BR112020007725A2 - anticorpo anti-pd-l1 e usos do mesmo - Google Patents

Abstract

A invenção se refere a um novo anticorpo e um fragmento de anticorpo que se liga especificamente a PD-L1 e uma composição compreendendo o anticorpo ou o fragmento de anticorpo. Além disso, a invenção se refere a um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo, uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico e um uso relacionado. Além disso, a invenção se refere a um uso terapêutico e diagnóstico desses anticorpos e fragmentos de anticorpos. Particularmente, a invenção se refere a um tratamento combinado desses anticorpos e fragmentos de anticorpos com outras terapias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “ANTICORPO ANTI-PD-L1 E USOS DO MESMO”

[0001] A invenção se refere a um novo anticorpo e um fragmento de anticorpo que se liga especificamente a PD-L1 eauma composição compreendendo o anticorpo ou o fragmento de anticorpo. Além disso, a invenção se refere a um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo, uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico e usos relacionados. Além disso, a invenção se refere a usos terapêuticos e de diagnóstico desses anticorpos e fragmentos de anticorpos. Em particular, a invenção se refere a terapias combinadas desses anticorpos e fragmentos de anticorpos com outras terapias, como modalidades ou agentes terapêuticos.

ANTECEDENTES

[0002] O ligante de morte programado 1 (PD-L1) é uma proteína envolvida na supressão das respostas do sistema imunológico durante infecções crônicas, gravidez, aloenxertos de tecidos, doenças autoimunes e câncer. PD-L1 regula as respostas imunes pela ligação a um receptor inibitório chamado morte programada 1 (PD-l), que é expressa na superfície das células T, células B e monócitos. PD-L1 também regula negativamente as funções das células T através da interação com outro receptor B7.1 (também conhecido como B7-1 ou CD80). A formação dos complexos PD-L1/PD-l e PD-

L1/B7.1 regula negativamente a sinalização do receptor de células T, levando a subsequente regulação negativa da ativação de células T e inibição da atividade imune antitumoral. A PD-Ll é superexpressa em muitos cânceres, incluindo uma variedade de tumores sólidos, como tumores da bexiga, tumores da mama, tumores do cólon, tumores do pulmão, melanomas, tumores do ovário, tumores salivares, tumores do estômago e tumores da tireoide. A superexpressão de PD-L1 em células tumorais pode promover invasão tumoral e é frequentemente associada a um mau prognóstico.

[0003] Portanto, ainda há uma necessidade na técnica de novos anticorpos anti-PD-Ll que se liguem melhor ao PD- L1 e tenham boa capacidade de drenagem.

SUMÁRIO

[0004] É divulgada aqui uma molécula de anticorpo que se liga ao PD-Ll. Também é fornecido um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o fragmento de anticorpo do mesmo, e um vetor de expressão, uma célula hospedeira e um método para produzir a molécula de anticorpo. Também é fornecido um imunoconjugado compreendendo uma molécula de anticorpo anti-PD-L1, uma molécula de anticorpo multiespecífico ou biespecífico e uma composição farmacêutica. A molécula de anticorpo anti-PD-Ll1 aqui divulgada pode ser usada sozinha ou em combinação com outras terapias, como agentes ou modalidades terapêuticas, para tratar, prevenir e/ou diagnosticar doenças tumorais e doenças infecciosas. Além disso, são aqui divulgados uma composição e um método para detectar PD-Ll, e um método para prevenir ou tratar uma variedade de doenças, incluindo tumores e/ou doenças infecciosas, utilizando a molécula de anticorpo anti-PD-L1.

[0005] Portanto, em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção (especificamente) se liga a PD-Ll. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção (especificamente) se liga à PD-L1 humana.

[0006] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll1 ou fragmento do mesmo da invenção se liga a PD-L1 (por exemplo, PD-Ll humano) com alta afinidade, por exemplo, se liga a PD-L1 com constantes de dissociação de equilíbrio (Kr) inferior a cerca de 50 nM, preferencialmente menor ou igual a cerca de 20 nM, mais preferencialmente menor ou igual a cerca de 15 nM, mais preferencialmente menor ou igual a cerca de 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM ou 2 nM e, mais preferencialmente, menor ou igual a cerca de 1,5 nM, 1,4 nM, 1,3 nM, 1,2 nM, 1,1 nM, 1 nM, 0,9 nM ou 0,8 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 da invenção se liga a PD-Ll com um Ko de 0,1-10 nM, preferencialmente 0,5- nM, mais preferencialmente 0,6-10 nM, 0,7-8 nM e 0,7-5 nM e mais preferencialmente 0,5-1,5 nM, 0,7-1,5 nM e 0,7-1 nM. Em algumas modalidades, o PD-L1 é um PD-L1 humano. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação ao anticorpo é determinada usando interferometria ótica biológica (por exemplo, medição de afinidade de Fortebio).

[0007] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção se liga a células que expressam PD-Ll1 humana, por exemplo, com uma ECso menor ou igual a cerca de 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,9 nM, 2,8 nM, 2,7 nM, 2,6 nM, 2,5 nM, 2,4 nM, 2,3 nM, 2,2 nM, 2,1 nM, 2 nM, 1,9 nM, 1,8 nM, 1,7 nM ou 1,6 nM. Em algumas modalidades, a ligação é determinada usando citometria de fluxo (por exemplo, FACS). Em algumas modalidades, a célula que expressa PD-L1l humana é uma célula CHO que expressa PD-Ll humana.

[0008] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção bloqueia atividades relevantes de PD-Ll, por exemplo, com um ECso menor ou igual a cerca de 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM ou 0,7 nM, e de preferência 0,1-1 nM, 0,5-1 nM, 0,6-1 nM, 0,6 nM, 0,7 nM, 0,8 nM, 0,9 nM ou 1 nM. Em algumas modalidades, a atividade relevante de PD-L1 é a ligação de PD-L1 a PD-l. Em algumas modalidades, oO anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção inibe a ligação de PD-Ll1 a PD-1 com um EC50 menor ou igual a cerca de 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM ou 0,7 nM e, de preferência 0,1-1 nM, 0,5-1 nM, 0,6-1 nM, 0,6 nM, 0,7 nM,

0,8 nM, 0,9 nM ou 1 nM em um ensaio MOA. Em algumas modalidades, a célula é uma célula CHO.

[0009] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção aumenta as funções das células T. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção aumenta a proliferação de células T. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção aumenta a secreção de IFN-y. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção aumenta a secreção de IL-2. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção aumenta a secreção de IFN-y e a secreção de IL-2. Em algumas modalidades, o aumento é determinado em uma reação linfocitária mista (MLR). Em algumas modalidades, a capacidade do anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção para ativar células T é superior aos anticorpos anti-PD-Ll conhecidos, como o Tecentriq.

[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção é menos viscoso do que o anticorpo anti-PD-Ll conhecido (por exemplo, Tecentrig) e, portanto, possui melhor capacidade de drenagem. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção tem um tempo de retenção (RT) inferior a cerca de 10 minutos, cerca de 9 minutos ou cerca de 8 minutos, preferencialmente, cerca de 7 a 9 minutos e, de preferência, cerca de 7 a 8,5 minutos, cerca de 7,5 a 8,5 minutos, cerca de 7 a 8 minutos ou cerca de 7,5 a 8 minutos, tal como cerca de 7,5 minutos, 7,6 minutos, 7,7 minutos, 7,8 minutos, 7,9 minutos, 8 minutos, 8,1 minutos, 8,2 minutos, 8,3 minutos, 8,4 minutos, 8,5 minutos, em cromatografia em coluna Zenix.

[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção inibe uma ou mais atividades de PD-Ll, por exemplo, causando um ou mais dos seguintes: aumento de linfócitos infiltrantes de tumor, aumento da proliferação mediada por receptor de célula T ou diminuição evasão imunológica das células cancerígenas.

[0012] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 ou o seu fragmento da invenção pode induzir citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).

[0013] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 da invenção, sozinho ou em combinação com outras terapias (por exemplo, modalidades terapêuticas e/ou agentes), é eficaz no tratamento de tumores (por exemplo, câncer) ou infecções (por exemplo, infecção crônica) ) Em algumas modalidades, o tumor é uma fuga imune do tumor. Em algumas modalidades, o tumor é câncer. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor gastrointestinal. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de cólon.

[0014] Em algumas modalidades, a cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo anti-PD-Ll ou fragmento do mesmo da invenção compreende ainda uma sequência peptídica de sinal, como METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 68).

[0015] Em algumas modalidades, o anticorpo da invenção também abrange variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo anti-PD-Ll, bem como anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos anti-PD-Ll ou seus fragmentos descritos acima.

[0016] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll1 da invenção compreende ainda uma região constante humana ou murina. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 da invenção é um anticorpo na forma de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, Igal, IgaA2, IgD ou IgE. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-Ll da invenção compreende uma região constante da cadeia pesada selecionada do grupo que consiste em regiões constantes da cadeia pesada de, por exemplo, IgGl, I19g9G2, IgG3, IgG4, IgM, Igal, IgA2, IgD e IgE; particularmente, selecionado do grupo que consiste em regiões constantes da cadeia pesada de, por exemplo, IgGl, IgG2, Ig63g e IgG4 e, mais particularmente, uma região constante da cadeia pesada de IgGl ou IgG4, como uma região constante da cadeia pesada da IgGl humana ou IgG4. Em uma modalidade, a região constante da cadeia pesada é uma região constante da cadeia pesada de IgGl humana ou IgG4 humana. Em algumas modalidades, a região constante murina compreendida no anticorpo anti-PD-Ll1 da invenção é selecionada do grupo que consiste em IgGl, IgG2A, IgG2B e IgG3.

[0017] Em outra modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll1 da invenção tem uma região constante da cadeia leve selecionada a partir de, por exemplo, uma região constante da cadeia leve kappa ou lambda, e preferencialmente uma região constante da cadeia leve kappa (por exemplo, kappa humano).

[0018] Em outra modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll1l compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG4 (por exemplo, IgG4 humana). Em uma modalidade, o IgG4 humano compreende uma substituição na posição 228 de acordo com a numeração da UE (por exemplo, uma substituição de Ser para Pro). Em outra modalidade, a IgG4 humana contém uma mutação para AA nas posições 114-115 (numeração EU) (Armour KLl1, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM, Williamson LM, Eur J Immunol., Agosto de 1999; 29 (8): 2613 -24, moléculas de IgG humanas recombinantes sem atividades de ligação ao receptor de Fc gamma I e de ativação de monócitos). Em outra modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll1 compreende uma região constante da cadeia pesada de IgGl (por exemplo, IgGl humana). Em uma modalidade, a IgGl humana compreende uma substituição na posição 297 de acordo com a numeração da UE (por exemplo, uma substituição de Asn para Ala). Em uma modalidade, a IgGl humana compreende uma substituição na posição 265 de acordo com a numeração da UE, uma substituição na posição 329 de acordo com a numeração da UE, ou ambas (por exemplo, uma substituição de Asp por Ala na posição 265 de acordo com a numeração da UE e/ou um substituição de Pro por Ala na posição 329 de acordo com a numeração da UE). Em uma modalidade, a IgGl humana compreende uma substituição na posição 234 de acordo com a numeração da UE, uma substituição na posição 235 de acordo com a numeração da UE, ou ambas (por exemplo, uma substituição de Leu a Ala na posição 234 de acordo com a numeração da UE e/ou um substituição de Leu por Ala na posição 235 de acordo com a numeração da UE). Em uma modalidade, a região constante da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos, como mostrado nas SEQ ID NOs: 64, 65 ou 66, ou uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade para o mesmo ou consiste na sequência.

[0019] Em outra modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região constante da cadeia leve kappa, por exemplo, uma região constante da cadeia leve kappa humana. Em uma modalidade, a região constante da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 67, ou uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade para o mesmo ou consiste na sequência.

[0020] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll compreende uma região constante de cadeia pesada de IgGl (por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de IgGl humana) e uma região constante de cadeia leve kappa (por exemplo, uma região constante de cadeia leve kappa humana). Em uma modalidade, a IgGl humana compreende uma substituição na posição 297 de acordo com à numeração da UE (por exemplo, uma substituição de Asn para Ala). Em alguma modalidade, a região constante da cadeia pesada de IgGl compreende uma sequência de aminoácidos, como mostrado nas SEQ ID NOs: 64 ou 65, ou uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade para o mesmo ou consiste na sequência. Em uma modalidade, a região constante da cadeia leve kappa humana compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 67, ou uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade para o mesmo ou consiste na sequência.

[0021] Em outra modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região constante da cadeia pesada de IgG4 (por exemplo, uma região constante da cadeia pesada de IgG4 humana) e uma região constante da cadeia leve kappa (por exemplo, uma região constante da cadeia leve kappa humana). Em uma modalidade, a região constante é uma região constante de IgG4 mutada, por exemplo, uma região constante de IgG4 humana mutada (por exemplo, tendo uma mutação na posição 228 de acordo com à numeração da UE, como à mutação S228P e/ou tendo uma mutação para AA em posições 114-115 (numeração da UE)). Em alguma modalidade, a região constante da cadeia pesada de IgG4 compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 66, ou uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade para o mesmo ou consiste na sequência. Em uma modalidade, a região constante da cadeia leve kappa humana compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 67, ou uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade para o mesmo ou consiste na sequência.

[0022] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll1 é isolada ou recombinante.

[0023] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo de monoespecificidade. A molécula de anticorpo anti-PD-L1 também pode ser uma molécula de anticorpo humanizado, quimérico ou humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-Ll1 é um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da sequência estrutural do anticorpo anti-PD-Ll é uma sequência estrutural de consenso humano. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 da invenção também compreende um fragmento de anticorpo do mesmo, preferencialmente um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em: Fab, Fab', Fab'-Fab'-SH, Fv, fragmento variável de cadeia única (por exemplo, scFv) ou (Fab')2, anticorpo de domínio único, diacorpo (dAb) ou anticorpo linear.

[0024] Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll está na forma de uma molécula de anticorpo biespecífica ou multiespecífica. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífica tem uma primeira especificidade de ligação para PD-L1 e uma segunda especificidade de ligação para LAG-3. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífico se liga a PD-L1 e LAG-3. A molécula de anticorpo multiespecífica pode ter qualquer combinação de especificidades de ligação para PD-L1 e outros alvos.

[0025] Em um aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 acima ou seus fragmentos. Em uma modalidade, é fornecido um vetor compreendendo o ácido nucleico. Em uma modalidade, o vetor é um vetor de expressão. Em uma modalidade, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico ou o vetor. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica.

Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada a partir de células de levedura, células de mamífero (por exemplo, células CHO ou células 293) ou outras células adequadas para a preparação de um anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em outra modalidade, a célula hospedeira é procariótica, como uma célula de E. coli.

[0026] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a preparação do anticorpo anti-PD-Ll ou fragmento do mesmo (preferencialmente fragmento de ligação ao antígeno), em que o método compreende incubar a célula hospedeira em condições adequadas para a expressão de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo (preferencialmente fragmento de ligação ao antígeno) e, opcionalmente, isolar o anticorpo ou fragmento do mesmo (preferencialmente fragmento de ligação ao antígeno). Em uma certa modalidade, o método compreende ainda recuperar o anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo (preferencialmente fragmento de ligação ao antígeno) da célula hospedeira.

[0027] Em algumas modalidades, a invenção fornece um imunoconjugado compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1 aqui fornecidos e outras substâncias, como um agente citotóxico ou um marcador. Em algumas modalidades, o imunoconjugado é usado para prevenir ou tratar tumores (por exemplo, câncer) ou doenças infecciosas. Em algumas modalidades, o tumor é uma fuga imune do tumor. De preferência, o tumor é um tumor gastrointestinal (por exemplo, câncer), tal como o câncer de cólon. De preferência, a doença infecciosa é uma infecção crônica.

[0028] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1l ou seus fragmentos (preferencialmente os fragmentos de ligação ao antígeno), ou os imunoconjugados descritos aqui, em que, preferencialmente, a composição é uma composição farmacêutica. Em uma modalidade, a composição compreende ainda materiais complementares farmacêuticos. Em uma modalidade, a composição, por exemplo, a composição farmacêutica, compreende o anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo da invenção ou o seu imunoconjugado, e uma combinação de um ou mais outros agentes terapêuticos (por exemplo, agentes quimioterápicos, outros anticorpos, agentes citotóxicos, vacinas, agentes anti-infecciosos ativos ou imunomoduladores, como ativadores de moléculas coestimuladoras ou inibidores de moléculas de pontos de verificação imune).

[0029] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é usada para prevenir ou tratar tumores (por exemplo, câncer) ou infecções. Em algumas modalidades, o tumor é uma fuga imune do tumor. De preferência, o tumor é um tumor gastrointestinal (por exemplo, câncer), como o câncer de cólon. De preferência, a doença infecciosa é uma infecção crônica. Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para prevenir ou tratar um tumor (por exemplo, câncer) ou uma doença infecciosa em um sujeito ou indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de qualquer anticorpo anti-PD-Lls ou seus fragmentos, composições farmacêuticas ou imunoconjugados aqui descritos. Em algumas modalidades, o tumor é uma fuga imune do tumor. Em uma modalidade, o tumor é um tumor gastrointestinal (por exemplo, câncer), como o câncer de cólon. Em uma modalidade, a doença infecciosa é uma infecção crônica. Em outro aspecto, a invenção também se refere ao uso de qualquer um dos anticorpos anti-PD-Ll ou seus fragmentos aqui descritos para a preparação de um medicamento para o tratamento de tumores (por exemplo, câncer) ou infecções em um indivíduo. Em algumas modalidades, o tumor é uma fuga imune do tumor. Em uma modalidade, o tumor é um tumor gastrointestinal (por exemplo, câncer), como o câncer de cólon. Em uma modalidade, a doença infecciosa é uma infecção crônica.

[0030] Em algumas modalidades adicionais, o método de prevenção ou tratamento descrito neste documento compreende ainda a administração de uma ou mais terapias (por exemplo, modalidades terapêuticas e/ou outros agentes terapêuticos) ao sujeito ou indivíduo. Em algumas modalidades, a modalidade terapêutica inclui tratamentos cirúrgicos e/ou terapias de radiação. Em algumas modalidades, outros agentes terapêuticos são selecionados do grupo que consiste em agentes quimioterápicos, agentes citotóxicos, vacinas, agentes ativos anti-infecciosos, outros anticorpos e imunomoduladores (por exemplo, ativadores de moléculas coestimuladoras ou inibidores da molécula de pontos de verificação imune).

[0031] Em algumas modalidades, o sujeito ou indivíduo é um animal não humano, como um mamífero, preferencialmente um humano.

[0032] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para detectar PD-L1 em uma amostra, compreendendo (a) contatar a amostra com qualquer um dos anticorpos anti-PD- Ll1 ou fragmentos dos mesmos aqui descritos; e (b) detectar a formação do complexo dos anticorpos anti-PD-Ll ou seus fragmentos e PD-Ll. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD- L1 é marcado de forma detectável.

[0033] Em algumas modalidades, a invenção se refere a um kit ou artefato compreendendo o anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo aqui descrito. Em algumas modalidades, o kit ou artefato compreende o anticorpo anti-PD-Ll1 ou fragmento do mesmo aqui descrito e materiais complementares farmacêuticos opcionais. Em algumas modalidades, o kit ou artefato compreende ainda instruções para administrar o medicamento para tratar um tumor ou infecção.

[0034] A invenção também abrange qualquer combinação de qualquer uma das modalidades descritas neste documento. Qualquer uma das modalidades descritas neste documento ou qualquer combinação dos mesmos é/é aplicável a todo e qualquer anticorpo anti-PD-Ll ou fragmentos dos mesmos, métodos e usos da invenção aqui descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0035] A Figura 1 mostra a ligação do anticorpo anti- PD-L1 da invenção a células CHO-PDL1 determinadas por FACS.

[0036] A Figura 2 mostra a ligação do anticorpo anti- PD-L1 da invenção a células CHO-PDL1 determinadas por FACS.

[0037] A Figura 3 mostra a atividade de bloqueio do anticorpo da invenção contra a interação PD-1/PD-L1 determinada pelo ensaio MOA.

[0038] As Figuras 4A e 4B mostram a ativação de células T (expressão relativa de IL-2) pelo anticorpo da invenção determinado pelo teste de MLR.

[0039] As Figuras 5A e 5B mostram a ativação de células T (expressão relativa de IFN-y) pelo anticorpo da invenção determinado pelo teste de MIR.

[0040] A Figura 6 mostra o efeito inibidor do anticorpo da invenção em tumores.

[0041] A Figura 7 mostra o efeito inibitório do anticorpo da invenção em combinação com um anticorpo anti- LAG-3.

DESCRIÇÃO DETALHADA Abreviações

[0042] Salvo indicação em contrário, as abreviações nesta especificação têm os seguintes significados:

[0043] As seguintes abreviações são usadas: ADCC — Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos CDC — Citotoxicidade dependente do complemento CDR -—- Região determinante de complementaridade em região variável de imunoglobulina CHO — Ovário de hamster chinês ECso — Uma concentração que resulta em 50% de potência ou ligação Ko — Constante de dissociação de equilíbrio ELISA — Ensaio imunossorvente ligado a enzima FACS — Classificação celular ativada por fluorescência MOA — Mecanismo de ação MLR - Reação linfocitária mista FR —- Região da estrutura do anticorpo ICs5o — Uma concentração que produz 50% de inibição Ig -— Imunoglobulina

Kabat - Alinhamento de imunoglobulina e sistema de numeração estabelecidos por Elvin A. Kabat ((1991) Sequências de proteínas de interesse imunológico, 5º Edição Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) mAb/Mab/MAb — Anticorpo monoclonal PCR —- Reação em cadeia da polimerase IFN — Interferon VL — Região variável de cadeia leve VH — Região variável de cadeia pesada LC — Cadeia leve HC — Corrente pesada HCDR -—- Região determinante complementar da cadeia pesada LCDR —- Região determinante complementar da cadeia leve Definição

[0044] Antes de a invenção ser descrita em detalhes abaixo, deve-se entender que a invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos aqui descritos, pois estes podem variar. Deverá também ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido pelos especialistas na técnica a que a invenção pertence.

[0045] Com o objetivo de explicar esta especificação, as seguintes definições serão usadas e, sempre que apropriado, os termos usados no singular também podem incluir o plural e vice-versa. Entende-se que a terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares e não se destina a ser limitativa.

[0046] O termo "cerca de" usados em combinação com um valor numérico pretende abranger os valores numéricos de um limite inferior a 5% ao valor numérico especificado, até um limite superior a 5% no valor numérico especificado.

[0047] "Afinidade" se refere à força da soma total de todas as interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, quando usada aqui, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, um anticorpo e um antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação de equilíbrio (Ko). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles conhecidos na técnica anterior e aqui descritos.

[0048] os termos "ligante de morte celular programada 1", "PD-Ll1", "ligante de morte programada 1", "aglomerado de diferenciação 274", "CD274" ou "homólogo 1 de B7", conforme usados aqui, se referem a qualquer PD- Ll1 de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e camundongos). Os termos abrangem "comprimento total", PD-Ll1l não processado e PD-Ll1 de qualquer forma que resulte do processamento na célula. PD-L1 pode se apresentar como uma proteína transmembranar ou como uma proteína solúvel. Os termos também abrangem variantes de PD-Ll de ocorrência natural, como variantes de emenda ou variantes alélicas. A estrutura básica do PD-Ll1 inclui quatro domínios: um domínio do tipo V extracelular do tipo Ig e um domínio do tipo C2 do tipo Ig, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático. Informações adicionais sobre o gene PD-L1 humano, incluindo sequências de DNA genômico, podem ser encontradas no NCBI Gene ID No. 29126. Informações adicionais sobre o gene PD-Ll humano, incluindo sequências de DNA genômico, podem ser encontradas no NCBI Gene ID No 60533. O amino a sequência ácida de uma proteína PD-Ll humana exemplar pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso NCBI NP 001254653 ou o número de acesso UniProt Q9NZQ7, ea sequência de uma proteína PD-Ll de camundongo exemplar pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso NCBI NP 068693 ou número de acesso Uniprot Q9EP73.

[0049] Os termos "anticorpo anti-PD-L1", "anticorpo anti-PD-L1", "anticorpo PD-L1" ou "anticorpo de ligação PD- Ll1", conforme aqui utilizados, se referem a anticorpos capazes de se ligar à proteína PD-Ll com afinidade suficiente, ou seus fragmentos. Em uma modalidade, a extensão em que o anticorpo anti-PD-L1 se liga a uma proteína não PD- L1 é inferior a cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% ou mais da extensão em que o anticorpo se liga a uma proteína PD-Ll, conforme medido, por exemplo, por radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de interferência bio- ótica ou ensaio de MSD.

[0050] Como aqui utilizado, "anticorpo monoclonal" ou "mAb" ou "Mab" se refere a um anticorpo de uma única cópia ou clone derivado de, por exemplo, um clone eucariótico procariótico ou fago, e não o método pelo qual são produzidos. Os anticorpos monoclonais ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser produzidos, por exemplo, por tecnologia de hibridoma, tecnologia recombinante, tecnologia de exibição de fagos, tecnologia sintética, como enxerto de CDR, ou uma combinação dessas ou de outras técnicas conhecidas na técnica.

[0051] "Anticorpo nativo" se refere a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente de diferentes estruturas. Por exemplo, um anticorpo IgG nativo é uma glicoproteína heterotetramérica de cerca de 150.000 Daltons, consistindo em duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas ligadas a uma ligação dissulfeto. Do terminal N ao C, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também denominada domínio pesado variável ou domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CHl, CH2 e CH3). Da mesma forma, dos terminais N a C, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também denominada domínio leve variável ou domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve do anticorpo pode ser atribuída a um dos dois tipos, chamados kappa (x) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante. "Região Fc da sequência nativa" inclui a sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos das regiões Fc encontradas na natureza. A região Fc humana da sequência nativa inclui: a região Fc IgGl humana da sequência nativa (alotipos não-A e A), a região Fc IgG2 humana da sequência nativa, a região E IgG3 humana da sequência nativa e a região Fc IgG4 humana da sequência nativa, e variantes naturais dos anteriores.

[0052] "Fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto, que compreende uma porção do anticorpo intacto e se liga a um antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, EFv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; anticorpos de cadeia simples (por exemplo, scFv); anticorpos de domínio único; anticorpos bivalentes ou biespecíficos ou seus fragmentos; anticorpos camelídeos; e anticorpos biespecíficos ou anticorpos multiespecíficos formados a partir dos fragmentos de anticorpo.

[0053] Como aqui utilizado, o termo "epítopo" se refere a porções de um antígeno (por exemplo, PD-L1l humano) que interagem especificamente com uma molécula de anticorpo. Tais porções (aqui referidas como determinante antigênico) geralmente compreendem, ou fazem parte de elementos como cadeias laterais de aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar. O determinante antigênico pode ser definido usando métodos conhecidos na técnica ou aqui divulgados (por exemplo, por cristalografia ou por troca de hidrogênio- deutério). Pelo menos uma ou algumas porções da molécula de anticorpo que interagem especificamente com o determinante antigênico estão geralmente localizadas dentro das CDRs. Geralmente, um epítopo possui características estruturais tridimensionais específicas. Geralmente, um epítopo possui características de carga específicas. Alguns epítopos são epítopos lineares, enquanto outros são epítopos conformacionais.

[0054] "Anticorpo que se liga ao mesmo epítopo ou sobreposição" como um anticorpo de referência se refere a um anticorpo que bloqueia 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% ou mais da ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição ou, inversamente, o anticorpo de referência que bloqueia 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% ou mais da ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição.

[0055] Um anticorpo que compete com um anticorpo de referência para se ligar ao seu antígeno se refere a um anticorpo que bloqueia 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% ou mais da ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um ensaio de competição. Por outro lado, o anticorpo de referência bloqueia 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% ou mais da ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição. Vários tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinar se um anticorpo compete com outro, como radioimunoensaio em fase sólida direta Ou indireta (RIA), imunoensaio enzimático em fase sólida (EIA) direto ou indireto, ensaio de competição em sanduíche (ver, por exemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253).

[0056] Um anticorpo que inibe (por exemplo, inibe competitivamente) a ligação de um anticorpo de referência ao seu antígeno se refere a um anticorpo que inibe 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% ou mais da ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno. Por outro lado, o anticorpo de referência inibe 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% ou mais da ligação do anticorpo ao seu antígeno. A ligação de um anticorpo ao seu antígeno pode ser medida por afinidade (por exemplo, constante de dissociação de equilíbrio). Os métodos para determinar a afinidade são conhecidos na técnica.

[0057] Um anticorpo que mostra a mesma afinidade ou/ou especificidade de ligação semelhante ou similar a um anticorpo de referência se refere a um anticorpo capaz de ter pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% ou mais de a afinidade de ligação e/ou especificidade do anticorpo de referência. Isto pode ser determinado por quaisquer métodos conhecidos na técnica para determinar a afinidade e/ou especificidade de ligação.

[0058] "Região determinante de complementaridade" ou "região CDR" ou "CDR" é uma região em um domínio variável de anticorpo que é altamente variável em sequência e forma um loop estruturalmente definido ("loop hipervariável") e/ou compreende resíduos de contato com antígeno ("ponto de contato do antígeno"). As CDRs são as principais responsáveis pela ligação aos epítopos. As CDRs das cadeias pesada e leve são geralmente denominadas CDR1, CDR2 e CDR3 e são numeradas sequencialmente a partir do terminal N.

As CDRs localizadas no domínio variável das cadeias pesadas de anticorpos são referidas como HCDRlI, HCDR2 e HCDR3, enquanto as CDRs localizadas no domínio variável das cadeias leves de anticorpos são referidas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3. Em uma determinada sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve ou de uma região variável de cadeia pesada, o limite exato da sequência de aminoácidos de cada CDR pode ser determinado usando qualquer um ou uma combinação de muitos sistemas bem conhecidos de atribuição de CDR de anticorpos, incluindo, por exemplo, Chothia, com base na estrutura tridimensional dos anticorpos e na topologia das alças CDR (Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883; Al- Lazikani et al., "Conformações padrão para as estruturas canônicas das imunoglobulinas", Journal of Molecular Biology, 273: 2927-948 (1997) ), Kabat com base na variabilidade da sequência de anticorpos (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4º edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Institutos Nacionais de Saúde (1987)), ADM (University of Bath), Contact (University College London), banco de dados internacional ImMunoGeneTics (IMGT) (imgt.cines.fr/ na World Wide Web) e definição de CDR do Norte com base no cluster de propagação de afinidade usando um grande número de cr estruturas ystal.

[0059] Por exemplo, de acordo com diferentes esquemas de determinação de CDR, os resíduos de cada CDR são os seguintes.

CDR Esquema de Esquema AbM Esquema de Esquema de Kabat Chothia contato LCDR1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 (Sistema de numeração Kabat) (Sistema de numeração de Chothia) HCDR2 HS0-H65 HS50-H58 H53-H55 H47-H58 95H02 H96-AOI 93H01 (Sistema de numeração Kabat)

[0060] As CDRs também podem ser determinadas com base nas mesmas posições numéricas de Kabat que uma sequência de CDRs de referência (por exemplo, qualquer uma das CDRs exemplares da invenção).

[0061] Salvo indicação em contrário, na invenção, o termo "CDR" ou "sequência CDR" abrange sequências de CDR determinadas por qualquer uma das maneiras descritas acima.

[0062] Salvo indicação em contrário, na invenção, quando se refere à posição de resíduos em uma região variável de anticorpo (incluindo resíduos da região variável de cadeia pesada e resíduos da região variável de cadeia leve), se refere às posições de numeração de acordo com o sistema de numeração Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md. (1991)).

[0063] Em uma modalidade, os limites das CDRs dos anticorpos da invenção são determinados pelas regras de Chothia ou Kabat, por exemplo, anticorpos de sequências mostradas na Tabela 1.

[0064] Deve-se notar que os limites das CDRs de regiões variáveis de um anticorpo obtido por diferentes sistemas de atribuição podem diferir. Ou seja, as sequências CDR de regiões variáveis de um anticorpo definidas por diferentes sistemas de atribuição diferem. Portanto, quando se trata de definir um anticorpo com sequências CDR específicas definidas na invenção, o escopo do anticorpo também abrange esse anticorpo cujas sequências de regiões variáveis compreendem as sequências CDR específicas, mas tendo reivindicado limites CDR diferentes dos limites CDR específicos definidos por a invenção como um protocolo diferente (por exemplo, regras diferentes do sistema de atribuição ou suas combinações) é aplicada.

[0065] Anticorpos com especificidades diferentes (isto é, locais de ligação diferentes para antígenos diferentes) têm CDRs diferentes (sob o mesmo sistema de atribuição). No entanto, embora as CDRs sejam diferentes de anticorpo para anticorpo, apenas um número limitado de posições de aminoácidos dentro das CDRs está diretamente envolvido na ligação ao antígeno. A menor região sobreposta pode ser determinada usando pelo menos dois dos métodos Kabat, Chothia, AbM, Contact e North, fornecendo assim uma "unidade de ligação mínima" para a ligação ao antígeno. A unidade de ligação mínima pode ser uma sub-porção da CDR. Como ficará claro para os especialistas na matéria, os resíduos das restantes sequências de CDR podem ser determinados por estrutura de anticorpos e dobragem de proteínas. Portanto, quaisquer variantes das CDRs aqui fornecidas também serão consideradas na invenção. Por exemplo, em uma variante de CDR, os resíduos de aminoácidos na unidade de ligação mínima podem permanecer inalterados, enquanto os outros resíduos de CDR definidos por Kabat ou Chothia podem ser substituídos por resíduos conservadores de aminoácidos.

[0066] Cinco principais classes de anticorpos são conhecidas na técnica: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas classes podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem a diferentes classes de imunoglobulinas são referidos como a, 5, E&, YV € p, respectivamente.

[0067] "Anticorpo na forma de IgG" se refere à forma de IgG à qual a região constante da cadeia pesada de um anticorpo pertence. As regiões constantes da cadeia pesada de todos os anticorpos do mesmo tipo são idênticas e as regiões constantes da cadeia pesada de anticorpos de diferentes tipos são diferentes. Por exemplo, um anticorpo na forma de IgGl se refere ao domínio Ig da sua região constante da cadeia pesada sendo um domínio Ig de uma IgGl.

[0068] "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" ou "ADCC" se refere a uma forma de citotoxicidade na qual uma imunoglobulina secretada que se liga a um receptor Fc (FcR) presente em certas células citotóxicas (por exemplo, células NK, neutrófilos e macrófagos) permite tais citotóxicos células efetoras para se ligarem especificamente às células alvo portadoras de antígeno e subsequentemente matam as células alvo com citotoxina. As células primárias mediadoras de ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991) resume a expressão de FcR em células hematopoiéticas. Para avaliar a atividade ADCC da molécula de interesse, pode ser realizado um ensaio ADCC in vitro, como descrito na Patente US No.

5.500.362 ou 5.821.337, ou Patente US No. 6.737.056 (Presta). As células efetoras úteis para esses ensaios incluem células PBMC e NK. Opcionalmente/alternativamente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, como o divulgado em Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

[0069] o termo "agente citotóxico" ou "fator citotóxico" utilizado na invenção se refere a substâncias que inibem ou impedem a função celular e/ou causam morte ou destruição celular. Exemplos de agentes citotóxicos são os divulgados nos documentos WO2015/153513, WO2016/028672, WO2015/138920 e WO2016/007235.

[0070] O termo "agente terapêutico", como descrito aqui, abrange qualquer substância eficaz na prevenção ou tratamento de tumores (como câncer) e infecções (como infecções crônicas), incluindo agentes quimioterápicos, agentes citotóxicos, vacinas, outros anticorpos, agentes anti-infecciosos ativos, imunomoduladores, como qualquer uma das substâncias divulgadas nos documentos WO2016/007235 ou WO2010/077634 ou US60/696426 que podem ser utilizados em combinação com anticorpos anti-PD-L1l.

[0071] "Agentes quimioterápicos" incluem compostos químicos úteis no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos são os divulgados nos documentos WO2016/007235, WO2010/077634, US60/696426 ou WO2016/061142, US61/264061 ou WO2016/007235.

[0072] O termo "citocina" é um termo geral para proteínas que são liberadas por uma população celular e atuam como mediadores intercelulares em outra célula. Exemplos de tais citocinas são linfocinas e monocinas; interleucinas (IL), como IL-l, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-l1 , IL-12 e IL-15; fator de necrose tumoral, como TNF-a ou TNF-B; e outros fatores polipeptídicos, incluindo LIF e kit ligante (KL) e interferon y. Como aqui utilizado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de culturas de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos de citocinas de sequência nativa, incluindo entidades de pequenas moléculas produzidas por síntese artificial e derivados e sais farmacologicamente aceitáveis.

[0073] O termo "molécula coestimuladora" se refere a um parceiro de ligação relevante que se liga especificamente a um ligante coestimulador em uma célula T e, portanto, permite uma resposta coestimuladora mediada por células T (por exemplo, mas não se limitando a proliferação). Moléculas coestimuladoras são moléculas da superfície celular que não sejam receptores de antígeno ou seus ligantes necessários para uma resposta imune altamente eficiente. As moléculas coestimuladoras incluem, mas não estão limitadas a: moléculas de MHC Classe I, proteínas receptoras de TNF, proteínas semelhantes a imunoglobulinas, receptores de citocinas, integrinas, moléculas de ativação linfocítica de sinalização (proteínas SLAM), receptor ativador de células NK, BTLA, receptor de ligante Toll, OX40, CD2, CD7, CD27,

CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-l, LFA-l (CDlla/CDl18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-l, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CDl9, CD4, CD8a, CD8B, IL2REB, IL2Ry, IL7Ra, ITGA4, VLAl, CDGA, ITGA4, VLAIGA IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CDl03, ITGAL, CDlla, LFA-l, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDllc, ITGBl, CD29, ITGB2, CDI8, LFA- 1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CDI60 (BY55), PSGL1, CDI00 (SEMA4D) CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CDl62), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CDl9a e um ligante que se liga especificamente a CD83.

[0074] O termo "ativador" ou "agonista" inclui substâncias que aumentam certos parâmetros (por exemplo, atividade) de uma dada molécula (por exemplo, uma molécula coestimuladora). Por exemplo, este termo inclui substâncias que aumentam a atividade (por exemplo, atividade coestimuladora) de uma molécula em pelo menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou mais.

[0075] O termo "molécula de pontos de verificação imune" se refere ao grupo de moléculas na superfície celular das células T CD4 e células T CD8. Essas moléculas podem atuar efetivamente como "freios" que regulam negativamente ou suprimem as respostas imunes antitumorais. As moléculas de pontos de verificação imune incluem, entre outras, o receptor de morte programado 1 (PD-l), antígeno linfocitário T citotóxico 4 (CTLA-4), B7Hl, B7H4, OX-40, CD137, CD40 e LAG-3, que inibir diretamente células imunes.

[0076] O termo "inibidor" ou "antagonista" inclui substância que reduz certos parâmetros (por exemplo, atividade) de uma dada molécula (por exemplo, uma proteína inibidora do ponto de verificação imune). Por exemplo, este termo inclui substâncias que inibem a atividade (por exemplo, atividade LAG-3) de uma dada molécula em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou mais. Portanto, o efeito inibitório não precisa ser de 100%.

[0077] O termo "diacorpo" se refere a um fragmento de anticorpo com dois locais de ligação ao antígeno, o fragmento compreendendo um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) em uma cadeia polipeptídica (VH-VL). Ao usar um vinculador muito curto para emparelhar entre os dois domínios em cada cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia para formar dois sites de ligação ao antígeno. Os diabéticos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos são descritos em mais detalhes em, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). Tricorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003).

[0078] A "região Fc funcional" possui as "funções efetoras" das regiões Fc das sequências nativas. "Funções efetoras" exemplificativas incluem regulação negativa de ligação a Clqg, CDC, ligação a receptores Fc, ADCC, fagocitose, receptores de superfície celular (por exemplo, receptores de células B ou BCRs) e similares. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc esteja associada a um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e possa ser avaliada usando uma variedade de ensaios, como os aqui divulgados.

[0079] "Função efetor" se refere a atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc do anticorpo e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação a Cclq e citotoxicidade dependente do complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, regulação negativa dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptores de células B) e Ativação de células B.

[0080] "Célula efetora humana" se refere a um leucócito que expressa um ou mais FcRs e executa funções efetoras. Em certas modalidades, a célula expressa pelo menos FCyRIII e executa a função efetora do ADCC. Exemplos de leucócitos humanos mediadores do ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de suas fontes naturais, como o sangue.

[0081] O termo "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade ou dosagem do anticorpo ou fragmento ou conjugado ou composição da invenção que gera os efeitos esperados em um paciente que necessita de tratamento ou prevenção depois de administrado ao paciente em doses únicas ou múltiplas. A quantidade eficaz pode ser facilmente determinada por um médico assistente como um especialista na técnica, considerando uma variedade de fatores, como a seguir: espécies de mamíferos; seu tamanho, idade e estado geral de saúde; a doença específica envolvida; a extensão ou gravidade da doença; resposta em um paciente individual; anticorpo específico administrado; via de administração; características de biodisponibilidade da formulação administrada; regime de dose selecionada; e uso de qualquer terapia concomitante.

[0082] "Quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz para alcançar um resultado terapêutico desejado em uma dosagem necessária por um período de tempo desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, ou conjugado ou composição do mesmo pode variar dependendo de uma variedade de fatores como estado mórbido, idade, sexo e peso de um indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo para provocar uma resposta desejada no indivíduo. A quantidade terapeuticamente eficaz é também uma quantidade na qual qualquer efeito tóxico ou indesejado do anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou seu conjugado ou composição é inferior ao efeito terapeuticamente benéfico. "Quantidade terapeuticamente eficaz" inibe preferencialmente um parâmetro mensurável (por exemplo, taxa de crescimento tumoral) em pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 50%, 60% ou 70% e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% ou 90%, em relação a indivíduos não tratados. A capacidade de um composto para inibir um parâmetro mensurável (por exemplo, câncer) pode ser avaliada em um sistema de modelo animal que prediz eficácia em tumores humanos. Opcionalmente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade de inibição do composto, a qual pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos pelos especialistas.

[0083] "Quantidade —profilaticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz para alcançar um resultado profilático desejado em uma dosagem necessária por um período de tempo desejado. Geralmente, uma vez que uma dose profilática é administrada em um indivíduo antes ou em um estágio anterior de uma doença, uma quantidade profilaticamente eficaz será menor que uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[0084] "Anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno" adequados para a invenção incluem, mas não estão limitados a, policlonais, monoclonais, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, recombinantes, heterólogos, hetero-híbridos, quiméricos, humanizados (especialmente enxertados em CDR), desimunizados, ou anticorpo humano, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')º2, fragmento gerado a partir da biblioteca de expressão Fab, Fd, EFv, Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv), anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv), diacorpo ou tetracorpo (Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (14), 6444-6448), nanocorpo (também referido como anticorpo de domínio único), anti- idiotípico (anti-Id) anticorpo (incluindo, por exemplo, anticorpo anti-Id contra o anticorpo da invenção) e fragmento de ligação ao epítopo de qualquer um dos anteriores.

[0085] O fragmento "Fab" inclui um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve, e também inclui o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHl) da cadeia pesada. Um fragmento Fab 'difere do fragmento Fab devido à adição de alguns resíduos

(incluindo uma ou mais cisteína de uma região de dobradiça de anticorpo) ao terminal carboxil do domínio CH1 da cadeia pesada. Fab'-SH se refere a um Fab' no qual o resíduo de cisteína do domínio constante carrega um grupo tiol livre. Um fragmento de anticorpo F (ab')>z foi originalmente gerado como fragmentos Fab' emparelhados com cisteínas de dobradiça entre os fragmentos Fab'. Também são conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos.

[0086] O termo "região Fc" é aqui utilizado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos uma porção de uma região constante. O termo inclui regiões Fc e regiões Fc variantes de sequências nativas. Em certas modalidades, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana se estende de Cys226 ou Pro230 até a extremidade carbonila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. Salvo indicação em contrário, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é baseada em um sistema de numeração da UE, que também é chamado de índice da UE, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, MD, 1991.

[0087] O termo "região variável" ou "domínio variável" se refere a um domínio de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo envolvido na ligação do anticorpo a um antígeno. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos nativos geralmente têm estruturas semelhantes, em que cada domínio contém quatro regiões estruturais conservadas (FR) e três regiões determinantes de complementaridade (CDR). (Ver, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6º Ed., W.H. Freeman and Co. p91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para fornecer especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga a um antígeno específico pode ser usado para isolar anticorpos que se ligam ao antígeno, de modo a rastrear bibliotecas de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Ver, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol., 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

[0088] "Estrutura" ou "FR" se refere a resíduos de domínio variável que não sejam resíduos CDR da região determinante de complementaridade. Um FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FRl, FR2, FR3 e FR4. Portanto, as sequências CDR e FR geralmente aparecem na sequência a seguir do domínio variável da cadeia pesada (VH) (ou domínio variável da cadeia leve (VL)): FR1- HCDR1 (LCDR1) -FR2-HCDR2 (LCDR2) -FR3-HCDR3 (LCDR3) -FR4.

[0089] Salvo indicação em contrário, a numeração de resíduos em vários domínios de anticorpos é baseada no sistema de numeração da UE, que também é chamado de índice da UE, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Ciência da Saúde, Bethesda, MD, 1991.

[0090] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo inteiro" e "anticorpo intacto" são usados aqui de forma intercambiável para se referir a um anticorpo com uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa ou a um anticorpo com uma cadeia pesada que contém uma região Fc como aqui definido.

[0091] "Fv" é o menor fragmento de anticorpo que contém um local de ligação ao antígeno intacto. Em uma modalidade, um tipo de Fv de cadeia dupla consiste em um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve em um dímero estreito e não covalentemente associado. Em um tipo Fv de cadeia única (scFv), um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve podem ser ligados covalentemente por meio de um ligante peptídico flexível, para que a cadeia leve e a cadeia pesada possam ser associadas a uma estrutura semelhante ao "Dímero" "estrutura do tipo de cadeia dupla. Nesta configuração, são as três CDRs de cada domínio variável que definem o local de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Para resumir, as seis CDRs conferem especificidade de ligação ao antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou contendo apenas metade Fv dos três CDRs específicos para o antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar a um antígeno, embora a afinidade seja menor que um local de ligação intacto. Para uma revisão do scFv, ver, por exemplo, Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, editado por Rosenburg e Moore, (Springer-Verlag, Nova York, 1994), páginas 269-315.

[0092] Os termos "célula hospedeira", "linhagem celular hospedeira" e "cultura de células hospedeiras" são usados de forma intercambiável e se referem a células nas quais um ácido nucleico exógeno é introduzido, incluindo gerações dessas células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas", que incluem células primárias transformadas e gerações derivadas delas, independentemente do número de passagens. Uma geração pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico à célula-mãe, mas pode conter mutações. As gerações mutantes com a mesma função ou atividade biológica que são rastreadas ou selecionadas a partir das células inicialmente transformadas estão incluídas neste documento.

[0093] "Anticorpo humano" se refere a um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à sequência de aminoácidos de um anticorpo gerado por uma célula humana ou humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza bibliotecas de anticorpos humanos ou outras sequências “codificadoras de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui explicitamente anticorpos humanizados contendo resíduos de ligação ao antígeno não humano.

[0094] "Estrutura de consenso humano" se refere a uma estrutura que representa os resíduos de aminoácidos que ocorrem com mais frequência na seleção de sequências estruturais de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é uma seleção de um subtipo de uma sequência de domínio variável. Geralmente, o subtipo da sequência é um subtipo divulgado em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Publicação Pública NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), Volumes 1-3. Em uma modalidade, para VL, o subtipo é o subtipo Kappa I, como em Kabat et al. (Veja acima). Em uma modalidade, para VH, o subtipo é o subtipo III, como em Kabat et al. (Veja acima).

[0095] Anticorpo "humanizado" se refere a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de CDRs não humanos e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos os pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou praticamente todas as CDRs (por exemplo, CDRs) correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem a os de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. A "forma humanizada" de um anticorpo (por exemplo, um anticorpo não humano) se refere a um anticorpo que foi humanizado.

[0096] Os termos "câncer" e "cancerígeno" se referem ou descrevem uma doença fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a carcinomas, linfomas, blastomas, sarcomas e leucemias ou neoplasias linfoides. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem, mas não estão limitados a, carcinoma de células escamosas (por exemplo, carcinoma epitelial de células escamosas), câncer de pulmão (incluindo câncer de pequenas células, câncer de células não pequenas, adenocarcinoma de pulmão e carcinoma de células escamosas do pulmão), câncer peritoneal, carcinoma hepatocelular, câncer gástrico (incluindo câncer gastrointestinal e câncer estromal gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de trato urinário, tumor de fígado, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer endometrial ou uterino, adenocarcinoma salivar, câncer renal, câncer de próstata, câncer vulvar,

câncer de tireoide, câncer de fígado, câncer anal, câncer peniano, melanoma, melanoma difuso superficial, melanoma lentigo maligno, melanoma acral, melanoma nodular , mieloma múltiplo e linfoma de células B, leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia de células cabeludas, miopia crônica leucemia elógena e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edema (como os associados a tumores cerebrais) e síndrome de Meigs, tumores cerebrais e câncer cerebral e câncer de cabeça e pescoço, e metástases relacionadas. Em certas modalidades, os cânceres adequados para o tratamento pelos anticorpos da invenção incluem câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer peritoneal, carcinoma hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, neuroglioma, câncer cervical, câncer de ovário câncer de fígado, câncer de bexiga, carcinoma hepatocelular, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial ou uterino, câncer de glândula salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, câncer de fígado, leucemia e câncer de cabeça e pescoço, incluindo as formas metastáticas desses cânceres.

[0097] Os termos "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbio proliferativo" se referem a distúrbios associados a um certo grau de proliferação celular anormal. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular se refere ao câncer.

[0098] O termo "tumor" se refere a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, independentemente de malignos ou benignos, e todas as células e tecidos pré- cancerosos e cancerosos. Os termos "câncer", "cancerígeno", "distúrbio proliferativo celular", "distúrbio proliferativo" e "tumor" não são mutuamente exclusivos quando aqui referidos.

[0099] O termo "doença infecciosa" se refere a uma doença causada por um patógeno, incluindo, por exemplo, infecção viral, infecção bacteriana, infecção fúngica ou protozoário, como infecção parasitária.

[0100] O termo "escape imune do tumor" se refere a tumores que escapam ao reconhecimento e à eliminação imunes. Portanto, como conceito de tratamento, a imunidade do tumor é "tratada" e o tumor é reconhecido e atacado pelo sistema imunológico quando a fuga é enfraquecida. Exemplos de reconhecimento de tumores incluem ligação, encolhimento e depuração de tumores.

[0101] O termo "infecção crônica" se refere a uma infecção na qual um agente infeccioso (por exemplo, um patógeno como vírus, bactérias, protozoários como parasita, fungo ou similar) induziu uma resposta imune em um hospedeiro infectado, mas não foi eliminado ou eliminado do hospedeiro como em infecções agudas.

As infecções crônicas podem ser persistentes, latentes ou lentas.

Embora as infecções agudas geralmente sejam resolvidas pelo sistema imunológico em dias ou semanas (como a gripe), as infecções persistentes podem durar meses, anos, décadas ou uma vida em níveis relativamente mais baixos (por exemplo, hepatite B). Em contraste, as infecções latentes são caracterizadas por atividade assintomática a longo prazo, interrompida às vezes por hiperinfecções rapidamente crescentes e níveis elevados de patógenos (como o herpes simplex). Finalmente, as infecções lentas são caracterizadas por progressões graduais e contínuas dos sintomas da doença, como um longo período de incubação seguido por processos clínicos prolongados e progressivos após o início dos sintomas clínicos.

Ao contrário das infecções latentes e persistentes, as infecções crônicas podem não começar na fase aguda da proliferação do vírus (por exemplo, infecção por picornavírus, vírus visna, tremor epizoótico, doença de Creutzfeldt-Jakob). Agentes infecciosos exemplares capazes de induzir infecções crônicas incluem vírus (por exemplo, citomegalovírus, vírus EB, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus do herpes simplex tipos I e II, vírus da imunodeficiência humana tipos 1 e 2, vírus do papiloma humano, vírus do linfócito T humano tipos 1 e 2, vírus varicela-zoster, etc.), bactérias (por exemplo, Mycobacterium tuberculosis, Listeria spp., Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Borrelia spp., Helicobacter pylori etc.), protozoários como parasitas (por exemplo, Leishmania spp., Plasmodium falciparum, Schistosoma spp., Toxoplasma spp., Trypanosoma spp., Taenia carssiceps etc.) e fungos (por exemplo, Aspergillus spp., Candida albicans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Pneumocyst etc.) . Agentes infecciosos adicionais incluem príons ou proteínas dobradas que afetam a estrutura do cérebro ou neurônios, propagando ainda mais o dobramento de proteínas nesses tecidos, levando à formação de placas amiloides (que causam morte celular, danos aos tecidos e, eventualmente, morte). Exemplos de doenças causadas por infecções por príons incluem a doença de Creutzfeldt-Jakob e suas variedades, a síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), insônia familiar fatal (IFS), kuru, scrapie, encefalopatia espongiforme bovina (BSE) em bovinos (também conhecida como "vaca louca") "doença) e várias outras encefalopatias em várias formas de animais [por exemplo, encefalopatia transmissível por marta (TME), doença crônica de perda (CWD) em cervos de cauda branca, cervos de alces e mulas, encefalopatia espongiforme felina, encefalopatia espongiforme felina (EUE) em nyala, orix e kudu maior, encefalopatia espongiforme do avestruz].

[0102] "Imunoconjugado" é um anticorpo que é conjugado com uma ou mais outras substâncias, incluindo, mas não limitado a agentes ou marcadores citotóxicos.

[0103] O termo "marcador" aqui utilizado se refere a um composto ou composição que é direta ou indiretamente conjugado ou fundido a um agente, tal como uma sonda polinucleotídica ou um anticorpo, e facilita a detecção do agente ao qual ele é conjugado ou fundido. O próprio marcador pode ser detectável (por exemplo, um marcador de radioisótopo ou um marcador fluorescente) ou pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição de substrato detectável no caso de marcação enzimática. O termo pretende abranger a marcação direta de uma sonda ou anticorpo por acoplamento (isto é, ligação física) de uma substância detectável à sonda ou anticorpo e marcação indireta de uma sonda ou anticorpo reagindo com outro reagente diretamente marcado. Exemplos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundário marcado com fluorescência e a marcação final de uma sonda de DNA biotinilada, de modo que possa ser detectada com uma estreptavidina marcada com fluorescência.

[0104] "Indivíduo" ou "sujeito" inclui mamíferos. Os mamíferos incluem, entre outros, animais domésticos (por exemplo, gado, cabra, gato, cachorro e cavalo), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos, como macacos),

coelho e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em algumas modalidades, o indivíduo ou sujeito é humano.

[0105] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi separado dos componentes de seu ambiente natural. Em algumas modalidades, o anticorpo é purificado a uma pureza maior que 95% ou 99%, conforme determinado por, por exemplo, eletroforese [por exemplo, SDS-PAGE, foco isoelétrico (IEF), eletroforese capilar] ou cromatografia (por exemplo, troca iônica ou reversão HPLC de fase). Para uma revisão dos métodos para avaliar a pureza do anticorpo, ver, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr., B848: 79-87 (2007).

[0106] Um ácido nucleico "isolado" se refere a uma molécula de ácido nucleico que foi separada dos componentes do seu ambiente natural. O ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em uma célula que normalmente contém a molécula de ácido nucleico, mas apresenta-se extracromossômica ou em um local cromossômico diferente da sua localização cromossômica natural.

[0107] "Um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-PD-Ll ou um fragmento do mesmo" se refere a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada ou leve do anticorpo (ou fragmento da mesma), incluindo essas moléculas de ácido nucleico em um único vetor ou em separado vetores e essas moléculas de ácido nucleico presentes em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

[0108] Os termos "ácido nucleico", "sequência de ácido nucleico", "sequência de nucleotídeo" ou "sequência de polinucleotídeo" e "polinucleotídeo" são usados de forma intercambiável. Eles se referem a nucleotídeos (desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos) de qualquer comprimento na forma de polímero ou seus análogos. Um polinucleotídeo pode ser de fita simples ou dupla e, se de fita simples, pode ser uma fita codificadora ou não codificadora (anti-sentido). Os polinucleotídeos podem incluir nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeo pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. O polinucleotideo pode ser modificado adicionalmente após polimerização, como por conjugação com um componente de marcação. Um ácido nucleico pode ser um polinucleotídeo recombinante ou um polinucleotídeo que não existe na natureza ou está ligado em um layout não natural a outro polinucleotídeo de fonte genômica, fonte de cDNA, fonte semissintética ou fonte sintética.

[0109] os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" (se em cadeia única) são usados aqui de forma intercambiável e se referem a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear Ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. O termo também inclui polímeros de aminoácidos que foram modificados (por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra operação, como conjugação com um componente de marcação). Os polipeptídeos podem ser isolados de fontes naturais, podem ser produzidos a partir de hospedeiros eucarióticos ou procarióticos através de técnicas recombinantes e podem ser produtos de métodos sintéticos.

[0110] O cálculo da identidade da sequência entre as sequências é realizado da seguinte maneira.

[0111] Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal (por exemplo, para um alinhamento ideal, podem ser introduzidas lacunas na primeira e na segunda sequências de aminoácidos ou em uma ou ambas as sequências ácidas ou sequências não homólogas podem ser descartadas para fins de comparação). Em uma modalidade preferida, para fins de comparação, o comprimento da sequência de referência alinhada é de pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, 60% e ainda mais preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 290%, 100% do comprimento da sequência de referência. Os resíduos Ou nucleotídeos de aminoácidos nas posições correspondentes de aminoácidos ou nas posições nucleotídicas são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo na posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição.

[0112] Um algoritmo matemático pode ser usado para obter a comparação de sequências e o cálculo da identidade percentual entre duas sequências. Em uma concretização preferida, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada com Needlema e Wunsch [(1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453] (disponível em http://www.gcg.com), que foi integrado ao programa GAP do pacote de software GCG, usando a matriz Blossom 62 ou a matriz PAM250 e pesos de intervalo de 16 , 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e pesos de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em ainda outra modalidade preferida, a identidade percentual entre duas sequências de ácidos nucleotídicos é determinada com o programa GAP (disponível em http://www.gcg.com) do pacote de software GCG, usando a matriz NWSgapdna.CMP e peso de intervalo de 40, 50, 60, 70 ou 80 e peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um conjunto de parâmetros particularmente preferido (e um que deve ser usado, salvo indicação em contrário) é uma matriz de pontuação Blossom 62 com uma penalidade de intervalo de 12, uma penalidade de extensão de intervalo de 4 e uma penalidade de intervalo de deslocamento de quadro de 5.

[0113] A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos também pode ser determinada com a tabela restante ponderada PAM120, penalidade de 12 e penalidade de 4, usando os algoritmos E. Meyers e W. Miller que foram incorporados ao programa ALIGN (versão 2.0) ((1989) CABIOS, 4: 11-17).

[0114] Adicionalmente ou alternativamente, as sequências de ácidos nucleicos e as sequências de proteínas aqui descritas podem ser ainda utilizadas como "sequências de consulta" para realizar pesquisas em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar outras sequências de membros da família ou sequências relacionadas. Por exemplo, essas pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. As pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o prograna NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para obter sequências nucleotídicas homólogas à molécula de ácido nucleico da invenção. As pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas à molécula de proteína da invenção. Para obter resultados de alinhamento com folga para fins de comparação, o BLAST com folga pode ser usado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Ao usar os programas BLAST e BLAST com gap, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Veja http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

[0115] Como aqui utilizado, o termo "hibridação sob condições de baixo rigor, médio rigor, alto rigor ou extremo rigor" descreve condições de hibridação e lavagem. Instruções para realizar reações de hibridação podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que é incorporado por referência. Métodos aquosos e não aquosos são descritos nas referências e qualquer um dos métodos pode ser usado. As condições de hibridação específicas mencionadas aqui são as seguintes: 1) condições de hibridação de baixo rigor estão em 6 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 ºC, seguidas de duas lavagens em 0,2 X SSC, 0,1% SDS pelo menos a 50 ºC (para condições de baixa exigência, a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55 ºC); 2) as condições de hibridação de rigor médio estão em 6 X SSC a cerca de 45 ºC, seguidas por uma ou mais lavagens em 0,2 XxX SSC, 0,1% SDS a cerca de 60 ºC; 3) as condições de hibridação de alto rigor estão em 6 X SSC a cerca de 45 ºC, seguidas por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 65 ºC; e preferencialmente 4) condições de hibridização de rigor extremo estão em fosfato de sódio 0,5 M, SDS a 7% a 65 ºC, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 0,2 X, SDS a

0,1% a 65 ºC. Condição de rigor extremo (4) é uma condição preferida e a que deve ser usada, salvo indicação em contrário.

[0116] O termo "composição farmacêutica" se refere a uma composição que existe em uma forma que permita que a atividade biológica do ingrediente ativo nela contido seja eficaz e não contém ingredientes adicionais com toxicidade inaceitável para um indivíduo ao qual a composição é administrada.

[0117] o termo "materiais suplementares farmacêuticos" se refere a diluentes, adjuvantes (por exemplo, adjuvantes de Freund (completos e incompletos)), excipientes, carreadores ou estabilizadores etc., que são administrados com a substância ativa.

[0118] Como usados aqui, "tratamento" (ou "tratar" ou "tratar") se refere a abrandar, interromper, interromper, aliviar, parar, reduzir ou reverter a progressão ou gravidade de um sintoma, distúrbio, condição ou doença existente.

[0119] Como aqui utilizado, "prevenção" (ou "prevenção" ou "prevenção") inclui a inibição do início ou progressão de uma doença ou distúrbio ou sintoma de uma doença ou distúrbio específico. Em algumas modalidades, indivíduos com histórico familiar de câncer são candidatos a regimes preventivos. Geralmente, no contexto de câncer, o termo "prevenção" se refere à administração de um medicamento antes do aparecimento de sinais ou sintomas de um câncer, particularmente em indivíduos com risco de câncer.

[0120] O termo "agente anti-infeccioso" inclui qualquer molécula que inibe ou elimina especificamente o crescimento de microrganismos, como vírus, bactérias, fungos ou protozoários, por exemplo, parasitas, e não é letal para o hospedeiro, na concentração de administração e intervalo de administração. Como aqui utilizado, o termo agente anti- infeccioso inclui antibióticos, antibacterianos, antivirais, antifúngicos e antiprotozoários. Em um aspecto específico, o agente anti-infeccioso não é tóxico para o hospedeiro na concentração e intervalo de administração.

[0121] Os agentes anti-infecciosos antibacterianos ou agentes antibacterianos podem ser amplamente classificados em bactericida (isto é, matando diretamente) ou bacteriostático (isto é, impedindo a divisão). Os agentes anti-infecciosos antibacterianos podem ser ainda classificados em agentes antibacterianos de espectro estreito (isto é, afetando apenas subtipos bacterianos limitados, como Gram-negativos etc.) ou agentes antibacterianos de amplo espectro (isto é, afetando uma ampla variedade de espécies). Exemplos incluem amicacina, gentamicina, geldanamicina, herbimicina, mupirocina, furantoína, pirazinamida, quinupristina/dalfopristina,

rifampicina/rifampicina, isoniazida e pirazinamida, Ou tinidazol.

[0122] o termo "antiviral" inclui qualquer substância que iniba ou elimine o crescimento, a patogenicidade e/ou a sobrevivência de um vírus. Isso inclui, por exemplo, aciclovir, cidofovir, zidovudina, didanosina (ddI, VIDEX), zalcitabina (ddC, HIVID), estavudina (d4T, ZERIT), lamivudina (3TC, EPIVIR), abacavir (ZIAGEN), emtricitabina (EMTRIVA), etc.

[0123] o termo "antifúngico" inclui qualquer substância que iniba ou elimine o crescimento, a patogenicidade e/ou a sobrevivência de um fungo. Isso inclui, por exemplo, natamicina, rimocidina, filipina, nistatina, anfotericina B, candicina, patchouli, óleo de semente de nim, óleo de coco etc.

[0124] O termo "antiprotozoário" inclui qualquer substância que iniba ou elimine o crescimento, patogenicidade e/ou sobrevivência de organismos protozoários (por exemplo, parasitas). Exemplos de agentes antiprotozoários incluem antimaláricos, como quinino, quinidina etc.

[0125] Para exemplos de antibacterianos, antivirais, antifúngicos e antiprotozoários, consulte, por exemplo, WO2010/077634 e similares.

[0126] Para agentes anti-infecciosos, consulte também, por exemplo, WO2014/008218, WO2016/028672, WO2015/138920 ou WO2016/061142.

[0127] O termo "vetor", como aqui utilizado, se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de proliferar outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui vetores que servem como estruturas de ácidos nucleicos autorreplicantes, bem como vetores que se ligam ao genoma de uma célula hospedeira na qual eles foram introduzidos. Alguns vetores são capazes de direcionar a expressão de um ácido nucleico ao qual estão operacionalmente ligados. Tais vetores são chamados vetores de "expressão" aqui.

[0128] "Amostra do indivíduo/paciente" se refere a uma coleção de células ou fluidos obtidos de um paciente ou indivíduo. A fonte das amostras de tecido ou células pode ser tecidos sólidos, por exemplo, a partir de amostras de órgãos ou tecidos frescos, congelados e/ou preservados ou amostras de biópsia ou amostras de punção; sangue ou qualquer componente sanguíneo; fluidos corporais, tais como fluidos cefalorraquidianos, fluidos amnióticos, fluidos peritoneais ou fluidos intersticiais; células de um indivíduo a qualquer momento durante a gravidez ou desenvolvimento. As amostras de tecido podem compreender compostos que naturalmente não são misturados com tecidos, como conservantes, anticoagulantes, tampões, fixadores, nutrientes,

antibióticos e similares. Exemplos de amostras de tumores incluem, entre outros, biópsias de tumores, aspirados por agulha fina, fluidos de lavagem brônquica, fluidos pleurais, esputa, urina, amostras cirúrgicas, células tumorais circulantes, soro, plasma, proteínas plasmáticas circulantes, ascites, culturas primárias de células ou células linhas derivadas de tumores ou exibindo propriedades semelhantes a tumores e amostras de tumores preservadas, como amostras de tumores fixadas em formalina, embebidas em parafina ou amostras de tumores congelados.

[0129] O termo "bula" é usado para se referir às instruções geralmente contidas na embalagem comercial de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre indicações, uso, dosagem, administração, terapias combinadas, contraindicações e/ou avisos relacionados à aplicação de tais medicamentos. produtos.

Anticorpo da invenção

[0130] Portanto, em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção se liga a PD-Ll1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção se liga ao PD-Ll de mamífero, como o PD-Ll humano. Por exemplo, a molécula de anticorpo se liga especificamente a um epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) de PD-Ll1. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo se liga a um ou mais domínios extracelulares de PD-L1.

[0131] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll1 ou fragmento do mesmo da invenção possui uma ou mais das seguintes propriedades:

[0132] (1) O anticorpo anti-PD-Ll ou fragmento do mesmo da invenção se liga a PD-Ll1 (por exemplo, PD-L1l1 humano) com alta afinidade, por exemplo, se liga a PD-Ll com constantes de dissociação de equilíbrio (Ko) de menos de cerca de 50 nM, de preferência menor ou igual a cerca de 20 nM, mais preferencialmente menor ou igual a cerca de 15 nM, mais preferencialmente menor ou igual a cerca de 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM ou 2 nM, e mais preferencialmente menor ou igual a cerca de 1,5 nM, 1,4 nM, 1,3 nM, 1,2 nM, 1,1 nM, 1 nM, 0,9 nM ou 0,8 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-Ll da invenção se liga a PD-L1 com um Ko de 0,1-10 nM, preferencialmente 0,5-10 nM, mais preferencialmente 0,6-10 nM, 0,7-8 nM e 0,7-5 nM e mais preferencialmente 0,5-1,5 nM, 0,7-1,5 nM e 0,7-1 nM. Em algumas modalidades, o PD-L1 é um PD-Ll1l humano. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação ao anticorpo é determinada usando interferometria ótica biológica (por exemplo, medição de afinidade de Fortebio).

[0133] (2) O anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção se liga a células que expressam PD-Ll1 humana, por exemplo, com uma EC50 menor ou igual a cerca de 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,9 nM, 2,8 nM, 2,7 nM, 2,6 nM, 2,5 nM, 2,4 nM,

2,3 nM, 2,2 nM, 2,1 nM, 2 nM, 1,9 nM, 1,8 nM, 1,7 nM ou 1,6 nM. Em algumas modalidades, a ligação é determinada usando citometria de fluxo (por exemplo, FACS). Em algumas modalidades, a célula que expressa PD-Ll1 humana é uma célula CHO que expressa PD-L1 humana.

[0134] (3) O anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção bloqueia atividades relevantes de PD-Ll, por exemplo, com um EC50 menor ou igual a cerca de 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM , 0,9 nM, 0,8 nM ou 0,7 nM, e preferencialmente 0,1-1 nM, 0,5-1 nM, 0,6-1 nM, 0,6 nM, 0,7 nM, 0,8 nM, 0,9 nM ou 1 nM. Em algumas modalidades, a atividade relevante de PD-L1 é a ligação de PD-L1 a PD-1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção inibe a ligação de PD-Ll1 a PD-l com um ECso menor ou igual a cerca de 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM ou 0,7 nM e, de preferência 0,1-1 nM, 0,5-1 nM, 0,6-1 nM, 0,6 nM, 0,7 nM, 0,8 nM, 0,9 nM ou 1 nM em um ensaio MOA. Em algumas modalidades, a célula é uma célula CHO.

[0135] (4) A capacidade do anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção para melhorar a função das células T, por exemplo, é superior aos anticorpos anti-PD-Ll1 conhecidos, como Tecentriqa.

[0136] (5) A capacidade do anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção para ativar células T, por exemplo em MLR,

por exemplo, é superior aos anticorpos anti-PD-L1 conhecidos, como Tecentriq.

[0137] (6) A capacidade do anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção para aumentar a secreção de IFN-y, por exemplo na MLR, por exemplo, é superior aos anticorpos anti- PD-Ll conhecidos, como Tecentriq.

[0138] (7) A capacidade do anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção para aumentar a secreção de IL-2, por exemplo em MLR, por exemplo, é superior aos anticorpos anti- PD-L1 conhecidos, como Tecentria.

[0139] (8) O anticorpo ou o seu fragmento da invenção é menos viscoso do que o anticorpo anti-PD-Ll conhecido (por exemplo, Tecentriq) e, portanto, possui melhor capacidade de drenagem. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção tem um tempo de retenção (RT) inferior a cerca de 10 minutos, cerca de 9 minutos ou cerca de 8 minutos, preferencialmente cerca de 7 a 9 minutos e preferencialmente cerca de 7 a 8,5 minutos , cerca de 7,5 a 8,5 minutos, cerca de 7 a 8 minutos ou cerca de 7,5 a 8 minutos, tal como cerca de 7,5 minutos, 7,6 minutos, 7,7 minutos, 7,8 minutos, 7,9 minutos, 8 minutos, 8,1 minutos, 8,2 minutos, 8,3 minutos, 8,4 minutos, 8,5 minutos, em cromatografia em coluna Zenix.

[0140] (9) O anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção inibe uma ou mais atividades de PD-Ll, por exemplo,

causando um ou mais dos seguintes: aumento de linfócitos infiltradores de tumor, aumento da proliferação mediada por receptor de células T ou diminuição da imunidade evasão de células cancerígenas.

[0141] (10) O anticorpo anti-PD-L1 ou o seu fragmento da invenção pode induzir citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).

[0142] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção possui uma ou mais das seguintes características: (i) mostrar a mesma afinidade ou/ou especificidade de ligação igual ou semelhante a PD-Ll que o anticorpo da invenção (por exemplo, qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3); (11) inibir (por exemplo, inibição competitiva) a ligação do anticorpo da invenção (por exemplo, qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3) ao PD-L1; (iii) ligar ao mesmo epítopo ou sobreposição que o anticorpo da invenção (por exemplo, qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3); (iv) competir com o anticorpo da invenção (por exemplo, qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3) pela ligação a PD-L1;

(v) ter uma ou mais características biológicas do anticorpo da invenção (por exemplo, qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3).

Anticorpos exemplares

[0143] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH), em que o VH compreende: (1) três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) contidas em um VH de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela B, ou (11) em relação à sequência de (i), uma sequência compreendendo um total de pelo menos uma e não mais de 5, 4, 3, 2 ou 1 alternância de aminoácidos (preferencialmente substituição de aminoácidos, preferencialmente substituição conservadora) nos três Regiões CDR.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-Ll1 ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma região variável de cadeia leve (VL), em que o VL compreende: (1) três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) contidas em uma VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela B, ou (ii) em relação à sequência de (i), uma sequência compreendendo um total de pelo menos uma e não mais de 5, 4, 3, 2 ou 1 alternância de aminoácidos (preferencialmente substituição de aminoácidos, preferencialmente substituição conservadora) nos três Regiões CDR.

[0144] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada VH e uma região variável de cadeia leve VL, em que (a) o VH compreende: (1) três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) contidas em um VH de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela B, ou (ii) em relação à sequência de (i), uma sequência compreendendo um total de pelo menos uma e não mais de 5, 4, 3, 2 ou 1 alternância de aminoácidos (preferencialmente substituição de aminoácidos, preferencialmente substituição conservadora) nos três Regiões CDR; e/ou (b) a VL compreende: (i) três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) contidas em uma VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela B, ou (ii) em relação à sequência de (i), uma sequência compreendendo um total de pelo menos uma e não mais de 5, 4, 3, 2 ou l alternância de aminoácidos (preferencialmente substituição de aminoácidos, preferencialmente substituição conservadora) nos três Regiões CDR.

[0145] Em uma modalidade preferida, o VH compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, ou 31.

[0146] Em uma modalidade preferida, a VL compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 ou 37.

[0147] Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-PD-L1 ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende: (i) três regiões determinantes de complementaridade HCDRs da região variável de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 26 ou 30 e três regiões determinantes de complementaridade HCDRs da região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 32 ou 36, ou (ii) três regiões determinantes de complementaridade HCDRs da região variável de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 27 e três regiões determinantes de complementaridade LCDRs da região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 33, ou (iii) três regiões determinantes de complementaridade HCDRs da região variável de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 28 e três regiões determinantes de complementaridade

LCDRs da região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 34, ou (iv) três regiões determinantes de complementaridade HCDRs da região variável de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 29 ou 31l e três regiões determinantes de complementaridade LCDRs da região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 35 ou 37.

[0148] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL), em que (i) o VH compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs), HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que o HCDR1 compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4, ou o HCDRI compreende uma sequência de aminoácidos com uma, duas ou três alternações (preferencialmente substituições de aminoácidos, preferencialmente substituições conservadoras) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4; o HCDR2 compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 ou 9, ou o HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos com uma, duas ou três alternações (de preferência amino substituições de ácidos,

preferencialmente substituições conservativas) comparadas com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 ou 9; o HCDR3 compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 13, ou o HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos com uma, duas ou três alternações (preferencialmente substituições de aminoácidos , preferencialmente substituições conservadoras) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 13;

e/ou

(ii) a VL compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs), LCDR1I, LCDR2 e LCDR3, em que a LCDR1 compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 14, ou 16 ou LCDRI compreende uma sequência de aminoácidos possuindo uma, duas ou três alternações (preferencialmente substituições de aminoácidos, preferencialmente substituições conservadoras) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, 15 ou 16; o LCDR2 compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 18, 19 ou 20, ou o LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos com uma, duas ou três alternações (preferencialmente substituições de aminoácidos,

de preferência substituições conservadoras) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 18, 19 ou 20; o LCDR3 compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 ou 25, ou o LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos com uma, duas ou três alternações (de preferência amino substituições de ácido, preferencialmente substituições conservadoras) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 ou 25.

[0149] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um anticorpo anti-PD-Ll ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL), em que (a) o VH compreende: (i) uma combinação de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrada na Tabela A; ou (ii) uma variante de uma combinação de HCDR de (i), compreendendo um total de pelo menos uma e não mais de 5, 4, 3, 2 ou 1 alternância de aminoácidos (preferencialmente substituição de aminoácidos, preferencialmente substituição conservadora) na três regiões CDR; e/ou

(b) a VL compreende: (i) uma combinação de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostrada na Tabela A; ou (ii) uma variante de uma combinação de LCDR de (i), compreendendo um total de pelo menos uma e não mais de 5, 4, 3, 2 ou 1 alternância de aminoácidos (preferencialmente substituição de aminoácidos, preferencialmente substituição conservadora) nos três Regiões CDR.

[0150] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um anticorpo anti-PD-Ll ou um fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que o VH compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs), HCDRlI, HCDR2 e HCDR3, e o VL compreende CDRs, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que as combinações de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1I, LCDR2 e LCDR3 contidas no anticorpo ou no seu fragmento de ligação ao antígeno são mostrado na tabela a seguir (Tabela A): Tabela A: Combinações exemplares de HCDRl1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 no anticorpo ou no seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção

EEE que que que que que que compreend | compreend | compreend | compreend | compreend| compreend Combinaçõ e ou e ou e ou e ou e ou e ou es consiste | consiste | consiste | consiste | consiste | consiste em uma em uma em uma em uma em uma em uma sequência | sequência | sequência | sequência | sequência | sequência de de de de de de aminoácid | aminoácid|aminoácid|aminoácid|amincácid|aminoácid os os os os os os mostrada | mostrada | mostrada | mostrada | mostrada | mostrada nas nas nas nas nas nas seguintes | seguintes | seguintes | seguintes |seguintes|seguintes

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NOs Nos Nos NOs Nos NOs 1) SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 1 NO: 5 NO: 10 NO: 14 NO: 17 NO: 21 (2) SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 2 NO: 6 NO: 11 NO: 15 NO: 18 NO: 22 (3) SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 2 NO: 7 NO: 12 NO: 15 NO: 18 NO: 23 (4) SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 3 NO: 8 NO: 13 NO: 16 NO: 19 NO: 24

SEQ ID (5) SEQ ID SEQ ID NO: 10, no 1a SEQ ID SEQ ID NO: 4 NO: 9 11, 12, : ! NO: 20 NO: 25 15, ou 16 ou 13

[0151] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada VH e/ou uma região variável de cadeia leve VL, em que (a) região variável de cadeia pesada VH (1) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 ou 31; (ii) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 ou 31; ou (iii) compreende uma sequência de aminoácidos tendo 1 ou mais (preferencialmente não mais que 10, mais preferencialmente não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1) alterações de aminoácidos (preferencialmente substituições de aminoácidos, mais preferencialmente substituições conservadoras de aminoácidos) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 ou 31, em que preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas CDRs;

[0152] e/ou (b) região variável de cadeia leve VL (i) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 ou 37; (ii) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36 ou 37; ou (iii) compreende uma sequência de aminoácidos tendo 1 ou mais (preferencialmente não mais que 10, mais preferencialmente não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1) alterações de aminoácidos (preferencialmente substituições de aminoácidos, mais preferencialmente substituições conservadoras de aminoácidos) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO:

32, 33, 34, 35, 36 ou 37, em que preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas CDRs.

[0153] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um anticorpo anti-PD-Ll1 ou um fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que combinações da região variável de cadeia pesada O VH e a região variável de cadeia leve VL contidos no anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo são mostrados na tabela a seguir (Tabela B): Tabela B: Combinações exemplares da região variável de cadeia pesada VH e da região variável de cadeia leve VL no anticorpo ou no seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção Combinações|VH, que compreende ou VL, que compreende ou consiste na sequência [consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos mostrada na seguinte mostrada na seguinte

SEQ ID NO SEQ ID NO lmM) so ID NO: 26 SEQ ID NO: 32 lt) seo ID NO: 27 SEQ ID NO: 33 63) — |sEQIDNO: 28 SEQ ID NO: 34 |) —— Tsso ID NO: 29 SEQ ID NO: 35 |'5) — /SEQIDNO: 30 SEQ ID NO: 36 66) —|seo ID NO: 31 SEQ ID NO: 37

[0154] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve, em que

(a) a cadeia pesada (i) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com um amino sequência de ácido selecionada a partir da SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45; (ii) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45; Ou (iii) compreende uma sequência de aminoácidos com 1 ou mais (preferencialmente não mais que 20 ou 10, mais preferencialmente não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1) alterações de aminoácidos (preferencialmente substituições de aminoácidos, mais preferencialmente conservadoras de aminoácidos substituições) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45, em que preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas CDRs da cadeia pesada, e mais preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem na região variável de cadeia pesada;

[0155] e/ou (b) a cadeia leve (i) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com um amino sequência ácida selecionada a partir da SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50 ou 51; (ii) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50 ou 51; ou (iii) compreende uma sequência de aminoácidos com 1 ou mais (preferencialmente não mais que 20 ou 10, mais preferencialmente não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1) alterações de aminoácidos (preferencialmente substituições de aminoácidos, mais preferencialmente conservadoras de aminoácidos substituições) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50 ou 51, em que preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas CDRs da cadeia leve e, mais preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem na região variável de cadeia leve;

[0156] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um anticorpo anti-PD-Ll ou um fragmento de ligação ao antígeno, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que as combinações das cadeias pesada e leve contidas no anticorpo ou na ligação ao antígeno seu fragmento são mostrados na tabela a seguir (Tabela C): Tabela C: Combinações exemplares de cadeia pesada e cadeia leve no anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção

Combinações|HC, que compreende ou LC, que compreende ou consiste na sequência consiste na sequência de aminoácidos de aminoácidos mostrada mostrada na seguinte na seguinte SEQ ID NO

SEQ ID NO |&ã) — |sEo ID NO: 38 SEQ ID NO: 46 lt) —|seo ID NO: 39 SEQ ID NO: 47 63) —— seo IDNO: 40 SEQ ID NO: 48 [& ser: SEQ ID NO: 4º |) — Ísso ID NO: 42 SEQ ID NO: 50 |66) — ÍsEo ID NO: 43 SEQ ID NO: 50 |) ssa 1DNO: M SEQ ID NO: 50 lt8) —— |sEQ IDNO: 45 SEQ ID NO: 51

[0157] Em algumas modalidades, a cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo anti-PD-Ll1 ou fragmento do mesmo da invenção compreende ainda uma sequência peptídica de sinal, como METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 68).

[0158] Em uma modalidade da invenção, a alternância de aminoácidos aqui descrita inclui substituição, inserção ou exclusão de aminoácidos. De preferência, a alternância de aminoácidos aqui descrita é a substituição de aminoácidos, de preferência a substituição conservadora.

[0159] Em uma modalidade preferida, a alteração de aminoácidos aqui descrita ocorre em regiões fora das CDRs (por exemplo, em FRs). Mais preferencialmente, a alternância de aminoácidos aqui descrita ocorre em regiões fora da região variável de cadeia pesada e/ou fora da região variável de cadeia leve.

[0160] Opcionalmente, o anticorpo anti-PD-Ll da invenção compreende modificações pós-traducionais na região variável de cadeia leve, na região variável de cadeia pesada, na cadeia leve ou na cadeia pesada. Modificações pós-tradução exemplificativas incluem formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra operação, como conjugação com um componente de marcação.

[0161] Em algumas modalidades, a substituição é uma substituição conservadora. Uma substituição conservadora se refere a uma substituição de um aminoácido por outro aminoácido da mesma classe, por exemplo, uma substituição de aminoácidos ácidos por outro aminoácido ácido, uma substituição básica de aminoácidos por outro aminoácido básico ou uma substituição neutra de aminoácidos por outro aminoácido neutro. Substituições exemplares são mostradas na Tabela D abaixo: Tabela D Resíduo original Substituição exemplar | Substituição preferida ARO Val: Teu: Te arg (3) Tys: Gin: Asn Asn (N) Gln: His: Asp, Lys: Gln Arg Esp O) Gus sm cvs (O) Gin (O) lu (E) Asp; Gin Gly (6) Tle (1) Leu: Val: Met: Ala: Leu Phe: norleucina

Leu (L) Norleucine: Ile: Val: Ile Met: Ala: Phe Es (O Arg: Gin: Asn Met (M) Leu: Phe: Tle Phe (F) Trp: Leu: Val: Ile: Tyr Ala: Tyr Trp (MW) Tyr: Phe Tyr (O) Trp: Pher The: Ser val (V) Ile: Leu: Met: Phe: Leu Ala: norleucina

[0162] Em certas modalidades, o anticorpo aqui fornecido é alterado para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de locais de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente alcançada alterando a sequência de aminoácidos de modo que um ou mais locais de glicosilação sejam criados ou removidos.

[0163] Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser realizadas para eliminar um ou mais locais de glicosilação da estrutura de região variável, eliminando desse modo a glicosilação nesse local. Essa aglicosilação pode aumentar a afinidade de um anticorpo para um antígeno. Ver, por exemplo, as Patentes US Nos. 5.714.350 e 6.350.861. Anticorpos com classes alteradas de glicosilação podem ser preparados, como anticorpos com baixo fucosilado com quantidades reduzidas de resíduos de fucosil ou anticorpos com estruturas de GlcNac bissecionadas aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados mostraram a capacidade de aumentar o ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidratos podem ser conseguidas expressando anticorpos em células hospedeiras com sistemas de glicosilação alterados. células com sistemas de glicosilação alterados foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais os anticorpos da invenção são expressos para assim produzir anticorpos com glicosilação alterada.

Por exemplo, as linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 não possuem o gene fucosiltransferase FUT8 (a (1,6) -ucosiltransferase), de modo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709 não possuem fucose em seus carboidratos.

As linhagens celulares Ms704, Ms705 e Ms709FUT8 -/- são criadas usando dois vetores alternativos para direcionar o gene FUT8 nas células CHO/DG44 para rompimento (consulte a Publicação de Patente US No. 20040110704 e Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22). O documento EP 1.176.195 descreve linhagens celulares com um gene FUT8 funcionalmente interrompido que codifica uma fucosiltransferase, de modo que os anticorpos expressos nas linhagens celulares exibam baixa fucosilação reduzindo ou eliminando enzimas relacionadas à ligação a- 1,6. O documento EP 1.176.195 também descreve linhagens celulares com baixa ou nenhuma atividade enzimática que adicionam fucose à ligação de N-acetilglucosamina às regiões Fc de um anticorpo, como a linhagem celular de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662). A publicação PCT WOO03/035835 descreve uma célula variante da linhagem celular CHO Lec1l3,

na qual a capacidade de anexar fucose aos carboidratos ligados a Asn (297) é reduzida, levando também à baixa fucosilação de anticorpos expressos na célula hospedeira (ver também Shields et al. (2002) J.

Biol.

Chem. 277: 26733- 26740). Anticorpos com perfis de glicosilação modificados também podem ser produzidos em ovos, como descrito na publicação PCT WO06/089231. Alternativamente, anticorpos com perfis de glicosilação modificados podem ser produzidos em células vegetais, como Lemna.

Um método para a produção de anticorpos em sistemas vegetais é divulgado em um pedido de patente dos EUA apresentado em 11 de agosto de 2006, correspondendo a Alston e Bird LLP.

Documento de Advogado nº 040989/314911. A publicação PCT WO99/54342 descreve uma linhagem celular projetada para expressar uma glicosiltransferase modificadora de glicoproteínas [como Bb (1,4) -N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)], assim os anticorpos expressos na linhagem celular manipulada exibem estruturas GlcNac aumentadas em bissecção, que resulta em aumento da atividade ADCC do anticorpo [ver também Umana et al. (1999) Nat.

Biotecnologia. 17: 176-180]). Alternativamente, a fucosidase pode ser usada para cortar resíduos fucosil do anticorpo; por exemplo, a-L-fucosidase remove resíduos fucosil do anticorpo [Tarentino et al. (1975) Biochem. 14: 5516-23].

[0164] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou o fragmento da invenção é glicosilado com um glicano ligado a N de levedura manipulada ou glicano ligado a CHO N.

[0165] Outra modificação abrangida pela invenção no anticorpo ou no seu fragmento aqui descrito é a PEGuilação. Um anticorpo pode ser PEGuilado para, por exemplo, aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para PEGilar um anticorpo, o anticorpo ou fragmento do mesmo reage tipicamente com polietileno glicol (PEG) (como um éster reativo ou derivado de aldeído do PEG) em uma condição em que um ou mais grupos PEG se ligam ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferencialmente, a PEGilação é realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação usando uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo semelhante). Como aqui utilizado, o termo "polietileno glicol" pretende abranger qualquer forma de PEG que tenha sido usada para derivar outras proteínas, como mono (C1-Cl0) alcoxi ou ariloxi polietileno gqglicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, O anticorpo a ser PEGuilado é um anticorpo aglicosilado. Os métodos para PEGilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados ao anticorpo da invenção, ver, por exemplo, EP 0154316 e EP 0401384.

[0166] Em certas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas em uma região Fc de um anticorpo aqui fornecido, produzindo assim uma variante da região Fc de modo que, por exemplo, a eficácia do anticorpo no tratamento de câncer ou de uma doença proliferativa celular seja aprimorada. O anticorpo anti-PD-Ll1 (por exemplo, anticorpo humanizado ou quimérico) e o seu fragmento de ligação ao antígeno divulgado aqui também incluem anticorpos e fragmentos com regiões Fc modificadas (ou fechadas) para fornecer funções efetoras alteradas. Ver, por exemplo, Patente US No. 5.624.821, WO2003/086310, WO2005/120571, WO2006/0057702. Tais modificações podem ser usadas para melhorar ou suprimir várias respostas do sistema imunológico e podem ter efeitos benéficos no diagnóstico e tratamento. As modificações da região Fc incluem alternância de aminoácidos (substituição, deleções e inserção), glicosilação ou desglicosilação e adição de Fc múltiplo. Modificações em Fc também podem alterar a meia-vida do anticorpo nos anticorpos terapêuticos, permitindo administrações menos frequentes e, assim, maior conveniência e menor uso de material. Ver Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731, páginas 734-735.

[0167] Em uma modalidade, o número de resíduos de cisteína de um anticorpo pode ser alterado para modificar as propriedades do anticorpo. Por exemplo, a região de charneira de CH1l é modificada para alterar (por exemplo, aumentar ou diminuir) o número de resíduos de cisteína na região de charneira. Este método é ainda descrito na Patente US No.

5.677.425. O número de resíduos de cisteína na região charneira de CHl pode ser alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leve e pesada, ou aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[0168] Em certas modalidades, os anticorpos aqui fornecidos podem ser ainda modificados para conter outras porções não proteicas conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. Porções adequadas para derivatização de anticorpos incluem, mas não estão limitadas a polímeros solúveis em água. Exemplos não limitativos de polímeros solúveis em água incluem, entre outros, copolímeros de polietileno glicol (PEG), etileno glicol/propileno glicol, carboximetil celulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-l,3-dioxano, poli- 1,3,6- trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácido (homopolímero ou copolímero aleatório) e dextrano ou poli (n-etileno metilpirrolidona) polietileno glicol, homopolímero de propileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado (como glicerol), álcool polivinílico e suas misturas. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros conectados ao anticorpo pode variar e, se mais de um polímero estiver conectado, eles podem ser a mesma molécula ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização podem ser determinados com base em considerações que incluem, entre outras, as características ou funções específicas do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado de anticorpo será usado em terapia em áreas definidas condições etc.

[0169] Em algumas modalidades, a invenção abrange fragmentos dos anticorpos anti-PD-Ll. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, EFv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv), anticorpos de domínio único e anticorpos biespecíficos formado a partir dos fragmentos de anticorpo.

[0170] Por exemplo, a molécula de anticorpo pode compreender uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (HC) e uma sequência de domínio variável de cadeia leve (LC). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo (aqui referida como um anticorpo incompleto) compreende ou consiste em uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Em outro exemplo, a molécula de anticorpo contém duas sequências de domínio variável da cadeia pesada e duas sequências de domínio variável da cadeia leve, formando assim dois locais de ligação ao antígeno. Tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Fd, Fd', Fv, anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv), anticorpos de domínio único, diacorpo (Dab) (bivalente e biespecífico) e quimérico (por exemplo, humanizados), que podem ser produzidos modificando anticorpos intactos ou sintetizados de novo usando a tecnologia de DNA recombinante. Estes fragmentos de anticorpos funcionais mantêm a capacidade de se ligar seletivamente aos seus antígenos ou receptores correspondentes. Os anticorpos e os fragmentos de anticorpo podem ser de qualquer classe de anticorpo, incluindo, sem limitação, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE e de qualquer subclasse de anticorpo (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4). A preparação de moléculas de anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. O anticorpo pode ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado em CDR ou um anticorpo produzido in vitro. O anticorpo pode ter, por exemplo, uma região constante da cadeia pesada selecionada dentre IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. O anticorpo também pode ter uma cadeia leve selecionada de, por exemplo, kappa ou lambda.

[0171] O anticorpo da invenção também pode ser um anticorpo de domínio único. O anticorpo de domínio único pode incluir anticorpo cujas regiões determinantes de complementaridade fazem parte de um polipeptídeo de domínio único. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a anticorpos da cadeia pesada, anticorpos “naturalmente desprovidos de cadeias leves, anticorpos de domínio único ou anticorpos modificados derivados do anticorpo convencional de 4 cadeias. O anticorpo de domínio único pode ser qualquer anticorpo da técnica anterior ou qualquer anticorpo de domínio único no futuro. O anticorpo de domínio único pode ser derivado de qualquer espécie, incluindo, mas não se limitando a, camundongo, humano, camelo, alpaca, peixe, tubarão, cabra, coelho e gado. De acordo com outro aspecto da invenção, o anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único de ocorrência natural, que é referido como um anticorpo de cadeia pesada desprovido de cadeias leves. Tais anticorpos de domínio único são divulgados, por exemplo, no documento WOS4/04678. Um anticorpo ou nanocorpo de domínio único pode ser um anticorpo produzido a partir de espécies de camelídeos, como camelo, alpaca, dromedário, lhama e guanaco. Espécies diferentes do camelo podem produzir anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeias leves; esses anticorpos de domínio único estão dentro do escopo da invenção.

[0172] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 da invenção é um anticorpo humanizado. Diferentes métodos para humanizar anticorpos são conhecidos dos especialistas como resumido por Almagro & Fransson, cujo conteúdo é aqui totalmente incorporado por referência [Almagro J.C. e Fransson J (2008) Frontiers in Bioscience 13: 1619-1633]. Almagro & Fransson distingue entre abordagem racional e abordagem empírica. A abordagem racional é caracterizada por gerar um pequeno número de variantes de anticorpos manipulados e avaliar sua ligação ou qualquer outra característica de interesse. Se variantes do design não produzirem os resultados esperados, uma nova rodada de avaliação de design e integração será iniciada. A abordagem racional inclui enxerto de CDR, recapeamento, super- humanização e otimização do conteúdo de cordas humanas. Por outro lado, o método empírico é baseado na geração de grandes bibliotecas de variantes humanizadas e seleciona os melhores clones usando técnicas de enriquecimento ou triagem de alto rendimento. Assim, a abordagem empírica depende de um sistema confiável de seleção e/ou triagem capaz de pesquisar um grande número de variantes de anticorpos. Tecnologias de exibição in vitro, como exibição de fagos e exibição de ribossomos, atendem a esses requisitos e são bem conhecidas dos especialistas. A abordagem empírica inclui a construção de bibliotecas de FR, seleção guiada, embaralhamento de estruturas e humanização.

[0173] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1l é um anticorpo humano. O anticorpo humano pode ser preparado através de uma variedade de técnicas conhecidas na arte. O anticorpo humano é geralmente descrito em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol 20: 450-459 (2008). Por exemplo, um camundongo transgênico carregando genes de imunoglobulina humana em vez de um sistema de camundongo pode ser usado para produzir anticorpos monoclonais humanos (ver, por exemplo, Wood et al., Pedido Internacional WO 91/00906; Kucherlapati et al., PCT Publicação WO 91/10741; Lonberg et al., Pedido Internacional WO 92/03918; Kay et al., Pedido Internacional 92/03917; Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368: 856-859; Green, LL et al., 1994 Nature Genet. 7: 13-21; Morrison, SL et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman et al., 1993 Yeast Immunol 7: 33-40; Tuaillon et al., 1993 PNAS 90: 3720-3724; e Bruggeman et al., 1991 Eur J Immunol 21: 1323-1326).

[0174] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll1 da invenção é um anticorpo não humano, como um anticorpo de roedor (camundongo ou rato), um anticorpo de cabra, um anticorpo de primata (por exemplo, macaco) e um anticorpo camelídeo. De preferência, o anticorpo não humano é um anticorpo para roedores (camundongo ou rato). Um método para a produção do anticorpo para roedores é conhecido na técnica.

[0175] Em algumas modalidades, o anticorpo da invenção é um anticorpo quimérico. Alguns anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No.

4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 81: 6851-6855, 1984. Em uma modalidade, o anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de camundongos, ratos, hamsters,

coelhos ou primatas não humanos, como macacos) e uma constante humana região. Em outra modalidade, o anticorpo quimérico é um anticorpo "comutado de classe", cuja classe ou subclasse foi alterada em comparação com a classe ou subclasse de anticorpo parental. O anticorpo quimérico inclui seus fragmentos de ligação ao antígeno.

[0176] Em certas modalidades, o anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir sua imunogenicidade em humanos, mantendo a especificidade e afinidade de seu anticorpo não humano original. Em geral, o anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, em que, por exemplo, uma CDR (ou uma parte dele) é derivada do anticorpo não humano e uma FR (ou uma parte dele) é derivada de uma sequência de anticorpos humanos. Opcionalmente, o anticorpo humanizado compreende ainda pelo menos parte da região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos FR no anticorpo humanizado são substituídos pelos resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[0177] O anticorpo da invenção pode ser isolado por triagem de uma biblioteca combinatória para anticorpos com atividades desejadas. Por exemplo, vários métodos são conhecidos na técnica para gerar bibliotecas de exibição de fagos e rastrear as bibliotecas quanto aos anticorpos com características de ligação desejadas. Os métodos são descritos em, por exemplo, Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (compilado por O 'Brien et al., Human Press, Totowa, NI, 2001) e mais detalhadamente descritos em, por exemplo McCafferty et al., Nature 348 552-554; Clackso et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks e Bradbury, Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (compilado por Lo, Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol 340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34) : 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Imunol. Methods 284 (1-2): 1119-132 (2004).

[0178] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo monoespecífica e se liga a um único epítopo. Por exemplo, a molécula de anticorpo monoespecífico inclui uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina que cada uma se liga ao mesmo epítopo.

[0179] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo multiespecífica, por exemplo, a molécula de anticorpo compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina, em que uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo, e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão no mesmo antígeno (por exemplo, a mesma proteína ou a mesma subunidade de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos não se sobrepõem. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão localizados em antígenos diferentes (por exemplo, proteínas diferentes ou subunidades diferentes de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo multiespecífico compreende um terceiro, quarto ou quinto domínio variável da imunoglobulina. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo multiespecífico é uma molécula de anticorpo biespecífica ou uma molécula de anticorpo triespecífico ou uma molécula de anticorpo tetraespecífico.

[0180] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo multiespecífico é uma molécula de anticorpo biespecífica. Um anticorpo biespecífico é específico para não mais que dois antígenos. Uma molécula de anticorpo biespecífica é caracterizada por uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina com especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina com especificidade de ligação para um segundo epítopo.

Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão no mesmo antígeno (por exemplo, a mesma proteína ou a mesma subunidade de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem.

Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos não se sobrepõem.

Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão localizados em antígenos diferentes (por exemplo, proteínas diferentes ou subunidades diferentes de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífica compreende sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve com especificidade de ligação para um primeiro epítopo e sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve com especificidade de ligação para um segundo epítopo.

Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífica compreende um anticorpo incompleto tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo e um anticorpo incompleto tendo especificidade de ligação para um segundo epítopo.

Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífica compreende um anticorpo incompleto ou um fragmento do mesmo com especificidade de ligação para um primeiro epítopo e um anticorpo incompleto ou um fragmento do mesmo com especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo biespecífico compreende um scFv ou um fragmento do mesmo com especificidade de ligação para um primeiro epítopo, e um scFfv ou um fragmento do mesmo com especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, o primeiro epítopo está no PD-Ll1 e o segundo epítopo está no LAG-3, OX40, TIM-3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-l e/ou CEACAM-5) ou PD-L2.

[0181] Em algumas modalidades, a invenção fornece ainda um anticorpo monoclonal anti-PD-L1 ("um imunoconjugado") conjugado com outras substâncias, por exemplo, uma fração ou marcador terapêutico, como um agente citotóxico ou um imunomodulador. O agente citotóxico inclui qualquer agente prejudicial para as células. Exemplos de agente citotóxico (por exemplo, um agente quimioterápico) adequado para formar o imunoconjugado são conhecidos na técnica, ver por exemplo WO2015/153513 ou WO2015/138920 ou semelhante. Por exemplo, o agente citotóxico inclui, mas não está limitado a, radioisótopos, por exemplo, iodo (131I ou 1251), ítrio (90X), lutécio (17LU), actínio (225AC) , praseodímio, astatina (211At), rênio (18Re ), bismuto (212Bi ou 213Bi), índio (111In), tecnécio (99mTc), fósforo (32P), ródio (188Rh), enxofre (35S), carbono (1C), trítio (3H), cromo (5s1Cr), cloro (36Cl), cobalto (515Co ou 568Co), ferro (59Fe), selênio (158Se) ou gálio (67Ga) . Exemplos de agentes citotóxicos incluem ainda agentes quimioterápicos ou outra substância terapêutica, por exemplo, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, teniposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunomicina, dihidroxiantracitrina, dihidroxiantracitrina, midrotransamina, actinomicina D, l-di-hidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos de todos os agentes terapêuticos acima. Os agentes citotóxicos incluem ainda, por exemplo, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5- fluorouracil e dacarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioefaloramucil, melfalano, carmustina (BSNU) CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis- diclorodiamminaplatina (II) (DDP) cisplatina), antramicinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente conhecida como daunomicina) e doxorrubicina D), antibióticos (actiotina) conhecida como actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)) e antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

[0182] Substâncias que podem ser conjugadas/acopladas ao anticorpo anti-PD-Ll podem ser vistas, por exemplo, nos documentos WO2010/077634 ou US60/696426 ou WO2016/007235 ou WO2016/061142 ou similares.

Ácido nucleico da invenção e célula hospedeira compreendendo o mesmo

[0183] Em um aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-PD-L1l acima ou seus fragmentos. O ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo a região variável de cadeia leve e/ou a região variável de cadeia pesada do anticorpo, ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a cadeia leve e/ou a cadeia pesada do anticorpo.

[0184] Por exemplo, um exemplo de ácido nucleico da invenção inclui um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26 a 51 ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26 a 51.

[0185] A invenção fornece ainda um ácido nucleico que é hibridado sob uma condição rigorosa com o seguinte ácido nucleico ou uma variação do seguinte ácido nucleico com uma ou mais substituições (por exemplo, substituições conservativas), deleções ou inserções: um ácido nucleico que codifica um aminoácido sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26 a 51; ou um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com um aminoácido sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26 a 51.

[0186] Em uma modalidade, são fornecidos um ou mais vetores contendo o ácido nucleico. Em uma modalidade, o vetor é um vetor de expressão, como um vetor de expressão eucariótico. O vetor inclui, mas não está limitado a um vírus, um plasmídeo, um cosmídeo, um fago lambda ou um cromossomo artificial de levedura (YAC). Inúmeros sistemas vetoriais podem ser usados. Por exemplo, uma classe de vetores utiliza elementos de DNA derivados de vírus animais, como vírus de papiloma bovino, poliomavírus, adenovírus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovírus (vírus de sarcoma de Rous ou MMTV ou MOMLV) e vírus SV40. Outra classe de vetores utiliza elementos de RNA derivados de vírus de RNA, como o vírus da Floresta Semliki, vírus da encefalite equina oriental e flavivírus. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão da presente invenção é um vetor de expressão pTT5.

[0187] Além disso, as células que possuem DNA estavelmente incorporado nos seus cromossomos podem ser selecionadas através da introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas.

Os marcadores podem, por exemplo, fornecer prototrofia, resistência biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados (por exemplo, cobre), etc., para um hospedeiro auxotrófico. Os genes marcadores selecionáveis podem ser ligados diretamente a uma sequência de DNA a ser expressa ou introduzida por co-transformação na mesma célula. Elementos “adicionais também podem ser necessários para a síntese ideal de mRNA. Os elementos podem incluir sinais de junção, promotores de transcrição, potenciadores e sinais de terminação.

[0188] Uma vez que o vetor de expressão ou sequência de DNA tenha sido preparado para expressão, o vetor de expressão pode ser transfectado ou introduzido em células hospedeiras adequadas. Várias técnicas podem ser usadas para esse fim, por exemplo, fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, eletroporação, transdução retroviral, transfecção viral, biolística, transfecção à base de lipídios ou outras técnicas convencionais. No caso de fusão de protoplastos, as células são incubadas em meio de cultura e rastreadas quanto à atividade apropriada. Os métodos e condições para incubar a célula transfectada resultante e para recuperar as moléculas de anticorpo resultantes são conhecidos dos especialistas na técnica e podem ser variados ou otimizados de acordo com o vetor de expressão particular e a célula hospedeira de mamífero específica usada com base na presente descrição e métodos conhecido na técnica.

[0189] Em uma modalidade, é fornecida uma célula hospedeira contendo um ácido nucleico que codifica a molécula de anticorpo aqui descrita ou o vetor aqui descrito. As células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar o ácido nucleico que codifica o anticorpo ou o vetor incluem células procarióticas ou eucarióticas, como aqui descrito. O anticorpo pode ser produzido, por exemplo, em bactérias, particularmente quando a glicosilação e as funções efetoras de Fc não são necessárias. A expressão de um fragmento de anticorpo e um polipeptídeo em bactérias é descrita em, por exemplo, Pat. 5648237, 5789199 e 5840523, e também descrito em Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pág. 245-254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli. Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta bacteriana na fração solúvel e pode ser ainda mais purificado. Em uma modalidade, a célula hospedeira é E. coli.

[0190] Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica. Em outra modalidade, a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em leveduras, células de mamífero (por exemplo, uma célula humana), células de insetos, células vegetais ou outras células adequadas para a preparação de um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Por exemplo, microrganismos eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para o vetor que codifica o anticorpo, incluindo cepas de fungos e leveduras nas quais uma via de glicosilação foi "humanizada", resultando na produção de um anticorpo com parcial ou totalmente padrão de glicosilação humana, referindo-se a Gerngross, Nat. Biotecnologia. 22: 1409-1414 (2004) e Nat. Biotecnologia. 24: 210-215 (2006). As células hospedeiras adequadas para expressar um anticorpo glicosilado também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados).

[0191] As células vertebradas também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, pode ser utilizada uma linhagem celular de mamífero projetada para ser adequada ao crescimento em suspensão. Outros exemplos de linhas de células hospedeiras de mamíferos úteis são as linhas CVl1 de rim de macaco (COS-7) transformadas com SV40, linhas de rim embrionário humano (células 293HEK ou 293, como descrito em, por exemplo, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)) e similares. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 216 (1980)) e linhagens celulares de mieloma como Y0, NSO0 e Sp2/0.

[0192] Revisões de certas linhas de células hospedeiras de mamíferos adequadas para produção de anticorpos podem ser vistas, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pág. 255-268 (2003). Outras células hospedeiras úteis incluem, mas não estão limitadas a células Vero, células Hela, células COS, células CHO, células HEK293, células BHK, células MDCKII, oócitos de linhagens celulares PerC6 (por exemplo, células PERC6 de Crucell) e células de animais transgênicos, como células epiteliais mamárias. As células de inseto adequadas incluem, mas não estão limitadas a células Sf9.

Método para preparar anticorpo e seu fragmento de ligação ao antígeno

[0193] O anticorpo anti-PD-L1 aqui divulgado pode ser produzido de forma recombinante. Existem vários métodos conhecidos na técnica para a produção de anticorpos recombinantes. Um exemplo de métodos para a produção recombinante de anticorpos é divulgado na Patente U.S. No.

4.816.567.

[0194] Em uma modalidade, é fornecido um método para a preparação de um anticorpo anti-PD-Ll1, em que o método compreende etapas de incubar células hospedeiras contendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo, como fornecido acima, em condições adequadas para expressar anticorpos e,

opcionalmente, recuperar o anticorpo das células hospedeiras (ou das culturas de células hospedeiras). Para a produção recombinante do anticorpo anti-PD-Ll, um ácido nucleico que codifica o anticorpo (por exemplo, o anticorpo descrito acima) é isolado e inserido em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ou expressão nas células hospedeiras. O ácido nucleico é facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos).

[0195] Em uma modalidade, a célula hospedeira contém um vetor que inclui um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de um VL do anticorpo e um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de um VH do anticorpo. Em uma modalidade, a célula hospedeira contém um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de um VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de um VH do anticorpo.

Análise

[0196] O anticorpo anti-PD-Ll1 aqui fornecido pode ser identificado, rastreado ou caracterizado por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividade biológica através de uma variedade de ensaios conhecidos na técnica.

Num aspecto, a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo da invenção é testada, por exemplo, por métodos conhecidos como ELISA, Western blotting, citometria de fluxo e esferas magnéticas revestidas com moléculas de anticorpo. A ligação ao PD-Ll pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, e métodos exemplares são aqui divulgados. Em algumas modalidades, uma interferometria óptica biológica (por exemplo, medição de afinidade de Fortebio) ou ensaio de MSD ou citometria de fluxo é usada.

[0197] Em outro aspecto, um ensaio de ligação competitiva pode ser usado para identificar um anticorpo que compete pela ligação a PD-L1 com qualquer um dos anticorpos anti-PD-Ll1 aqui divulgados. Em algumas modalidades, esses anticorpos competitivos se ligam ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que qualquer um dos anticorpos anti-PD-Ll aqui divulgados. Um método exemplar detalhado para localizar um epítopo de ligação ao anticorpo é descrito em Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

[0198] A invenção fornece ainda um ensaio para identificar um anticorpo anti-PD-L1l possuindo uma ou mais das propriedades descritas acima. Além disso é fornecido um anticorpo com essas atividades biológicas in vivo e/ou in vitro.

[0199] Em algumas modalidades, o anticorpo da invenção é testado para uma ou mais das propriedades descritas acima.

[0200] As células para utilização em qualquer um dos referidos ensaios in vitro incluem células ou linhagens celulares que expressam naturalmente PD-Ll ou que são modificadas por engenharia para expressar PD-L1.

[0201] Será apreciado que qualquer um dos referidos ensaios pode ser realizado utilizando o imunoconjugado da invenção em vez de ou em adição ao anticorpo anti-PD-L1.

[0202] Será apreciado que qualquer um dos referidos ensaios pode ser realizado usando o anticorpo anti-PD-L1 e outros agentes terapêuticos.

Composição farmacêutica e preparação farmacêutica

[0203] A invenção fornece ainda uma composição (incluindo uma composição farmacêutica ou uma preparação farmacêutica) compreendendo um anticorpo anti-PD-Ll ou um fragmento do anticorpo ou um imunoconjugado do mesmo, e uma composição compreendendo o ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-PD-Ll ou o seu fragmento. Em certas modalidades, as composições compreendem um ou mais anticorpos que se ligam a PD-Ll ou fragmentos dos anticorpos ou imunoconjugados dos mesmos, ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam os um ou mais anticorpos que se ligam a PD-L1 ou seus fragmentos. Tais composições podem ainda conter materiais complementares farmacêuticos adequados, tais como um carreador farmacêutico, um excipiente e similares conhecidos na técnica, incluindo tampões.

[0204] O carreador farmacêutico adequado para uso na invenção pode ser líquido estéril, como água e óleo, incluindo petróleo ou óleo de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e o gostar. A água é um carreador preferido quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente usados para soluções injetáveis.

[0205] Excipientes adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e o gosto. Para utilizações de excipientes, ver "Handbook of Pharmaceutical Excipients", quinta edição, R. C. Rowe, P. J. Seskey e S. C. Owen, Pharmaceutical Press, London, Chicago.

[0206] A composição pode ainda conter uma pequena quantidade de agente umectante ou emulsificante, ou tampão de pH, se desejado.

[0207] As composições podem assumir a forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um comprimido, uma pílula, uma cápsula, um pó, uma preparação de liberação sustentada e similares. As preparações orais podem conter carreadores e/ou excipientes padrão, como manitol de grau farmacêutico, lactose, amido, estearato de magnésio e sacarina.

[0208] A preparação farmacêutica, preferencialmente na forma de uma preparação liofilizada ou uma solução aquosa, compreendendo o anticorpo anti-PD-Ll aqui descrito pode ser preparada misturando o anticorpo anti-PD-Ll de pureza desejada com um ou mais materiais complementares farmacêuticos opcionais [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16º edição, Osol, A. ed. (1980)].

[0209] Uma preparação de anticorpo liofilizado exemplar é descrita na Patente U.S. 6267958. A preparação aquosa de anticorpos inclui aqueles descritos na Patente U.S. 6171586 e WO2006/044908, e a última preparação compreende um tampão de histidina-acetato.

[0210] A composição farmacêutica ou preparação da invenção também pode conter mais de um ingrediente ativo requerido por uma indicação particular tratada, preferencialmente ingredientes ativos com atividades complementares sem afetar adversamente um ao outro. Por exemplo, é desejável fornecer ainda outros ingredientes ativos anticâncer, como um agente quimioterápico e/ou um agente citotóxico. Os ingredientes ativos são adequadamente combinados em uma quantidade eficaz para a finalidade pretendida. Os ingredientes ativos podem ser qualquer substância conhecida na técnica e capaz de ser combinada com um anticorpo anti-PD-Ll1, incluindo agentes quimioterápicos, outros anticorpos e outros agentes terapêuticos. Exemplos dos ingredientes ativos podem ser vistos em, por exemplo, WO2010/077634, WO2016/061142, US61/264061, US60/696426, WO2016/007235 e similares.

[0211] Em algumas modalidades, o ingrediente ativo é um anticorpo anti-LAG-3, por exemplo, um anticorpo anti-LAG- 3 que se liga a um antígeno humano, preferencialmente, o anticorpo anti-LAG-3 é humanizado.

[0212] Uma preparação de liberação sustentada pode ser preparada. Exemplos adequados da preparação de liberação sustentada incluem uma matriz semipermeável de um polímero hidrofóbico sólido contendo um anticorpo, a matriz está na forma de um artigo moldado, por exemplo, um filme ou uma microcápsula.

Uso de anticorpo

[0213] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para modular uma resposta imune em um indivíduo. O método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-PD-Ll1) ou a composição farmacêutica ou o imunoconjugado aqui divulgado, modulando assim a resposta imune no indivíduo. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo (por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de anticorpo anti-PD-Ll1) ou a composição farmacêutica ou o imunoconjugado aqui divulgado restaura, aprimora, estimula ou aumenta a resposta imune no indivíduo.

[0214] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para prevenir ou tratar um tumor (por exemplo, câncer) em um indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-PD-L1) ou a composição farmacêutica ou o imunoconjugado aqui divulgado. Em algumas modalidades, o tumor é uma fuga imune do tumor. De preferência, o tumor é um tumor gastrointestinal (por exemplo, câncer), como o câncer de cólon.

[0215] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para prevenir ou tratar uma doença infecciosa em um indivíduo, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-PD-L1) ou o produto farmacêutico composição ou o imunoconjugado aqui divulgado. Em uma modalidade, a doença infecciosa é uma infecção crônica.

[0216] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para induzir citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo no indivíduo, e o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-PD-Ll1) ou a composição farmacêutica ou o imunoconjugado aqui divulgado.

[0217] O indivíduo pode ser um mamífero, por exemplo, um primata, preferencialmente um primata superior, por exemplo, um humano (por exemplo, um paciente com ou em risco de ter a doença aqui descrita). Em uma modalidade, o indivíduo precisa de uma resposta imune aprimorada. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 aqui descrita promove a proliferação de células T. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll1 aqui descrita restaura, aprimora ou estimula uma resposta de célula T específica de antígeno no indivíduo, por exemplo, produção de interleucina-2 (IL-2) ou interferon-gama (IFN- gama) na resposta das células T específicas ao antígeno. Em algumas modalidades, a resposta imune é uma resposta antitumoral. Em uma modalidade, o indivíduo tem ou está em risco de ter a doença aqui descrita (por exemplo, o tumor ou doença infecciosa como aqui descrito). Em certas modalidades, o indivíduo é imunocomprometido ou em risco de imunocomprometimento. Por exemplo, o indivíduo recebe ou recebeu quimioterapia e/ou radioterapia. Alternativamente ou em combinação, o indivíduo é imunocomprometido devido à infecção ou corre o risco de ser imunocomprometido devido à infecção.

[0218] Em algumas modalidades, o tumor, por exemplo, câncer, descrito aqui inclui, mas não está limitado a um tumor sólido, um câncer hematológico, um tumor de tecidos moles e uma lesão metastática.

[0219] Exemplos do tumor sólido incluem um tumor maligno, por exemplo, sarcomas e carcinomas (incluindo adenocarcinomas e carcinomas de células escamosas) de vários sistemas orgânicos, como carcinomas que afetam fígado, pulmões, seios, linfa, trato gastrointestinal (por exemplo, cólon), trato geniturinário (por exemplo, células epiteliais dos rins e da bexiga), próstata e faringe. Os adenocarcinomas incluem tumores malignos, como a maioria dos cânceres de cólon, câncer retal, carcinoma de células renais, câncer de fígado, carcinomas de células não pequenas em câncer de pulmão, câncer de intestino delgado e câncer de esôfago. Os carcinomas de células escamosas incluem tumores malignos, como carcinomas nos pulmões, esôfago, pele, regiões da cabeça e pescoço, cavidade oral, ânus e colo do útero. Em uma modalidade, o câncer é melanoma, por exemplo, melanomas avançados. Em uma modalidade, o câncer é câncer gastrointestinal, como o câncer de cólon. As lesões metastáticas dos carcinomas acima mencionados também podem ser tratadas ou prevenidas usando o método e a composição da invenção.

[0220] Exemplos não limitativos de cânceres preferenciais a serem tratados incluem linfoma (por exemplo, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin), câncer de mama (por exemplo, câncer de mama metastático), câncer de pulmão (por exemplo, células não pequenas câncer de pulmão (NSCLC), por exemplo, estágio IV ou câncer de pulmão de células não pequenas recorrentes, adenocarcinoma de NSCLC ou carcinoma espinocelular de NSCLC), mielomas (por exemplo, mielomas múltiplos), leucemias (por exemplo, leucemias mielógenas crônicas), câncer de pele (por exemplo, melanomas (por exemplo, melanoma em estágio III ou IV) ou carcinoma de células de Merkel), câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (HNSCC)), síndromes mielodisplásicas, câncer de bexiga (por exemplo, carcinomas de células de transição), câncer de rim (por exemplo, carcinomas de células renais, por exemplo, carcinoma de células renais de células claras e por exemplo, carcinoma de células renais de células claras avançadas ou metastáticas) e câncer de cólon. Além disso, malignidades refratárias ou recorrentes podem ser tratadas usando a molécula de anticorpo aqui descrita.

[0221] Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados incluem osteocarcinoma, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer de ouvido ou pescoço, melanomas cutâneos ou intraoculares, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer anal, câncer anal, câncer gastroesofágico, câncer gástrico, câncer testicular, câncer uterino, câncer das trompas de falópio, câncer endometrial, câncer do colo do útero, câncer vaginal, carcinoma de células de Merkel, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, carcinoma endócrino, câncer de tireoide, câncer de paratireoide, carcinoma adrenal, sarcoma de tecidos moles, carcinoma uretral, carcinoma do pênis, leucemia crônica ou aguda (incluindo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoblástica aguda e leucemia linfocítica crônica), tumores sólidos pediátricos, linfoma linfocítico, câncer de bexiga, mieloma múltiplo, síndromes —mielodisplásicos câncer renal ou ureteral, câncer de pelve renal, tumores do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, tumor angiogênese, tumores epistróficos, glioma do tronco cerebral, adenoma hipofisário, sarcoma de Kaposi, carcinoma epidermóide, carcinoma de células escamosas, linfoma de células T e cânceres “induzidos ambientalmente (incluindo cânceres induzidos por amianto, por exemplo, mesotelioma) e combinações dos mesmos.

[0222] O tratamento de câncer metastático, por exemplo, câncer metastático expressando PD-L1 (Iwai et al., (2005) Int. Immunol. 17: 133-144), pode ser implementado usando a molécula de anticorpo aqui descrita.

[0223] A fuga imune do tumor também pode ser tratada usando a molécula de anticorpo aqui descrita.

[0224] Em uma modalidade, o tumor é um câncer que expressa níveis elevados de PD-L1.

[0225] Em algumas modalidades, o câncer aqui descrito é câncer de cólon e câncer metastático.

[0226] Em algumas modalidades, a infecção é aguda ou crônica. Em algumas modalidades, a infecção crônica é uma infecção persistente, uma infecção latente ou uma infecção lenta. Em algumas modalidades, a infecção crônica é causada por um patógeno selecionado do grupo que consiste em bactérias, vírus, fungos e protozoários.

[0227] Em algumas modalidades, o patógeno é uma bactéria. Em uma modalidade, a bactéria é selecionada do grupo que consiste em espécies de Mycobacterium (Mycobacterium spp.), Espécies de Salmonella (Salmonella spp.), Espécies de Listeria (Listeria spp.), Espécies de Streptococcus (Streptococcus spp.), Espécies de Haemophilus (Haemophilus spp.) .), Espécies de Neisseria (Neisseria spp.), Espécies de Klebsiella (Klebsiella spp.), Espécies de

Borrelia (Borrelia spp.), Bacterioides fragilis, espécies de Treponema (Treponema spp.) E Helicobacter pylori.

[0228] Em algumas modalidades, o patógeno é um vírus. Em uma modalidade, o vírus é selecionado do grupo que consiste em vírus infecciosos, por exemplo, vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C (HBV ou HCV), vírus do herpes simplex I ou II, vírus da imunodeficiência humana I ou II, citomegavírus, epstein barr (EBV), papilomavírus humano, vírus I ou II da leucemia linfotrópica T humana e varicela zoster.

[0229] Em algumas modalidades, o patógeno é um fungo. Em uma modalidade, um distúrbio induzido por fungos é selecionado do grupo que consiste em aspergilose, blastomicose, candida albicans, coccidioiodmicose immitis, histoplasmose, paracoccidioiomicose e microsporidiose.

[0230] Em algumas modalidades, o patógeno é um protozoário como um parasita. Em uma modalidade, o distúrbio causado pelo protista é selecionado do grupo que consiste em leishmaniose, plasmodiose (isto é, malária), criptosporidiose, toxoplasmose, tripanossomíase e infecção por helmintos, incluindo doenças causadas por trematódeos (por exemplo, esquistossomose), cestoides (por exemplo, equinococose) e nematoides (por exemplo, triquinose), ascaridíase, filariose e estrongiloidose.

[0231] Em outra modalidade, a infecção é uma infecção por hepatite, por exemplo, uma infecção por hepatite B ou hepatite C. A molécula de anticorpo anti-PD-Ll pode ser combinada com tratamentos convencionais para infecção por hepatite B ou infecção por hepatite C para vantagens terapêuticas. Em certas modalidades, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 é administrada em combinação com um antígeno da hepatite B (por exemplo, Engerix BB) ou vacina, e opcionalmente em combinação com um adjuvante contendo alumínio.

[0232] Em outra modalidade, a doença infecciosa é influenza. Em certas modalidades, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 é administrada em combinação com um antígeno ou vacina da influenza.

[0233] As doenças adequadas para prevenção Ou tratamento com o anticorpo anti-PD-Ll1 ou o seu fragmento da invenção podem ser vistas ainda em WO2010/077634, WO2016/061142, US60/696426, WO2016/007235 ou US61/264061.

[0234] Em outros aspectos, a invenção fornece utilizações do anticorpo anti-PD-Ll ou fragmento do mesmo ou seu imunoconjugado na fabricação ou preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento das doenças Ou condições relacionadas acima mencionadas.

[0235] Em algumas modalidades, o anticorpo ou oO fragmento de anticorpo ou o imunoconjugado da invenção atrasa o início das condições e/ou sintomas associados às condições.

Terapia combinada

[0236] Em algumas modalidades, o método de prevenção ou tratamento aqui descrito compreende ainda administrar ao sujeito ou indivíduo a molécula de anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento do mesmo) ou a composição farmacêutica ou oO imunoconjugado aqui divulgado em combinação com um ou mais outras terapias, por exemplo, modalidades terapêuticas e/ou outros agentes terapêuticos.

[0237] Em algumas modalidades, a modalidade terapêutica inclui cirurgia (por exemplo, ressecção de tumor), uma terapia de radiação (por exemplo, uma terapia de feixe externo que envolve uma terapia de radiação conforme tridimensional na qual uma região de irradiação é projetada), irradiação parcial (por exemplo, irradiação direcionado a um alvo ou órgão pré-selecionado), irradiação focada e similares. A irradiação focada pode ser selecionada do grupo que consiste em radiocirurgia estereotática, radiocirurgia estereotática fracionada e radioterapia com intensidade modulada. A irradiação focada pode ter uma fonte de radiação selecionada do grupo que consiste em feixes de partículas (prótons), cobalto-60 (fótons) e aceleradores lineares (raios-X), por exemplo, como descrito em WO 2012/177624.

[0238] A terapia de radiação pode ser conduzida através de um ou combinação de métodos, incluindo, entre outros, terapia de feixe externo, terapia de radiação interna, irradiação de implante, radiocirurgia estereotática, radioterapia sistêmica, radioterapia e braquiterapia intersticial permanente ou transitória.

O termo "braquiterapia" se refere à terapia de radiação fornecida por uma substância radioativa espacialmente confinada inserida no corpo nos ou perto dos locais de tumores ou outras doenças proliferativas dos tecidos.

O termo pretende incluir, entre outros, a exposição a radioisótopos (por exemplo, At-211, I-131, 1I-125, Y-90, Re-l186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P -32 e isótopos radioativos de Lu). Fontes de radiação adequadas incluem sólidos e líquidos.

Por meio de exemplos não limitativos, a fonte de radiação pode ser um radionuclídeo, como I-125, I-131, Yb-169 e Ir-192 como fonte sólida, I-125 como fonte sólida ou outros radionuclídeos que emitem fótons, partículas beta, radiação gama ou outros raios terapêuticos.

A substância radioativa também pode ser um fluido feito de qualquer solução de radionuclídeo, por exemplo, uma solução I-125 ou I-131, ou um fluido radioativo pode ser produzido usando uma pasta de um fluido adequado contendo pequenas partículas de um radionuclídeo sólido (por exemplo, Au-198 e Y-90). Além disso, o radionuclídeo pode estar contido em microesferas de gel ou radioativas.

[0239] Em algumas modalidades, o agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em agentes quimioterápicos, agentes citotóxicos, vacinas, outros anticorpos, agentes ativos anti-infecciosos e imunomoduladores (por exemplo, ativadores de moléculas coestimuladoras ou inibidores da molécula de pontos de verificação imune).

[0240] Exemplos de agentes citotóxicos incluem medicamentos anti-microtúbulos, inibidores da topoisomerase, antimetabólitos, inibidores mitóticos, agentes alquilantes, antraciclinas, alcaloides da vinca, agentes intercalantes, agentes ativos capazes de interferir nas vias de transdução de sinal, agentes —“apoptóticos ativos, inibidores de proteassoma e irradiação (por exemplo, irradiação parcial ou total do corpo (por exemplo, radiação gama) ).

[0241] Outros anticorpos exemplares incluem, entre outros, inibidores do ponto de verificação imune (por exemplo, anti-CTLA-4, anti-TIM-3, anti-CEACAM ou anti-LAG- 3), anticorpos (por exemplo, anticorpos GITR agonísticos ou anticorpos CD137 ) que estimulam células imunes, anticorpos anticâncer (por exemplo, rituximabe (RituxanGO ou MabTheraO), trastuzumabe (Herceptino), tositumomabe (BexxarO), ibritumomabe (ZevalinO), alemtuzumabe (CampathOo), epratuzumabe (LymphocideO), bevacizumabe (AvastinO), erlotinibe (TarcevabO), cetuximabe (Erbituxo) e similares.

[0242] Agentes quimioterápicos exemplares incluem, entre outros, anastrozol (ArimitexO), bicalutamida (Casodex6O0), sulfato de bleomicina (Blenoxane6O), busulfan (Mylerano), injeção de busulfan (BusulfexO), capecitabina (XelodaG), N4 -pentiloxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatina (ParapalatinO), carmustina (BiCNUO), clorambucil (LeukeranO), cisplatina (PlatinolO), cladribina (LeustatinO), ciclofosfamida (CytoxanO ou Neosar), citosina arabinosídeo, citosina arabinosídeo (Cytosar-UG), depócito (DepoCytO), dacarbazina (DTIC-DomeO), dactinomicina (actinomicina D e Cosmegan), cloridrato de daunomicina (Cerubidine6O), injeção de lipossomo citrato de daunomicina (DaunoXomeO) dexametasona, docetaxel (TaxotereO), cloridrato de doxorrubicina (Adriamycino e RubexO), etoposídeo (Vepesido), fosfato de fludarabina (Fludara6), 5- fluorouracil (AdrucilO e Efudexo), flutamida (Eulacibino), tezacitinao, tez gemcitabina (difluorodeoxicitidina), hidroxiureia (HydreaO0), idarubicina (Idamyc inO), ifosfamida (IFEXO), irinotecano (CamptosarO), L-asparaginase (ELSPARO), folinato de cálcio, melfalano (AlkranO), 6-mercaptopurina (Purinethol6), metotrexato (FolexO), mitoxantrona, gemtuzumab ozogamicina (mylotarg), paclitaxel (TaxolO), fênix (ítrio 90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 em combinação com implantes de carmustina (GliadelG), citrato de tamoxifeno (NolvadexO), teniposídeo (VumonO), 6-

tioguanina, tiotepa, tirapazamina (TirazolineG), cloridrato de topotecano para injeção (Hycamptino), vinblastina (VelbanOo), vincristina (OncovinO), vinorelbina, ibrutinibe, Zydelig (idelalisibe) e brentuximabe vedotina.

[0243] Vacinas exemplares incluem, mas não estão limitadas a vacinas contra o câncer. A vacina pode ser uma vacina baseada em DNA, uma vacina baseada em RNA ou uma vacina baseada em transdução de vírus. As vacinas contra o câncer podem ser profiláticas ou terapêuticas. Em algumas modalidades, a vacina contra o câncer é uma vacina de câncer de peptídeo que é uma vacina de peptídeo personalizada em algumas modalidades. Em algumas modalidades, a vacina contra o câncer de peptídeo é um peptídeo longo multivalente, vários peptídeos, mistura de peptídeos, peptídeo híbrido ou vacina de células dendríticas pulsada por peptídeo (ver, por exemplo, Yamada et al., Cancer Sci, 104: 14-21, 2013).

[0244] Exemplos de agentes anti-infecciosos ativos incluem, entre outros, antivirais, antifúngicos, antiprotozoários e antibacterianos, como análogos de nucleosídeos (zidovudina (AST), ganciclovir, foscarnet ou cidovir), como descrito acima.

[0245] Os imunomoduladores incluem inibidores da molécula de pontos de verificação imune e ativadores de moléculas coestimuladores.

[0246] Em algumas modalidades, o inibidor da molécula de pontos de verificação imune é um inibidor de PD- 1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, CEACAM (por exemplo, CEACAM- 1, -3 e/ou -5) , VISTA, BTLA, TIGIT, LAIRI, CD160, 2B4 e/ou TGFR beta.

A inibição da molécula pode ocorrer no nível de DNA, RNA ou proteína.

Em algumas modalidades, ácidos nucleicos inibitórios (por exemplo, dsRNA, siRNA ou SshRNA) podem ser utilizados para inibir a expressão de moléculas de pontos de verificação imune.

Em outras modalidades, os inibidores da molécula de pontos de verificação imune são polipeptídeos que se ligam à molécula de pontos de verificação imune, como um ligante solúvel (por exemplo, PD- 1-Ig ou CTLA-41Ig) ou um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno, por exemplo, o anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga a PD-l, PD-L2, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, - 3 e/ou -5), CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA , TIGIT, LAIRI1, CD160, 2B4 e/ou TGFR beta ou uma combinação dos mesmos.

Em outras modalidades, o imunomodulador é um inibidor de CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, -3 e/ou -5) (por exemplo, CEACAM humano (por exemplo, CEACAM-l, -3 e/ou -5)). Em outras modalidades, o imunomodulador é um inibidor de LAG-3 (por exemplo, LAG-3 humano). Em uma modalidade, o inibidor de LAG-3 é uma molécula de anticorpo contra LAG-3, por exemplo, um anticorpo anti-LAG-3 que se liga ao ser humano, preferencialmente o anticorpo anti-LAG-3 sendo humanizado.

Em outras modalidades, o imunomodulador é um inibidor de TIM-3 (por exemplo, TIM-3 humano). Em uma modalidade, o inibidor de TIM-3 é uma molécula de anticorpo contra TIM-3.

[0247] Em algumas modalidades, o imunomodulador é um ativador ou agonista da molécula coestimuladora. Em uma modalidade, o agonista da molécula coestimuladora é um agonista (por exemplo, um anticorpo agonístico ou um fragmento de ligação ao antígeno ou uma fusão solúvel) de uma molécula selecionada do grupo que consiste em OX40, CD2, CD27, CD27, CDS , ICAM-1, LFA-1 (CDlla/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CDl37), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7- Ligando H3 ou CD83. Em outras modalidades, o imunomodulador é um agonista de GITR. Em uma modalidade, o agonista de GITR é uma molécula de anticorpo contra GITR. Em outras modalidades, o imunomodulador é um agonista de OX40. Em uma modalidade, o agonista de OX40 é uma molécula de anticorpo contra OX40.

[0248] Em algumas modal idades adicionais, o anticorpo anti-PD-Ll ou fragmento do mesmo também pode ser usado em combinação com um inibidor de tirosina quinase (por exemplo, um inibidor de receptor tirosina quinase (RTK)). Inibidores de tirosina quinase exemplares incluem, mas não estão limitados a, inibidores da via do fator de crescimento epidérmico (EGF) (por exemplo, inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)), inibidores da via do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (por exemplo, receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), por exemplo, inibidor de VEGFR-1, inibidor de VEGFR- 2 e inibidor de VEGFR-3), inibidores da via do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) (por exemplo, inibidor do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), por por exemplo, inibidor de PDGFR-beta) inibidores de RAF-l1, inibidores de KIT e inibidores de RET.

[0249] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll ou fragmento do mesmo da invenção também pode ser usado em combinação com um inibidor de PI3K, um inibidor de mTOR, um inibidor de BRAF, um inibidor de MEK, um inibidor de JAK2 e/ou similares.

[0250] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, a administração do anticorpo anti-PD- Ll ou o seu fragmento da invenção é combinada com a administração de um antígeno. O antígeno pode ser, por exemplo, um antígeno tumoral, um antígeno viral, um antígeno bacteriano ou um antígeno de um patógeno. Em algumas modalidades, o antígeno tumoral compreende uma proteína. Em algumas modalidades, o antígeno tumoral compreende um ácido nucleico. Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é uma célula tumoral.

[0251] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll ou o seu fragmento da invenção pode ser administrado em combinação com uma terapia compreendendo transferência adotiva de células T (por exemplo, linfócitos T citotóxicos ou CTLs) expressando um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[0252] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll1 ou o seu fragmento da invenção pode ser administrado em combinação com um agente antitumoral.

[0253] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll1 ou o seu fragmento da invenção pode ser administrado em combinação com um vírus oncolítico. Em algumas modalidades, o vírus oncolítico é capaz de se replicar seletivamente em células cancerígenas e desencadear a morte de células cancerígenas ou atrasar o crescimento de células cancerígenas. Em alguns casos, o vírus oncolítico não tem efeito ou efeito mínimo em células não cancerígenas. O vírus oncolítico inclui, mas não está limitado a, adenovírus oncolítico, vírus do herpes simplex oncolítico, retrovírus oncolítico, parvovírus oncolítico, vírus da vacina oncolítica, vírus da sindbis oncolítico, vírus da gripe oncolítica ou vírus da influenza oncolítica (por exemplo, doença de Newcastle oncolítica, (NDV), vírus oncolítico do sarampo ou vírus da estomatite vesicular oncolítica (VSV)). Em algumas modalidades, o vírus oncolítico é um vírus descrito na US 2010/0178684 Al, por exemplo, um vírus oncolítico recombinante.

[0254] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- Ll1 ou o seu fragmento da invenção pode ser administrado em combinação com uma citocina.

[0255] Em algumas modalidades, o anticorpo Ou fragmento do mesmo da invenção pode ser combinado com uma terapia de câncer convencional na técnica, incluindo, mas não se limitando a, (i) terapias de radiação (por exemplo, terapia de radiação, radioterapia e irradiação) ou radiação ionizante para matar células cancerígenas e reduzir tumores, em que a terapia de radiação pode ser realizada através de terapia de radiação por feixe externo (EBRT) ou braquiterapia interna; (ii) quimioterapias ou aplicação de drogas citotóxicas, que geralmente afetam células que se dividem rapidamente; (iii) terapias ou agentes direcionados (por exemplo, inibidor de tirosina quinase, como imatinibe e gefitinibe; anticorpo monoclonal; terapia fotodinâmica) que afetam especificamente a desregulação das proteínas das células cancerígenas; (iv) imunoterapias ou respostas imunes melhoradas do hospedeiro (por exemplo, vacina); (v) terapias hormonais ou hormônios bloqueadores (por exemplo, quando os tumores são sensíveis aos hormônios); (vi) inibidores da angiogênese ou terapias que bloqueiam a angiogênese e o crescimento; e (vii) cuidados paliativos ou terapias relacionadas à melhoria da qualidade dos cuidados de saúde para controlar a dor, náusea, vômito, diarreia e sangramento,

nas quais são administrados analgésicos como morfina e oxicodona e antieméticos como ondansetron e aprepitant. para permitir um regime terapêutico mais agressivo.

[0256] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção pode ser combinado com um método convencional que aprimora as funções imunológicas do hospedeiro. O método convencional inclui, mas não se limita a: (1) aprimoramento da APC, por exemplo, (a) injetando um DNA que codifica um aloantígeno MHC heterólogo a um tumor ou (b) transfectando uma célula tumoral biopsiada com um gene que aumenta a possibilidade de reconhecimento de antígeno imune (por exemplo, citocina imunoestimuladora, GM-CSF, molécula coestimuladora B7.1 e molécula coestimuladora B7.2), (ii) imunoterapia celular adotiva ou terapia com células T ativada específica para tumor. A imunoterapia celular adotiva inclui o isolamento de linfócitos T que se infiltram no tumor e estimula a expansão da população in vitro, por exemplo, através da IL-2 ou tumor ou ambos; além disso, células T disfuncionais isoladas podem ser ativadas através da aplicação in vitro do anticorpo da invenção e, em seguida, as células T ativadas podem ser readministradas ao hospedeiro.

[0257] As várias terapias de combinação descritas acima podem ser ainda mais combinadas para o tratamento.

[0258] Mais exemplos de combinações do anticorpo anti-PD-L1 com outras modalidades terapêuticas ou agentes terapêuticos podem ser encontrados nos documentos WO2016/061142, WO2010/077634, US60/696426, US61/264061, WO2016/007235 ou similares.

[0259] Essas terapias de combinação abrangem tanto a coadministração (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão contidos na mesma formulação ou formulações separadas) quanto a administração separada, na qual a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente com e/ou após a administração de outras terapias, por exemplo, modalidades terapêuticas ou agentes terapêuticos. A molécula de anticorpo e/ou outras terapias, por exemplo, agentes terapêuticos ou modalidades terapêuticas, podem ser administradas durante doenças ativas ou no período de remissão ou doenças menos ativas. A molécula de anticorpo pode ser administrada antes de outras terapias, concomitantemente com outras terapias, após outras terapias ou durante a remissão de doenças.

[0260] Em uma modalidade, a administração do anticorpo anti-PD-Ll1 e a administração de outras terapias (as modalidades terapêuticas ou os agentes terapêuticos) ocorrem em cerca de um mês, ou em cerca de uma, duas ou três semanas, ou em cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias um do outro.

[0261] Em algumas modalidades, as combinações de anticorpos aqui descritas podem ser administradas separadamente (por exemplo, como anticorpos separados) ou em ligação (por exemplo, como uma molécula de anticorpo biespecífica ou triespecífica).

[0262] Será apreciado que qualquer terapia pode ser realizada utilizando o imunoconjugado da invenção em vez de ou em adição ao anticorpo anti-PD-L1l.

Terapia combinada com anticorpo anti-LAG-3

[0263] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD- L1 da invenção pode ser usado para tratamento em combinação com um anticorpo anti-LAG-3.

[0264] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG- 3 da invenção é um anticorpo anti-LAG-3 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG-3 da invenção é um anticorpo IgGl ou um anticorpo IgG2 ou um anticorpo IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG-3 é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG-3 é humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG- 3 é um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da sequência estrutural do anticorpo anti- LAG-3 é uma sequência estrutural de consenso humano. Em uma modalidade, o anticorpo anti-LAG-3 da invenção também compreende um fragmento de anticorpo do mesmo, de preferência um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em: Fab, Fab', Fab'-Fab'-SH, Fv, fragmento variável de cadeia única (por exemplo, scFv) ou (Fab')2, anticorpo de domínio único, diacorpo (dAb) ou anticorpo linear.

[0265] Em algumas modalidades específicas, o anticorpo anti-LAG-3 ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende: (i) três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDRs) da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 75, e/ou (1i) três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDRs) da região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 76.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG-3 ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL), em que (i) o VH compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que o HCDR1 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; o HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 70 ou consiste na sequência de aminoácidos; o HCDR3 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;

[0266] e/ou

(ii) a VL compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a LCDR1 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; o LCDR2 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; o LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 74 ou consiste na sequência de aminoácidos.

[0267] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG- 3 ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada VH e/ou uma região variável de cadeia leve VL, em que (a) região variável de cadeia pesada VH (i) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 75, (ii) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 75, ou (iii) compreende uma sequência de aminoácidos tendo 1 ou mais (preferencialmente não mais que 10, mais preferencialmente não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1) alterações de aminoácidos (preferencialmente substituições de aminoácidos, mais preferencialmente substituições conservadoras de aminoácidos) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO:

75, em que preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas CDRs;

[0268] e/ou (b) região variável de cadeia leve VL (1) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 76, (ii) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 76, ou (iii) compreende uma sequência de aminoácidos com 1 ou mais (preferencialmente não mais que 10, mais preferencialmente não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1) alterações de aminoácidos (preferencialmente substituições de aminoácidos, mais preferencialmente substituições conservadoras de aminoácidos) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 716, em que preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas CDRs.

[0269] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-LAG- 3 ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve, em que (a) a cadeia pesada (i) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com um amino sequência de ácido selecionada de SEQ ID NO: 77,

(ii) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 77, ou

(iii) compreende uma sequência de aminoácidos com 1 ou mais (preferencialmente não mais que 20 ou 10, mais preferencialmente não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1) alterações de aminoácidos (preferencialmente substituições de aminoácidos, mais preferencialmente conservadoras de aminoácidos substituições) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 77, em que, preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas CDRs da cadeia pesada e, mais preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas região variável de cadeia;

e/ou

(b) a cadeia leve

(i) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com um amino sequência de ácido selecionada de SEQ ID NO: 78,

(ii) compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 78, ou

(iii) compreende uma sequência de aminoácidos com 1 ou mais (preferencialmente não mais que 20 ou 10, mais preferencialmente não mais que 5, 4, 3, 2 ou 1) alterações de aminoácidos (preferencialmente substituições de aminoácidos, mais preferencialmente conservadoras de aminoácidos substituições) em comparação com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 78, em que preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem nas CDRs da cadeia leve e, mais preferencialmente, as alterações de aminoácidos não ocorrem na luz região variável de cadeia.

[0270] Em algumas modalidades, modificações para o anticorpo anti-PD-Ll da invenção também se aplicam ao anticorpo anti-LAG-3.

Via de administração e dosagem

[0271] O anticorpo da invenção (ou a composição farmacêutica ou o imunoconjugado contendo o anticorpo, ou qualquer outro agente terapêutico) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo administração parenteral, administração intrapulmonar, administração intranasal e administração intralesional, se necessário pelo tratamento local. A infusão parenteral inclui administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Os fármacos podem ser administrados por qualquer meio adequado, como injeção, por exemplo, injeção intravenosa ou subcutânea, até certo ponto, dependendo do tratamento a curto ou longo prazo. Vários esquemas de dosagem são contemplados aqui, incluindo, mas não se limitando a, administração única ou múltiplas administrações, injeções de bolus e infusões de pulso em vários momentos.

[0272] Para prevenir ou tratar uma doença, a dosagem apropriada (quando usada sozinha ou em combinação com um ou mais de outros agentes terapêuticos) do anticorpo da invenção dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, a gravidade e progressão da doença, se o anticorpo é administrado para fins profiláticos ou terapêuticos, tratamentos anteriores, histórico clínico de um paciente e respostas ao anticorpo, e a critério de um médico assistente. O anticorpo é adequadamente administrado a um paciente através de uma dose única ou através de uma série de tratamentos.

[0273] Em algumas modalidades, o regime de dose é ajustado para fornecer a resposta ideal desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, uma única injeção em bolus pode ser administrada, várias doses separadas podem ser administradas ao longo do tempo ou uma dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, conforme indicado pela criticidade da condição de tratamento. É particularmente vantajoso formular uma composição parentérica em uma forma de unidade de dosagem para facilitar a administração da dose e uniformidade. A forma unitária de dosagem como aqui utilizada se refere a unidades fisicamente separadas adequadas como doses unitárias para indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo, que é calculada para produzir um efeito terapêutico desejado em combinação com um carreador farmacêutico necessário. A especificação da forma unitária de dosagem da invenção depende diretamente (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico específico a ser alcançado; e (b) das limitações únicas no campo da combinação do composto ativo para uma terapia sensível em um indivíduo.

[0274] A dosagem e o regime da molécula de anticorpo anti-PD-L1 podem ser determinados pelos especialistas. Em certas modalidades, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 é administrada (por exemplo, por via subcutânea ou intravenosa) através de injeção a uma dose de cerca de l a 30 mg/kg, por exemplo, cerca de 5 a 25 mg/kg, cerca de 10 a mg/kg, cerca de 1 a 5 mg/kg, ou cerca de 3 mg/kg. O regime pode variar de, por exemplo, uma vez por semana a uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll é administrada a cada duas semanas a uma dose de cerca de 10 a 20 mg/kg. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-Ll1 é administrada em uma dose menor ou igual a cerca de 5 mg/kg, menor ou igual a cerca de 4 mg/kg, menor ou igual a cerca de 3 mg/kg , menor ou igual a cerca de 2 mg/kg, ou menor ou igual a cerca de 1 mg/kg a cada duas semanas, sozinho ou em combinação (por exemplo, em combinação com uma molécula de anticorpo anti-LAG-3). Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD-L1 é administrada a uma dose de cerca de 1 a 5 mg/kg a cada duas semanas, a uma dose de cerca de 1 a 4 mg/kg a cada duas semanas, a uma dose de cerca de 1 a 3 mg/kg a cada duas semanas, ou a uma dose de cerca de 1 a 2 mg/kg a cada duas semanas. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-PD- L1 é administrada sozinha ou em combinação (por exemplo, em combinação com uma molécula de anticorpo anti-LAG-3) a uma dose de cerca de 1 a 5 mg/kg a cada duas semanas, a uma dose de cerca de 1 a 4 mg/kg a cada duas semanas, a uma dose de cerca de 1 a 3 mg/kg a cada duas semanas ou a uma dose de cerca de 1 a 2 mg/kg a cada duas semanas.

Método e composição para diagnóstico e detecção

[0275] Em certas modalidades, qualquer um dos anticorpos anti-PD-Ll ou seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos pode ser usado para a detecção da presença de PD-Ll em uma amostra biológica. O termo "detecção", conforme usados aqui, inclui detecção quantitativa ou qualitativa, e as detecções exemplares podem envolver imuno-histoquímica, imunocitoquímica, citometria de fluxo (por exemplo, FACS), esferas magnéticas complexadas com moléculas de anticorpo, ELISA e técnicas de PCR (por exemplo, RT-PCR). Em algumas modalidades, a amostra biológica é sangue, soro ou outra amostra de fluido de fonte biológica. Em certas modalidades, a amostra biológica inclui células ou tecidos. Em algumas modalidades, a amostra biológica é derivada de uma lesão proliferativa ou cancerosa.

[0276] Em uma modalidade, um anticorpo anti-PD-L1 é fornecido para uso em um método de diagnóstico ou detecção. Em outro aspecto, é fornecido um método para detectar a presença de PD-Ll em uma amostra biológica. Em certas modalidades, o método compreende detectar a presença de proteínas PD-Ll em uma amostra biológica. Em certas modalidades, o PD-L1 é PD-Ll1 humano. Em certas modalidades, o método compreende o contato da amostra biológica com o anticorpo anti-PD-Ll, conforme descrito aqui, em uma condição que permite que o anticorpo anti-PD-L1 se ligue a PD-L1 e detectar se um complexo é formado pelo anticorpo anti-PD-L1 e PD-Ll. A formação do complexo indica a presença de PD-Ll. O método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-Ll1 é usado para selecionar um indivíduo adequado para tratamento com o anticorpo anti-PD-Ll, por exemplo, em que PD-Ll é um biomarcador para a seleção do indivíduo.

[0277] Em uma modalidade, um anticorpo anti-PD-L1 é fornecido para uso em uma modalidade. Em uma modalidade, o anticorpo da invenção pode ser usado para diagnosticar cânceres ou tumores, por exemplo, para avaliar (por exemplo,

monitorar) o tratamento ou progressão, diagnóstico e/ou estadiamento de uma doença (por exemplo, a doença hiperproliferativa ou cancerígena) aqui descrita em um indivíduo.

Em certas modalidades, é fornecido um anticorpo anti-PD-Ll marcado.

A marcação inclui, mas não está limitado a, um marcação ou fração (por exemplo, um marcação fluorescente, um marcação cromofórico, um marcação denso de elétrons, um marcação quimioluminescente e um marcação radioativo) que é detectado diretamente, bem como um fragmento que é detectado indiretamente, como uma enzima ou um ligante, por exemplo, por uma reação enzimática ou uma interação molecular.

Marcadores exemplares incluem, entre outros, radioisótopos de 32P, 14C, 125IT, 3H e 1311, fluoróforos (por exemplo, quelatos de terras raras ou luciferina e seus derivados), rodamina e seus derivados, dansil, umbelliferona, luceriferase [por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana (US Pat. 4737456) ], luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodiona, peroxidase de rábano silvestre (HR), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glucoamilase, lisase, carboidrato oxidase (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase) e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases —heterocíclicas (por exemplo, uricase e xantina oxidase), enzimas que utilizam peróxido de hidrogênio para oxidar precursores de corantes (por exemplo, HR, lactoperoxidase ou microperoxidase), biotina/avidina,

rótulos de spin, rótulos de fagos, radicais livres estáveis e o método diagnóstico ou de detecção similar. Em outro aspecto, é fornecido um método para detectar a presença de PD-L1 em uma amostra biológica. Em certas modalidades, o método compreende detectar a presença de proteínas PD-L1 em uma amostra biológica. Em certas modalidades, o PD-L1 é PD- L1l humano. Em certas modalidades, o método compreende o contato da amostra biológica com o anticorpo anti-PD-L1, conforme descrito aqui, em uma condição que permite que o anticorpo anti-PD-L1 se ligue a PD-Ll e detectar se um complexo é formado pelo anticorpo anti-PD-L1 e PD-Ll. A formação do complexo indica a presença de PD-Ll. O método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 é usado para selecionar um indivíduo adequado para tratamento com o anticorpo anti-PD-Ll, por exemplo, em que PD-L1 é um biomarcador para a seleção do indivíduo.

[0278] Em algumas modalidades da invenção aqui fornecidas, a amostra é obtida antes do tratamento com o anticorpo anti-PD-Ll. Em algumas modalidades, a amostra é obtida antes do tratamento com um medicamento anticâncer. Em algumas modalidades, a amostra é obtida após o câncer ter metastizado. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra fixada em formalina e embebida em parafina (FFPE). Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de biópsia (por exemplo,

uma biópsia nuclear), uma amostra cirúrgica (por exemplo, uma amostra de uma ressecção cirúrgica) ou um aspirado por agulha fina.

[0279] Em algumas modalidades, PD-Ll é detectado antes do tratamento, por exemplo, antes do tratamento inicial ou antes de um tratamento após um intervalo de um determinado tratamento.

[0280] Em algumas modalidades, é fornecido um método para o tratamento de um tumor ou infecção, que compreende: detectar a presença de PD-L1 em um indivíduo (por exemplo, usando uma amostra, por exemplo, uma amostra contendo células cancerígenas do indivíduo), determinando desse modo um valor PD-L1; comparar o valor PD-Ll1 com um valor de controle; e se o valor de PD-Ll for maior que o valor de controle, administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-PD-Ll1 (por exemplo, o anticorpo anti-PD-L1l aqui descrito), opcionalmente em combinação com um ou mais de outros terapias, ao indivíduo, tratando desse modo o tumor ou infecção.

Sequências exemplificativas de anticorpos anti-PD-L1 da invenção Tabela 1: Sequências de CDR de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos exemplares da invenção e de anticorpos de controle aqui descritos (entre parênteses são regras de certeza)

Antic | HCDRI HCDR2 HCDR3 LCDRI1 LCDR2 LCDR3 a) a) 3- GFNIEDT | DPANDD GLGRWFA | KASQDVINAV | SASNRYT | QoHYSPPLT

266.1 | (SEQ ID | (SEQ ID Y (SEQ |A (SEQ ID (SEQ ID | (SEQ ID NO: 1) |NO: 5) ID NO: NO: 14) NO: 17) | NO: 21) 10) 4- GDSITSG | SYTGS (SEQ |APPWLSA | KSSQSLLYSS | WASTRES | povyYysyPWT

79.2 (SEQ ID | ID NO: 6) |MDY NOKNSLA (SEQ ID | (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID | (SEQ ID NO: 18) | NO: 22) NO: 11) |NO: 15) 4- GDSITSG | SYSGS (SEQ |GDLWPPW | KSSQSLLYSS | WASTRES | povyeYPLT

26.6 (SEQ ID | ID NO: 7) |FAY NOKNSLA (SEQ ID | (SEQ ID NO: 2) (SEQID (SEQ ID NO: 18) | NO: 23) NO: 12) NO: 15) 4- GYTFTTY | NPNSDY QSFDY RASESVEFYG | AASNVES | HOGRKVPYT

48.5 (SEQ ID | (SEQ ID (SEQ ID | TSLLO (SEQ | (SEQ ID | (SEQ ID NO: 3) |NO: 8) NO: 13) [TD NO: 16) | NO: 19) | NO: 24) HZ326 | GFNIEDT | DPANDD GLGRWFA | KASQDVINAV | SASNRYT | QOHEYSPPLT 6- (SEQ ID | (SEQ ID Y (SEQ [A (SEQ ID (SEQ ID | (SEQ ID IgGIN |NO: 1) |NO: 5) ID NO: NO: 14) NO: 17) | NO: 21) 297A 10) HZ326 | GFNIEDT | DPANDD GLGRWFA | KASQDVINAV | SASNRYT | QoHYSPPLT 6- (SEQ ID | (SEQ ID Y (SEQ |A (SEQ ID (SEQ ID | (SEQ ID IgG1l NO: 1) |NO: 5) ID NO: NO: 14) NO: 17) | NO: 21) 10) HZ326 | GFNIEDT | DPANDD GLGRWFA | KASQDVINAV | SASNRYT | QOHYSPPLT 6- (SEQ ID | (SEQ ID Y (SEQ |A (SEQ ID (SEQ ID | (SEQ ID IgeG4P |NO: 1) |NO: 5) ID NO: NO: 14) NO: 17) | NO: 21) AAK 10) HZ448 | GYTFTTY | NPNSDY QSFDY RASESVEFYG | AASNVES | HOGRKVPYT 5- (SEQ ID | (SEQ ID (SEQ ID | TSLLO (SEQ | (SEQ ID | (SEQ ID IgGIN |NO: 3) |NO: 8) NO: 13) [ID NO: 16) |NO: 19) | NO: 24) 297A Sequê | XiX2X:Xa | SYXGS (em KiXaXIXa | XIXIXIXaXsX ncia XsXeX7 que X é XsXeX7 EXTXaXo de (em que | selecionad (em que | (em que conse |X: é G, |o de Tou x1 é x1 é nso xo é Ss) (SEQ ID selecio | seleciona selecio | NO: 9) nado de | do de Q nado S, Wou |ou H, Xz entre A, Xz é | é O, X3 é D, F ou A, X; é | seleciona Y, XxX; é S, X: é |do de H, selecio selecio |Y ou G, nado nado de | X1 é entre N ou T, | seleciona N, S ou xs é do de Y T, X1 é selecio |ou R, Xs selecio nado de | é nado R ou V, | seleciona entre I xs é do de S ou F, selecio | ou G, Xs xs é nado de | é selecio R ou V, | seleciona nado xs é do de S, entre T selecio |G ou K, ou E, nado de | Xs é xs é YouE seleciona selecio ex é |dodeP, nado selecio |Y ou v, entre T nado de |X' é P, Xs ou E, Tous) |é xs é (SEQ ID | seleciona selecio NO: 20) [do entre nado L, WouY entre S ex érT , Dou (SEQ ID Tex NO: 25) é selecio nado entre GG, T ou Y) (SEQ ID NO: 4) ATE GFTFSDS | SPYGGS RHWPGGF | QODVSTAVA SASFLYS | QOYLYHPAT (SEQ ID | (SEQ ID DY (SEQ | (SEQ ID (SEQ ID | (SEQ ID NO: 52) | NO: 53) ID NO: NO: 55) NO: 56) | NO: 57) 54) ADI- GSIYSES | SIVYSGYTYY | ARVRTWD | OASQDISNYL | DASNLET | QQVLELPPW 31853 | YYyWG NPSLKS AAFDI N (SEQ ID (SEQ ID | T (SEQ ID t (SEQ ID | (SEQ ID (SEQ ID | NO: 72) NO: 73) | NO: 74) NO: 69) | NO: 70) NO: 71) | (Regra de (Regra (Regra de (Kabat (Regra |Kabat) de Kabat) rule) IMGT) Kabat)

[0281] * A regra de definição de CDR do ADI-31853 está listada na linha.

Tabela 2: Regiões variáveis das cadeias pesada e leve de anticorpos exemplares da invenção e de anticorpos de controle aqui descritos An ti | Região variável de cadeia pesada | Região variável de cadeia leve = (VA) (VL) rp o 3— | EVOLOOSVAELVKPGASVKLSCTASGFNIEDT | SIVMTOSHKFMSTSIGDRVNISCKASQDVI 26 | YIENVKORPEQGLEWIGRIDPANDDTKYDPKF | NAVANWCOOKPGOSPKLLIYSASNRYTGVPD &. | OGKATITADTSSNTAYLOLSSLTPEDTAVYYC | RFTGSGSGTDFTFTISSVOAEDLAVYYCOO " GRGLGRWFAYWGQOGTLVTVSA (SEQ ID HYSPPLTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: NO: 26) 32) EVOLOOSGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSG | DIVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQOSLL 4- | YWNWIREFPGNKLEYLGYISYTGSTYYNPSLK | YSSNOKNSLAWYQOQOKPGQOSPKLLIYWASTR 79 | SRISITRDTSKNQYSLOLNSVTTEDTATYYCA | ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLA .2 | KAPRWLSAMDYWGQOGTSVTVSS (SEQ ID VYYCQOQYYSYPWIFGGGTKLEIK (SEQ NO: 27) ID NO: 33)

QVOLKESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSG | NIVMTOTPSSLAVSVGEKITMSCKSSQOSLL 4- | YWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGSTYHNPSLK | YSSNOKNSLAWYOOKPGOSPKLLIYWASTR 26 | SRISITRDTSKNQFYLOLNSVTKEDTATYYCA | ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVEAEDLA -6 | RGDLWPPWFAYWGOGTLVTVSA (SEQ ID VYYCOQYYGYPLTFGAGTKLELK (SEQ NO: 28) TD NO: 34) EVOLOOSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTY | DIVLTOSPASLAVSLGORATISCRASESVE 4- TMHWVKQORPGOGLEWIGNINPNSDYAIYNQKF FYGTSLLQWYQOQKPGQPPKLLIYAASNVES 48 | KDKATLTADKSSNTAYMOLSGLTSEDSAVYYC | GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEVDDVALY .5 AKQSFDYWGQOGTTLTVSS (SEQ ID NO: FCHOGRKVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID 29) NO: 35)

HZ 32 66 | EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCTASGFNIEDT | GIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKASQDVI - | YIHWVOOAPGOGLEWIGRIDPANDDTKYAPKF | NAVAWYQOKPGOSPKLLIYSASNRYTGVPD Tg | OGRATITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC | RFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDLAVYYCOO Gl GRGLGRWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID HYSPPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: N2 NO: 30) 36) 97

A 3 EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCTASGFNIEDT | GIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKASQDVI 66 YIHWVOQAPGOGLEWIGRIDPANDDTKYAPKF NAVAWYQOQOKPGOSPKLLIYSASNRYTGVPD

QGRATITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC RFSGSGSGTDEFTLTISSLOAEDLAVYYCOO o GRGLGRWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID HYSPPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: Ig e . sa NO: 30) 36)

AZ & EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCTASGENIEDT | GIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKASQDVI *º | YIHWVOQOAPGOGLEWIGRIDPANDDTKYAPKF | NAVAWYQOKPGOSPKLLIYSASNRYTGVPD 1g | PGRATITADISTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC | RFSGSGSGTDETLTISSLOAEDLAVYYCOO a GRGLGRWFAYWGOGTLVTVSS (SEQ ID HYSPPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: PA NO: 30) 36)

AK

HZ 44 85 | QVOLVOSGAEVAKPGASVKVSCKASGYTFTTY | DIVLTOSPASLAVSPGORATITCRASESVE bl TMHWVRORPGOGLEWIGNINPNSDYAIYAQKF FYGTSLLQWYQQKPGOQPPKLLIYAASNVES Tg | OGRATMTADKSTNTAYMELSSLRSEDSAVYYC | GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEADDTANY Gl AKQSFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NO: YCHOGRKVPYTFGOGTKLEIK (SEQ ID N2 31) NO: 37) 97

A EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDS | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVS

AT WIHWVROAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSV TAVAWYQOQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPS e | KGRFTISADISKNTAYLOMNSLRAEDTAVYYC | RESGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOO ARRHWPGGFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID | YLYHPATFGOGTKVEIK (SEQ ID NO: NO: 58) 59) AD | QLOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIYSE DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIS I- SYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIVYSGYTYYNPS NYLNWYOQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPS 31 | LKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY | RFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQOO 85 CARVRTWDAAFDIWGOGTMVTVSS (SEQ ID VLELPPWIFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 3 NO: 75) 76)

Tabela 3: Cadeias pesadas e leves de anticorpos exemplares da invenção e de anticorpos de controle aqui descritos

A n t c Cadeia pesada (HC) Cadeia leve (LC) o r

P o

EVOLOQSVAELVKPGASVKLSCTASGFNIEDTYI HWVKQRPEQGLEWIGRIDPANDDTKYDPKFQGKA

TITADTSSNTAYLOLSSLTPEDTAVYYCGRGLGR WFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTS | SIVMTOSHKFMSTSIGDRVNISCKASQDVI : GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF | NAVAWCOQOKPGOSPKLLIYSASNRYTGVPD ' PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH | RFETGSGSGTDFTFTISSVOAEDLAVYYCQOQ ? KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP | HYSPPLTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPP ' SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE | SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKV ' VKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVL | DNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT "| PVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK | LSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSEN ' GOPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP RGEC (SEQ ID NO: 46)

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS

KLTVDKSRWQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 38) 4 | EVOLOOSGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYW | DIVMSQOSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQOSLL

7 | ITRDTSKNQYSLOLNSVTTEDTATYYCAKAPRWL | ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLA 9 | SAMDYWGOGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST | VYYCOQYYSYPWITFGGGTKLEIKRTVAAPS - | SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT | VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA 2 | FPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVN | KVOWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYS HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG | LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQOGLSSP PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 47)

EVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSV LTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGOPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWOQEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 39)

QVELKESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYW NWIRKFPGNKLEYMGYISYSGSTYHNPSLKSRIS

ITRDTSKNQFYLQLNSVTKEDTATYYCARGDLWP PWFAYWGQOGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKST | NIVMTOTPSSLAVSVGEKITMSCKSSOSLL 4 | SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT | YSSNOKNSLAWYOOKPGOSPKLLIYWASTR —- | FPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQOTYICNVN | ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVEAEDLA 2 | HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG | VYYCOQOYYGYPLTFGAGTKLELKRTVAAPS 6 | PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP | VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA - | EVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSV | KVOWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYS 6 | LTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA | LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSP KGOPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 48

PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 40) EVOLOQOSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTM | DIVLTOSPASLAVSLGORATISCRASESVE HWVKORPGOGLEWIGNINENSDYAIYNOKFKDKA | FYGTSLLOWYOOKPGOPPKLLIYAASNVES TLTADKSSNTAYMOLSGLTSEDSAVYYCAKQOSFD | GVUPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEVDDVALY

8 | YWGOGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT FCHOGRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF . AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV | LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPS | QWNKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF | STLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVT LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF KSFNRGEC (SEQ ID NO: 49)

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL HQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT

VDKSRWOQOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 41)

H Z | EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCTASGENIEDTYI 3 | HWVOQAPGOGLEWIGRIDPANDDTKYAPKFQOGRA 2 | TITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGLGR 6 | WFAYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS | GIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKASQDVI 6 | GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF | NAVAWYOQOKPGOSPKLLIYSASNRYTGVPD - PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQOTYICNVNE | RESGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCOQO I | KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP | HEYSPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP g | SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE | SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKV G | VKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVL | DNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT 1 TVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK | LSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSEFN N | GOPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP RGEC (SEQ ID NO: 50) 2 | SDIAVEWESNGOQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS 9 | KLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLS 7 LSPGK (SEQ ID NO: 42)

A H | EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCTASGENIEDTYI | GIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKASQDVI

3 TITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGLGR | RESGSGSGTDFTLTISSLQOAEDLAVYYCOQO 2 | WFAYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS HYSPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVEIFPP 6 | GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF | SDEQLKSGTASVVCLLNNEFYPREAKVQOWKV 6 | PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNE | DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT - | KPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP | LSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFN I SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE RGEC (SEQ ID NO: 50) g | VKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL G | TVLEQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 1 | GOPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYFP

SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS

KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLS LSPGK (SEQ ID NO: 43)

H

EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCTASGFNIEDTYI 3 HWVOQAPGOGLEWIGRIDPANDDTKYAPKFOGRA : TITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCGRGLGR ? WFAYWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTS GIVMTOSPDSLAVSLGERATINCKASQDVI $ ESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF | NAVAWYOQKPGOSPKLLIYSASNRYTGVPD º PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH | RESGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCOQ : KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVF | HYSPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVEIFPP ' LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQF SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKV ] NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVL | DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT º HQODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP | LSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSEFN º REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI RGEC (SEQ ID NO: 50) : AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLT ? VDKSRWQOEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSL

A G (SEQ ID NO: 44)

K H | QVUOLVOSGAEVAKPGASVKVSCKASGYTETTYTM | DIVLTOSPASLAVSPGQORATITCRASESVE

4 | TMIADKSTNTAYMELSSLRSEDSAVYYCAKQOSFD | GVUPARFSGSGSGTDFTLTINPVEADDTANY 4 | YWEQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT | YCHOGRKVPYTFGOGTKLEIKRTVAAPSVEF 8 | AMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV | IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV | LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTY ICNVNHKPS | QWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS - | NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF | STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQOGLSSPVT TI | LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF KSFNRGEC (SEQ ID NO: 51) g | NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL G | HODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGÇQP 1 | REPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPSDT N | AVENESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT 2 | VDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSP 9 GK (SEQ ID NO: 45) 7

A EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWI HWVROAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRF

TISADTSKNTAYLQOMNSLRAEDTAVYYCARRHWP GGFDYWGEGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVS SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT | TAVAWYOOKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPS FPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVN | RESGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCOO

A HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG | YLYHPATFGOGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP 7 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP | SDEQLKSGTASVVCLLNNEFYPREAKVOWKV : EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSV | DNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LTVLHOQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA | LSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFN KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY RGEC (SEQ ID NO: 61)

PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 60)

EVRLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAM GWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRE

TTSRDDSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPG WYAADVWGOGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS | DIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASOSIS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH | SYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQOSGVPS I1 | TFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNV | RESGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFATYYCOO g | NHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG | ADLPAFAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP G | GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED | SDEQLKSGTASVVCLLNNEFYPREAKVOWKV 1 | PEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS | DNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT VLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK | LSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFN AKGQPREPQOVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF RGEC (SEQ ID NO: 63)

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 62)

QLOLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIYSESY YWGWIRQOPPGKGLEWIGSIVYSGYTYYNPSLKSR

VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVRT ? WDAAFDIWGOGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSR | DIOQMTOSPSSLSASVGDRVTITCQOASQDIS ' STSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV | NYLNWYOOKPGKAPKLLIYDASNLETGVPS ' HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCN | RESGSGSGTDFTFTISSLOPEDIATYYCOO — | vDHKPSNTKVDKRVESKYCGPPCPPCPAPEAAGGP | VLELPPWIFOGCTKVEIKRTVAAPSVEIFP ? SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE | PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWK * VOFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL | VDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL º TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK | TLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSF : GOPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYP NRGEC (SEQ ID NO: 78) : SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS

RLTVDKSRWOEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLS LSLG (SEQ ID NO: 77)

Tabela 4: Regiões constantes das cadeias pesada e leve exemplares

Reg | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLY ião | SLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF con | PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVENAKTKPREEQYNSTYRVVSVL sta | TVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV nte | K6FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEAL da | HNHYTOKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64)

cad eia pes ada de

IgG

1

Reg | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLY ião | SLSSVVTVPSSSLGTOTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF con | PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVL sta | TVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV nte | KGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEAL da | HNHYTOKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 65)

cad eia pes ada de

196

1

(co mpr een den do uma mut açã o

N29

7A na pos içã o

297

)

Reg | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLY ião | SLSSVVIVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK con | PADTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVL sta | HODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGF nte | YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWOEGNVFSCSVMHEALHNH da | YToOKSLSLSLG (SEQ ID NO: 66)

cad eia pes ada de

IgG 4 x RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKD reg | STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 67) ião con sta nte da cad eia lev e

[0282] Estes e outros aspectos e modalidades da invenção são descritos nos desenhos (a seguir, uma breve descrição dos desenhos) e na seguinte descrição detalhada da invenção e são ilustrados nos exemplos a seguir. Qualquer uma ou todas as características discutidas acima e ao longo do pedido podem ser combinadas em várias modalidades da invenção. Os exemplos a seguir ilustram ainda mais a invenção. No entanto, deve entender-se que os exemplos são descritos a título ilustrativo e não limitativo, e várias modificações podem ser feitas por aqueles versados na técnica.

Exemplos Exemplo 1. Preparação de células de hibridoma

[0283] Uma tecnologia de hibridoma é um método de fusão de duas células, mantendo as principais características de ambas. As duas células se referem a um esplenócito de camundongo imunizado a antígeno e a uma célula de mieloma de camundongo. O esplenócito de camundongo (linfócito B) imunizado por antígeno específico é caracterizado por funções de secreção de anticorpos, mas não pode ser subcultivado in vitro.

As células de mieloma de camundongo podem se dividir e proliferar indefinidamente em condições de cultura, isto é, são chamadas imortalizadas.

Na ação de um meio seletivo, apenas as células híbridas formadas pela fusão das células do mieloma e das células B podem ter a capacidade de passagem, e um clone celular com a função de secreção de anticorpos e a imortalidade é formado.

Em um experimento, um camundongo foi imunizado pela proteína hPD- Ll, e as células de esplenócitos e mieloma do camundongo foram obtidas e fundidas, de modo que as células de hibridoma capazes de expressar anticorpos positivos foram obtidas.

Fusão de hibridoma Animais experimentais e informações imunológicas

Balb/c (Tecnologia Animal de Laboratório Rato

Co. do Rio Vital de Pequim, Ltd.)

Proteína PD-Ll1 humana (domínio Antígeno extracelular), BIOSSistemas ACRO, Nº de imunizante catálogo PD1l-H5229

50 ug/camundongo, subcutâneo (SC), 50 ul Método imunizante por mancha, 4 manchas Tempos de imunização

Imunização final 50 ug de proteína PD-Ll, intraperitoneal de reforço (IP), 3 dias antes da fusão

[0284] Preparação da eletroporação: os pratos foram completamente embebidos em etanol a 70% e secos em uma bancada ultra limpa para uso.

[0285] Isolamento de esplenócitos: o camundongo foi sacrificado por deslocamento cervical, esterilizado com álcool a 75% por 5 min e imediatamente colocado em uma placa de dissecação de camundongo no banco ultra limpo, na posição de decúbito lateral esquerdo, e os membros do camundongo foram fixados com Agulhas nº 7; o baço foi retirado após abertura asséptica da cavidade abdominal e depois lavado com meio basal (preparado conforme tabela abaixo). Os tecidos conjuntivos circundantes foram cuidadosamente removidos. O baço foi então transferido para outro prato contendo o meio basal; o baço foi pressionado com uma agulha de cotovelo, perfurado com uma agulha pequena e depois pressionado com uma pinça para liberar completamente os esplenócitos, de modo a obter a suspensão do esplenócito; após ser filtrada através de um filtro de células 100 pM, a suspensão celular foi lavada uma vez por 30 mL de meio basal e centrifugada a 1200 rpm por 6 min.

Nome Composição Preparação

RPMI-1640 (Hyclone) 90% FBS (Hyclone) 10% Meio basal GlutaMAX"" Suplemento 1x (Gibco)

[0286] Lise de eritrócitos: O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 10 mL de um tampão de lise de glóbulos vermelhos (GIBCO). Em seguida, foram adicionados 20 mL de um tampão de lise RBC; a suspensão foi deixada em repouso por 5 min e centrifugada a 1100 rpm por 6 min. Após a remoção do sobrenadante, as células foram ressuspensas em 10 mL de meio basal. Em seguida, foram adicionados 30 mL de meio basal e as células foram centrifugadas a 1100 rpm por 6 min; após remoção do sobrenadante, as células foram ressuspensas em 20 mL de meio basal e contadas.

[0287] Eletroporação: as células SP2/0 (células de mieloma de camundongo) (ATCC) foram ressuspensas em 20 mL de meio basal e contadas; as células SP2/0 e os esplenócitos foram misturados na proporção de 1: 2 para 1: 1 e centrifugados a 100 rpm por 6 min; após remoção do sobrenadante, as células misturadas foram ressuspensas em 10 mL de tampão de fusão (BTXpress); então, 15 mL de tampão de fusão foram adicionados e a mistura foi centrifugada a 1000 rpm por 5 min com o sobrenadante descartado; depois de repetir os passos acima, as células foram ressuspensas com uma quantidade apropriada de solução tampão de fusão e a densidade celular mista foi ajustada para 1 x 107 células/mL. As configurações do aparelho de eletroporação foram as seguintes. 2 mL de suspensão de células foram adicionados a cada placa para eletroporação.

[0288] Pós-fusão: As células foram deixadas no prato à temperatura ambiente por 5 min; as células foram transferidas para um tubo de centrifugação e diluídas para 1-2 x 104 células/mL com meio seletivo (preparado conforme a tabela a seguir). Foram adicionados 100 pL de suspensão de células a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades. O meio seletivo foi trocado 7 dias após a fusão. As células foram pesquisadas no dia 10 (ou mais tarde, dependendo do estado de crescimento celular) da incubação. As células de hibridoma que expressam anticorpos anti-PD-Ll específicos foram selecionadas através do FACS [FACS ARIA (BD Biosciences)].

Nome Composição Preparação

RPMI-1640 (Hyclone) 90% FBS (Hyclone) 10% Meio seletivo Meio HAT (Gibco) 1x Suplemento GlutaMAX ** 1x (Gibco) Subclonagem de células de hibridoma positiva

[0289] Subclonagem: 200 npL do meio basal descrito acima foram adicionados a cada cavidade nas segundas a oitavas colunas de uma placa de 96 cavidades; foi feita uma suspensão usando as células dos cavidades positivos selecionados e foi adicionada à primeira coluna; Transferiram-se 100 1yL da suspensão de células na primeira coluna para a segunda coluna e transferiram-se 100 upL da mistura para a coluna seguinte depois de misturar bem. O passo acima foi repetido até que uma mistura de 300 ul fosse obtida na última coluna. Após 15 minutos de repouso, as células foram contadas ao microscópio. Um volume correspondente contendo cerca de 100 células foi adicionado a 20 mL do meio basal descrito acima para misturar e plaquear a 200 ul de cada cavidade. Após uma semana, as células foram observadas ao microscópio. Os cavidades monoclonais foram marcados e os cavidades positivos foram detectados.

[0290] Criopreservação celular: As células foram monitoradas quanto a seus estados. Aqueles que cresceram bem com viabilidade acima de 90% foram centrifugados a 1000 rpm por 5 min e o sobrenadante foi descartado; As células foram ressuspensas em 1 x 107 células/mL usando crioprotetor (45,5% de FBS, 44,5% de RPMI-1640 e 10% de DMSO), aliquotadas em tubos de criopreservação, colocadas em recipientes de resfriamento programados e criopreservadas a -80 ºC .

Exemplo 2. Produção e purificação de um anticorpo quimérico

[0291] Utilizando biotecnologia molecular, a invenção produz sequências de anticorpos nas células de hibridoma positivas para anti-PD-L1 e constrói um anticorpo quimérico de rato humano usando as sequências de anticorpos.

[0292] Extração de RNA: As células frescas foram centrifugadas a 300 g por 5 min e o sobrenadante foi descartado. 500 pL de tampão LY (Biomiga) (20 pL de betamercaptoetanol por 1 mL antes do uso) foram adicionados ao precipitado e foram agitados até ficarem claros. A mistura foi transferida para um tubo de centrifugação e centrifugada a 13000 rpm por 2 min. O fluxo foi coletado. Foi adicionado etanol 100% ao escoamento na proporção de 1/2 e o fluido foi misturado por 5 vezes até que uma solução clara fosse obtida. A solução límpida foi adicionada a um tubo de coleta de RNA e centrifugada a 13000 rpm por 1 min, e a porção líquida foi descartada. Foram adicionados 500 1uL de tampão de recuperação (Takara) e a mistura foi centrifugada a 13000 rpm por 30 s e foi centrifugada por mais 30 s após adição de 500 ul de tampão de lavagem de RNA (Biomiga) (é adicionado etanol antes do uso). O processo acima foi repetido antes de centrifugação adicional e uma evaporação para uma remoção completa do etanol. A coluna de coleta foi pré-tratada com 30 pL de água tratada com DEPC e a mistura foi centrifugada a 12000 g por 2 min e os eluatos foram coletados. A concentração de RNA foi medida. Produção de cDNA por transcrição reversa: O sistema de reação I foi configurado da seguinte maneira: Oligo dT Iniciador* 1 pºL dANTP* 1 ul RNA modelo (RNA obtido acima) 5 ug DdH20 livre de RNase * Compõem até 10 nuL

[0293] * Derivado do Kit de síntese de cDNA da 1º fita PrimeScript II; comprado de Takara.

[0294] Após incubação a 65 ºC por 5 min, o sistema foi rapidamente resfriado em gelo; ao sistema de reação 1, o seguinte sistema de transcrição reversa foi adicionado em uma quantidade total de 20 uL:

Sistema de reação 1 10 pb x Tampão PrimeScript II * 4 pb Inibidor da RNase (40U/UL) * 0.5 ul (20 U) PrimeScript II RTase 1 pL (200U) (200U/UL)* DdH2O livre de RNase * Compõem até 20 uL

[0295] * Derivado do Kit de síntese de cDNA da 1º? fita PrimeScript II; comprado de Takara.

[0296] Após mistura lenta, a transcrição reversa foi induzida nas seguintes condições de 42 ºC por 60 min — 95 ºC por 5 min. A mistura foi então arrefecida em gelo antes da coleta de cDNA.

[0297] Conexão do cCDNA com o vetor T:

[0298] A região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve foram amplificadas separadamente por PCR. O sistema de reação PCR compreendeu os seguintes componentes: Nome Quantidade TaKaRa EX Tag HS 0,25 nuL Primer Mix 1 (tabela 5 a 1 nb seguir) Primer Mix 2 (tabela 6) 1 uLl CDNA (obtido como mencionado acima) 1 uL Tampão de Marcador 10 x Ex 5 ubl Mistura dANTP (2,5 mM cada) 4 ub DdH20 livre de RNase Compõem até 50 ul

[0299] As condições da reação de PCR foram as seguintes: 94 ºC 5 min

94 ºC 30 s 30 ciclos 55 ºC 30 s 72 ºC 60s 72 “ºC 5 min

[0300] Foram adicionados 0,5 pl do vetor pMD20-T (Clontech) e 5 uL de Ligation Mighty Mix (Takara) a 4,5 1uL do produto de PCR da reação de PCR. A mistura foi suavemente misturada e incubada a 37 ºC por 2 h para obter um produto de ligação.

Transformação de células:

[0301] As células competentes TOP10 [Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.] foram retiradas de -80 ºC e descongeladas em gelo. 5 pl do produto de ligação obtido foram adicionados às células competentes TOP10 descongeladas. A mistura foi agitada e incubada em gelo durante 30 min. Após choque térmico a 42 “C por 90 s, a mistura obtida foi rapidamente resfriada em gelo em 2 min. 900 1uLl de meio de cultura LB [Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.] foram adicionados ao tubo de EP e a mistura foi incubada a 37 “*C em um agitador a 220 rpm por 1 hora. As bactérias foram centrifugadas a 3000 g por 2 min. Foram removidos 800 unuL de sobrenadante e as bactérias foram ressuspensas com o restante do meio para inoculação em uma placa de ampicilina. As bactérias foram incubadas durante a noite a 37 ºC. Os clones foram separados para sequenciação.

[0302] As regiões VH e VL, que foram sequenciadas, do anticorpo anti-PD-Ll de camundongo gerado a partir dos hibridomas do Exemplo 1 foram amplificadas por PCR: as sequências de iniciadores a montante e a jusante são mostradas nas Tabelas 5 e 6.

Tabela 5. Iniciador (Primer Mix 1) para a região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo anti-PD-L1 do camundongo Iniciador Sequência (5'-3"') Razão (%) OVH1 SAGGTCCAGCTGCAGCAGYYTGG 28,6 OVH2 CAGGTRCAGCTGAAGSAGTCAGG 10,7 OVH3 GAKGTGCAGCTTCAGCAGTCRGG 8,9 OVH5 GAVGTGAWGCTGGTGGAGTCTGR 71 OVH11 GAAGTGCAGCTGTTGGAGACTGG 3,6 OVH14 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGK 16,1 OVHIL5 CAGGTTCACCTACAACAGTCTGG 3,5 REVESE-6 CTGAGGARACGGTGACCG 6 REVESE-4 CTGAGGAGACTGTGAGAGWGGT 4 REVESE-2-1 CTGAGGAGACGGTGACTGAGGT 2 REVESE-2-2 CTGCAGAGACAGTGACCAGAGT 2 Água q.s.

[0303] Depois de os componentes terem sido misturados em proporções, o Primer Mix 1 resultante foi utilizado para subsequente amplificação por VH PCR.

Tabela 6. Iniciador (Primer Mix 2) para a região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo anti-PD-Ll1 do camundongo

Iniciador Sequência (5'-3') Razão (%) Pl Um total de - 5 OVK1 GATGYTKTKVTGACCCAAACTCC 21,3 OVK3 RACATTGTGCTGACMCAATCTCC 6,7 OVK4a SARAWTGTKCTCWCCCAGTCTCC 5,97 OVK4b SARBAWTCTKCTCWCCCAGTCTCC 5,97 OVK4c SARAWTTTKCTCWCCCAGTCTCC 5,97 OVK6a ARCATTGTGATGACCCAGWCTCA 2,63 OVK6b ARCATTGTGATGACCCAGWCTCC 2,63 OVK6C GRCATTGTGATGACCCAGWCTCA 2,63 OVK6d GRCATTGTGATGACCCAGWCTCC 2,63 OVK10 GATATCCAGATGACACAGACTAC 10,8 OVK14 GAMATCMWGATGACCCARTCTCC 7,7 P2 Um total de mMIGKV1-1 GATGYTGTGATGACCCAAACTCC 1 mMIGKV1-2 GATGTTTTGATGACCCAAACTCC 1 mMIGKV2-1 GATATTGTGATGACGCAGGCTGC 1 mIGKV2-2 GATATTGTGATAACCCAGGATGA 1 mMIGKV4-1 GAAAATGTGCTCACYCAGTCTCC 1 mMIGKV5-1 GACATCTTGCTGACTCAGTCTCC 1 mMIGKV5-2 GACATTGTGATGACTCAGTCTCC 1 mMIGKV9-1 GACATCCAGATGATTCAGTCTCC 1 mIGKV9-2 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC 1 mMIGKV12-19 GACATCCAGATGACHCAGTCTCC 1 P3 Um total de

IGKV1 GATGYTKTGATGACCCAAACTCCA 6 IGKV2-109 GATATTGTGATGACGCAGGCTGCA 2 IGKV2-112 GATATTGTGATAACCCAGGATGAA 2 IGKV3-7 GACATTGTGCTAACACAGTCTCCT 1 IGKV3-1-5,10 RACATTGTGCTSACCCAATCTCCA 10 IGKV5-48 GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCA 1 IGKV6-13 GACATTGTGATGACCCAGTCTCARA 1 IGKV6-32 AGTATTGTGATGACCCAGACTCCC 1 IGKV14 GACATCMAGATGACMCAGTCTCCA 4 IGKV4-51,86 GAARAATGTGCTCACYCAGTCTCCA 1 IGKV7-33 GACATTGTGATGACTCAGTCTCCA 1 IGKV9-123 GACATCCAGATGATTCAGTCTCCA 1 IGKV9-124 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCA 1 IGKV10-95 GATATCCAGATGACACAGACTACT 1 IGKV11-125 GATGTCCAGATGATTCAGTCTCCA 1 mK-Rev TACAGTTGGTGCAGCATCAG

[0304] Depois de os componentes terem sido misturados em proporções, o Primer Mix 2 resultante foi utilizado para subsequente amplificação por VL PCR. O sistema de PCR foi o seguinte: Nome Quantidade 2 x Prime STAR HS (Pré- 25 pb mistura) Mistura de iniciadoress * 2 ul Modelo de plasmídeo 0.5 ul Mistura dNTP (2,5 mM cada) 4 pb DdH2O livre de RNase Compõem até 50 ul

[0305] * Para amplificação de VH, foi aplicado o Primer Mix 1; para amplificação de VL, foi aplicado o Primer Mix 2.

[0306] O gel foi cortado para recuperar os produtos de amplificação por PCR.

[0307] Recombinação homóloga: O sistema de recombinação homóloga foi configurado da seguinte maneira: Nome Quantidade Recuperando fragmentos 1 uL vetor pTT5 2 uL x tampão (Takara) 2 ut Enzima homóloga de 1 uL recombinação (Takara) ddH20 Compõem até 10 ul

[0308] Após incubação durante 30 min a 37 ºC, foi obtido um produto recombinante. As células competentes TOP10 foram transformadas pelo produto recombinante e os monoclones foram separados para sequenciação. Os clones contendo plasmídeos com direções de inserção corretas foram selecionados como clones positivos e preservados.

[0309] os plasmídeos contendo a sequência de anticorpos anti-PD-Ll foram extraídos dos clones positivos obtidos acima.

[0310] As células 293F (Invitrogen) foram passadas de acordo com um volume de transfecção desejado e a densidade celular foi ajustada para 1,5 x 106 células/mL no dia antes da transfecção. A densidade celular no dia da transfecção era de aproximadamente 3 x 106 células/mL. Uma quantidade apropriada de plasmídeos foi adicionada ao meio de cultura F17 (Gibco, A13835-01) com 1/10 do volume final como transfecção e misturada. Uma quantidade apropriada de polietilenimina (PEI) (Polysciences, 23966) foi adicionada à mistura (em uma proporção de plasmídeos para PEI = 1:3 nas células 293F), misturada e incubada à temperatura ambiente por 10 minutos, resultando em um DNA/Mistura PEI. Após ressuspensão com a mistura DNA/PEI, as células foram introduzidas a 36,5 ºC, 8% de CO2. Após 24 h, as células foram suplementadas com FEED (Sigma) com 2% do volume de transfecção e foram incubadas a 36,5 ºC, 8% de CO2 a 120 rpm. No dia 6 dias de subcultura ou até uma viabilidade cair abaixo de 60%, as células foram centrifugadas e o sobrenadante foi coletado e purificado.

[0311] A coluna de gravidade para purificação foi seca a 180 ºC por 4 horas após ser tratada com NaOH 0,5 M durante a noite, resultando em uma coluna de purificação. Os recipientes de vidro foram lavados com água destilada e secos. Antes da purificação, as culturas coletadas foram centrifugadas a 4500 rpm por 30 min e as células foram descartadas. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,22 mL. Cada tubo foi cheio com 1 mL de proteína A e equilibrado com 10 mL de tampão de ligação (fosfato de sódio mM, NaCl 150 mM, pH 7,0). O sobrenadante filtrado foi carregado na coluna de purificação, que foi então reequilibrada com 15 mL de tampão de ligação. Foram adicionados 5 mL de tampão eluente (ácido cítrico + citrato de sódio 0,1 M, pH 3,5). O eluato foi coletado e 80 ul de Tris-HCl foram adicionados por mL de eluato. O tampão dos anticorpos recolhidos foi alterado para PBS (Gibco, 70011- 044) por ultrafiltração/diafiltração e as concentrações foram medidas.

[0312] As sequências de aminoácidos das CDRs, as regiões variáveis das cadeias leve e pesada e as cadeias leve e pesada dos 4 anticorpos quiméricos obtidos da invenção e seus números de sequência são mostrados nas Tabelas 1 a 3 acima.

[0313] O anticorpo de referência usado na invenção são os anticorpos PD-L1l da Roche, Atezolizumabe (doravante denominado ATE ou Ate, ou o nome comercial: Tecentriqg), dos quais as sequências de aminoácidos das CDRs, as regiões variáveis das cadeias leve e pesada e as cadeias leve e pesada também são mostradas nas Tabelas de 1 a 3 acima.

Exemplo 3. Cinética de ligação de anticorpos quiméricos para antígenos, conforme determinado por interferometria ótica biológica

[0314] A constante de dissociação de equilíbrio (Kr) para ligação do anticorpo da invenção à PD-Ll humana foi determinada por interferometria ótica biológica (ForteBio). Foi realizado um ensaio de afinidade ForteBio da técnica anterior (Estep, P., et al., Medição baseada em solução de alto rendimento da afinidade anticorpo-antígeno e eliminação de epítopos. MAbs, 2013.5 (2): 270-8).

[0315] Meia hora antes da experiência, um número apropriado de sensores AMQ (Pall, 1506091) (para detecção de amostras) ou AHQ (Pall, 1502051) (para detecção de controle positivo), dependendo do número de amostras, foram embebidos em tampão SD (PBS 1 x, BSA 0,1%, Tween-20 0,05%).

[0316] Tampão SD, anticorpos e antígenos (incluindo PD-Ll1 humano, PD-L1 de camundongo e macaca fascicularis PD- Ll, todos adquiridos da Acrobiosystems), cada um de 100 uL foram adicionados a microplacas de meia área de poliestireno preto com 96 cavidades (Greiner, 675076). Os sensores foram organizados de acordo com as posições das amostras. As configurações do instrumento foram as seguintes: os procedimentos de operação foram Linha de base, Carregamento - 1 nm, Linha de base, Associação e Dissociação. O tempo de execução de cada procedimento dependia das taxas de associação e dissociação. A velocidade de rotação era de 400 rpm e a temperatura era de 30 ºC. Os valores de Ko foram analisados pelo software de análise ForteBio.

[0317] No ensaio descrito acima, as afinidades dos anticorpos 3-266.1, 4-79.2, 4-26.6 e 4-48.5 são mostradas na Tabela 7: Tabela 7. Constantes de afinidade (constantes de dissociação de equilíbrio) para ligações de antígenos e anticorpos pelo ensaio ForteBio Anticorpos Ko» (M) 3-266,1 9,80E-10 4-79,2 7,56E-09 4-26,6 3,85E-09 4-48,5 1,23E-09 ATE 2,94E-09

[0318] No ensaio acima, os valores de Ko dos anticorpos quiméricos 3-266,1, 4-79,2, 4-26,6 e 4-48,5 foram 9,80E-10 M, 7,56E-os M, 3,85E-o0s M e 1,23E-o0s M, respectivamente.

Os anticorpos neste estudo apresentaram valores de Ko» semelhantes ou superiores em comparação com a referência.

Exemplo 4. Ensaios de ligação de anticorpos quiméricos e células que superexpressam PD-L1

[0319] Neste estudo, a ligação de anticorpos quiméricos, diluídos em gradiente, da invenção a linhagens celulares CHO estáveis, superexpressou PD-Ll humana na superfície celular, foi medida por citometria de fluxo.

[0320] As células CHO (CHO-PDL1) que superexpressam PD-L1 humana foram geradas por transfecção de células CHO-S (Invitrogen, ExpiCHO "" Expression System Kit, Nº de Catálogo A29133) com vetores pCHOl1.0 (Invitrogen) carregando cDNA de PD-L1 humano (Sino biológico) clonado em múltiplos locais de clonagem (MCSs).

[0321] As células CHO-PDL1 foram contadas, diluídas para 1 x 105 células/mL e adicionadas a cada cavidade de placas de 96 cavidades em forma de U a 100 npL/cavidade. A suspensão foi centrifugada a 400 gq por 5 min e o sobrenadante foi descartado. As amostras (anticorpos quiméricos 3-266.1, 4-79.2, 4-26.6 e 4-48.5 respectivamente, e o controle positivo Ate) (os anticorpos foram diluídos em série três vezes a partir de uma concentração de 500 nM em PBS contendo 0,1% de soro bovino albumina (BSA) até a 8º concentração) foram adicionadas às placas em forma de U. As células foram ressuspensas em um volume de 100 unL/cavidade e depois deixadas em gelo por 30 min. A suspensão foi centrifugada a 400 g por 5 min e o sobrenadante foi descartado. As células foram lavadas uma vez com PBS. A mistura foi centrifugada a 400 g por 5 min e o sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 100 ul de anticorpo secundário marcado com FITC para Fab anti-camundongo (Jackson Immuno Research) (diluído em PBS em 1: 500) por cavidade e 100 ul de anticorpo secundário marcado com FITC para Fab anti-humano (Jackson Immuno Research) foi adicionado às células às quais o anticorpo de controle positivo foi adicionado. As células foram incubadas por 30 min em gelo no escuro. As células foram centrifugadas a 400 g por 5 min com o sobrenadante sendo descartado e foram lavadas uma vez com um PBS. As células foram ressuspensas com 100 ul de 1 x PBS e detectadas por FACS.

[0322] No ensaio descrito acima, a ligação dos anticorpos 3-266.1, 4-79.2, 4-26.6 e 4-48.5 às células CHO- PDL1 é mostrada na FIG. 1

[0323] No ensaio acima, os anticorpos 3-266.1, 4-

79.2, 4-26.6 e 4-48.5 todos ligados ao PD-Ll humano superexpressos nas células CHO, e ECso foram 2.139 nM, 2.598 nM, 1.985 nM e 1.995 nM respectivamente. Comparados com o anticorpo de referência ATE, os anticorpos 3-266.1, 4-79.2, 4-26.6 e 4-48.5 têm afinidades superiores e as capacidades de ligação de alguns anticorpos eram mais do que o dobro do anticorpo de referência.

Exemplo 5. Humanização de anticorpos quiméricos

[0324] Os anticorpos quiméricos obtidos no Exemplo 1 foram humanizados. A humanização do anticorpo foi realizada usando um programa de software proprietário SmrtMolHumanize da Macromoltek. As sequências foram inseridas no software e o sistema gerou modelos tridimensionais das sequências. As sequências foram então humanizadas através dos seguintes passos: 1) determinar a estrutura dos loops de CDR; 2) pesquisar em um banco de dados de sequência da linhagem germinativa humana as sequências homólogas mais próximas para cada região V/J das cadeias pesada e leve; 3) triagem para a linhagem germinativa humana que é mais semelhante às cadeias pesada e leve e tem a quantidade mínima de mutação reversa; 4) construir as regiões CDR do anticorpo quimérico na espinha dorsal de um anticorpo humano; 5) determinar as posições dos aminoácidos que mantêm as funções da CDR na espinha dorsal com base nas sequências e características estruturais; 6) adicionar mutação de volta (de volta aos aminoácidos de entrada) em posições importantes da sequência;

7) gerar o modelo tridimensional da sequência humanizada; 8) examinar manualmente a sequência e a estrutura para identificar locais de risco que podem causar erros de dobramento ou estabilidade reduzida; 9) otimização de aminoácidos em locais de risco.

[0325] As sequências de aminoácidos das CDRsS, as regiões variáveis das cadeias leve e pesada e as cadeias leve e pesada dos 4 anticorpos quiméricos obtidos da invenção (HZ3266-IgGIN297A, HZ3266-IgGl, HZ3266-IgG4PAK e H7Z4485- IgG1N297A) são mostrados nas Tabelas de 1 a 3 acima.

Exemplo 6. Cinética de ligação de anticorpos humanizados para antígenos, conforme determinado por ForteBio

[0326] A ligação da constante de dissociação de equilíbrio (Ko) dos anticorpos humanizados de diferentes subtipos de Fc da invenção ao PD-Ll humano foi determinada por ForteBio. O ensaio de afinidade ForteBio foi mostrado no Exemplo 2. No ensaio descrito acima, as afinidades dos anticorpos HZ3266-IgG1N297A, HZ3266-IgGl, HZ3266-IgG4PAK e HZ4485-IgG1N297A são mostradas na Tabela 8: Tabela 8. Constantes de afinidade para ligações de antígenos e anticorpos pelo ensaio ForteBio

HZ3266-IgG1N297A 7,24E-10 HZ 3266-IgGl 9,35E-10 HZ3266-GAPAAK 1,32E-09 HZ4485-IgG1N297A 3,17E-09

[0327] No ensaio acima, os anticorpos humanizados HZ3266-IgG1N297A, HZ3266-IgGl, HZ3266-G4PAAK e HZ4485- IgG1N297A aqui descritos apresentaram valores de Kv de 7,24E- M, 9,35E-10 M, 1,32E-0o M e 3,17E-0o M, respectivamente, e os anticorpos humanizados neste estudo têm valores de Kv» semelhantes ou superiores em comparação aos da referência.

Exemplo 7. Ensaios de ligação de anticorpos humanizados e células que superexpressam PD-L1

[0328] Neste estudo, a ligação de anticorpos humanizados, diluídos em gradiente, da invenção a linhagens celulares estáveis de CHO superexpressou PD-L1 humana na superfície celular (CHO-PDL1) foi medida por citometria de fluxo. O ensaio foi mostrado no Exemplo 3, com exceção de que os anticorpos utilizados foram os anticorpos humanizados HZ3266-IgG1N297A, HZ3266-IgG1, HZ3266-G4PAAK e HZ4485- IgG1N297A. Os anticorpos foram diluídos em série três vezes a partir de uma concentração de 500 nM em PBS contendo albumina de soro bovino a 0,1% (BSA) até a 8º concentração. As condições de ligação dos anticorpos humanizados HZ3266-

IgGIN297A, HZ3266-IgGl, HZ3266-G4PAAK, HZ4485-IgG1N297A e CHO-PDL1 são mostradas na Figura 2)

[0329] No ensaio, os anticorpos humanizados HZ3266- IgGl, HZ3266-IgGIN297A, HZ3266-G4PAAK e HZ4485-IgGl1N297A ligados ao PD-Ll humano superexpressos nas células CHO, e o EC5S0 foi de 1,813 nM, 1,784 nM, 1,862 nM, e 1,561 nM, respectivamente. Comparados com os anticorpos de referência ATE, estes anticorpos tinham capacidades de ligação superiores.

Exemplo 8. Detecção de atividade biológica de anticorpos por MOA

[0330] Os anticorpos anti-PD-1/PD-Ll podem aliviar o efeito inibitório no caminho do sinal NFAT a jusante, bloqueando a ligação de PD-l e PD-Ll. Neste estudo, foi utilizado um sistema de detecção de MOA (bioensaio de bloqueio PD-1/PD-Ll, modelo de propagação celular, catálogo J1252) disponível na Promega, Inc. De acordo com o método fornecido no manual do produto, a ativação do sinal NFAT foi refletida pela detecção da expressão de genes repórteres fluorescentes, detectando assim os efeitos inibitórios dos anticorpos na ligação a PD-l e PD-L1.

[0331] As células CHOKI-PDL1 (do sistema de detecção MOA descrito acima) foram plaqueadas um dia antes do ensaio de atividade. As células foram passadas 1 a 2 dias antes do plaqueamento. O sobrenadante da cultura foi descartado e as células foram lavadas uma vez com PBS (Gibco). Uma quantidade apropriada de tripsina (Gibco) foi adicionada para digestão por 3-5 min a 37 ºC, 5% de CO2; foi adicionado meio de cultura com um volume 4 vezes maior que o de tripsina e as células foram transferidas para tubos de centrífuga de 50 mL e contadas. As células com um volume desejado foram centrifugadas a 230 g durante 10 min. As células foram adicionadas em meio de cultura 1640 (Gibco) e ressuspensas em 4 x 105 células/mL. As células foram adicionadas a placas de cultura branca de 96 cavidades (Nunclon) a 100 uL/cavidade. O PBS foi adicionado aos cavidades de borda a 200 nuL/cavidade. As células foram incubadas durante a noite em uma incubadora a 37 ºC, 5% de CO2.

[0332] Tratamento com células Jurkat-PDl (a partir do sistema de detecção MOA descrito acima): As células foram passadas dois dias antes do teste de atividade. Após a contagem, as células do volume desejado foram centrifugadas a 170 gq por 5 min; as células foram ressuspensas em 1,25 x* 106 células/mL com tampão de ensaio [1640 meio de cultura (Gibco) + 1% de FBS].

[0333] Adição de amostras e células Jurkat-PDl às placas de ensaio (do sistema de detecção MOA descrito acima): 95 nL/cavidade de sobrenadante de células CHOK1I-PDL1 foi descartado. 40 nuL das amostras [os anticorpos humanizados HzZ3266-IgGl, HZ3266-IgG1N297A e HZ4485-IgG1N297A preparados na invenção, o controle positivo (Ate) e o controle negativo (IgGl)] foram adicionados [os anticorpos foram diluídos em série três vezes uma concentração de 100 nM em tampão de ensaio até a 8º concentração]. Foram adicionados 40 1uL das células Jurkat-PDl. As células foram incubadas em uma incubadora a 37 ºC, 5% de CO? por 6 h.

[0334] Detecção: O tampão Bio-GloTM (do sistema de detecção MOA descrito acima) foi descongelado com antecedência e o substrato Bio-GloTM (do sistema de detecção MOA descrito acima) foi adicionado e bem misturado. Após 6 horas, o reagente Bio-GloTM (do sistema de detecção MOA descrito acima) foi adicionado a 80 uL/cavidade. A mistura resultante foi deixada à temperatura ambiente durante 5-10 minutos antes da leitura.

[0335] Neste ensaio, como mostrado na Figura 3, os anticorpos HzZ3266-IgGl, HZ3266-IgG1N297A e HZ4485-IgG1N297A podem efetivamente bloquear a interação PD1/PD-L1.

Exemplo 9. Reação linfocitária mista

[0336] Neste estudo, os anticorpos e células DC maduras e células T CD4 + derivadas de diferentes doadores foram co-incubadas. As quantidades de expressão relativa de IL2 e IFN-y no sistema foram detectadas, de modo que o efeito ativador de diferentes anticorpos nas células T foi refletido.

[0337] Isolamento de PBMC: PBS de 2,5 vezes foi adicionado a 50 mL de sangue fresco de um doador. A mistura foi adicionada suavemente a FiColl (Thermo) e dividida em alíquotas em 4 tubos com 12,5 mL cada tubo. As amostras foram centrifugadas a 400 g por 30 min antes de parar a uma desaceleração de 0. A tira branca intermediária foi pipetada em PBS e lavada duas vezes com PBS.

[0338] Isolamento de células DC: As células PBMC isoladas acima foram incubadas aderentemente por 2 horas a 37 ºC, CO: a 6% após a adição de 5 mL de meio de cultura de células T (preparado conforme a tabela a seguir). A suspensão de células foi pipetada para isolamento de células CD4+. 3 mL de meio de cultura DC (preparado de acordo com a tabela a seguir) foram adicionados às células restantes para uma incubação de 2 dias e outros 3 mL de meio de cultura DC foram adicionados. No dia 5 da cultura, rTNFa (sistemas de P&D) (1000 U/mL), IL-lb (sistemas de P&D) (5 ng/ml), IL-6 (sistemas de P&D) (10 ng/ml) e 1 uM de PGE2 (Tocris) foram adicionados para outra incubação de 2 dias, resultando em células CD para reação de mistura de linfócitos (MLR).

Soro AB humano 5% Meio de cultura de Na-Pyr (Gibco) 1% células T: NEAA (Gibco) 1% P/S (Gibco) 1% Glutamax (Gibco) 1%

Soro AB humano 1% Meio de cultura de HEPES (Sigma) 10 mM células DC B-Me (Sigma) 50 uM IL-4 (Sistemas de P&D) (1000U/mL) GM-CSF (Sistemas de P&D) (1000U/mL)

[0339] Isolamento de células T CD4 +: Isso foi realizado de acordo com as instruções do kit 'Isolamento de células T CD4 + não tocadas' (11346D, Invitrogen). Os PBMCs foram deixados por 2 h antes da suspensão celular ser pipetada em um tubo de centrifugação de 15 mL. As células foram centrifugadas a 200 g por 10 min e o precipitado foi ressuspenso com 500 ul de um meio de separação, 100 ul de soro do tipo AB e 100 ul de anticorpo purificado. A mistura foi incubada por 20 min a 4 “C e lavada uma vez com o meio de separação. 500 pl de um tampão de esferas (Invitrogen) foram adicionados para uma incubação de 15 min e as esferas foram removidas por um campo magnético. A mistura foi lavada uma vez com meio de cultura de células T e ressuspensa com 8 mL de meio de cultura. A mistura resultante foi então incubada a 37 ºC, 6% de CO>2.

[0340] MLR: As células DC maduras obtidas acima foram misturadas com células CD4+ a 200 mL por cavidade, com 10000 células DC e 100000 células CD4+. os anticorpos (concentrações: 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0,8 nM, 0,16 nM e 0,032 nM) da invenção foram adicionados. Uma mistura das células

DC preparadas acima (representadas como DC na tabela a seguir), células T CD4+ (representadas como CD4 na tabela a seguir), a mistura (representada como célula na tabela a seguir) de células DC e células CD4+ e A IgGl divulgada na Tabela 3 aqui serviu como controle negativo e DC + células T CD4+ + esferas magnéticas anti-CD3/CD28 (QIAGEN) (representadas como Contas na tabela a seguir) serviram como controle positivo. As amostras foram incubadas por 5 dias e as concentrações de IL2 e IFN-gama (a expressão relativa em DeltaF%) foram detectadas por kits cisbio (Teste Human IL2 Kit 1000, Teste Humano IFN gama 1000).

[0341] Os resultados são mostrados nas Tabelas 9, 10, 11 e 12 e nas Figuras 4 e 5. Os dados nas tabelas estão em DeltaF%.

Tabela 9. Expressão relativa de IL2 em células do doador 1 Nome 100 nM 20nM 4nM O,8nM 0,16 nM 0,032 nM HZ3266-IgG1 29,21 18,35 25,44 18,19 27,15 26,75 HZ3266-IgG4PAAK 27,23 31,54 49,54 37,47 27,76 12,7 HZ3266-IgG1N297A 26,68 36,48 24,78 45,85 10,09 25,71 HZ4485-IgGIN297A 46,79 57,07 43,51 14,1 6,655 28,83 ATE 63,66 42,66 9,989 23,34 8,729 37,55 DC 19,71* CcD4 21,67* célula 27,17* Grânulos 17,85 IgG1 2,47

[0342] *Controle negativo; não foram adicionados anticorpos ou esferas magnéticas. Tabela 10. Expressão relativa de IL2 em células do doador 2 Nome 100 nM 20 nM 4mnM 0,8 nM 0,16 nM 0,032 nM HZ3266-IgG]l 36,91 6,659 27,29 12,83 52,58 33,79 HZ3266-IgG4PAAK 35,59 17,76 16,9 40,03 27,13 34,2 HZ3266-IgGIN297A — 43,74 25,01 24,49 23,83 13,2 32,88 HZ4485-IgG1N297A — 21,29 19,11 54,91 33,08 52,22 7,629 ATE 22,68 36,87 18,62 47,91 25,62 45,62 DC 8,379* CD4 53,96* Célula 39,05* Grânulos 9,422 IgGl 29,71

[0343] *Controle negativo; não foram adicionados anticorpos ou esferas magnéticas. Tabela 11. Expressão relativa de IFN-y em células do doador 1 Nome 100 nM 20nM 4nM O,8nM 0,l16nM 0,032 nM HZ3266-IgG1 482,7 452,4 453,5 412,3 166,3 101,1 HZ3266-I9G4PAAK 384,7 259,3 310,8 326,7 188,9 120,9 HZ3266-IgGIN297A 332,1 349,5 369,7 354,5 143,7 92,12 HZ4485-IgGIN297A 379 350,3 357,5 288,3 156,6 66,73 ATE 380,1 338,4 438,8 348,3 155,1 58,48 DC -18,8* CD4 14,6% Célula MLR 69,89* Grânulos 215,1 IgG1 49,66

[0344] *Controle negativo; não foram adicionados anticorpos ou esferas magnéticas.

Tabela 12. Expressão relativa de IFN-y em células do doador 2 Nome 100 nM 20 nM 4 nM 0,8 nM 0,16 nM 0,032 nM HZ3266-IgG1 286,7 267,3 449,1 236,7 194 48,33 HZ3266-IgG4PAAK 402,1 260,2 266,7 205,4 119,6 48,5 HZ3266-IgG1N297A 284,2 306,8 210,5 190,1 138,3 66,4 HZ4485-IgG1N297A 327 382,9 371,9 258,7 144,7 112,7 ATE 349,8 352,4 314,1 317,6 114,5 87,25 DC —4,12* CD4 7,17% Célula 67,53* Grânulos 367,8 IgG1 57,15

[0345] *Controle negativo; não foram adicionados anticorpos ou esferas magnéticas.

[0346] Portanto, os anticorpos da invenção podem ativar efetivamente células T in vitro, e parte dos efeitos de ativação são superiores aos do anticorpo de controle positivo.

Exemplo 10. Ensaio de capacidade de drenagem de anticorpos pela coluna Zenix

[0347] Neste ensaio, a capacidade de drenagem do anticorpo foi detectada analisando o tempo de retenção dos anticorpos humanizados exemplares da invenção em colunas zenix (Sepax Technologies, Inc). Quanto menor o tempo de retenção, menor a viscosidade do anticorpo e melhor a farmacologia.

[0348] Condições cromatográficas: comprimento de onda: 214 nm, temperatura da coluna: 25 “ºC, vazão: 0,35 mL/min, volume de injeção: 10 uL.

[0349] Preparação da amostra: 100 ul de amostras (anticorpos HZ3266-IgGl, HZ3266-IgG4PAAK, HZ3266-IgG1N297A e HZ4485-I9GGIN297A; ATE como controle positivo com uma concentração de 1 mg/mL) foram centrifugadas a 13000 rpm por min. 80 pL do sobrenadante foram transferidos para um inserto de fase líquida e colocados em uma bandeja de amostra de fase líquida para injeção.

[0350] Como mostrado na Tabela 13, os tempos de retenção dos diferentes isotipos HZ3266 e HZ4485 na coluna foram mais curtos que os do anticorpo de referência, indicando uma boa capacidade de druggability dos anticorpos HZ3266 e HZ4485.

Tabela 13. Ensaio de capacidade de druggability de anticorpos pela coluna Zenix Amostra Tempo de retenção (TR) (min) HZ3266-IgGl 7,744 HzZ3266-IgG4PAAK 7,73 HZ3266-IgG1N297A 7,749 HZ4485-IgG1N297A 8,429 ATE 10,317 Exemplo 11. Ensaio de eficácia antitumoral

[0351] Neste ensaio, o efeito antitumoral do anticorpo PD-L1l da invenção foi testado em células MC38

(MC38-hPDL1) (Nanjing Yinhe Biotech) que expressam PD-L1 humana em camundongos transgênicos hPD-L1.

[0352] Camundongos transgênicos hPD-L1:

[0353] Camundongos transgênicos hPD-Ll1 fêmeas com fundo C57B1/6 (cerca de oito semanas), adquiridos de Shanghai Model Organisms Center, Inc. Antes do estudo, os camundongos foram adaptados por 7 dias após a chegada.

Células:

[0354] As células MC38 (MC38-hPDLl) que expressam PD-L1l humana foram adquiridas da Nanjing Yinhe Biotech e foram subcultivadas em estrita conformidade com as instruções para outros ensaios in vivo. As células foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em PBS estéril, com a densidade celular ajustada para 5 x 106 células/mL. No dia 0, 0,2 mL de suspensão celular foram enxertados subcutaneamente na região abdominal dos camundongos transgênicos hPD-Ll para estabelecer modelos de camundongo portadores de tumor MC38-hPDL1.

Administração:

[0355] O volume tumoral dos camundongos foi medido 6 dias após o enxerto, e os camundongos com volume tumoral variando de 87,4 mm; a 228,4 mm3 foram selecionados e divididos igualmente em grupos por volume tumoral (8 camundongos cada grupo, um recebendo IgGl e outro recebendo HzZ3266 -IgGlIN297A da invenção). Os camundongos foram tratados duas vezes por semana aos 6, 10, 14, 17, 21, 24, 28, 31 e 35 dias após o enxerto. As dosagens e via de administração são mostradas na Tabela 12. As alterações no volume do tumor e no peso corporal dos camundongos foram monitorizadas durante o período de tratamento duas vezes/semana durante 5 semanas. Os pesos corporais e os volumes tumorais foram medidos antes de cada dose. Medida do volume tumoral: O comprimento máximo do eixo principal (L) e o comprimento máximo do eixo menor (W) dos tumores foram medidos com um paquímetro e o volume do tumor foi calculado usando a seguinte fórmula: V = LxW2/2. Os camundongos foram pesados duas vezes por semana usando uma balança eletrônica.

Tabela 14. Desenho do estudo Grupo Dose Volume de Concentra Via de dosagem ção administração IgG1 20 mg/kg 10mL/kg 2.0 mg/ml Intraperitone (sequência al mostrada na Tabela 3) Anticorpo da 20 mg/kg 10mL/kg 2,0 mg/ml Intraperitone invenção al

[0356] Os anticorpos da invenção mostraram uma eficácia antitumoral significativa uma semana após a administração (Figura 6) e, no dia 35, o tumor em um camundongo que recebeu o anticorpo da invenção foi completamente regredido. os resultados mostraram que diferentes dosagens de anticorpos não tiveram efeito no peso corporal dos camundongos portadores de tumor.

[0357] Portanto, o anticorpo da invenção tem efeito inibitório óbvio nos tumores.

Exemplo 12. Combinação de anticorpo anti-PD-Ll1 da invenção com anticorpo anti-LAG-3 humano

[0358] Neste estudo, a atividade antitumoral, o uso combinado do anticorpo anti-PD-Ll (HZ3266-IgG1IN297A) e do anticorpo anti-LAG-3 humano (ADI-31853) foi testado em um modelo de camundongo humanizado.

[0359] Neste estudo, a eficácia antitumoral do anticorpo anti-PD-Ll foi testada em camundongos NCG portadores de células cancerígenas da pele humana A375 (ATCC). PBMCsS humanas (todas as células) (2 x 106 células/camundongo) foram injetadas intravenosamente com antecedência e, em seguida, os modelos de camundongo A375 com tumor foram estabelecidos por meio de enxerto subcutâneo. Os camundongos foram agrupados após a formação do tumor e tratamentos com diferentes anticorpos foram dados. As alterações no tamanho do tumor e no peso corporal dos camundongos foram monitoradas durante o período de tratamento. Os tratamentos foram administrados duas vezes por semana, durante 2 semanas, com um total de 5 doses. Os camundongos foram monitorados duas vezes por semana durante 4 semanas. As dosagens e via de administração são as seguintes. A inibição do crescimento tumoral (TGI%) foi calculada após o final do tratamento.

Anticorpo anti-LAG-3 humano ADI-31853

[0360] O cDNA que codifica as sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada (Tabela 3) do anticorpo anti-LAG-3 ADI-31853 foi clonado em um vetor de expressão pTT5, de acordo com um método convencional na técnica.

[0361] O vetor de expressão contendo genes de anticorpos alvo e um reagente de transfecção PEI (Polysciences) foi transfectado transitoriamente para células renais embrionárias humanas incubadas 293 (Invitrogen) de acordo com um esquema fornecido pelo fabricante. Após a transfecção, o sobrenadante foi descartado e as células foram diluídas para 4 x 106/mL com meio EXPI293 fresco (Gibco). As células foram incubadas a 37 ºC, CO2 a 5% por 7 dias, com meio fresco alimentado a cada 48 horas. Após 7 dias, as células foram centrifugadas a 1300 rpm por 20 min. O sobrenadante foi purificado com proteína A para produzir anticorpos com pureza superior a 95%.

[0362] A constante de dissociação de equilíbrio (Kr) para ligação de ADI31853 ao LAG-3 humano (hLAG-3) foi medida por interferometria ótica biológica (ForteBio). Foi realizado um ensaio de afinidade ForteBio da técnica anterior (Estep, P., et al., Medição baseada em solução de alto rendimento da afinidade anticorpo-antígeno e eliminação de epítopos. MAbs, 2013.5 (2): 270-8). Resumidamente, Oo sensor foi equilibrado off-line no tampão de teste por 30 minutos e a detecção on-line foi realizada por 60 segundos para estabelecer uma linha de base. O anticorpo purificado obtido como descrito acima foi carregado on-line em um sensor AHQ (ForteBio) para o ensaio de afinidade ForteBio. O sensor com o anticorpo carregado foi então exposto a 100 nM de um antígeno LAG-3 humano (ArcoBiosystems) por 5 minutos antes de transferir o sensor para o tampão de ensaio para dissociação por 5 minutos para medição da taxa de dissociação. A análise cinética foi realizada usando um modelo de ligação 1:1.

[0363] No ensaio descrito acima, a afinidade ADI- 31853 foi a seguinte: do AHQ e o LAG-3-His humano Constante | Constante Anticorpo estava em solução (100 nM) [a de o de o afinidade inivalente, a constante | associação | dissociação de dissociação do equilíbrio Ko (M-18-1) (S-1) (M)] Camundongos:

[0364] Camundongos NOG, fêmeas, 7-8 semanas de idade (idades de enxerto de células tumorais), peso de 17,6-24,2 g, adquiridos do Laboratório de Beijing Vital River Animal Technology Co., Ltd. Antes do estudo, os camundongos foram adaptados por 7 dias após chegada.

Células:

[0365] As células de câncer de pele humana A375 (ATCC tt CRL-1619) foram adquiridas da ATCC e foram subcultivadas em estrita conformidade com o requisito fornecido pela ATCC para outros ensaios in vivo. As células foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em PBS estéril, com a densidade celular ajustada para 30 x 106 células/mL. Os camundongos NOG foram injetados intravenosamente com PBMC humano (Todas as Células), seguido de barbear dorsal direita e injeções subcutâneas das células A375 a 0,2 mL/camundongo. O volume tumoral dos camundongos foi medido 7 dias após o enxerto e os camundongos com volume tumoral variando de 70 a 71 mm3 foram selecionados e divididos aleatoriamente em grupos por volume tumoral.

Tratamento:

[0366] Os seguintes anticorpos foram injetados por via subcutânea em vários grupos: (1) IgG humana (equitech-Bio), 20 mg/kg; (2) LAG-3 (ADI-31853), 10 mg/kg; (3) PD-L1 (HZ3266-IgG1N297A), 10 mg/kg; (4) LAG-3 (ADI-31853), 10 mg/kg + PD-Ll (H2Z3266- IgG1N297A), 10 mg/kg.

[0367] No sétimo dia após o enxerto, os camundongos com tamanhos médios de tumores que atendiam aos requisitos foram aleatoriamente agrupados com 8 camundongos por grupo. Os camundongos em cada grupo foram administrados com os quatro regimes nos dias 7, 10, 14 e 17 nas doses acima, respectivamente.

[0368] Análise: O volume do tumor e o peso corporal foram medidos duas vezes por semana durante o estudo, e os camundongos foram sacrificados quando os tumores atingiram o ponto final ou quando os camundongos tiveram mais de 20% de perda de peso. O comprimento máximo do eixo principal (L) e o comprimento máximo do eixo menor (W) dos tumores foram medidos com um paquímetro e o volume do tumor foi calculado usando a seguinte fórmula: V = L x W./2. O volume do tumor ao longo do tempo dos camundongos em vários grupos foi plotado. A significância estatística foi determinada usando a análise de variância (ANOVA). Um valor de P abaixo de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todas as análises.

[0369] Como mostrado na Figura 7, pode-se observar que o uso combinado do anticorpo monoclonal anti-LAG-3 ADI- 31853 (31853) e do anticorpo monoclonal anti-PD-L1 (Hz73266- IgG1N297A) (HZ 3266) inibiu significativamente o crescimento do tumor em comparação com o uso de um controle de IgG humano (equitech-Bio) (hIgG) e uso separado dos dois anticorpos.

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a PD-Ll, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (1) três regiões determinantes de complementaridade HCDRs de uma região variável de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 26 ou 30, e três regiões determinantes de complementaridade LCDRs de uma região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 32 ou 36, ou (1i) três regiões determinantes de complementaridade HCDRs de uma região variável de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 27, e três regiões determinantes de complementaridade LCDRs de uma região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 33, ou (iii) três regiões determinantes de complementaridade HCDRs de uma região variável de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 28, e três regiões determinantes de complementaridade LCDRs de uma região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 34, ou (iv) três regiões determinantes de complementaridade HCDRs de uma região variável de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 29 ou 31, e três regiões determinantes de complementaridade LCDRs de uma região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 35 ou 37.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a PD-Ll, o anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende três regiões determinantes de complementaridade (HCDRs) de uma região variável de cadeia pesada e três regiões determinantes de complementaridade (LCDRs) de uma região variável de cadeia leve, em que HCDR1l compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1, 2, 3 ou 4, HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 ou 9, HCDR3 compreende um amino sequência de ácido, como mostrado na SEQ ID NO: 10, 11, 12 ou 13, LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 14, ou 16, LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO : 17, 18, 19 ou 20, e o LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 ou 25.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao PD-Ll, o anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende: (i) três regiões determinantes de complementaridade (HCDRs) contidas em um VH de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela B; ou

(ii) uma combinação de HCDRlI, HCDR2 e HCDR3, como mostrado na Tabela A; e/ou a região variável de cadeia leve compreende: (1) três regiões determinantes de complementaridade (LCDRs) contidas em uma VL de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela B; ou (11) uma combinação de LCDRlI, LCDR2 e LCDR3, como mostrado na Tabela A.

4. Anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve e/ou uma região variável de cadeia pesada, em que (1) a região variável de cadeia pesada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 26 ou 30; e/ou a região variável de cadeia leve compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 32 ou 36; (ii) a região variável de cadeia pesada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos

90% de identidade com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; e/ou a região variável de cadeia leve compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (iii) a região variável de cadeia pesada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 28; e/ou a região variável de cadeia leve compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (iv) a região variável de cadeia pesada compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 29 ou 31; e/ou a região variável de cadeia leve compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 35 ou 37.

5. Anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve e/ou uma região variável de cadeia pesada, em que (i) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou 30; e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32 ou 36; (ii) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; (iii) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34; (iv) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou 31; e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 ou 37.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma cadeia pesada (i) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 38, 42, 43 ou 44; ou

(ii) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 38, 42, 43 ou 44;

e/ou

(b) uma cadeia leve

(i) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 46 ou 50; ou

(1i) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 46 ou 50; ou

(a) uma cadeia pesada

(i) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; ou

(ii) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39;

e/ou

(b) uma cadeia leve

(i) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; ou

(ii) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; ou

(a) uma cadeia pesada

(i) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; ou

(ii) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40;

e/ou

(b) uma cadeia leve

(1) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou

(ii) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou

(a) uma cadeia pesada

(1) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 41 ou 45; ou

(ii) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 41 ou 45;

e/ou

(b) uma cadeia leve

(i) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 49 ou 51; ou (ii) compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 49 ou 51.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao PD-Ll, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que tem um ou mais dos seguintes recursos: (1) ligar a PD-Ll1 (por exemplo, PD-Ll humana) com alta afinidade, por exemplo, ligar a PD-Ll com uma constante de dissociação de equilíbrio (Ko) menor que cerca de 2 nM; (2) o anticorpo ou fragmento do mesmo se liga a células que expressam PD-Ll1 humana, por exemplo, com um ECso menor ou igual a cerca de 2 nM; (3) o anticorpo ou fragmento do mesmo bloqueando uma atividade associada ao PD-Ll, por exemplo, com um ECso menor ou igual a cerca de 0,7 nM; (4) o anticorpo ou fragmento do mesmo aumentando uma função de célula T, por exemplo, superior a um anticorpo conhecido anti-PD-Ll, por exemplo, Tecentriqg; (5) o anticorpo ou fragmento do mesmo aumentando a proliferação de células T, por exemplo, em MLR, por exemplo, superior a um anticorpo anti-PD-Ll conhecido, por exemplo, Tecentriqg;

(6) o anticorpo ou fragmento do mesmo aumentando a secreção de IFN-y, por exemplo, superior a um anticorpo anti- PD-Ll1 conhecido, por exemplo, Tecentriqg;

(7) o anticorpo ou fragmento do mesmo aumentando a secreção de IL-2, por exemplo, superior a um anticorpo anti- PD-Ll conhecido, por exemplo, Tecentriq;

(8) em um ensaio em coluna Zenix, um tempo de retenção (RT) inferior a cerca de 10 minutos;

(9) inibir uma ou mais atividades de PD-Ll1, por exemplo, resultando em um ou mais dos seguintes: aumento de linfócitos infiltrantes de tumor, aumento da proliferação mediada por receptor de células T ou diminuição da evasão imune de células cancerígenas;

(10) induzir citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC);

(11) mostrar a mesma afinidade ou/ou especificidade de ligação igual ou similar para PD-Ll como qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3;

(12) inibir (por exemplo, inibição competitiva) a ligação de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3 a PD-L1;

(13) ligar ao mesmo epítopo ou sobreposição que qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3;

(14) competir com qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3 pela ligação ao PD-L1;

(15) ter uma ou mais características biológicas de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 3.

8. Anticorpo anti-PD-L1l ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno na forma de IgGl ou IgG4 e, opcionalmente, o anticorpo anti-PD-Ll ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região constante da cadeia leve k, por exemplo, uma região constante da cadeia leve k humana.

9. Anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

10. Anticorpo anti-PD-Ll1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano ou um anticorpo quimérico.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em: Fab, Fab', Fab'-Fab'-SH, Ev, anticorpos de cadeia única tais como scFv, fragmentos (Fab')2, anticorpos de domínio único, diacorpos (dAbs) ou anticorpos lineares.

12. Anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico ou multiespecífico e, de preferência, o anticorpo biespecífico se liga a PD-L1 e LAG-3.

13. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13, em que, de preferência, o vetor é um vetor de expressão, tal como um vetor pTT5.

15. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13 ou o vetor conforme definido na reivindicação 14, em que a célula hospedeira é, preferencialmente, procariótica ou eucariótica, mais preferencialmente, a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em células de EF. coli, células de levedura, células de mamífero ou outras células adequadas para a produção do anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e, mais preferencialmente, a célula hospedeira é uma célula 293 ou célula CHO.

16. Método para preparar um anticorpo anti-PD-Ll ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o método caracterizado pelo fato de que compreende incubar a célula hospedeira conforme definida na reivindicação 15 em condições adequadas para a expressão de um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e, opcionalmente, isolar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; opcionalmente, o método compreende ainda recuperar oO anticorpo anti-PD-Ll ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir da célula hospedeira.

17. Imunoconjugado caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-PD-Ll ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e uma substância adicional, tal como um agente citotóxico.

18. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-PD-Ll1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou o imunoconjugado conforme definido na reivindicação 17 e, opcionalmente, um material suplementar farmacêutico.

19. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-PD-Ll ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou o imunoconjugado conforme definido na reivindicação 17, um agente terapêutico adicional e, opcionalmente, um material suplementar farmacêutico; em que, preferencialmente, o agente terapêutico adicional é selecionado do grupo que consiste em agentes quimioterápicos, outros anticorpos (por exemplo, um anticorpo anti-LAG-3, por exemplo, um anticorpo anti-LAG-3 que se liga a um antígeno humano, preferencialmente, o anticorpo anti-LAG-3 é humanizado), agentes citotóxicos, vacinas, agentes ativos anti-infecção, ou agentes imunomoduladores (por exemplo, um ativador de moléculas coestimuladoras ou um inibidor de moléculas do ponto de verificação imune).

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LAG-3 compreende: (i) três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDRs) da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 75, e/ou (ii) três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDRs) da região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 76.

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-LAG-3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL), em que (1) o VH compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que o HCDR1 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; o HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 70 ou consiste na sequência de aminoácidos; o HCDR3 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e/ou (ii) a VL compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a LCDR1 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; o LCDR2 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; o LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 74 ou consiste na sequência de aminoácidos.

22. Uso de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-PD- L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou do imunoconjugado “conforme definido na reivindicação 17 caracterizado pelo fato de que é na preparação de medicamentos para prevenir ou tratar um tumor ou uma doença infecciosa em um sujeito ou indivíduo.

23. Uso de uma quantidade eficaz do anticorpo anti-PD- Ll1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou do imunoconjugado conforme definido na reivindicação 17 ou da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 18 ou 19, e do anticorpo anti-LAG-3 (por exemplo, o anticorpo anti-LAG-3 que se liga a um antígeno humano, de preferência, o anticorpo anti-LAG-3 é humanizado) caracterizado pelo fato de que é na preparação de medicamentos para prevenir ou tratar um tumor ou uma doença infecciosa em um sujeito ou um indivíduo.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o tumor é câncer, tal como um tumor do trato gastrointestinal, tal como câncer do trato gastrointestinal, tal como câncer de cólon; ou a doença infecciosa é uma infecção crônica.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que os medicamentos podem ser administrados em combinação com uma ou mais de outras terapias, em que as terapias, por exemplo, incluem modalidades terapêuticas e/ou outros agentes terapêuticos, preferencialmente as modalidades terapêuticas incluem tratamento cirúrgico e/ou radioterapia, ou o agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em agentes quimioterápicos, agentes citotóxicos, vacinas, agentes ativos anti-infecção, outros anticorpos (por exemplo, um anticorpo anti-LAG-3, por exemplo, um anticorpo anti-LAG -3 que se liga a um antígeno humano, de preferência, o anticorpo anti-LAG-3 é humanizado) ou agentes imunomoduladores (por exemplo, um ativador de moléculas coestimuladoras ou um inibidor de moléculas do ponto de verificação imune).

26. Uso, de acordo com as reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-LAG-3 compreende: (i) três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDRs) da região variável de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 75, e/ou (ii) três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDRs) da região variável de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 76.

27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti- LAG-3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL), em que (i) o VH compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) HCDRl1, HCDR2 e HCDR3, em que o HCDR1 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; o HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 70 ou consiste na sequência de aminoácidos; o HCDR3 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; e/ou (ii) a VL compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) LCDRl, LCDR2 e LCDR3, em que a LCDR1 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; o LCDR2 compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; o LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 74 ou consiste na sequência de aminoácidos.

28. Método para detectar PD-Ll em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende (a) contactar a amostra com o anticorpo anti-PD-L1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; e (b) detectar a formação de um complexo pelo anticorpo anti-PD-Ll1 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e PD-L1 é detectado e, opcionalmente, o anticorpo anti-PD-L1 é marcado de forma detectável.