CN112020517A - 用于与抗pd-l1抗体组合的抗cd137抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及这样的抗体，其结合人CD137且展示激动剂活性，并且可单独和与抗人PD‑L1抗体、化学疗法和电离辐射组合用于治疗实体瘤和血液肿瘤。

Description

用于与抗PD-L1抗体组合的抗CD137抗体
本发明处于医药领域中。具体地，本发明涉及可以与针对人PD-L1 (SEQ ID NO:26)的抗体组合的针对人CD137 (SEQ ID NO:1)的激动性抗体，包含此类激动性抗人CD137抗体或抗人PD-L1抗体的组合物的组合，以及使用此类激动性抗人CD137抗体与抗人PD-L1抗体的组合单独或与化疗和其他癌症治疗剂组合用于治疗实体和血液肿瘤的方法。
肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫系统的检测和消除，其中一些机制包括操纵免疫检查点途径。免疫检查点途径用于自身耐受性维持和T细胞活化的调节，但癌细胞可以操纵这些途径以延长肿瘤存活。程序性细胞死亡1(PD-1)/人程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)途径是一种这种免疫检查点。人PD-1在T细胞上表达，并且已显示PD-L1或PD-L2与PD-1的结合抑制T细胞增殖和细胞因子产生。此外，已知一些肿瘤表达PD-L1和PD-L2，并且这种表达可以有助于抑制肿瘤内免疫应答。还已显示一些患者发展对抗PD-L1治疗的适应性抗性，而一些则完全没有应答。
现在已知加强抗肿瘤免疫应答可以是癌症疗法的有效手段。在这方面，CD137(也称为4-1BB)属于TNF受体家族，并且在T细胞免疫应答的活化中起作用，诸如通过驱动T细胞增殖和效应子功能，抑制活化诱导的细胞死亡和促进免疫记忆。靶向CD137的激动剂抗体已在鼠肿瘤模型中显示作为单一疗法的前景(Melero. I. 等人, Nat. Med. (1997) 3(6):682-685)；然而，靶向人CD137的激动剂抗体尚未证明在人患者中作为单一疗法或联合疗法的足够的应答。在这方面，utomilumab (人CD137激动剂IgG2 mAb)(Fisher, T.M. 等人,Cancer Immunol. Immunother. (2012) 61:1721-1733)和urelumab(人源化CD137激动剂IgG4 mAb)(Segal, N.H. Clin. Cancer Res. (2017) 23(8):1929-1936)都没有获得监管批准用作单一疗法或与抗PD-L1抗体的组合疗法。实际上，还没有批准靶向人CD137的激动性抗体用于人中的治疗用途。
尽管没有监管批准，但在具有晚期恶性肿瘤的患者中研究utomilumab和阿维鲁单抗的组合(NCT03217747)。然而，目前仍然需要改进的人抗体，其激动人CD137受体并促进稳健的抗癌免疫应答，展示可接受的毒性概况，并且可以与抗人PD-L1抗体疗法组合。
此外，先前公开的靶向CD137的激动抗体作为癌症单一疗法和/或组合药物的用途可能受到诸如以下因素的阻碍：所述抗体的激动强度和/或由于其在效力可能需要的更高剂量下使用而导致的免疫相关的不良事件。具体而言，先前公开的抗体或者太有效，导致不良事件，或展示次佳的效力，限制它们与抗PD-L1抗体疗法的组合性。本文描述了新型的人抗体，其激动人CD137受体，并具有有利的药理学属性的改进组合。具体而言，本文所述的抗人CD137激动性抗体是工程改造的人Fcγ-受体-介导的效应子无效抗体，其结合人CD137和食蟹猴CD137，在体外刺激T细胞活化，促进人CD137细胞表面表达，增强NF-κB活性，作为单一疗法在非小细胞肺癌的鼠肿瘤模型中抑制肿瘤生长，在体外抑制T-调节细胞介导的抑制，活化期望的免疫基因标记，增加肿瘤内CD3+ T细胞的频率，与人CD137-配体竞争结合人CD137，和结合人CD137上的独特氨基酸残基。在这方面，当在鼠肿瘤模型中与抗人PD-L1抗体组合时，本文公开的靶向CD137的激动性抗体提供了益处。
用于本发明的组合中的已知的抗人PD-L1抗体的非限制性实例包括阿特朱单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、BMS-936559和抗体B(先前描述于WO2017/034916中)。在一些实施方案中，抗体B包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实例中，抗体B包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
用于本文所述的组合中的有用的化疗剂的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、甲氨蝶呤、多柔比星、依托泊苷、卡铂、顺铂、环磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、紫杉醇(taxol)、喜树碱、FOLFIRI、FOLFOX、多西他赛、道诺霉素、紫杉醇(paclitaxel)、奥沙利铂及其组合。
如本文所用的术语“抗体”是指多肽复合物，其具有两条重链(HC)和两条轻链(LC)，使得重链和轻链通过二硫键相互连接；其中所述抗体是IgG亚类抗体。
用于本发明中的CD137激动剂抗体是工程改造的非天然存在的多肽复合物。本发明的DNA分子是DNA分子，其包含编码具有本发明的抗体中的多肽中的至少一种的氨基酸序列的多肽的非天然存在的多核苷酸序列。
本发明的抗人CD137抗体是IgG型抗体且具有经由链内和链间二硫键交联的"重"链和"轻"链。各重链由N-末端HCVR和重链恒定区("HCCR")构成。各轻链由LCVR和轻链恒定区("LCCR")构成。当在某些生物系统中表达时，具有天然人Fc序列的抗体在Fc区中被糖基化。通常，糖基化发生在抗体的Fc区中的高度保守的N-糖基化位点处。N-聚糖通常与天冬酰胺连接。抗体同样可在其他位置处被糖基化。
任选地，本文描述的抗人CD137抗体包含源自人IgG1的Fc部分。众所周知IgG1结合Fc-γ受体家族(FcγR)的蛋白以及C1q。与这些受体的相互作用可诱导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，任选地，本文描述的抗人CD137抗体是缺乏Fc效应子功能的人单克隆抗体(IgG1，Fc-无效)。为了获得Fc-无效IgG1抗体，必需在其IgG1 Fc区的CH2区内选择性诱变残基。将氨基酸取代L234A、L235E和G237A引入IgG1 Fc以减少与FcγRI、FcγRIIa和FcγRIII的结合，并且引入取代A330S和P331S以减少C1q介导的补体结合。为了减少当在人体中给药时免疫应答的潜在诱导，某些氨基酸可能需要回复突变以匹配抗体种系序列。
HCVR和LCVR区可进一步细分成间插有更保守区(称为框架区("FR"))的超变区(称为互补决定区("CDR"))。各HCVR和LCVR由三个CDR和四个FR构成，其从氨基-末端至羧基-末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重链的三个CDR称为"HCDR1、HCDR2和HCDR3"且轻链的三个CDR称为"LCDR1、LCDR2和LCDR3"。CDR含有大多数与抗原形成特异性相互作用的残基。为了本发明的目的，使用North CDR定义。North CDR定义(North等人, “A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”, Journal ofMolecular Biology, 406, 228-256 (2011))基于用大量晶体结构的亲和力传播聚类。
可通过使编码HCVR的DNA可操作连接至编码重链恒定区的另一DNA分子，来将编码HCVR区的分离DNA转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域中已知的。可例如通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。
可通过使编码LCVR的DNA可操作连接至编码轻链恒定区的另一DNA分子，来将编码LCVR区的分离DNA转化成全长轻链基因。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的。可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。优选地，对于本发明的抗人CD137抗体而言，轻链恒定区为κ恒定区。
在序列已可操作连接至表达控制序列之后将在宿主细胞中表达本发明的多核苷酸。表达载体通常可在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体将含有选择标记(例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶)以允许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。
本文所述的抗体可容易在哺乳动物细胞(其非限制性实例包括CHO、NS0、HEK293和COS细胞)中产生。可以使用本领域中众所周知的技术培养宿主细胞。可通过众所周知的方法将含有目标多核苷酸序列(例如，编码抗体的多肽的多核苷酸和表达控制序列)的载体转移至宿主细胞中，所述方法可以根据细胞宿主的类型而变化。
可以采用蛋白纯化的各种方法，并且此类方法是本领域中已知的，并且描述于例如Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)和Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 第3版, Springer, NY (1994)。
在本发明的其他实施方案中，以分离形式提供抗体或编码其的核酸。如本文所用，术语"分离的"是指不含或基本上不含细胞环境中发现的任何其他大分子物质的蛋白、肽或核酸。如本文所用的"基本上不含"意指目标蛋白、肽或核酸占存在的大分子物质的大于80%(以摩尔计)、优选地大于90%和更优选地大于95%。
本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径(其非限制性实例为静脉内施用)施用。本发明的抗体可以连同药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以单个剂量或多个剂量施用于患者。本发明的药物组合物可通过本领域中众所周知的方法制备(例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第22版 (2012), A. Loyd 等人,Pharmaceutical Press)并且包含如本文所公开的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
用于静脉内(i.v.)或非静脉内施用、局部或全身性、或其组合的给药时间表通常范围从单次推注剂量或连续输注到每天多次施用(例如，每4-6小时)，或如由治疗医师和患者的病况所示。给药量和频率可以由治疗患者的医师确定。
术语"治疗(treating)"(或"治疗(treat)"或"治疗(treatment)")是指减缓、中断、阻止、缓解、停止、减轻或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度。
"有效量"意指本发明的抗体或包含本发明的抗体的药物组合物将引发研究者、医师或其他临床医师寻求的对组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物或医学应答或期望治疗效果的量。抗体的有效量可根据因素而变化，所述因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及抗体在个体内引发期望应答的能力。有效量也是其中治疗有益效果胜过抗体的任何毒性或有害效果的量。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的轻链。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；和/或其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人PD-L1抗体是阿特朱单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和具有SEQ IDNO:25的氨基酸序列的轻链。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆道癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、直肠癌或甲状腺癌。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌或透明细胞肾癌。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或肾细胞癌。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与电离辐射组合施用。
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与一种或多种化疗剂组合施用。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人PD-L1抗体是阿特朱单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗。
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本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆道癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、直肠癌或甲状腺癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌或透明细胞肾癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或肾细胞癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与电离辐射组合施用。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与一种或多种化疗剂组合施用。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。
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本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人PD-L1抗体是阿特朱单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆道癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、直肠癌或甲状腺癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌或透明细胞肾癌。
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本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是食道癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是胃癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是头颈癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是非小细胞肺癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是前列腺癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是直肠癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是甲状腺癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是胆管癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是头颈部鳞状细胞癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是肺腺癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是肺鳞状细胞癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是透明细胞肾癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是膀胱癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是头颈部鳞状细胞癌。
本公开提供了抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3；其中所述癌症是肾细胞癌。
抗体表征、产生、表达和纯化
使用SEQ ID NO:14中所示的重链多核苷酸序列和SEQ ID NO:17中所示的轻链多核苷酸序列在哺乳动物细胞中生产抗体导致产生两种抗体产物相关的种类：(a)具有SEQ IDNO:10中所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:11的轻链氨基酸序列的全长抗体(以下称为“抗体A1”)；和(b)由于轻链的n-末端丙氨酸的修剪而产生的抗体的单氨基酸截短形式(以下称为“抗体A2”)，所述抗体A2具有SEQ ID NO:10中所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:13中所示的轻链氨基酸序列。如本文所用，“抗体A1/2”是指由使用SEQ ID NO:17中所示的轻链多核苷酸序列而产生且包括抗体A1 (~6%)和抗体A2 (~94%)的抗体产物。使用SEQ IDNO:14中所示的重链多核苷酸序列和SEQ ID NO:15中所示的轻链多核苷酸序列，可以在没有大量抗体A2的情况下合成抗体A1。使用SEQ ID NO:14中所示的重链多核苷酸序列和SEQID NO:16中所示的轻链多核苷酸序列，可以在没有大量抗体A1的情况下合成抗体A2。
本发明的抗体可以通过使用已知方法(包括但不限于通过使用噬菌体展示)产生。另外，可以使用本文描述的测定法进一步筛选如上所述衍生的抗体。
抗体A1、A2和B的重链和轻链可变区的多肽和抗体A1、A2和B的完整重链和轻链氨基酸序列以及编码其的核苷酸序列列于标题为“氨基酸和核苷酸序列”的部分中。此外，抗体A1、A2、A1/2和B的轻链、重链、轻链可变区和重链可变区的SEQ ID NO显示于表1和2中。
表1
对应的SEQ ID (氨基酸) 抗体A1 抗体A2 抗体B
靶标 人CD137 人CD137 人PD-L1
HCDR1 2 2 --
HCDR2 3 3 --
HCDR3 4 4 --
LCDR1 5 5 --
LCDR2 6 6 --
LCDR3 7 7 --
HCVR 8 8 22
LCVR 9 12 23
重链 10 10 24
轻链 11 13 25
表2
对应的SEQ ID (DNA) 抗体A1 抗体A2 抗体A1/2
HC 14 14 14
LC 15 16 17
可基本上如下所述制备并纯化本发明的抗体(包括但不限于抗体A1、A2、A1/2和B)。可用用于分泌抗体的表达系统使用最佳预定HC：LC载体比率或编码HC和LC两者的单一载体系统瞬时或稳定转染适当宿主细胞(诸如HEK 293或CHO)。可使用许多常用技术中的任一者纯化其中已分泌抗体的澄清培养基。例如，可将培养基方便地施加至已用相容缓冲液(诸如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)。可洗涤该柱以除去非特异性结合组分。可例如通过pH梯度(诸如20mMTris缓冲液(pH 7)至10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)或磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)至100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0))洗脱结合抗体。可诸如通过UV吸收或SDS-PAGE检测抗体级分，且然后可合并。取决于预期用途，进一步纯化是任选的。可使用常用技术浓缩和/或无菌过滤抗体。可通过常用技术(包括大小排阻、疏水性相互作用、离子交换、多模式或羟基磷灰石色谱)有效除去可溶性聚集物和多聚体。该产物可以立即在-70℃下冷冻或可以冻干。
如本文所用，BMS20H4.9是指具有SEQ ID NO:18中所示的重链和SEQ ID NO:19中所示的轻链的抗体，并且先前已描述于US7288638中。如本文所用，PF83是指具有SEQ IDNO:20中所示的重链和SEQ ID NO:21中所示的轻链的抗体，并且先前已描述于US8337850中。
抗体A1/2结合人CD137
可以通过ELISA测量本文公开的抗体结合人CD137的能力。为了测量与人CD137的结合，将96-孔板(Nunc)用人CD137-Fc (R&D Systems)在4℃下包被过夜。将孔用封闭缓冲液(含有0.2%牛血清白蛋白和0.05% Tween-20的PBS)封闭2 h。将孔用含有0.05% Tween-20的PBS洗涤3次。然后以不同浓度添加抗体A1/2或对照IgG (100微升)，并在室温下孵育1 h。洗涤后，将板与100微升的山羊抗人IgG F(ab’)2-HRP缀合物(Jackson Immuno ResearchLaboratories)在室温下孵育45分钟。将板洗涤，且然后与100微升的3,3’, 5,5’-四甲基联苯胺一起孵育。在SpectraMax®微板读取仪上读取650 nm处的吸光度。使用GraphPadPrism 7软件计算半最大有效浓度(EC50)。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体A1/2以0.027nM的EC50结合人CD137。
抗体A1/2结合食蟹猴CD137
可以使用流式细胞术测定来测量本文公开的抗体结合细胞表面食蟹猴CD137的能力。表达食蟹猴CD137的稳定细胞通过如下生成：根据制造商的方案使用Lipofectamine™2000试剂(Invitrogen™)将Cyno-CD137受体质粒DNA转染至人293细胞(ATCC)中。在含有10%胎牛血清和1% GlutaMAX™的Dulbecoo氏改良的Eagle氏培养基中，使用0.5微克/mL嘌呤霉素选择稳定的细胞。对于流式细胞术，汇合的贴壁细胞使用Gibco®细胞解离缓冲液(Life Technologies)分离，在FACS缓冲液(含有3%胎牛血清的磷酸盐缓冲溶液)中在4℃下封闭1 h，且然后以1 x 105个细胞/孔的密度转移至96-孔圆底板。添加抗体A1/2、BMS20H4.9、PF83或对照人IgG1(在FACS缓冲液中以0.5微克/mL开始1:4稀释)(100微升)，并将细胞在4℃下染色1 h。
在FACS缓冲液中洗涤之后，以1:200稀释度添加二抗R-藻红蛋白缀合的山羊抗人IgG, F(ab’)2片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，并将细胞在4℃下孵育30分钟。洗涤细胞，并且根据制造商的方案使用LIVE/DEAD® Fixable远红色死细胞染色试剂盒(Life Technologies)进行活/死细胞染色。在FACS缓冲液中洗涤细胞，并在IntelliCyt HTFC®筛选系统上进行处理。使用FlowJo®软件分析流式细胞术数据。将平均荧光强度(MFI)比计算为(实验抗体的MFI)/(对照IgG的MFI)。
在基本上如上所述进行的实验中，与BMS20H4.9 (0.94的MFI比)和PF83 (37的MFI比)相比，浓度为0.5微克/mL的抗体A1/2展示153的更高的MFI比。
人细胞上的抗体A1/2结合减少CD137表达
可以如下测定本文公开的抗体调节人CD137细胞表面水平的能力。表达人CD137的稳定细胞通过如下生成：根据制造商的方案使用Lipofectamine™ 2000试剂(Invitrogen™)将人CD137质粒DNA转染至人293细胞(ATCC)中。在含有10%胎牛血清和1% GlutaMAX™的Dulbecoo氏改良的Eagle氏培养基中，使用0.5微克/mL的嘌呤霉素选择稳定的细胞。在培养基中以300纳摩尔浓度开始的CD137抗体与细胞在37℃下孵育24小时。将细胞用PBS洗涤，使用Gibco®细胞解离缓冲液分离，并在冷缓冲液(1x PBS，1% BSA，0.09%叠氮化钠)中用相同的CD137抗体染色2 h。洗涤后，将细胞用Alexa Fluor 647-缀合的山羊抗人IgG检测抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)染色30分钟。将细胞洗涤，并根据制造商的方案用Zombie Green Live/Dead (BioLegend)进行差异标记。所有细胞都在Fortessa X-20上处理。用FlowJo®软件进行分析，以生成Alexa Fluor 647的中值荧光强度(MFI)，并针对等效可溶性荧光染料(MESF)标准曲线的Alexa Fluor 647分子(Bangs Laboratories)进行校准。将MESF值针对未处理的染色对照(100%)和未处理的同种型染色对照(0%)进行归一化。
在基本上如上所述进行的实验中，与PF83 (12%)相比，浓度为300纳摩尔浓度的抗体A1/2诱导CD137水平的增加(21%)，而BMS20H4.9使细胞表面上的CD137减少56%。
抗体A1/2的NF-κB荧光素酶报告子测定活性
可以如下测量本文公开的抗体活化NF-κB的能力。双重稳定的NF-κB荧光素酶报告子/人CD137-293细胞通过如下生成：根据制造商的方案使用Lipofectamine™ 2000试剂(LifeTechnologies)将pGL4.32[luc2P/NF-kappaB-RE/Hygro]质粒DNA (Promega)转染至表达人CD137的293细胞中。在含有10%胎牛血清和1% GlutaMAX™的Dulbecoo氏改良的Eagle氏培养基中，使用100微克/mL潮霉素和0.5微克/mL嘌呤霉素选择稳定的细胞。使用ThermoMultiDrop Combi试剂分配器(Thermo Fisher Scientific)将细胞以5 x 103个细胞/孔的密度铺板在384孔板中，并在37℃下培养过夜。使用Hamilton STAR™ (Hamilton Company)在板内以9微摩尔浓度或1.33微摩尔浓度开始以10-点2-倍稀释度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释抗体A1/2、BMS20H4.9、PF83或对照人IgG1，并转移至细胞中。然后将细胞与所述抗体在5% CO2中在37℃下孵育5.5 h，且然后使用ONE-Glo™荧光素酶测定系统(Promega™)和Thermo™ Scientifi MultiDrop™ Combi试剂分配器进行处理。使用SpectraMax®微板读取仪(Molecular Devices)测量发光，并使用Genedata Screener® (Genedata)进行数据分析。数据如下归一化：%活性 = [(孔值-最低对照的中值)/(最大对照的中值-最低对照的中值)] x 100%。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体A1/2展示78%的最大活性，其高于PF83(12%的最大活性)且低于BMS20H4.9(115%的最大活性)。
抗体A1/2促进T细胞来源的干扰素-γ产生
可以如下测量本文公开的抗体促进T细胞来源的干扰素-γ(IFN-γ)产生的能力。通过Ficoll密度梯度离心(Ficoll® Paque PLUS; GE Healthcare)从全血或白细胞分离人外周血单核细胞(PBMC)，并在具有10%胎牛血清(HyClone)的Roswell Park MemorialInstitute培养基(RPMI)(Life Technologies)中生长。将PBS中的抗人CD3抗体克隆HIT3a(BD Biosciences)包被至96-孔板上(典型范围：2至15纳克/孔)，并在4℃下孵育过夜。抽吸后，将孔用PBS冲洗，并将人PBMC以1.5 x 105个细胞/孔的密度转移至96-孔板上。抗体A1/2、BMS20H4.9、PF83或对照人IgG1通过在含有10%胎牛血清的RPMI中以80微克/mL的初始浓度1：4稀释来制备。将抗人CD28抗体克隆CD28.2(BioLegend)添加至板中(典型范围0.2至2微克/mL)，随后添加测试抗体，并在加湿的5% CO2培养箱中在37℃孵育96 h。收集上清液，并使用R&D Systems®人IFN-γ DuoSet ELISA试剂盒测量人IFN-γ水平。简而言之，将IFN-γ捕获抗体在室温下包被至板上(4微克/mL)过夜。抽吸和洗涤后，将板在室温下封闭1h。添加样品上清液和IFN-γ标准品，在室温下孵育2h。洗涤后，添加100微升的IFN-γ检测抗体，在室温下孵育2小时，并洗涤。添加链霉抗生物素蛋白-HRP (100微升的1:40稀释液)，在室温下持续20分钟。洗涤后，通过添加100微升底物溶液20分钟、随后添加50微升终止溶液来将板显色，并使用SpectraMax®微板读取仪在450 nm处测量信号。使用SoftMax Pro软件和GraphPad Prism(GraphPad软件)进行数据分析。将诱导倍数计算为样品平均IFN-γ(pg/mL)/对照hIgG1平均IFN-γ (pg/mL)。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体A1/2增强CD3/CD28共刺激对人PBMC的次优活化，如通过IFN-γ细胞因子产生所测量。在这方面，以5微克/ml的抗体A1/2进行处理导致IFN-γ产生增加3.8倍，其高于PF83(1.6倍增加)，且低于BMS20H4.9(9.4倍增加)。
抗体A1/2固相结合测定
可以使用ELISA测定测量抗体A1/2与人C1q的结合。将抗体A1/2和对照抗体(阴性对照IgG1)在PBS中连续稀释，并在4℃下包被至ELISA板上过夜。以10毫克/mL的浓度添加酪蛋白缓冲液中的人C1q，并孵育2小时。通过将板与抗人C1q-HRP (AbD Serotec Inc., 1:200稀释度)孵育1 h来检测人C1q，并使用TMB (KPL, Inc.)将板显色。使用Synergy Neo2杂合多模式读取仪(BioTek®)在450 nm处测量吸光度。
使用MSD测定(Meso Scale Diagnostics)测定抗体A1/2与FcγRI、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(F)和FcγRIIIa(V)的结合。简而言之，将Fcγ受体包被至Meso Scale板上过夜，并将连续稀释的测试抗体添加至板中并孵育2 h。使用抗人二抗(Meso ScaleDiagnostics, D20TF-6)检测抗体A1/2，并用Read Buffer T (Meso Scale Diagnostics,R92TC-1)将该板显色。在SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Diagnostics)上测量发光，并使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据。
表3
抗体 FcγRI(EC<sub>50</sub> nM) FcγRIIa(H)(EC<sub>50</sub> nM) FcγRIIb(EC<sub>50 </sub>nM) FcγRIIIa(F)(EC<sub>50 </sub>nM) FcγRIIIa(V)(EC<sub>50</sub> nM) 人C1q(EC<sub>50</sub> nM)
抗体A1/2 >5* >134* >134* >134* >134* >330*
阳性对照IgG1(完整Fc受体效应子功能) 0.8 93.7 >134* 19 6.2 8.9
*表示测试的抗体的最大浓度。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体A1/2不结合FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIa或Clq(如上表3所示)。在其他实验中，抗体A1/2在基于细胞的抗体依赖性的细胞的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性测定中未表现出可检测的效应子功能。
建立的肿瘤模型中的抗体A1/2的抗肿瘤效力
将HCC827人非小细胞肺癌(ATCC)肿瘤细胞系维持在其各自的培养基中，并收获用于植入。将肿瘤细胞(每只小鼠1 x 107个细胞)皮下注射至7周龄的雌性NOD/SCID Gamma(NSG)小鼠(Jackson Laboratories)的右侧腹中。当肿瘤大小达到近似350 mm3至450 mm3时，将小鼠随机分组，每组5至8只。通过用Dynabeads®人T-扩增CD3/CD28珠粒(Thermo FisherScientific)刺激幼稚的人PBMC 9至10天来生成人扩增的T细胞并建库。通过在SepMate管(STEMCELL Technologies)中在Ficoll® Paque PLUS上离心来制备人PBMC (NY血液中心)并建库。解冻扩增的T细胞，并将1 x 106个细胞注入小鼠中。作为对照，在一些小鼠中，仅植入肿瘤细胞而没有T细胞或PBMC。治疗在第0天或第1天开始。治疗组包括对照IgG、BMS20H4.9、PF83和抗体A1/2。经由腹膜内注射以10mg/kg抗体每周一次给动物给药，持续4周。每周两次记录体重(BW)，并使用下式计算BW的百分比变化：(观察日的BW-初始日的BW)/初始日BW x 100%。使用电子卡尺每周两次测量肿瘤体积。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3) = π/6 * 长度 * 宽度2。如果几何平均值的△T > 0，则式100 × △T / △C计算%T/C。△T = 研究的观察日的药物治疗组的平均肿瘤体积–给药初始日的药物治疗组的平均肿瘤体积；△C = 研究的观察日的对照组的平均肿瘤体积–给药初始日的对照组的平均肿瘤体积。使用SAS软件(版本9.2)中的MIXED程序，通过按时间和治疗的方差的双向重复测量分析，进行肿瘤体积数据的统计分析。
在基本上如上所述进行的实验中，与用PF83 (T/C% = 81.2)和BMS20H4.9 (T/C%= 96.9)治疗的小鼠(其显示没有抑制)相比，用抗体A1/2治疗的小鼠表现出显著的肿瘤生长抑制(T/C% = 30.6; P < 0.001)。
抗体A1、抗体A2和抗体A1/2的动力学/亲和力结果
Biacore T200仪器可用于测量固定的人CD137-Fc与抗体A1、抗体A2和抗体A1/2结合的动力学。将重组人细胞外CD137-Fc蛋白(R&D Systems)经由胺偶联(GE Healthcare)共价固定至CM5传感器芯片。在HBS-EP+缓冲液中以30微升/min的流速进行CD137抗体测试。以各种浓度注射样品，并在25℃下获得测量值。在每次样品注射后，将表面以30微升/min的流速用10毫摩尔甘氨酸-HCl pH2.0再生24秒，且然后用缓冲液稳定10秒。使用Biacore T200软件评估浓度范围为0.123纳摩尔浓度至30纳摩尔浓度的传感图。缔合(Ka)和解离(Kd)速率常数的计算基于1:1 Langmuir结合模型拟合。平衡解离常数(KD)或结合亲和力常数从动力学速率常数比率Kd/Ka计算。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体A1、抗体A2和抗体A1/2以表4中举例说明的动力学和亲和力常数结合人CD137。
表4
抗体 K<sub>on</sub> (1/Ms) K<sub>off</sub> (1/s) K<sub>D</sub> (M) R<sub>max</sub> Chi<sup>2</sup>
抗体A2 1.33E+06 7.13E-03 5.36E-09 23.10 0.247
抗体A1 1.61E+06 5.36E-03 3.33E-09 22.76 0.355
抗体A1/2 1.52E+06 7.11E-03 4.67E-09 20.86 0.303
比较抗体A1、抗体A2和抗体A1/2的NF-κB荧光素酶报告子测定
如本文先前所述，可以测量本文公开的抗体活化NF-κB的能力，其修改在于在PBS中制备抗体稀释液，并在板内以9微摩尔浓度开始制备10-点2-倍稀释液。
在基本上如上所述进行的实验中，与抗体A1(63.4%的最大活性)和抗体A2(72.3%的最大活性)相比，抗体A1/2(70.5%的最大活性)表现出相似的最大活性。
抗体A1和抗体A2促进T细胞来源的干扰素-γ产生
如本文先前所述，可以测量本文公开的抗体促进T细胞来源的干扰素-γ(IFN-γ)产生的能力。在基本上如本文所述进行的实验中，抗体A1、抗体A2和抗体A1/2增强CD3/CD28共刺激对人PBMC的次优活化，如通过IFN-γ细胞因子产生所测量。在这方面，用5微克/mL的抗体A1/2治疗导致IFN-γ产生增加3.1倍，这与抗体A1(3.5倍增加)和抗体A2(3.5倍增加)相当。
抗体A1和抗体A2在建立的肿瘤模型中的抗肿瘤效力
如本文先前所述，可以测量本文公开的抗体抑制小鼠中的肿瘤生长的能力。
在基本上如上所述进行的实验中，抗体A1、抗体A2和抗体A1/2在HCC827建立的肿瘤模型中抑制肿瘤生长。用抗体A1/2 (T/C% = 47.1%; P < 0.001)治疗显示与抗体A1 (T/C% = 56.0%; P < 0.001)和抗体A2 (T/C% = 48.7%; P < 0.001)类似的肿瘤生长的减少。
如经由X-射线晶体学测定的抗体A1的表位
使用12 mL CaptureSelect IgG-CH1 Affinity Matrix从293HEK细胞上清液纯化抗体A1-Fab。SDS-PAGE和分析大小排阻色谱法(SEC)用于解决纯化的抗体A1-Fab的纯度和质量。将该基质的洗脱物质与1X Tris缓冲盐水(TBS)进行缓冲液交换。在利用Ni Sepharose®Excel柱、Ni-NTA柱和SEC柱的三个步骤中从293HEK上清液纯化hCD137* (*(人CD137氨基酸22-161，ΔC121S)-AAA-6His)。简而言之，将两升上清液在没有任何缓冲液交换的情况下直接负载入Ni Sepharose Excel柱中。该步骤的洗脱液与PBS进行缓冲液交换，并使用Ni-NTA重力流柱进一步纯化。进一步纯化该步骤的洗脱液，并使用制备型SEC柱与1X TBS进行缓冲液交换。来自第一Ni Sepharose Excel步骤的流通液含有大量的hCD137*。然后将其重新负载入Ni Sepharose Excel柱，随后负载入Ni-NTA和制备型SEC柱。SDS-PAGE用于基于其纯度合并hCD137*级分。hCD137*的浓度为14.5毫克/mL，并且抗体A1-Fab的浓度为7.5毫克/mL。
抗体A1-Fab:CD137*复合物以1:1摩尔比合并，且然后进入凝胶过滤柱，在20毫摩尔Tris pH 8.0、100毫摩尔氯化钠中进行预平衡。将所得复合物浓缩至12.5毫克/mL。过滤后，在21℃和8℃两者下，使用Phoenix液体处理机，在坐滴板中将抗体A1-Fab:CD137复合物用稀疏基质晶体筛选条件设置为1:1比率。在21℃下，在1摩尔柠檬酸三钠(pH 6.5)中，大的棱柱样晶体在4天内在单一条件下生长。收获晶体并在20%甘油和储层条件下进行冷冻保护，固定并在液氮中快速冷冻，然后使用Advanced Photo Source, Argonne NationalLaboratory，对样品进行X-射线筛选，并收集数据。使用CCP4程序套件(Winn, M.D. 等人Acta. Cryst. 2011：D67, 235-242)，将抗体A1-Fab/hCD137*数据处理至2.4Å。该晶体属于空间群P3121，其中晶胞参数为a=b=124.9 Å，b=112.7 Å，α=β=90°和γ=120°。使用内部Fab结构作为搜索模型，通过用程序Phaser(McCoy, A.J.等人，J. Appl. Cryst. 2007 40：658-674)的分子置换来确定结构。使用Refmac (Winn, M.D. 等人 Acta. Cryst. 2011：D67, 235-242; Murshudov, G..N. Act. Cryst. 2011：D67, 355-367)和Buster(Bricogne, G.. 等人 2016; Buster Version 2.11.6. Cambridge, United Kingdom:Global Phasing Let.)来细化Fab的分子置换溶液。使用程序COOT(Emsley, P. ActaCryst. 2010：D66, 486-501)，使用来自细化的图来手动构建CD137的模型。细化的R-因子为R=17.8%，Rfree=20.5%。
在基本上如该测定中所述进行的实验中，解析抗体A1-Fab:hCD137*复合物，并且表位/互补位在下表5中举例说明。表5列出抗体A1-Fab上的在hCD137*上所列残基的6Å内的残基。抗体A1-Fab的重链与hCD137*具有57个接触点(截止值6Å)，而轻链具有18个接触点(截止值6Å)。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 368511DEST_PATH_IMAGE002
抗体A1/2完全阻断CD137/CD137-配体相互作用
可以用ELISA测定法测量本文公开的抗体阻断人CD137和CD137-配体(以下称为CD137L)相互作用的能力。首先，利用ELISA测定法来定量hCD137** (人CD137氨基酸22-164，ΔC121S)-AAA-FLAG与hCD137L*和抗体A1/2、BMS20H4.9和PF83的结合EC50。将96孔Immulon® 4HBX ELISA板的孔在4℃下在温和搅拌下用100微升PBS(pH 7.2)中的50纳克hCD137**包被过夜。用PBST中的5% BSA封闭和洗涤后，添加His-标记的重组人CD137L(以下称为hCD137L*) (R&D Systems)的五倍稀释系列(392纳摩尔– 0.005纳摩尔)、BMS20H4.9的五倍稀释系列(53-0.00068纳摩尔)、PF83的五倍稀释系列(107-0.0014纳摩尔)或抗体A1/2的五倍稀释系列(53-0.00068纳摩尔)，每个稀释度一式两份进行，并在室温下在温和搅拌下孵育1 h。然后洗涤用抗CD137抗体处理的孔，并添加HRP-缀合的山羊抗Fab抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories)的1:10000稀释液，并遵循标准方案在室温下孵育。然后洗涤用hCD137L*处理的孔，并添加HRP-缀合的小鼠抗His抗体(Sigma-Aldrich®)的1:5000稀释液，并遵循标准方案在室温下孵育板。根据制造商的说明，使用TMB过氧化物酶显色底物和终止溶液用于信号的可视化和检测。将吸光度读数绘制在GraphPad Prism软件版本6中。EC50值通过该软件的一个位点-特异性结合功能的非线性回归曲线拟合分析来计算。在如所述进行的实验中，与hCD137**的结合亲和力(EC50)对于hCD137L测定为0.6纳摩尔，对于抗体1/2测定为1.4纳摩尔，对于BMS20H4.9测定为0.43纳摩尔，且对于PF83测定为大于10纳摩尔。
hCD137L*与BMS20H4.9、PF83和抗体A1/2竞争结合hCD137**的能力可以如下测定。将96-孔Immulon 4HBX ELISA板在4℃下在温和搅拌下用100微升PBS(pH 7.2)中的50纳克hCD137**包被过夜。在封闭(用PBST中的5% BSA)和洗涤后，将hCD137L*的五倍稀释液(196至0.0025纳摩尔)与饱和量的以下指定抗体混合：抗体A1/2(200纳克/孔)，BMS20H4.9 (3纳克/孔)或PF83 (1000纳克/孔)。然后将混合物一式两份添加至孔中，并在室温下在温和搅拌下孵育1 h。洗涤后，遵循标准方案将板与HRP-缀合的山羊抗Fab抗体(1:1000稀释度，Jackson ImmunoResearch Laboratories)在室温下孵育。根据制造商的说明，使用TMB过氧化物酶显色底物和终止溶液用于信号的可视化和检测。
绘制保持与CD137结合的mAb的百分比，并使用GraphPad Prism软件通过非线性回归曲线拟合分析计算IC50值。
在基本上如上所述进行的实验中，hCD137L*完全阻断抗体A1/2与hCD137**的结合，其中IC50为0.401纳摩尔。hCD137L*还阻断PF83与hCD137**的结合，其中IC50为1.037纳摩尔(表面保留30%结合信号)。hCD137L*对BMS20H4.9与hCD137**的结合没有可测量的作用。
抗体A1/2在与BMS20H4.9和PF83不同的特定氨基酸残基处结合人CD137
引入人CD137点突变来确定其中抗体A1/2、BMS20H4.9和PF83结合人CD137的氨基酸残基。使用市售的定点诱变试剂盒(Quickchange II试剂盒，Qiagen)的标准方案生成CD137-Fc突变体。表达并纯化野生型和突变型CD137-Fc蛋白。此处报道的所有突变体都具有与野生型CD137-Fc的大小排阻概况相似的大小排阻概况(即引入的突变不损害蛋白的结构完整性)。为了确定突变对抗体的结合的影响，利用针对CD137-Fc野生型和突变体的点ELISA测定法。将96-孔Immulon 4HBX ELISA板的孔在4℃下在温和搅拌下用100微升PBS(pH 7.2)中的50纳克人CD137-ECD-C121S-Fc或其突变体包被过夜。在封闭(用PBST中的5% BSA)并洗涤后，添加指定抗体的五倍稀释八点系列(100 – 0.00128纳摩尔)，并在室温下在温和搅拌下孵育1 h。洗涤孔并添加HRP-缀合的二抗(HRP-缀合的山羊抗-Fab抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories)的1:10000稀释液，并遵循标准方案在室温下孵育。根据制造商的说明使用TMB过氧化物酶显色底物和终止溶液用于信号的可视化和检测。每个浓度点的吸光度读数通过野生型相互作用的吸光度进行归一化。对于每种突变体，测定八个浓度的归一化比率的平均值。
将突变单独地在以下位置处引入人CD137 (SEQ ID NO:1)：P27、N42、D63、Q67、A97、G98、S100、M101、Q104、K114、K115、R130、I132、R134。表6表明BMS20H4.9和抗体A1/2对于人CD137的所示突变体的结合概况。表7表明PF83和抗体A1/2对于人CD137的所示突变体的结合概况。总体而言，表6和7表明，与BMS20H4.9和PF-83相比，抗体A1/2结合人CD137上不同的氨基酸残基。
表6
BMS20H4.9 (相对于野生型hCD137的结合的%) 抗体A1/2 (相对于野生型hCD137的结合的%)
P27L* 85 100
N42S* 0 100
D63N 100 100
Q67R 100 100
Q67V 100 100
A97P 100 15
G98K 100 85
G98Q 100 100
S100T 100 100
M101R 100 100
Q104K 100 100
K114E 100 20
K115Q 100 25
*表示如经由X-射线晶体学在6Ǻ确定的抗体A1/2的表位之外的位置。
表7
抗体A1/2 (相对于野生型hCD137的结合的%) PF83 (相对于野生型hCD137的结合的%)
K115Q 25 100
R130A* 100 100
R130H* 100 100
I132V* 100 100
R134Q* 100 25
*表示如经由X-射线晶体学在6Ǻ确定的抗体A1/2的表位之外的位置。
人肿瘤中的CD137基因表达
可以使用癌症基因组图谱(TCGA)数据库和计算方法分析人肿瘤免疫浸润物中的CD137基因表达概况。简而言之，从Omicsoft组织的TCGA RNASeq结果生成CD137/CD3e的表达比率。为了比较肿瘤样品和同一组织的邻近正常组织中的CD137/CD3e的表达比率，进行t-检验并计算每种肿瘤类型的Cohen's d。在肿瘤相比于正常组织的表达比率的t-检验中具有<0.05的P值和Cohen’s d > 0.8的大效应大小的肿瘤类型是统计学显著的。计算肿瘤相比于正常组织中的CD137/CD3e的表达比率的差异作为对数倍数变化(logFC)。
在如上所述进行的实验中，在不同的癌症类型(包括但不限于乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、膀胱癌和头颈癌)间观察到增加的肿瘤CD137/CD3比率(表8)。富含CD137+淋巴细胞的肿瘤是使用抗体A1、抗体A2或抗体A1/2的CD137抗体疗法的候选物。
表8
癌症 CD137/CD3表达比率(logFC) P值
膀胱癌 1.92 3.85E-03
乳腺癌 2.46 3.56E-39
胆管癌 1.78 4.81E-06
结肠癌 2.36 1.23E-19
子宫内膜癌 2.14 4.01E-15
食道癌 1.07 1.71E-04
胃癌 1.68 9.27E-10
头颈癌 1.90 8.06E-15
肺腺癌 1.37 2.63E-13
肺鳞状细胞癌 1.63 2.37E-13
前列腺癌 1.04 2.73E-04
直肠癌 1.62 1.40E-05
甲状腺癌 1.24 2.29E-06
抗体A1/2增加体内CD3+ T细胞肿瘤浸润
本文公开的抗体改变人源化小鼠模型中的T细胞肿瘤浸润的能力可以通过免疫组织化学(IHC)来确定。简而言之，将L55人非小细胞肺癌细胞(L55-CBG-2A-GFP, University ofPennsylvania)植入NSG小鼠中。当肿瘤的大小达到250-300 mm3时，将注射人PBMC (8 x 106个细胞)，并每周一次以10毫克/kg给药抗体，持续4周。在研究结束时，将肿瘤收集在福尔马林中，加工至石蜡中，切片，并用抗CD3抗体(Cell Signaling Technology)染色。使用Aperio XT ScanScope®以200倍放大倍率采集图像并进行半定量分析。使用AperioImageScope软件计算CD3阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分比。通过单向ANOVA比较结果，随后进行Holm-Sidak方法用于多重比较(Sigma Plot 12.5, Systat Software)。
在如上所述进行的实验中，抗体A1/2在L55建立的肿瘤中诱导CD3+ T细胞肿瘤浸润。与BMS20H4.9 (18%)或人IgG (27%)治疗相比，对抗体A1/2应答的CD3+ T细胞的百分比(60%)更高。
抗体A1/2和抗体B的组合
可以使用NCI-H292 Winn模型、HCC827人NSCLC模型和L55人NSCLC模型测试与抗人PD-L1抗体抗体B组合的抗体A1/2。NCI-H292 Winn模型如下使用。使用7周龄的雌性NOD/SCIDGamma (NSG)小鼠(Jackson Laboratories)。以近似80%-90%汇合度收获在其各自培养基中培养的人NSCLC细胞系NCI-H292 (ATCC; CRL-1848)，并以10 x 106个细胞/mL悬浮于HBSS中。如先前所述，从获得自纽约血液中心获得的全血单位分离人PBMC。PBMC与NCI-H292肿瘤细胞合并，肿瘤细胞与PBMC的比率为4:1。离心混合物，并将沉淀以10 x 106 个NCI-H292细胞和2.5 x 106个PBMC/mL的浓度重悬浮于HBSS中。在第0天，将每只小鼠在右侧腹皮下植入0.2 mL溶液。每个研究中包括仅接受肿瘤细胞的对照组。将小鼠随机分为5至8只小鼠的治疗组，并在第0天或第1天开始治疗。治疗组通常包括对照IgG、抗体A1/2、抗人PD-L1抗体(抗体B)以及抗体A1/2和抗体B的组合。除非指示，向动物以10 mg/kg腹膜内给药，每周一次，持续4周。对于Winn模型，抗体B以0.25 mg/kg给药，或者对于HCC827模型，抗体B以1 mg/kg给药，每周一次，持续4周。
将HCC827人NSCLC (ATCC; CRL-2868)和L55人NSCLC (University ofPennsylvania)肿瘤细胞系维持在其相应的培养基中并收获用于植入。将肿瘤细胞(每只小鼠，对于HCC827 (HBSS)，细胞数范围为10x106，且对于L55 (1:1 HBSS和Matrigel混合物)，细胞数范围为5x106)皮下注射至7周龄的雌性NOD/SCID Gamma (NSG)小鼠(JacksonLaboratories)的右侧腹中。当肿瘤大小达到近似250 mm3至400 mm3时，将小鼠随机分为5至8只小鼠的组。如先前所述，生成人扩增的T细胞。将扩增的T细胞(3 x 106至8 x 106)或PBMC(5 x 105至8 x 106)解冻并注射至小鼠中。作为对照，单独的肿瘤细胞不植入T细胞或植入PBMC。治疗在第0天或第1天开始。治疗组通常包括对照IgG、抗体A1/2、抗体B、抗体A1/2和抗体B的组合。向动物以10 mg/kg(除非另有指示) i.p.给药，每周一次，持续4周。
对于所有模型，每周两次记录体重(BW)，并且基本上如上所述计算BW的%变化。使用电子卡尺每周两次测量肿瘤体积，并且如上所述计算肿瘤体积。此外，如果△ < 0，则使用公式 = 100 x ∆T / T初始计算%消退。没有可测量肿瘤的动物被视为完全应答者(CR)，并且具有>50%消退的肿瘤是部分应答者(PR)。使用SAS软件(版本9.2)中的MIXED程序，通过按时间和治疗的方差的双向重复测量分析，进行肿瘤体积数据的统计分析。实施Bliss独立性分析以确定用测试的两种化合物的组合治疗与任一单一药物相比是累加的或大于累加的或小于累加的。对于高于基线的肿瘤体积，百分比应答为%ΔT/C，并且对于低于基线的肿瘤体积，百分比应答为%消退。比较(单药物治疗)-(组合治疗)的差异。在如所述进行的实验中，相对于用抗体A1/2或抗体B的单一疗法，抗体A1/2和抗体B的组合提供了累加的肿瘤生长抑制，如表9中所示。
表9
Figure DEST_PATH_IMAGE003
*Bliss独立性方法
Figure 347969DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 190023DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 585232DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE009
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Claims (39)

1. 治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体与有效量的抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体的组合；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3。
2. 权利要求1的方法，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。
3. 权利要求1的方法，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。
4. 权利要求1的方法，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链。
5. 权利要求1的方法，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述抗人PD-L1抗体是阿特朱单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗。
7. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。
8. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆道癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、直肠癌或甲状腺癌。
10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述癌症是胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌或透明细胞肾癌。
11.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述癌症是膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或肾细胞癌。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与电离辐射组合施用。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与一种或多种化疗剂组合施用。
14. 抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体，其用于与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次组合用于治疗癌症，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3。
15. 权利要求14所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。
16. 权利要求14所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。
17. 权利要求14所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链。
18. 权利要求14所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链。
19.权利要求14-18中任一项所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人PD-L1抗体是阿特朱单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗。
20. 权利要求14-18中任一项所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。
21. 权利要求14-18中任一项所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
22.权利要求14-21中任一项所用的抗人CD137抗体，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆道癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、直肠癌或甲状腺癌。
23.权利要求14-21中任一项所用的抗人CD137抗体，其中所述癌症是胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌或透明细胞肾癌。
24.权利要求14-21中任一项所用的抗人CD137抗体，其中所述癌症是膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或肾细胞癌。
25.权利要求14-24中任一项所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与电离辐射组合施用。
26.权利要求14-25中任一项所用的抗人CD137抗体，其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与一种或多种化疗剂组合施用。
27. 抗人CD137 (SEQ ID NO:1)抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中所述药物待与抗人PD-L1 (SEQ ID NO:26)抗体同时、分开或依次施用；其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID:2的氨基酸序列的HCDR1，具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR2，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR3，具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR1，具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的LCDR2，和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR3。
28. 权利要求27的用途，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区。
29. 权利要求27的用途，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。
30. 权利要求27的用途，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链。
31. 权利要求27的用途，其中所述抗人CD137抗体包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链。
32.权利要求27-32中任一项的用途，其中所述抗人PD-L1抗体是阿特朱单抗、德瓦鲁单抗或阿维鲁单抗。
33. 权利要求27-32中任一项的用途，其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。
34. 权利要求27-32中任一项的用途，其中所述抗人PD-L1抗体包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
35.权利要求27-34中任一项的用途，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、胆道癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、直肠癌或甲状腺癌。
36.权利要求27-34中任一项的用途，其中所述癌症是胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌或透明细胞肾癌。
37.权利要求27-34中任一项的用途，其中所述癌症是膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌或肾细胞癌。
38.权利要求27-37中任一项的用途，其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与电离辐射组合施用。
39.权利要求27-38中任一项的用途，其中所述抗人CD137抗体和抗人PD-L1抗体中的至少一种与一种或多种化疗剂组合施用。
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