙特異性抗體分子,以及醫藥組成物。本文公開的抗PD-L1抗體分子可以單獨或聯合其他療法,例如治療劑或治療方式,用來治療、預防和/或診斷腫瘤疾病以及感染性疾病。此外,本文還公開了用於檢測PD-L1的組成物和方法,以及使用抗PD-L1抗體分子預防或治療多種疾病(包括腫瘤和/或感染性疾病)的方法。
因此,在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段(特異性)結合PD-L1。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段(特異性)結合人PD-L1。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段以高親和力結合PD-L1(例如人PD-L1),例如,依以下平衡解離常數(KD)與PD-L1結合,該KD小於大約50nM,較佳地,小於或等於大約20nM,更佳地小於或等於大約15nM,更佳地小於或等於大約10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM,最佳地,該KD小於或等於大約1.5nM、1.4nM、1.3nM、1.2nM、1.1nM、1nM、0.9nM或
0.8nM。在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體以0.1至10nM,較佳地0.5至10nM,更佳地0.6至10nM、0.7至8nM、0.7至5nM,最佳地0.5至1.5nM、0.7至1.5nM、0.7至1nM的KD結合PD-L1。在一些實施方案中,PD-L1為人PD-L1。在一些實施方案中,抗體結合親和力是使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量)測定法測定的。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段結合表達人PD-L1的細胞,例如,以小於或等於大約4nM、3.5nM、3nM、2.9nM、2.8nM、2.7nM、2.6nM、2.5nM、2.4nM、2.3nM、2.2nM、2.1nM、2nM、1.9nM、1.8nM、1.7nM或1.6nM的EC50。在一些實施方案中,該結合用流式細胞術(例如FACS)測定。在一些實施方案中,表達人PD-L1的細胞為表達人PD-L1的CHO細胞。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段阻斷PD-L1的相關活性,例如以小於或等於大約10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM或0.7nM的EC50,較佳以大約0.1至1nM、0.5至1nM、0.6至1nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM或1nM的EC50。在一些實施方案中,PD-L1的相關活性是PD-L1與PD-1的結合。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段在MOA測定中以小於或等於大約10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM或0.7nM的EC50,較佳以大約0.1至1nM、0.5至1nM、0.6至1nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM或1nM
的EC50抑制PD-L1與PD-1的結合。在一些實施方案中,細胞為CHO細胞。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段提高T細胞功能。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段提高T細胞增殖。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段提高IFN-γ分泌。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段提高IL-2分泌。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段提高IFN-γ分泌和IL-2分泌。在一些實施方案中,該提高是在混合淋巴細胞反應(MLR)中測定的。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段激活T細胞的能力優於已知的抗PD-L1抗體,例如Tecentriq。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段相比已知的抗PD-L1抗體(例如Tecentriq)具有更低的黏性,因此具有更好的成藥性。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段在Zenix管柱檢測法中,駐留時間(RT)低於大約10分鐘、大約9分鐘或大約8分鐘,較佳地,駐留時間在大約7分鐘至9分鐘之間,較佳地在大約7至8.5分鐘,大約7.5至8.5分鐘,大約7至8分鐘,或大約7.5至8分鐘之間,例如大約7.5分鐘、7.6分鐘、7.7分鐘、7.8分鐘、7.9分鐘、8分鐘、8.1分鐘、8.2分鐘、8.3分鐘、8.4分鐘、8.5分鐘。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段抑制PD-L1的一種或多種活性,例如,導致以下一者或多者:腫瘤浸潤型淋巴細胞增加、T細胞受體介導的增殖增加、
或癌細胞的免疫逃避減少。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段能夠誘發抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體單獨或與其他的療法(例如治療方式和/或治療劑)組合能夠有效治療腫瘤(例如癌症)或感染(例如慢性感染)。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一些實施方案中,腫瘤是癌症。在一些實施方案中,腫瘤是胃腸道腫瘤。在一些實施方案中,癌症是結腸癌。
在一些實施方案中,本發明抗PD-L1抗體或其片段的重鏈和/或輕鏈還包含信號肽序列,例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:68)。
在一些實施方案中,本發明的抗體還涵蓋抗PD-L1抗體的胺基酸序列的變體,以及與上文所述的任何抗PD-L1抗體或其片段結合相同表位的抗體。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體還包含人或鼠恆定區。在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE形式的抗體。在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體包含選自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重鏈恆定區的重鏈恆定區;特別地,選自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重鏈恆定區的重鏈恆定區,更具體地IgG1或IgG4的重鏈恆定區,例如人IgG1或IgG4的重鏈恆定區。在一個實施方案中,重鏈恆定區
是人IgG1或人IgG4重鏈恆定區。在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體所包含的鼠恆定區選自IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3。
在另一個實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體分子具有例如選自κ或λ輕鏈恆定區的輕鏈恆定區、較佳地κ(例如,人κ)的輕鏈恆定區。
在又一個實施方案中,抗PD-L1抗體分子包含IgG4(例如,人IgG4)的重鏈恆定區。在一個實施方案中,人IgG4包含在根據EU編號的位置228處的置換(例如,Ser至Pro置換)。在又一個實施方案中,人IgG4在第114-115位(EU編號)被突變為AA(Armour KL1,Clark MR,Hadley AG,Williamson LM,Eur J Immunol.1999 Aug;29(8):2613-24,Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities)。在又一個實施方案中,抗PD-L1抗體分子包含IgG1(例如,人IgG1)的重鏈恆定區。在一個實施方案中,人IgG1包含在根據EU編號的位置297處的置換(例如,Asn至Ala置換)。在一個實施方案中,人IgG1包括在根據EU編號的位置265處的置換、在根據EU編號的位置329處的置換或這兩種置換(例如,在根據EU編號的位置265處的Asp至Ala置換和/或在根據EU編號的位置329處的Pro至Ala置換)。在一個實施方案中,人IgG1包括在根據EU編號的位置234處的置換、在根據EU編號的位置235處的置換或這兩種置換(例如,在根據EU編號的位置234處的Leu
至Ala置換和/或在根據EU編號的位置235處的Leu至Ala置換)。在一個實施方案中,重鏈恆定區包含SEQ ID NO:64、65或66所示的胺基酸序列,或與之具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列,或由該序列組成。
在又一個實施方案中,抗PD-L1抗體分子包含κ輕鏈恆定區,例如,人κ輕鏈恆定區。在一個實施方案中,輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:67的胺基酸序列,或與之具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列,或由該序列組成。
在一個實施方案中,抗PD-L1抗體分子包括IgG1的重鏈恆定區(例如,人IgG1的重鏈恆定區)和κ輕鏈恆定區(例如,人κ輕鏈恆定區)。在一個實施方案中,人IgG1包含在根據EU編號的位置297處的置換(例如,Asn至Ala置換)。在一些實施方案中,人IgG1重鏈恆定區包含SEQ ID NO:64或65所示的胺基酸序列,或與之具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列,或由該序列組成。在一個實施方案中,人κ輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:67的胺基酸序列,或與之具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列,或由該序列組成。
在另一個實施方案中,抗PD-L1抗體分子包IgG4的重鏈恆定區(例如,人IgG4重鏈恆定區)和κ輕鏈恆定區(例
如,人κ輕鏈恆定區)。在一個實施方案中,恆定區是突變的IgG4,例如,突變的人IgG4(例如,具有在根據EU編號的位置228處的突變(例如,S228P突變)和/或具有在第114-115位(EU編號)突變為AA的突變)。在一些實施方案中,人IgG4重鏈恆定區包含SEQ ID NO:66所示的胺基酸序列,或與之具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列,或由所述序列組成。在一個實施方案中,人κ輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:67的胺基酸序列,或與之具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列,或由所述序列組成。
在一個實施方案中,抗PD-L1抗體分子是分離的或重組的。
在一些實施方案中,抗PD-L1抗體是單株抗體或具有單特異性的抗體。抗PD-L1抗體分子也可以是人源化的、嵌合的、人的抗體分子。在一些實施方案中,抗PD-L1抗體是嵌合抗體。在一些實施方案中,抗PD-L1抗體是人源化抗體。在一些實施方案中,抗PD-L1抗體是人抗體。在一些實施方案中,至少部分的抗PD-L1抗體的框架序列是人共有框架序列。在一個實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體還涵蓋其抗體片段,較佳地選自以下的抗體片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)或(Fab’)2、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。
在某些實施方案中,抗PD-L1抗體分子處於雙特異性
或多特異性抗體分子形式。在一個實施方案中,雙特異性抗體分子具有針對PD-L1的第一結合特異性和針對LAG-3的第二結合特異性。在一個實施方案中,雙特異性抗體分子與PD-L1和LAG-3結合。多特異性抗體分子可以具有任何針對PD-L1與其他靶標的結合特異性的組合。
在一方面,本發明提供了編碼以上任何抗PD-L1抗體或其片段的核酸。在一個實施方案中,提供包含該核酸的載體。在一個實施方案中,載體是表達載體。在一個實施方案中,提供包含該核酸或所述載體的宿主細胞。在一個實施方案中,宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中,宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。在另一個實施方案中,宿主細胞是原核的,例如大腸桿菌細胞。
在一個實施方案中,本發明提供製備抗PD-L1抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)的方法,其中該方法包含在適於表達編碼該抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)的核酸的條件下培養該宿主細胞,以及視需要地分離所述抗體或其片段(較佳地抗原結合片段)。在某個實施方案中,該方法還包括從宿主細胞回收抗PD-L1抗體或其片段(較佳地抗原結合片段)。
在一些實施方案中,本發明提供了免疫綴合物,其包含本文中提供的任何抗PD-L1抗體和其它物質,例如細胞毒性劑或標記物。在一些實施方案中,該免疫綴合物用於
預防或治療腫瘤(例如癌症)或感染性疾病。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地,腫瘤是胃腸道腫瘤(例如癌症),例如結腸癌。較佳地,感染性疾病是慢性感染。
在一些實施方案中,本發明提供包含本文所述的任何抗PD-L1抗體或其片段(較佳地其抗原結合片段)或其免疫綴合物的組合物,較佳地組合物為醫藥組成物。在一個實施方案中,該組成物還包含藥用輔料。在一個實施方案中,組合物,例如,醫藥組成物,包含本發明的抗PD-L1抗體或其片段或其免疫綴合物,以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑))的組合。
在一些實施方案中,該醫藥組成物用於預防或治療腫瘤(例如癌症)或感染。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地,腫瘤是胃腸道腫瘤(例如癌症),例如結腸癌。較佳地,感染性疾病是慢性感染。在另一方面中,本發明涉及預防或治療受試者或個體腫瘤(例如癌症)或感染性疾病的方法,該方法包括向所述受試者施用有效量的本文所述的任何抗PD-L1抗體或其片段、醫藥組成物或免疫綴合物。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一個實施方案中,腫瘤是胃腸道腫瘤(例如癌症),例如結腸癌。在一個實施方案中,感染性疾病是慢性感染。在另一方面,本發明還涉及本文所述的任何抗PD-L1抗體或其片段製備用於在受試者中治療腫瘤(例如癌症)或感染的藥
物的用途。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。在一個實施方案中,腫瘤是胃腸道腫瘤(例如癌症),例如結腸癌。在一個實施方案中,感染性疾病是慢性感染。
在進一步的一些實施方案中,在本文所述的預防或治療方法中,還包括向該受試者或個體施用一種或多種療法(例如治療方式和/或其它治療劑)。在一些實施方案中,治療方式包括手術治療和/或放射療法。在一些實施方案中,其它治療劑選自化療劑、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、其它抗體或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑)。
在一些實施方案中,受試者或個體是非人動物,例如哺乳動物,較佳地人。
在一方面中,本發明涉及檢測樣品中PD-L1的方法,該方法包括(a)將樣品與本文所述的任何抗PD-L1抗體或其片段接觸;和(b)檢測抗PD-L1抗體或其片段和PD-L1間的複合物的形成。在一個實施方案中,抗PD-L1抗體是被可檢測地標記的。
在一些實施方案中,本發明涉及試劑盒或製品,其包含本文所述的任何抗PD-L1抗體或其片段。在一些實施方案中,該試劑盒或製品包含本文所述的抗PD-L1抗體或其片段與視需要的藥用輔料。在一些實施方案中,該試劑盒或製品進一步包含關於施用藥物來治療腫瘤或感染的說明書。
本發明還涵蓋本文所述的任何實施方案的任意組合。
本文所述的任何實施方案或其任何組合適用於本文所述的發明的任何和所有抗PD-L1抗體或其片段、方法和用途。
第1圖顯示了FACS檢測的本發明抗PD-L1抗體和CHO-PDL1細胞的結合情況。
第2圖顯示了用FACS檢測的本發明抗PD-L1抗體和CHO-PDL1細胞的結合情況。
第3圖顯示了用MOA法檢測的本發明抗體對PD-1/PD-L1相互作用的阻斷活性。
第4A圖和第4B圖顯示了用MLR實驗檢測的本發明抗體對T細胞的激活作用(IL-2相對表達量)。
第5A圖和第5B圖顯示了用MLR實驗檢測的本發明抗體對T細胞的激活作用(IFN-γ相對表達量)。
第6顯示了本發明抗體對腫瘤的抑制作用。
第7圖顯示了本發明抗體與抗LAG-3抗體聯合對腫瘤的抑制作用。
在下文詳細描述本發明前,應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑,因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案,而並不意圖限制本發明的範圍,其僅會由所附申請專利範圍限制。除非另外定義,本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域中普通技術人員通常的理解具有相同的含義。
為了解釋本說明書,將使用以下定義,並且只要適當,以單數形式使用的術語也可以包括複數,並且反之亦然。要理解,本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案,並且不意欲是限制性的。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
“親和力”是指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明,在用於本文時,“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可用平衡解離常數(KD)來表述。親和力可藉由本領域知道的常用方法來測量,包括現有技術已知以及本文中所描述的那些。
如本文所用的術語“程序性細胞死亡1配體1”、“PD-L1”、“程序性死亡配體1”、“分化簇274”、“CD274”
或“B7同系物1”是指來自任何脊椎動物來源的任何天然PD-L1,該任何脊椎動物來源包括哺乳動物,諸如靈長類(例如,人)和齧齒類(例如,小鼠和大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-L1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。該術語還涵蓋天然存在的PD-L1的變體,例如剪接變體或等位基因變體。PD-L1的基本結構包括4個結構域:胞外Ig樣V型結構域和Ig樣C2型結構域、跨膜結構域以及細胞質結構域。可在NCBI Gene ID No.29126下找到關於人PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的另外信息。可在NCBI Gene ID No.60533下找到關於小鼠PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的另外信息。示例性全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可例如在NCBI登錄號NP_001254653或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到,而可例如在NCBI登錄號NP_068693或Uniprot登錄號Q9EP73下找到示例性全長小鼠PD-L1蛋白序列。
本文所用的術語“抗PD-L1抗體”、“抗PD-L1”、“PD-L1抗體”或“結合PD-L1的抗體”是指這樣的抗體,該抗體能夠以足夠的親和力結合PD-L1蛋白或其片段。在一個實施方案中,抗PD-L1抗體與非PD-L1蛋白結合的程度低於所述抗體與PD-L1結合的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%或以上,如例如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物光干涉測定法或MSD測定法測量的。
如本文所用,“單株抗體”或“mAb”或”Mab”指來源於例如真核生物的、原核生物的或噬菌體選殖的單一套數或純株的抗體,而不指其產生的方法。單株抗體或其抗原結合片段可以例如藉由融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術例如CDR接枝、或此類或其它本領域已知的技術的組合來產生。
“天然抗體”指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異四聚糖蛋白,由以二硫化物鍵合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端,每條重鏈具有一個可變區(VH),又稱作可變重域或重鏈可變域,接著是三個恆定域(CH1,CH2,和CH3)。類似地,從N至C端,每條輕鏈具有一個可變區(VL),又稱作可變輕域或輕鏈可變域,接著是一個恆定輕(CL)域。根據其恆定域胺基酸序列,抗體輕鏈可歸入兩種類型中的一種,稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。“天然序列Fc區”包含與在自然界中找到的Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。天然序列人Fc區包括天然序列人IgG1 Fc區(非A和A同種異型);天然序列人IgG2 Fc區;天然序列人IgG3 Fc區;和天然序列人IgG4 Fc區;及其天然存在變體。
“抗體片段”指與完整抗體不同的分子,其包含完整抗體的一部分且結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限於Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2;雙抗體;線性抗體;單鏈抗體(例如scFv);單結構域抗體;雙價或雙特異性抗體或其片段;駱駝科抗體;和由抗體片段
形成的雙特異性抗體或多特異性抗體。
如本文所用,術語“表位”指抗原(例如,人PD-L1)中與抗體分子特異性相互作用的部分。這部分(本文中稱作表位決定簇)一般包含元件如胺基酸側鏈或糖側鏈或是其組成部分。表位決定簇可以用本領域已知的或本文公開的方法(例如,藉由結晶學或藉由氫-氘交換法)限定。抗體分子上與表位決定簇特異性相互作用的至少一個或某些部分一般位於CDR內。通常,表位具有特定的三維結構特徵。通常,表位具有特定電荷特徵。一些表位是線性表位,而另一些是構象表位。
與參照抗體“結合相同或重疊表位的抗體”是指這樣的抗體,其在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該參照抗體與其抗原的結合,反言之,參照抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。
與參照抗體競爭結合其抗原的抗體是指這樣的抗體,其在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該參照抗體與其抗原的結合。反言之,參照抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗體是否與另一種競爭,這些測定例如:固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等,1983,Methods in Enzymology 9:242-253)。
抑制(例如競爭性抑制)參照抗體與其抗原的結合的抗體是指這樣的抗體,其抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該參照抗體與其抗原的結合。反言之,參照抗體抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。抗體與其抗原的結合可以親和力(例如平衡解離常數)衡量。測定親和力的方法是本領域已知的。
與參照抗體顯示相同或相似的結合親和力和/或特異性的抗體是指這樣的抗體,其能夠具有參照抗體的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合親和力和/或特異性。這可以藉由本領域已知的任何測定結合親和力和/或特異性的方法進行測定。
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3,從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3,而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中,各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定,該指派系統包括例如:基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883,Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the
canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997)),基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath),Contact(University College London),國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上),以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。
例如,根據不同的CDR確定方案,每一個CDR的殘基如下所述。
CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。
除非另有說明,否則在本發明中,術語“CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。
除非另有說明,否則在本發明中,當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時,是指根據Kabat編號系統(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。
在一個實施方案中,本發明抗體的CDR藉由Chothia規則或Kabat規則確定邊界,例如其序列如表1所示。
應該注意,基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此,在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時,該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體,其可變區序列包含該具體CDR序列,但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。
具有不同特異性(即,針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR(在同一指派系統下)。然而,儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的,但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,
AbM、Contact和North方法中的至少兩種,可以確定最小重疊區域,從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭,藉由抗體的結構和蛋白折疊,可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此,本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如,在一個CDR的變體中,最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變,而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。
本領域已知五個主要類別的抗體:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,並且這些抗體中的數個可以進一步被劃分為亞類(同種型),例如,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別被稱為α,δ,ε,γ和μ。
“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬於的IgG形式。所有同一型的抗體的重鏈恆定區都是相同的,不同型的抗體之間的重鏈恆定區不同。例如,IgG1形式的抗體是指其重鏈恆定區Ig結構域為IgG1的Ig結構域。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”指其中結合到某些細胞毒性細胞(例如NK細胞,嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型免疫球蛋白使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞,隨後用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。介導ADCC的主要細胞,NK細胞,只表達FcγRIII,而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和
Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性,可進行體外ADCC測定法,諸如美國專利No.5,500,362或5,821,337或美國專利No.6,737,056(Presta)中所記載的。可用於此類測定法的效應細胞包括PBMC和NK細胞。可選地/另外地,可在體內評估目的分子的ADCC活性,例如在動物模型中,諸如Clynes等人,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。
術語“細胞毒性劑”或“細胞毒性因子”用在本發明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑例子參見WO2015/153513、WO2016/028672、WO2015/138920、WO2016/007235中所公開的那些。
本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療腫瘤(例如癌症)和感染(例如慢性感染)中有效的任何物質,包括化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑或免疫調節劑,例如WO2016/007235或WO2010/077634或US60/696426中所公開的可以與抗PD-L1抗體聯合使用的任何物質。
“化療劑”包括在治療癌症中有用的化學化合物。化療劑的例子參見WO2016/007235、WO2010/077634、US60/696426或WO2016/061142、US61/264061或WO2016/007235中所公開的那些。
術語“細胞因子”是由一種細胞群釋放,作為細胞間介質作用於另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子
有淋巴因子,單核因子;白介素(IL),諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15;腫瘤壞死因子,諸如TNF-α或TNF-β;及其它多肽因子,包括LIF和kit配體(KL)和γ-干擾素。如本文中使用的,術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物,包括藉由人工合成產生的小分子實體,及其藥劑學可接受的衍生物和鹽。
術語“共刺激分子”指T細胞上與共刺激配體特異性結合,因而由T細胞介導共刺激反應(如但不限於增殖)的相關結合配偶體。共刺激分子是高效免疫應答要求的除抗原受體或其配體之外的細胞表面分子。共刺激分子包括但不限於:MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞因子受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞的活化分子(SLAM蛋白)、NK細胞活化受體、BTLA、Toll配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、
LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和與CD83特異性結合的配體。
術語“激活劑”或“激動劑”包括使所提供的分子(例如,共刺激分子)的某些參數(例如,活性)增加的物質。例如,這個術語包括使得所提供的分子增加至少5%、10%、25%、50%、75%或更多的活性(例如,共刺激活性)的物質。
術語“免疫檢查點分子”意指在CD4 T細胞和CD8 T細胞的細胞表面上的一組分子。這些分子可以有效地充當下調或抑制抗腫瘤免疫應答的“刹車”。免疫檢查點分子包括但不限於程序性死亡1(PD-1)、細胞毒T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)、B7H1、B7H4、OX-40、CD137、CD40和LAG-3,它們直接抑制免疫細胞。
術語“抑制劑”或“拮抗劑”包括使得所提供的分子(例如,免疫檢查點抑制蛋白)的某些參數(例如,活性)降低的物質。例如,這個術語包括使得所提供的分子抑制至少5%、10%、20%、30%、40%或更多的活性(例如,LAG-3活性)的物質。因此,抑制作用不必是100%。
術語“雙抗體”指具有兩個抗原結合位點的抗體片段,該片段在相同的多肽鏈(VH-VL)中包含與輕鏈可變結構域
(VL)連接的重鏈可變結構域(VH)。藉由使用因為太短而不能在相同鏈上的兩個結構域之間配對的接頭,迫使該結構域與另一條鏈的互補結構域配對從而產生兩個抗原結合位點。雙抗體可以是二價的或雙特異性的。雙抗體更充分地描述於例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003);和Hollinger等,美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6444-6448(1993)中。三抗體和四抗體同樣描述於Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
“功能性Fc區”擁有天然序列Fc區的“效應器功能”。例示性的“效應器功能”包括C1q結合;CDC;Fc受體結合;ADCC;吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體;BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)聯合,而且可以使用多種測定法來評估,例如本文所公開的那些。
“效應子功能”指那些可歸於抗體Fc區且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應子功能的實例包括:C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結合;抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用;細胞表面受體(例如B細胞受體)下調;和B細胞活化。
“人效應細胞”指表達一種或多種FcR並行使效應器功能的白細胞。在某些實施方案中,該細胞至少表達FcγRIII並行使ADCC效應器功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC),天然殺傷(NK)細胞,單核
細胞,細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞。效應細胞可以從其天然來源分離,例如血液。
術語“有效量”指本發明的抗體或片段或綴合物或組合物的這樣的量或劑量,其以單一或多次劑量施用患者後,在需要治療或預防的患者中產生預期效果。有效量可以由作為本領域技術人員的主治醫師藉由考慮以下多種因素來容易地確定:諸如哺乳動物的物種;它的大小、年齡和一般健康;涉及的具體疾病;疾病的程度或嚴重性;個體患者的應答;施用的具體抗體;施用模式;施用製劑的生物利用率特徵;選擇的給藥方案;和任何伴隨療法的使用。
“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段,有效實現所需治療結果的量。抗體或抗體片段或其綴合物或組合物的治療有效量可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量和抗體或抗體部分在個體中激發所需反應的能力而變動。治療有效量也是這樣的一個量,其中抗體或抗體片段或其綴合物或組合物的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的對象,“治療有效量”較佳地抑制可度量參數(例如腫瘤生長率)至少約20%、更佳地至少約40%、甚至更佳地至少約50%、60%或70%和仍更佳地至少約80%或90%。可以在預示人腫瘤中的功效的動物模型系統中評價化合物抑制可度量參數(例如,癌症)的能力。可選地,可以藉由檢驗化合物抑制的能力評價組合物的這種特性,所述抑制在體外藉由熟練技術人員已知的測定法。
“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段,有效實現所需預防結果的量。通常,由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用,故預防有效量將小於治療有效量。
適用於本發明的“抗體及其抗原結合片段”包括但不限於多株、單株、單價、雙特異性、異綴合物、多特異性、重組、異源、異源雜合、嵌合、人源化(特別是接枝有CDR的)、去免疫的、或人的抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、由Fab表達庫產生的片段、Fd、Fv、二硫化物連接的Fv(dsFv)、單鏈抗體(例如scFv)、雙抗體或四抗體(Holliger P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14),6444-6448)、奈米抗體(nanobody)(也稱為單結構域抗體)、抗獨特型(抗Id)抗體(包括例如針對本發明抗體的抗Id抗體)和上述任一種的表位結合片段。
“Fab”片段包括重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域,並且還包括輕鏈的恆定結構域以及重鏈的第一恆定結構域(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1結構域的羧基末端增加了一些殘基(包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸)而與Fab片段不同。Fab’-SH是對其中恆定結構域的半胱胺酸殘基攜帶一個游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab’)2抗體片段最初是作為成對Fab’片段生成的,在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段的其它化學偶聯也是已知的。
術語“Fc區”在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域,該區域包含至少一部分的恆定區。該術語包括天然
序列Fc區和變體Fc區。在某些實施方案中,人IgG重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羰基端。然而,Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外說明,Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統,其也被稱為EU索引,如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
術語“可變區”或“可變結構域”是指參與抗體與抗原結合的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域通常具有相似的結構,其中每個結構域包含四個保守的框架區(FR)和三個互補決定區(CDR)。(參見,例如,Kindt等Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.91頁(2007))。單個VH或VL結構域可以足以給予抗原結合特異性。此外,可以使用來自與特定抗原結合的抗體的VH或VL結構域來分離結合該抗原的抗體,以分別篩選互補VL或VH結構域的文庫。參見,例如,Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。
“框架”或“F R”是指除互補決定區CDR殘基之外的可變結構域殘基。可變結構域的FR通常由四個FR結構域組成:FR1,FR2,FR3和FR4。因此,CDR和FR序列通常出現在重鏈可變結構域(VH)(或輕鏈可變結構域(VL))的以下序列中:
FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
除非另有說明,抗體各個結構域中的殘基的編號根據EU編號系統,其也被稱為EU索引,如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
術語“全長抗體”、“完整的抗體”和“完整抗體”在本文被可交換地用於指結構與天然抗體結構基本相似或具有包含如本文所定義的Fc區的重鏈的抗體。
“Fv”是包含完整抗原結合位點的最小抗體片段。在一個實施方案中,雙鏈Fv種類由一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域以緊密的,非共價締合的二聚體組成。在單鏈Fv(scFv)種類中,一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域可以藉由柔性肽接頭共價連接從而使輕鏈和重鏈可以以類似於雙鏈Fv種類的“二聚體”結構締合。在這種構型中,正是每個可變結構域的三個CDR作用來限定了VH-VL二聚體的表面上的抗原結合位點。總而言之,六個CDR將抗原結合特異性賦予抗體。然而,即使是單個可變結構域(或只包含對抗原特異的三個CDR的一半Fv)也具有識別和結合抗原的能力,儘管親和性低於完整結合位點。關於scFv的綜述參見例如Pluckthun於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,卷113,Rosenburg和Moore編輯,(Springer-Verlag,New York,1994),第269-315頁
中。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可交換地使用且是指其中引入外源核酸的細胞,包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”,其包括初級轉化的細胞和來源於其的後代,而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親本細胞不完全相同,而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。
“人抗體”指具有這樣的胺基酸序列的抗體,所述胺基酸序列對應於下述抗體的胺基酸序列,所述抗體由人或人細胞生成或來源於非人來源,其利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
“人共有框架”是指這樣的框架,即在選擇人免疫球蛋白VL或VH框架序列中,其代表最常出現的胺基酸殘基。一般而言,對人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇是從可變結構域序列的亞型中選擇。一般而言,該序列的亞型是如Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),1-3卷)中公開的亞型。在一個實施方案中,對於VL,該亞型是如Kabat等(見上文)中的亞型κI。在一個實施方案中,對於VH,該亞型是如Kabat等(見上文)中的亞型III。
“人源化”抗體是指包含來自非人CDR的胺基酸殘基
和來自人FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在一些實施方案中,人源化抗體將包含基本上所有的至少一個、通常兩個可變結構域,其中所有或基本上所有的CDR(例如,CDR)對應於非人抗體的那些,並且所有或基本上所有的FR對應於人抗體的那些。人源化抗體視需要可以包含至少一部分的來源於人抗體的抗體恆定區。抗體(例如非人抗體)的“人源化形式”是指已經進行了人源化的抗體。
術語“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。癌症的例子包括但不限於癌,淋巴瘤,母細胞瘤,肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更具體例子包括但不限於鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌),肺癌(包括小細胞肺癌,非小細胞肺癌,肺的腺癌,和肺的鱗癌),腹膜癌,肝細胞癌,胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌),胰腺癌,成膠質細胞瘤,宮頸癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,尿道癌,肝瘤,乳腺癌,結腸癌,直腸癌,結腸直腸癌,子宮內膜癌或子宮癌,唾液腺癌,腎癌,前列腺癌,外陰癌,甲狀腺癌,肝癌,肛門癌,陰莖癌,黑素瘤,淺表擴散性黑素瘤,惡性雀斑樣痣黑素瘤,肢端黑素瘤,結節性黑素瘤,多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤,慢性淋巴細胞性白血病(CLL),急性成淋巴細胞性白血病(ALL),毛細胞性白血病,慢性成髓細胞性白血病,和移植後淋巴增殖性病症(PTLD),以及與瘢痣病(phakomatoses),水腫(諸如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖,腦瘤和腦癌,以及頭
頸癌,及相關轉移。在某些實施方案中,適合於藉由本發明的抗體來治療的癌症包括非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、神經膠質瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、白血病和頭頸癌,包括那些癌症的轉移性形式。
術語“細胞增殖性病症”和“增殖性病症”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。在一個實施方案中,細胞增殖性病症指癌症。
術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖,無論是惡性的還是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”,“癌性”,“細胞增殖性病症”,“增殖性病症”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。
術語“感染性疾病”是指病原體引發的疾病,包括例如病毒感染、細菌感染、真菌感染或者原生動物例如寄生蟲感染。
術語“腫瘤免疫逃逸”是指腫瘤逃避免疫識別和清除。因此,作為治療概念,當所述逃避減弱時,腫瘤免疫得到“治療”,腫瘤被免疫系統識別並攻擊。腫瘤識別的實例包括腫瘤結合、腫瘤收縮和腫瘤清楚。
術語“慢性感染”是指這樣的感染,其中傳染原(例如,病原體如病毒、細菌、原生動物例如寄生蟲、真菌或諸如此類)已經在感染的宿主中誘導了免疫應答,但尚未如在
急性感染過程中一樣被從宿主中清除或消除。慢性感染可以是持續性的、潛伏性的或緩慢的。儘管急性感染通常被免疫系統在數天或數週(如流感)內解決,持續性的感染可以相對低的水平持續數月、數年、數十年或一生(例如,乙型肝炎)。相比之下,潛伏性的感染的特徵是長期的無症狀活動,被一段時間的迅速增加的高度感染和升高的病原體水平不時打斷(例如單純皰疹)。最後,緩慢感染的特徵是疾病症狀的逐漸和連續增加,諸如長期的潛伏期,隨後在臨床症狀出現後是延長的和進展的臨床過程開始。不像潛伏性的和持續性的感染,慢性感染可以不以病毒增殖的急性期開始(例如,小RNA病毒感染(picornaviruses infection)、綿羊髓鞘脫落病毒(visna virus)、瘙癢病(scrapie)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease))。能夠誘導慢性感染的示例性傳染原包括病毒(例如,巨細胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒I型和II型、人免疫缺陷病毒1型和2型,人乳頭狀瘤病毒、人T淋巴細胞病毒1型和2型,水痘-帶狀皰疹病毒等等),細菌(例如,結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis),李斯特菌屬物種(Listeria spp.),肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae),肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),疏螺旋體屬物種(Borrelia spp.),幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)等等),原生動物例如寄生蟲(例如,利什曼原蟲屬物種(Leishmaniaspp.),惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum),
血吸蟲屬物種(Schistosoma spp.),弓形蟲屬物種(Toxoplasma spp.),錐蟲屬物種(Trypanosoma spp.),Taenia carssiceps等等),和真菌(例如,麯黴屬物種(Aspergillus spp.),白色念珠菌(Candida albicans),粗球孢子菌(Coccidioides immitis),夾膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum),卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)等等)。另外的傳染原包括朊病毒或錯誤折疊的蛋白質,其藉由在這些組織中進一步傳播蛋白錯誤折疊影響腦或神經元結構,導致形成澱粉樣蛋白斑(其導致細胞死亡、組織損傷和最終死亡)。由朊病毒感染導致的疾病的實例包括:克雅氏病及其變種(Creutzfeldt-Jakob disease and its varieties),Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome(GSS),致命性家族性失眠症(sFI)(fatal familial insomnia(sFI)),庫魯病(kuru),瘙癢病(scrapie),牛的牛海綿狀腦病(BSE)(又名“狂牛”病)(Bovine spongiformencephalopathy(BSE)in cattle(aka“mad cow”disease)),以及其他各種動物形式的腦病[例如,傳染性水貂腦病(TME)(transmissible mink encephalopathy(TME)),白尾鹿(white-tailed deer)、麇鹿(elk)和騾鹿(mule deer)中慢性消耗性疾病(chronicwasting disease(CWD)),貓海綿狀腦病(feline spongiform encephalopathy),尼牙藪羚(nyala)、羚羊(oryx)和更大角羚(greater kudu)中的外來有蹄類腦病(EUE)(exoticungulate encephalopathy(EUE),鴕鳥的海綿狀腦病(spongiform encephalopathy of theostrich)]。
“免疫綴合物”是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。
本文所使用的術語“標記”是指被直接或間接綴合或融合至試劑(諸如多核苷酸探針或抗體)並且促進其所綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組合物。標記本身可以是可檢測的(例如,放射性同位素標記或螢光標記)或在酶促標記的情況下可以催化可檢測的受質化合物或組合物的化學改變。術語旨在涵蓋藉由將可檢測物質偶聯(即,物理連接)至探針或抗體來直接標記探針或抗體以及藉由與直接標記的另一種試劑反應來間接標記探針或抗體。間接標記的實例包括使用螢光標記的二級抗體進行的一級抗體的檢測和具有生物素的DNA探針的末端標記,使得其可以用螢光標記的鏈黴抗生素蛋白來檢測。
“個體”或“受試者”包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於,家養動物(例如,牛,羊,貓,狗和馬),靈長類動物(例如,人和非人靈長類動物如猴),兔,以及齧齒類動物(例如,小鼠和大鼠)。在一些實施方案中,個體或受試者是人。
“分離的”抗體是這樣的抗體,其已經與其天然環境的組分分離。在一些實施方案中,將抗體純化至超過95%或99%純度,如藉由例如電泳(例如,SDS-PAGE,等電聚焦(IEF),毛細管電泳)或層析(例如,離子交換或反相HPLC)確定的。對於用於評估抗體純度的方法的綜述,參見,例如,Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分離的”核酸是指這樣的核酸分子,其已經與其天然環境的組分分離。分離的核酸包括包含在通常包含該核酸分子的細胞中的核酸分子,但是該核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置處。
“分離的編碼抗PD-L1抗體或其片段的核酸”是指一個或多個核酸分子,其編碼抗體重鏈或輕鏈(或其片段),包括在單一載體或分開的載體中的這樣的核酸分子,以及存在於宿主細胞中的一個或多個位置處的這樣的核酸分子。
術語“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”互換使用。它們指聚合物形式的任何長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其類似物。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈,並且如果為單鏈,可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸,如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分打斷。可以在聚合後進一步修飾多核苷酸,如藉由與標記組分綴合。核酸可以是重組多核苷酸或在自然界中不存在或與另一個多核苷酸以非自然佈局連接的基因組來源、cDNA來源、半合成來源或合成來源的多核苷酸。
術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”(如果為單鏈)在本文中互換地使用並且為任意長度的胺基酸聚合物。該聚合物可以是線形或分支的,它可以包含修飾的胺基酸,並且它可以由非胺基酸隔斷。該術語也包括已經被修飾(例如,二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作,如以標記組分綴合)的胺基酸聚合物。多肽可以從天然來源
分離,可以藉由重組技術從真核或原核宿主產生並且可以是合成方法的產物。
如下進行序列之間序列同一性的計算。
為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分數,將該序列出於最佳比較目的比對(例如,可以為了最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入間隙或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。在一個較佳實施方案中,為比較目的,所比對的參考序列的長度是至少30%、較佳地至少40%、更佳地至少50%、60%和甚至更佳地至少70%、80%、90%、100%的參考序列長度。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時,則該分子在這個位置處是相同的。
可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。在一個較佳實施方案中,使用已經集成至GCG軟體的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可獲得),使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和間隙權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6,確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。在又一個較佳的實施方案中,使用GCG軟體中的GAP程序(在http://www.gcg.com可獲得),使用NWSgapdna.CMP矩陣和間隙權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、
5或6,確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別較佳的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用間隙罰分12、間隙延伸罰分4和移碼間隙罰分5的Blossum 62評分矩陣。
還可以使用PAM120加權餘數表、間隙長度罰分12,間隙罰分4),利用已經併入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。
額外地或備選地,可以進一步使用本文所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共數據庫執行檢索,以例如鑒定其他家族成員序列或相關序列。例如,可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序執行此類檢索。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序,評分=100、字長度=12執行,以獲得與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程序、評分=50、字長度=3執行,以獲得與本發明蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了出於比較目的獲得帶間隙的比對結果,可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那樣使用間隙BLAST。當使用BLAST和間隙BLAST程序時,可以使用相應程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
如本文所用,術語“在低嚴格性、中等嚴格性、高嚴格性或極高嚴格性條件下雜交”描述了雜交和洗滌條件。進
行雜交反應的指導可以在藉由引用方式併入的Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。參考文獻中描述了含水方法和非含水方法並且可以使用任一方法。本文中提及的特異性雜交條件如下:1)低嚴格性雜交條件是在約45℃於6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中,隨後至少在50℃(對於低嚴格性條件,可以增加洗滌的溫度至55℃)於0.2X SSC,0.1% SDS中洗滌兩次;2)中等嚴格性雜交條件是在約45℃於6 X SSC中、隨後在60℃在0.2 X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次;3)高嚴格性雜交條件是在約45℃在6 X SSC中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次;並且較佳地4)極高嚴格性雜交條件是在65℃於0.5M磷酸鈉、7%SDS中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次。極高嚴格性條件(4)是較佳的條件和除非另外說明,否則應當使用的一個條件。
術語“醫藥組成物”指這樣的組成物,其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在,並且不包含對施用該組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、賦形劑、載體或穩定劑等。
用於本文時,“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進
展或嚴重性。
用於本文時,“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中,具有癌症家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常,在癌症的背景中,術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前,特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。
術語“抗感染活性劑”包括在施用濃度和給藥間隔下特異性抑制或消除微生物生長但對宿主不致命的任何分子,所述微生物諸如病毒、細菌、真菌或原生動物,例如寄生蟲。用於本文時,術語抗感染活性劑包括抗生素、抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗原生動物劑。在一個具體方面中,抗感染活性劑在施用濃度和給藥間隔對宿主是無毒的。
抗細菌的抗感染活性劑或抗菌劑可廣泛的分類為殺菌的(即,直接殺死)或抑菌的(即,阻止分裂)。抗菌的抗感染活性劑可進一步再分類為窄譜抗菌劑(即,僅影響小類細菌亞型,例如,革蘭氏陰性等)或廣譜抗菌劑(即,影響廣泛種類)。實例包括阿米卡星、慶大黴素、格爾德黴素、除莠黴素、莫匹羅星、呋喃妥因、吡嗪醯胺、奎奴普丁/達福普汀、利福平/異福醯胺或替硝唑等。
術語“抗病毒劑”包括抑制或消除病毒生長、致病和/或存活的任何物質。這包括例如阿昔洛韋、西多福韋、齊多夫定、去羥肌苷(ddI,VIDEX)、紮西他濱(ddC,HIVID)、司他夫定(d4T,ZERIT)、拉米夫定(3TC,EPIVIR))、阿巴
卡韋(ZIAGEN)、恩曲他濱(EMTRIVA)等。
術語“抗真菌劑”包括抑制或消除真菌生長、致病和/或存活的任何物質。這包括例如那他黴素、龜裂殺菌素、非律平、制黴菌素、兩性黴素B、坎底辛、綠葉刺蕊草(patchouli)、印度楝樹種子油(neem seed oil)、椰子油(Coconut Oil)等。
術語“抗原生動物劑”包括抑制或消除原生動物生物體(例如寄生蟲)生長、發病和/或存活的任何物質。抗原生動物劑的實例包括抗瘧疾試劑例如,奎寧、奎尼丁等
示例性的抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑參見例如WO2010/077634等。
抗感染活性劑還參見例如WO2014/008218、WO2016/028672、WO2015/138920或WO2016/061142。
術語“載體”當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。一些載體能夠指導與其可操作相連的核酸的表達。這樣的載體在本文中被稱為“表達載體”。
“受試者/患者樣品”指從患者或受試者得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織,像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品;血液或任何血液組分;體液,諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液;來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中
天然不與組織混雜的化合物,諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素等等。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不限於腫瘤活檢、細針吸出物、支氣管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手術標本、循環中的腫瘤細胞、血清、血漿、循環中的血漿蛋白質、腹水、衍生自腫瘤或展現出腫瘤樣特性的原代細胞培養物或細胞系,以及保存的腫瘤樣品,諸如福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。
術語“包裝插頁”用於指治療產品的商業包裝中通常包含的用法說明書,其含有關於涉及此類治療產品應用的適應症,用法,劑量,施用,聯合療法,禁忌症和/或警告的信息。
因此,在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段結合PD-L1。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段結合哺乳動物PD-L1,例如人PD-L1。例如,抗體分子與PD-L1上的表位(例如,線性或構象表位)特異性結合。在一些實施方案中,抗體分子與PD-L1的一個或多個胞外結構域結合。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段具有以下一種或多種性質:
(1)本發明的抗PD-L1抗體或其片段以高親和力結合PD-L1(例如人PD-L1),例如,以以下平衡解離常數(KD)與PD-L1結合,該KD小於大約50nM,較佳地,小於或等
於大約20M,更佳地小於或等於大約15nM,更佳地小於或等於大約10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM,最佳地,所述KD小於或等於大約1.5nM、1.4nM、1.3nM、1.2nM、1.1nM、1nM、0.9nM或0.8nM。在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體以0.1-10nM,較佳地0.5至10nM,更佳地0.6至10nM、0.7至8nM、0.7-5nM,最佳地0.5至1.5nM、0.7至1.5nM、0.7至1nM的KD結合PD-L1。在一些實施方案中,PD-L1為人PD-L1。在一些實施方案中,抗體結合親和力是使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量)測定法測定的。
(2)本發明的抗體或其片段結合表達人PD-L1的細胞,例如,以小於或等於大約4nM、3.5nM、3nM、2.9nM、2.8nM、2.7nM、2.6nM、2.5nM、2.4nM、2.3nM、2.2nM、2.1nM、2nM、1.9nM、1.8nM、1.7nM或1.6nM的EC50。在一些實施方案中,該結合用流式細胞術(例如FACS)測定。在一些實施方案中,表達人PD-L1的細胞為表達人PD-L1的CHO細胞。
(3)本發明的抗體或其片段阻斷PD-L1的相關活性,例如以小於或等於大約10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM或0.7nM的EC50,較佳以大約0.1至1nM、0.5至1nM、0.6至1nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM或1nM的EC50。在一些實施方案中,PD-L1的相關活性是PD-L1與PD-1的結合。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段在MOA測定中以小於或等於大約10nM、5nM、
4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM或0.7nM的EC50,較佳以大約0.1至1nM、0.5至1nM、0.6至1nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM或1nM的EC50抑制PD-L1與PD-1的結合。在一些實施方案中,細胞為CHO細胞。
(4)本發明的抗體或其片段提高T細胞功能,例如優於已知的抗PD-L1抗體,例如Tecentriq。
(5)本發明的抗體或其片段提高T細胞增殖,例如在MLR中,例如優於已知的抗PD-L1抗體,例如Tecentriq。
(6)本發明的抗體或其片段提高IFN-γ分泌,例如在MLR中,例如優於已知的抗PD-L1抗體,例如Tecentriq。
(7)本發明的抗體或其片段提高IL-2分泌,例如在MLR中,例如優於已知的抗PD-L1抗體,例如Tecentriq。
(8)本發明的抗體或其片段相比已知的抗PD-L1抗體(例如Tecentriq)具有更低的黏性,因此具有更好的成藥性。在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段在Zenix柱檢測法中,駐留時間(RT)低於大約10分鐘、大約9分鐘或大約8分鐘,較佳地,駐留時間在大約7分鐘至9分鐘之間,較佳地在大約7至8.5分鐘,大約7.5至8.5分鐘,大約7至8分鐘,或大約7.5至8分鐘之間,例如大約7.5分鐘、7.6分鐘、7.7分鐘、7.8分鐘、7.9分鐘、8分鐘、8.1分鐘、8.2分鐘、8.3分鐘、8.4分鐘、8.5分鐘。
(9)本發明的抗體或其片段抑制PD-L1的一種或多種活性,例如,導致以下一者或多者:腫瘤浸潤型淋巴細胞增加、T細胞受體介導的增殖增加、或癌細胞的免疫逃避
減少。
(10)本發明的抗PD-L1抗體或其片段能夠誘發抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性:(i)顯示與本發明抗體(例如表3所列的任一抗體)對PD-L1相同或相似的結合親和力和/或特異性;(ii)抑制(例如,競爭性抑制)本發明抗體(例如表3所列的任一抗體)與PD-L1的結合;(iii)與本發明抗體(例如表3所列的任一抗體)結合相同或重疊的表位;(iv)與本發明抗體(例如表3所列的任一抗體)競爭結合PD-L1;(v)具有本發明抗體(例如表3所列的任一抗體)的一個或多個生物學特性。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH),其中該VH包含(i)表B所列任一抗體的VH中所含的三個互補決定區域(CDR),或(ii)相對於(i)的序列,在該三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其抗原
結合片段包含輕鏈可變區(VL),其中該VL包含:(i)表B所列任一抗體的VL中所含的三個互補決定區域(CDR);或(ii)相對於(i)的序列,在該三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL,其中(a)該VH包含(i)表B所列任一抗體的VH中所含的三個互補決定區域(CDR),或(ii)相對於(i)的序列,在該三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的序列;和/或(b)該VL包含:(i)表B所列任一抗體的VL中所含的三個互補決定區域(CDR);或(ii)相對於(i)的序列,在該三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的序列。
在較佳的實施方案中,VH包含選自SEQ ID NO:26、27、28、29、30或31所示的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成。
在較佳的實施方案中,VL包含選自SEQ ID NO:32、
33、34、35、36或37所示的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成。
在較佳的實施方案中,本發明抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含(i)如SEQ ID NO:26或30所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:32或36所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR,或者(ii)如SEQ ID NO:27所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:33所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR,或者(iii)如SEQ ID NO:28所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:34所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR,或者(iv)如SEQ ID NO:29或31所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及如SEQ ID NO:35或37所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL),其中(i)該VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3,其中HCDR1包含選自SEQ ID NO:1、2、3或4的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,或者HCDR1包含與選自SEQ ID NO:1、2、3或4的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列;HCDR2包含選自SEQ ID NO:5、6、7、8
或9的胺基酸序列,或由所述胺基酸序列組成,或者HCDR2包含與選自SEQ ID NO:5、6、7、8或9的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列;HCDR3包含選自SEQ ID NO:10、11、12或13的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,或者HCDR3包含與選自SEQ ID NO:10、11、12或13的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列;和/或(ii)其中該VL包含互補決定區域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中LCDR1包含選自SEQ ID NO:14、15或16的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,或者LCDR1包含與選自SEQ ID NO:14、15或16的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列;LCDR2包含選自SEQ ID NO:17、18、19或20的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成,或者LCDR2包含與選自SEQ ID NO:17、18、19或20的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列;LCDR3包含選自SEQ ID NO:21、22、23、24或25的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成,或者LCDR3包含與選自SEQ ID NO:21、22、23、24或25的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)的胺基酸序列。
在較佳的實施方案中,本發明提供抗PD-L1抗體或其
抗原結合片段,其包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL),其中(a)該VH包含(i)表A所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的組合;或(ii)(i)的HCDR組合的變體,該變體在該三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換);和/或(ii)該VL包含(i)表A所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合;或者(ii)(i)的LCDR組合的變體,該變體在該三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換,較佳保守置換)。
在較佳的實施方案中,本發明提供抗PD-L1抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL),其中該VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3並且該VL包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中該抗體或其抗原結合片段所包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合如下表(表A)所示:
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和/或輕鏈可變區VL,其中,
(a)重鏈可變區VH
(i)包含與選自SEQ ID NO:26、27、28、29、30或31的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成;或者
(ii)包含選自SEQ ID NO:26、27、28、29、30或31的胺基酸序列或由其組成;或者(iii)包含與選自SEQ ID NO:26、27、28、29、30或31的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列,較佳地,該胺基酸改變不發生在CDR區中;和/或
(b)輕鏈可變區VL
(i)包含與選自SEQ ID NO:32、33、34、35、36或37的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成;(ii)包含選自SEQ ID NO:32、33、34、35、36或37的胺基酸序列或由其組成;或者(iii)包含與選自SEQ ID NO:32、33、34、35、36或37的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列,較佳地,該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在較佳的實施方案中,本發明提供抗PD-L1抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL),其中該抗體或其抗原結合片段所包含的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的組合如下表(表B)所示:
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含重鏈和/或輕鏈,其中
(a)重鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO:38、39、40、41、42、43、44或45的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成;(ii)包含選自SEQ ID NO:38、39、40、41、42、43、44或45的胺基酸序列或由其組成;或者(iii)包含與選自SEQ ID NO:38、39、40、41、42、43、44或45的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸
改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列,較佳地,所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中,更佳地,該胺基酸改變不發生在重鏈可變區中;和/或
(b)輕鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO:46、47、48、49、50或51的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成;(ii)包含選自SEQ ID NO:46、47、48、49、50或51的胺基酸序列或由其組成;或者(iii)包含與選自SEQ ID NO:46、47、48、49、50或51的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列,較佳地,該胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中,更佳地,該胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中。
在一些實施方案中,本發明抗PD-L1抗體或其片段的重鏈和/或輕鏈還包含信號肽序列,例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:68)。
在本發明的一個實施方案中,本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。較佳的,本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換,較佳地保守置換。
在較佳的實施方案中,本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地,本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。
視需要地,本發明的抗PD-L1抗體包括對輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈或重鏈的翻譯後修飾。示例性的翻譯後修飾包括二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作,如以標記組分綴合。
在一些實施方案中,置換為保守性置換。保守置換是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸置換,例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸置換,一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸置換,或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸置換。示例性的置換如下表D所示:
在某些實施方案中,本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。
舉例而言,可實施一或多種胺基酸置換以消除一或多個可變區框架糖基化位點,由此消除該位點處的糖基化。
這類無糖基化可增加抗體對抗原的親和力。例如參見美國專利第5,714,350號及第6,350,861號。可製備具有改變類型的糖基化的抗體,例如具有減小量的岩藻糖基殘基的低岩藻糖化抗體或具有增加的等分GlcNac結構的抗體。這類改變的糖基化模式已顯示可增加抗體的ADCC能力。可藉由例如在具有改變的糖基化體系的宿主細胞中表達抗體來實現這類糖類修飾。具有改變的糖基化體系的細胞已在本領域中闡述,且可用作為在其中表達本發明的抗體以由此產生具有改變的糖基化的抗體的宿主細胞。舉例而言,細胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基轉移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基轉移酶),從而在Ms704、Ms705及Ms709細胞系中表達的抗體在其糖類上缺乏岩藻糖。藉由使用兩種代替載體靶向破壞CHO/DG44細胞中的FUT8基因來創建Ms704、Ms705及Ms709FUT8-/-細胞系(參見美國專利公開20040110704號及Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。EP 1,176,195描述了具有功能受破壞的編碼岩藻糖基轉移酶的FUT8基因的細胞系,從而在這類細胞系中表達的抗體藉由減少或消除α-1,6鍵相關酶來展現低岩藻糖化。EP 1,176,195還描述了具有向結合抗體Fc區的N-乙醯葡糖胺添加岩藻糖的低酶活性或不具有該酶活性的細胞系,例如大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。PCT公開文本WO 03/035835描述了一種變體CHO細胞系Lec13細胞,其中使岩藻糖附接至Asn(297)-連接的糖類的能力降低,從而亦導致在該
宿主細胞中表達的抗體的低岩藻糖化(亦參見Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。具有經修飾的糖基化概況的抗體亦可產生於雞蛋中,如PCT公開文本WO 06/089231中所闡述。備選地,具有經修飾的糖基化概況的抗體可產生於植物細胞(例如青萍(Lemna))中。在植物系統中產生抗體的方法公開在對應於Alston及Bird LLP代理檔案號:040989/314911的2006年8月11日提出申請的美國專利申請案中。PCT公開文本WO 99/54342描述了經工程化以表達糖蛋白修飾糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))的細胞系,從而在該工程化細胞系中表達的抗體展現增加的等分GlcNac結構,其導致增加的抗體的ADCC活性(亦參見Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。備選地,可使用岩藻糖苷酶切除抗體的岩藻糖殘基;舉例而言,岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體去除岩藻糖基殘基(Tarentino等人(1975)Biochem.14:5516-23)。
在本發明的一個實施方案中,本發明所述抗體或片段用經工程改造的酵母N-連接的聚糖或CHO N-連接的聚糖糖基化。
本發明所涵蓋的另一種對本文所述抗體或其片段的修飾是聚乙二醇化(pegylation)。可對抗體實施聚乙二醇化以例如增加抗體的生物(例如血清)半衰期。為將抗體聚乙二醇化,通常使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反應性酯或醛衍生物)在其中一或多個PEG基團變得附
接至抗體或抗體片段的條件下發生反應。較佳地,經由使用反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)進行醯化反應或烷基化反應來實施聚乙二醇化。如本文中所使用,術語“聚乙二醇”意圖涵蓋已用於衍生化其他蛋白質的PEG的任一形式,例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施方案中,要聚乙二醇化的抗體是無糖基化抗體。本領域中已知使蛋白質聚乙二醇化的方法且可將其應用於本發明的抗體,例如參見EP 0154316及EP 0401384。
在某些實施方案中,可在本文中所提供抗體的Fc區中引入一個或多個胺基酸修飾,以此產生Fc區變體,以便增強例如抗體治療癌症或細胞增殖性疾病的有效性。本文中公開的抗PD-L1抗體(例如,人源化抗體或嵌合抗體)和其抗原結合片段也包括具有修飾的(或封閉的)Fc區以提供改變的效應子功能的抗體和片段。參見,例如,美國專利號5,624,821、WO2003/086310、WO2005/120571、WO2006/0057702。可以使用這樣的修飾增強或抑制免疫系統的各種反應,可能具有在診斷和治療中的有益效果。Fc區的修飾包括胺基酸變化(置換、缺失和插入)、糖基化或去糖基化、和添加多個Fc。對Fc的修飾還可以改變治療性抗體中的抗體的半衰期,從而實現更低頻率的給藥和因而增加的方便和減少的材料使用。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731,734-735頁。
在一個實施方案中,可以改變抗體的半胱胺酸殘基數
目以修飾抗體特性。例如對CH1的鉸鏈區實施修飾,從而改變(例如增加或降低)鉸鏈區中的半胱胺酸殘基的數目。此辦法進一步闡述於美國專利第5,677,425號中。可以改變CH1的鉸鏈區中半胱胺酸殘基的數目以例如促進輕鏈及重鏈的裝配或增加或降低抗體的穩定性。
在某些實施方案中,本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括,但不限於,水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括,但不限於,聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚合物可具有任何分子量,並且可為分支或未分支的。連接到抗體的聚合物的數目可變化,並且如果連接多於一個聚合物,那麼其可為相同或不同分子。一般說來,用於衍生化的聚合物的數目和/或類型可基於包括但不限於有待改善的抗體的特定特性或功能、抗體衍生物是否將在確定條件下用於療法中等考慮因素加以確定。
在一些實施方案中,本發明涵蓋抗PD-L1抗體的片段。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH,F(ab’)2、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體(例如scFv)、單結
構域抗體;和由抗體片段形成的多特異性抗體。
例如,抗體分子可以包括重鏈(HC)可變結構域序列和輕鏈(LC)可變結構域序列。在一個實施方案中,抗體分子包含一條重鏈和一條輕鏈(在本文中稱作半抗體)或由其組成。在另一個例子中,抗體分子包含兩個重鏈可變結構域序列和兩個輕鏈可變結構域序列,因而形成兩個抗原結合位點。如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、單結構域抗體、雙抗體(Dab)(雙價和雙特異性)和嵌合(例如,人源化)抗體,它們可以藉由修飾完整抗體產生,或使用重組DNA技術從頭合成那些抗體分子。這些功能性抗體片段保留選擇性地與其相應抗原或受體結合的能力。抗體和抗體片段可以來自任何抗體類別,包括但不限於IgG、IgA、IgM、IgD和IgE並且來自任何抗體亞類(例如,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗體分子的製備可以是單株或多株的。抗體也可以是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體或體外生成的抗體。抗體可以具有例如選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區。抗體還可以具有例如選自κ或λ的輕鏈。
本發明的抗體也可以是單結構域抗體。單結構域抗體可以包括其互補決定區是單結構域多肽組成部分的抗體。例子包括但不限於重鏈抗體、天然缺少輕鏈的抗體、衍生自常規4-鏈抗體的單結構域抗體或工程化抗體。單結構域抗體可以是現有技術的任何抗體,或將來的任何單結構域抗體。單結構域抗體可以衍生自任何物種,包括但不限於
小鼠、人、駱駝、羊駝、魚類、鯊魚、山羊、兔和牛。根據本發明的另一個方面,單結構域抗體是天然存在的單結構域抗體,稱作缺少輕鏈的重鏈抗體。這類單結構域抗體例如在WO 94/04678中公開。單結構域抗體或奈米抗體可以是自駱駝科(Camelidae)物種(例如駱駝、羊駝、單峰駝、駝羊和原駝)中產生的抗體。除駱駝之外的其他物種可以產生天然缺少輕鏈的重鏈抗體;這類單結構域抗體處於本發明的範圍內。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體是人源化抗體。用於使抗體人源化的不同方法是技術人員已知的,如由Almagro&Fransson綜述的,其內容藉由提述完整併入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers in Bioscience 13:1619-1633)。Almagro&Fransson區分理性辦法和經驗辦法。理性辦法的特徵在於生成少數工程化抗體變體並評估其結合或任何其它感興趣的特性。如果設計的變體不產生預期的結果,那麼啟動新一輪的設計和結合評估。理性辦法包括CDR嫁接、表面重建(Resurfacing)、超人源化(Superhumanization)和人字符串內容優化(Human String Content Optimization)。相比之下,經驗辦法基於生成大的人源化變體庫並使用富集技術或高通量篩選選出最佳純株。因而,經驗辦法依賴於能夠對大量抗體變體進行搜索的可靠的選擇和/或篩選系統。體外展示技術,如噬菌體展示和核糖體展示滿足這些要求並且是技術人員公知的。經驗辦法包括FR庫、導向選擇(Guided selection)、框架改組
(Framework-shuffling)和Humaneering。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體是人抗體。可使用本領域中已知的各種技術來製備人抗體。人抗體一般描述於van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol 5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol 20:450-459(2008)。例如,可以使用攜帶人免疫球蛋白基因而非小鼠系統的轉基因小鼠,產生人單株抗體(參見,例如,Wood等人,國際申請WO 91/00906;Kucherlapati等人,PCT公開WO 91/10741;Lonberg等人,國際申請WO 92/03918;Kay等人,國際申請92/03917;Lonberg,N.等人,1994 Nature 368:856-859;Green,L.L.等人,1994 Nature Genet.7:13-21;Morrison,S.L.等人,1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855;Bruggeman等人,1993 Year Immunol 7:33-40;Tuaillon等人,1993 PNAS 90:3720-3724;Bruggeman等人,1991 Eur J Immunol 21:1323-1326)。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體是非人抗體,例如齧齒類(小鼠或大鼠)抗體、山羊抗體、靈長類(例如,猴)抗體、駱駝抗體。較佳地,非人抗體是齧齒類(小鼠或大鼠)抗體。產生齧齒類抗體的方法是本領域已知的。
在某些實施方案中,本發明的抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利號4,816,567;以及Morrison等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81:6851-6855,1984中。在一個實施方案中,嵌合抗體包含非人可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人靈長類諸如猴的可變區)和人
恆定區。在又一個實施方案中,嵌合抗體為“類別轉換”抗體,其中類別或亞類與親本抗體的類別或亞類相比已經改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施方案中,嵌合抗體為人源化抗體。通常,非人抗體被人源化以降低對人的免疫原性,同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般說來,人源化抗體包含一個或多個可變域,其中例如CDR(或其部分)來源於非人抗體,並且FR(或其部分)來源於人抗體序列。人源化抗體視需要還將包含至少一部分人恆定區。在一些實施方案中,人源化抗體中的一些FR殘基被來自非人抗體(例如CDR殘基所來源的抗體)的相應殘基置換,例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。
可藉由在組合文庫中篩選具有所需活性的抗體來分離本發明抗體。舉例來說,本領域中已知多種用於產生噬菌體展示文庫並且在這些文庫中篩選具有所需結合特徵的抗體的方法。這些方法於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,2001)中評述,並且進一步於例如McCafferty等人,Nature348:552-554;Clackso等人,Nature 352:624-628(1991);Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo編,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等人,J.Mol.Biol340(5):1073-1093(2004);Fellouse,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中描述。
在一個實施方案中,抗體分子是單特異性抗體分子並且結合單一表位。例如,單特異性抗體分子具有各自結合相同表位的多個免疫球蛋白可變結構域序列。
在一個實施方案中,抗體分子是多特異性抗體分子,例如,它包含多個免疫球蛋白可變結構域序列,其中多個免疫球蛋白可變結構域序列的第一免疫球蛋白可變結構域序列具有針對第一表位的結合特異性並且多個免疫球蛋白可變結構域序列的第二免疫球蛋白可變結構域序列具有針對第二表位的結合特異性。在一個實施方案中,第一和第二表位在相同抗原(例如,相同蛋白質(或多聚體蛋白的亞基))上。在一個實施方案中,第一和第二表位重疊。在一個實施方案中,第一和第二表位不重疊。在一個實施方案中,第一和第二表位在不同抗原(例如,不同蛋白質(或多聚體蛋白的不同亞基))上。在一個實施方案中,多特異性抗體分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可變結構域。在一個實施方案中,多特異性抗體分子是雙特異性抗體分子、三特異性抗體分子或四特異性抗體分子。
在一個實施方案中,多特異性抗體分子是雙特異性抗體分子。雙特異性抗體對不多於兩種抗原具有特異性。雙特異性抗體分子以針對第一表位具有結合特異性的第一免疫球蛋白可變結構域序列和針對第二表位具有結合特異性
的第二免疫球蛋白可變結構域序列為特徵。在一個實施方案中,第一和第二表位在相同抗原(例如,相同蛋白質(或多聚體蛋白的亞基))上。在一個實施方案中,第一和第二表位重疊。在一個實施方案中,第一和第二表位不重疊。在一個實施方案中,第一和第二表位在不同抗原(例如,不同蛋白質(或多聚體蛋白的不同亞基))上。在一個實施方案中,雙特異性抗體分子包含針對第一表位具有結合特異性的重鏈可變結構域序列和輕鏈可變結構域序列以及針對第二表位具有結合特異性的重鏈可變結構域序列和輕鏈可變結構域序列。在一個實施方案中,雙特異性抗體分子包含針對第一表位具有結合特異性的半抗體和針對第二表位具有結合特異性的半抗體。在一個實施方案中,雙特異性抗體分子包含針對第一表位具有結合特異性的半抗體或其片段和針對第二表位具有結合特異性的半抗體或其片段。在一個實施方案中,雙特異性抗體分子包含針對第一表位具有結合特異性的scFv或其片段和針對第二表位具有結合特異性的scFv或其片段。在一個實施方案中,第一表位位於PD-L1上並且第二表位位於LAG-3、OX40、TIM-3、CEACAM(例如,CEACAM-1和/或CEACAM-5)或PD-L2上。
在一些實施方案中,本發明還涵蓋與其他物質,例如治療性模塊或標記物,如細胞毒性劑或免疫調節劑綴合的抗PD-L1單株抗體(“免疫綴合物”)。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。適合於形成免疫綴合物的細胞毒性劑
(例如化療劑)的例子是本領域中已知的,參見例如WO2015/153513或WO2015/138920等。例如,細胞毒性劑包括但不限於:放射性同位素(例如,碘(131I或125I)、釔(90Y)、鑥(177Lu)、錒(225Ac)、鐠、砹(211At)、錸(186Re)、鉍(212Bi或213Bi)、銦(111In)、鍀(99mTc)、磷(32P)、銠(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、鉻(51Cr)、氯(36Cl)、鈷(57Co或58Co)、鐵(59Fe)、硒(75Se)或鎵(67Ga)。細胞毒性劑的實例還包括化療劑或其它治療藥物,例如紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根鹼、絲裂黴素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝黴素、放線菌素D、1-脫氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤黴素和它們的類似物或同系物。細胞毒性劑還包括,例如:抗代謝物(例如,胺甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、胺烯咪胺(decarbazine)),烷化劑(例如,氮芥、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙胺酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑黴素、絲裂黴素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順鉑),胺茴黴素類(例如,柔紅菌素(以前稱為道諾黴素)和阿黴素),抗生素(例如,放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光輝黴素和安麯黴素(AMC)),和抗有絲分裂劑(例如,長春新鹼和長春鹼)。
可以與抗PD-L1抗體綴合/偶聯的物質還參見例如
WO2010/077634、US60/696426、WO2016/007235或WO2016/061142等。
在一方面,本發明提供了編碼以上任何抗PD-L1抗體或其片段的核酸。該核酸可以編碼包含抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區的胺基酸序列,或包含抗體的輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列。
例如,本發明的示例性的核酸包含編碼選自SEQ ID NO:26至51中任一項所示胺基酸序列的核酸,或編碼與選自SEQ ID NO:26至51中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸。
本發明還涵蓋與下述核酸在嚴格性條件下雜交的核酸或與下述核酸具有一個或多個置換(例如保守性置換)、缺失或插入的核酸:包含編碼選自SEQ ID NO:26至51中任一項所示胺基酸序列的核酸序列的核酸;或包含編碼與選自SEQ ID NO:26至51中在一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸序列的核酸。
在一個實施方案中,提供包含該核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中,載體是表達載體,例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。可以使用眾多載體系統。例如,一個類別的載體利用衍生自動物病毒例如牛乳頭瘤病毒、
多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、逆轉錄病毒(勞斯肉瘤病毒、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。另一類載體利用衍生自RNA病毒如Semliki森林病毒、東方馬腦炎病毒和黃病毒的RNA元件。在較佳的實施方案中,本發明的表達載體是pTT5表達載體。
另外,可以藉由引入允許選擇已轉染的宿主細胞的一個或多個標記物,選出已經穩定將DNA摻入至其染色體中的細胞。標記物可以例如向營養缺陷型宿主提供原養型、殺生物抗性(例如,抗生素)或重金屬(如銅)抗性等。可選擇標記基因可以與待表達的DNA序列直接連接或藉由共轉化引入相同的細胞中。也可能需要額外元件以便最佳合成mRNA。這些元件可以包括剪接信號,以及轉錄啟動子、增強子和終止信號。
一旦已經製備了用於表達的表達載體或DNA序列,則可以將表達載體轉染或引入適宜的宿主細胞中。多種技術可以用來實現這個目的,例如,原生質體融合、磷酸鈣沉澱、電穿孔、逆轉錄病毒的轉導、病毒轉染、基因槍、基於脂質的轉染或其他常規技術。在原生質體融合的情況下,將細胞在培養基中培育並且篩選適宜的活性。用於培養所產生的轉染細胞和用於回收產生的抗體分子的方法和條件是本領域技術人員已知的並且可以基於本說明書和現有技術已知的方法,根據使用的特定表達載體和哺乳動物宿主細胞變動或優化。
在一個實施方案中,提供包含編碼本文所述的抗體分
子的核酸或本文所述載體的宿主細胞。用於選殖或表達編碼抗體的核酸或載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。抗體例如可在細菌中產生,特別當不需要糖基化和Fc效應子功能時。對於抗體片段和多肽在細菌中的表達,見,例如,美國專利號5,648,237,5,789,199和5,840,523,還見Charlton,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,編輯,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254頁,其描述抗體片段在大腸桿菌中的表達)。在表達後,抗體可以從可溶級分中的細菌細胞糊狀物分離,並且可以進一步純化。在一個實施方案中,宿主細胞是大腸桿菌細胞。
在一個實施方案中,宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中,宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如人細胞)、昆蟲細胞、植物細胞或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。例如,真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是編碼抗體的載體的合適選殖或表達宿主,包括糖基化途徑已經進行“人源化”從而導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體的真菌和酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。適於表達糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。
也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如,可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系的其它實例是用SV40轉化的猴腎CV1系
(COS-7);人胚腎系(293HEK或293細胞,如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:216(1980));以及骨髓瘤細胞系如Y0,NS0和Sp2/0。
關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述見例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,卷248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268頁(2003)。其它有用的宿主細胞還包括但不限於Vero細胞、Hela細胞、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、BHK細胞、MDCKII細胞、PerC6細胞系(例如,來自Crucell的PERC6細胞)卵母細胞和來自轉基因動物的細胞,例如乳腺上皮細胞。合適的昆蟲細胞包括但不限於Sf9細胞。
可以重組生產本文公開的抗PD-L1抗體。存在幾種本領域已知的用於生產重組抗體的方法。用於重組生產抗體的方法的一個例子公開在美國專利號4,816,567中。
在一個實施方案中,提供了製備抗PD-L1抗體的方法,其中該方法包括,在適合抗體表達的條件下,培養包含編碼該抗體的核酸的宿主細胞,如上文所提供的,和視需要地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述抗體。為了重組產生抗PD-L1抗體,分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體)的核酸,並將其插入一個或多個載體,用於在宿
主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸易於使用常規規程分離和測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針進行)。
在一個實施方案中,宿主細胞包含含有編碼抗體的VL的胺基酸序列的核酸以及編碼抗體的VH的胺基酸序列的核酸的載體。在一個實施方案中,宿主細胞包含含有編碼抗體的VL的胺基酸序列的核酸的第一載體和含有編碼抗體的VH的胺基酸序列的核酸的第二載體。
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗PD-L1抗體進行鑒定、篩選,或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面,對本發明的抗體測試其抗原結合活性,例如藉由已知的方法諸如ELISA、Western印跡,流式細胞術、抗體分子複合的磁珠等來進行。可使用本領域已知方法來測定PD-L1結合,本文中公開了例示性方法。在一些實施方案中,使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量)或MSD測定法或流式細胞術。
另一方面,可使用競爭測定法來鑒定與本文中公開的任何抗PD-L1抗體競爭對PD-L1的結合的抗體。在某些實施方案中,此類競爭性抗體結合與本文中公開的任何抗PD-L1抗體所結合表位相同的表位(例如線性或構象表位)。用於定位抗體所結合表位的詳細例示性方法見Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。
本發明還提供了用於鑒定具有上文所述的一種或多種性質的抗PD-L1抗體的測定法。還提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。
在某些實施方案中,對本發明的抗體測試上文所述的一種或多種性質。
供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表達PD-L1或經改造而表達PD-L1的細胞或細胞系。
可以理解的是,能夠使用本發明的免疫綴合物替換或補充抗PD-L1抗體來進行任何上述測定法。
可以理解的是,能夠使用抗PD-L1抗體和其它的治療劑來進行任何上述測定法。
本發明還包括包含抗PD-L1抗體或其片段或其免疫綴合物的組成物(包括醫藥組成物或藥物製劑)和包含編碼抗PD-L1抗體或其片段的核酸的組成物。在某些實施方案中,組成物包含一種或多種結合PD-L1的抗體或其片段或其免疫綴合物或一種或多種編碼一種或多種結合PD-L1的抗體或其片段的核酸。這些組成物還可以包含合適的藥用輔料,如本領域中已知的藥用載體、賦形劑等,包括緩衝劑。
適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體,如水和油,包括那些石油、動物、植物或合成來源的,如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用醫藥組成物時,水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體,特別是用於可注射溶液。
合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途,亦參見“Handbook of PharmaceuticalExcipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,PharmaceuticalPress,London,Chicago。
若期望的話,該組成物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑,或pH緩衝劑。
這些組成物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、持續釋放配製劑等的形式。口服配製劑可以包含標準載體和/或賦形劑,如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。
可以藉由將具有所需純度的本發明的抗PD-L1抗體與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.編(1980))混合來製備包含本文所述的抗PD-L1抗體的藥物製劑,較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。
示例性的凍乾抗體製劑描述於美國專利號6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利號6,171,586和WO2006/044908中所述的那些,後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含超過一種活性成分,所述活性成分是被治療的特定適應證所需的,較
佳具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些活性成分。例如,理想的是還提供其它抗癌活性成分,例如化療劑和/或細胞毒性劑。所述活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。活性成分可以是本領域已知的能夠與抗PD-L1抗體組合的任何物質,包括化療劑、其它抗體以及其他的治療劑。這些活性成分的例子參見例如WO2010/077634、WO2016/061142、US61/264061、US60/696426、WO2016/007235等等。
在一些實施方案中,該活性成分是抗LAG-3抗體,例如結合人的抗LAG-3抗體,較佳地,抗LAG-3抗體是人源化的。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質,該基質呈成形物品,例如薄膜或微囊形式。
在一方面中,本發明涉及調節對象中免疫反應的方法。該方法包括向對象施用有效量的本文公開的抗體分子(例如,抗PD-L1抗體)或醫藥組成物或免疫綴合物,從而調節對象中的免疫反應。在一個實施方案中,本文公開的抗體分子(例如,治療有效量的抗PD-L1抗體分子)或醫藥組成物或免疫綴合物恢復、增強、刺激或增加對象中的免疫反應。
在另一方面中,本發明涉及預防或治療受試者的腫瘤(例如癌症)的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的
本文公開的抗體分子(例如,抗PD-L1抗體)或醫藥組成物或免疫綴合物。在一些實施方案中,腫瘤是腫瘤免疫逃逸。較佳地,腫瘤是胃腸道腫瘤(例如癌症),例如結腸癌。
在另一方面中,本發明涉及預防或治療受試者的感染性疾病的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的本文公開的抗體分子(例如,抗PD-L1抗體)或醫藥組成物或免疫綴合物。在一個實施方案中,感染性疾病是慢性感染。
在另一方面,本發明涉及在受試者中引起抗體依賴性細胞介導的細胞毒性的方法,該方法包括向該受試者施用有效量的本文公開的抗體分子(例如,抗PD-L1抗體)或醫藥組成物或免疫綴合物。
受試者可以是哺乳動物,例如,靈長類,較佳地,高級靈長類,例如,人類(例如,患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的患者)。在一個實施方案中,受試者需要增強免疫反應。在一些實施方案中,本文所述的抗PD-L1抗體分子提高T細胞增殖。在一些實施方案中,本文所述的抗PD-L1抗體分子恢復、增強或刺激受試者中的抗原特異性T細胞反應,例如,抗原特異性T細胞反應中的白介素-2(IL-2)或干擾素-γ(IFN-γ)產生。在一些實施方案中,免疫反應是抗腫瘤反應。在一個實施方案中,受試者患有本文所述疾病(例如,如本文所述的腫瘤或感染性疾病)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中,受試者免疫受損或具有免疫受損風險。例如,受試者接受或已經接受過化療治療和/或放射療法。備選地或組合下,受
試者因感染而免疫受損或具有因感染而免疫受損的風險。
在一些實施方案中,本文所述的腫瘤,例如癌症,包括但不限於實體瘤、血液學癌、軟組織腫瘤和轉移性病灶。
實體瘤的例子包括惡性腫瘤,例如,多個器官系統的肉瘤和癌(括腺癌和鱗狀細胞癌),如侵襲肝、肺、乳腺、淋巴、胃腸道的(例如,結腸)、生殖泌尿道(例如,腎、膀胱上皮細胞)、前列腺和咽的那些癌。腺癌包括惡性腫瘤如大部分結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺癌中的非小細胞癌、小腸癌和食道癌。鱗狀細胞癌包括惡性腫瘤,如在肺、食道、皮膚、頭頸區域、口腔、肛門和子宮頸的那些癌。在一個實施方案中,癌症是黑素瘤,例如,晚期黑素瘤。在一個實施方案中,癌症是胃腸道癌症,例如結腸癌。前述癌的轉移性病灶也可以使用本發明的方法和組合物治療或預防。
用於治療的較佳癌症的非限制性例子包括淋巴瘤(例如,彌漫性大B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、乳腺癌(例如,轉移性乳腺癌)、肺癌(例如,非小細胞肺癌(NSCLC),例如,IV期或復發性非小細胞肺癌、NSCLC腺癌、或NSCLC鱗狀細胞癌)、骨髓瘤(例如,多發性骨髓瘤)、白血病(例如,慢性髓性白血病)、皮膚癌(例如,黑素瘤(例如,III期或IV期黑素瘤)或Merkel細胞癌)、頭頸癌(例如,頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、脊髓發育不良綜合症、膀胱癌(例如,移行細胞癌)、腎癌(例如,腎細胞癌,例如,透明細胞腎細胞癌,例如,晚期或轉移性透明
細胞腎細胞癌)和結腸癌。另外,難治性或復發性惡性腫瘤可以使用本文所述的抗體分子治療。
可以治療的其他癌症的例子包括骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門癌、胃-食管癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、Merkel細胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病,包括急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴細胞白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞淋巴瘤、膀胱癌、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊樞椎腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、Kaposi肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘導的癌症,包括石棉誘導的那些癌症(例如,間皮瘤)和該癌症的組合。
可以使用本文所述的抗體分子實現對轉移性癌(例如,表達PD-L1的轉移性癌(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144))的治療。
還可以使用本文所述的抗體分子對腫瘤免疫逃逸進行治療。
在一個實施方案中,腫瘤是表達升高水平的PD-L1的癌症。
在一些實施方案中,本文所述的癌症是結腸癌及其轉移性癌症。
在一些實施方案中,該感染是急性的或慢性的。在一些實施方案中,該慢性感染是持續性的感染、潛伏的感染或緩慢感染。在一些實施方案中,該慢性感染是由選自細菌、病毒、真菌和原生動物的病原體導致的。
在一些實施方案中,該病原體是細菌。在一個實施方案中,該細菌選自:分枝桿菌屬物種(Mycobacterium spp.)、沙門氏菌屬物種(Salmonellaspp.)、李斯特菌屬物種(Listeria spp.)、鏈球菌屬物種(Streptococcus spp.)、嗜血桿菌屬物種(Haemophilus,spp.)、奈瑟菌屬物種(Neisseria spp.)、克雷伯氏菌屬物種(Klebsiella spp.)、疏螺旋體屬物種(Borrelia spp.)、脆弱擬桿菌(Bacterioides fragillis)、密螺旋體屬物種(Treponema spp.)和幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)。
在一些實施方案中,該病原體是病毒。在一個實施方案中,該病毒選自:感染病毒,例如乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒(hepatitis-B,-C),單純性皰疹病毒-I、-II(herpes simplex virus -I,-II)、人免疫缺陷病毒-I、-II(humanimmunodeficiency virus -I,-II)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)、EB病毒(Eppstein Barr virus)、人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus)、人類T淋巴細胞白血病病毒-I或-II(human T lymphotrophic viruses,-I,-II)、水痘帶狀皰疹病毒(varicallazoster)。
在一些實施方案中,該病原體是真菌。在一個實施方案中,真菌引起的病症選自:麯黴病(aspergilosis)、芽生菌病(blastomycosis)、白色念珠菌病(candidiasis albicans)、球孢子菌病(coccidioiodmycosis immitis)、組織胞漿菌病(histoplasmosis)、類球孢子菌病(paracoccidioiomycosis)、微孢子蟲病(microsporidiosis)。
在一些實施方案中,該病原體是原生動物,例如寄生蟲。在一個實施方案中,該原生動物導致的病症選自:利什曼病(leishmaniasis)、瘧原蟲病(plasmodiosis)(即,瘧疾(malaria))、隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)、弓形體病(toxoplasmosis)、錐蟲病(trypanosomiasis)和蠕蟲感染(helminth infection),包括那些由吸蟲(trematodes)(例如血吸蟲病(schistosomiasis))、絛蟲(cestodes)(例如包蟲病(echinococcosis))和線蟲(nemotodes)(如旋毛蟲病(trchinosis)、蛔蟲病(ascariasis)、絲蟲病(filariosis)和類圓線蟲病(strongylodiosis))導致的病症。
在另一個實施方案中,感染是肝炎感染,例如,乙型肝炎或丙型肝炎感染。抗PD-L1抗體分子可以出於治療優勢與乙型肝炎感染或丙型肝炎感染的常規治療組合。在某些實施方案中,抗PD-L1抗體分子與乙型肝炎抗原((例如,Engerix B))或疫苗,和視需要地聯合含鋁佐劑組合施用。
在另一個實施方案中,感染性疾病是流感。在某些實施方案中,抗PD-L1抗體分子與流感抗原或疫苗組合施
用。
適於用本發明的抗PD-L1的抗體或其片段預防或治療的疾病可進一步參見WO2010/077634、WO2016/061142、US60/696426、WO2016/007235或US61/264061。
在其他方面,本發明提供抗PD-L1抗體或其片段或其免疫綴合物在生產或製備藥物中的用途,所述藥物用於預防或治療上文提及的相關疾病或病症。
在一些實施方案中,本發明的抗體或抗體片段或免疫綴合物會延遲病症和/或與病症相關的症狀的發作。
在一些實施方案中,本文所述的預防或治療方法還包括向所述受試者或個體聯合施用本文公開的抗體分子(例如,抗PD-L1抗體或其片段)或醫藥組成物或免疫綴合物,以及一種或多種其它療法,例如治療方式和/或其它治療劑。
在一些實施方案中,治療方式包括外科手術(例如腫瘤切除術);放射療法(例如,外粒子束療法,它涉及其中設計照射區域的三維適形放射療法)、局部照射(例如,指向預選靶或器官的照射)或聚焦照射)等。聚焦照射可以選自立體定位放射手術、分割立體定位放射手術和強度調節型放射療法。聚焦照射可以具有選自粒子束(質子)、鈷-60(光子)和直線加速器(X射線)的輻射源,例如,如WO 2012/177624中描述。
放射療法可以藉由幾種方法之一或方法組合施用,該
方法包括而不限於外粒子束療法、內部放射療法,植入物照射、立體定位放射手術、全身放射療法、放療法和永久或短暫間質近距放射療法。術語“近距放射療法”指藉由空間限制的放射性物質遞送的放射療法,所述放射性物質在腫瘤或其他增殖性組織疾病部位處或其附近插入體內。該術語意在而不限於包括暴露於放射性同位素(例如At-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32和Lu的放射性同位素)。合適輻射源包括固體和液體。藉由非限制性舉例方式,輻射源可以是放射性核素,如I-125、I-131、Yb-169、Ir-192作為固態源、I-125作為固態源或發射光子、β粒子、γ輻射或其他治療性射線的其他放射性核素。放射性物質也可以是從任何放射性核素溶液,例如,I-125或I-131溶液製成的流體,或可以使用含有固體放射性核素(如Au-198、Y-90)小顆粒的合適流體的漿液產生放射性流體。另外,放射性核素可以包含在凝膠或放射性微球狀體中。
在一些實施方案中,治療劑選自化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、或免疫調節劑(例如共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑)。
示例性的細胞毒性劑包括抗微管藥物、拓撲異構酶抑制劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、烷基化劑、蒽環類、長春鹼類生物鹼、嵌入劑、能夠干擾信號轉導途徑的活性劑、促凋亡活性劑、蛋白酶體抑制劑和照射(例如,局部或全身照射(例如、γ輻射)。
示例性的其它抗體包括但不限於免疫檢查點抑制劑(例如,抗CTLA-4、抗TIM-3、抗CEACAM或抗LAG-3);刺激免疫細胞的抗體(例如,激動性GITR抗體或CD137抗體);抗癌抗體(例如,利妥昔單抗(Rituxan®或MabThera®)、曲妥珠單抗(Herceptin®)、托西莫單抗(Bexxar®)、替伊莫單抗(Zevalin®)、阿來組單抗(Campath®)、依帕珠單抗(Lymphocide®)、貝伐珠單抗(Avastin®)、厄洛替尼(Tarceva®)西妥昔單抗(Erbitux®),等等。
示例性的化療劑包括但不限於阿那曲唑(Arimidex®)、比卡魯胺(Casodex®)、硫酸博來黴素(Blenoxane®)、白消安(Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(Xeloda®)、N4-戊氧羰基-5-脫氧-5-氟胞苷、卡鉑(Paraplatin®)、卡莫司汀(BiCNU®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、順鉑(Platinol®)、克拉立濱(Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(DTIC-Dome®)、更生黴素(dactinomycin)(放線菌素D、Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松、多西紫杉醇(Taxotere®)、鹽酸多柔比星(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(Eulexin®)、替札他濱(tezacitibine)、吉西他濱(雙氟脫氧胞苷)、羥基脲(Hydrea®)、伊達比星(Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康
(Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、亞葉酸鈣、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺蝶呤(Folex®)、米托蒽醌(米托蒽醌)、米羅他(mylotarg)、紫杉醇(Taxol®)、phoenix(釔90/MX-DTPA)、噴司他丁、聚苯丙生20聯用卡莫司汀植入物(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(Nolvadex®)、替尼泊苷(Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、塞替派、替拉紮明(Tirazone®)、注射用鹽酸拓撲替康(Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)、長春瑞濱(長春瑞濱)、依魯替尼、吉利德(idelalisib)和貝倫妥單抗-維多汀(brentuximab vedotin)。
示例性的疫苗包括但不限於癌症疫苗。疫苗可以是基於DNA的疫苗、基於RNA的疫苗或基於病毒轉導的疫苗。癌症疫苗可以是預防性的或治療性的。在一些實施方案中,該癌症疫苗是肽癌症疫苗,其在一些實施方案中是個性化肽疫苗。在一些實施方案中,該肽癌症疫苗是多價長肽、多重肽、肽混合物、雜合肽,或經肽脈衝的樹突細胞疫苗(參見例如Yamada等人,Cancer Sci,104:14-21,2013)。
示例性的抗感染活性劑包括但不限於,抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑、抗菌劑,例如核苷類似物齊多夫定(AST)、更昔洛韋、膦甲酸或西多福韋(cidovir),如上文所述。
免疫調節劑包括免疫檢查點分子抑制劑和共刺激性分子激活劑。
在一些實施方案中,免疫檢查點分子的抑制劑是PD-1、
PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、CEACAM(例如,CEACAM-1、-3和/或-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFR β的抑制劑。對分子的抑制可以在DNA、RNA或蛋白質水平進行。在一些實施方案中,抑制性核酸(例如,dsRNA、siRNA或shRNA)可以用來抑制免疫檢查點分子的表達。在其他實施方案中,免疫檢查點分子的抑制劑是與免疫檢查點分子結合的多肽例如,可溶性配體(例如,PD-1-Ig或CTLA-4Ig),或抗體或其抗原結合片段;例如,與PD-1、PD-L2、CEACAM(例如,CEACAM-1、-3和/或-5)、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFR β或其組合結合的抗體或其片段。在其他實施方案中,免疫調節劑是CEACAM(例如,CEACAM-1、-3和/或-5)(例如,人CEACAM(例如,CEACAM-1、-3和/或-5))的抑制劑。在其他實施方案中,免疫調節劑是LAG-3(例如,人LAG-3)的抑制劑。在一個實施方案中,LAG-3的抑制劑是針對LAG-3的抗體分子,例如結合人的抗LAG-3抗體,較佳地,抗LAG-3抗體是人源化的。在其他實施方案中,免疫調節劑是TIM-3(例如,人TIM-3)的抑制劑。在一個實施方案中,TIM-3的抑制劑是針對TIM-3的抗體分子。
在一些實施方案中,免疫調節劑是共刺激分子的激活劑或激動劑。在一個實施方案中,共刺激分子的激動劑選自以下分子的激動劑(例如,激動性抗體或其抗原結合片段、或可溶性融合物):OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、
LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配體。在其他實施方案中,免疫調節劑是GITR激動劑。在一個實施方案中,GITR激動劑是針對GITR的抗體分子。在其他實施方案中,免疫調節劑是OX40激動劑。在一個實施方案中,OX40激動劑是針對OX40的抗體分子。
在進一步的一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段還能與酪胺酸激酶抑制劑(例如,受體酪胺酸激酶(RTK)抑制劑)組合使用。示例性酪胺酸激酶抑制劑包括但不限於表皮生長因子(EGF)途徑抑制劑(例如,表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑)、血管內皮生長因子(VEGF)途徑抑制劑(例如,血管內皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑(例如,VEGFR-1抑制劑、VEGFR-2抑制劑、VEGFR-3抑制劑)、血小板衍生生長因子(PDGF)途徑抑制劑(例如,血小板衍生生長因子受體(PDGFR)抑制劑(例如,PDGFR-ß抑制劑))、RAF-1抑制劑、KIT抑制劑和RET抑制劑。
在一些實施方案中,本發明的的抗PD-L1抗體或其片段還能與PI3K抑制劑、mTOR抑制劑、BRAF抑制劑、MEK抑制劑和/或JAK2抑制劑等組合使用。
在本發明的任何方法的一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段的施用與抗原的施用組合。抗原可以例如是腫瘤抗原、病毒抗原、細菌性抗原或來自病原體的抗原。在一些實施方案中,腫瘤抗原包含蛋白質。在一些
實施方案中,腫瘤抗原包含核酸。在一些實施方案中,腫瘤抗原是腫瘤細胞。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段可以與包含過繼轉移表達嵌合抗原受體(CAR)的T細胞(例如細胞毒性T細胞或CTL)的治療聯合施用。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段可以與抗腫瘤劑聯合施用。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段可以與溶瘤病毒聯合施用。在一些實施方案中,溶瘤病毒能夠在癌細胞中選擇性複製並且觸發癌細胞死亡或延緩其生長。在一些情況下,溶瘤病毒對非癌細胞無影響或影響最小。溶瘤病毒包括但不限於溶瘤腺病毒、溶瘤單純皰疹病毒、溶瘤逆轉錄病毒、溶瘤細小病毒、溶瘤痘苗病毒、溶瘤辛德比斯病毒、溶瘤流感病毒、或溶瘤RNA病毒(例如,溶瘤呼腸孤病毒、溶瘤新城疫病毒(NDV)、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水泡性口炎病毒(VSV))。在一些實施方案中,溶瘤病毒是US 2010/0178684 A1中描述的病毒,例如,重組溶瘤病毒。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體或其片段可以與細胞因子聯合施用。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段可以與本領域常規的癌症療法組合,常規的癌症療法包括但不限於:(i)放射療法(例如,放射療法、X射線療法、照射)或用電離輻射殺死癌細胞並縮小腫瘤。放射療法可經體外放射
治療(EBRT)或經內部近距離放射療法施用;(ii)化學療法,或應用細胞毒藥物,其一般影響快速分裂的細胞;(iii)靶向療法,或特異性影響癌細胞蛋白去調節的藥劑(例如,酪胺酸激酶抑制劑伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib);單株抗體,光動力學療法);(iv)免疫療法,或增強宿主免疫應答(例如,疫苗);(v)激素療法,或阻斷激素(例如,當腫瘤是激素敏感的時候),(vi)血管發生抑制劑,或阻斷血管形成和生長,和(vii)姑息護理,或這樣的治療,其涉及改善護理質量以降低疼痛、噁心、嘔吐、腹瀉和出血,其中疼痛藥物如嗎啡(morphine)和羥考酮(oxycodone),抗-催吐藥如昂丹司瓊(ondansetron)和阿瑞匹坦(aprepitant),從而可容許更具攻擊性的治療方案。
在一些實施方案中,本發明的抗體或其片段可以與增強宿主免疫功能的常規方法組合,該常規方法包括但不限於:(i)APC增強,諸如(a)向腫瘤注射編碼異源MHC同種異體抗原的DNA,或(b)用增加免疫抗原識別可能性的基因(例如免疫刺激細胞因子、GM-CSF、共刺激分子B7.1、B7.2)轉染活檢的腫瘤細胞,(iii)過繼性細胞免疫療法,或用活化的腫瘤特異性T細胞治療。過繼性細胞免疫療法包括分離腫瘤浸潤的宿主T淋巴細胞,諸如藉由IL-2或腫瘤或兩者刺激體外擴增該群體;此外,功能障礙的分離的T細胞也可藉由體外應用本發明的抗體來活化,如此活化的T細胞可然後重新施用給宿主。
上文所述的各種組合療法可以進一步組合以用於治
療。
更多的抗PD-L1抗體與其他治療方式或治療劑的組合的例子可以參見WO2016/061142、WO2010/077634、US60/696426、US61/264061或WO2016/007235等。
此類組合療法涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中),和分開施用,在該情況中,可以在施用別的療法,例如治療方式和/或治療劑之前,同時,和/或之後發生本發明的抗體的施用。抗體分子和/或其他療法,例如治療劑或治療方式可以在活動性疾病期間或在緩解或活動度更小的疾病期間施用。抗體分子可以在其他治療前、與其他治療同時、治療後或在疾病緩解期間施用。
在一個實施方案中,抗PD-L1抗體的施用和別的療法(例如治療方式或治療劑)的施用彼此在約一個月內,或約一,兩或三週內,或約1,2,3,4,5,或6天內發生。
在一些實施方案中,本文中描述的抗體組合可以分別施用,例如,作為單獨的抗體分別施用,或連接時(例如作為雙特異性或三特異性抗體分子)施用。
可以理解的是,能夠使用本發明的免疫綴合物替換或補充抗PD-L1抗體來進行任何治療。
在一些實施方案中,本發明的抗PD-L1抗體可以與抗LAG-3抗體聯合用於治療。
在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體是抗人
LAG-3抗體。在一些實施方案中,本發明的抗LAG3抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG4形式的抗體。在一些實施方案中,抗LAG-3抗體是單株抗體。在一些實施方案中,抗LAG-3抗體是人源化的。在一些實施方案中,抗LAG-3抗體是嵌合抗體。在一些實施方案中,至少部分的抗LAG-3抗體的框架序列是人共有框架序列。在一個實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體還涵蓋其抗體片段,較佳地選自以下的抗體片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)或(Fab’)2、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。
在一些具體的實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段包含(i)如SEQ ID NO:75所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,和/或(ii)如SEQ ID NO:76所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL),其中(i)該VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3,其中HCDR1包含SEQ ID NO:69的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成;HCDR2包含選自SEQ ID NO:70的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:71的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成;
和/或(ii)其中該VL包含互補決定區域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中LCDR1包含SEQ ID NO:72的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:73的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;LCDR3包含選自SEQ ID NO:74的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和/或輕鏈可變區VL,其中,
(a)重鏈可變區VH
(i)包含與選自SEQ ID NO:75的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成;或者(ii)包含選自SEQ ID NO:75的胺基酸序列或由其組成;或者(iii)包含與選自SEQ ID NO:75的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列,較佳地,該胺基酸改變不發生在CDR區中;和/或
(b)輕鏈可變區VL
(i)包含與選自SEQ ID NO:76的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或
99%同一性的胺基酸序列或由其組成;(ii)包含選自SEQ ID NO:76的胺基酸序列或由其組成;或者(iii)包含與選自SEQ ID NO:76的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列,較佳地,該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中,本發明的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段包含重鏈和/或輕鏈,其中
(a)重鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO:77的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成;(ii)包含選自SEQ ID NO:77的胺基酸序列或由其組成;或者(iii)包含與選自SEQ ID NO:77的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列,較佳地,該胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中,更佳地,該胺基酸改變不發生在重鏈可變區中;和/或
(b)輕鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO:78的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成;(ii)包含選自SEQ ID NO:78的胺基酸序列或由其組成;或者(iii)包含與選自SEQ ID NO:78的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個,更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換,更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列,較佳地,該胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中,更佳地,該胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中。
在一些實施方案中,本發明針對抗PD-L1抗體的修飾同樣適用於抗LAG-3抗體。
本發明的抗體(以及包含其的醫藥組成物或免疫綴合物,以及任何另外的治療劑)可以藉由任何合適的方法給藥,包括腸胃外給藥,肺內給藥和鼻內給藥,並且,如果局部治療需要,病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一定程度上根據用藥是短期或長期性而定,可藉由任何適合途徑,例如藉由注射,例如靜脈內或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時程,包括,但不限於,單次給藥或在多個時間點多次給藥、推注給藥及脈衝輸注。
為了預防或治療疾病,本發明的抗體的合適劑量(當單
獨或與一種或多種其他的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、該抗體是以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對所述抗體的應答,和主治醫師的判斷力。該抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。
在一些實施方案中,調整劑量方案以提供最佳的所需反應(例如,治療反應)。例如,可以施用單次團注,可以隨時間推移施用幾個分開的劑量或可以如治療情況的危急性所示,按比例減少或增加該劑量。特別有利的是以劑量單位形式配製腸胃外組合物以易於劑量的施用和均勻性。如本文所用的劑量單位形式指適合作為用於待治療對象的單一劑量的物理分立的單元;每個單元含有預定量的活性化合物,該預定量經計算與所要求的藥用載體結合時產生所需的治療效果。用於本發明劑量單位形式的規格直接取決於(a)活性化合物的獨特特徵和待實現的特定治療效果,以及(b)混合這種活性化合物用於個體中敏感性治療的領域內所特有的限制。
可以由技術人員確定抗PD-L1抗體分子的劑量和治療方案。在某些實施方案中,抗PD-L1抗體分子藉由注射(例如,皮下或靜脈內)以約1至30mg/kg,例如,約5至25mg/kg、約10至20mg/kg、約1至5mg/kg,或約3mg/kg的劑量施用。給藥方案可以從例如一週一次變動至每2、3或4週一次。在一個實施方案中,抗PD-L1抗體分子以約
10至20mg/kg的劑量每隔一週施用。在一個實施方案中,將抗PD-L1抗體分子以小於或等於約5mg/kg;小於或等於約4mg/kg;小於或等於約3mg/kg;小於或等於約2mg/kg;小於或等於約1mg/kg的劑量每隔一週單獨或組合(例如,與抗LAG-3抗體分子組合)施用。在一個實施方案中,將抗PD-L1抗體分子以大約1至5mg/kg的劑量每隔一週、大約1至4mg/kg的劑量每隔一週、大約1至3mg/kg的劑量每隔一週或大約1至2mg/kg的劑量每隔一週施用。在一個實施方案中,將抗LAG-3抗體分子以大約1至5mg/kg的劑量每隔一週、大約1至4mg/kg的劑量每隔一週、大約1至3mg/kg的劑量每隔一週或大約1至2mg/kg的劑量每隔一週單獨或組合(例如,與抗LAG-3抗體分子組合)施用。
在某些實施方案中,本文中提供的任何抗PD-L1抗體或其抗原結合片段可以用於檢測PD-L1在生物樣品中的存在。術語“檢測”用於本文中時,包括定量或定性檢測,示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如,FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如,RT-PCR)。在某些實施方案中,生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中,生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中,生物樣品來自過度增生性或癌性病灶。
在一個實施方案中,提供用於診斷或檢測方法的抗
PD-L1抗體。在另一個方面中,提供檢測PD-L1在生物樣品中的存在的方法。在某些實施方案中,方法包含檢測PD-L1蛋白在生物樣品中的存在。在某些實施方案中,PD-L1是人PD-L1。在某些實施方案中,該方法包括將生物樣品與如本文所述的抗PD-L1抗體在允許抗PD-L1抗體與PD-L1結合的條件下接觸,並檢測在抗PD-L1抗體和PD-L1之間是否形成複合物。複合物的形成表示存在PD-L1。該方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中,抗PD-L1抗體被用於選擇適合利用抗PD-L1抗體的治療的受試者,例如其中PD-L1是用於選擇所述受試者的生物標記物。
在一個實施方案中,可以使用本發明抗體診斷癌症或腫瘤,例如評價(例如,監測)對象中本文所述疾病(例如,過度增生性或癌性疾病)的治療或進展、其診斷和/或分期。在某些實施方案中,提供標記的抗PD-L1抗體。標記包括但不限於,被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記),以及被間接檢測的部分,如酶或配體,例如,藉由酶促反應或分子相互作用。示例性標記包括但不限於,放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I,螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物,羅丹明及其衍生物,丹醯(dansyl),傘形酮(umbelliferone),螢光素酶(luceriferase),例如,螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456),螢光素,2,3-二氫酞嗪二酮,辣根過氧化物酶(HR),鹼性磷酸酶,
β-半乳糖苷酶,葡糖澱粉酶,溶解酶,糖類氧化酶,例如,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,雜環氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶,以及利用過氧化氫氧化染料前體的酶如HR,乳過氧化物酶,或微過氧化物酶(microperoxidase),生物素/親和素,自旋標記,噬菌體標記,穩定的自由基等等。
在本文中提供的任何發明的一些實施方案中,樣品是在用抗PD-L1抗體治療之前獲得的。在一些實施方案中,樣品是在用癌症藥物治療之前獲得的。在一些實施方案中,樣品是在癌症已經轉移之後獲得的。在一些實施方案中,樣品是福爾馬林固定、石蠟包膜(FFPE)的。在一些實施方案中,樣品是活檢(例如芯活檢),手術標本(例如來自手術切除的標本),或細針吸出物。
在一些實施方案中,在治療之前,例如,在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測PD-L1。
在一些實施方案中,提供了一種治療腫瘤或感染的方法,該方法包括:對受試者(例如,樣品)(例如,包含癌細胞的受試者樣品)檢驗PD-L1的存在,因而確定PD-L1值,將PD-L1值與對照值比較,並且如果PD-L1值大於對照值,則向受試者施用治療有效量的視需要與一種或多種其他療法組合的抗PD-L1抗體(例如,本文所述的抗PD-L1抗體),因而治療腫瘤或感染。
本發明的這些以及其它方面和實施方案在圖式(圖式
簡述緊隨其後)和以下的發明詳述中得到描述並且示例於以下實施例中。上文以及整個本申請中所論述的任何或所有特徵可以在本發明的各種實施方案中組合。以下實施例進一步說明本發明,然而,應理解實施例以說明而非限定的方式來描述,並且本領域技術人員可以進行多種修改。
融合瘤技術是藉由融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特徵。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細胞(B淋巴細胞)的主要特徵是它的抗體分泌功能,但不能在體外連續培養,小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖,即具有所謂永生性。在選擇培養基的作用下,只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才能具有持續培養的能力,形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特徵的細胞克隆。本實驗藉由hPD-L1蛋白免疫小鼠,再獲取小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合,獲得能夠表達陽性抗體的融合瘤細胞。
實驗動物及免疫信息
電融合皿準備:用70%乙醇徹底浸泡電融合皿,並於超淨台中吹乾備用。
分離脾細胞:頸脫位將小鼠處死,用75%酒精消毒體表5min,隨即放入超淨台內小鼠解剖板上,左側臥位,用7號針頭固定四肢。無菌打開腹腔取出脾臟,用基礎培養基(配置方法如下表)洗滌,並仔細去掉周圍附著的結締組織。隨後將脾臟轉移到另一個盛有基礎培養基的平皿中。以彎頭針頭壓住脾臟,用小針頭在脾臟上插孔,並用鑷子擠壓,使脾細胞充分釋放,製成脾細胞懸液。細胞懸液經100μM細胞篩網過濾後用30ml基礎培養基洗一遍,1200rpm離心6min。
裂解紅細胞:去除上清,用10ml RBC裂解緩衝液(GIBCO)重懸細胞。然後再加入20ml RBC裂解緩衝液。懸液靜置5min後1100rpm離心6min。去上清後用10ml
基礎培養基重懸細胞,然後再加入30ml基礎培養基,1100rpm離心6min。去除上清後,細胞重懸於20ml基礎培養基中並計數。
電融合:用20ml基礎培養基重懸小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞(ATCC)並計數。將SP2/0和脾細胞以1:2至1:1的比例混合,100rpm離心6min。去除上清後將混合的細胞重懸於10ml融合緩衝液(BTXpress)中。再加入15ml融合緩衝液,1000rpm離心5min,去除上清。重複上述步驟一遍後,用適量融合緩衝液重選細胞,調整混合細胞密度至1×107個細胞/ml。電融合儀的參數設置如下。每個電融合皿中加入2ml細胞懸液進行電融合。
電融合後鋪板:細胞於電融合皿中室溫靜置5min。將細胞轉移入離心管中,用篩選培養基(配置方法如下表)稀釋細胞至1至2×104個細胞/ml。96孔板中每孔加入100μl細胞懸液。融合後第7天更換篩選培養基。培養第10天(或更久,根據細胞生長狀態)後進行篩選。藉由FACS(FACS ARIA(BD Biosciences))檢測篩選出表達特異性抗PD-L1抗體的融合瘤細胞。
亞選殖步驟:準備一塊96孔板,第2至第8列每孔加入200μl如上所述的基礎培養基。將上述融合篩選出的陽性孔的細胞製成細胞懸液並加入第1列。將第1列細胞懸液取100μl加入第2列,充分混勻後取100μl加入下一列。重複上述步驟,直至最後一列體積變為300μl;靜置96孔板15min,顯微鏡下觀察計數。取100個細胞對應的體積加入20ml如上所述的基礎培養基中,並混勻鋪板,每孔200μl。一周後顯微鏡下觀察,判斷並標記出單純株孔,待測挑出陽性孔。
細胞凍存:觀察細胞狀態,等細胞生長良好,活力>90%時,1000rpm離心5min,去除上清。用凍存液(45.5%FBS,44.5%RPMI-1640,10%DMSO)重懸細胞至1×107個細胞/ml,分裝至凍存管,放入程序降溫盒中,-80℃凍存。
本發明利用分子生物學技術,獲得抗PD-L1陽性融合瘤細胞中的抗體序列,並利用其構建人鼠嵌合抗體。
RNA抽提:新鮮細胞,300g離心5min,去除上清,沉澱中加入500μl LY緩衝液(Biomiga)(在使用前每1ml加入20μl β巰基乙醇),混勻至澄清。加入到DNA去除管中,13000rpm離心2min,收集流穿液。按1/2的比例向流穿液中加入100%乙醇,混勻5次至澄清。將澄清的溶液加入到RNA收集管中,13000rpm離心1min去除液體,加入500μl RB(Recovery Buffer,回收緩衝液)(Takara),13000rpm離心30s,再加入500μl RNA洗滌緩衝液(Biomiga)(用之前加入乙醇),離心30s,重複一遍上述過程後,離心徹底揮發去除乙醇後,向收集柱中加入30μl DEPC水,12000g離心2min,收集洗脫液。測定RNA濃度。
65℃溫育5min後,迅速置冰上冷卻。向反應體系I中加入下列反轉錄體系,總量為20μl:
*來自PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit,購自Takara。
緩慢混勻後按下列條件進行反轉錄翻譯:42℃ 60min→95℃ 5min,然後放冰上冷卻,獲得cDNA。
取4.5μl上述PCR反應獲得的PCR產物,加入0.5μl pMD20-T載體(Clontech),5μl Ligation Mighty Mix(Takara),輕輕混勻,於37℃反應2h,獲得連接產物。
-80℃取出TOP10感受態(天根生化科技(北京)有限公司),冰上融化,取上文獲得的連接產物5μl加入到融化的TOP10感受態中,混勻後冰上孵育30min。42℃熱激90s後迅速冰上冷卻2min,向EP管中補加900μl LB培養基(生工生物工程(上海)股份有限公司),37℃,220rpm搖床培養1h。3000g離心2min,吸除800μl上清,用剩餘的培養基將菌體重懸並塗布在胺苄青黴素抗性的平板上。於37℃培養過夜,挑純株測序。
PCR擴增已經測序的實施例1中融合瘤產生的鼠抗PD-L1抗體VH及VL區:上下游引子序列見表5及表6。
按上述比例混合後,獲得Primer Mix 1用於後續VH的PCR擴增。
按上述比例混合後,獲得Primer Mix 2用於後續VL的PCR擴增。
切膠回收PCR擴增產物。
37℃反應30min,獲得重組產物。重組產物轉化TOP10感受態,並挑取單純株測序,選擇包含插入方向正確的質粒的純株作為陽性純株,保存陽性純株。
從上文獲得的陽性純株中提取包含抗PD-L1抗體的質粒。
根據所需轉染體積傳代293F細胞(Invitrogen),轉染前一天將細胞密度調整至1.5×106個細胞/ml。轉染當天細胞密度約為3×106個細胞/ml。取終體積1/10的F17培養基(Gibco,A13835-01)作為轉染緩衝液,加入適當的質粒,混勻。加合適的聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences,23966)到質粒中(質粒與PEI的比例在293F細胞中為1:3),混勻後室溫孵育10min,獲得DNA/PEI混合物。用DNA/PEI混合物重懸細胞後,36.5℃,8%的CO2。24h後補加轉染體積2%的FEED(Sigma),於36.5℃,120rpm,8%的CO2條件下培養。連續培養至第6天或者細胞活力60%時,收集細胞上清進行純化。
將純化使用的重力柱使用0.5M NaOH過夜處理,玻璃瓶等用蒸餾水洗淨後在180℃ 4h乾烤,獲得純化柱。純化前將收集的培養基4500rpm離心30min,棄掉細胞。再將上清使用0.22μl的濾器過濾。每管裝填1ml Protein A,並使用10ml結合緩衝液(磷酸鈉20mM.NaCl 150mM,PH7.0)平衡。將過濾後的上清加入純化柱後使用15ml結合緩衝液再平衡。加5ml洗脫緩衝液(檸檬酸+檸檬酸鈉0.1M,PH3.5),收集洗脫液,每1ml的洗脫液加入80μl Tris-HCl。將收集的抗體超濾濃縮交換到PBS(Gibco,70011-044)中,並檢測濃度。
本發明獲得的4個嵌合抗體的CDR、輕鏈可變區和重
鏈可變區,輕鏈和重鏈的胺基酸序列,以及序列編號請參見上文表1-3。
本發明所用的對照抗體為羅氏的PD-L1抗體阿特珠單抗(Atezolizumab)(以下簡稱ATE或Ate,商品名Tecentriq),其CDR、輕鏈可變區和重鏈可變區,輕鏈和重鏈的胺基酸序列也參見上文表1-3。
採用生物光干涉測定法(ForteBio)測定本發明抗體結合人PD-L1的平衡解離常數(KD)。ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人,High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):第270-8頁)進行。
實驗開始前半個小時,根據樣品數量,取合適數量的AMQ(Pall,1506091)(用於樣品檢測)或AHQ(Pall,1502051)(用於陽性對照檢測)傳感器浸泡於SD buffer(PBS 1×,BSA 0.1%,Tween-20 0.05%)中。
取100μl的SD緩衝液、抗體、抗原(包括人PD-L1、小鼠PD-L1及食蟹猴PD-L1,均自Acrobiosystems購買)分別加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner,675076)中。根據樣品位置布板,選擇傳感器位置。儀器設置參數如下:運行步驟:Baseline、Loading~1nm、Baseline、Association和Dissociation;各個步驟運行時間取決於樣品結合和解離速度,轉速為400rpm,溫度為30℃。使用
ForteBio分析軟件分析KD值。
在以上試驗中,嵌合抗體3-266.1、4-79.2、4-26.6、4-48.5的KD值分別為9.80E-10M、7.56E-09M、3.85E-09M、1.23E-09M,與對照組相比,本研究中的抗體具有相似或更優的KD值。
本研究利用流式細胞儀檢測了梯度稀釋的本發明的嵌合抗體與表面過表達人PD-L1的CHO穩定細胞株的結合情況。
藉由將帶有純株到多選殖位點(MCS)的人PD-L1 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0載體(Invitrogen)轉染到CHO-S細胞(Invitrogen,ExpiCHOTM Expression System Kit,貨號:A29133),產生過表達人PD-L1的CHO細胞
(CHO-PDL1)。
將CHO-PDL1細胞計數,並稀釋至1×106個細胞/ml,向U型底96孔板中加入100μl/孔。400g 5min,離心,去除細胞培養基。將樣品(分別是嵌合抗體3-266.1、4-79.2、4-26.6、4-48.5,以及陽性對照抗體Ate)(抗體稀釋方法為:最高抗體濃度為500nM,三倍稀釋在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中,總共測試了8個濃度)加入U型板並重懸細胞,100μl/孔,冰上靜置30min。400g 5min去除上清,PBS洗細胞1遍。400g 5min去除PBS,每孔加入100μl抗鼠Fab的FITC標記的二抗(Jackson Immuno Research)(1:500稀釋於PBS中),在加入陽性對照抗體的細胞中加入100μl抗人Fab的FITC標記的二抗(Jackson Immuno Research)。冰上避光孵育30min。400g 5min去除上清,PBS洗細胞1遍。用100μl 1×PBS重懸細胞,FACS檢測。
在以上測定法所述的實驗中,抗體3-266.1、4-79.2、4-26.6、4-48.5和CHO-PDL1細胞的結合情況如第1圖所示。
在以上試驗中,抗體3-266.1、4-79.2、4-26.6、4-48.5均結合CHO細胞上過表達的人PD-L1,EC50分別為2.139nM、2.598nM、1.985nM、1.995nM,與對照抗體ATE相比,其結合力更優,部分抗體的結合能力是對照抗體的兩倍多。
將實施例1得到的嵌合抗體進行人源化。抗體人源化
過程使用Macromoltek公司的SmrtMolHumanize專有軟件程序進行。首先將序列輸入軟件,系統會生成序列的三維模型,並經過以下步驟進行人源化:①確定CDR環結構;②在人種系序列數據庫為重鏈和輕鏈的每個V/J區域找到最接近的同源序列;③篩選與重鏈輕鏈最匹配的人種系以及最低量的回復突變;④將嵌合抗體的CDR區構建至人的骨架區上;⑤使用序列和結構特徵,確定骨架區中起到維持CDR功能的胺基酸位置;⑥在確定為重要的序列位置進行回復突變(返回到輸入胺基酸類型);⑦生成人源化序列的三維模型;⑧手工檢查序列和結構,以確定可能會導致錯誤折疊或降低穩定性的風險位點;⑨優化風險位點的胺基酸。
本發明獲得的4個人源化抗體(HZ3266-IgG1N297A,HZ3266-IgG1、HZ3266-IgG4PAK和HZ4485-IgG1N297A)的CDR、輕鏈可變區和重鏈可變區,輕鏈和重鏈的胺基酸序列請參見如上文所述的表1-3。
採用ForteBio測定法測定本發明不同Fc亞型的人源化抗體結合人PD-L1的平衡解離常數(KD)。ForteBio親和
力測定方法同實施例2。在以上測定法所述的實驗中,抗體HZ3266-IgG1N297A、HZ3266-IgG1、HZ3266-IgG4PAAK、HZ4485-IgG1N297A的親和力如表8所示:
在以上試驗中,本文所述的人源化抗體HZ3266-IgG1N297A、HZ3266-IgG1、HZ3266-G4PAAK、HZ4485-IgG1N297A的KD值分別為7.24E-10M、9.35E-10M、1.32E-09M、3.17E-09M,與對照組相比,本研究中的人源化抗體具有相似或更優的KD值。
本研究利用流式細胞儀檢測了梯度稀釋的本發明的人源化抗體與表面過表達人PD-L1的CHO穩定細胞株(CHO-PDL1)的結合情況。試驗方法同實施例3,例外是使用的抗體是人源化抗體HZ3266-IgG1N297A、HZ3266-IgG1、HZ3266-G4PAAK、HZ4485-IgG1N297A,抗體稀釋方法為:最高抗體濃度為500nM,三倍稀釋在含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS中,總共測試了8個濃度的人源化抗體
HZ3266-IgG1N297A、HZ3266-IgG1、HZ3266-G4PAAK、HZ4485-IgG1N297A和CHO-PDL1細胞的結合情況如第2圖所示。
在以上試驗中,人源化抗體HZ3266-IgG1、HZ3266-IgG1N297A、HZ3266-G4PAAK、HZ4485-IgG1N297A結合CHO細胞上過表達的人PD-L1,EC50分別為1.813nM、1.784nM、1.862nM、1.561nM,與對照抗體ATE相比,具有更強的結合能力。
抗PD-1/PD-L1抗體能夠藉由阻斷PD-1和PD-L1的結合,從而解除對下游NFAT信號通路的抑制作用。本研究使用Promega公司提供的MOA檢測系統(PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay,Cell Propagation Model,Catalog J1252),根據說明書提供的方法,藉由檢測螢光報告基因的表達反應出NFAT信號的激活情況,從而檢測抗體對PD-1/PD-L1結合的抑制作用。
活性檢測前一天鋪CHOK1-PDL1細胞(來自上述MOA檢測系統):鋪CHOK1-PDL1前1至2天傳代。棄培養上清,PBS(Gibco)洗一遍細胞。加入適量Trypsin(Gibco)於37℃、5% CO2消化3至5min。加入4倍Trypsin體積的培養基,轉移細胞至50ml離心管並計數。取所需體積細胞,230g,離心10min。加入1640培養基(Gibco),重懸細胞至4×105個細胞/mL。將細胞加入96孔白色細胞培養板(Nunclon),100μl/孔。邊孔加入PBS,200μl/孔。細胞
於37℃/5% CO2培養箱中培養過夜。
處理Jurkat-PD1細胞(來自上述MOA檢測系統):活性檢測前兩天進行細胞傳代。計數後取所需體積細胞,170g,離心5min。用測定緩衝液(1640培養基(Gibco)+1%FBS)重懸細胞至1.25×106個細胞/ml。
加入樣品和Jurkat-PD1細胞至檢測板(來自上述MOA檢測系統):棄95μl/孔CHOK1-PDL1細胞上清。加入40μl樣品(本發明製備的人源化抗體HZ3266-IgG1、HZ3266-IgG1N297A、HZ4485-IgG1N297A)及陽性對照(Ate)、陰性對照(IgG1)(抗體稀釋方法為:最高抗體濃度為100nM,三倍稀釋在測定緩衝液中,總共測試了8個濃度)。加入40μl Jurkat-PD1細胞。於37℃/5% CO2培養箱中培養6小時。
檢測:提前將Bio-GloTM緩衝液(來自上述MOA檢測系統)融化,加入Bio-GloTM受質(來自上述MOA檢測系統),混勻。6小時後,加入Bio-GloTM試劑(來自上述MOA檢測系統),80μl/孔。室溫放置5~10min。讀數。
在以上試驗中,實驗結果如第3圖所示,抗體HZ3266-IgG1、HZ3266-IgG1N297A、HZ4485-IgG1N297A均可以有效阻斷PD1/PD-L1的相互作用。
本研究將抗體和體外培養的、來源於不同供體的成熟DC細胞及CD4+ T細胞共同孵育,藉由檢測體系中IL2和IFN-γ的相對表達量,從而反應出不同抗體對T細胞的激
活作用。
PBMC分離:取捐贈者新鮮血液50ml,添加2.5倍PBS,輕輕加入到FiColl(Thermo),分4管,每管12.5ml,400g,30min離心,0減速度停止。吸取中間白色條帶至PBS中,PBS洗2次。
DC細胞分離:取如上所述分離的PBMC細胞添加5ml T細胞培養基(配製方法如下表),37℃、6% CO2、貼壁培養2h,吸取懸浮細胞液做CD4+細胞分離,剩下細胞添加3ml DC培養基(配製方法如下表),培養2天後添加3ml DC培養基,再培養第5天,然後添加rTNFa(R&D Systems)(1000U/ml),IL-1b(R&D Systems)(5ng/ml),IL-6(R&D Systems)(10ng/ml)和1μM PGE2(Tocris)培養2天,作為淋巴細胞混合反應(MLR)的DC細胞。
CD4+T細胞分離:按照‘Untouched CD4+ T cell isolation’ kit instructions(11346D,Invitrogen)說明書,利用該試劑盒進行操作。PBMC靜置培養2h,吸取懸浮的細胞液至15ml離心管中,200g離心10min,沉澱加入500μl分離液、100μl AB型血清、100μl純化抗體重懸,4℃孵育20min,用分離液清洗一次,再加入500μl Bead Buffer(Invitrogen)孵育15min,磁場去除Bead,T細胞培養基洗一次,使用8ml培養基重懸,37℃、6% CO2培養。
MLR實驗:將上述獲得的成熟後的DC細胞與CD4+
細胞混合,每孔體積200μl,DC細胞10000個,CD4+細胞100000個,加入本發明的抗體(濃度:100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM),以上文製備的DC細胞(下表中表示為DC)、CD4+ T細胞(下表中表示為CD4)、DC細胞與CD4+細胞混合(下表中表示為Cell)和本文表3中公開的IgG1作為陰性對照,DC+ CD4+T細胞+抗-CD3/CD28磁珠(QIAGEN)(下表中表示為Beads)作為陽性對照,混合培養5天,利用cisbio試劑盒(Human IL2 Kit 1000 Test、Human IFN gamma 1000test)檢測IL2和IFN-γ濃度(相對表達量以DeltaF%計)。
實驗結果如表9、10、11和12及第4圖、第5圖所示。其中表中的數據單位為DeltaF%。
因此,本發明的抗體均可以在體外有效激活T細胞,且部分激活效果優於陽性對照抗體。
本實驗藉由記錄本發明的示例性人源化抗體在Zenix柱(Sepax Technologies,Inc)中的停留時間,檢測了抗體的成藥性。停留時間越短,反應該抗體的黏性較低,成藥性較好。
色譜條件:檢測波長:214nm,柱溫:25℃,流速:0.35ml/min,進樣量:10μl。
樣品準備:取100μl樣品(待檢測抗體HZ3266-IgG1、HZ3266-IgG4PAAK、HZ3266-IgG1N297A、HZ4485-IgG1N297A;ATE作為陽性對照,抗體濃度:1mg/ml),13 000rpm離心
5min,取80μl上清於液相內插管中,置於液相樣品盤中待進樣檢測。
實驗結果如表13所示,HZ3266的不同亞型和HZ4485在柱上的停留時間均短於對照抗體,表明HZ3266和HZ4485的成藥性較好。
本實驗採用表達人PD-L1的MC38細胞(MC38-hPDL1)(南京銀河公司)在hPD-L1轉基因小鼠測定本發明的PD-L1抗體的抗腫瘤作用。
雌性C57B1/6背景的人PDL-1轉基因小鼠(約8周大)購自上海南方實驗動物技術有限公司。小鼠在到達後馴化7天,隨後開始研究。
表達人PD-L1的MC38細胞(MC38-hPDL1)購自南京銀河生物醫藥有限公司,並嚴格按照說明書進行常規傳代培
養用於後續體內實驗。離心收集細胞,在無菌PBS中重懸細胞並調整細胞密度為5×106個/ml。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至人PD-L1轉基因小鼠右側腹部區域中來建立MC38-hPDL1荷瘤小鼠模型。
腫瘤細胞接種6天後檢測各隻小鼠瘤體積,挑選出瘤體積在87.4mm3至228.4mm3範圍內的小鼠按瘤體積平均分組(每組8至隻小鼠,一組給藥IgG1,一組給藥本發明抗體HZ3266-IgG1N297A)。分別在接種後第6、10、14、17、21、24、28、31和35天時給藥,其中給藥頻率為2次/週,給藥劑量和方式如表12所示。在給藥期間監測各組小鼠瘤體積和體重變化,監測頻率均為2次/週,連續監測5週。在每次給藥前測定體重和腫瘤體積。腫瘤體積測定:採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W),腫瘤體積按如下公式計算:V=L×W2/2。採用電子天平測定體重,每週2次。
本發明抗體在給藥一周後即顯示出顯著的抗腫瘤作用(第6圖),到第35天時,本發明抗體組有1只小鼠腫瘤完全消退。體重結果顯示不同抗體劑量組對荷瘤小鼠體重
無影響。
因此,本發明抗體對腫瘤有明顯的抑制效果。
本研究利用人源化小鼠模型研究了本發明的抗PD-L1抗體(HZ3266-IgG1N297A)和抗人LAG-3抗體(ADI-31853)聯合使用的抗腫瘤活性。
本研究採用A375(ATCC)人的皮膚癌細胞在NCG小鼠上測定抗PD-L1抗體的抗腫瘤作用。預先靜脈注射人的PBMC(AllCells)(2×106個細胞/小鼠),然後採用皮下接種的方式建立A375荷瘤小鼠模型,成瘤後分組,給予不同抗體的治療,監測給藥期間各組小鼠腫瘤體積和體重變化,給藥頻率為2次/週,給藥2週,共給藥5次。監測頻率均為2次/週,連續監測4週,給藥劑量和方式如下。給藥結束後計算相對腫瘤抑制率(TGI%)。
根據本領域常規方法,將編碼抗LAG-3抗體ADI-31853的輕鏈胺基酸序列和重鏈胺基酸序列(表3)的cDNA分別選殖到表達載體pTT5中。
將含有目標抗體基因的上述表達載體與轉染試劑PEI(Polysciences)按照生產產商提供的方案瞬時轉染培養的人腎胚細胞293細胞(Invitrogen),轉染後,棄去培養基並用新鮮的EXPI293培養基(Gibco)把細胞稀釋到4×106/ml。在37℃,5% CO2的條件下培養細胞7天,每48小時流加新鮮培養基。7天後,1300rpm離心20min。
取上清液,用Protein A純化上清液,使抗體的純度>95%。
採用生物光干涉測量(ForteBio)測定法測定結合人LAG-3(hLAG-3)的ADI31853的平衡解離常數(KD)。ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人,High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)進行。簡言之,傳感器在分析緩衝液中線下平衡30分鐘,然後線上檢測60秒建立基線,在線加載如上所述獲得的經純化的抗體至AHQ傳感器(ForteBio)上進行ForteBio親和測量。再將具有加載的抗體的傳感器暴露於100nM的人LAG-3抗原(ArcoBiosystems)中作用5分鐘,之後將傳感器轉移至分析緩衝液解離5分鐘用於解離速率測量。使用1:1結合模型進行動力學的分析。
NOG小鼠,雌性,7至8週(腫瘤細胞接種時的小鼠週齡),體重17.6至24.2g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠在到達後馴化7天,隨後開始研究。
人的皮膚癌細胞A375(ATCC# CRL-1619)購自ATCC,並嚴格按照ATCC要求進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞,在無菌PBS中重懸細胞並調整細胞密度為30×106個/ml。NOG小鼠已經靜脈注射了人的PBMC(AllCells)後,右側背部剃毛,皮下注射A375細胞0.2ml/隻。腫瘤細胞接種7天後檢測各隻小鼠瘤體積,挑選出瘤平均體積在70至71mm3範圍內的小鼠按瘤體積隨機分組。
每組分別皮下注射如下劑量的抗體:(1)人IgG(equitech-Bio),20mg/kg;(2)LAG-3(ADI-31853),10mg/kg;(3)PD-L1(HZ3266-IgG1N297A),10mg/kg;(4)LAG-3(ADI-31853),10mg/kg+PD-L1(HZ3266-IgG1N297A),10mg/kg。
接種後第7天,將瘤平均體積符合上述要求的小鼠隨機分組,每組8隻。分別用如上四組試劑在第7天、第10天、第14天和第17天為每組小鼠按如上劑量給藥。
分析:在整個研究期間每週測量兩次腫瘤和體重,當腫瘤達到端點時或當小鼠具有>20%體重減輕時,使小鼠安樂死。採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W),腫瘤體積按如下公式計算:V=L×W2/2。將來自每組的小鼠的腫瘤尺寸與時間作圖。使用方差分析(ANOVA)
來確定統計顯著性。<0.05的P值被視為在所有分析中具有統計顯著性。
實驗結果見第7圖,可見抗LAG-3單株抗體ADI-31853(31853)和抗PD-L1單株抗體(HZ3266-IgG1N297A)(HZ3266)聯合使用時與人IgG對照(equitech-Bio)(hIgG)及這兩個抗體分別使用相比,能顯著抑制腫瘤的生長。
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<221> misc_feature
<222> (3)
<223> Xaa可為N、S或T。
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> Xaa可為I or F
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> Xaa可為T或E
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> Xaa可為S、D或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)
<223> Xaa可為G、T或Y
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為T或S
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> Xaa可為S、W or A
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> Xaa可為A
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> Xaa可為S
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> Xaa可為N or T
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> Xaa可為R or V
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> Xaa可為Y或E
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)
<223> Xaa可為T或S
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> Xaa可為Q或H
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> Xaa可為Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> Xaa可為H、Y或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> Xaa可為Y或R
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> Xaa可為S、G或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> Xaa可為P、Y或V
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)
<223> Xaa可為P
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> Xaa可為L、W或Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> Xaa可為T
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 29
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 30
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 31
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 34
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 35
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 38
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 39
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 40
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 41
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 42
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 43
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 44
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 45
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 46
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 47
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 48
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 49
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 51
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 60
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 61
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 62
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 63
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 64
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 65
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 66
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 67
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 75
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 76
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 77
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<210> 78
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
該代表圖無元件符號及其代表之意義。
Claims (47)
- 一種結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段,該抗體包含重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,以及輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR,其中(i)HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或由其組成,HCDR2包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列或由其組成,HCDR3包含SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列或由其組成,LCDR1包含SEQ ID NO:14所示的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成,LCDR2包含SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列或由其組成,且LCDR3包含SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列或由其組成。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體包含輕鏈可變區和/或重鏈可變區,其中,(i)重鏈可變區包含SEQ ID NO:26的胺基酸序列或由其組成;和輕鏈可變區包含SEQ ID NO:32的胺基酸序列或由其組成;(ii)重鏈可變區包含SEQ ID NO:30的胺基酸序列或由其組成;和輕鏈可變區包含SEQ ID NO:36的胺基酸序列或由其組成。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體包含(a)重鏈 包含SEQ ID NO:38的胺基酸序列或由其組成;和/或(b)輕鏈包含SEQ ID NO:46的胺基酸序列或由其組成;或者(a)重鏈包含SEQ ID NO:42的胺基酸序列或由其組成;和(b)輕鏈包含SEQ ID NO:50的胺基酸序列或由其組成;或者(a)重鏈包含SEQ ID NO:43的胺基酸序列或由其組成;和(b)輕鏈包含SEQ ID NO:50的胺基酸序列或由其組成;或者(a)重鏈包含SEQ ID NO:44的胺基酸序列或由其組成;和(b)輕鏈包含SEQ ID NO:50的胺基酸序列或由其組成。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其具有以下一個或多個特性:(1)以高親和力結合人PD-L1以以下平衡解離常數(KD)與PD-L1結合,該KD小於大約2nM;(2)結合表達人PD-L1的細胞,以小於或等於大約 2nM的EC50;(3)阻斷PD-L1的相關活性,以小於或等於大約0.7nM的EC50;(4)提高T細胞功能;(5)提高T細胞增殖;(6)提高IFN-γ分泌;(7)提高IL-2分泌;(8)在Zenix柱檢測法中,駐留時間(RT)低於大約10分鐘;(9)抑制PD-L1的一種或多種活性;(10)能夠誘發抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);(11)顯示與如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的任一抗體對PD-L1相同或相似的結合親和力和/或特異性;(12)競爭性抑制如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的任一抗體與PD-L1的結合;(13)與如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的任一抗體結合相同或重疊的表位;(14)與如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的任一抗體競爭結合PD-L1;(15)具有如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的任一抗體分子的一個或多個生物學特性。
- 如申請專利範圍第3項所述的抗體或其抗原結合片段, 其中,抑制PD-L1的一種或多種活性包含導致以下一者或多者:腫瘤浸潤型淋巴細胞增加、T細胞受體介導的增殖增加、或癌細胞的免疫逃避減少。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體是IgG1形式的或IgG4形式的抗體或抗原結合片段和/或該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含κ輕鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第6項所述的抗體或其抗原結合片段,其中κ輕鏈恆定區為人κ輕鏈恆定區。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體是單株抗體。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗體是人源化的抗體或人抗體或嵌合抗體。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗原結合片段是選自以下的抗體片段:Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體、(Fab’)2片段、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。
- 如申請專利範圍第10項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該抗原結合片段是scFv。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其抗原結合片段,其中該抗體是雙特異性或多特異性抗體。
- 如申請專利範圍第12項所述的抗體或其抗原結合片段,其中,該雙特異性抗體分子與PD-L1和LAG-3結合。
- 一種分離的核酸,其編碼如申請專利範圍第1至13項 中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種包含如申請專利範圍第14項所述的核酸的載體。
- 一種包含如申請專利範圍第14項所述的核酸或如申請專利範圍第15項所述的載體的宿主細胞。
- 一種製備結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段的方法,該方法包含在適於表達編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的核酸的條件下培養如申請專利範圍第16項所述的宿主細胞。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法,其還包含分離該抗體或其抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第17項所述的方法,其還包含從該宿主細胞回收該結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
- 一種免疫綴合物,其包含如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段和其它物質。
- 如申請專利範圍第20項所述的免疫綴合物,其中所述其他物質為細胞毒性劑。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第20或21項所述的免疫綴合物。
- 如申請專利範圍第22項所述的醫藥組成物,其還包含藥用輔料。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第20或21項所述的免疫綴合物,以及其它治療劑。
- 如申請專利範圍第24項所述的醫藥組成物,其中,該其它治療劑選自化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑或免疫調節劑。
- 如申請專利範圍第25項所述的醫藥組成物,其中,該抗體為結合人的LAG-3抗體。
- 如申請專利範圍第26項所述的醫藥組成物,其中,該抗LAG-3抗體為人的抗LAG-3抗體。
- 如申請專利範圍第26或27項所述的醫藥組成物,其中,該抗LAG-3抗體包含(i)如SEQ ID NO:75所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,和/或(ii)如SEQ ID NO:76所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
- 如申請專利範圍第26或27項所述的醫藥組成物,其中,該抗LAG-3抗體包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL),其中(i)該VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3,其中HCDR1包含SEQ ID NO:69的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成;HCDR2包含選自SEQ ID NO:70的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:71的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;和/或(ii)其中該VL包含互補決定區域(CDR)LCDR1、 LCDR2和LCDR3,其中LCDR1包含SEQ ID NO:72的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:73的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;LCDR3包含選自SEQ ID NO:74的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如申請專利範圍第25項所述的醫藥組成物,其中,該免疫調節劑為共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑。
- 如申請專利範圍第24至27項和第30項中任一項所述的醫藥組成物,其還包含藥用輔料。
- 一種有效量的如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第20或21項所述的免疫綴合物的用途,其用在製備用於在受試者中治療受試者或個體腫瘤或感染性疾病的藥物。
- 一種有效量的如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第20或21項所述的免疫綴合物或如申請專利範圍第22或23項所述的醫藥組成物以及結合人的抗LAG-3抗體的用途,其用在製備藥物,其中該藥物用於在受試者中治療受試者或個體腫瘤或感染性疾病。
- 如申請專利範圍第33項所述的用途,其中,該抗LAG-3抗體為人源化的抗體。
- 如申請專利範圍第32至34項中任一項所述的用途,其中,該腫瘤是癌症或者該感染性疾病是慢性感染。
- 如申請專利範圍第35項所述的用途,其中,該癌症是胃腸道癌症。
- 如申請專利範圍第36項所述的用途,其中,該胃腸道癌症是結腸癌。
- 如申請專利範圍第32或33項所述的用途,其中,該藥物還能夠聯合施用一種或多種其它療法。
- 如申請專利範圍第38項所述的用途,其中,該療法包括治療方式和/或其它治療劑。
- 如申請專利範圍第39項所述的用途,其中,該治療方式包含手術治療和/或放射療法,或者該治療劑選自化療劑、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、其它抗體或免疫調節劑。
- 如申請專利範圍第40項所述的用途,其中,該結合抗體為結合人的抗LAG-3抗體。
- 如申請專利範圍第40或41項所述的用途,其中,該抗LAG-3抗體為人源化的抗體。
- 如申請專利範圍第40或41項所述的用途,其中,該抗LAG-3抗體包含(i)如SEQ ID NO:75所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR,和/或(ii)如SEQ ID NO:76所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
- 如申請專利範圍第40或41項所述的用途,其中,該抗LAG-3抗體包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL), 其中(i)該VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3,其中HCDR1包含SEQ ID NO:69的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成;HCDR2包含選自SEQ ID NO:70的胺基酸序列,或由該胺基酸序列組成;HCDR3包含SEQ ID NO:71的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;和/或(ii)其中該VL包含互補決定區域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中LCDR1包含SEQ ID NO:72的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;LCDR2包含SEQ ID NO:73的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成;LCDR3包含選自SEQ ID NO:74的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如申請專利範圍第40項所述的用途,其中,該免疫調節劑是共刺激分子的激活劑或免疫檢查點分子的抑制劑。
- 一種檢測樣品中PD-L1的方法,該方法包含(a)將樣品與如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段接觸;和(b)檢測結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段和PD-L1間的複合物的形成。
- 如申請專利範圍第46項所述的方法,其中,抗PD-L1抗體是被可檢測地標記的。
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