CN111373261A - Cd19 cart细胞可清除表达极低水平cd19的骨髓瘤细胞 - Google Patents

Cd19 cart细胞可清除表达极低水平cd19的骨髓瘤细胞 Download PDF

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Abstract

本发明总体涉及使用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的免疫疗法，具体地，本发明涉及利用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞靶向以低表达癌细胞表面抗原为特征的癌细胞亚群的免疫疗法，更具体地，本发明涉及使用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞靶向多发性骨髓瘤中的CD19(CD19CART)的免疫疗法，其中所述多发性骨髓瘤为浆细胞的克隆性增殖。

Description

CD19 CART细胞可清除表达极低水平CD19的骨髓瘤细胞
技术领域
本发明总体涉及使用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的免疫疗法。具体地，本发明涉及使用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞靶向以低表达癌细胞表面抗原为特征的癌细胞亚群的免疫疗法，更具体地，本发明涉及使用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞靶向多发性骨髓瘤中的CD19(CD19CART)的免疫疗法，其中所述多发性骨髓瘤为浆细胞的克隆性增殖。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是一种血液恶性肿瘤，伴有产生异常免疫球蛋白的浆细胞克隆性增殖。尽管已采用综合化学疗法进行了积极治疗，大多数骨髓瘤患者仍然无法治愈1。在最近的一项临床研究中，Garfall等人报道了在经过大量预处理的骨髓瘤患者中采用基因工程T细胞过继免疫治疗的临床疗效，该基因工程T细胞表达对B细胞标记物CD19特异的嵌合抗原受体(CAR)(CD19CART)。他们在清髓化学疗法和自体造血干细胞移植(HSCT)2后接受CD19CART治疗的患者中，观察到一例完全缓解和几例部分缓解。值得注意的是，完全应答的患者先前接受的清髓性化疗和自体HSCT仅诱发了部分、瞬时性的缓解，因此，该完全缓解的结果应归因于CD19CART的给药2。
CD19CART疗法被批准作为患有复发性/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)3-6的患者的潜在治愈性疗法。在这些疾病中，CD19在恶性肿瘤细胞上广泛表达，其抗原密度约为每个细胞数千个分子3,4,7，这被认为是CD19CART可识别的最佳范围。相反，CD19通常被认为是骨髓瘤细胞上不常表达且不广泛的靶点2,8。根据流式细胞术(FC)的常规检测，在Garfall等人的研究中，获得完全缓解的患者的骨髓瘤细胞中仅有0.05％表达CD19，引发了CD19作为骨髓瘤治疗靶点的作用的争议。此外，关于FC的灵敏度和激活CD19CART所需的CD19抗原密度阈值的争论一直在进行。
在先前的工作中，发明人已经展现了直接随机光学重建显微术(dSTORM)在确定人细胞质膜上分子的绝对拷贝数中的能力9,10。这种超分辨显微术具有单分子灵敏度11,12，这表明该技术可用于检测骨髓瘤细胞中极低水平表达的CD19，而该表达水平无法通过FC检测到。发明人假设CD19可在一定比例的骨髓瘤细胞中以低于FC的检测极限的分子密度表达。为了验证这一点，发明人使用dSTORM生成骨髓瘤细胞上CD19的表达谱，并评估CD19CART对其的识别能力。发明人展示了在一骨髓瘤患者亚组中，CD19在大部分骨髓瘤细胞上以非常低的抗原密度表达，该抗原密度低于FC的检测极限，并且证明了CD19CART能识别每个骨髓瘤细胞上少于100个的CD19分子并予以清除。
发明内容
本发明总体涉及使用免疫细胞如嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的免疫疗法。具体地，本发明涉及使用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞靶向以低表达癌细胞表面抗原为特征的癌细胞亚群的免疫疗法，更具体地，本发明涉及使用嵌合抗原受体(CAR)工程改造的T细胞靶向多发性骨髓瘤的CD19(CD19CART)的免疫疗法，其中所述多发性骨髓瘤为浆细胞的克隆性增殖。
本发明通过以下优选实施例举例说明：
1.一种方法，其包括以下步骤：
(A)分析来自癌症患者的含有癌细胞的样品，获得癌细胞的细胞表面抗原的信息；和
(B)基于在步骤(A)中获得的信息对所述的含有癌细胞的样品进行分类。
2.如第1项所述的方法，其中，所述的癌症是血液癌或实体瘤。
3.如第1项或第2项所述的方法，其中，所述的癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，优选地，所述的癌症是多发性骨髓瘤。
4.如第1-3项中任一项所述的方法，其中，步骤(A)包括使用超分辨显微术分析所述含有癌细胞的样品。
5.如第1-4项中任一项所述的方法，其中，步骤(A)包括确定所述的癌细胞上所述细胞表面抗原的分子数目。
6.如第4项或第5项所述的方法，其中，所述的超分辨显微术是单分子定位显微术。
7.如第4-6项中所述的方法，其中，所述的超分辨显微术是dSTORM、STORM、PALM或FPALM。
8.如第7项所述的方法，其中，所述的超分辨显微术是dSTORM。
9.如第1-8项中任一项所述的方法，其中，在该方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞样品是否包含表达细胞表面抗原的一部分癌细胞。
10.如第6-9项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原是如第5项所述的抗原。
11.如第5-10项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原是癌症抗原。
12.如第5-11项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原不能通过流式细胞术检测到。
13.如第5-12项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原可通过超分辨显微术检测到。
14.如第5-13项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原可通过单分子定位显微术检测到。
15.如第5-14项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原可通过dSTORM、STORM、PALM或FPALM检测到。
16.如第15项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原可通过dSTORM检测到。
17.如第5-16项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过4个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
18.如第5-16项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过8个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
19.如第5-16项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过16个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
20.如第5-16项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过32个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
21.如第5-16项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过64个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
22.如第5-16项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过100个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
23.如第5-16项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过200个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
24.如第5-16项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过300个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
25.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过10,000个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
26.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过5,000个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
27.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过2,500个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
28.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过1,500个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
29.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过1,350个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
30.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过1,300个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
31.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过1,000个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
32.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过800个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
33.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过500个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
34.如第5-24项中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过400个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
35.如第5-34项中任一项所述的方法，其中，每个细胞的所述细胞表面抗原的所述分子数目通过显微术确定。
36.如第5-35项中任一项所述的方法，其中，每个细胞的所述细胞表面抗原的所述分子数目通过超分辨显微术确定。
37.如第5-36项中任一项所述的方法，其中，每个细胞的所述细胞表面抗原的所述分子数目通过单分子定位显微术确定。
38.如第35-37项中任一项所述的方法，其中，所述的显微术是dSTORM、STORM、PALM或FPALM。
39.如第35-38项中任一项所述的方法，其中，所述的显微术是dSTORM。
40.如第1-39项中任一项的方法，其中，所述的细胞表面抗原选自包含CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD52、CD64、CD70、CD72、CD123、CD135、CD138、CD220、CD269、CD319、ROR1、ROR2、SLAMF7、BCMA、αvβ3-整联蛋白、α4β1-整联蛋白、EpCAM-1、MUC-1、MUC-16、L1-CAM、c-kit、NKG2D、NKG2D-配体、PD-L1、PD-L2、Lewis-Y、CAIX、CEA、c-MET、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、Her2、FAP、FR-a、EphA2、GD2、GD3、GPC3、IL-13Ra、间皮素、PSMA、PSCA和VEGFR的组，优选CD19和/或CD20。
41.如第5-40项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原是CD19。
42.如第5-41项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原是CD20。
43.如第4-42项中任一项所述的方法，其中，步骤(A)包括以下子步骤：
(A-I)在所述癌细胞上标记所述细胞表面抗原；
(A-II)通过超分辨显微术检测所述癌细胞上的所述标记的细胞表面抗原；和
(A-III)对每个癌细胞上标记的细胞表面抗原分子的数目进行计数。
44.如第5-43项中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原分别在步骤(A)和步骤(A-I)中通过免疫染色进行标记。
45.如第1-44项中任一项所述的方法，其中，步骤(B)还包括以下步骤：
(B-I)如果在步骤(A-III)中获得的每个细胞的细胞表面抗原分子的数目高于最小阈值，则将所述含有癌细胞的样品分类为所述的细胞表面抗原阳性；和/或
(B-II)如果在步骤(A-III)中获得的每个细胞的细胞表面抗原分子的数目低于最小阈值，则将所述含有癌细胞的样品分类为所述的细胞表面抗原阴性。
46.如第45项所述的方法，其中，所述的最小阈值的范围为4-300。
47.如第45项或第46项所述的方法，其中，所述的最小阈值为4。
48.如第45项或第46项所述的方法，其中，所述的最小阈值为8。
49.如第45项或第46项所述的方法，其中，所述的最小阈值为16。
50.如第45项或第46项所述的方法，其中，所述的最小阈值为32。
51.如第45项或第46项所述的方法，其中，所述的最小阈值为64。
52.如第45项或第46项所述的方法，其中，所述的最小阈值为100。
53.如第45项或第46项所述的方法，其中，所述的最小阈值为200。
54.如第45项或第46项所述的方法，其中，所述的最小阈值为300。
55.如第1-54项中任一项所述的方法，其中，基于在步骤(B)中所述的对含有癌细胞的样品的分类，对所述患者进行癌症治疗是否适格进行预测。
56.如第55项所述的方法，其中，如果在步骤(B)中针对所述的细胞表面抗原的所述含有癌细胞的样品的分类为阳性，则预测所述患者适用癌症治疗。
57.如第1-56项中任一项所述的方法，其中，所述的方法是选择用于癌症治疗的靶抗原的方法。
58.如第1-57项中任一项所述的方法，其中，所述的方法是用于选择癌症治疗的患者的方法。
59.如第58项所述的方法，其中，所述的癌症疗法是针对所述细胞表面抗原的癌症免疫疗法。
60.如第59项所述的方法，其中，所述的癌症免疫疗法是针对所述细胞表面抗原的靶向癌症免疫疗法。
61.如第60项所述的方法，其中，所述的靶向癌症免疫疗法是针对所述细胞表面抗原的基于细胞的靶向癌症免疫疗法。
62.如第61项所述的方法，其中，所述的基于细胞的靶向癌症免疫疗法是使用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞靶向所述细胞表面抗原的免疫疗法。
63.如第59-62项中任一项所述的方法，其中，所述的免疫疗法是靶向细胞表面抗原的免疫疗法，所述细胞表面抗原选自包含CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD52、CD64、CD70、CD72、CD123、CD135、CD138、CD220、CD269、CD319、ROR1、ROR2、SLAMF7、BCMA、αvβ3-整联蛋白、α4β1-整联蛋白、EpCAM-1、MUC-1、MUC-16、L1-CAM、c-kit、NKG2D、NKG2D-配体、PD-L1、PD-L2、Lewis-Y、CAIX、CEA、c-MET、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、Her2、FAP、FR-a、EphA2、GD2、GD3、GPC3、IL-13Ra、间皮素、PSMA、PSCA和VEGFR的组，优选地，所述免疫疗法是靶向CD19和/或CD20的免疫疗法。
64.如第63项的方法，其中，所述的免疫疗法是靶向CD19和/或CD20的免疫疗法。
65.如第63项的方法，其中，所述的免疫疗法是靶向CD19的免疫疗法。
66.如第63项的方法，其中，所述的免疫疗法是靶向CD20的免疫疗法。
67.如第1-66项中任一项所述的方法，其中，所述的方法的所有步骤均在体外进行。
68.如第1-67项中任一项所述的方法，其中，所述的方法不包括通过手术或疗法对人体或动物体进行治疗。
69.如第1-68项中任一项所述的方法，其中，所述的方法不是在人体或动物体上实施的诊断方法。
70.如第1-69项中任一项所述的方法，其中，所述的含有癌细胞的样品是骨髓抽出物。
71.如第1-70项中任一项所述的方法，其中，所述的含有癌细胞的样品包括原发性骨髓瘤细胞，并且所述患者是骨髓瘤患者。
72.如第1-71项中任一项所述的方法，其中，所述的含有癌细胞的样品包括表达CD138的原发性骨髓瘤细胞，并且所述患者是骨髓瘤患者。
73.如第1-72项中任一项所述的方法，其中，所述的含癌细胞的样品可通过从骨髓抽出物中阳性选择CD138的原发性骨髓母细胞获得。
74.如第73项所述的方法，其中，所述的选择是使用磁珠选择。
75.一种能够靶向癌细胞的细胞表面抗原的免疫细胞，应用于治疗患者中所述癌症的方法，其中，在该方法中，免疫细胞将施用于患者。
76.如第75项所述的免疫细胞用于如第75项所述的应用，其中，所述的癌症是骨髓瘤。
77.如第75项或第76项所述的免疫细胞用于如第75项或第76项所述的应用，其中，所述的癌症包含如权利要求5-74中任一项所述的对所述细胞表面抗原呈阳性的部分细胞。
78.如第75-77项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-77项中任一项所述的应用，其中，所述的方法包括癌症免疫疗法。
79.如第78项所述的免疫细胞用于如第78项所述的应用，其中，所述的癌症免疫疗法是靶向癌症免疫疗法。
80.如第79项所述的免疫细胞用于如第79项所述的应用，其中，所述的靶向癌症免疫疗法是基于细胞的靶向癌症免疫疗法。
81.如第79项或第80项所述的免疫细胞用于如第79项或第80项所述的应用，其中，所述的靶向癌症免疫疗法是靶向第63-66项中任一项所述的细胞表面抗原的靶向癌症免疫疗法。
82.如第81项的免疫细胞用于如第81项所述的应用，其中，所述的免疫细胞能够结合所述细胞表面抗原。
83.如第75-82项中任一项所述的权利要求所述的免疫细胞用于如第75-82中任一项所述的应用，其中，该免疫细胞能够结合CD19和/或CD20。
84.如第75-83项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-83项中任一项所述的应用，其中，该免疫细胞能够结合CD20。
85.如第84项的免疫细胞用于如第84项所述的应用，其中，所述的免疫细胞能够结合CD20的胞外结构域。
86.如第75-85项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-85项中任一项所述的应用，其中，所述的免疫细胞能够结合CD19。
87.如第86项的免疫细胞用于如第86项所述的应用，其中，所述的免疫细胞能够结合CD19的胞外结构域。
88.如第75-87项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-87项中任一项所述的应用，其中，所述的细胞是表达嵌合抗原受体的细胞。
89.如第88项所述的免疫细胞用于如第88项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体能够结合所述细胞表面抗原。
90.如第88项或第89项所述的免疫细胞用于如第88项或第89项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体能够结合CD19和/或CD20。
91.如第88-90项中任一项所述的免疫细胞用于如第88-90项中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体能够结合CD20。
92.如第88-91项中任一项所述的免疫细胞用于如第88-91项中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体能够结合CD19。
93.如第75-92项中任一项的免疫细胞用于如第75-92项中任一项所述的应用，其中，所述的细胞选自T细胞、NK细胞和B细胞。
94.如第75-93项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-93项中任一项所述的应用，其中，所述的细胞是T细胞。
95.如第75-94项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-94项中任一项所述的应用，其中，所述的基于细胞的靶向癌症免疫疗法是具有嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的免疫疗法。
96.如第75-95项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-95项中任一项所述的应用，其中，所述的患者是适用通过权利要求55-74中任一项所述的方法可预测的所述治疗的患者。
97.如第75-96项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-96项中任一项所述的应用，其中，所述的癌症通过流式细胞术确定了所述细胞表面抗原的表达是阴性的。
98.如第97项所述的免疫细胞用于如第97项所述的应用，其中，所述的癌症通过超分辨显微术检测确定了所述细胞表面抗原的表达是阳性的。
99.如第98项所述的免疫细胞用于如第98项所述的应用，其中，所述的癌症通过单分子定位显微术确定了所述细胞表面抗原的表达是阳性的。
100.如第98项或第99项所述的免疫细胞用于如第98项或第99项所述的应用，其中，所述的癌症通过dSTORM、STORM、PALM或FPALM确定的所述细胞表面抗原表达呈阳性。
101.如第100项所述的免疫细胞用于如第100项所述的应用，其中，所述的癌症通过dSTORM确定的所述细胞表面抗原的表达是阳性的。
102.如第75-101项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-101项中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少4个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
103.如第75-101项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-101项中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少8个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
104.如第75-101项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-101项中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少16个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
105.如第75-101项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-101项中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少32个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
106.如第75-101项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-101项中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少64个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
107.如第75-101项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-101项中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少100个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
108.如第75-101项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-101项中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少200个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
109.如第75-101项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-101项中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少300个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
110.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过10,000个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
111.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过5,000个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
112.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过2,500个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
113.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过1,500个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
114.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过1,350个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
115.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过1,300个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
116.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过1,000个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
117.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过800个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
118.如第75-109项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-109项中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过500个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
119.如第75-118项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-118项中任一项所述的应用，其中，所述的治疗是与清髓化学疗法联用的治疗。
120.如第119项所述的免疫细胞用于如第119项所述的应用，其中，所述的清髓化学疗法包括用美法仑治疗。
121.如第120项所述的免疫细胞用于如第120项所述的应用，其中，美法仑以每平方米100mg至每平方米200mg的剂量施用，优选地，美法仑以每平方米140mg的剂量施用。
122.如第75-121项中任一项所述的免疫细胞用于如第75-121项中任一项所述的应用，其中，所述的治疗是与自体造血干细胞移植联用的治疗；和/或与同种异体造血干细胞移植联用的治疗。
123.如第88-122项中任一项所述的免疫细胞用于如第88-122项中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体是具有由SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的嵌合抗原受体。
124.如第88-122项中任一项所述的免疫细胞用于如第88-122项中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体是具有由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的嵌合抗原受体。
125.如第88-122项中任一项的免疫细胞用于如第88-122项中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体是具有由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的嵌合抗原受体。
附图说明
图1：使用流式细胞仪检测多发性骨髓瘤细胞上的CD19
通过流式细胞仪和dSTORM检测原发性骨髓瘤细胞。用抗CD138的抗体和抗CD38的抗体对取自多发性骨髓瘤患者的CD138纯化的骨髓抽出物进行染色，以检测骨髓瘤细胞和CD19特异性抗体或相应的同种型对照。图中为高CD19+骨髓瘤细胞(A，患者M012)、CD19+MM细胞(B，患者M016)、CD19不确定表达(C，患者M019)和CD19-MM细胞(D，患者M022)的示例(通过流式细胞术判断)。对浆细胞(FSC/SSC)和CD138+/CD38+MM细胞设门。
表1和图5显示了所有患者的数据。
图2：使用dSTORM检测多发性骨髓瘤细胞上的CD19
使用常规的宽场荧光(A)和dSTORM(B)在原发性骨髓瘤细胞上检测CD19。图像描绘了CD19+(顶行)和CD19-骨髓瘤细胞(底行)的底部质膜(附着在玻璃表面)中的CD19分子。小面板(C)显示放大的方框区域，展示了dSTORM显著增强的灵敏度。CD38(D)、CD138(E)的荧光图像和相应的透射光图像(F)用于鉴定细胞。标尺为10μm和1μm(C)。
图3(3A-3D)：通过dSTORM定量多发性骨髓瘤细胞上的CD19，并通过CD19-CART细胞清除
用抗CD138的抗体和抗CD38的抗体对来自多发性骨髓瘤患者的CD138纯化的骨髓抽出物进行染色，以检测骨髓瘤细胞和CD19特异性抗体或所述相应的同种型对照。使用dSTORM对图1中所示的相同患者进行了研究。使用dSTORM定量分析MM细胞质膜中同种型抗体(第一列)和CD19(第二列)密度的分布。分布分析的红色部分对应于通过流式细胞仪检测确定的CD19阳性细胞的百分比(见图1)。密度以每μm2抗体的对数表示。随后将密度分布分为CD19阳性亚群(CD19阳性细胞)和CD19阴性亚群(CD19阴性细胞)。后一组由同种型对照抗体的密度分布模式(对照抗体与质膜和玻璃表面的非特异性结合)定义。分布用一个一元或者二元对数正态函数拟合，该函数依赖于通过Anderson-Darling检验计算出的拟合精度(在p值<0.05时舍弃)。第三列和第四列：CAR T细胞和对照T细胞处理的MM细胞上的CD19密度的对数。PDF：概率密度函数。表1和图8显示了所有患者的数据。
图4：患者之间的CD19表达差异很大
(A)通过dSTORM检测CD19+(深灰色)和CD19-(浅灰色)原发性MM细胞亚群的平均蛋白密度。所示的值来自一例代表性阴性患者(M014)和所有CD19阳性患者，范围从0.2(M017)到3.1(M022)个CD19分子/μm2。(B)CD19+和CD19-细胞的百分比，患者中CD19阳性细胞的范围从10％(M022)到80％(M019)。
图5(图5A和5B)：通过流式细胞仪检测多发性骨髓瘤细胞上的CD19
用抗CD138的抗体和抗CD38的抗体对来自多发性骨髓瘤患者的CD138纯化的骨髓抽出物进行染色，以检测骨髓瘤细胞(第一行)和CD19特异性抗体(第三行)或相应的同种型对照(第二行)，并通过流式细胞仪进行测量。对浆细胞(FSC/SSC)和CD138+/CD38+MM细胞设门。所述的百分比是指CD138+/CD38+子集中的CD19阳性细胞。
图6：dSTORM的灵敏度是流式细胞术的1000倍
用抗CD138的抗体、抗CD38的抗体和抗CD19的抗体或相应的同种型对照对CD38+/CD138+/CD19+ALL细胞系NALM-6进行染色。(A)使用流式细胞术以递减的CD19特异性抗体(下行)或相应的同种型对照(上行)稀释度检测NALM-6细胞上的CD19。(B)通过dSTORM检测CD19抗体(黑色方块)和同种型对照(红色圆形)。当CD19抗体浓度为2.5μg/ml(1:20稀释)时，CD19密度在3.4±0.2个CD19抗体/μm2(实心箭头)时达到饱和。检测的最低密度为0.006±0.002个CD19抗体/μm2，此时的浓度为5×10-5μg/ml(1：106稀释，空心箭头)。在同种型抗体浓度为5×10-5μg/ml时，不能检测到任何分子(0分子/μm2)，在图中以红色空心圆圈表示。相应的dSTORM图像如(C)2.5μg/ml和(D)5×10-4μg/ml CD19抗体所示。标尺为2μm。
图7：CD19分类示意图
密度分布分为CD19阳性亚群(CD19阳性细胞)和CD19阴性亚群(CD19阴性细胞；蓝色范围)。后一组由同种型对照抗体的密度分布模式(对照抗体与质膜和玻璃表面的非特异性结合)定义。在这种情况下，将密度分布拟合为一个二元对数正态函数，以估计中位值(μ)并计算从小值(μ-2σ)到大值(μ+2σ)的密度范围。根据每个细胞1,350个分子的截止点，将CD19阳性细胞群进一步分为CD19low(橙色范围)和CD19high亚群(红色范围)(更多信息请见文本)。
图8(图8A-8K)：通过dSTORM定量多发性骨髓瘤细胞上的CD19，并通过CD19-CAR T细胞根除
用抗CD138的抗体和抗CD38的抗体对来自多发性骨髓瘤患者的CD138纯化的骨髓抽出物进行染色，以检测骨髓瘤细胞和CD19特异性抗体或所述相应的同种型对照。所示为所有CD19阳性患者和一例代表性阴性患者的分布(D)。左图：未经处理的MM细胞每μm2的同种型和CD19抗体的对数。右图：对照T细胞和CAR T细胞处理的MM细胞上的CD19密度的对数。随后将密度分布分为CD19阳性亚群(CD19阳性细胞)和CD19阴性亚群(CD19阴性细胞)。后一组由同种型对照抗体的密度分布模式(对照抗体与质膜和玻璃表面的非特异性结合)定义。分布用一个一元或者二元对数正态函数拟合，该函数依赖于通过Anderson-Darling检验计算出的拟合精度(在p值<0.05时舍弃)。未对患者M008评估对照T细胞的作用(A)。M014(D)是完全CD19-患者的一个例子。PDF：概率密度函数。数据也总结在表1中。
图9：原发性多发性骨髓瘤细胞CD19高表达和CD19低表达
(A,B)重构的dSTORM图像的4×4μm切片显示固定的MM细胞表面附着的质膜中的单个CD19分子。(A)CD19低表达(～13个分子/细胞，M017)和(B)CD19高表达(～3000个分子/细胞，M022)。标尺为1μm。
图10：与原发性MM细胞共培养后，CD19CAR T细胞产生抗原特异性IFNγ
在GolgiStopTM存在的情况下，将未转导的对照CD8+T细胞(黑色)或CD19CAR T细胞(浅灰色)与原发性骨髓瘤细胞或K562_CD19共培养4h，效应子：靶标的比率为4：1。用Cytofix/Cytoperm处理T细胞，并对CD8和IFNγ染色。所示为原发性MM或K562_CD19细胞存在的情况下IFNγ+ T细胞的百分比减去仅在培养基中培养4小时的IFNγ+ T细胞的百分比。对淋巴细胞(FSC/SSC)，CD8+和IFNγ+细胞设门。除K562_CD19(n＝12)外，每一列表示一个单独的实验。ndt：未评估患者M020的细胞因子产生。
图11：CD19抗体对对照细胞系的特异性
通过常规的宽场显微术(上行：归一化荧光，下行：透射光)检测所用的抗CD19抗体的结合特异性。用抗CD19-AF647抗体(列标记：CD19)和其相应的同种型AF647抗体(列标记：同种型)对NALM-6(A,B)，MM.1S(C,D)，K562(E,F)和表达CD19的K562_CD19细胞(G,H)进行染色。标尺为7μm。
图12：使用流式细胞术检测骨髓瘤细胞上的CD20
流式细胞分析从骨髓抽出物中纯化的原发性骨髓瘤细胞上CD20表达。所示的点图设门策略：FSC/SSC浆细胞设门→7-AAD-→CD138+/CD38+→同种型对照或CD20+ 。
图13：通过dSTORM定量分析骨髓瘤细胞上的CD20，并通过CD20CART清除CD20阳性骨髓瘤细胞
(A)使用常规的宽场荧光和dSTORM检测原发性骨髓瘤细胞上的CD20。图像显示了一个CD20+(上行)或CD20-骨髓瘤细胞(下行)的底部质膜(附着在玻璃表面)。所示为透射光图像，CD38、CD138的荧光图像，用于鉴定通过常规荧光显微镜和dSTORM检测到的细胞和CD20分子。小面板显示放大的方框区域，展示了dSTORM显著增强的灵敏度。标尺为1μm和0.2μm。
(B)使用dSTORM对CD20进行定量。
用抗CD138的抗体和抗CD38的抗体对来自4例多发性骨髓瘤患者的CD138纯化的骨髓抽出物进行染色，以检测骨髓瘤细胞和CD20特异性抗体或所述相应的同种型对照。左图：每μm2未经处理的MM细胞同种型和CD20抗体的对数。右图：对照T细胞和CAR T细胞处理的MM细胞上的CD20密度对数。随后将密度分布分为CD20阳性亚群(CD20阳性细胞)和CD20阴性亚群(CD20阴性细胞)。后一组由同种型对照抗体的密度分布模式(对照抗体与质膜和玻璃表面的非特异性结合)定义。分布用一个一元或者二元对数正态函数拟合，该函数依赖于通过Anderson-Darling检验计算出的拟合精度(在p值<0.05时舍弃)。图中显示来自4例多发性骨髓瘤患者的合并数据。为更好地进行比较，所有图片均显示了同种型对照的拟合(虚线)。表2中还汇总了单个患者的数据，并在图14中示出。
(C)重建的dSTORM图像代表性4×4μm切片，显示固定的来自4例MM患者的MM细胞的表面附着质膜中的单个CD20分子。标尺为1μm。
图14：通过dSTORM定量分析骨髓瘤细胞上的CD20，并通过CD20CART清除CD20阳性骨髓瘤细胞
(A-D)用抗CD138的抗体和抗CD38的抗体对来自4例多发性骨髓瘤患者的CD138纯化的骨髓抽出物进行染色，以检测骨髓瘤细胞和所述的CD20特异性抗体或所述相应的同种型对照。左图：每μm2未经处理的MM细胞同种型和CD20抗体的对数。右图：对照T细胞和CAR T细胞处理的MM细胞上的CD20密度对数。随后将密度分布分为CD20阳性亚群(CD20阳性细胞)和CD20阴性亚群(CD20阴性细胞)。后一组由同种型对照抗体的密度分布模式(对照抗体与质膜和玻璃表面的非特异性结合)定义。分布用一个一元或者二元对数正态函数拟合，该函数依赖于通过Anderson-Darling检验计算出的拟合精度(在p值<0.05时舍弃)。未评估患者M026(B)的T细胞效应。数据也总结在表2中。
具体实施方式
CD19正作为MM CAR T细胞免疫治疗的靶点。Garfall等人最近的一项研究报道了一例在骨髓清除性化疗和自体HSCT后接受了CD19CART完全缓解的骨髓瘤患者，尽管通过FC评估该患者只有0.05％的骨髓瘤细胞呈CD19阳性2。但Garfall等人并未证明这个观察的任何机制。本发明人着手验证CD19在骨髓瘤细胞中的表达比例是否高于Garfall等人的研究中通过FC鉴定的比例，包括是否存在以非常低的水平表达CD19但足以被CD19CART2,13,14识别的骨髓瘤细胞。检验该假说的一个障碍是FC相对较高的检测极限，FC是临床常规检测方法，每个细胞的检测极限约为数千个分子的数量级7,15,16。另外，迄今为止还不知道触发并随后激活CART细胞所需的肿瘤细胞精确抗原阈值。数项研究试图用模型细胞系外推CAR的检测下限，从而估计出每个细胞数百个靶分子的范围17,18。然而，由于FC缺乏检测靶细胞上如此低的抗原水平的能力，这些估计值还没有得到严密的验证。
在此，发明人通过dSTORM，运用单分子灵敏的超分辨显微术，结果表明，在14例骨髓瘤患者的10例中，CD19在占整个骨髓瘤细胞群高达80％的大部分骨髓瘤细胞中表达。但是，在大多数骨髓瘤细胞上，CD19的表达水平低于FC的检测极限，并且只能通过dSTORM进行观察。发明人还表明，极低水平表达的CD19足以被CD19CART识别和清除，并确定CD19CART的敏感性阈值远低于每个骨髓瘤细胞100个CD19分子。
发明人的数据表明，FC显著低估了表达CD19的骨髓瘤细胞的百分比，并错误地将10例患者中的8例患者的骨髓瘤细胞分类为CD19阴性，尽管根据dSTORM成像，CD19在一部分骨髓瘤细胞中表达水平较低。发明人的数据表明，FC无法检测到表达少于1,350个CD19分子的骨髓瘤细胞，这与先前有关该方法在临床常规中的灵敏度的报道一致15-18。发明人表明，在检测到一定比例的表达CD19的骨髓瘤细胞(高密度或低密度)的10例骨髓瘤患者中，每例患者在用CD19CART进行体外短期治疗后都清除了相应骨髓瘤细胞。这些数据表明，CD19CART可能在体内对表达CD19的骨髓瘤细胞有效。发明人研究中使用的CD19-CAR已在ALL和NHL3,4的临床试验中得到验证。但是，发明人的数据还显示，在10例患者中，每例患者中都有一部分CD19阴性骨髓瘤细胞没有被CD19CART清除。这些数据表明，CD19CART治疗后的MM的完全缓解可能只在与另一种有效的抗骨髓瘤治疗(例如，Garfall等人的研究中所述的美法仑(每平方米140mg))联合使用才能实现。实际上，最近对ALL中的CD19CART和骨髓瘤中的B细胞成熟抗原(BCMA)-CART细胞进行的研究表明，抗原阴性白血病细胞或骨髓瘤细胞的存在会导致这些细胞的生长和快速复发。
CAR是合成受体，尽管CD19CART已在ALL和NHL中获得临床批准，但其作用机理在分子水平上仍然是未知。为了预测功效和评估安全性，确定CART细胞的抗原敏感性是特别令人感兴趣的。在此，发明人首次提供直接证据证明CD19CART能够识别和清除在其表面表达少于100个CD19分子的骨髓瘤细胞。这些数据确定了CART细胞的敏感性阈值，其超过了先前研究中使用模型肿瘤细胞系进行的预测17,18，而先前的研究受到FC无法以单分子分辨率计数抗原的限制。发明人的数据支持了先前的观点，即CART细胞在检测肿瘤细胞表面分子方面比常规抗体和双特异性抗体更敏感17。此外，发明人表明，他们先前的无法检测到的表达足以触发CART功能的发现不仅限于CD19，而且还适用于包括CD20在内的其他抗原。进一步地，本研究提出了挑战，即CART细胞在检测肿瘤细胞上的抗原方面比在临床实践中已建立的分析工具更敏感。因此，需要在临床常规中采用比FC更灵敏的检测方法(和免疫组织化学)，以指导患者和CART细胞的抗原选择，并检测健康组织中的低水平表达以防止毒性。发明人所在机构正在积极开展将dSTORM分析应用于临床病理的工作，但需要进一步简化方法以广泛应用。
总之，发明人的数据支持后续CD19作为MM中CART细胞的靶点的评估。发明人表明，单分子灵敏的荧光成像方法，如dSTORM，可以根据CD19表达辅助对骨髓瘤患者进行分期，从而确定最有机会从这种新颖的、高度创新的治疗中受益的患者。这些观点不仅与MM的CD19CART有关，而且与靶向其他血液恶性肿瘤和实体瘤中的其他抗原的CART方法有关，以开发其全部治疗潜力并确保患者安全。
术语定义和实施例
除非下文另外定义，否则应根据本领域技术人员已知的一般含义来理解本发明中使用的术语。
本发明引用的每个出版物，专利申请，专利和其他参考文献均以与本发明不矛盾的程度通过引用全文并入本发明。所述参考文献由“参考文献”部分中提供的参考编号和相应的参考详细信息指示。
如本发明所述的靶向剂是与普通药剂相反的能够特异性结合其靶点的试剂。本发明优选的靶向剂能够结合细胞表面上的CD19，通常结合CD19的胞外结构域。本发明优选的另一种靶向剂能够结合细胞表面上的CD20，通常结合CD20的胞外结构域。
在本发明的一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD19和/或CD20的癌细胞特异性结合。在本发明的一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD19的癌细胞特异性结合。在本发明的一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD20的癌细胞特异性结合。在本发明的另一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD19和/或CD20的造血细胞特异性结合。在本发明的另一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD19的造血细胞特异性结合。在本发明的另一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD20的造血细胞特异性结合。在本发明的另一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD19和/或CD20的造血癌细胞特异性结合。在本发明的另一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD19的造血癌细胞特异性结合。在本发明的另一个实施方案中，靶向剂能够与表达CD20的造血癌细胞特异性结合。在本发明的一个优选实施方案中，靶向剂能够结合表达CD19和/或CD20的原发性骨髓瘤细胞。在本发明的一个优选实施方案中，靶向剂能够结合表达CD19的原发性骨髓瘤细胞。在本发明的一个优选实施方案中，靶向剂能够结合表达CD20的原发性骨髓瘤细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，靶向剂能够结合表达低水平的CD19和/或CD20的原发性骨髓瘤细胞，优选地，CD19和/或CD20的表达水平不能使其通过流式细胞术检测到，更优选地，CD19和/或CD20的表达水平不能使其通过流式细胞术检测到，但能通过超分辨显微镜，特别是单分子定位显微镜(例如dSTORM)检测到。在本发明的另一个优选的实施方案中，靶向剂能够结合表达低水平的CD20的原发性骨髓瘤细胞，优选地，CD20的表达水平不能使其通过流式细胞术检测到，更优选地，CD20的表达水平不能使其通过流式细胞术检测到，但能通过超分辨显微术，特别是单分子定位显微术(例如dSTORM)检测到。在本发明的一个特别优选的实施方案中，靶向剂能够结合表达低水平的CD19的原发性骨髓瘤细胞，优选地，CD19的表达水平不能使其通过流式细胞术检测到，更优选地，CD19的表达水平不能使其通过流式细胞术检测到，但能通过超分辨显微术，特别是单分子定位显微术(例如dSTORM)检测到。
优选地，本发明使用的免疫细胞和靶向剂能够导致表达靶抗原的癌细胞的癌细胞数量减少。优选地，这可以由坏死或凋亡引起的细胞毒性导致，或者由抑制或停止增殖，如抑制生长导致。癌细胞数量的减少可以通过本领域已知的各种常用方法和分析来测定。
在一个实施方案中，嵌合抗原受体能够结合CD19和/或CD20。在一个实施方案中，嵌合抗原受体能够结合CD19。在一个实施方案中，嵌合抗原受体能够结合CD20。在一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体能够结合CD19和/或CD20的胞外结构域。在一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体能够结合CD19的胞外结构域。在一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体能够结合CD20的胞外结构域。在一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体在免疫细胞中表达，优选地，为T细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，嵌合抗原受体在T细胞中表达，并使所述T细胞以高特异性与表达CD20和/或CD19的骨髓瘤细胞特异性结合，以对所述急性髓性白血病细胞施加生长抑制作用，优选地，为细胞毒性效应。在本发明的一个优选实施方案中，嵌合抗原受体在T细胞中表达，并使所述T细胞以高特异性与表达CD19的骨髓瘤细胞特异性结合，以对所述急性髓性白血病细胞施加生长抑制作用，优选地，为细胞毒性效应。在本发明的一个优选实施方案中，嵌合抗原受体在T细胞中表达，并使所述T细胞以高特异性与表达CD20的骨髓瘤细胞特异性结合，以对所述急性髓性白血病细胞施加生长抑制作用，优选地，为细胞毒性效应。
“免疫疗法”在本发明中是指将免疫细胞转移到患者体内以靶向治疗癌症。这些细胞可能来自患者或另一个体。在免疫疗法中，通常从个体，优选地，从患者中提取免疫细胞，优选地，为T细胞，对其进行遗传修饰并在体外培养，之后施用于患者。免疫疗法的优势在于，它能够靶向抑制肿瘤细胞的生长，优选地，具有细胞毒性，而没有常规治疗中对非肿瘤细胞的非靶向毒性。
在本发明的一个优选实施方案中，从患有多发性骨髓瘤的患者中分离T细胞，用编码能够结合CD19的嵌合抗原受体的基因转移载体转导T细胞，并施用该患者以治疗多发性骨髓瘤，优选地，所述的骨髓瘤细胞表达CD19，更优选地，所述的骨髓瘤细胞低水平表达CD19，更优选地，所述的低水平表达CD19的骨髓瘤细胞无法通过流式细胞仪检测到，但可以通过超分辨显微术，特别是单分子定位显微术(例如dSTORM)检测到。在一个优选的实施方案中，所述的T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
在本发明的另一个优选的实施方案中，从患有多发性骨髓瘤的患者中分离T细胞，用编码能够结合CD20的嵌合抗原受体的基因转移载体转导T细胞，并施用该患者以治疗多发性骨髓瘤，优选地，所述的骨髓瘤细胞表达CD20，更优选地，所述的骨髓瘤细胞低水平表达CD20，更优选地，所述的低水平表达CD20的骨髓瘤细胞无法通过流式细胞仪检测到，但可以通过超分辨显微术，特别是单分子定位显微术(例如dSTORM)检测到。在一个优选的实施方案中，所述的T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
在根据本发明的另一个优选实施方案中，从患有多发性骨髓瘤的患者中分离T细胞，用编码能够结合CD19和/或CD20的嵌合抗原受体的基因转移载体转导T细胞，并施用该患者以治疗多发性骨髓瘤，优选地，所述的骨髓瘤细胞表达CD19和/或CD20，更优选地，所述的骨髓瘤细胞低水平表达CD19和/或CD20，更优选地，所述的低水平表达CD19和/或CD20的骨髓瘤细胞无法通过流式细胞仪检测到，但可以通过超分辨显微术，特别是单分子定位显微术(例如dSTORM)检测到。在一个优选的实施方案中，所述的T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
本发明中诸如“癌症的治疗”或“治疗癌症”的术语是指治疗性治疗。例如，可以通过评估治疗是否抑制接受治疗的一个或多个患者的癌症生长来评估治疗方法是否有效。优选地，如通过本领域已知的合适的统计学检验评估，抑制是统计学上显著的。癌症生长的抑制可以通过比较接受本发明治疗的一组患者与未治疗的对照组的患者的癌症生长进行评估，或者通过比较接受本领域标准癌症治疗方法和本发明治疗的一组患者，与仅接受本领域标准癌症治疗方法的对照组的患者的癌症生长进行评估。此类评估癌症生长抑制作用的研究是根据临床研究公认的标准设计的，例如具有足够统计能力的双盲随机研究。术语“治疗癌症”包括对癌症生长的抑制，其中癌症的生长被部分抑制(如，与对照组患者相比，癌症生长延缓)，被完全抑制(如，患者体内癌症停止生长)，以及被逆转(如，癌症缩小)。可以基于已知的癌症进展临床指标评估治疗方法是否有效。
本发明中癌症的治疗并不排除在患者中也出现附加的或次要的治疗益处。然而，应理解，请求保护的主要治疗是治疗癌症本身，并且任何次要或附加的作用仅反映了抑制癌症生长可选的、附加的优点。
本发明中癌症的治疗可以是一线治疗，二线治疗，三线治疗或四线治疗。该治疗也可以是超越四线治疗的治疗。这些术语的含义在本领域中是已知的，并且符合美国国家癌症研究所常用的术语。
术语“能够结合”在本发明中是指与要结合的分子(例如CD19和/或CD20)形成复合物的能力。结合通常是非共价的，通过诸如离子键，氢键和范德华力的分子间力发生，并且通常是可逆的。测定结合能力的各种方法和分析方法是本领域已知的。结合通常是具有高亲和力的结合，亲和力通过KD值表示，优选地，其值小于1μM，更优选地，其值小于100nM，特别优选地，其值小于10nM，特别优选地，其值小于1nM，特别优选地，其值小于100pM，特别优选地，其值小于10pM，特别优选地，其值小于1pM。
本发明中所使用的诸如“含有”或“包含”的术语的每次使用都可以可选地被“组成”或“由...组成”代替。
本领域已知的药学上可接受的载体，包括任何合适的稀释剂，可以在本发明中使用。本发明中，术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典，欧洲药典或其他普遍认可的药典中列出，用于哺乳动物，尤其是人类。药学上可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌渗水性缓冲液及其组合。应理解的是，制剂形式会进行适当调整，以适用给药方式。
本发明使用的组合物和制剂根据制备药物组合物和制剂的已知标准制备。例如，组合物和制剂的制备方式应使它们可以适当地贮存和施用，如通过使用药学上可接受的组分，例如载体、赋形剂或稳定剂。当向患者施用药物组合物或制剂时，上述药学上可接受的成分在使用量上是无毒的。添加到药物组合物或制剂中的药学上可接受的组分取决于组合物或制剂中存在的抑制剂和靶向剂的化学性质(取决于靶向剂是例如抗体或其片段，还是表达嵌合抗原受体的细胞)，药物组合物的特定预期用途和给药途径。
本发明中“每个细胞的细胞表面抗原分子的数目”可以符合本领域已知的术语的含义的任何数目。在非限制性的优选实施方案中，“每个细胞的细胞表面抗原分子的数目”是指表达所述细胞表面抗原的细胞或部分细胞的每个细胞的平均分子数目。在一个更优选的非限制性实施方案中，“每个细胞的细胞表面抗原分子的数目”是指每个细胞相对于表达所述细胞表面抗原的细胞或部分细胞的分子数目的平均值。在另一个非限制性实施方案中，“每个细胞的细胞表面抗原分子的数目”是指每个细胞相对于表达所述细胞表面抗原的细胞或部分细胞的分子数目的中位数。
本发明中细胞表面抗原的分子数目可以通过合适的方法确定。优选地，这些数目可以通过超分辨显微术确定，更优选地，可以通过单分子定位显微术确定，例如dSTORM、STORM、PALM或FPALM，最优选地，通过dSTORM确定。
应当理解，对本发明中使用的免疫染色的任何方法，包括上述可以使用免疫染色的超分辨显微术，例如dSTORM，其中所用的任何抗体均以合适的浓度使用。在一个优选的实施方案中，本发明中使用的抗体在饱和条件下使用。在另一个优选的实施方案中，本发明的方法在经过临床验证的条件下进行。
在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物或制剂适合施用于人，优选地，所述的制剂是无菌的和/或无热原的。
实施例
通过以下非限制性实施例举例说明本发明的其他方面和细节。
在多发性骨髓瘤(浆细胞的克隆性增殖)中研究了以嵌合抗原受体(CAR)工程化的靶向CD19的T细胞(CD19CART)免疫疗法。Garfall等人最近的一项研究中报告了一例完全缓解的骨髓瘤患者，其在进行清髓性化学疗法和自体干细胞移植后接受了CD19CART治疗，即使通过常规临床检测方法流式细胞术(FC)检测仅有0.05％的骨髓瘤细胞表达CD19。该研究引发了CD19CART在治疗骨髓瘤中的作用的争议。
发明人通过单分子灵敏的直接随机光学重建显微镜术(dSTORM)生成n＝14例患者的骨髓瘤细胞上CD19的表达谱，并将该表达谱与FC获得的表达谱进行了比较。同时，用CD19CART体外处理骨髓瘤细胞。
发明人通过dSTORM在14例患者中的10例患者的部分骨髓瘤细胞(范围：10.3％-80％)中检测到CD19。大多数骨髓瘤细胞以非常低的水平表达CD19，低于FC的检测极限。采用FC仅在这10例患者中的2例，以较小的细胞比例(范围：4.9％-30.4％)检测到CD19。4例患者的dSTORM检测结果为CD19阴性。采用CD19CART进行治疗可清除骨髓瘤细胞，即使FC未检测到CD19。在部分患者中，CD19在大部分骨髓瘤细胞中表达，但仍不能被FC检测到。这些患者为CD19CART细胞疗法的候选者。发明人证明，对于每个靶细胞，CD19CART识别的阈值远低于100个CD19分子，超过了目前对该新型疗法的敏感度的预期。
具体地，实施例按如下方式进行：
人体受试者
获取多发性骨髓瘤患者的骨髓抽出物，并从健康供体的外周血中分离出用于CAR修饰的T细胞。所有参与者均提供了书面知情同意书，本研究方案经维尔茨堡大学机构审查委员会批准。
流式细胞术分析
使用抗CD138磁珠(Miltenyi，Bergisch-Gladbach，德国)对骨髓中分离出的原发性骨髓瘤细胞进行阳性筛选，并用抗CD19AF647(克隆株：HIB19)、CD20AF647(克隆株：2H7)，或AF647同种型对照和抗CD38-AF488，抗CD138-PE抗体和7-AAD染色，以从分析中排除死细胞。
CAR T细胞处理
在进行dSTORM分析之前，将骨髓瘤细胞(2.5×104)与CD19CART、CD20CART(1×105)或未转导的对照T细胞(1×105)在96孔圆底平板中共培养4小时。CD19-CAR如前所述21。
dSTORM分析
用抗CD19-AF647、抗CD20-AF647、抗CD38-AF488和抗CD138-AF555抗体或AF647同种型对照抗体(BioLegend，伦敦，英国)对骨髓瘤细胞进行染色。在OlympusIX-71倒置显微镜上采集图像，使用单分子定位软件RapidSTORM3.322重建dSTORM图像，并使用Mathematica(WolframResearch，Inc.，Mathematica，版本号11.2，尚佩恩，伊利诺伊州)编写的自定义脚本进行CD19定量分析。
原发性骨髓瘤细胞
在磷酸盐缓冲液(PBS)中按1:10稀释骨髓抽出物，并在50mL LeukoSep管(GreinerBio One，Frckenhausen，德国)中使用Ficoll-hypaque密度离心分离白细胞。使用CD138-MicroBeads(Miltenyi，Bergisch-Gladbach，德国)进行阳性选择，分离出CD138+骨髓瘤细胞。
细胞系和细胞培养基
NALM-6(DSMZ，海德堡，德国)、MM.1S和K562(均为ATCC，Manassas，弗吉尼亚州，美国)细胞在RPMI-1640培养基中维持培养，该培养基含有8％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺，以及100U/mL青霉素/链霉素(所有成分均来自Gibco，Thermo Scientific，施韦特，德国)。通过人CD19的慢病毒转导产生K562_CD19细胞。原发性骨髓瘤细胞和T细胞在RPMI-1640培养基中维持培养，该培养基包含8％的人血清、2mM的Glutamax、0.1％的β-巯基乙醇和100U/mL的青霉素/链霉素(T细胞培养基；其他所有成分均来自Gibco)。向T细胞培养物补充50U/mL IL-2(Proleukin，诺华，巴塞尔，瑞士)。
CD19CART和CD20CART的产生
先前的研究21中已经描述了载体的设计和实验步骤。简而言之，在50mL LeukoSep管(Greiner Bio One)中使用Ficoll-hypaque密度离心纯化健康供体的外周血单核细胞(PBMCs)，并使用负磁分选(CD8+ T细胞分离试剂盒，人源，Miltenyi)分离CD8+ T细胞。用抗CD3/CD28磁珠(
Figure BDA0002486366040000261
人T-活化剂CD3/CD28，ThermoScientific)刺激T细胞，并用epHIV7慢病毒转导，该慢病毒编码包含以下内容的CAR构建体：分别来源于FMC63和Leu16的抗CD19或抗CD20的单链可变片段；IgG4-Fc铰链间隔子；CD28跨膜区；4-1BB_CD3ζ信号组件；以及截短的表皮生长因子受体(EGFR)传导标记23。使用生物素化的抗EGFR单克隆抗体(mAb)西妥昔单抗(Merck，达姆施塔特，德国)和抗生物素微珠(Miltenyi)富集含EGFRt+的T细胞。纯化的CD19CART、CD20CART和未转导的对照T细胞用如前所述24照射的CD19+/CD20+饲养细胞进行扩增，并等分保存在液氮中，直至功能测试。
产生嵌合抗原受体的方法、嵌合抗原受体的表达载体的构建方法和转导所述载体的方法是本领域已知的。非限制性示例性方法包括前述方法25,26，出于所有目的将其全部内容通过引用并入本文。
在本发明的一个优选的实施例中，嵌合抗原受体CD19 CAR具有由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在更优选的实施例中，所述的CD19 CAR可通过具有SEQID NO：2所示核苷酸序列的慢病毒载体表达。
在本发明的一个优选的实施例中，嵌合抗原受体CD20 CAR具有由SEQ ID NO：3所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。在更优选的实施例中，所述的CD20 CAR可通过具有SEQID NO：4所示核苷酸序列的慢病毒载体表达。
SEQ ID NO：1(编码CD19 CAR的核苷酸序列)
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SEQ ID NO：2(编码CD19 CAR的表达载体的核苷酸序列)
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SEQ ID NO：3(编码CD20 CAR的核苷酸序列)
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SEQ ID NO：4(编码CD20 CAR的表达载体的核苷酸序列)
gttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattaccctatagtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtgatacccatgttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggatctacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggggatcaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgaagcttcgaggggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctacctgaggccgccatccacgccggttgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctaggtaagtttaaagctcaggtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagcctacctagactcagccggctctccacgctttgcctgaccctgcttgctcaactctacgtctttgtttcgttttctgttctgcgccgttacagatccaagctgtgaccggcgcctacggctagcgccgccaccatgttgctgctggttacatctctgctgctgtgcgagctgccccatcctgcctttctgctgatccccgacatcgtgctgacacagagccctgccatcctgagtgcttccccaggcgagaaagtgaccatgacctgtagagccagcagcagcgtgaactacatggactggtatcagaagaagcccggcagcagccccaagccttggatctacgccacaagcaatctggccagcggagtgcctgccagattttctggctctggcagcggcacaagctacagcctgacaatcagcagagtggaagccgaggatgccgccacctactactgtcagcagtggtccttcaatcctcctaccttcggcggaggcaccaagctggaaatcaagggctctacaagcggcggaggatctggcggtggaagtggcggaggcggatcttctgaagttcagctgcaacagtctggcgccgagctggttaagcctggcgcctctgtgaagatgagctgcaaggccagcggctacaccttcaccagctacaacatgcactgggtcaagcagacccctggacagggactcgagtggatcggagccatctatcccggcaatggcgacacctcctacaaccagaagttcaagggcaaagccacactgaccgccgacaagagcagcagcacagcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgattactactgcgccagaagcaactactacggcagctcctactggttcttcgacgtgtggggagccggcaccacagtgacagtgtctagcgagtctaagtacggaccgccttgtcctccttgtccagctcctcctgtggccggacctagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttccagagcacctaccgggtggtgtccgtgctgacagtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctaccccagcgacattgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgagcctgggcaagatgttctgggtgctggtggtcgtgggcggagtgctggcctgttacagcctgctcgtgaccgtggccttcatcatcttttgggtcaagcggggcagaaagaagctgctgtatatcttcaagcagcccttcatgcggcccgtgcagaccacacaggaagaggacggctgctcctgccggttccccgaggaagaagaaggcggctgcgagctgagagtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctatcagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctagaagaaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcggagaagaggcaagggccacgatggcctgtaccagggactgagcaccgccaccaaggatacctatgacgcactgcacatgcaggccctgccccccagactcgagggcggaggcgaaggcagaggatctctgctgacatgcggcgacgtggaagagaaccctggccccagaatgctgctgctcgtgacaagcctgctgctgtgcgagctgccccaccctgcctttctgctgatcccccggaaagtgtgcaacggcatcggcatcggagagttcaaggacagcctgtccatcaacgccaccaacatcaagcacttcaagaattgcaccagcatcagcggcgacctgcacatcctgccagtggcctttagaggcgacagcttcacccacacccccccactggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcaaggccacaggccaggtctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctcttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtgagccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctcaggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagt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编码CD19 CAR的如SEQ ID NO：1所示的上述核苷酸序列和如SEQ ID NO：2所示的上述表达载体用于本发明所有非限制性实验性实施例中。
编码CD20 CAR的如SEQ ID NO：3所示的上述核苷酸序列和如SEQ ID NO：4所示的上述表达载体用于本发明所有非限制性实验性实施例中。
抗体和流式细胞术
抗CD19抗体(克隆株HIB19，AF647)、CD20抗体(克隆株2H7，AF647)、CD38抗体(克隆株HIT2，AF488)和CD138抗体(克隆株MI15，PE和非偶联)来自BioLegend(英国伦敦)；使用的IFN-γ(克隆株B27，FITC)来自BD Biosciences(德国海德堡)，CD8(克隆株BW135/80，VioBlue)来自Miltenyi。将抗CD138抗体与AF555(ThermoFisher Scientific)偶联，用于dSTORM显微镜操作。使用FACS Canto II(BD)机器进行流式分析，并使用FlowJo软件(TreeStar，阿什兰，俄勒冈州)进行分析。
实验步骤
将CD19CART、CD20 CART和未转导的对照T细胞解冻、洗涤，并在含有低剂量IL-2(10IU/mL)的T细胞培养基中培养过夜。然后，将1×105T细胞与2.5×104原发性骨髓瘤细胞或对照肿瘤细胞系不含有GolgiStopTM(BD)(用于显微镜测量)或含有GolgiStopTM(BD)条件下共培养4小时。使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD)使经GolgiStopTM处理的细胞透性化，并对细胞内IFN-γ染色。对于CD19表达的流式细胞分析按照生产商的说明书，洗涤未接触的原发性骨髓瘤细胞，并用抗CD38-AF488、抗CD138-PE和抗CD19-AF647或AF647同种型对照进行染色，之后再进行洗涤和分析。对于显微镜测量，在LabTek室玻片(NuncTMLab-TekTMII室玻片系统，ThermoFisher Scientific)上涂覆聚D-赖氨酸和原发性骨髓瘤细胞(或细胞系/共培养物)，并在37℃粘附90分钟。然后，用PBS洗涤细胞，并用抗CD38-AF488、抗CD138-AF555和抗CD19-AF647、抗CD20-AF6647或AF647同种型对照染色。洗涤细胞并用4％多聚甲醛固定以用于dSTORM分析。
超分辨成像
为了实现Alexa Fluor 647的可逆光转换，使用了基于PBS的成像缓冲液(pH7.4)，该缓冲液包含80mMβ-巯基乙胺(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国)和一种除氧体系，该体系含3％(w/v)葡萄糖、4U/mL葡萄糖氧化酶和80U/mL过氧化氢酶。dSTORM检测方法如前所述11,12。使用配备油浸物镜(APON 60XOTIRF，Olympus)和物镜台(IX2-NPS，Olympus)的Olympus IX-71倒置显微镜(奥林匹斯，德国汉堡)。AF647、AF555和AF488由合适的激光系统激发(Genesis MX 639和MX 561，Coherent，德国哥廷根；iBeam smart 488nm，Toptica，德国格拉菲芬)。激发光通过合适的带通滤光片进行光谱净化，然后聚焦到物镜的后焦平面上。为了在不同的照明模式(epi和TIRF照明)之间切换，将透镜系统和反射镜设置于线性平移台上。多色镜(HC 410/504/582/669，Semrock，Rochester，美国纽约)用于将激发(光)和发射(荧光)光线分开。荧光发射通过相同的物镜聚集，并通过二向色分束器和若干检测滤光片(HC 440/521/607/700，Semrock；HC 679/41，Semrock，用于Alexa 647；HQ 610/75，Chroma(Bellows Falls，美国犹他州)，用于Alexa 555；ET525/50，Chroma，用于Alexa 488)透射，并投射到两台电子倍增CCD相机(均为iXon Ultra 897，英国贝尔法斯特安道尔；分束器635LP，Semrock)。通过在检测路径中放置其他透镜，生成128nm最终像素大小。激发强度约为3.3kW/cm2。通常，以～67Hz(15ms曝光时间)的帧频记录15,000帧。
图像重建和数据分析
从记录的图像堆栈中，使用定位软件rapidSTORM 3.322生成具有所有定位的表以及重建的dSTORM图像。仅对CD38/CD138双阳性细胞(即骨髓瘤细胞)的CD19表达进行进一步分析。使用定制的Mathematica(Wolfram Research，Inc.，Mathematica，版本号11.2，Champaign，美国伊利诺伊州)脚本对CD19和CD20进行定量。分析流程包括以下步骤：丢弃每帧包含少于800个光子的荧光斑。使用alpha-shape算法(α值为30)将来自一种抗体的重复定位进行分组。已证实检测到的抗体的总体密度足够小，可以产生分离良好的alpha形状。抗体密度(CD19、CD20或同种型)由分组的定位数除以每个细胞底部质膜的面积(由目标区域(ROI)选择器确定)得出。每例患者和病例各分析10-80个细胞，以获得CD19、CD20和同种型抗体密度分布。为了区分CD19和CD20抗体的非特异性(阴性亚群)结合与特异性(阳性亚群)结合，将检测到的抗体密度分布拟合为一元或二元对数正态分布。结合特异性结合抗体的平均密度(定位μm-2)对非特异性结合抗体和特异性结合抗体的相对比例进行估算。所有分布估计值的显著性均使用Anderson-Darling检验进行了统计学检验(p值<0.05时舍弃)。
实施例1：患者特点和FC检测的CD19表达
为了通过FC和dSTORM生成原发性骨髓瘤细胞上的CD19表达谱，从连续14例经组织病理学可诊断疾病的MM患者中获得骨髓。在该患者系列中，4例为新诊骨髓瘤患者，10例为已接受过治疗的患者，后者处于部分缓解状态(n＝2)或疾病进展状态(n＝8)(表S1)。首先，发明人采用FC检测骨髓瘤细胞上的CD19(图5)。在14例患者中的2例患者(M012和M016)中，发明人发现了一个明显可区分的CD19阳性骨髓瘤细胞群，分别占细胞数的30.4％和4.9％(图1A，B)。在其余的12例患者中，骨髓瘤细胞为CD19阴性或仅包含少部分骨髓瘤细胞(<3％)，其中CD19染色后采集的信号无法与背景区分开(图1C，D；图5，表1)。
实施例2：dSTORM检测骨髓瘤细胞上的CD19比FC更灵敏
将dSTORM应用于来自两例FC呈CD19阳性患者的相同骨髓瘤细胞样本。在两个患者中，发明人通过dSTORM检测到表达CD19的骨髓瘤细胞百分比均高于FC：患者M012中为68％(FC中为30.4％)；M016患者中为32％(FC中为4.9％)(表1)。这种差异表明，dSTORM在检测CD19方面比FC更灵敏。为了验证这一点，在广泛表达CD19的人白血病细胞系NALM-6上进行了抗体滴定实验(图6A)。结果表明，dSTORM方法的检测限为0.006±0.002CD19个分子/μm2，大约相当于该模型细胞系每个细胞3.1±1.3个CD19分子。该值比FC确定的检测限低至少3个对数倍(图6；表S2)。综上所述，这些数据表明，dSTORM在检测CD19方面比FC更灵敏，并且能够以单分子分辨率可视化肿瘤细胞上的CD19分子。
实施例3：FC未检测到dSTORM鉴定的CD19low骨髓瘤细胞
基于dSTORM与FC相比更高的检测灵敏度，发明人推测，除了FC检测到的CD19high骨髓瘤细胞之外，还有尚未被FC检测到的CD19low骨髓瘤细胞群。为了验证这一点，采用基于流式细胞术的细胞分选方法分离CD19阳性和CD19阴性的骨髓瘤细胞，但是发现经此过程存活下来的细胞数量不足以进行后续的dSTORM分析。因此，基于患者M012的骨髓瘤细胞获得的dSTORM数据生成CD19密度图。图7提供了示意性的密度图和分类。该图清晰显示了预期的CD19阳性和CD19阴性的骨髓瘤细胞分离(图3A)。来自患者M012的所有CD19阳性骨髓瘤细胞中CD19的平均密度为每细胞1,200±580分子(表1)。发明人认为，FC仅检测到最高表达CD19的骨髓瘤细胞，并对密度图的前30.4％中的CD19分子进行定量。已发现，这些CD19high骨髓瘤细胞中CD19分子的平均数量为每个细胞2,240±260分子，而其余的CD19low骨髓瘤细胞中的CD19分子平均为每个细胞750±60分子。(图3A，表1)。在密度图的第30.4个百分点处，将CD19high和CD19low的骨髓瘤细胞分开的截止点为每个细胞1,350个CD19分子。发明人获得了患者M016的类似数据(图3B)。总的来说，这些数据表明，dSTORM使用的单分子灵敏荧光成像可检测到FC检测不到的单个细胞CD19分子表达少于1,350个的CD19low骨髓瘤细胞。
实施例4：dSTORM在被FC分类为CD19阴性的患者中检测到CD19low骨髓瘤细胞
接下来，发明人通过dSTORM检查了来自被FC分类为CD19阴性或不确定的12例患者的骨髓瘤细胞上的CD19表达情况。dSTORM在这12例患者中检测到8例CD19阳性骨髓瘤细胞(图4A，图8，图9)，并确定它们占整个骨髓瘤细胞总数的10.3％至80.3％(平均值：55±9％，图4B，表1)。在这8例的5例患者中，骨髓瘤细胞仅为CD19low。在这8例的3例患者中，还检测到一小部分CD19high骨髓瘤细胞(平均值：29±10％)(表1，图8)。在其余的4例患者中，dSTORM仅检测到CD19阴性骨髓瘤细胞，其水平与在原发性骨髓瘤细胞中获得的背景信号(平均值：17.1±2.4分子/每细胞)无显著差异。综上所述，这些数据表明，患者的大部分低表达CD19的骨髓瘤细胞被FC错误分类为CD19阴性。
实施例5：通过CD19CART清除CD19low(和CD19high)骨髓瘤细胞
为了研究在CD19high和CD19low的骨髓瘤细胞上CD19的表达量是否足以识别CART，发明人在体外对其用CD19CART处理了4小时，然后重复dSTORM分析。在同时含有CD19high和CD19low骨髓瘤细胞的所有患者中，dSTORM检测到的表达CD19的骨髓瘤细胞被完全清除，仅有CD19阴性的骨髓瘤细胞在处理后存活(图3，图8)。源自同一供体且未配备CD19-CAR的对照T细胞与CD19high和CD19low骨髓瘤细胞无任何相关反应(图3，图8)。CD19low骨髓瘤细胞的完全清除表明，CD19CART需要每个靶细胞少于1,350个CD19分子的抗原密度才能被触发。为了排除由于旁观者杀伤(如由于CD19high骨髓瘤细胞触发的CD19CART释放的溶细胞性颗粒)而导致CD19low骨髓瘤细胞清除的可能性，对只有CD19low的骨髓瘤细胞重复进行CD19CART治疗分析。发明人发现，在所有患者中，CD19CART完全清除CD19low骨髓瘤细胞，包括来自患者M017和M013的CD19low骨髓瘤细胞，每个细胞分别表达平均64±8和93±10个CD19分子(图8，图9)。总的来说，这些数据表明CD19CART能够迅速清除CD19极低表达水平的骨髓瘤细胞。此外，数据表明触发CD19CART所需的抗原阈值远低于每个靶细胞100个CD19分子。
实施例6：CD19CART分泌的IFNγ不能预示CD19low骨髓瘤细胞的存在
发明人试图确定与骨髓瘤细胞共培养后CD19CART的IFNγ合成的胞内染色是否可以用作检测CD19low骨髓瘤细胞的存在的简单替代方法，而不是使用单分子灵敏荧光成像。然而，IFNγ检测仅对通过FC和dSTORM已显示含有CD19阳性骨髓瘤细胞的十例患者中的两例有效(图10)。这些数据表明，在CD19CART中诱导细胞因子产生所需的抗原阈值较触发溶细胞活性所需的阈值更高，这与先前关于触发独特的T细胞效应子功能的数据一致17。总之，这些数据表明常规检测和分析方法灵敏度不足以揭示骨髓瘤细胞上CD19极低水平的表达。
实施例7：dSTORM以单分子灵敏度检测原发性骨髓瘤细胞上的CD19
为了进行CD19的dSTORM成像，发明人使用了B细胞急性淋巴细胞性白血病细胞系NALM-6，其在流式细胞术中对CD19均呈阳性(表型：CD19+CD38+CD138+)。K562作为阴性对照(CD19-，图11)。发明人首先寻求建立dSTORM成像的检测范围，并用连续稀释的AF649标记的抗CD19mAb(浓度(c)＝5×10-5–10μg/ml；每稀释梯度分析n＝10-30个细胞)对NALM-6细胞进行染色。在饱和条件下(c≥2.5μg/ml)，发明人检测到3.4±0.2个CD19分子/μm2，相当于每个NALM-6细胞1,780±210个CD19分子。每次稀释后，发明人获得的CD19分子数量逐渐减少(表S2)。dSTORM的检测极限为0.006±0.002个CD19分子/μm2，相当于每个细胞3.1±1.3个CD19分子(c＝5×10-5μg/ml)(图6)。在所有浓度下，dSTORM正确分类了所有分析的表达CD19的NALM-6细胞(n＝176细胞)。为了比较，本发明人通过流式细胞术进行了平行分析，仅当抗CD19mAb以c≥5×10-2μg/ml使用时，才能在NALM-6细胞上检测到CD19的均匀表达(图6)。总体而言，这些数据表明，dSTORM成像能够高特异性检测肿瘤细胞上高分子密度和极低分子密度的CD19。此外，在检测肿瘤细胞上极低水平的CD19分子时，dSTORM的灵敏度比流式细胞术高出至少3对数倍。
实施例8：通过CD20CART清除CD20low(和CD20high)骨髓瘤细胞
为了将本发明的适用性扩展到CD19以外，本发明人研究了CD20的表达，在使用dSTORM和FC的骨髓瘤患者的初始样本中，通常认为CD20是在大多数骨髓瘤患者中的骨髓瘤细胞中不表达27的另一分子。至于CD19，经流式细胞术判断的另外4例患者的骨髓瘤细胞很少表达CD20，其中2/4例患者被统一归类为CD20-。在2/4例患者中，FC检测到CD20+骨髓瘤细胞群占骨髓瘤细胞的33％(M025)和16.8％(M027)。(图12)。
相反地，dSTORM揭示了3/4例患者中CD20+骨髓瘤细胞群的存在，占骨髓瘤细胞的17.4-76.7％，这表明所有患者中都存在CD20dim细胞群，因为发现表达CD20的细胞群的规模远高于流式细胞仪的估计值(M025为76.7％vs 33％，M027为64.7％vs 16.8％；表2)。计算表面抗原密度得出每个细胞的中位值为650-1,911个CD20分子。发明人发现，对于CD19，与CD20CART共培养4小时，能够在2/2例患者中根除表达CD20的细胞(图13，图14，表S2)。
表S1：患者特点
Figure BDA0002486366040000431
Figure BDA0002486366040000441
*基于测量的骨髓瘤细胞量与表现的临床特征、对治疗的反应和生存率之间的相关性的MM临床分期系统28。
**细胞遗传学分析：高风险的细胞遗传学特征是指不利的FISH检测结果，包括IgH易位(t(4；14)或t(14；16)或t(14；20))，17p13缺失和/或1q21增益29。
***国际骨髓瘤工作组对多发性骨髓瘤的反应和最小残留疾病评估的共识标准。
表S2：NALM-6细胞抗体滴定
Figure BDA0002486366040000442
表1-CD19dSTORM和流式细胞术获得的数据汇总
Figure BDA0002486366040000443
Figure BDA0002486366040000451
Figure BDA0002486366040000461
(s)：单个事件
ndt：未评估患者M020的细胞因子产生
(*)平均值以粗体显示。括号中：计算的数据范围从低(中位数-2σ)值到高(中位数+2σ)值(所有值的95.45％位于此范围内)。每个表达超过1,350个CD19分子的CD19+细胞被分类为CD19high，否则被分类为CD19low(模拟数据)。Δ％CD19+：从CD19+门控中用于相应CD19染色的细胞百分比中减去CD19+门控中用于同种型对照的细胞百分比。
表2-dSTORM和流式细胞仪获得的CD20数据汇总
Figure BDA0002486366040000462
Figure BDA0002486366040000471
ndt：未评估患者M026的细胞毒性
(*)平均值以粗体显示。括号中：计算的数据范围从低(中位数-2σ)值到高(中位数+2σ)值(所有的值的95.45％位于此范围内)。
Δ％CD20+：从CD20+门控中用于相应CD20染色的细胞百分比中减去CD20+门控中用于同种型对照的细胞百分比。
工业适用性
根据制药和诊断产品的已知标准，本发明使用的免疫细胞以及用于本发明的方法的材料可以按照要求保护的方法和用途(例如，用于治疗本发明所定义的癌症)的产品进行工业化生产和销售。因此，本发明在工业上是适用的。
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序列表
<110> 尤里乌斯-马克西米利安-维尔茨堡大学
<120> CD19 CART细胞可清除表达极低水平CD19的骨髓瘤细胞
<130> P20110974WP
<150> EP 17202583.5
<151> 2017-11-20
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2529
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码CD19 CAR的核苷酸序列
<400> 1
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cgaatctaag tacggaccgc cctgcccccc ttgccctatg 840
ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtcaccgtg 900
gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 960
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1020
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc cgacgcccct 1080
gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag aagggaagag 1140
tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gcctcggcgg 1200
aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1260
agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg cctgtatcag 1320
ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccca 1380
aggctcgagg gcggcggaga gggcagagga agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag 1440
aatcccggcc ctaggatgct tctcctggtg acaagccttc tgctctgtga gttaccacac 1500
ccagcattcc tcctgatccc acgcaaagtg tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa 1560
gactcactct ccataaatgc tacgaatatt aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt 1620
ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt aggggtgact ccttcacaca tactcctcct 1680
ctggatccac aggaactgga tattctgaaa accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg 1740
attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata 1800
cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca 1860
tccttgggat tacgctccct caaggagata agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac 1920
aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag 1980
aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc 2040
catgccttgt gctcccccga gggctgctgg ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc 2100
cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg gacaagtgca accttctgga gggtgagcca 2160
agggagtttg tggagaactc tgagtgcata cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc 2220
atgaacatca cctgcacagg acggggacca gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt 2280
gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg 2340
gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac 2400
ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc 2460
gccactggga tggtgggggc cctcctcttg ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc 2520
ttcatgtga 2529
<210> 2
<211> 9382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码CD19 CAR的表达载体的核苷酸序列
<400> 2
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 240
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 300
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 360
attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 420
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 480
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 540
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 600
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 660
gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta 720
ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt 780
aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt 840
ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg 900
gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa 960
agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1020
tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca 1080
gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140
aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200
ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260
tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa 1320
aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac 1380
agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta 1440
ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt 1500
aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 1560
gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc 1620
ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 1680
tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg 1740
caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 1800
cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 1860
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accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct 1980
ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 2040
cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgctgc tgctggtgac 2100
cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg ctgatccccg acatccagat 2160
gacccagacc acctccagcc tgagcgccag cctgggcgac cgggtgacca tcagctgccg 2220
ggccagccag gacatcagca agtacctgaa ctggtatcag cagaagcccg acggcaccgt 2280
caagctgctg atctaccaca ccagccggct gcacagcggc gtgcccagcc ggtttagcgg 2340
cagcggctcc ggcaccgact acagcctgac catctccaac ctggaacagg aagatatcgc 2400
cacctacttt tgccagcagg gcaacacact gccctacacc tttggcggcg gaacaaagct 2460
ggaaatcacc ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa 2520
gggcgaggtg aagctgcagg aaagcggccc tggcctggtg gcccccagcc agagcctgag 2580
cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gcccgactac ggcgtgagct ggatccggca 2640
gccccccagg aagggcctgg aatggctggg cgtgatctgg ggcagcgaga ccacctacta 2700
caacagcgcc ctgaagagcc ggctgaccat catcaaggac aacagcaaga gccaggtgtt 2760
cctgaagatg aacagcctgc agaccgacga caccgccatc tactactgcg ccaagcacta 2820
ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag 2880
cagcgaatct aagtacggac cgccctgccc cccttgccct atgttctggg tgctggtggt 2940
ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc gtggccttca tcatcttttg 3000
ggtgaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt 3060
acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg 3120
atgtgaactg cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca 3180
gaatcagctg tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa 3240
gcggagaggc cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg 3300
cctgtataac gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa 3360
gggcgagcgg aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac 3420
caaggatacc tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaaggctcg agggcggcgg 3480
agagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gccctaggat 3540
gcttctcctg gtgacaagcc ttctgctctg tgagttacca cacccagcat tcctcctgat 3600
cccacgcaaa gtgtgtaacg gaataggtat tggtgaattt aaagactcac tctccataaa 3660
tgctacgaat attaaacact tcaaaaactg cacctccatc agtggcgatc tccacatcct 3720
gccggtggca tttaggggtg actccttcac acatactcct cctctggatc cacaggaact 3780
ggatattctg aaaaccgtaa aggaaatcac agggtttttg ctgattcagg cttggcctga 3840
aaacaggacg gacctccatg cctttgagaa cctagaaatc atacgcggca ggaccaagca 3900
acatggtcag ttttctcttg cagtcgtcag cctgaacata acatccttgg gattacgctc 3960
cctcaaggag ataagtgatg gagatgtgat aatttcagga aacaaaaatt tgtgctatgc 4020
aaatacaata aactggaaaa aactgtttgg gacctccggt cagaaaacca aaattataag 4080
caacagaggt gaaaacagct gcaaggccac aggccaggtc tgccatgcct tgtgctcccc 4140
cgagggctgc tggggcccgg agcccaggga ctgcgtctct tgccggaatg tcagccgagg 4200
cagggaatgc gtggacaagt gcaaccttct ggagggtgag ccaagggagt ttgtggagaa 4260
ctctgagtgc atacagtgcc acccagagtg cctgcctcag gccatgaaca tcacctgcac 4320
aggacgggga ccagacaact gtatccagtg tgcccactac attgacggcc cccactgcgt 4380
caagacctgc ccggcaggag tcatgggaga aaacaacacc ctggtctgga agtacgcaga 4440
cgccggccat gtgtgccacc tgtgccatcc aaactgcacc tacggatgca ctgggccagg 4500
tcttgaaggc tgtccaacga atgggcctaa gatcccgtcc atcgccactg ggatggtggg 4560
ggccctcctc ttgctgctgg tggtggccct ggggatcggc ctcttcatgt gagcggccgc 4620
tctagacccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataatcaacc tctggattac 4680
aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga 4740
tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc 4800
tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa 4860
cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc 4920
acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc 4980
atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 5040
gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg 5100
attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct 5160
tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg 5220
agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc gtcgactagc cgtaccttta 5280
agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 5340
ctggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatctgc tttttgcctg tactgggtct 5400
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 5460
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 5520
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagaatt 5580
cgatatcaag cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc aattcgccct 5640
atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 5700
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 5760
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga 5820
aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt 5880
ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat 5940
agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa 6000
cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta 6060
atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc 6120
ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc 6180
gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac 6240
acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 6300
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 6360
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 6420
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 6480
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 6540
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 6600
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 6660
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 6720
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 6780
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 6840
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 6900
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 6960
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 7020
aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 7080
tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 7140
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 7200
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 7260
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 7320
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 7380
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 7440
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 7500
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 7560
cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 7620
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 7680
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 7740
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 7800
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 7860
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 7920
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 7980
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 8040
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 8100
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 8160
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 8220
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 8280
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 8340
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 8400
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctcgaaa ttaaccctca 8460
ctaaagggaa caaaagctgg agctccaccg cggtggcggc ctcgaggtcg agatccggtc 8520
gaccagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 8580
ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 8640
cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 8700
gcaaaaagct tcgacggtat cgattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttgacattg 8760
attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 8820
ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 8880
ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 8940
ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 9000
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 9060
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 9120
cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 9180
ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 9240
aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 9300
taggcgtgta cggaattcgg agtggcgagc cctcagatcc tgcatataag cagctgcttt 9360
ttgcctgtac tgggtctctc tg 9382
<210> 3
<211> 3180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码CD20 CAR的核苷酸序列
<400> 3
atgttgctgc tggttacatc tctgctgctg tgcgagctgc cccatcctgc ctttctgctg 60
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gtgaccatga cctgtagagc cagcagcagc gtgaactaca tggactggta tcagaagaag 180
cccggcagca gccccaagcc ttggatctac gccacaagca atctggccag cggagtgcct 240
gccagatttt ctggctctgg cagcggcaca agctacagcc tgacaatcag cagagtggaa 300
gccgaggatg ccgccaccta ctactgtcag cagtggtcct tcaatcctcc taccttcggc 360
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ggcggaggcg gatcttctga agttcagctg caacagtctg gcgccgagct ggttaagcct 480
ggcgcctctg tgaagatgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcaccag ctacaacatg 540
cactgggtca agcagacccc tggacaggga ctcgagtgga tcggagccat ctatcccggc 600
aatggcgaca cctcctacaa ccagaagttc aagggcaaag ccacactgac cgccgacaag 660
agcagcagca cagcctacat gcagctgagc agcctgacca gcgaggacag cgccgattac 720
tactgcgcca gaagcaacta ctacggcagc tcctactggt tcttcgacgt gtggggagcc 780
ggcaccacag tgacagtgtc tagcgagtct aagtacggac cgccttgtcc tccttgtcca 840
gctcctcctg tggccggacc tagcgtgttc ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg 900
atgatcagcc ggacccccga agtgacctgc gtggtggtgg atgtgtccca ggaagatccc 960
gaggtgcagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020
agagaggaac agttccagag cacctaccgg gtggtgtccg tgctgacagt gctgcaccag 1080
gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaagggcct gcccagcagc 1140
atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctcgcg agccccaggt gtacacactg 1200
cctccaagcc aggaagagat gaccaagaac caggtgtccc tgacctgtct cgtgaagggc 1260
ttctacccca gcgacattgc cgtggaatgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1320
aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac ggctcattct tcctgtacag cagactgacc 1380
gtggacaaga gccggtggca ggaaggcaac gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1440
ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg tctctgagcc tgggcaagat gttctgggtg 1500
ctggtggtcg tgggcggagt gctggcctgt tacagcctgc tcgtgaccgt ggccttcatc 1560
atcttttggg tcaagcgggg cagaaagaag ctgctgtata tcttcaagca gcccttcatg 1620
cggcccgtgc agaccacaca ggaagaggac ggctgctcct gccggttccc cgaggaagaa 1680
gaaggcggct gcgagctgag agtgaagttc agcagaagcg ccgacgcccc tgcctatcag 1740
cagggccaga accagctgta caacgagctg aacctgggca gacgggaaga gtacgacgtg 1800
ctggataagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agcctagaag aaagaacccc 1860
caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1920
ggaatgaagg gcgagcggag aagaggcaag ggccacgatg gcctgtacca gggactgagc 1980
accgccacca aggataccta tgacgcactg cacatgcagg ccctgccccc cagactcgag 2040
ggcggaggcg aaggcagagg atctctgctg acatgcggcg acgtggaaga gaaccctggc 2100
cccagaatgc tgctgctcgt gacaagcctg ctgctgtgcg agctgcccca ccctgccttt 2160
ctgctgatcc cccggaaagt gtgcaacggc atcggcatcg gagagttcaa ggacagcctg 2220
tccatcaacg ccaccaacat caagcacttc aagaattgca ccagcatcag cggcgacctg 2280
cacatcctgc cagtggcctt tagaggcgac agcttcaccc acaccccccc actggatcca 2340
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tgctatgcaa atacaataaa ctggaaaaaa ctgtttggga cctccggtca gaaaaccaaa 2640
attataagca acagaggtga aaacagctgc aaggccacag gccaggtctg ccatgccttg 2700
tgctcccccg agggctgctg gggcccggag cccagggact gcgtctcttg ccggaatgtc 2760
agccgaggca gggaatgcgt ggacaagtgc aaccttctgg agggtgagcc aagggagttt 2820
gtggagaact ctgagtgcat acagtgccac ccagagtgcc tgcctcaggc catgaacatc 2880
acctgcacag gacggggacc agacaactgt atccagtgtg cccactacat tgacggcccc 2940
cactgcgtca agacctgccc ggcaggagtc atgggagaaa acaacaccct ggtctggaag 3000
tacgcagacg ccggccatgt gtgccacctg tgccatccaa actgcaccta cggatgcact 3060
gggccaggtc ttgaaggctg tccaacgaat gggcctaaga tcccgtccat cgccactggg 3120
atggtggggg ccctcctctt gctgctggtg gtggccctgg ggatcggcct cttcatgtga 3180
<210> 4
<211> 10033
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码CD20 CAR的表达载体的核苷酸序列
<400> 4
gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60
tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120
taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180
aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt 240
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 300
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 360
attagatcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa 420
acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga 480
aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa ccatcccttc agacaggatc 540
agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat 600
agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa 660
gaaaaaagca cagcaagcag cagctgacac aggacacagc aatcaggtca gccaaaatta 720
ccctatagtg cagaacatcc aggggcaaat ggtacatcag gccatatcac ctagaacttt 780
aaatgcatgg gtaaaagtag tagaagagaa ggctttcagc ccagaagtga tacccatgtt 840
ttcagcatta tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg 900
gggacatcaa gcagccatgc aaatgttaaa agagaccatc aatgaggaag ctgcaggcaa 960
agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt 1020
tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca 1080
gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140
aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200
ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260
tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa 1320
aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac 1380
agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta 1440
ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt 1500
aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 1560
gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc 1620
ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 1680
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caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 1800
cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 1860
cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag 1920
accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct 1980
ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 2040
cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgttgc tgctggttac 2100
atctctgctg ctgtgcgagc tgccccatcc tgcctttctg ctgatccccg acatcgtgct 2160
gacacagagc cctgccatcc tgagtgcttc cccaggcgag aaagtgacca tgacctgtag 2220
agccagcagc agcgtgaact acatggactg gtatcagaag aagcccggca gcagccccaa 2280
gccttggatc tacgccacaa gcaatctggc cagcggagtg cctgccagat tttctggctc 2340
tggcagcggc acaagctaca gcctgacaat cagcagagtg gaagccgagg atgccgccac 2400
ctactactgt cagcagtggt ccttcaatcc tcctaccttc ggcggaggca ccaagctgga 2460
aatcaagggc tctacaagcg gcggaggatc tggcggtgga agtggcggag gcggatcttc 2520
tgaagttcag ctgcaacagt ctggcgccga gctggttaag cctggcgcct ctgtgaagat 2580
gagctgcaag gccagcggct acaccttcac cagctacaac atgcactggg tcaagcagac 2640
ccctggacag ggactcgagt ggatcggagc catctatccc ggcaatggcg acacctccta 2700
caaccagaag ttcaagggca aagccacact gaccgccgac aagagcagca gcacagccta 2760
catgcagctg agcagcctga ccagcgagga cagcgccgat tactactgcg ccagaagcaa 2820
ctactacggc agctcctact ggttcttcga cgtgtgggga gccggcacca cagtgacagt 2880
gtctagcgag tctaagtacg gaccgccttg tcctccttgt ccagctcctc ctgtggccgg 2940
acctagcgtg ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc 3000
cgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaggaagat cccgaggtgc agttcaattg 3060
gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcca 3120
gagcacctac cgggtggtgt ccgtgctgac agtgctgcac caggactggc tgaacggcaa 3180
agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc agcatcgaga aaaccatcag 3240
caaggccaag ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacaca ctgcctccaa gccaggaaga 3300
gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaag ggcttctacc ccagcgacat 3360
tgccgtggaa tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt 3420
gctggacagc gacggctcat tcttcctgta cagcagactg accgtggaca agagccggtg 3480
gcaggaaggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac 3540
ccagaagtcc ctgtctctga gcctgggcaa gatgttctgg gtgctggtgg tcgtgggcgg 3600
agtgctggcc tgttacagcc tgctcgtgac cgtggccttc atcatctttt gggtcaagcg 3660
gggcagaaag aagctgctgt atatcttcaa gcagcccttc atgcggcccg tgcagaccac 3720
acaggaagag gacggctgct cctgccggtt ccccgaggaa gaagaaggcg gctgcgagct 3780
gagagtgaag ttcagcagaa gcgccgacgc ccctgcctat cagcagggcc agaaccagct 3840
gtacaacgag ctgaacctgg gcagacggga agagtacgac gtgctggata agcggagagg 3900
ccgggaccct gagatgggcg gcaagcctag aagaaagaac ccccaggaag gcctgtataa 3960
cgaactgcag aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggaatga agggcgagcg 4020
gagaagaggc aagggccacg atggcctgta ccagggactg agcaccgcca ccaaggatac 4080
ctatgacgca ctgcacatgc aggccctgcc ccccagactc gagggcggag gcgaaggcag 4140
aggatctctg ctgacatgcg gcgacgtgga agagaaccct ggccccagaa tgctgctgct 4200
cgtgacaagc ctgctgctgt gcgagctgcc ccaccctgcc tttctgctga tcccccggaa 4260
agtgtgcaac ggcatcggca tcggagagtt caaggacagc ctgtccatca acgccaccaa 4320
catcaagcac ttcaagaatt gcaccagcat cagcggcgac ctgcacatcc tgccagtggc 4380
ctttagaggc gacagcttca cccacacccc cccactggat ccacaggaac tggatattct 4440
gaaaaccgta aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac 4500
ggacctccat gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca 4560
gttttctctt gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga 4620
gataagtgat ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat 4680
aaactggaaa aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg 4740
tgaaaacagc tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg 4800
ctggggcccg gagcccaggg actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg 4860
cgtggacaag tgcaaccttc tggagggtga gccaagggag tttgtggaga actctgagtg 4920
catacagtgc cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca caggacgggg 4980
accagacaac tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg 5040
cccggcagga gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca 5100
tgtgtgccac ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg 5160
ctgtccaacg aatgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg gggccctcct 5220
cttgctgctg gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg tgagcggccg ctctagaccc 5280
gggctgcagg aattcgatat caagcttatc gataatcaac ctctggatta caaaatttgt 5340
gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 5400
ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 5460
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 5520
gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 5580
ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 5640
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 5700
tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 5760
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 5820
ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 5880
tccctttggg ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgactag ccgtaccttt aagaccaatg 5940
acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg 6000
ctaattcact cccaaagaag acaagatctg ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta 6060
gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa 6120
taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac 6180
tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagaat tcgatatcaa 6240
gcttatcgat accgtcgacc tcgagggggg gcccggtacc caattcgccc tatagtgagt 6300
cgtattacaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta 6360
cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg 6420
cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg aaattgtaag 6480
cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca 6540
ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag 6600
tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg 6660
gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt 6720
tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag 6780
agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc 6840
gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc 6900
gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 6960
ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 7020
ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 7080
cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 7140
ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 7200
tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 7260
cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 7320
actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 7380
aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 7440
tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 7500
ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 7560
tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 7620
gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 7680
gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 7740
tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg 7800
gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 7860
ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 7920
gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 7980
aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 8040
ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 8100
ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 8160
tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 8220
gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 8280
agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 8340
taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 8400
gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 8460
gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 8520
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 8580
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 8640
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 8700
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 8760
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 8820
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc 8880
tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 8940
agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc 9000
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 9060
cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga 9120
acaaaagctg gagctccacc gcggtggcgg cctcgaggtc gagatccggt cgaccagcaa 9180
ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 9240
ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct 9300
ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc 9360
ttcgacggta tcgattggct catgtccaac attaccgcca tgttgacatt gattattgac 9420
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 9480
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 9540
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 9600
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 9660
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 9720
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 9780
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 9840
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 9900
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 9960
acggaattcg gagtggcgag ccctcagatc ctgcatataa gcagctgctt tttgcctgta 10020
ctgggtctct ctg 10033

Claims (125)

1.一种方法，其包括以下步骤：
(A)分析来自癌症患者的含有癌细胞的样品，获得癌细胞的细胞表面抗原的信息；和
(B)基于在步骤(A)中获得的信息对所述的含有癌细胞的样品进行分类。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述的癌症是血液癌或实体瘤。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述的癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，优选地，所述的癌症是多发性骨髓瘤。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，步骤(A)包括使用超分辨显微术分析所述含有癌细胞的样品。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，步骤(A)包括确定所述的癌细胞上所述细胞表面抗原的分子数目。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述的超分辨显微术是单分子定位显微术。
7.如权利要求4-6任一项所述的方法，其中，所述的超分辨显微术是dSTORM、STORM、PALM或FPALM。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述的超分辨显微术是dSTORM。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，在该方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞样品是否包含表达细胞表面抗原的一部分癌细胞。
10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原是如权利要求5所述的抗原。
11.如权利要求5-10中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原是癌症抗原。
12.如权利要求5-11中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原不能通过流式细胞术检测到。
13.如权利要求5-12中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原可通过超分辨显微术检测到。
14.如权利要求5-13中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原可通过单分子定位显微术检测到。
15.如权利要求5-14中任一项的方法，其中，所述的细胞表面抗原可通过dSTORM、STORM、PALM或FPALM检测到。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原可通过dSTORM检测到。
17.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过4个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
18.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过8个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
19.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过16个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
20.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过32个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
21.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过64个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
22.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过100个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
23.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过200个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
24.如权利要求5-16中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达超过300个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
25.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过10,000个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
26.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过5,000个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
27.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过2,500个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
28.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过1,500个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
29.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过1,350个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
30.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过1,300个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
31.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过1,000个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
32.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过800个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
33.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过500个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
34.如权利要求5-24中任一项所述的方法，其中，在所述方法的步骤(A)中，分析所述含有癌细胞的样品是否包含每个细胞表达不超过400个所述细胞表面抗原分子的一部分癌细胞。
35.如权利要求5-34中任一项所述的方法，其中，每个细胞的所述细胞表面抗原的所述分子数目通过显微术确定。
36.如权利要求5-35中任一项所述的方法，其中，每个细胞的所述细胞表面抗原的所述分子数目通过超分辨显微术确定。
37.如权利要求5-36中任一项所述的方法，其中，每个细胞的所述细胞表面抗原的所述分子数目通过单分子定位显微术确定。
38.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其中，所述的显微术是dSTORM、STORM、PALM或FPALM。
39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中，所述的显微术是dSTORM。
40.如权利要求1-39中任一项的方法，其中，所述的细胞表面抗原选自包含CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD52、CD64、CD70、CD72、CD123、CD135、CD138、CD220、CD269、CD319、ROR1、ROR2、SLAMF7、BCMA、αvβ3-整联蛋白、α4β1-整联蛋白、EpCAM-1、MUC-1、MUC-16、L1-CAM、c-kit、NKG2D、NKG2D-配体、PD-L1、PD-L2、Lewis-Y、CAIX、CEA、c-MET、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、Her2、FAP、FR-a、EphA2、GD2、GD3、GPC3、IL-13Ra、间皮素、PSMA、PSCA和VEGFR的组，优选CD19和/或CD20。
41.如权利要求5-40中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原是CD19。
42.如权利要求5-41中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原是CD20。
43.如权利要求4-42中任一项所述的方法，其中，步骤(A)包括以下子步骤：
(A-I)在所述癌细胞上标记所述细胞表面抗原；
(A-II)通过超分辨显微术检测所述癌细胞上的所述标记的细胞表面抗原；和
(A-III)对每个癌细胞上标记的细胞表面抗原分子的数目进行计数。
44.如权利要求5-43中任一项所述的方法，其中，所述的细胞表面抗原分别在步骤(A)和步骤(A-I)中通过免疫染色进行标记。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中，步骤(B)还包括以下步骤：
(B-I)如果在步骤(A-III)中获得的每个细胞的细胞表面抗原分子的数目高于最小阈值，则将所述含有癌细胞的样品分类为所述的细胞表面抗原阳性；和/或
(B-II)如果在步骤(A-III)中获得的每个细胞的细胞表面抗原分子的数目低于最小阈值，则将所述含有癌细胞的样品分类为所述的细胞表面抗原阴性。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述的最小阈值的范围为4-300。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中，所述的最小阈值为4。
48.如权利要求45或46所述的方法，其中，所述的最小阈值为8。
49.如权利要求45或46所述的方法，其中，所述的最小阈值为16。
50.如权利要求45或46所述的方法，其中，所述的最小阈值为32。
51.如权利要求45或46所述的方法，其中，所述的最小阈值为64。
52.如权利要求45或46所述的方法，其中，所述的最小阈值为100。
53.如权利要求45或46所述的方法，其中，所述的最小阈值为200。
54.如权利要求45或46所述的方法，其中，所述的最小阈值为300。
55.如权利要求1-54中任一项所述的方法，其中，基于在步骤(B)中所述的对含有癌细胞的样品的分类，对所述患者进行癌症治疗是否适格进行预测。
56.如权利要求55所述的方法，其中，如果在步骤(B)中针对所述的细胞表面抗原的所述含有癌细胞的样品的分类为阳性，则预测所述患者适用癌症治疗。
57.如权利要求1-56中任一项所述的方法，其中，所述的方法是选择用于癌症治疗的靶抗原的方法。
58.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中，所述的方法是用于选择癌症治疗的患者的方法。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述的癌症疗法是针对所述细胞表面抗原的癌症免疫疗法。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述的癌症免疫疗法是针对所述细胞表面抗原的靶向癌症免疫疗法。
61.如权利要求60所述的方法，其中，所述的靶向癌症免疫疗法是针对所述细胞表面抗原的基于细胞的靶向癌症免疫疗法。
62.如权利要求61所述的方法，其中，所述的基于细胞的靶向癌症免疫疗法是使用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞靶向所述细胞表面抗原的免疫疗法。
63.如权利要求59-62中任一项所述的方法，其中，所述的免疫疗法是靶向细胞表面抗原的免疫疗法，所述细胞表面抗原选自包含CD19、CD20、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD52、CD64、CD70、CD72、CD123、CD135、CD138、CD220、CD269、CD319、ROR1、ROR2、SLAMF7、BCMA、αvβ3-整联蛋白、α4β1-整联蛋白、EpCAM-1、MUC-1、MUC-16、L1-CAM、c-kit、NKG2D、NKG2D-配体、PD-L1、PD-L2、Lewis-Y、CAIX、CEA、c-MET、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、Her2、FAP、FR-a、EphA2、GD2、GD3、GPC3、IL-13Ra、间皮素、PSMA、PSCA和VEGFR的组，优选地，所述免疫疗法是靶向CD19和/或CD20的免疫疗法。
64.如权利要求63的方法，其中，所述的免疫疗法是靶向CD19和/或CD20的免疫疗法。
65.如权利要求63的方法，其中，所述的免疫疗法是靶向CD19的免疫疗法。
66.如权利要求63的方法，其中，所述的免疫疗法是靶向CD20的免疫疗法。
67.如权利要求1-66中任一项所述的方法，其中，所述的方法的所有步骤均在体外进行。
68.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其中，所述的方法不包括通过手术或疗法对人体或动物体进行治疗。
69.如权利要求1-68中任一项所述的方法，其中，所述的方法不是在人体或动物体上实施的诊断方法。
70.如权利要求1-69中任一项所述的方法，其中，所述的含有癌细胞的样品是骨髓抽出物。
71.如权利要求1-70中任一项所述的方法，其中，所述的含有癌细胞的样品包括原发性骨髓瘤细胞，并且所述患者是骨髓瘤患者。
72.如权利要求1-71中任一项所述的方法，其中，所述的含有癌细胞的样品包括表达CD138的原发性骨髓瘤细胞，并且所述患者是骨髓瘤患者。
73.如权利要求1-72中任一项所述的方法，其中，所述的含癌细胞的样品可通过从骨髓抽出物中阳性选择CD138的原发性骨髓母细胞获得。
74.如权利要求73所述的方法，其中，所述的选择是使用磁珠选择。
75.一种能够靶向癌细胞的细胞表面抗原的免疫细胞，应用于治疗患者中所述癌症的方法，其中，在该方法中，免疫细胞将施用于患者。
76.如权利要求75所述的免疫细胞用于如权利要求75所述的应用，其中，所述的癌症是骨髓瘤。
77.如权利要求75或76所述的免疫细胞用于如权利要求75或76所述的应用，其中，所述的癌症包含如权利要求5-74中任一项所述的对所述细胞表面抗原呈阳性的一部分细胞。
78.如权利要求75-77中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-77中任一项所述的应用，其中，所述的方法包括癌症免疫疗法。
79.如权利要求78所述的免疫细胞用于如权利要求78所述的应用，其中，所述的癌症免疫疗法是靶向癌症免疫疗法。
80.如权利要求79所述的免疫细胞用于如权利要求79所述的应用，其中，所述的靶向癌症免疫疗法是基于细胞的靶向癌症免疫疗法。
81.如权利要求79或80所述的免疫细胞用于如权利要求79或80所述的应用，其中，所述的靶向癌症免疫疗法是靶向如权利要求63-66中任一项所述的细胞表面抗原的靶向癌症免疫疗法。
82.如权利要求81的免疫细胞用于如权利要求81所述的应用，其中，所述的免疫细胞能够结合所述细胞表面抗原。
83.如权利要求75-82中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-82中任一项所述的应用，其中，该免疫细胞能够结合CD19和/或CD20。
84.如权利要求75-83中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-83中任一项所述的应用，其中，该免疫细胞能够结合CD20。
85.如权利要求84所述的免疫细胞用于如权利要求84所述的应用，其中，所述的免疫细胞能够结合CD20的胞外结构域。
86.如权利要求75-85中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-85中任一项所述的应用，其中，所述的免疫细胞能够结合CD19。
87.如权利要求86所述的免疫细胞用于如权利要求86所述的应用，其中，所述的免疫细胞能够结合CD19的胞外结构域。
88.如权利要求75-87中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-87中任一项所述的应用，其中，所述的细胞是表达嵌合抗原受体的细胞。
89.如权利要求88所述的免疫细胞用于如权利要求88所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体能够结合所述细胞表面抗原。
90.如权利要求88或89所述的免疫细胞用于如权利要求88或89所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体能够结合CD19和/或CD20。
91.如权利要求88-90中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求88-90中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体能够结合CD20。
92.如权利要求88-91中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求88-91中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体能够结合CD19。
93.如权利要求75-92中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-92中任一项所述的应用，其中，所述的细胞选自T细胞、NK细胞和B细胞。
94.如权利要求75-93中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-93中任一项所述的应用，其中，所述的细胞是T细胞。
95.如权利要求75-94中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-94中任一项所述的应用，其中，所述的基于细胞的靶向癌症免疫疗法是具有嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的免疫疗法。
96.如权利要求75-95中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-95中任一项所述的应用，其中，所述的患者是适用通过权利要求55-74中任一项所述的方法可预测的所述治疗的患者。
97.如权利要求75-96中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-96中任一项所述的应用，其中，所述的癌症通过流式细胞术确定的所述细胞表面抗原的表达是阴性的。
98.如权利要求97所述的免疫细胞用于如权利要求97所述的应用，其中，所述的癌症通过超分辨显微术检测确定了所述细胞表面抗原的表达是阳性的。
99.如权利要求98所述的免疫细胞用于如权利要求98所述的应用，其中，所述的癌症通过单分子定位显微术确定了所述细胞表面抗原的表达是阳性的。
100.如权利要求98或99所述的免疫细胞用于如权利要求98或99所述的应用，其中，所述的癌症通过dSTORM、STORM、PALM或FPALM确定了所述细胞表面抗原表达呈阳性。
101.如权利要求100所述的免疫细胞用于如权利要求100所述的应用，其中，所述的癌症通过dSTORM确定了所述细胞表面抗原的表达是阳性的。
102.如权利要求75-101中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-101中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少4个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
103.如权利要求75-101中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-101中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少8个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
104.如权利要求75-101中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-101中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少16个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
105.如权利要求75-101中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-101中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少32个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
106.如权利要求75-101中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-101中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少64个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
107.如权利要求75-101中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-101中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少100个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
108.如权利要求75-101中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-101中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少200个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
109.如权利要求75-101中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-101中任一项所述的应用，其中，一部分癌细胞以每个细胞至少300个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
110.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过10,000个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
111.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过5,000个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
112.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过2,500个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
113.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过1,500个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
114.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过1,350个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
115.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过1,300个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
116.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过1,000个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
117.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过800个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
118.如权利要求75-109中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-109中任一项所述的应用，其中，所述的癌细胞以每个细胞不超过500个细胞表面抗原分子的数量表达所述细胞表面抗原。
119.如权利要求75-118中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-118中任一项所述的应用，其中，所述的治疗是与清髓化学疗法联用的治疗。
120.如权利要求119所述的免疫细胞用于如权利要求119所述的应用，其中，所述的清髓化学疗法包括用美法仑治疗。
121.如权利要求120所述的免疫细胞用于如权利要求120所述的应用，其中，美法仑以每平方米100mg至每平方米200mg的剂量施用，优选地，美法仑以每平方米140mg的剂量施用。
122.如权利要求75-121中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求75-121中任一项所述的应用，其中，所述的治疗是与自体造血干细胞移植联用的治疗；和/或与同种异体造血干细胞移植联用的治疗。
123.如权利要求88-122中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求88-122中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体是具有由SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的嵌合抗原受体。
124.如权利要求88-122中任一项所述的免疫细胞用于如权利要求88-122中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体是具有由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的嵌合抗原受体。
125.如权利要求88-122中任一项的免疫细胞用于如权利要求88-122中任一项所述的应用，其中，所述的嵌合抗原受体是具有由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的嵌合抗原受体。
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