CN104667274B

CN104667274B - 一种提高渔用疫苗浸泡免疫效果的佐剂及其应用方法

Info

Publication number: CN104667274B
Application number: CN201510071454.2A
Authority: CN
Inventors: 任燕; 吴淑勤; 孙保兴; 石存斌
Original assignee: Guangzhou Rui Yang Surfactant Co Ltd; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Guangzhou Rui Yang Surfactant Co Ltd; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2017-05-03
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104667274A

Abstract

本发明公开了一种提高渔用疫苗浸泡免疫效果的佐剂及其应用方法。该佐剂为蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷，或者为蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷、氮酮和山莨菪碱组成的组合物。该佐剂的应用方法为：将适量佐剂溶于水后再与疫苗溶液按一定的体积比混匀，再将需要免疫的鱼体放入其中，充气浸泡15~30min即可。在本发明中，蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷具有良好的生物降解性，无毒，界面张力低，水溶性好，具有分散、乳化等作用，使不溶于水的油类或不溶性抗原在溶液中分散更均匀，能够有效提高疫苗的免疫效果；且本发明佐剂施用方法简单，施用安全、环境友好，且在养殖生产中对鱼的生长无不良影响。

Description

一种提高渔用疫苗浸泡免疫效果的佐剂及其应用方法

技术领域

本发明涉及渔用疫苗的施用途径及应用效果，具体是提高渔用疫苗浸泡免疫效果的佐剂及其应用方法。

背景技术

我国是淡水养殖大国，集约化程度高，水产病害也较为严重。疫苗是预防疾病的有效手段，能刺激动物机体产生抗体，可使鱼类特异抵御病原的攻击，在提高鱼类特异性免疫水平的同时亦能增强机体抗不良应激的能力，作为符合环境友好和可持续发展战略的病害防控措施，已成为国际现代水产养殖业的标准生产规范内容之一。渔用疫苗在浸泡免疫过程中，细菌抗原需要克服鱼类体表黏液、鳞片及皮肤的障碍，才能进入机体，效果差。目前国内商品化的渔用疫苗（嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗、草鱼出血病活疫苗）均以注射免疫途径为主。渔用疫苗注射投递的免疫效果好，但成本高、劳动强度大，适合工厂化养殖中应用，不适合在我国池塘、网箱养殖鱼中应用，而浸泡免疫操作方便，尤其适用于小规格鱼种在分塘、运输等过程中免疫。如何提高鳃和皮肤对抗原的摄入量，是建立浸泡投递技术的首要问题。利用免疫佐剂、细胞渗透剂等材料，结合高渗浸泡、超声波处理等透皮方法，增强鱼体对抗原的摄入量，从而提高免疫效果是浸泡免疫的发展方向和趋势。基于此，开发应用高效、安全、使用方便、环境友好的提高浸泡疫苗免疫效果的浸泡材料，可大大推动渔用疫苗的应用，进而推动水产养殖业的健康发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高渔用疫苗浸泡免疫效果的佐剂及其应用方法。

本发明所采取的技术方案是：

蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷在制备渔用疫苗浸泡疫苗佐剂中的应用。

一种渔用浸泡疫苗的佐剂，该佐剂由以下质量份数的成分组成：1～20份蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷、0～10份氮酮、0～30份山莨菪碱。

进一步的，上述佐剂由以下质量份数的成分组成：10份蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷、5份氮酮、15份山莨菪碱。

进一步的，上述蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的制备方法为：先将蓖麻油先经浓硫酸酸化脱水，再与聚乙二醇400进行酯化反应生成蓖麻油聚乙二醇400单酯；蓖麻油聚乙二醇400单酯再与葡萄糖发生反应被糖苷化，即得蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷。

进一步的，上述蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的制备方法具体包括以下步骤：

1）酸化：按重量将蓖麻油和浓硫酸按体积比10∶(0.5～1.5)的混匀，加热至100～110℃时，用蓖麻油将下层溶液pH值调节至2～3，保温反应25～35min，停止加热和搅拌，静置0.5～1h，取上层的油中水反复洗涤至放出水液的pH值为4～5为止，然后搅拌加热，在真空度为580~620mm/Hg下加热至240~260℃维持25～35min，进行脱水处理，使含水量降至万分之三以下，得脱水后的蓖麻油；

2）酯化：按重量计将上述脱水后的蓖麻油和聚乙二醇400按重量比（3.8～4.2）：（2.8～3.2）混匀，再加入重量聚乙二醇400与脱水后的蓖麻油两者总重量的2%～5%的对甲苯磺酸，在搅拌下加热至80~90℃，保温反应5.6～6.5h；然后取样测定粗酯的酸值，依酸值加入过量碳酸钠，在搅拌下升温至100～120℃后反应8~12min；获得蓖麻油聚乙二醇400单酯；

3）糖苷化：将上述制得的蓖麻油聚乙二醇400单酯与一水葡萄糖按摩尔比1:1混匀，并加入路易斯酸作催化剂，在真空和氮气保护下于110～130℃反应5.5～6.5h，反应至溶液由浑浊变成淡黄色透明液体，即得到最终成品，即蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷。

上述一种渔用浸泡疫苗佐剂的使用方法，该方法包括以下步骤：

1）将上述制备的渔用浸泡疫苗佐剂中加入水搅拌混匀，得到的溶液为浸泡免疫溶液1；

2）将上述1）得到的浸泡佐剂溶液1与疫苗溶液按体积比1:（100~200）混合均匀，得到的混合溶液为浸泡免疫溶液2，其中渔用浸泡疫苗佐剂各组分的终浓度范围分别为：蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷1~20µg/mL、氮酮0~10µg/mL、山莨菪碱0~30µg/mL；

3）将需要免疫的鱼体放入浸泡免疫溶液2中，充气浸泡15~30min，即完成免疫。

本发明的有益效果是：

1）在本发明中，蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷具有良好的生物降解性，无毒，界面张力低，水溶性好，具有分散、乳化等作用，使不溶于水的油类或不溶性抗原（如：细菌、病毒等）在溶液中分散更均匀，在渔用疫苗浸泡免疫中有一定的增效功能。氮酮又名月桂氮卓酮是一种无色或微黄色液体，不溶于水，有促渗透作用。本发明利用蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的亲水亲油特性，从而使氮酮均匀分散在疫苗溶液中，并跟鱼体表和鳃充分接触进而发挥促渗透功能。山莨菪碱可以阻断M胆碱受体，使平滑肌松弛并解除血管痉挛，具有细胞膜稳定和扩张微血管作用，可以作为一种细胞松弛剂，能够恢复并增强黏膜的生理功能，提高免疫力。蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷单用或与氮酮、山莨菪碱组合施用，均能够有效提高疫苗浸泡免疫效果；施用方法程序简单，应用安全且环境友好。

2）在疫苗（细菌类、病毒类）浸泡免疫鱼类时应用本发明佐剂，能够有效提高疫苗的免疫效果，且效果显著高于单一成分的。

3）本发明佐剂施用方法简单，施用安全、环境友好，且在养殖生产中对鱼的生长无不良影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的合成方法

蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的合成工艺为：将蓖麻油先经酸化、再酯化制成蓖麻油聚乙二醇400单酯，最后糖苷化制得蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷；具体操作过程如下：

1）酸化：按重量将蓖麻油和浓硫酸按体积比10∶(0.5～1.5)的比例投入反应釜中进行搅拌、升温，当温度升高至105℃时，取样检验下层溶液的pH值，然后用蓖麻油将pH值调节至2～3，保温反应0.5小时，停止加热和搅拌，静置0.5～1小时，将下层酸液放入贮存容器或回用，在上层的油中加入等体积的自来水洗涤，反复洗涤至放出水液的PH值为4～5为止，然后搅拌加热，在真空度为600mm/Hg下加热至250℃维持0.5小时，进行脱水处理，使含水量降至万分之三以下，得脱水后的蓖麻油；

2）酯化：将上述脱水后的蓖麻油和聚乙二醇400按质量比4:3的比例投入到反应釜中，再将占两者总质量2%～5%的对甲苯磺酸加入至反应釜中，在搅拌下加热至温度（80~90℃），保温反应6小时；然后取样测定粗酯的酸值，依酸值加入过量1%的碳酸钠，在搅拌下快速升温至100～120℃后反应10分钟；获得产物蓖麻油聚乙二醇400单酯；

3）糖苷化：将上述制得的蓖麻油聚乙二醇400单酯与一水葡萄糖按摩尔比1:1投入反应设备，并加入1%的路易斯酸作催化剂，在真空和氮气保护下于120℃反应6小时，反应物由浑浊变成淡黄色透明液体，即得到最终成品，即蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷。

实施例2～5：一种渔用浸泡疫苗的佐剂

实施例2～5所述的渔用浸泡疫苗佐剂的配方如表1所示（表中的数值均为质量份数）。

表1实施例2～5所述的渔用浸泡疫苗佐剂的配方

将表1中的各成分按相应的质量份数混匀即可获得实施例2～5所述的渔用浸泡疫苗佐剂。

实施例6 渔用浸泡疫苗佐剂的应用方法

渔用浸泡疫苗佐剂的使用方法：

1）将上述实施例2~5任一制备的渔用浸泡疫苗佐剂加入自来水中搅拌，混合均匀，得到的溶液为浸泡免疫溶液1；

2）将上述1）得到的浸泡佐剂溶液1与疫苗溶液按体积比1:（100~200）混合均匀，得到的混合溶液为浸泡免疫溶液2，其中各组分终浓度分别为：蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷1~20µg/mL、氮酮0~10µg/mL、山莨菪碱0~30µg/mL；

3）将需要免疫的鱼体放入浸泡免疫溶液2中，充气浸泡15-30min，即完成免疫。

下面对上述实施例制备的蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷及其作为组分的组合佐剂（实施例2～5）作进一步的效果检测。

一、蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷及其作为组分的组合佐剂与嗜水气单胞菌灭活疫苗联合浸泡免疫异育银鲫

1.材料：

1.1试验鱼：异育银鲫体重（5±1）g，体长（6.5±0.5）cm。实验前暂养2周，观察摄食活动状态，确认健康后用于实验。实验期间水温（26±1）℃。

1.2菌种：嗜水气单胞菌YYK090901菌株为中国水产科学研究院珠江水产研究所自行分离、鉴定并保藏的细菌，为本次实验的疫苗制备菌株和攻击菌株。

1.3疫苗溶液：嗜水气单胞菌灭活前浓度为0.96×10¹⁰CFU/mL-1.63×10¹⁰CFU/mL，经0.3%甲醛28 ℃灭活48-72h，无菌检验合格后4℃保存备用。使用前用曝气自来水稀释50倍，使细菌抗原浓度在1×10⁸CFU/mL以上，得到疫苗溶液。

2.方法

2.1分组：每组2个平行，每个平行30尾试验鱼。

组合佐剂+疫苗组：疫苗溶液中含有实施例2制备的组合佐剂，即：疫苗溶液中含有10µg/mL 蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷、5µg/mL氮酮、15 µg/mL山莨菪碱；

蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷+疫苗组：疫苗溶液中含有实施例3制备的组合佐剂，即疫苗溶液中含有10µg/mL 蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷、0µg/mL氮酮、0 µg/mL山莨菪碱；

疫苗组：不含本发明佐剂中的任何成分及其他佐剂的疫苗溶液；

对照组：不含任何佐剂成分及疫苗的养殖用水；

2.2免疫程序：将异育银鲫分别放入四种溶液中浸泡15-30 min进行首次免疫，捞出，首次免疫7 d后经同样的方法进行二次加强免疫。

2.3鱼体保护试验：首次免疫后第28天，用半数致死量LD₅₀（8.7×10⁶CFU/mL，0.1mL）的嗜水气单胞菌YYK090901菌株腹腔注射攻击各组试验鱼。每天观察记录死亡数，连续观察14 d。计算相对免疫保护率（RPS）：RPS=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%。

3. 结果

活菌攻击结果如表2所示，YYK090901菌株攻击各组试验鱼，连续观察14d结果显示，各组死亡时间集中在活菌攻击后12h～72h，72h后无死亡情况发生。对照组、无佐剂疫苗组、蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷+疫苗组、组合佐剂+疫苗组平均累计死亡率分别为85%、40%、25%、11.67%。相对免疫保护率由高到低依次为组合佐剂+疫苗组（86.27%）、蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷组+疫苗组（70.59%）、无佐剂疫苗组（52.94%）。具体结果如下表2所示。

上述结果说明，蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷及其作为组分的组合佐剂均具有提高疫苗的免疫效果，其中组合佐剂效果优于蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的。

表2各组的相对免疫保护率

二、蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷及其作为组分的组合佐剂与维氏气单胞菌灭活疫苗联合浸泡免疫草鱼

1.材料：

1.1试验鱼：草鱼体质量（20±1.5）g，体长（12±1.5）cm。实验前暂养2周，观察摄食活动状态，确认健康后用于实验。实验期间水温（26±1）℃。

1.2菌种：维氏气单胞菌LYK090701菌株为中国水产科学研究院珠江水产研究所自行分离、鉴定并保藏的细菌，为本次实验的疫苗制备菌株和攻击菌株。

1.3疫苗溶液：维氏气单胞菌灭活前浓度为0.88×10¹⁰CFU/mL-1.23×10¹⁰CFU/mL，经0.3%甲醛28 ℃灭活48-72h，无菌检验合格后4℃保存备用。使用前用曝气自来水稀释50倍，使细菌抗原浓度在1×10⁸CFU/mL以上，得到疫苗溶液。

2.方法

2.1分组各组实验鱼：（每组2个平行，每个平行20尾）

组合佐剂+疫苗组：疫苗溶液中含有实施例4制备的组合佐剂，即：疫苗溶液中含有20µg/mL 蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷、1µg/mL氮酮、10 µg/mL山莨菪碱；

对照组：不含任何佐剂成分及疫苗的养殖用水；

2.2免疫程序：将草鱼分别放入四种溶液中浸泡15-30 min进行首次免疫，捞出，首次免疫7 d后经同样的方法进行二次加强免疫。

2.3鱼体保护试验：首次免疫后第28天，用半数致死剂量LD₅₀（2.0×10⁸CFU/mL，0.2mL）的维氏气单胞菌LYK090701菌株腹腔注射攻击各组试验鱼。每天观察记录死亡数，连续观察14 d。计算相对免疫保护率（RPS）：RPS=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%。

3. 结果

活菌攻击结果：LYK090701菌株攻击各组试验鱼，连续观察14d结果显示，各组集中死亡时间在活菌攻击后12h-72h，72h后无死亡情况发生。组合佐剂+疫苗组、蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷+疫苗组、无佐剂疫苗组、对照组平均累计死亡率分别为27.5%、35%、55%、85%。组合佐剂组的相对免疫保护率为67.65%、蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷组的为58.82%、无佐剂疫苗组的为35.29%。结果如下表3所示。

表3各组的相对免疫保护率

上述结果进一步说明，蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷及其作为组分的组合佐剂均具有提高疫苗的免疫效果，其中组合佐剂效果优于蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

Claims

1.蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷在制备渔用疫苗浸泡疫苗佐剂中的应用。

2.一种渔用浸泡疫苗的佐剂，其特征在于：该佐剂由以下质量份数的成分组成：1～20份蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷、0～10份氮酮、0～30份山莨菪碱。

3.根据权利要求2所述的一种渔用浸泡疫苗的佐剂，其特征在于：该佐剂由以下质量份数的成分组成：10份蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷、5份氮酮、15份山莨菪碱。

4.根据权利要求3所述的一种渔用浸泡疫苗的佐剂，其特征在于：所述的蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的制备方法为：先将蓖麻油先经浓硫酸酸化脱水，再与聚乙二醇400进行酯化反应生成蓖麻油聚乙二醇400单酯；蓖麻油聚乙二醇400单酯再与葡萄糖发生反应被糖苷化，即得蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷。

5.根据权利要求4所述的一种渔用浸泡疫苗的佐剂，其特征在于：所述的蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷的制备方法具体包括以下步骤：

1）酸化：按重量将蓖麻油和浓硫酸按比例10∶(0.5～1.5)混匀，加热至100～110℃时，用蓖麻油将下层溶液pH值调节至2～3，保温反应25～35min，停止加热和搅拌，静置0.5～1h，取上层的油中水反复洗涤至放出水液的pH值为4～5为止，然后搅拌加热，在真空度为580~620mm/Hg下加热至240~260℃维持25～35min，进行脱水处理，使含水量降至万分之三以下，得脱水后的蓖麻油；

2）酯化：按重量计将上述脱水后的蓖麻油和聚乙二醇400按重量比（3.8～4.2）：（2.8～3.2）混匀，再加入重量为聚乙二醇400与脱水后的蓖麻油两者总重量的2%～5%的对甲苯磺酸，在搅拌下加热至80~90℃，保温反应5.6～6.5h；然后取样测定粗酯的酸值，依酸值加入过量碳酸钠，在搅拌下升温至100～120℃后反应8~12min；获得蓖麻油聚乙二醇400单酯；

3）糖苷化：将上步所得的蓖麻油聚乙二醇400单酯与一水葡萄糖按摩尔比1:1混匀，并加入路易斯酸作催化剂，在真空和氮气保护下于110～130℃反应5.5～6.5h，反应至溶液由浑浊变成淡黄色透明液体，即得到最终成品，即蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷。