CN102580082B - 一种禽用灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种禽用灭活疫苗，其含有组分及各组分的体积百分比如下：聚氧乙烯氢化蓖麻油RH400.5-5%；油酸山梨醇脂（司班-80）1-10%；吐温-801-5%；油25-67.5%；抗原液30-55%；所述油为EQLANE130。配置疫苗时将制备得到的EQLANE130新油佐剂与抗原1：1混匀、乳化后得到灭活疫苗。用EQLANE130新油佐剂制备疫苗能够减少10%油的用量，将制备过程缩短为两步，免疫动物后能够提高体液免疫反应和增强免疫效果。

Description

一种禽用灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种禽用灭活疫苗及其制备方法。 

背景技术

我国是一个农业大国，改革开放以来，畜牧业得到了突飞猛进的发展，已成为世界畜牧业大国，是世界上养鸡、养猪最多的国家，具有广阔的兽药市场。据联合国粮农组织(FAO)统计，进人20世纪80年代以来，全世界肉类每年增加的数量80％来自中国。畜牧业养殖总量未来保持稳定增长。以水禽为例，水禽是我国的特色传统产业，也是畜牧业的重要组成部分，其饲养量和消费量一直稳居世界首位。据联合国粮农组织(FAO)统计，目前鸭、鹅出栏量分别达到22.78亿只和6.97亿只；鸭、鹅的存栏量居世界首位。截止2005年底，我国鸭存栏7.3亿只，占全世界鸭存栏量的69％；我国鹅存栏量为2.7亿只，占世界鹅存栏量的88％。我国水禽产品产值占畜牧业总产值的10％。由于水禽饲养方式和环境的特殊性，极易感染各种传染病，一旦发病，传播较快，损失严重。从2003年底开始，H5N1亚型高致病性禽流感造成巨大的经济损失，也引发了严重的公共卫生问题。使用疫苗对畜禽经行强制免疫，是疾病预防控制的重要措施之一，每年国家购买疫苗支出就得上百亿元人民币。 

目前的疫苗接种绝大多数都是通过直接注射来完成。通过对灭活疫苗的长期使用，目前发现直接注射存在诸多问题。 

第一、目前灭活疫苗油佐剂与抗原的比例为3∶2，油的比例大，不仅不易吸收，而且具有一定的毒副作用； 

第二、目前灭活疫苗的生产工艺一般需要分三步：第一步将注射用的白油 和油溶性的乳化剂混合均匀，第二部将抗原液与水溶性的乳化剂混合均匀，第三部将第一、二部的均匀溶液混合并进一步乳化，制备出油包水的灭活疫苗；疫苗的制造工艺比较复杂、生产成本高； 

第三、油包水的灭活疫苗注射时阻力大，增加了免疫的难度。 

因此，减少油佐剂的用量和改变疫苗的制备工艺，减少禽类动物的应激反应，有着十分重要和现实的意义。 

发明内容

本发明的目的是发明一种禽用灭活疫苗及其制备方法，其使用的油佐剂在改变乳化剂和减少油佐剂用量的前提下，能够增强动物的免疫效果，优化制备工艺，减少生产成本。 

本发明的技术方案如下： 

一种禽用油佐剂，其含有组分及各组分的体积百分比如下： 

聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40       0.5-12％； 

油酸山梨醇脂(司班-80)        1-21％； 

吐温-80                      1-12％； 

油                           55-97.5％； 

所述油为EQLANE 130。 

所述的禽用灭活疫苗的油佐剂的制备方法，包括如下具体步骤： 

(1)按配方分别量取聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，油酸山梨醇脂(司班-80)，吐温-80  1-5％，油和抗原液；将油加热到60-100℃，按照体积比加入聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，混匀； 

(2)待油温降到50℃以下后，加入油酸山梨醇脂搅拌均匀，110℃灭菌30分钟，冷却，即得到所述禽用灭活疫苗的油佐剂。 

一种禽用灭活疫苗，其含有组分及各组分的体积百分比如下： 

聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40          0.5-5％； 

油酸山梨醇脂(司班-80)           1-10％； 

吐温-80                         1-5％； 

油                              25-67.5％； 

抗原液                          30-55％； 

所述油为EQLANE 130。 

较佳地，所述禽用灭活疫苗，其含有组分及各组分的体积百分比如下 

聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40              1.5-2％； 

油酸山梨醇脂(司班-80)           4.5-6％； 

吐温-80                         1-2％； 

油                              43-44％； 

抗原液                          40-50％。 

所述聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40做为非离子增溶剂和乳化剂，它是由氢化蓖麻油产生的聚乙二醇及甘油羟基硬脂酸40(德国药典、欧洲药典)或Polyxyl40氢化蓖麻油(美国药典-国家处方)，HLB值14-16，CremophorRH40熔点约为30℃，微臭，水溶性无味，能溶于水、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、三氯乙烯、苯、甲苯和二甲苯氯仿；在水中的溶解度随温度的升高而变小，至一定温度时溶液显乳光，并能和同类Cremophor、脂肪酸、脂肪醇混合；在水和醇溶液是稳定的，但和浓酸、浓碱相遇时会水解；水溶液经热压灭菌(120度)后PH值稍有下降。 

本发明所述的禽用灭活疫苗的油佐剂的制备方法为： 

(1)按配方分别量取聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，油酸山梨醇脂(司班-80)，吐温-80 1-5％，油和抗原液；将油加热到60-100℃，按照体积比加入聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，混匀； 

(2)待油温降到50℃以下后，加入油酸山梨醇脂搅拌均匀，110℃灭菌30分钟，冷却，即得到所述禽用灭活疫苗的油佐剂。 

使用时，将所述禽用灭活疫苗的油佐剂与30-55％抗原，优选比例为40-50％，乳化后即得到灭活疫苗，2-8度储存备用。 

本发明的有益效果为：本发明中由于使用具有亲水和疏水基的聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，增强了乳化效果，减少了白油的用量，简化了生产工艺，通过实验证明在小鼠和水禽中能够增强免疫效果，使抗体在较长的时间内保持在一个较高的水平，通过减少油的用量，使油的粘稠度降低，减少了注射的难度。 

附图说明

图1、不同种类乳化剂制备的油佐剂疫苗免疫小鼠后抗体水平变化检测结果比较。 

图2：新油佐剂疫苗免疫小鼠后抗体水平变化检测结果比较。 

图3：不同比例新油佐剂禽流感H5N1(Re-5株)灭活疫苗免疫SFP鸡后抗体水平变化检测结果比较。 

图4：新油佐剂疫苗免疫肉鸭后HI抗体水平变化检测结果比较1。 

图5：新油佐剂疫苗免疫肉鸭后HI抗体水平变化检测结果比较2。 

具体实施方式

实施主要试剂的说明： 

1、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，原产地为德国BASF，批号为83109247G0，购买于北京凤礼精求商贸有限责任公司，HLB值14-16，Cremophor RH40熔点约30℃，微臭，水溶液无味，粘度(25℃)20-40mPa·s 

2、油酸山梨醇脂(Span-80)购买于北京益利精细化学品有限公司，具体技术指标如下： 

水份..................  ...............≤2％ 

皂化值................................135-160 

羟值....................................190-220 

酸值......................................≤9％ 

3、油佐剂为道达尔石油(广州)有限公司提供的Gemseal 40(G40)、EQLANE130或国产的10号白油，所用的油是经过深度精制后的矿物油。具有无色、无味、化学惰性、光安定性能好，基本组成为饱和烃结构，芳香烃、含氮、氧、硫等物质近似于零，对酸、光、热均稳定，不溶于乙醇，溶于乙醚、苯、石油醚等，并可与多数脂肪油互溶。 

4、吐温-80购买于国药集团化学试剂有限公司，批号为F20050719，具体技术指标如下： 

水份........................  ......≤3％ 

皂化值KOH mg/g.................45-55 

羟值KOH mg/g.....................65-80 

酸值KOH mg/g.........................≤2 

灼烧残渣..................    ...≤0.25％ 

重金属.........   ..................≤0.001％。 

实例一：禽用灭活疫苗的油佐剂的制备(以EQLANE130为例) 

用量筒分别取二组80ml EQLANE130(道达尔石油(广州)有限公司产品)，置于带搅拌子的三角瓶中；用带加热的磁力搅拌器加热EQLANE130，边加热边搅拌，加热到80℃，向一组EQLANE130中加入5％聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，另一组EQLANE130加入5％吐温-80，混匀；待EQLANE130温降到50℃以下后，按照体积比加入10％油酸山梨醇脂，110℃灭菌30分钟，定容到100ml，冷却至室温存储备用，即得禽用灭活疫苗的EQLANE130油佐剂，其中，加入聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40的一组命名为EQLANE130新油佐剂，加入吐温-80的一组命名为EQLANE130油。 

采用相同的方法，分别制备白油和新白油佐剂，G40油和G40新油佐剂。 

实例二：不同种类乳化剂制备的油佐剂疫苗免疫小鼠后抗体水平变化检测 

1、禽流感H5N1(Re-5株)灭活疫苗的制备 

A、将实施例1制备得到的白油、G40油和EQLANE130油分别与禽流感H5N1(Re-5株)抗原液(由广东大华农动物保健品股份有限公司提供)，按照1∶1的体积比例混匀，再用高速匀浆机乳化10-15分钟，分别制备出以下三种灭活疫苗：H5N1(Re-5株)+白油疫苗、H5N1(Re-5株)+G40油苗、H5N1(Re-5株)+EQLANE130油苗； 

B、将实施例1制备得到的新白油佐剂组G40新油佐剂组和EQLANE130新油佐剂组分别与禽流感H5N1(Re-5株)抗原液(由广东大华农动物保健品股份有限公司提供)，按照1∶1的体积比例混匀，再用高速匀浆机乳化10-15分钟，分别制备出以下三种灭活疫苗：H5N1(Re-5株)+新白油佐剂疫苗、H5N1(Re-5株)+G40新油佐剂疫苗、H5N1(Re-5株)+EQLANE130新油佐剂疫苗。 

C、将R40与禽流感H5N1(Re-5株)抗原液(由广东大华农动物保健品股份有限公司提供)，按照1∶1的体积比例混匀，再用高速匀浆机乳化10-15分钟，制备H5N1(Re-5株)+R40： 

D、以生理盐水为阴性对照。 

2、实验动物和分组 

6-8周清洁级昆明白小鼠48只，分8组，每组6只，各组按0.1ml/只的剂量分别腿部肌肉注射上述灭活疫苗，具体分组如下： 

(1)、H5N1(Re-5株)+白油佐剂组； 

(2)、H5N1(Re-5株)+新白油佐剂疫苗组； 

(3)、H5N1(Re-5株)+G40油苗组； 

(4)、H5N1(Re-5株)+G40新油佐剂疫苗组； 

(5)、H5N1(Re-5株)+EQLANE130油苗组； 

(6)、H5N1(Re-5株)+EQLANE130新油佐剂疫苗组； 

(7)、H5N1(Re-5株)+R40组； 

(8)、生理盐水组。 

3、采样 

各组小鼠免疫前取血1次；免疫后10天，14天，28天、42天眼眶静脉取血各一次，共取5次；每次取血0.1-0.2ml；血样置37℃1-2小时，4000转/分离心8-10分钟，取血清置于离心管中，-20℃保存备用。 

4、禽流感特异性IgG检测 

(1)抗原包被：用ELISA包被液稀释抗原至2μg/ml，用稀释后的抗原包被96孔板，100μl/孔，4℃过夜； 

(2)封闭：PBST(0.05％Tween20溶于PBS)洗涤3次，每次5min，5％脱脂奶粉(完达山乳业股份有限公司生产)，100μl/孔，37℃封闭1h； 

(3)加血清：PBST洗涤3次，每次5min，将小鼠血清用2％脱脂奶粉做2倍梯度稀释，以未免疫的小鼠血清作对照，100μl/孔，37℃孵育1h； 

(4)加二抗：PBST洗涤3次，每次5min，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(Solarbio公司生产1∶1000)，100μl/孔，37℃孵育1h； 

(5)显色：PBST洗涤3次，每次5min，加底物TMB(Amresco公司生产)显色，100μl/孔，37℃避光显色15min； 

(6)终止：加入0.2mo l/L硫酸终止显色，100μl/孔； 

(7)读数：OD 450nm/620nm处测光密度值。实验孔的OD值为对照孔的两倍时认为是阳性。 

5、结果 

将所得IgG检测结果作图，如图1所示。分析图1可知，单独用乳化剂制备的疫苗效果不明显，加入不同种类油佐剂制备的疫苗，新的乳化剂聚氧乙烯氢 化蓖麻油RH40整体抗体水平明显好于传统乳化剂吐温-80，产生抗体的时间均早于传统乳化剂，最佳疫苗组为H5N1(Re-5株)+EQLANE130新油佐剂疫苗组。 

实例三：新油佐剂疫苗免疫小鼠后抗体水平变化检测 

1、禽流感H5N1(Re-5株)灭活疫苗的制备 

将实例1中得到的白油和EQLANE130新油佐剂分别与禽流感H5N1(Re-5株)抗原液(由广东大华农动物保健品股份有限公司提供)，按照1∶1的比列混匀，再用高速匀浆机乳化10-15分钟，即分别制备成H5N1(Re-5株)+白油苗和H5N1(Re-5株)+EQLANE130新油佐剂疫苗，同时以生理盐水做另一组对照。 

2、实验动物和分组 

取6-8周清洁级昆明白小鼠18只，分3组，每组6只，各组按0.1ml/只的剂量分别腿部肌肉注射上述灭火疫苗或生理盐水，具体分组如下： 

(1)、H5N1(Re-5株)+白油苗； 

(2)、H5N1(Re-5株)+EQLANE130新油佐剂组； 

(3)、生理盐水组。 

3、采样 

各组小鼠免疫前取血1次；免疫后10天，14天，28天、42天、56天眼眶静脉取血各一次，共取6次；每次取血0.1-0.2ml；血样置37℃1-2小时，4000转/分离心8-10分钟，取血清置于离心管中，-20℃保存备用。 

4、禽流感特异性IgG检测 

检测方法和步骤和实例2相同。 

5、结果 

将所得IgG检测结果作图，如图2所示。分析图2可知，采用本发明以EQLANE130为原料制备的新佐剂，并用其配置成禽流感H5N1(Re-5)灭活疫苗。在抗原量等同的前提下，与原来配方白油灭活疫苗相比，EQLANE130新油佐剂在免疫后第10天能够产生较高的抗体效价(1∶12800)，明显好于原白油佐剂组抗体效价(1∶3200)，免疫之后42天抗体水平达到最高值，EQLANE130新油佐剂抗体效价(1∶204800)明显高于原白油剂组抗体效价(1∶51200)。也就是说从免疫后产生抗体效价的时间和整体的抗体效价，EQLANE130新油佐剂均好于原白油剂组。 

实例四：不同比例新油佐剂禽流感H5N1(Re-5株)灭活疫苗免疫SFP鸡后比较实验 

1、将实例1中得到的EQLANE130新油佐剂分别按占疫苗体积的60％、50％、30％、20％、10％与占疫苗体积的45％的禽流感H5N1(Re-5株)抗原液(由广东大华农动物保健品股份有限公司提供)充分混匀，再用高速匀浆机乳化10分钟，即制备成油包水禽流感灭活疫苗，另外用实例1中制备的白油按占疫苗体积的60％与占疫苗体积的50％的禽流感H5N1(Re-5株)抗原液(由广东大华农动物保健品股份有限公司提供)充分混匀，再用高速匀浆机乳化10分钟，作为对照，同时用生理盐水作为另一个对照。 

2、实验动物和分组 

取21-28日龄SFP鸡35只，分7组，每组5只，各组按0.5ml/只的剂量分别颈部皮下注射上述疫苗，具体分组如下： 

(1)、H5N1(Re-5株)+60％新油佐剂组； 

(2)、H5N1(Re-5株)+60％普通白油组； 

(3)、H5N1(Re-5株)+50％新油佐剂组； 

(4)、H5N1(Re-5株)+30％新油佐剂组； 

(5)、H5N1(Re-5株)+20％新油佐剂组； 

(6)、H5N1(Re-5株)+10％新油佐剂组； 

(7)、生理盐水组。 

3、采样 

各组SFP鸡免疫前取血1次；免疫后7天、10天、14天、21天、28天、60天各取血一次，共取7次；每次取血0.5-1ml；血样置37℃1-2小时，4000转/分离心8-10分钟，取血清置于离心管中，-20℃保存备用。 

4、抗体检测 

(1)材料与试剂 

PBS实验自配溶液 

微量反应板购于海门盛邦实验器材有限公司 

禽流感H5N1(Re-5)抗原购于哈尔滨兽医研究所 

SPF鸡购于北京梅里亚维生物技术公司 

(2)实验步骤 

血凝(HA)试验 

(a)在微量反应板的1-12孔均加入25微升PBS。 

(b)吸取25微升病毒抗原加入第1孔，混匀。 

(c)从第1孔吸取25微升病毒抗原加入第2孔，混匀后从第2孔内吸取25微升加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25微升弃之。 

(d)每孔再加入25微升PBS。 

(e)每孔均加入25微升1％(V/V)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)。 

(f)振荡混匀，在室温(20-25℃)下静置40分钟后观察结果(如果环境温度太高，可置4℃环境下1小时)。对照孔红细胞将明显的从孔底沿着倾 斜面向下呈线形流动。 

(g)结果判定。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线形流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明此孔红细胞被病毒凝集。完全血凝(不流淌)的病毒抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。 

血凝抑制试验(HI) 

(a)根据血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。 

例如，如果血凝的终点滴度为1∶256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64(256除以4)。 

(b)在微量反应板的1-11孔加入25微升PBS，第12孔加入50微升PBS。 

(c)吸取25微升血清加入第1孔内，充分混匀后吸25微升于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25微升弃去。 

(d)1-11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液25微升，混匀，室温(约20℃)静置至少30分钟。 

(e)每孔加入25微升的1％鸡红细胞悬液轻轻混匀，静置约40分钟(室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下1小时)，对照孔红细胞将明显的从孔底沿着倾斜面向下呈线形流动。 

(f)结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3log2判定HI试验阴性；HI价等于4log2为阳性。 

5、结果 

将所得结果作图如图3所示，分析图3可知通过实验得出结果较好的组为：H5N1(Re-5株)+60％新油佐剂组、H5N1(Re-5株)+60％普通白油组、H5N1(Re-5 株)+50％新油佐剂组三个实验组，另外三个实验组结果一般，从而得到在不影响乳化效果的前提下，新油佐剂使用量可以由传统白油佐剂的60％降低到50％，减少了10％油佐剂的用量，且抗体水平在较长的时间内维持在较高的水平。 

实例五：新油佐剂疫苗免疫肉鸭后HI抗体水平变化检测1 

1、禽流感H5N1(Re-5株)灭活疫苗的制备 

将实例1中得到的EQLANE130新油佐剂和白油分别与禽流感H5N1(Re-5株)抗原液(由广东大华农动物保健品股份有限公司提供)，按照1∶1的体积比列混匀，再用高速匀浆机乳化10分钟，即分别制备成H5N1(Re-5株)+EQLANE130新油佐剂灭活疫苗和H5N1(Re-5株)+白油灭活疫苗，并以没有经过处理的H5N1(Re-5株)抗原和生理盐水分别作为对照。 

2、实验动物和分组 

取10-14日龄肉鸭24只，分4组，每组6只，各组按0.3ml/只的剂量分别颈部皮下注射上述疫苗，H5N1(Re-5株)抗原或生理盐水，具体分组如下： 

(1)、H5N1(Re-5株)+白油佐剂组 

(2)H5N1(Re-5株)+EQLANE130新油佐剂组 

(3)、H5N1(Re-5株)抗原组 

(4)、生理盐水组 

3、采样 

免疫前取血1次；免疫后10天，14天，21天，28天、35天、42天各取血一次，共取7次；每次取血0.5-1ml；血样置37℃1-2小时，4000转/分离心8-10分钟，取血清置于离心管中，-20℃保存备用。 

4、抗体检测 

检测方法和步骤和实例4相同。 

5、结果 

将所得结果作图如图4，分析图4可知：通过实验用禽流感H5N1(Re-5)制备出来的灭活疫苗，新油佐剂灭活疫苗和原白油佐剂灭活疫苗免疫麻鸭后均能产生较高的抗体，因前期受母源抗体的影响，两种疫苗均要到免疫后28天才能产生较高的抗体，且维持一段较高的时间，二者比较起来EQLANE130新油佐剂灭活疫苗组明显好于原白油佐剂灭活疫苗组，从第28天开始整体抗体效价EQLANE130新油佐剂灭活疫苗组抗体水平平均高出原白油佐剂灭活疫苗组1-2(log2)，在抵御禽流感病毒入侵将起到十分重要的作用。 

实例六：新油佐剂疫苗免疫肉鸭后HI抗体水平变化检测2 

1、禽流感H5N1(Re-4株)灭活疫苗的制备 

将实例1中得到的EQLANE130新油佐剂和白油分别与禽流感H5N1(Re-4株)抗原液(由广东大华农动物保健品股份有限公司提供)，按照1∶1的体积比例混匀，再用高速匀浆机乳化10分钟，即分别制备成H5N1(Re-4株)+EQLANE130新油佐剂灭活疫苗和H5N1(Re-4株)+白油佐剂灭活疫苗，并以没有经过处理的H5N1(Re-4株)抗原和生理盐水分别作为对照。 

2、实验动物和分组 

取10-14日龄肉鸭24只，分4组，每组6只，各组鸭颈部皮下注射下述疫苗0.3ml/只，具体分组如下： 

(1)H5N1(Re-4株)+白油佐剂组 

(2)H5N1(Re-4株)+EQLANE130新油佐剂组 

(3)、H5N1(Re-4株)抗原组 

(4)、生理盐水组 

3、采样 

免疫前取血1次；免疫后10天，14天，21天，28天、35天、42天各取血一次，共取7次；每次取血0.5-1ml；血样置37℃1-2小时，4000转/分离心8-10分钟，取血清置于离心管中，-20℃保存备用。 

4、抗体检测 

检测方法和步骤和实例4相同。 

5、结果 

将所得结果作图如图5，分析图5可知：通过实验用禽流感H5N1(Re-4)抗原制备出来的灭活疫苗，新油佐剂灭活疫苗和原白油佐剂灭活疫苗免疫麻鸭后均能产生较高的抗体，因前期受母源抗体的影响，两种疫苗均要到免疫后28天才能产生较高的抗体，且维持一段较高的时间，二者比较起来EQLANE130新油佐剂灭活疫苗组明显好于原白油佐剂灭活疫苗组，特别是到免疫后42天EQLANE130新油佐剂灭活疫苗组整体抗体水平高于原白油佐剂灭活疫苗组1-2(log2)。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。 

Claims (2)

1.一种禽用灭活疫苗的油佐剂，其含有组分及各组分的体积百分比如下：

所述油为EQLANE 130。

2.一种禽用灭活疫苗，其特征在于，其含有组分及各组分的体积百分比如下：

所述油为EQLANE 130。