CN104164416A

CN104164416A - 一种从鲜奶中高效提取核酸的方法

Info

Publication number: CN104164416A
Application number: CN201310181887.4A
Authority: CN
Inventors: 杨丰利; 李小杉
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2014-11-26

Abstract

本发明涉及一种从鲜奶中高效提取核酸的方法，属生物工程应用技术领域，其特征在于包括如下步骤：（1）、二次向鲜奶样品中加入生理盐水，经混合离心后，弃去脂肪层和上层液体，得沉淀A；（2）、向沉淀A中加入TES溶液、盐酸胍溶液和蛋白酶K溶液；经水浴后室温冷却，再加入Tris饱和酚，经抽提离心后，取上清液B；（3）、向上清液B中加入乙酸钠溶液和异丙醇，经混合离心后，弃上清，得核酸溶于双蒸水中，-20℃保存备用。本发明能有效地排除脂肪和蛋白质对核酸提取的影响，具有从多种鲜奶中方便有效地提取核酸、提取核酸的浓度和纯度高、方法简单的特点。

Description

一种从鲜奶中高效提取核酸的方法

技术领域：

本发明涉及一种从鲜奶中高效提取核酸的方法，属生物工程应用技术领域。

背景技术：

近年来，分子生物学的发展促进了在动物方面研究的深度和广度。长期以来，家畜核酸的来源和提取主要源于家畜的血液，而家畜血液的采集对家畜有一定的应激反应，同时也有一定的难度，而鲜奶的采集就比较容易了。从样品中提取的核酸是进行病原微生物检测、物种鉴定、物种起源、物种多样性评估及其亲缘关系、物种系统进化等研究的必要材料。然而，在鲜奶中含有大量的脂肪和丰富的蛋白质，这对于提取鲜奶中的核酸造成了很大的困难，导致提取的核酸纯度不够和浓度很低。能否提取出高质量的核酸分子则是核酸分子生物学实验的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续实验的成败。传统的核酸抽提方法主要包括异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、碱抽提法、溴化十六烷基三甲铵抽提法、溴化乙锭-氯化铯梯度离心法和寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸-纤维素层析法等。这些方法都难以有效去除鲜奶中的脂肪和蛋白质，以至所获得的核酸纯度不够，致使严重影响后续研究的开展，甚至无法进行后续的研究。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从鲜奶中高效提取核酸的方法，能有效地排除脂肪和蛋白质对核酸提取的影响，具有从多种鲜奶中方便有效地提取核酸、提取核酸的浓度和纯度高、方法简单的特点。

本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。

本发明所提供的一种从鲜奶中高效提取核酸的方法，包括如下步骤：

（1）、取鲜奶样品，向鲜奶样品中加入其体积50%的生理盐水，混合均匀，13000转/分钟、4℃离心10分钟，弃去脂肪层和上层液体；再向余下的液体中加入鲜奶样品等体积的生理盐水，混合均匀，13000转/分钟、4℃离心10分钟，弃去脂肪层和上层液体，得沉淀A；

所述的鲜奶样品为奶牛鲜奶、水牛奶鲜奶或羊奶鲜奶；

（2）、向沉淀A中加入86%鲜奶样品体积的TES溶液、10%鲜奶样品体积的盐酸胍溶液和4%鲜奶样品体积的蛋白酶K溶液；50℃水浴12小时，室温冷却，再加入50%鲜奶样品体积的Tris饱和酚，抽提10分钟，13000转/分钟、4℃离心5分钟，取上清液B，弃沉淀；

所述的TES溶液，其Tris-HCl终浓度为50mmol/L；EDTA终浓度为10mmol/L；SDS终浓度为1%；pH值为8.0；

所述的盐酸胍溶液的浓度为5mol/L；

所述的蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL；

所述的Tris饱和酚为市售成品；

（3）、取上清液B，向上清液B中加入10%上清液B体积的乙酸钠溶液和80%上清液B体积的异丙醇，混合均匀，沉淀核酸，13000转/分钟、4℃离心10分钟，弃上清，得核酸溶于10%鲜奶样品体积的双蒸水中，-20℃保存备用；

所述的乙酸钠溶的浓度为3mol/L、pH值为5.2；

所述的异丙醇为市售成品。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1、本发明采用两次加入生理盐水、高速冷冻离心的方法，使鲜奶中的脂肪对提取核酸过程没有影响，提高了核酸提取的纯度。

2、本发明采用盐酸胍和蛋白酶K对蛋白质的分解消化以及Tris饱和酚对蛋白质的分离，使后续沉淀核酸的过程中只含有极其微量的蛋白质，使提取的核酸的浓度和纯度都很高。

3、本发明能有效地排除脂肪和蛋白质对核酸提取的影响，具有从多种鲜奶中方便有效地提取核酸、提取核酸的浓度和纯度高、方法简单的特点。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

1、试剂（试剂均为分析纯或生物级别）

生理盐水；TES溶液（Tris-HCl终浓度为50mmol/L；EDTA终浓度为10mmol/L；SDS终浓度为1%；pH值为8.0）；盐酸胍溶液（5mol/L）；蛋白酶K溶液（20mg/mL）；乙酸钠溶液（3mol/L，pH值为5.2）；Tris饱和酚；异丙醇。

2、仪器设备及材料

高速冷冻离心机（至少满足13 000转/分钟、4℃）；超纯水发生器（分子生物学级别）；恒温水浴锅；冰箱（2℃～8℃、-20℃）；微量可调移液器及配套吸头（10μl～100μl，50μl～200μl，100μl～1000μl）；离心管（1.5mL、2mL）。

3、实验方法

（1）、取水牛奶鲜奶样品1000μl，加入500μl生理盐水，混合均匀，13000转/分钟、4℃离心10分钟，弃去脂肪层和上层液体，再加入1000μl生理盐水，混合均匀，13000转/分钟、4℃离心10分钟，弃去脂肪层和上层液体，得沉淀A；

（2）向步骤（1）的沉淀A中加入860μl TES溶液、100μl浓度为5mol/L的盐酸胍溶液和40μl浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，50℃水浴12小时，室温冷却，再加入500μl Tris饱和酚，抽提10分钟，13000转/分钟、4℃离心5分钟，取上清液B，弃沉淀；

（3）取步骤（2）的上清液B，加入10%上清液B体积、浓度为3mol/L、pH值为5.2的乙酸钠溶液和80%上清液B体积的异丙醇，混合均匀，沉淀核酸，13000转/分钟、4℃离心10分钟，弃上清，得核酸溶于100μl的双蒸水中，-20℃保存备用。

4、结果

水牛奶鲜奶体细胞数（SCC）以及提取核酸的纯度和浓度如表1所示。

SCC范围：1.6万/ml～193.4万/ml，浓度范围：2789.1ng/μl～7280.7ng/μl，A260/A280范围：1.56～2.17。

经SPSS统计分析，SCC与核酸的浓度之间的相关系数为0.716。

表1水牛奶鲜奶核酸提取结果

Claims

1.一种从鲜奶中高效提取核酸的方法，其特征在于包括如下步骤：

（3）、取上清液B，向上清液B中加入10%上清液B体积的乙酸钠溶液和80%上清液B体积的异丙醇，混合均匀，沉淀核酸，13000转/分钟、4℃离心10分钟，弃上清，得核酸溶于10%鲜奶样品体积的双蒸水中，-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种从鲜奶中高效提取核酸的方法，其特征在于所述的TES溶液，其Tris-HCl终浓度为50mmol/L；EDTA终浓度为10mmol/L；SDS终浓度为1%；pH值为8.0；所述的盐酸胍溶液的浓度为5mol/L；所述的蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL；所述的乙酸钠溶液的浓度为3mol/L、pH值为5.2。

3.根据权利要求2所述的一种从鲜奶中高效提取核酸的方法，其特征在于所述的鲜奶样品为奶牛鲜奶、水牛奶鲜奶或羊奶鲜奶。