CN106636159A - 一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法 - Google Patents

一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，该方法包括以下步骤：S1：设计基因：在基因上加入HIS标签和GST标签；S2：表达和破碎；S3：第一步纯化：过Ni柱，然后用洗脱液洗脱，纯度能够达到90％以上；S4：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白过GST柱，纯度能够达到95～98.5％，用洗脱液洗脱目标蛋白。本发明所得到的蛋白纯度大大的提高，且本方法操作比较简单，后处理简单、耗时短，蛋白活性高，蛋白不会出现不希望的凝集或沉淀等而导致蛋白损失，且处理过程中不会引入大量的盐而影响后期实验，具有重要的工业应用前景。

Description

一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法
技术领域
本发明涉及生物领域中的蛋白表达、提取以及纯化，具体涉及一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法。
背景技术
大肠杆菌蛋白的表达涉及到蛋白的可溶性，对于疏水性蛋白来说后期处理比较麻烦，因为蛋白过完Ni柱之后涉及到咪唑的处理，现在传统的工艺就是透析或者加疏水柱，但是透析容易出现蛋白凝集，产生大量沉淀，损失量高，导致目标蛋白的产量降低，蛋白活性低，耗时时间长；而加疏水柱后期洗脱会加入大量的氯化钠，高盐对于后期实验有影响，所以这两种方法对于有些疏水性强的蛋白来说很不合适。更重要的是，目前均采用单标签的方式，而像GST标签等均为蛋白类物质，因此体系中同时会存在相应标签的游离的杂蛋白，导致除去困难或无法除去等，致使蛋白质纯度降低，且后处理工艺复杂。
此外，对于大肠杆菌破碎而言，传统的大肠杆菌破碎工艺为超声破碎和高压匀浆；高压匀浆仪价格昂贵，而且仪器出故障的概率高，维修费用高。超声破碎的方法缺点很多，比如由于超声会产生持续的热量，这样会降低蛋白的活性，还破坏蛋白的结构，造成蛋白量的损失。还有就是超声破碎对体积有要求，体积不能过大，体积过大，超声时间越长，产生的热量也会增加，对蛋白影响会更严重。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷提供了一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，所述方法包括以下步骤：
S1：设计基因：设计所要表达的蛋白的基因，并在所述基因上插入HIS标签和GST标签；
S2：表达：将已插入HIS标签和GST标签的基因转入大肠杆菌内进行相关蛋白的表达；
S3：破碎：破碎大肠杆菌体；
S4：第一步纯化：过Ni柱，除去包括游离GST杂蛋白在内的大量杂质，然后用第一洗脱液洗脱，纯度能够达到90%以上，所述第一洗脱液包括咪唑；
S5：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白过GST柱，除去包括咪唑在内的杂质，纯度能够达到95～98.5%，用第二洗脱液洗脱目标蛋白；所述第二洗脱液包括还原型谷胱甘肽。
进一步地，步骤S4中所述的第一洗脱液还包括NaCl和Tris。
进一步地，步骤S4中所述的第一洗脱液中各种成分的浓度为：咪唑200～250Mmol，NaCl0.5Mmol，Tris20Mmol。
进一步地，步骤S5中所述的第二洗脱液还包括Tris。
进一步地，所述提取纯化方法还包括第三步纯化，所述第三步纯化为：将步骤S5洗脱下来的目标蛋白再过脱盐柱。
进一步地，步骤S3中所述破碎的具体方法为：①收集步骤S2中完成蛋白表达的大肠杆菌，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液，混匀，静置；②将步骤①的蔗糖溶液稀释，混匀，静置；③加入饱和硫酸铵溶液，静置；④离心，弃上清；⑤将步骤④得到的沉淀溶解，即可进行步骤S5的纯化。
更进一步地，步骤S3中所述破碎的具体方法为：①收集步骤S2中完成蛋白表达的大肠杆菌，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液，混匀，静置0.5～2h；所述蔗糖溶液的溶度为40%以上；所述大肠杆菌与蔗糖溶液的比例为：2g:(50～100)mL；②将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液稀释至浓度为15～25%，混匀，静置0.5～2h；③加入浓度为30～50%的饱和硫酸铵溶液，静置0.5～2h；④离心，弃上清；⑤将步骤④得到的沉淀再溶解，即可进行步骤S5的纯化；步骤①～③中所述的浓度均为质量/体积浓度。
进一步地，所述蔗糖溶液中的溶剂为水、PBS或Tris溶液。
进一步地，步骤④所述的离心为在12000r/min下离心15min。
本发明至少具有以下有益效果：
本发明在过Ni柱时不仅可以除去大量的杂质，还可除去游离的GST杂蛋白，过GST柱可除去咪唑等，所得到的蛋白纯度大大的提高，提高幅度达到了10～17%，在成熟、成型的本技术领域中能够达到如此改进并实现如此效果实属不易。
本发明的方法对于所要提取纯化的蛋白质的类型没有任何要求，亲水性蛋白质和疏水性蛋白质均可，对于结果没有影响。
本发明方法操作比较简单，后处理简单、耗时短，蛋白活性高，蛋白不会出现不希望的凝集或沉淀等而导致蛋白损失，且处理过程中不会引入大量的盐而影响后期实验。
此外，本发明采用蔗糖梯度方法使大肠杆菌破碎，过程比较简单，方法比较温和，在低温下进行，不会影响蛋白活性，提取效率比超声破碎高，和高压匀浆提取效率等同，不需要大型的仪器，所用试剂比较便宜，所以成本比较低，适合实验室的生产用。
综上，本发明的优势明显，具有重要的工业应用前景。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明出现的Tris和PBS均为生物领域常用试剂，Tris的中文名为三羟甲基氨基甲烷；PBS缓冲液是磷酸缓冲盐溶液；HIS标签和GST标签是蛋白纯化过程中常用的标签，HIS指组氨酸，GST指谷胱甘肽巯基转移酶。
实施例1
本发明实施例所述的一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，该方法包括以下步骤：
S1：设计基因：设计所要表达的蛋白的基因，并在所述基因上加入HIS标签和GST标签；
S2：表达：将加入了HIS标签和GST标签的基因转入大肠杆菌内进行相关蛋白的表达；
S3：破碎：破碎大肠杆菌体；
S4：第一步纯化：过Ni柱，除去包括游离GST杂蛋白在内的大量杂质，然后用洗脱液洗脱，纯度能够达到93%，该洗脱液的成分包括NaCl、Tris和咪唑，其浓度为：咪唑210Mmol，NaCl 0.5M，Tris 20Mmol。
S5：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白过GST柱，除去咪唑，然后用洗脱液洗脱目标蛋白，纯度能够达到97.5%，所述洗脱液包括10MM还原型谷胱甘肽和20MM Tris。
实施例2
本发明实施例所述的一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，该方法包括以下步骤：
S1：设计基因：设计所要表达的蛋白的基因，并在基因上加入双标签，即HIS标签和GST标签；
S2：表达：将加入了HIS标签和GST标签的基因转入大肠杆菌内进行相关蛋白的表达；
S3：破碎：破碎大肠杆菌体；
S4：第一步纯化：过Ni柱，除去包括游离GST杂蛋白在内的大量杂质，然后用洗脱液洗脱，纯度能够达到94%，该洗脱液的成分包括NaCl、Tris和咪唑，其浓度为：咪唑220Mmol，NaCl 0.5M，Tris 20Mmol。
S5：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白过GST柱，除去咪唑，然后用洗脱液洗脱目标蛋白，该洗脱液包括10Mmol还原型谷胱甘肽和20Mmol Tris。
S6：第三步纯化：将步骤S5洗脱下来的目标蛋白再过脱盐柱，最后所得的目标蛋白的纯度能够达到98.5%。
实施例3
本发明实施例所述的一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，该方法包括以下步骤：
S1：设计基因：设计所要表达的蛋白的基因，并在基因上加入双标签，即HIS标签和GST标签；
S2：表达：将加入了HIS标签和GST标签的基因转入大肠杆菌内进行相关蛋白的表达；
S3：破碎：破碎大肠杆菌体；
S4：第一步纯化：过Ni柱，除去包括游离GST杂蛋白在内的大量杂质，然后用洗脱液洗脱，纯度能够达到91%，该洗脱液的成分包括NaCl、Tris和咪唑，其浓度为：咪唑220Mmol，NaCl 0.5M，Tris 20Mmol。
S5：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白过GST柱，除去咪唑，然后用洗脱液洗脱目标蛋白，该洗脱液包括10Mmol还原型谷胱甘肽和20Mmol Tris。
S6：第三步纯化：将步骤S5洗脱下来的目标蛋白再过脱盐柱，最后所得的目标蛋白的纯度能够达到95%。
实施例4
实施例1和2中步骤S3中破碎的具体方法为：
①收集完成蛋白表达的大肠杆菌2g，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液80mL，混匀，4℃的冰箱内静置1h；该蔗糖溶液为饱和的蔗糖水溶液，饱和蔗糖水溶液的浓度约为50%，即将25g的蔗糖溶解于50ｍＬ的水中所得；
②静置后将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液用水稀释至浓度为20%，混匀，4℃的冰箱内静置1h；
③静置后在步骤②中加入饱和硫酸铵水溶液，加入至硫酸铵溶液的浓度降为40%，在4℃的冰箱内静置1h，蛋白沉淀，除去溶解了蔗糖等杂质的上清；液
④收集步骤③中沉淀的蛋白，并在12000r/min下离心15min，弃上清，收集沉淀；
⑤将步骤④得到的沉淀用PBS再溶解，即可进行步骤S5的纯化。
实施例5
实施例1和2中步骤S3中破碎的具体方法为：
①收集完成蛋白表达的大肠杆菌2g，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液10mL，混匀，4℃的冰箱内静置1.5h；该蔗糖溶液的溶度为45%的蔗糖溶液，该蔗糖溶液为将22.5g的蔗糖溶解于50mL的PBS溶液中所得；
②静置后将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液用PBS稀释至浓度为17%，混匀，4℃的冰箱内静置1.5h；
③静置后在步骤②中加入饱和硫酸铵溶液，加入至硫酸铵溶液的浓度降为35%，在4℃的冰箱内静置1.5h，蛋白沉淀，除去溶解了蔗糖等杂质的上清液；
④收集步骤③中沉淀的蛋白，在12000r/min下离心15min，弃上清，收集沉淀；
⑤将步骤④得到的沉淀用PBS复溶，即可进行步骤S5的纯化。
实施例6
实施例1和2中步骤S3中破碎的具体方法为：
①收集完成蛋白表达的大肠杆菌2g，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液50mL，混匀，4℃的冰箱内静置2h；该蔗糖溶液的溶度为40%的蔗糖溶液，该蔗糖溶液为将20g的蔗糖溶解于50mL的Tris溶液中所得；
②静置后将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液用Tris溶液稀释至浓度为15%，混匀，2℃的冰箱内静置2h；
③静置后在步骤②中加入饱和硫酸铵溶液，加入至硫酸铵溶液的浓度降为45%，在4℃的冰箱内静置2h，蛋白沉淀，除去溶解了蔗糖等杂质的上清液；
④收集步骤③中沉淀的蛋白，在15000r/min下离心15min，弃上清，收集沉淀；
⑤将步骤④得到的沉淀用Tris溶液复溶，即可进行步骤S5的纯化。
实施例4～6中均在4℃的低温下静置，主要是因为低温下蛋白更稳定，使用者可以根据实际需要选择温度，但均在本发明的保护范围内。此外，实施例3～5中的硫酸铵溶液的溶剂可以为水、PBS等。
对比例1
一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，该方法包括以下步骤：S1：设计基因：设计所要表达的蛋白的基因，并在所述基因上加入HIS标签；S2：表达：将加入了HIS标签的基因转入大肠杆菌内进行相关蛋白的表达；S3：破碎：破碎大肠杆菌体；S4：第一步纯化：过Ni柱，然后用洗脱液洗脱，该洗脱液的成分包括NaCl、Tris和咪唑，其浓度为：咪唑210Mmol，NaCl 0.5M，Tris 20Mmol。S5：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白采用透析，除去咪唑在内的杂质，用洗脱液洗脱目标蛋白，该洗脱液包括10Mmol还原型谷胱甘肽和20MmolTris，最终所得的目标蛋白纯度为到83%，蛋白损失率为8%。
由实施例1～3和对比例1可知，本发明的方法所得的蛋白质的纯度比现有技术所得蛋白质的纯度高12～15%，且由于透析容易出现蛋白凝集，产生大量沉淀，损失量高，因此，导致对比例1中的目标蛋白的损失率达到了8%。
本发明的方法没有太多杂蛋白，方法简单，所需时间较短，而对比例1中需要透析等过程，需要时间长且较为复杂，并且所得到的蛋白活性降低率高。此外，对比例1中的方法对于有些疏水性强的蛋白来说很不合适。
对比例2
一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，该方法包括以下步骤：S1：设计基因：设计所要表达的蛋白的基因，并在所述基因上加入GST标签；S2：表达：将加入了GST标签的基因转入大肠杆菌内进行相关蛋白的表达；S3：破碎：破碎大肠杆菌体；S4：第一步纯化：过GST柱，然后用洗脱液洗脱，该洗脱液的成分为还原型谷胱甘肽和Tris。S5：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白采用分子筛柱除去GST游离蛋白，最终得到的目标蛋白的纯度为82%。
由实施例2和对比例2可知，本发明的方法所得的蛋白质的纯度比现有技术所得蛋白质的纯度高12～16%。
此外，分子筛柱分离目标蛋白与GST游离蛋白所需时间长，且通常会出现蛋白凝集等损失。而本发明的方法没有太多杂蛋白，方法简单，所需时间较短。
对比例3
一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，该方法包括以下步骤：S1：设计基因：设计所要表达的蛋白的基因，并在所述基因上加入HIS标签；S2：表达：将加入了HIS标签的基因转入大肠杆菌内进行相关蛋白的表达；S3：破碎：破碎大肠杆菌体；S4：第一步纯化：过Ni柱，然后用洗脱液洗脱，该洗脱液的成分包括NaCl、Tris和咪唑，其浓度为：咪唑210Mmol，NaCl 0.5M，Tris 20Mmol。S5：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白采用疏水柱，除去咪唑在内的杂质，用洗脱液洗脱目标蛋白，该洗脱液包括10MM还原型谷胱甘肽和20MMTris，最终所得的目标蛋白纯度为到85%。
由实施例3和对比例3可知，本发明的方法所得的蛋白质的纯度比现有技术所得蛋白质的纯度高11%，而且由于加疏水柱后期洗脱会加入大量的氯化钠，高盐对于后期实验有影响，因此，对比例3中的方法对于有些疏水性强的蛋白来说很不合适。
此外，本发明的方法没有太多杂蛋白，方法简单，所需时间较短，而对比例需要时间长且较为复杂，并且所得到的蛋白活性降低率高。
具体实施时，Ni柱、GST柱以及脱盐柱等均为市售的常用亲和层析柱。本发明中所提到的浓度均为质量与体积比浓度。
最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
S1：设计基因：设计所要表达的蛋白的基因，并在所述基因上插入HIS标签和GST标签；
S2：表达：将已插入HIS标签和GST标签的基因转入大肠杆菌内进行相关蛋白的表达；
S3：破碎：破碎大肠杆菌体；
S4：第一步纯化：过Ni柱，除去包括游离GST杂蛋白在内的大量杂质，然后用第一洗脱液洗脱，纯度能够达到90％以上，所述第一洗脱液包括咪唑；
S5：第二步纯化：将步骤S4中洗脱下来的目标蛋白过GST柱，除去包括咪唑在内的杂质，纯度能够达到95～98.5％，用第二洗脱液洗脱目标蛋白；所述第二洗脱液包括还原型谷胱甘肽。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤S4中所述的第一洗脱液还包括NaCl和Tris。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤S4中所述的第一洗脱液中各种成分的浓度为：咪唑200～250Mmol，NaCl0.5Mmol，Tris20Mmol。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤S5中所述的第二洗脱液还包括Tris。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：所述提取纯化方法还包括第三步纯化，所述第三步纯化为：将步骤S5洗脱下来的目标蛋白再过脱盐柱。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤S3中所述破碎的具体方法为：①收集步骤S2中完成蛋白表达的大肠杆菌，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液，混匀，静置；②将步骤①的蔗糖溶液稀释，混匀，静置；③加入饱和硫酸铵溶液，静置；④离心，弃上清；⑤将步骤④得到的沉淀溶解，即可进行步骤S5的纯化。
7.根据权利要求6所述的大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤S3中所述破碎的具体方法为：①收集步骤S2中完成蛋白表达的大肠杆菌，并在大肠杆菌中加入蔗糖溶液，混匀，静置0.5～2h；所述蔗糖溶液的溶度为40％以上；所述大肠杆菌与蔗糖溶液的比例为：2g:(50～100)mL；②将步骤①中混合有大肠杆菌的蔗糖溶液稀释至浓度为15～25％，混匀，静置0.5～2h；③加入浓度为30～50％的饱和硫酸铵溶液，静置0.5～2h；④离心，弃上清；⑤将步骤④得到的沉淀再溶解，即可进行步骤S5的纯化；步骤①～③中所述的浓度均为质量/体积浓度。
8.根据权利要求6或7所述的大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：所述蔗糖溶液中的溶剂为水、PBS或Tris溶液。
9.根据权利要求6或7所述的大肠杆菌表达蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤④所述的离心为在12000r/min下离心15min。
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