CN110257424A

CN110257424A - 一种定点编辑ccr5基因的方法

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Publication number: CN110257424A
Application number: CN201810198471.6A
Authority: CN
Inventors: 祝海宝; 罗思施; 陶米林; 李恬婧; 陈梓珊; 黄雨亭
Original assignee: Guangdong Medical Technology Co Ltd Chi Chi
Current assignee: Guangdong Medical Technology Co Ltd Chi Chi
Priority date: 2018-03-12
Filing date: 2018-03-12
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2038-03-12
Also published as: CN110257424B

Abstract

本发明涉及感染性疾病免疫技术领域，尤其涉及一种定点编辑CCR5基因的方法。本发明根据hTRIM5/CypA基因和人的CCR5基因，构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体；然后将基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体和同源重组供体系统共同转染到受体细胞系中，从而获取CCR5基因被定点插入hTRIM5/CypA基因的细胞系。由于CCR5位点是开放位点，所以插入的外源hTRIM5/CypA会持续稳定表达，同时不表达CCR5基因，从而使该细胞不仅能抵御R5噬性HIV‑1病毒的侵染，同时也能抵御X4噬性HIV病毒的侵染。

Description

一种定点编辑CCR5基因的方法

技术领域

本发明涉及感染性疾病免疫技术领域，尤其涉及一种定点编辑CCR5基因的方法。

背景技术

HIV-1是一种能感染人类导致人类免疫缺陷的RNA病毒。HIV-1病毒入侵人体后，通过与细胞表面的CD4受体结合，在辅助受体CCR5或CXCR4的参与作用下，进入CD4T淋巴细胞，在该细胞内增殖复制，使CD4T淋巴细胞大量损耗，病毒释放到血液形成HIV血症。人体感染HIV后，会导致免疫缺陷并引发一系列机会性感染及肿瘤，致死率高。临床上主要采用联合用药的方式治疗艾滋病,即俗称“鸡尾酒疗法”的高效抗逆转录病毒疗法——Highlyactive anti-retroviral therapy(HAART)。鸡尾酒疗法通常由两种逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂组成，利用不同靶标、不同作用环节的抗HIV药物的协同作用，有效地抑制HIV在人体内的复制，大大降低了艾滋病的发病率和死亡率，延长患者寿命。但现有的大多数蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂只有在HIV进入宿主细胞内并开始复制之后才能发挥作用，无法完全清除体内的HIV病毒。并且长期用药还易导致病毒对药物的耐受，毒副作用大，还存在费用高昂等突出问题。面对艾滋病全球蔓延的形势以及现有药物的局限性，临床上迫切需要高效低毒、使用方便、价格便宜的新型抗HIV药物及治疗方案，因此新治疗方案的开发已成为研究热点，目前广受关注方案有如下几种。

一、对HIV-1进入人体的关键受体进行基因编辑或敲除。

研究表明，利用RNA干扰降低CCR5基因的表达量，或通过基因敲除技术定点敲除CCR5基因，能使CD4T细胞有效抵御HIV-1的侵染，该方法已经逐渐走向临床。CCR5基因属于G蛋白偶联的7跨膜受体家庭的一员，其基因位于人类3号染色体短臂，全长约6000bp,有4个外显子，蛋白长度为352的氨基酸，是R5嗜性HIV-1感染CD4T细胞的辅助受体(HIV-1感染机理如图1所示)。同时，CCR5还是一个基因安全港(safe harbor gene)。将外源基因整合到CCR5基因位点，该外源基因不会对细胞产生有毒副作用，同时该外源基因能够长时稳定的高表达。

近几年基因编辑技术获得突破性的发展，尤其是第三代基因编辑技术CRISPR更具有明显的优势，如构建简单，效率高，操作简便等。CRISPR系统包含以下几个部分：1)PAM位点，位于靶序列的下游，只有几个nt(例如，spCAS9/NGG；saCAS9/NNGRRT),根据此位点来选取靶序列；2)靶序列，识别并与切割位点结合的序列，一般在20nt左右；3)TracRNA,连接与靶序列之后的一段回文RNA序列；4)Cas9内切酶，具有独立酶活性。Cas9含有2个独特的活性位点，分别为氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH。Cas9中的HNH活性位点剪切gRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链。而Nickase(缺口酶)为Cas9蛋白的突变体，其RuvC或HNH活性位点失活，使其只能切割目的序列的其中一条DNA链，从而形成DNA单链缺口。CRISPR的工作原理如图2所示，sgRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的活性位点剪切DNA的两条链或一条链(Nickase)，最终引入DNA双链断裂(DSB)或单链断裂(SSB)。DSB有两种修复方式：一种是非同源末端连接(NHEJ)，一种是同源重组(HR)，当同源重组片段存在的情况下倾向于后者。SSB有两种修复方式：一是以未断裂的互补链为模板进行修复，一种是在同源重组片段存在的情况下以同源重组(HR)的方式进行修补。利用上述原理可以对特定基因进行突变敲除或定点编辑，相较于目前普遍采用的随机整合(将外源DNA片段随机插入到宿主细胞的基因组)，定点基因编辑的安全风险更加可控，尤其是利用Nickase单链切割介导的同源重组,更是将脱靶突变的安全风险降到最低。

二、新型抗病毒药物开发。

虽然HIV对人的感染性很强，但对于与人进化关系非常近的灵长类动物，其感染性却截然不同。在新大陆猴中，鹰猴表现出对HIV-1有明显的限制作用，而在旧大陆猴中，恒河猴、食蟹猴等也不能被感染，HIV-1进入细胞后，被整合到宿主细胞基因组之前，其生命周期会被阻断。研究发现，TRIM5a基因在进化过程中的突变，可能是导致猿长类动物在抵抗HIV-1感染上出现差异的重要原因之一。TRIM家族蛋白又称RBCC蛋白，因所有TRIM蛋白均具有三个结构域RING,Box,和Coiled-coil而得名。TRIM5a是TRIM5转录产物中最长的选择性剪接体,相比其他的TRIM5分子及其他TRIM蛋白家族成员在C末端多了一个B30.2/SPRY结构域。TRIM5a可识别并降解病毒的衣壳蛋白，从而抵抗多种反转录病毒，可能是一种重要的先天性免疫因子。然而，人类的TRIM5a基因在进化过程中已经失去了限制HIV-1病毒复制的能力。

通过对鹰猴TRIM5基因型的研究发现，一个LINE-1(Long interspersed nuclearelement 1)逆转座子催化一个CYPA(Cyclophilin A)假基因的cDNA序列通过逆转座的方式插入到TRIM5a基因的第7与第8外显子之间的内含子中，从而形成了TRIM5a-CYPA融合基因(图3)。CYPA属于亲环素家族，是一种高度保守的蛋白质，主要存在于细胞质内。CYPA的结合位点是由亲水性的亚口袋A和疏水性的亚口袋B组成，该位点能够与衣壳蛋白N末端中连接螺旋4和5之间氨基酸环相结合，并通过疏水作用及氢键来维持CYPA与衣壳蛋白的结合。普遍认为CYPA具有异构酶活性，可影响HIV-1衣壳蛋白的折叠和组装。研究发现，与HIV-1衣壳相结合的CYPA的脯氨酸异构可以增强TRIM5a对衣壳蛋白的抑制活性。TRIM5a或TRIM5a-CYPA蛋白药可能是未来抗HIV药物的重要研发方向。

最接近的现有技术：

利用慢病毒载体，将干扰CCR5基因表达的shRNA，以及TRIM5a基因随机整合到细胞基因组中，使得目的细胞的CCR5基因表达量下降并且TRIM5a基因过表达，从而提高细胞对HIV-1病毒攻击的抵抗能力。

最接近的现有技术存在缺点：

慢病毒为一种整合型逆转录病毒，利用慢病毒载体将CCR5shRNA及TRIM5a基因随机整合到细胞基因组，是一个不可控、不可逆的过程，一旦整合到生理代谢、疾病及癌症等相关的基因位点，将引发致命的安全风险。

本发明提供一种定点编辑CCR5基因的方法，该方法(如图4)一方面使得CCR5基因被敲除，从而降低CCR5基因的表达量，抵御R5嗜性HIV病毒的侵染，另一方面在基因安全港CCR5基因中插入hTRIM5/CypA基因及其启动子，使hTRIM5/CypA基因稳定的表达降解病毒衣壳蛋白，所以能抵御X4噬性HIV-1病毒的侵染。本发明不仅对HIV-1病毒的攻击起到了双重抵抗效果，更重要的是，与现有技术相比，本发明提供的技术方案可有效控制hTRIM5/CypA基因的插入位点，使得hTRIM5/CypA基因定点插入CCR5基因，为HIV-1感染的治疗提供一套更安全、更可控的方案。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种定点编辑CCR5基因的方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于，其是根据hTRIM5/CypA基因和人的CCR5基因，构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体；然后将基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体和同源重组供体系统共同转染到受体细胞系中，从而获取CCR5基因被定点插入hTRIM5/CypA基因的细胞系。

优选地，所述方法包括以下步骤：步骤一，设计并筛选CRISPR/Cas9敲除人CCR5基因的高效的gRNA靶序列，构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体；步骤二，根据步骤一筛选的gRNA靶序列，设计并克隆上游同源臂序列和下游同源臂序列，克隆hTRIM5/CypA基因序列，构建同源重组供体系统；步骤三，将构建好的基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体和同源重组供体系统共同转染受体细胞系；步骤四，利用基因组PCR验证hTRIM5/CypA基因序列在CCR5基因位点的定点整合；步骤五，用P24蛋白含量检测法验证在CCR5基因位点定点整合hTRIM5/CypA基因的细胞对HIV-1病毒的抵抗能力。

优选地，所述的gRNA包括gRNA或gRNA的组合。

优选地，所述受体细胞系包括造血干细胞或T淋巴细胞。

优选地，所述基于CRISPR/Cas9系统的载体为px458载体。

优选地，所述gRNA的靶序列为SEQ ID NO:2。

优选地，所述的同源重组供体系统包括上游同源臂序列SEQ ID NO:5，下游同源臂序列SEQ ID NO:8，hTRIM5/CypA基因编码序列SEQ ID NO:10。

优选地，所述hTRIM5/CypA基因的启动子和hTRIM5/CypA基因序列位于上游同源臂序列和下游同源臂序列之间，所述hTRIM5/CypA基因的启动子序列位于hTRIM5/CypA基因序列的上游。

本发明地有益效果是，利用CRISPR/Cas9系统介导hTRIM5/CypA基因定点整合到CCR5基因位点，一方面使得CCR5基因被敲除，从而降低CCR5基因的表达量，抵御R5嗜性HIV病毒的侵染，另一方面在基因安全港CCR5基因中插入hTRIM5/CypA基因及其启动子，使hTRIM5/CypA基因稳定地表达降解病毒衣壳蛋白，所以能抵御X4噬性HIV-1病毒的侵染。本发明不仅对HIV-1病毒的攻击起到了双重抵抗效果，更重要的是，本发明提供的技术方案可有效控制hTRIM5/CypA基因的插入位点，使得hTRIM5/CypA基因定点插入CCR5基因，为HIV-1感染的治疗提供一套更安全、更可控的方案。

附图说明

图1为HIV1感染细胞过程模式图；

图2为第三代基因编辑技术CRISPR的原理图；

图3为鹰猴TRIM5a-CYPA基因模式图；

图4为CRISPR/CAS9介导hTRIM5/CypA定点整合到CCR5基因位点技术模式；

图5为商业化质粒pX458的图谱；

图6为CRISPR-Cas9敲除CCR5基因的高效率gRNA筛选的部分T7E1检测结果电泳图；

图7为商业化质粒pDonor-TALEN-EGFP的图谱；

图8为改造质粒pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86-F的图谱；

图9为改造质粒pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86的图谱；

图10为改造质粒pDonor-EF1α-hTRIM5/CypA-EGFP-hCCR5F86的图谱；

图11为细胞基因组CCR5基因F86位点定点整合hTRIM5/CypA的序列示意图；

图12为Hela-CD4和Hela-CD4-hTRIM5/CypA细胞侵染X4嗜性病毒NL4-3第4天和第7天的培养液上清中P24蛋白含量比较；

图13为TZM-bl和TZM-bl-hTRIM5/CypA细胞侵染R5嗜性病毒NL4.3bal第4天和第7天的培养液上清中P24蛋白含量比较。

具体实施方式

以下实施例中使用到的实验材料包含：质粒pX458、质粒pDonor-TALEN-EGFP；大肠杆菌感受态细胞DH5α、Top10；限制性内切酶；HEK293T、HepG2细胞系；Hela-CD4细胞系；TZM-bl细胞系等。

实施例1CRISPR-Cas9敲除CCR5基因的高效率的gRNA筛选

1、gRNA准备

(1)根据CCR5基因的序列(包括外显子和与外显子比邻的内含子序列)设计20nt的gRNA序列，该gRNA在CCR5基因上的靶序列的3’-端为NGG；

(2)分别合成带粘性末端的靶序列正义链和反义链(正义链的5’-端加cacc，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在正义链的5’-端加caccG；在反义链的5’-端加aaac，若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G，则在反义链的3’-端加C)；

(3)将上述正义链和反义链混合，90℃处理后自然冷却至室温进行退火处理，合成带粘性末端的双链gRNA。

2、载体准备

(1)pX458质粒(图谱见图5)扩增和提取，并测定质粒浓度；

(2)采用限制性内切酶Bbs I对pX458进行酶切，37℃酶切1h后加loading buffer终止反应；

(3)琼脂糖凝胶电泳回收线性化质粒pX458，并测定回收产物浓度，-20℃保存备用。

3、连接转化

(1)将切胶回收的线性化pX458载体与退火后的gRNA双链进行连接反应；

(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏；

(3)将复苏后的TOP10细胞涂布LB固体平板(Amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h；

(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp+)中扩大培养；

(5)使用引物SeqF(5’-ATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3’)(SEQ IN NO:1)，对上述菌液分别测序；

(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

4、细胞转染

(1)HEK293T和HepG2细胞铺板；

(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将3(6)中提取的质粒分别转染HEK293T或HepG2细胞；特别注意的是，HEK293T细胞CCR5基因的其中一个等位基因在Δ32区存在突变，故对Δ32区内的gRNA的突变效率分析不宜采用HEK293T细胞，本方案中，我们对Δ32区内的gRNA的突变效率分析使用HepG2细胞。转染方法同HEK293T；

(3)转染后的细胞培养48小时，收集细胞。

5、T7E1酶切分析突变效率

(1)将上述4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；

(2)在gRNA结合位点上下游设计PCR引物，使扩增的目的片段约为750bp；

(3)分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段；

(4)纯化回收PCR产物，并测定产物浓度；

(5)将上述纯化的PCR产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；

(6)上述每管退火产物分别加入T7核酸内切酶1(T7E1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照组(不加T7E1，用ddH2O代替)，37℃酶切1h；

(7)2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，以Takara公司的DL1,000DNA Marker作为参照。

图6展示部分电泳检测结果：根据T7E1检测的原理，酶切效率越高表示该gRNA的突变效率越高，图中泳道F86的切割效率最高，对应的靶序列为

5′-tggtgacaagtgtgatcact-3′(SEQ ID NO:2)。选择SEQ ID NO:2作为hTRIM5/CypA基因定点整合CCR5基因的同源重组位点。本实施例所构建的插入了靶序列SEQ ID NO:2的质粒命名为pX458-F86。

实施例2hTRIM5/CypA基因定点整合CCR5位点的供体载体的构建

(一)CCR5F86上游同源臂F86-F的获得

pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86-F表达载体的构建

1、PCR扩增目的片段F86-F；

使用引物F86-SnaB I-L/F86-Sal I-R，以HepG2细胞基因组为模板，扩增F86-F目的片段。

F86-SnaB I-L(SEQ ID NO:3)：

5′-gttctagtggttggctacgtagcaccatgcttgacccagtttc-3′

F86-Sal I-R(SEQ ID NO:4)：

5′-tagcttatcgataccgtcgacGTCACCACCCCAAAGGTGAC-3′

所得的PCR产物序列中含有F86上游同源臂F86-F的DNA序列SEQ ID NO:5：

gcaccatgcttgacccagtttcttaaaattgttgtcaaagcttcattcactccatggtgctatagagcacaagattttatttggtgagatggtgctttcatgaattcccccaacagagccaagctctccatctagtggacagggaagctagcagcaaaccttcccttcactacaaaacttcattgcttggccaaaaagagagttaattCAATGTAGACATCTATGTAGGCAATTAAAAACCTATTGATGTATAAAACAGTTTGCATTCATGGAGGGCAACTAAATACATTCTAGGACTTTATAAAAGATCACTTTTTATTTATGCACAGGGTGGAACAAGATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCAATCTATGACATCAATTATTATACATCGGAGCCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTGCCTCCGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGCTGGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAATGTGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCTGTCGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTGGTGAC

2、表达载体准备

(1)将含载体pDonor-TALEN-EGFP(质粒图谱如图7所示)的大肠杆菌扩大培养，提取质粒pDonor-TALEN-EGFP；

(2)采用限制性内切酶SnaB I和Sal I-HF双酶切pDonor-TALEN-EGFP质粒，37℃酶切1h，80℃酶失活20min，-20℃保存备用。

3、重组反应

(1)将F86-F片段和线性化的pDonor-TALEN-EGFP载体进行同源重组反应，37℃反应30min后，马上置于冰浴上5min；

(2)上述重组产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏；

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。

(4)从上述平板上挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp+)中扩大培养；

(5)对上述菌液分别进行测序鉴定；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名

pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86-F(质粒图谱如图8所示)，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

(二)CCR5F86下游同源臂F86-R的获得及pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86表达载体的构建

1、PCR扩增目的片段F86-R；

使用引物F86-Not I-L/F86-BstB I-L，以HepG2细胞基因组为模板，扩增F86-R目的片段。F86-Not I-L(SEQ ID NO:6)：

5-cactagttctagagcggccgcgtggtggctgtgtttgcgtc-3′

F86-BstB I-L(SEQ ID NO:7)：

5-actgcaggctctagattcgaagccatgtgcacaactctgactg-3′

所得的PCR产物序列中含有F86下游同源臂F86-R的DNA序列SEQ ID NO:8：

GTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAAAAACTCTGCTTCGGTGTCGAAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTATCTTCACCATCATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCCTACAACATTGTCCTTCTCCTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCTAACAGGTTGGACCAAGCTATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATGACGCACTGCTGCATCAACCCCATCATCTATGCCTTTGTCGGGGAGAAGTTCAGAAACTACCTCTTAGTCTTCTTCCAAAAGCACATTGCCAAACGCTTCTGCAAATGCTGTTCTATTTTCCAGCAAGAGGCTCCCGAGCGAGCAAGCTCAGTTTACACCCGATCCACTGGGGAGCAGGAAATATCTGTGGGCTTGTGACACGGACTCAAGTGggctggtgacccagtcagagttgtgcacatggc

2、表达载体准备

(1)将含改造载体pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86-F的大肠杆菌扩大培养，提取质粒pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86-F；

(2)用限制性内切酶Not I-HF，在37℃酶切1h后，再加入BstB I在65℃酶切1h；

(3)上述酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，DNA Clean-up kit纯化pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86-F酶切线性化产物，并测定浓度，-20℃保存备用。

3、重组反应

(1)将F86-R片段和线性化的pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86-F载体进行同源重组反应，37℃反应30min后，马上置于冰浴上5min；

(5)对上述菌液分别进行测序鉴定；

(6)将测序正确的菌液提取质粒，命名为pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86(质粒图谱如图9所示)，并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。

(三)hTRIM5/CypA基因的获得及pDonor-EF1α-hTRIM5/CypA-hCCR5F86表达载体的构建

1、目的片段合成

(1)委外合成含hTRIM5/CypA基因编码序列和P2A自剪切序列的DNA片段，如SEQ IDNO:9所示：

(2)将SEQ ID NO:9插入到pUC19载体的Sma I位点，构建成pUC19-hTRIM5/CypA；

SEQ ID NO:9：

aagctttcagatccgctagcgctaccggtcgccaccATGGCTTCTGGAATCCTGGTTAATGTAAAGGAGGAGGTGACCTGCCCCATCTGCCTGGAACTCCTGACACAACCCCTGAGCCTGGACTGCGGCCACAGCTTCTGCCAAGCATGCCTCACTGCAAACCACAAGAAGTCCATGCTAGACAAAGGAGAGAGTAGCTGCCCTGTGTGCCGGATCAGTTACCAGCCTGAGAACATACGGCCTAATCGGCATGTAGCCAACATAGTGGAGAAGCTCAGGGAGGTCAAGTTGAGCCCAGAGGGGCAGAAAGTTGATCATTGTGCACGCCATGGAGAGAAACTTCTACTCTTCTGTCAGGAGGACGGGAAGGTCATTTGCTGGCTTTGTGAGCGGTCTCAGGAGCACCGTGGTCACCACACGTTCCTCACAGAGGAGGTTGCCCGGGAGTACCAAGTGAAGCTCCAGGCAGCTCTGGAGATGCTGAGGCAGAAGCAGCAGGAAGCTGAAGAGTTAGAAGCTGACATCAGAGAAGAGAAAGCTTCCTGGAAGACTCAAATACAGTATGACAAAACCAACGTCTTGGCAGATTTTGAGCAACTGAGAGACATCCTGGACTGGGAGGAGAGCAATGAGCTGCAAAACCTGGAGAAGGAGGAGGAAGACATTCTGAAAAGCCTTACGAACTCTGAAACTGAGATGGTGCAGCAGACCCAGTCCCTGAGAGAGCTCATCTCAgATCTGGAGCATCGGCTGCAGGGGTCAGTGATGGAGCTGCTTCAGGGTGTGGATGGCGTCATAAAAAGGACGGAGAACGTGACCTTGAAGAAGCCAGAAACTTTTCCAAAAAATCAAAGGAGAGTGTTTCGAGCTCcTGATCTGAAAGGAATGCTAGAAGTGTTTAGAGAGCTGACAGATGTCCGACGCTACTGGGTTGATGTGACAGTGGCTCCAAACAACATTTCATGTGCTGTCATTTCTGAAGATAAGAGACAAGTGAGCTCTGTCAACCCCACCGTGTTCTTCGACATTGCCGTCGACGGCGAGCCCTTGGGCCGCGTCTCCTTTGAGCTGTTTGCAGACAAGGTCCCAAAGACAGCAGAAAATTTTCGTGCTCTGAGCACTGGAGAGAAAGGATTTGGTTATAAGGGTTCCTGCTTTCACAGAATTATTCCAGGGTTTATGTGTCAGGGTGGTGACTTCACACGCCATAATGGCACTGGTGGCAAGTCCATCTATGGGGAGAAATTTGAAGATGAGAACTTCATCCTAAAGCATACGGGTCCTGGCATCTTATCGATGGCAAATGCTGGACCCAACACAAATGGTTCCCAGTTTTTCATCTGCACTGCCAAGACTGAGTGGTTGGATGGCAAGCATGTGGTGTTTGGCAAAGTGAAAGAAGGCATGAATATTGTGGAGGCGATGGAGCGCTTTGGGTCCAGGAATGGCAAGACCAGCAAGAAGATCACCATTGCTGACTGTGGACAACTCGAATCCGGAAGCGGAGCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCACAgctaccggtcgccaccatgg

其中，hTRIM5/CypA基因的编码序列如(SEQ ID NO:10)所示；

SEQ ID NO:10：

ATGGCTTCTGGAATCCTGGTTAATGTAAAGGAGGAGGTGACCTGCCCCATCTGCCTGGAACTCCTGACACAACCCCTGAGCCTGGACTGCGGCCACAGCTTCTGCCAAGCATGCCTCACTGCAAACCACAAGAAGTCCATGCTAGACAAAGGAGAGAGTAGCTGCCCTGTGTGCCGGATCAGTTACCAGCCTGAGAACATACGGCCTAATCGGCATGTAGCCAACATAGTGGAGAAGCTCAGGGAGGTCAAGTTGAGCCCAGAGGGGCAGAAAGTTGATCATTGTGCACGCCATGGAGAGAAACTTCTACTCTTCTGTCAGGAGGACGGGAAGGTCATTTGCTGGCTTTGTGAGCGGTCTCAGGAGCACCGTGGTCACCACACGTTCCTCACAGAGGAGGTTGCCCGGGAGTACCAAGTGAAGCTCCAGGCAGCTCTGGAGATGCTGAGGCAGAAGCAGCAGGAAGCTGAAGAGTTAGAAGCTGACATCAGAGAAGAGAAAGCTTCCTGGAAGACTCAAATACAGTATGACAAAACCAACGTCTTGGCAGATTTTGAGCAACTGAGAGACATCCTGGACTGGGAGGAGAGCAATGAGCTGCAAAACCTGGAGAAGGAGGAGGAAGACATTCTGAAAAGCCTTACGAACTCTGAAACTGAGATGGTGCAGCAGACCCAGTCCCTGAGAGAGCTCATCTCAgATCTGGAGCATCGGCTGCAGGGGTCAGTGATGGAGCTGCTTCAGGGTGTGGATGGCGTCATAAAAAGGACGGAGAACGTGACCTTGAAGAAGCCAGAAACTTTTCCAAAAAATCAAAGGAGAGTGTTTCGAGCTCcTGATCTGAAAGGAATGCTAGAAGTGTTTAGAGAGCTGACAGATGTCCGACGCTACTGGGTTGATGTGACAGTGGCTCCAAACAACATTTCATGTGCTGTCATTTCTGAAGATAAGAGACAAGTGAGCTCTGTCAACCCCACCGTGTTCTTCGACATTGCCGTCGACGGCGAGCCCTTGGGCCGCGTCTCCTTTGAGCTGTTTGCAGACAAGGTCCCAAAGACAGCAGAAAATTTTCGTGCTCTGAGCACTGGAGAGAAAGGATTTGGTTATAAGGGTTCCTGCTTTCACAGAATTATTCCAGGGTTTATGTGTCAGGGTGGTGACTTCACACGCCATAATGGCACTGGTGGCAAGTCCATCTATGGGGAGAAATTTGAAGATGAGAACTTCATCCTAAAGCATACGGGTCCTGGCATCTTATCGATGGCAAATGCTGGACCCAACACAAATGGTTCCCAGTTTTTCATCTGCACTGCCAAGACTGAGTGGTTGGATGGCAAGCATGTGGTGTTTGGCAAAGTGAAAGAAGGCATGAATATTGTGGAGGCGATGGAGCGCTTTGGGTCCAGGAATGGCAAGACCAGCAAGAAGATCACCATTGCTGACTGTGGACAACTCGAA

以pUC19-hTRIM5/CypA为模板，使用引物hT5-AfeI-L/hT5-AfeI-R，PCR扩增目的片段；

hT5-AfeI-L(SEQ ID NO:11)：5′-aagctttcagatccgctagc-3′

hT5-AfeI-R(SEQ ID NO:12)：5′-ccatggtggcgaccggtagc-3′

扩增的目的片段序列如SEQ ID NO:13所示；

SEQ ID NO:13：

3、表达载体准备

(1)将含改造载体pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86的大肠杆菌扩大培养，提取质粒pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86；

(2)采用限制性内切酶Afe I单酶切pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86质粒，37℃酶切1h，65℃酶失活20min，-20℃保存备用。

4、重组反应

(1)将前述以pUC19-hTRIM5/CypA为模板经PCR扩增的目的片段SEQ ID NO:13和线性化的pDonor-TALEN-EGFP-hCCR5F86载体进行同源重组反应，37℃反应30min后，马上置于冰浴上5min；

(3)将复苏后的DH5α细胞涂布LB固体平板(Amp+)，倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h；

(5)对上述菌液分别进行测序鉴定；

(6)将测序正确的菌液命名为pDonor-EF1α-hTRIM5/CypA-EGFP-hCCR5F86(质粒图谱如图10所示)，制备成甘油菌至-20℃保存备用。

实施例3HIV-1易感细胞株的改造

1、24孔板贴壁培养Hela-CD4(X4嗜性易感细胞系)和TZM-bl(R5嗜性易感细胞系)细胞，铺板密度为1.2×10^5cells/孔，用DMEM培养基(添加10％FBS)培养；

2、用无内毒素中提试剂盒提取质粒pDonor-EF1α-hTRIM5/CypA-EGFP-hCCR5F86(图10)与pX458-F86；

3、使用Lipofectamine 3000Transfection Reagent，将上述两种质粒共同转化Hela-CD4以及TZM-bl细胞系；

4、从第五天开始，加入终浓度800μg/ml的G418筛选，每隔2-3天传代一次，每次更换含800μg/mL G418的新鲜DMEM培养基；

5、药物筛选12天后，消化细胞，用流式细胞仪分选并接种到96孔板中；

6、将分选到96孔板的细胞扩大培养，挑选稳定并均匀表达绿色荧光蛋白GFP的细胞株，继续传代培养；

7、上述细胞株传代培养后取一部分冷冻保藏于液氮中，另一部分用于提取基因组，测定基因组浓度后于-20℃保存备用；

8、以上述细胞株的基因组为模板，以F86-C2-L/F86-C2-R为引物，进行PCR扩增；

F86-C2-L(SEQ ID NO:14)：5′-ACTGGCTTGCTCATAGTGCATGTTCTTTG-3′

F86-C2-R(SEQ ID NO:15)：5′-ATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAG-3′

9、PCR产物委外测序，测序结果如图11所示：在CCR5基因序列上F86上游同源臂的3’-端已成功插入pDonor-EF1α-hTRIM5/CypA-EGFP-hCCR5F86中F86上游和下游同源臂之间的部分序列，说明pDonor-EF1α-hTRIM5/CypA-EGFP-hCCR5F86中F86上、下游同源臂之间的序列已成功重组到CCR5基因上的F86位点；

10、将上述经过测序鉴定已经在细胞基因组CCR5基因中定点插入了外源序列的细胞株命名为Hela-CD4-hTRIM5/CypA和TZM-bl-hTRIM5/CypA，并在液氮中保存。

实施例4改造后细胞系的抗病毒效果测试

(一)对X4嗜性HIV病毒的抗病毒测试

将实施例3中保存的改造后的HIV-1易感细胞株Hela-CD4-hTRIM5/CypA复苏，铺板密度为1.2×10^5cells/孔，用DMEM培养基(含10％FBS)培养过夜，以未改造的细胞系Hela-CD4为对照组，每组设3个重复；

往培养基中添加X4嗜性病毒NL43，病毒含量为100ng/孔，侵染过夜；

弃含病毒的培养上清液，换300μL新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)；

病毒侵染的第4天，取150μL上清液放-80℃保存待测，添加150μL新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)；

病毒侵染的第7天，取150μL上清液放-80℃保存待测；

用荧光酶标仪对第4天和第7天的样品进行检测，对照标准曲线计算各组样品中P24蛋白的含量，结果如图12所示：被X4嗜性病毒NL4-3侵染的第4天，Hela-CD4的细胞培养上清中检测到41958.22pg/mL的P24蛋白，而在第7天时P24蛋白达73522.63pg/mL，即病毒在Hela-CD4细胞中大量扩增繁殖；而Hela-CD4-hTRIM5/CypA在第4天和第7天时分别检测到14935.05pg/mL和3581.95pg/mL的P24蛋白，即病毒在Hela-CD4-hTRIM5/CypA细胞中基本不能扩增。说明hTRIM5/CypA的定点整合，对X4嗜性病毒NL4-3的侵染和扩散有抵抗作用。

(二)对R5嗜性HIV病毒的抗病毒测试

1、将实施例3中保存的改造后的HIV-1易感细胞株TZM-bl-hTRIM5/CypA复苏，铺板密度为1.2×10^5cells/孔，用DMEM培养基(含10％FBS)培养过夜，以未改造的细胞系TZM-bl为对照组，每组设3个重复；

2、往培养基中添加R5嗜性病毒NL4.3bal，病毒含量为400ng/孔，侵染过夜；

3、弃含病毒的培养上清液，换300μL新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)；

4、病毒侵染的第4天，取150μL上清液放-80℃保存待测，添加150μL新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)；

5、病毒侵染的第7天，取150μL上清液放-80℃保存待测；

6、用荧光酶标仪对第4天和第7天的样品进行检测，对照标准曲线计算各组样品中P24蛋白的含量，结果如图13所示：被R5嗜性病毒NL4.3bal侵染的第4天，TZM-bl的细胞培养上清中检测到123027.73pg/mL的P24蛋白，而在第7天时P24蛋白达394243.85pg/mL，即病毒在TZM-bl细胞中大量扩增繁殖；TZM-bl-hTRIM5/CypA在第4天和第7天时分别检测到71728.56pg/mL和153726.43pg/mL的P24蛋白。本实验中，R5嗜性病毒NL4.3bal的攻毒用量是X4嗜性病毒NL43用量的4倍，说明hTRIM5/CypA整合以及CCR5敲除的双重作用，对高浓度R5嗜性病毒的侵染和扩散有抵抗作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 广东赤萌医疗科技有限公司

<120> 一种定点编辑CCR5基因的方法

<141> 2018-03-12

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atttttgtga tgctcgtcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

tggtgacaag tgtgatcact 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> Hepatitis G virus

<400> 3

gttctagtgg ttggctacgt agcaccatgc ttgacccagt ttc 43

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Hepatitis G virus

<400> 4

tagcttatcg ataccgtcga cgtcaccacc ccaaaggtga c 41

<210> 5

<211> 783

<212> DNA

<213> Hepatitis G virus

<400> 5

gcaccatgct tgacccagtt tcttaaaatt gttgtcaaag cttcattcac tccatggtgc 60

tatagagcac aagattttat ttggtgagat ggtgctttca tgaattcccc caacagagcc 120

aagctctcca tctagtggac agggaagcta gcagcaaacc ttcccttcac tacaaaactt 180

cattgcttgg ccaaaaagag agttaattca atgtagacat ctatgtaggc aattaaaaac 240

ctattgatgt ataaaacagt ttgcattcat ggagggcaac taaatacatt ctaggacttt 300

ataaaagatc actttttatt tatgcacagg gtggaacaag atggattatc aagtgtcaag 360

tccaatctat gacatcaatt attatacatc ggagccctgc caaaaaatca atgtgaagca 420

aatcgcagcc cgcctcctgc ctccgctcta ctcactggtg ttcatctttg gttttgtggg 480

caacatgctg gtcatcctca tcctgataaa ctgcaaaagg ctgaagagca tgactgacat 540

ctacctgctc aacctggcca tctctgacct gtttttcctt cttactgtcc ccttctgggc 600

tcactatgct gccgcccagt gggactttgg aaatacaatg tgtcaactct tgacagggct 660

ctattttata ggcttcttct ctggaatctt cttcatcatc ctcctgacaa tcgataggta 720

cctggctgtc gtccatgctg tgtttgcttt aaaagccagg acggtcacct ttggggtggt 780

gac 783

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> Hepatitis G virus

<400> 6

cactagttct agagcggccg cgtggtggct gtgtttgcgt c 41

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> Hepatitis G virus

<400> 7

actgcaggct ctagattcga agccatgtgc acaactctga ctg 43

<210> 8

<211> 647

<212> DNA

<213> Hepatitis G virus

<400> 8

gtggtggctg tgtttgcgtc tctcccagga atcatcttta ccagatctca aaaagaaggt 60

cttcattaca cctgcagctc tcattttcca tacagtcagt atcaattctg gaagaatttc 120

cagacattaa agatagtcat cttggggctg gtcctgccgc tgcttgtcat ggtcatctgc 180

tactcgggaa tcctaaaaac tctgcttcgg tgtcgaaatg agaagaagag gcacagggct 240

gtgaggctta tcttcaccat catgattgtt tattttctct tctgggctcc ctacaacatt 300

gtccttctcc tgaacacctt ccaggaattc tttggcctga ataattgcag tagctctaac 360

aggttggacc aagctatgca ggtgacagag actcttggga tgacgcactg ctgcatcaac 420

cccatcatct atgcctttgt cggggagaag ttcagaaact acctcttagt cttcttccaa 480

aagcacattg ccaaacgctt ctgcaaatgc tgttctattt tccagcaaga ggctcccgag 540

cgagcaagct cagtttacac ccgatccact ggggagcagg aaatatctgt gggcttgtga 600

cacggactca agtgggctgg tgacccagtc agagttgtgc acatggc 647

<210> 13

<211> 1585

<212> DNA

<213> Galago senegalensis

<400> 13

aagctttcag atccgctagc gctaccggtc gccaccatgg cttctggaat cctggttaat 60

gtaaaggagg aggtgacctg ccccatctgc ctggaactcc tgacacaacc cctgagcctg 120

gactgcggcc acagcttctg ccaagcatgc ctcactgcaa accacaagaa gtccatgcta 180

gacaaaggag agagtagctg ccctgtgtgc cggatcagtt accagcctga gaacatacgg 240

cctaatcggc atgtagccaa catagtggag aagctcaggg aggtcaagtt gagcccagag 300

gggcagaaag ttgatcattg tgcacgccat ggagagaaac ttctactctt ctgtcaggag 360

gacgggaagg tcatttgctg gctttgtgag cggtctcagg agcaccgtgg tcaccacacg 420

ttcctcacag aggaggttgc ccgggagtac caagtgaagc tccaggcagc tctggagatg 480

ctgaggcaga agcagcagga agctgaagag ttagaagctg acatcagaga agagaaagct 540

tcctggaaga ctcaaataca gtatgacaaa accaacgtct tggcagattt tgagcaactg 600

agagacatcc tggactggga ggagagcaat gagctgcaaa acctggagaa ggaggaggaa 660

gacattctga aaagccttac gaactctgaa actgagatgg tgcagcagac ccagtccctg 720

agagagctca tctcagatct ggagcatcgg ctgcaggggt cagtgatgga gctgcttcag 780

ggtgtggatg gcgtcataaa aaggacggag aacgtgacct tgaagaagcc agaaactttt 840

ccaaaaaatc aaaggagagt gtttcgagct cctgatctga aaggaatgct agaagtgttt 900

agagagctga cagatgtccg acgctactgg gttgatgtga cagtggctcc aaacaacatt 960

tcatgtgctg tcatttctga agataagaga caagtgagct ctgtcaaccc caccgtgttc 1020

ttcgacattg ccgtcgacgg cgagcccttg ggccgcgtct cctttgagct gtttgcagac 1080

aaggtcccaa agacagcaga aaattttcgt gctctgagca ctggagagaa aggatttggt 1140

tataagggtt cctgctttca cagaattatt ccagggttta tgtgtcaggg tggtgacttc 1200

acacgccata atggcactgg tggcaagtcc atctatgggg agaaatttga agatgagaac 1260

ttcatcctaa agcatacggg tcctggcatc ttatcgatgg caaatgctgg acccaacaca 1320

aatggttccc agtttttcat ctgcactgcc aagactgagt ggttggatgg caagcatgtg 1380

gtgtttggca aagtgaaaga aggcatgaat attgtggagg cgatggagcg ctttgggtcc 1440

aggaatggca agaccagcaa gaagatcacc attgctgact gtggacaact cgaatccgga 1500

agcggagcca ctaacttctc cctgttgaaa caagcagggg atgtcgaaga gaatcccggg 1560

ccacagctac cggtcgccac catgg 1585

<210> 11

<211> 1478

<212> DNA

<213> Galago senegalensis

<400> 11

atggcttctg gaatcctggt taatgtaaag gaggaggtga cctgccccat ctgcctggaa 60

ctcctgacac aacccctgag cctggactgc ggccacagct tctgccaagc atgcctcact 120

gcaaaccaca agaagtccat gctagacaaa ggagagagta gctgccctgt gtgccggatc 180

agttaccagc ctgagaacat acggcctaat cggcatgtag ccaacatagt ggagaagctc 240

agggaggtca agttgagccc agaggggcag aaagttgatc attgtgcacg ccatggagag 300

aaacttctac tcttctgtca ggaggacggg aaggtcattt gctggctttg tgagcggtct 360

caggagcacc gtggtcacca cacgttcctc acagaggagg ttgcccggga gtaccaagtg 420

aagctccagg cagctctgga gatgctgagg cagaagcagc aggaagctga agagttagaa 480

gctgacatca gagaagagaa agcttcctgg aagactcaaa tacagtatga caaaaccaac 540

gtcttggcag attttgagca actgagagac atcctggact gggaggagag caatgagctg 600

caaaacctgg agaaggagga ggaagacatt ctgaaaagcc ttacgaactc tgaaactgag 660

atggtgcagc agacccagtc cctgagagag ctcatctcag atctggagca tcggctgcag 720

gggtcagtga tggagctgct tcagggtgtg gatggcgtca taaaaaggac ggagaacgtg 780

accttgaaga agccagaaac ttttccaaaa aatcaaagga gagtgtttcg agctcctgat 840

ctgaaaggaa tgctagaagt gtttagagag ctgacagatg tccgacgcta ctgggttgat 900

gtgacagtgg ctccaaacaa catttcatgt gctgtcattt ctgaagataa gagacaagtg 960

agctctgtca accccaccgt gttcttcgac attgccgtcg acggcgagcc cttgggccgc 1020

gtctcctttg agctgtttgc agacaaggtc ccaaagacag cagaaaattt tcgtgctctg 1080

agcactggag agaaaggatt tggttataag ggttcctgct ttcacagaat tattccaggg 1140

tttatgtgtc agggtggtga cttcacacgc cataatggca ctggtggcaa gtccatctat 1200

ggggagaaat ttgaagatga gaacttcatc ctaaagcata cgggtcctgg catcttatcg 1260

atggcaaatg ctggacccaa cacaaatggt tcccagtttt tcatctgcac tgccaagact 1320

gagtggttgg atggcaagca tgtggtgttt ggcaaagtga aagaaggcat gaatattgtg 1380

gaggcgatgg agcgctttgg gtccaggaat ggcaagacca gcaagaagat caccattgct 1440

gactgtggac aactcgaaaa gctttcagat ccgctagc 1478

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Galago senegalensis

<400> 12

ccatggtggc gaccggtagc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Galago senegalensis

<400> 13

ccatggtggc gaccggtagc 20

<210> 13

<211> 1585

<212> DNA

<213> Galago senegalensis

<400> 13

aagctttcag atccgctagc gctaccggtc gccaccatgg cttctggaat cctggttaat 60

gtaaaggagg aggtgacctg ccccatctgc ctggaactcc tgacacaacc cctgagcctg 120

gactgcggcc acagcttctg ccaagcatgc ctcactgcaa accacaagaa gtccatgcta 180

gacaaaggag agagtagctg ccctgtgtgc cggatcagtt accagcctga gaacatacgg 240

cctaatcggc atgtagccaa catagtggag aagctcaggg aggtcaagtt gagcccagag 300

gggcagaaag ttgatcattg tgcacgccat ggagagaaac ttctactctt ctgtcaggag 360

gacgggaagg tcatttgctg gctttgtgag cggtctcagg agcaccgtgg tcaccacacg 420

ttcctcacag aggaggttgc ccgggagtac caagtgaagc tccaggcagc tctggagatg 480

ctgaggcaga agcagcagga agctgaagag ttagaagctg acatcagaga agagaaagct 540

tcctggaaga ctcaaataca gtatgacaaa accaacgtct tggcagattt tgagcaactg 600

agagacatcc tggactggga ggagagcaat gagctgcaaa acctggagaa ggaggaggaa 660

gacattctga aaagccttac gaactctgaa actgagatgg tgcagcagac ccagtccctg 720

agagagctca tctcagatct ggagcatcgg ctgcaggggt cagtgatgga gctgcttcag 780

ggtgtggatg gcgtcataaa aaggacggag aacgtgacct tgaagaagcc agaaactttt 840

ccaaaaaatc aaaggagagt gtttcgagct cctgatctga aaggaatgct agaagtgttt 900

agagagctga cagatgtccg acgctactgg gttgatgtga cagtggctcc aaacaacatt 960

tcatgtgctg tcatttctga agataagaga caagtgagct ctgtcaaccc caccgtgttc 1020

ttcgacattg ccgtcgacgg cgagcccttg ggccgcgtct cctttgagct gtttgcagac 1080

aaggtcccaa agacagcaga aaattttcgt gctctgagca ctggagagaa aggatttggt 1140

tataagggtt cctgctttca cagaattatt ccagggttta tgtgtcaggg tggtgacttc 1200

acacgccata atggcactgg tggcaagtcc atctatgggg agaaatttga agatgagaac 1260

ttcatcctaa agcatacggg tcctggcatc ttatcgatgg caaatgctgg acccaacaca 1320

aatggttccc agtttttcat ctgcactgcc aagactgagt ggttggatgg caagcatgtg 1380

gtgtttggca aagtgaaaga aggcatgaat attgtggagg cgatggagcg ctttgggtcc 1440

aggaatggca agaccagcaa gaagatcacc attgctgact gtggacaact cgaatccgga 1500

agcggagcca ctaacttctc cctgttgaaa caagcagggg atgtcgaaga gaatcccggg 1560

ccacagctac cggtcgccac catgg 1585

<210> 14

<211> 569

<212> DNA

<213> Helarctos malayanus

<400> 14

aagctttcag atccgctagc gctaccggtc gccaccatgg cttctggaat cctggttaat 60

gtaaaggagg aggtgacctg ccccatctgc ctggaactcc tgacacaacc cctgagcctg 120

gactgcggcc acagcttctg ccaagcatgc ctcactgcaa accacaagaa gtccatgcta 180

gacaaaggag agagtagctg ccctgtgtgc cggatcagtt accagcctga gaacatacgg 240

cctaatcggc atgtagccaa catagtggag aagctcaggg aggtcaagtt gagcccagag 300

gggcagaaag ttgatcattg tgcacgccat ggagagaaac ttctactctt ctgtcaggag 360

gacgggaagg tcatttgctg gctttgtgag cggtctcagg agcaccgtgg tcaccacacg 420

ttcctcacag aggaggttgc ccgggagtac caagtgaagc tccaggcagc tctggagatg 480

ctgaggcaga agcagcagga agctgaagag ttagaagctg acatcagaga agagaaagct 540

actggcttgc tcatagtgca tgttctttg 569

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> Helarctos malayanus

<400> 15

atcgccttct tgacgagttc ttctgag 27

Claims

1.一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于，其是根据hTRIM5/CypA基因和人的CCR5基因，构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体；然后将基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体和同源重组供体系统共同转染到受体细胞系中，从而获取CCR5基因被定点插入hTRIM5/CypA基因的细胞系。

2.根据权利要求1所述的一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一，设计并筛选CRISPR/Cas9敲除人CCR5基因的高效的gRNA靶序列，构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体；

步骤二，根据步骤一筛选的gRNA靶序列，设计并克隆上游同源臂序列和下游同源臂序列，克隆hTRIM5/CypA基因序列，构建同源重组供体系统；

步骤三，将构建好的基于CRISPR/Cas9系统的gRNA载体和同源重组供体系统共同转染受体细胞系；

步骤四，利用基因组PCR验证hTRIM5/CypA基因序列在CCR5基因位点的定点整合；

步骤五，用P24蛋白含量检测法验证在CCR5基因位点定点整合hTRIM5/CypA基因的细胞对HIV-1病毒的抵抗能力。

3.根据权利要求1或2所述的一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于所述的gRNA包括gRNA或gRNA的组合。

4.根据权利要求1或2所述的一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于所述受体细胞系包括造血干细胞或T淋巴细胞。

5.根据权利要求1或2所述的一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于所述基于CRISPR/Cas9系统的载体为px458载体。

6.根据权利要求1或2所述的一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于，所述gRNA的靶序列为SEQ ID NO:2。

7.根据权利要求1或2所述的一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于，所述同源重组供体系统包括上游同源臂序列SEQ ID NO:5，下游同源臂序列SEQ ID NO:8，hTRIM5/CypA基因编码序列SEQ ID NO:10。

8.根据权利要求1或2所述的一种定点编辑CCR5基因的方法，其特征在于，所述hTRIM5/CypA基因的启动子和hTRIM5/CypA基因序列位于上游同源臂序列和下游同源臂序列之间，所述hTRIM5/CypA基因的启动子序列位于hTRIM5/CypA基因序列的上游。