CN102307477A - 佐剂组合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够调节受试者中的免疫应答的佐剂组合物。此类佐剂组合物还可用于增强抗原的免疫原性。还提供了制备所述佐剂组合物的方法以及使用所述佐剂组合物的方法。

Description

佐剂组合物及使用方法
与相关申请的交叉引用
本申请对于2009年1月5日提交的美国临时申请No.61/204,316要求优先权。
政府资助
本发明是在国立卫生研究院授予的基金号1R43AI084690-01下由政府资助而进行的。政府在本发明中拥有一定的权利。
技术领域
本公开涉及佐剂组合物及其使用方法。
背景
疫苗是非常有成本效益的医疗干预。然而，虽然许多疾病已通过疫苗接种而被预防，许多其它疾病仍有待预防。此外，对于许多已存在针对其的疫苗的疾病，需要改进的疫苗。产生疫苗的主要病症是疫苗缺乏免疫原性或免疫原性低。疫苗的功效可通过使用佐剂和递送系统而被增强。特别感兴趣的是增加通过经由粘膜途径的无针方法施用的疫苗的免疫原性的佐剂。
概述
本公开提供了能够调节受试者中免疫应答的佐剂组合物。此类佐剂组合物还可用于通过增强抗原递呈、通过例如天然杀伤细胞的活化和/或直接的B细胞活化而增强先天免疫应答，来增强抗原的免疫原性。还提供了制备所述佐剂组合物的方法以及使用所述佐剂组合物的方法。
在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油；和下列的至少一种：(a)类黄酮，或类黄酮衍生物，或类黄酮衍生物的盐；和(b)维生素，或者其衍生物或盐，其中所述维生素选自维生素A、维生素E、维生素D、维生素C。在某些情况下，所述组合物包含芥子油和类黄酮(例如儿茶素)或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐。在某些情况下，所述类黄酮是儿茶素、或者其衍生物或盐。在某些情况下，所述组合物包含芥子油和维生素，或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油、类黄酮，或类黄酮衍生物，或类黄酮衍生物的盐以以及维生素，或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油并且所述维生素可以是维生素E或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油和维生素A或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油和维生素C或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油、儿茶素或者其衍生物或盐以及维生素A或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油、儿茶素，或者其衍生物或盐以及维生素E，或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油、类黄酮(例如儿茶素)或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐，以及异硫氰酸烯丙酯。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油、维生素(例如维生素A)或者其衍生物或盐，以及异硫氰酸烯丙酯。在某些实施方案中，所述组合物包含芥子油、类黄酮(例如儿茶素)或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐、维生素(例如维生素A)或者其衍生物或盐、以及异硫氰酸烯丙酯。在某些方面，所述组合物还包含抗原。在某些实施方案中，所述佐剂组合物包含异硫氰酸烯丙酯以及类黄酮和维生素的至少一种。
可通过许多途径例如鼻内、经肺、舌下、口服、含服(buccal)、阴道内、直肠内、经眼、真皮内、经皮肤、经皮(transcuataneous)、皮下、静脉内和肌内向受试者(例如哺乳动物)施用所述组合物。
还提供了制备所述组合物的方法，所述方法包括将芥子油与下列的至少一种混合：类黄酮，或类黄酮衍生物，或类黄酮衍生物的盐，以及维生素或者其衍生物或盐。
本申请还提供了包含药学上可接受的植物油；类黄酮或类黄酮衍生物，或类黄酮衍生物的盐；以及维生素或维生素衍生物或维生素衍生物盐的组合物，其中所述维生素选自维生素A、维生素E、维生素D、维生素C。在某些情况下，所述组合物包含植物油和类黄酮(例如儿茶素)或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐。在某些情况下，所述类黄酮为儿茶素或者其衍生物或盐。某些情况下，所述组合物包含植物油和维生素或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油、类黄酮或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐以及维生素或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油并且所述维生素可以是维生素E或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油和维生素A或其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油和维生素C或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油、儿茶素或者其衍生物或盐、以及维生素A或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油、儿茶素或者其衍生物或盐、以及维生素E或者其衍生物或盐。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油、类黄酮(例如儿茶素)或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐以及异硫氰酸烯丙酯。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油、维生素(例如维生素A)或者其衍生物或盐以及异硫氰酸烯丙酯。在某些实施方案中，所述组合物包含植物油、类黄酮(例如儿茶素)或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐、维生素(例如维生素A)或者其衍生物或盐和异硫氰酸烯丙酯。在某些方面，所述组合物还包含抗原。
附图简述
图1显示在单一肌内(IM)疫苗接种后3周时抗-HA IgG1抗体和抗-流感-HA IgG2a抗体的血清滴度。
图2显示在第二次肌内(IM)疫苗接种后1周时抗-流感-HA IgG1抗体和抗-流感-HA IgG2a抗体的血清滴度。
图3显示在第二次肌内(IM)疫苗接种后1周时抗-流感-HA IgA抗体的血清滴度。
图4显示在第二次肌内(IM)疫苗接种后1周时阴道灌洗(vaginallavage)中抗-流感-HA IgG1抗体的滴度。
图5显示在第二次肌内(IM)疫苗接种后1周时阴道灌洗中抗-流感-HA IgA抗体的滴度。
图6显示在第二次肌内(IM)疫苗接种后1周时用流感-HA离体活化后的TH1、TH2和Treg应答。
图7显示在第二次鼻内(IN)疫苗接种后2周时抗-HIVgp120IgG1抗体和抗-HIVgp-120IgG2a抗体的血清滴度。
图8显示在第二次IN疫苗接种后2周时阴道灌洗中抗-HIVgp120IgG1抗体和抗-HIVgp120IgA抗体的滴度。
图9显示在两次IN/SL(鼻内/舌下)和两次IM疫苗接种后1周时抗-HIVgp 120IgG1、IgG2a和IgA抗体的血清滴度。
图10显示在两次IN/SL(鼻内/舌下)和两次IM疫苗接种后1周时阴道灌洗中抗-HIVgp 120IgG1和IgA抗体的滴度。
在描述本发明和本发明的特定示例性实施方案之前，要理解本发明不限定于所描述的特定实施方案，这样其当然可以变化。还应理解，本申请中所使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而不意欲是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。
当提供数值范围时，应理解除非语境中另有明确的指示，否则在所述范围的上限和下限之间的各个中间值(intervening value)(至下限的单位的十分之一)和在该所述范围内的任何其它的所述值或中间值均被包括在本发明内。可被独立地包括在所述更小范围中的这些更小范围的上限和下限也被包括在本发明中，受所述范围内任何被特别排除的限制所限。当所述范围包括所述界限的一个或两个时，排除这两个所包括的界限的范围也被包括在本发明中。
除非另有定义，否则本申请中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本申请中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实施或测试，但现在描述了优选的方法和材料。本申请中提及的所有出版物均通过引用而被并入，以公开和描述与所述出版物被引用相关联的方法和/或材料。当此类出版物可能展示与本公开所明示或暗示的定义矛盾的术语定义时，以本公开的定义为准。
必须指出，如本申请中和所附权利要求中所使用的，除非语境中清楚地另外指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数所指物。因此，例如，提及“一种(an)佐剂组合物”包括多种佐剂组合物，提及“一种(a)维生素”包括1、2或更多种维生素，以及提及“一种(a)类黄酮”包括1、2或更多种类黄酮等等。术语佐剂和递送系统可互换地使用。
本申请中所谈论的出版物仅为了其在本申请的申请日之前的公开而被提供。本申请中没有任何内容将被解释为承认本发明无权因为是在先发明而局先于此类出版物。此外，所提供的出版物的日期可能与可能需要独立地确认的实际出版日期不同。
示例性实施方案详述
本公开提供能够调节受试者中免疫应答的佐剂组合物。此类佐剂组合物还可被用于通过增强抗原递呈、通过例如天然杀伤细胞的活化和/或直接的B细胞活化而增强先天免疫应答，来增强抗原的免疫原性。还提供了制备所述佐剂组合物的方法以及使用所述佐剂组合物的方法。
定义
短语“佐剂组合物”是指当向受试者施用时能够诱导受试者中的免疫应答的组合物。当与抗原组合而被施用时，“佐剂组合物”能够引起抗原特异性免疫应答。
对抗原或组合物的“免疫应答”是受试者中对存在于目的抗原或组合物中的分子的体液和/或细胞免疫应答的发生。“体液免疫应答”是指主要由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是主要由T淋巴细胞和/或其它白血细胞介导的免疫应答。
短语“药学上可接受的”是指通常是安全的、并且当受试者是非人时对于兽医用途而言是可接受的物质。对于人“药学上可接受的”是指通常是安全的、并且对于人的药物用途而言是可接受的物质。
术语“抗原”是指可在适当的条件下被免疫系统所识别(例如，被抗体结合或经加工以引起由例如T细胞产生的细胞免疫应答)的任何物质。抗原包含一个或多个表位。B细胞表位包括至少约3至5个氨基酸，例如4个或更多个氨基酸。半抗原或多糖也可作为B细胞表位。T细胞表位(例如细胞毒性T细胞(CTL)表位)可包括至少约7至9个氨基酸，例如8个或更多个氨基酸。辅助T细胞表位可包括至少约12至20个氨基酸。术语“抗原”表示亚单位抗原(即，与抗原天然所结合的完整生物体相分离的抗原)以及被杀死的、减毒的或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物、朊病毒、变应原或任何其它引起疾病的试剂。抗原可以是经修饰的蛋白质，其包括修饰(例如对天然蛋白质序列的缺失、添加和置换(通常在性质上是保守的))。术语抗原还表示编码蛋白质或肽抗原的核酸(DNA或RNA)。
如本申请中所使用的，“穿透促进(Penetration enhancement)”或“渗透促进(permeation enhancement)”是指增加皮肤或粘膜层对抗原的渗透性以增加抗原穿过皮肤或粘膜层并进入淋巴结或血流的速度。
“治疗有效量”或“有效量”是指当向哺乳动物或其它受试者施用以预防或治疗疾病时，足以实现对疾病的所述预防或治疗的化合物的量。“治疗有效量”将取决于化合物，疾病及其严重度，和待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
概述
本公开提供能够引起免疫应答的佐剂组合物。此类佐剂组合物也可被用于通过增强抗原递呈、通过例如天然杀伤细胞的活化和/或直接的B细胞活化而增强先天免疫应答，来增强抗原的免疫原性。还提供了制备所述佐剂组合物的方法以及使用所述佐剂组合物的方法。
佐剂组合物
本申请中提供的佐剂组合物包含：药学上可接受的植物油；类黄酮，或类黄酮衍生物，或类黄酮衍生物的盐；以及维生素或者其衍生物或盐。所述维生素可以是维生素A、维生素E、维生素D、维生素C。
在另一个实施方案中，本申请中所提供的组合物包含：具有或不具有异硫氰酸烯丙酯的芥子油(芥子精油)；以及下列的至少一种：(a)类黄酮或类黄酮衍生物，或类黄酮衍生物的盐；和(b)维生素，或者其衍生物或盐。所述维生素可以是维生素A、维生素E、维生素D、维生素C或者其衍生物或盐。
在某些实施方案中，所述类黄酮是黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、儿茶素、花色素或异黄酮，或其衍生物或衍生物的盐。在某些实施方案中，所述佐剂组合物包含芥子油和儿茶素(例如儿茶素水合物)。
在某些实施方案中，所述佐剂组合物包含一种或多种维生素(例如维生素A、维生素E、维生素D、维生素C、其衍生物和盐)以及植物油载体(例如芥子油)。此类佐剂组合物可任选地包含类黄酮或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐。在某些实施方案中，所述佐剂组合物包含维生素A和油载体(例如芥子油)。在某些实施方案中，所述佐剂组合物包含维生素E和油载体(例如芥子油)。
所述佐剂组合物可任选地包含其它添加剂，例如防腐剂、着色剂、香料(flavorant)等。所述佐剂组合物可还包含抗原。
药学上可接受的植物油载体
如本申请中所使用的“药学上可接受的植物油载体”是指适合于通过所需的途径(例如全身性或粘膜途径，包括口服和局部递送途径)向人或非人动物施用的植物油。本公开包括了可食用的佐剂组合物。
“植物油”是指可从植物或植物产品中获得的油，并包括可从种子(包括坚果、谷物)、果实、根、花、茎等获得的油。实例包括玉米油、芥子油、橄榄油、椰子油、红花油、豆油等。本公开的植物油包括可从非遗传修饰和经遗传修饰的植物获得的油。植物油包括具有发红剂性质的植物油，即，例如当局部用于皮肤时促进毛细血管的扩张和增加血液循环的油。植物油可源自植物或植物产品(例如，非遗传修饰或经遗传修饰的植物或植物产品)，或可被合成产生，例如通过混合在植物油中发现的单个组分，其中所述单个组分可源自植物或植物产品，或被合成产生。所述提供植物油或单个脂肪酸的来源的植物可以是经遗传修饰的。
在某些实施方案中，所述植物油是芥子油。如本申请中所使用的“芥子油”是指可从十字花科(Brassicacae)的芥属植物的种子获得的油，其中所述油可在提取过程中不加热而从芥属植物获得(例如，可通过冷榨提取法获得)。可不加热而从芥属植物的种子获得的芥子油比使用基于加热的提取法(例如，通过使用蒸气)而可从相同种子获得的油具有更少量的(例如，不显著的或不可检测的)异硫氰酸烯丙酯。可从其获得在本公开的组合物中用作载体的芥子油的十字花科的芥属植物包括但不必限定于芫菁(Brassica rapa)(食用绿植)、黑芥(Brassica nigra)(黑芥)、印度芥菜(Brassica juncea)(棕芥)、白芥(Brassica hirta)(白芥或黄芥)、埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)(埃塞俄比亚芥)、甘蓝(Brassica oleracea)(野生芥)、油菜(Brassica campestris)(包括大油菜(Brassica napus L.)和白菜型油菜(B.campestris L.))以及欧洲油菜(Brassica napus)。“芥子油”所包括的油可包括可从油菜籽获得的油。
在某些实施方案中，所述植物油是芥花籽油。此类芥花籽油可具有下列组成：6-8％的饱和脂肪酸(具有3.5棕榈酸)；14.4％的单不饱和脂肪酸(具有60％的油酸)和69.3％的多不饱和脂肪酸类(具有20％亚油酸，10％的α亚麻酸)。
在某些实施方案中，用于本申请所描述的组合物中的植物油可由约14％-70％的单不饱和脂肪酸、约18％-22％的多不饱和脂肪酸和约5％-12％的饱和脂肪酸构成。所述单不饱和脂肪酸可具有约18％-51％的芥酸和约7％-22％的油酸，所述多不饱和脂肪酸可具有约9-15％的亚麻酸和约6-24％的亚油酸，并且所述饱和脂肪酸可具有约3-4％的棕榈酸。
在某些实施方案中，本申请中描述的组合物中所使用的植物油可由14％-70％的单不饱和脂肪酸、18％-22％的多不饱和脂肪酸和5％-12％的饱和脂肪酸构成。
在某些实施方案中，本申请中描述的组合物中所使用的植物油可由14％-20％的单不饱和脂肪酸、18％-20％的多不饱和脂肪酸和5％-6％的饱和脂肪酸构成。
在某些实施方案中，本申请中描述的组合物中所使用的植物油可由约60％-70％的单不饱和脂肪酸、约18％-22％的多不饱和脂肪酸和约5％-6％的饱和脂肪酸构成。
当所述植物油是芥子油时，在某些实施方案中，所述芥子油可具有下列组成：单不饱和脂肪酸(芥酸(18-51％)、油酸(7-22％))、多不饱和脂肪酸(亚麻酸(9-15％)和亚油酸(6-24％))和5％的饱和脂肪酸。所述芥子油还可额外地包含其它组分，例如蛋白质(30％)、酚醛树脂、植酸钙镁和二巯基硫酮(dithiol thione)。芥子油还可含有490mg/100gm的钙。芥子油还可含有9-15％的ω3脂肪酸。
在一些实施方案中，所述芥子油是可从芜青获得的油。可从芜青获得的芥子油包括具有下列组成的油：5.4％的饱和脂肪酸(具有2.7％的棕榈酸、1.0％的硬脂酸、0.6％的山嵛酸、1.1％的其它)；67.3％的单不饱和脂肪酸(具有23.3％的油酸、10.0％的鳕烯酸、33.8％的芥酸)和20.6％的多不饱和脂肪酸(具有9.4％的亚油酸、9.9％的α亚麻酸)。
在某些实施方案中，所述植物油载体(例如，芥子油)可以是一种或多种植物油的混合物，例如芥子油(添加或不添加AIT)和玉米油；芥子油(添加或不添加AIT)和豆油；芥子油(添加或不添加AIT)和椰子油。本公开还包括具有下列植物油载体的组合物：所述植物油载体本身是发红剂和/或与发红剂油相结合。发红剂油的实例包括冬青油(水杨酸甲酯)、芥子油和迷迭香油(迷迭香(Rosmarinus officinalis))。
类黄酮
所述佐剂组合物可包括一种或多种类黄酮或其衍生物或盐。类黄酮(也已知为生物类黄酮)是在水果和蔬菜中发现的植物素(phytochemical)。类黄酮有下列类型：类黄酮(例如，芹菜素(apigenin)、木犀草素)、黄酮醇类(例如，槲皮素、杨梅黄酮)、黄素酮类(例如，柑桔素、橙皮苷)、儿茶素(例如，表儿茶素、儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯)、花色素/花青苷类(例如，花青定、花葵素)和异类黄酮(例如，染料木黄酮、黄豆苷元)。
在某些实施方案中，所述佐剂组合物可包含表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、儿茶素的一种形式(多酚)。在一些实施方案中，所述佐剂组合物可包含儿茶素，例如儿茶素水合物。在一些实施方案中，所述儿茶素不是儿茶素的多聚体形式。
维生素
所述佐剂组合物可任选地包含一种或多种维生素，或者其衍生物或盐。所述一种或多种维生素可以是维生素A、维生素E、维生素D、维生素C及其衍生物或盐的一种或多种。
维生素A.维生素A是脂溶性维生素，其源自两个来源：预形成的类维生素A(preformed retinoids)和维生素原类胡萝卜素类。类维生素A(例如视黄醛和视黄酸)在动物来源(例如肝、肾、卵和乳制品)中被发现。类葫萝卜素(例如β-胡萝卜素(其具有最高的维生素A活性))在植物(例如深色蔬菜(dark vegetable)或黄色蔬菜(yellow vegetable)和胡萝卜)中被发现。维生素A也已知为视黄醇、视黄酸、抗干眼醇、维生素A醇、维生素A1、全-反式-3，7-二甲基-9-(2，6，6-三甲基-1-环己烷-1-基)-2，4，6，8-任四烯-1-醇。在某些情况下，维生素A的酸衍生物全反式视黄酸(ATRA)可被包含在所述佐剂组合物中。在某些情况下，所述佐剂组合物可包含类维生素A，例如异维A酸(Ro 4-3780)、阿维A酯(RO 10-9359；合成的类维生素A)或莫维A胺(Ro 11-1430)。在某些情况下，维生素A棕榈酸酯(VA)可被包含在所述佐剂组合物中。
维生素E.在8种发挥维生素E活性的天然物质(α-、β-、δ-和γ-生育酚类以及α-、β-、δ-和γ-生育三烯酚类)中，α-生育酚(α-T)传统地被认为是最重要的维生素，因为当在动物模型系统中评估时，其在所有维生素中发挥最高的生物学活性。维生素E也与(±)-α-生育酚和DL-all-rac-α-生育酚、5，7，8-三甲基母育酚、D-α-生育酚、2，5，7，8-四甲基-2-(4′，8′，12′-三甲基十三烷基)-6-色原烷醇和非氧化型(+)-α-乙酸生育酚和相关的all-rac-α-乙酸生育酚同义。相关的分子是D-α-琥珀酸生育酚、琥珀酸维生素E。
在某些实施方案中，包含在所述佐剂组合物中的维生素E可以是α-生育酚(α-T)。在其它情况下，维生素E类似物(例如α琥珀酸生育酚(α-TOS))可被包含在所述佐剂组合物中。
维生素D.维生素D是一组脂溶性激素原，其两种主要形式是维生素D2(或麦角沉钙醇)和维生素D3(或胆钙化醇)。通过阳光照射、食物和补充物获得的维生素D在生物学上是惰性的并且必须经历两次羟化反应而在体内被活化。骨化三醇(1，25-二羟胆钙化醇)是在体内发现的维生素D的活性形式。术语维生素D是指这些代谢产物和这些物质的其它类似物。在某些实施方案中，所述佐剂组合物可包含1，25-二羟维生素D3(DHVD3)。
维生素C.维生素C或L-抗坏血酸对于人而言是必需的营养物。抗坏血酸盐(抗坏血酸的离子)是所有动物和植物中许多关键的代谢反应所需的。维生素C的药效团是抗坏血酸盐离子。在活的生物体中，抗坏血酸盐是抗氧化剂，因为其保护身体免受氧化应激，并且其是若干至关重要的酶促反应中的辅因子。维生素C纯粹是抗坏血酸的L-对映体；相反的D-对映体不具有生理学意义。
添加剂
在某些实施方案中，所述佐剂组合物的植物油载体可包含异硫氰酸烯丙酯(AIT)。异硫氰酸烯丙酯(AIT)也被称为挥发性芥子油或芥子精油或芥子油。AIT是式为CH2CHCH2NCS的有机硫化合物。AIT导致芥子、辣根和绿芥末(wasabi)的辛辣味道。其微溶于水，但良好地溶于大多数有机溶剂中。异硫氰酸烯丙酯来自于黑芥或褐色印度芥(brown Indian mustard)的种子。当这些芥籽破碎时，黑芥子硫苷酸酶被释放并且作用于已知为黑芥子硫苷酸钾(sinigrin)的硫代葡萄糖酸盐上，以产生异硫氰酸烯丙酯。异硫氰酸烯丙酯对于植物是作为抵抗草食动物的防御；因为其对植物本身是有害的，所以其以无害的硫代葡萄糖酸盐的形式贮存，与黑芥子硫苷酸酶分离。当动物咀嚼植物时，异硫氰酸烯丙酯被释放，从而驱赶动物。异硫氰酸烯丙酯在商业上通过烯丙基氯与硫氰酸钾的反应：CH2＝CHCH2Cl+KSCN→CH2＝CHCH2NCS+KCl而产生。以这种方式获得的产物有时已知为合成芥子油。异硫氰酸烯丙酯还可通过种子的干馏而被释放。以这种方式获得的产物已知为挥发性芥子油并且纯度通常为约92％。其主要在食品中用作调味剂。合成的异硫氰酸烯丙酯用作杀虫剂、杀菌剂和杀线虫剂，并且在某些情况下被用于作物保护。
在某些情况下，所述佐剂组合物可由：AIT和维生素(例如，维生素A、C、D、E或者其盐或衍生物的一种或多种)构成。在某些情况下，所述佐剂组合物可由：AIT和类黄酮(例如儿茶素，例如儿茶素水合物)构成。在某些情况下，所述佐剂组合物可由：AIT、维生素(例如，维生素A、C、D、E或者其盐或衍生物的一种或多种)和类黄酮(例如儿茶素，例如儿茶素水合物)构成。
所述佐剂组合物可包含含有角鲨烯的MF59，其是已在动物和人研究中显示出佐剂特性的类萜植物衍生物。然而，在某些实施方案中，所述佐剂组合物中可不包含MF59或角鲨烯。因此，在一些实施方案中，本申请中所提供的佐剂组合物包含类黄酮；药学上可接受的油载体；和任选地选自维生素A、维生素E和维生素C的一种或多种维生素，但不包含MF59或角鲨烯。
所述佐剂组合物可包含皂苷及其衍生物QS-21。然而，在某些实施方案中，皂苷可不被包含在所述佐剂组合物中。因此，在一些实施方案中，本申请中所提供的佐剂组合物包含类黄酮；药学上可接受的油载体；和任选地选自维生素A、维生素E和维生素C的一种或多种维生素但不包含皂苷或其衍生物。
在结构上与天然存在的类异戊二烯佐剂相似的叶绿醇的衍生物膳食二萜醇(dietary diterpene alcohol)引起所有主要IgG亚类(特别是IgG2a)的增加的滴度和细胞毒性效应T细胞应答。所述佐剂组合物可包含叶绿醇或其衍生物。然而，在某些实施方案中，叶绿醇可不被包含在所述佐剂组合物中。因此，在一些实施方案中，本申请中提供的佐剂组合物包含类黄酮；油载体和任选地选自维生素A、维生素E和维生素C的一种或多种维生素，但不包含叶绿醇或其衍生物。
所述佐剂组合物可包含其它添加剂，例如明胶、抗生素、山梨醇、蔗糖、乳糖、其它糖类、生物粘附剂(bioadhesive)、粘膜粘着剂(例如透明质酸或其衍生物，例如HYAFF)、亲水性聚合物和水凝胶类、聚氧化乙烯同聚物、壳聚糖、蜂蜡等。
所述佐剂组合物可包含免疫原性增强剂，例如脂多糖类、肠毒素类例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的不耐热毒素、来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的霍乱毒素、toll样受体激动剂(例如，CpG或CpG寡核苷酸)。例如，可将所述佐剂组合物与其它疫苗递送系统例如明矾、脂质体、水包油乳剂组合。
可用大的、被缓慢代谢的大分子(例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒)来配制所述佐剂组合物。微粒载体(particulate carrier)的实例包括从聚甲基丙烯酸甲酯聚合物衍生的载体以及从聚(交酯类)和已知为PLG的聚(丙交酯-co-乙交酯)衍生的微粒。
所述佐剂组合物可包括包含突变的A亚基和B亚基的全毒素的突变体形式(例如来自大肠杆菌的)，其可以是寡聚的，如在野生型全毒素中一样。B亚基优选是未突变的。然而，预期可与B亚基相分离而使用突变的A亚基，以基本上纯的形式或与其它试剂相复合，所述其它试剂可替代B亚基和/或其功能性贡献。用于所述组合物的LT突变体包括具有一个或多个下列突变的突变体：A亚基中位置63处的丝氨酸的突变和A亚基中位置72处的丙氨酸的突变，例如，位置63处的丝氨酸被赖氨酸置换以及位置72处的丙氨酸被精氨酸置换。
所述佐剂组合物可包含霍乱毒素(″CT″)或者其去毒突变体，或者从生物可降解的且无毒性的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)形成的微粒(即，直径约100nm至约150μm，更优选直径约200nm至约30μm和更优选直径约500nm至约10μm的颗粒)。
可使用聚(α-羟酸)，特别是由聚(丙交酯)(″PLA″)(其为D，L-丙交酯与乙交酯或乙醇酸的共聚物)例如聚(D，L-丙交酯-co-乙交酯)(″PLG″或″PLGA″)或D，L-丙交酯与己内酯的共聚物，来将本申请中公开的佐剂组合物配制为微粒。所述微粒可源自各种聚合起始材料的任一种，所述各种聚合起始材料具有各种分子量并且在共聚物(例如PLG)的情况下具有各种丙交酯∶乙交酯比率，对其的选取将主要是个选择的问题，部分取决于共施用的抗原。如果所述组合物包含抗原，抗原可被圈闭在微粒内，或者可被吸附于其表面上。
在某些实施方案中，本申请中公开的组合物包含免疫调节因子，例如能够调节免疫应答的蛋白质。免疫调节因子的非限制性实例包括淋巴因子(也已知为细胞因子)例如IL-6、TGF-β、IL-1、IL-2、IL-3等)；和趋化因子(例如，分泌的蛋白质例如巨噬细胞抑制因子)。某些细胞因子例如TRANCE、flt-3L和CD40L的分泌形式能够增强APC的免疫刺激能力。可被单独使用或与本申请中公开的组合物结合使用的细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素-2(IL-2)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、G-CSF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1α(IL-1.α)、白细胞介素-11(IL-11)、MIP-1γ、白血病抑制因子(LIF)、c-kit配体、血小板生成素(TPO)、CD40配体(CD40L)、肿瘤坏死因子相关激活诱导因子(TRANCE)和flt3配体(flt-3L)。
所述佐剂组合物可包含乳化剂(例如卵磷脂)，例如为两性的且对于人和/或兽医学用途是可接受的磷脂类和/或表面活性剂。所述表面活性剂可以是离子性的(例如Tween80)、阳离子性的(例如CTAB)或两性离子性的(例如CHAPS)。表面活性剂对于人和/或兽医学用途的可接受性可由本领域技术人员来确定。如果表面活性剂分子的一部分是疏水性的而一部分是亲水性的，则此表面活性剂是两亲的。用于本申请中公开的佐剂组合物的表面活性剂的实例包括但不限于Tween表面活性剂和Span表面活性剂。Tween和Span表面活性剂包括但不限于单月桂酸酯(Tween 20、Tween 21、Span 20)、单棕榈酸酯(Tween 40、Span 40)、单硬脂酸酯(Tween 60、Tween 61、Span 60)、三硬酯酸酯(Tween 65、Span 65)、单油酸酯(Tween 80、Tween 81、Span 80)和三油酸酯(Tween 85、Span 85).
所述佐剂组合物可包含接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、磷酸盐缓冲液等。
所述佐剂组合物可包含药用发红剂(medicinal rubefacient)，例如辣椒素(源自辣椒，辣椒(Capsicum minimum))、水杨酸盐类(例如冬青油，水杨酸甲酯)、烟酸酯、擦洗用酒精、普通草本发红剂包括：丁香(Eugenia caryphyllus)、大蒜(Allium sativum)、姜(Zingiberofficinale)、辣根(Cochlearia armoracia)、芥子(例如白芥或黑芥)、荨麻(Urtica dioica)、迷迭香油(Rosmarinus officinalis)、芸香(Ruta graveolens)。
抗原
可将本申请中公开的佐剂组合物与一种或多种抗原组合施用。可使用期望诱导针对其的免疫应答的任何抗原。这样的抗原可从病毒、真菌、或细菌或其它人和/或动物病原体、或癌细胞获得。所述抗原可以是变应原。全长蛋白质或其片段以及经修饰的或未修饰的蛋白质可用作抗原。抗原还可包括多糖。在一些情况下，抗原可由DNA或RNA(例如源自病原体或癌细胞的)编码。
癌抗原。许多人类癌症表达特异于癌细胞的细胞表面分子，即，它们不被正常人的体细胞以可检测水平或显著水平表达。此类抗原的实例包括但不限于下列：各种糖脂类和多糖、A-甲胎蛋白(AFP)和癌抗原CA125、CA15-3和CA19-9。
AFP：血清AFP上升到异常高的值发生在几种恶性疾病(包括非精原细胞瘤睾丸癌和原发性肝细胞癌)和一些良性疾病(包括肝炎和肝硬化)中。
CA125：癌抗原125(CA125)是与上皮卵巢癌相关的表面抗原，并且迄今为止CA125是残留上皮卵巢癌的最灵敏的标志物。CA125也可在患有肺癌、宫颈癌、输卵管癌以及子宫癌和子宫内膜异位症的患者中升高。
CA15-3：癌症抗原15-3(CA15-3)用于就复发，特别是转移性疾病而术后监控乳腺癌患者。已显示CA15-3在卵巢癌复发的早期检测中是有用的。CA15-3水平也在结肠肿瘤、肺肿瘤和肝肿瘤中增加。
CA19-9：血清CA19-9水平通常在患有某些胃肠恶性肿瘤(例如胰腺癌、结直肠癌、胃癌和肝癌)的受试者中升高。持续升高的血清CA19-9值可能与进行性的恶性病和不良治疗反应相关联。减小的CA 19-9值可标示着有利的预后和对治疗良好的反应。
朊病毒抗原。传播性海绵状脑病(TSE)是特征在于快速进行性衰退(progressive deterioration)(在认知功能和/或协调方面)的一组神经退行性疾病，其总是导致死亡。TSE在人和动物中发生。TSE的最可能的原因是根据羊瘙痒症(朊病毒疾病最古老的已知形式)命名的被称为PrPSc的朊蛋白形式，其其源自绵羊和山羊。朊病毒如何引起脑损伤目前还不清楚，但所有的假设都暗示PrPSc对天然朊蛋白(PrPC)的翻译后修饰以形成淀粉样蛋白纤维是发病机制中的中心事件。
在人中，克罗伊茨费尔特-雅各布病(CJD)是最普遍的TSE(发病率1/百万/年)。临床上，患者可被诊断为可能的或很可能CJD患者，但神经病理学确认是获得确切诊断所必需的。神经病理学检查基于组织学损害的三元素：棘细胞层水肿、神经元丧失和反应性星形胶质化。
朊病毒蛋白(PrP)最初被描述为导致传播性海绵状脑病(TSE)的传染剂的关键组分。TSE是一组神经退行性病症，其包括人中的克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)和库鲁病、牛海绵状脑病、绵羊疯痒病以及鹿和麋鹿中的慢性消耗性疾病。虽然对TSE的病理生理学仍然知之甚少，但几乎不变的特征是PrP(羊瘙痒症PrP，称为PrPSc)的异常同种型在患病个体被感染的组织中的积累。发现PrP是由宿主的独特基因Prnp(在人中为PRNP)编码的，其结构在物种之间非常保守。其生理学产物以可变的水平在许多组织中被表达为称作细胞PrP(PrPC)的GPI锚定膜蛋白。
病原体。与本申请中描述的佐剂组合物组合使用的抗原包括源自任何病原体(包括病毒、细菌或真菌、或癌症)的抗原。此类抗原包括，例如病原体的结构以及非结构蛋白(以它们的天然形式或以经优化而增强免疫原性的形式)例如HI V的Env、Gag和Pol，或RSV的F蛋白、或流感病毒的HA。
可包含在所述佐剂组合物中的其它抗原是：来自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)血清群B的蛋白质抗原，例如国际专利申请公开案：WO99/24578；WO99/36544；WO99/57280；WO 00/22430和WO96/29412中的蛋白质抗原；来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群B的外膜囊泡(outer membrane vesicle)(OMV)制备物，例如国际专利申请WO0152885中公开的那些；来自脑膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的寡糖抗原；来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖类抗原、来自甲型肝炎病毒的抗原(例如灭活的病毒)、来自乙型肝炎病毒的抗原(例如表面和/或核心抗原)、来自丙型肝炎病毒、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原(例如百日咳全毒素(pertussis holotoxin)(PT))和来自百日咳博德特菌的丝状血球凝集素(FHA)(任选地也与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2相组合)、白喉抗原(例如白喉类毒素)、破伤风抗原(例如破伤风类毒素)、来自流感嗜血杆菌B型(Haemophilus influenzae B)的糖类抗原、来自淋球菌(N.gonorrhoeae)的抗原(例如国际专利申请公开案WO99/24578；WO99/36544；WO99/57280)。其它目的抗原包括来自下列的抗原：肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)(例如国际专利申请WO0202606；国际专利申请公开案：WO99/27105；WO00/27994；WO00/37494)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(例如国际专利申请WO99/28475)、龈紫单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、脊髓灰质炎抗原(例如I PV或OPV)、狂犬病抗原(例如冻干的灭活病毒(例如77，RabAvert.TM))、麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原、流感抗原(例如血球凝集素和/或神经氨酸苷酶表面蛋白、呼吸道合胞病毒(例如F或G蛋白)、病毒的嵌杯病毒科(例如诺罗病毒(norovirus)和沙波病毒(sapovirus))、呼肠孤病毒科(例如轮状病毒)、单纯疱疹病毒、朊病毒、沙门氏菌(Salmonella bacteria)、大肠杆菌、霍乱弧菌(Vibriocholera)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌(streptococcus))[例如国际专利申请PCT/GB01/04789]、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(A组链球菌)[例如国际专利申请PCT/GB01/04789]、金黄色葡萄球菌(Staphlylococcus aureus)、呼吸道合胞病毒(例如F或G蛋白)、病毒的嵌杯病毒科(例如诺罗病毒和沙波病毒(sapovirus))、呼肠孤病毒科(例如轮状病毒)、单纯疱疹病毒、沙门氏菌。
可将糖或糖类抗原缀合至载体蛋白。例如，示例性的载体蛋白是细菌毒素或类毒素(例如白喉毒素、霍乱毒素、大肠杆菌不耐热类毒素或破伤风类毒素、CRM.sub.197白喉类毒素)，脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白[欧洲专利申请0372501]，合成肽[欧洲专利申请0378881和0427347]，热激蛋白[国际专利申请WO93/17712]，百日咳蛋白[国际专利申请WO98/58668；也参见EP 04711771]，来自流行性嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[国际专利申请WO 00/56360.]，来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[国际专利申请WO 00/61761]。可使用任何适当的缀合反应，必要时使用任何适当的连接体。
编码抗原的核酸。所公开的免疫调节/佐剂组合物可包含编码抗原、编码上述多肽抗原或蛋白质抗原的核酸。可由核酸编码并且作为基于DNA或RNA的疫苗和载体疫苗被提供的抗原的实例包括用于HIV、疱疹、肝炎和流感的疫苗。
组合物的实例
示例性组合物提供于下面的表1中。
表1
Figure BDA0000081914470000191
Figure BDA0000081914470000201
上述佐剂组合物1-26是示例性的并且可包含额外的组分，例如额外的油载体(例如葵花子油、椰子油、豆油)。在其它实施方案中，上述组合物1-26不包含额外的油载体(例如葵花子油、椰子油、豆油)。
表1中所述的佐剂组合物1-26以及本说明书中描述的其它佐剂组合物可包含额外的组分，例如添加剂(例如抗原、防腐剂、着色剂、香料、缓冲剂、盐等)。
佐剂组合物的组分和其相对量
本申请中所描述的佐剂组合物可被用于诱导免疫应答例如Th-1应答。Th-1应答可能特别适合相应于病毒感染、细胞内病原体和肿瘤细胞，因为其包括活化CTL的IL-2和IFN-γ。
本申请中所描述的佐剂组合物可被用于诱导免疫应答例如Th-2应答。Th-2应答可能更适合相应于细胞外细菌和蠕虫寄生虫并且还可介导变态反应，因为已知IL-4和IL-5诱导IgE的产生和嗜酸性粒细胞(eosinophil)的活化。
如果需要更高的Th-2应答，那么可将维生素A(例如，全反式维甲酸(ATRA)，一种维生素A的酸性衍生物)包括在佐剂组合物中。在某些情况下，可能需要引起Th-1型免疫应答。在这些情况下，所述佐剂组合物可包含维生素C(例如，抗坏血酸盐)和/或维生素D和/或维生素E和/或类黄酮。
所述佐剂组合物可在佐剂组合物中包含：类黄酮和维生素A；或类黄酮、维生素C和维生素A；或类黄酮、维生素D和维生素A；或类黄酮、维生素E和维生素A；或类黄酮、维生素C和E以及维生素A；或类黄酮、维生素C和D以及维生素A；或类黄酮、维生素D和E以及维生素A。要理解，各前述佐剂组合物包含药学上可接受的植物油(例如芥子油、玉米油、豆油、葵花油等)。此外，要理解各前述组合物可包含所提及的维生素或者其盐或衍生物。类似地，所述类黄酮可以是类黄酮或其盐或衍生物。
在某些实施方案中，与包含药学上可接受的植物油(例如芥子油)和类黄酮或包含药学上可接受的植物油(例如芥子油)和维生素(例如，维生素A、C、D和/或E)的佐剂组合物的效果相比，在佐剂组合物中包含药学上可接受的植物油(例如芥子油)、类黄酮和维生素(例如，维生素A、C、D和/或E)可产生增强的免疫应答(例如，协同效应)。
本申请中公开的佐剂组合物可包含芥子油或另一种药学上可接受的油载体。具有发红剂性质的药学上可接受的油载体(例如芥子油)适合于制备用于通过粘膜或皮肤的上皮细胞施用或直接注射施用(通过例如肌内或真皮内施用)的佐剂组合物。
以液体形式用于本申请中所描述的佐剂组合物中的药学上可接受的油载体(例如芥子油)的体积可在佐剂组合物的总体积的1至95％的范围内。因此，在某些情况下，药学上可接受的油载体可构成主题(subject)佐剂组合物总体积的1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％(按体积计)。
可被包含在主题佐剂组合物中的维生素(或其盐或衍生物)的量可基于受试者的体重来确定。一般地，推荐的每日供给量可被用于确定可存在于主题佐剂组合物中的维生素的量。
例如，可被包含在主题主体佐剂组合物中的维生素A的量可在1至250μg/kg体重的范围内，例如1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、70μg/kg、90μg/kg、110μg/kg、130μg/kg、150μg/kg、170μg/kg、190μg/kg、210μg/kg、230μg/kg或250μg/kg体重。
例如，可被包含在主题佐剂组合物中的维生素C的量可在1至100mg/kg体重的范围内，例如1、5、10、15、30、50、70、80、90或100mg/kg体重。
例如，可被包含在主题佐剂组合物中的维生素D的量可在0.01至10μg/kg的体重的范围内，例如0.01、0.5、1、2、5、7、8、9或10μg/kg体重。
例如，可被包含在主题佐剂组合物中的维生素E的量可在0.01至10μg/kg体重的范围内，例如0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、7、8、9或10μg/kg体重。
可被包含在主题佐剂组合物中的类黄酮(或其盐或衍生物)的量可基于受试者的体重来确定。类黄酮(例如儿茶素(如儿茶素水合物))的量可在1至100mg/kg的受试者体重的范围内，例如1、5、10、15、30、50、70、80、90或100mg/kg的体重。
所述佐剂组合物可以是悬浮剂、片剂(用于吞咽或咀嚼的)、快速溶解片剂或凝胶或贴带(strips)、胶囊、粉剂、凝胶、乳膏剂、洗剂、软膏剂、气溶胶等的形式。
用于向人受试者施用的示例性佐剂组合物可包含3-80％体积/体积的芥子油，例如，3％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％体积/体积的芥子油。
用于向人受试者施用的示例性佐剂组合物可包含0.1-100mg的维生素A，例如0.1、0.5、1、5、10、15、30、50、70、80、90或100mg维生素A。
用于向人受试者施用的示例性佐剂组合物可包含0.1-400mg的维生素E，例如0.1、0.5、1、5、10、15、30、50、70、80、90、100、200、300或400mg的维生素E。
用于向人受试者施用的示例性佐剂组合物可包含0.1-2000mg的维生素C，例如0.1、0.5、1、10、30、100、130、200、300、600、900、1000、1300、1500、1800或2000mg的维生素C。
用于向人受试者施用的示例性佐剂组合物可包含0.1-2000mg的儿茶素水合物，例如0.1、0.5、1、10、30、100、130、200、300、600、900、1000、1300、1500、1800或2000mg的儿茶素水合物。
用于向人受试者施用的示例性佐剂组合物可包含0.001-10mg的AIT，例如0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、7、8、9或10mg的AIT。
如本申请中所使用的，体积/体积是指佐剂组合物的总体积中组分的体积。
可通过施用某些免疫调节性多核苷酸而在哺乳动物中诱导Th1-型免疫应答。免疫调节性多核苷酸包括被称为免疫刺激序列(″ISS″)的序列，其通常包括CG二核苷酸。参见，例如，PCT申请WO 98/55495、WO 97/28259、美国专利Nos.6,194,388和6,207,646。因此，在某些实施方案中，主题佐剂组合物可包含ISS。
在某些实施方案中，主题佐剂组合物可包含上述的乳化剂(例如，卵磷脂、或表面活性剂例(如去污剂))。佐剂组合物中的乳化剂的浓度取决于不同的因素。例如，佐剂组合物中药学上可接受的油的浓度越高，则需要的乳化剂越多。一般地，主题佐剂组合物中表面活性剂或其它乳化剂的浓度为1.5％至5％v/v，或1.5％至3％v/v或1.5％至2.5％或2％v/v。当使用超过一种表面活性剂时，用于佐剂组合物中的全部表面活性剂的浓度之和也为1.5％至5％，或1.5％至3％，或1.5％至2.5％，或2％v/v。
本申请中公开的佐剂组合物可以不包含抗原。不包含抗原的佐剂组合物可用于一般性地和非特异性地增强免疫应答，例如用作每日服用的一般性免疫增强剂。备选地，可将不包含抗原的佐剂组合物与抗原联合施用，即在疫苗接种之前、与之同时或在疫苗接种之后施用。
包含抗原的佐剂组合物
在某些实施方案中，主题佐剂组合物可包含一种或多种抗原。
佐剂组合物中抗原的浓度可广泛地变化，并且将根据所选择的具体施用模式和受试者的需要，主要基于液体体积、粘度、体重等等来选择。药物制剂中抗原的浓度可广泛地变化，即从低于约0.1％，通常2％或至少约2％，到多至20％-30％或更多(按重量/体积计)，并且将根据所选择的具体施用模式，主要通过抗原的性质、液体体积、粘度等来选择。在某些实施方案中，抗原可以为佐剂组合物的0.1％-30％w/v，例如佐剂组合物的0.1％-25％、0.5％-20％、1％-15％、2％-10％、3％-8％或5％-6％w/v。
制备佐剂组合物的方法
可使用许多方法从各种来源获得主题佐剂组合物的组分。备选地，可化学合成所述组分。在某些情况下，可通过从天然来源分离来制备组分，并且可对组分进行额外的修饰，例如化学修饰。例如，可从芥属植物种子(mustard plant seed)提取芥子油。备选地，可从售主购买药学上可接受的植物油载体。维生素A、C、D和E可购自SigmaAldrich化学公司，通过标准生物化学方法制备和产生。类黄酮(例如儿茶素，如儿茶素水合物)可从Sigma Aldrich化学公司购买，通过标准生物化学方法制备和产生。
一般地，儿茶素可从绿茶中被提取或被化学合成。韩国和中国绿茶以及普洱茶、印度红茶、龙井茶、铁观音、竹茶(Bamboo teas)、茉莉花茶、乌龙茶、花茶、红茶可用于提取儿茶素(例如表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯)。中国绿茶是富含儿茶素的来源。与其它种类的茶相比，绿茶是更好的儿茶素来源。
可将维生素A(例如，视黄酸)、维生素D(例如，骨化三醇(1，25-二羟胆钙化醇)、维生素E(例如，α-生育酚)和儿茶素水合物溶解在乙醇(例如200酒精度的乙醇)中。可将维生素C溶解在碱性溶液(例如碳酸氢钠缓冲液)中。可将抗原溶解在水、缓冲液(例如PBS)或盐溶液中。可制备佐剂组合物的单个组分的储液，然后可将适当体积的组分混合在一起以获得主题佐剂组合物。可用PBS或盐水调整主题佐剂组合物的总体积。
在某些实施方案中，可以上述的量将药学上可接受的油和类黄酮以及任选地维生素与表面活性剂(例如
Figure BDA0000081914470000251
-80)一同混合。在施用之前，可通过反复抽出和释放药学上可接受的油、表面活性剂和另一种组分的混合物来乳化佐剂组合物。
可在混合之前或在形成佐剂组合物之后将佐剂组合物的组分进行灭菌。可在施用之前将佐剂组合物与凝胶混合，或配制成微粒等。
可将本申请中公开的佐剂组合物配制成喷雾剂(例如，鼻腔喷雾剂)、滴剂(例如，鼻腔滴剂)、凝胶、粉剂、片剂或胶囊剂、贴剂(patch)等。特别感兴趣的是适合于通过吸入而施用的佐剂组合物，包括但不限于用于形成气溶胶的液体悬浮剂以及用于干粉吸入递送系统的粉剂形式。适合于通过主题佐剂组合物的吸入而施用的装置包括但不限于喷雾器、雾化器、蒸发器、喷散器(nebulizers)和干粉吸入递送装置。
可将本申请中公开的佐剂组合物配制成液体或乳剂用于利用胃肠外途径(例如静脉内、肌内、皮下途径)进行注射。
使用佐剂组合物的方法
本公开提供用于调节受试者中免疫应答(例如刺激细胞和/或体液免疫应答)的方法。本申请中公开的佐剂组合物可用于预防和/或治疗各种感染和肿瘤性疾病。
条件
在某些实施方案中，本申请中公开的佐剂组合物可用于施用抗原的情境中而作为疫苗。所述疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗。预防性疫苗是在感染之前被施用以预防疾病，而治疗性疫苗是在感染或疾病发作后施用的。预防性疫苗包含与受试者可处于发生其的风险中的病症相关联的一个或多个表位(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)抗原作为预防肺结核的疫苗)。治疗性疫苗包含与个体所患的特定病症相关联的一个或多个表位，例如肺结核患者中的结核分枝杆菌或牛型分枝杆菌(M.bovis)表面抗原、经受过敏症的个体中个体对其过敏的抗原(即，过敏症脱敏疗法)、来自患有癌症的个体的肿瘤细胞(例如，如美国专利No.5,484,596中所描述的)或癌症患者中的肿瘤相关抗原。
可将佐剂组合物与抗原联合施用(例如，在相同的组合物中或使用分开的组合物而同时施用)，或者可将所述佐剂组合物分开地施用(例如，在施用抗原之前或之后至少12小时)。在某些实施方案中，将抗原与佐剂组合物混合。
主题佐剂组合物和抗原的施用可引起所述疫苗意欲治疗的病症的一种或多种症状的改善，或一种或多种症状的延迟发作。如对于本领域技术人员来说将是显而易见的，确切的症状及其改善的方式将取决于寻求治疗的病症。例如，当治疗性疫苗用于肺结核时，与抗原一起施用所述佐剂组合物可引起咳嗽、胸膜或胸壁痛、发热和/或本领域内已知的其它症状的减轻或发作延迟。当疫苗是用于过敏症脱敏疗法中的变应原时，与抗原一起施用所述佐剂组合物可引起过敏症的症状减轻或发作延迟(例如，鼻炎、变应性结膜炎的减轻、IgE的循环水平和/或组胺的循环水平的下降)。
主题佐剂组合物还可被预防性地用于增强对由广泛的细菌或病毒病原体(包括用作生物战或生物恐怖主义的试剂的、天然的或经遗传修饰的生物体)产生的感染的抗性。
其它的实施方案涉及具有预先存在的疾病或病症(例如癌症或传染病)的受试者的免疫调节性治疗。癌症是进行免疫调节的吸引人的靶标，因为大多数癌症表达肿瘤相关和/或肿瘤特异性抗原，所述抗原未在身体的其它细胞上发现。对Th1-型免疫应答的刺激通过细胞免疫系统细胞(例如，CTL)或体液免疫系统的组分的直接作用，或通过对与被免疫系统(包括巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞)靶向的细胞接近的细胞的旁观者效应，而导致肿瘤细胞的死亡。
还可向患有由细胞外病原体(例如，细菌或原生生物)或由细胞内病原体(例如，病毒)引起的传染病的受试者施用本申请中公开的佐剂组合物。
在某些实施方案中，可通过施用本申请中公开的佐剂组合物来治疗患有与Th2-型免疫应答相关的病症(例如(不限于)过敏症、过敏症引起的哮喘、特应性皮炎、嗜酸性胃肠道炎症、嗜酸性食道炎和变应性支气管肺曲菌病)的受试者。例如，可向患有与Th2-型免疫应答相关的病症的受试者施用包含药学上可接受的油载体、类黄酮和至少一种维生素C、D和E的佐剂组合物，从而增加一种或多种Th1-型应答相关的细胞因子的水平，这可导致与受试者对变应原的应答相关的Th2-型应答特征的下降。对具有Th2-型应答相关病症的受试者的免疫调节引起所述病症的一种或多种症状的减轻或改善或发作延迟。当病症是过敏症或过敏症引起的哮喘时，一种或多种症状的改善包括下列一种或多种的减轻：鼻炎、变应性结膜炎、IgE的循环水平、组胺的循环水平和/或对“拯救”吸入器疗法(例如，通过计量吸入器或喷散器施用的吸入的沙丁胺醇)的要求。
施用途径
可通过许多施用途径将本申请中公开的佐剂组合物施用给受试者。示例性的施用途径包括粘膜，例如口服、舌下、鼻内、吸入、经眼、阴道内、直肠内途径；和全身性途径，例如肌内、真皮内、经皮肤、腹膜内、皮下或经皮途径。在某些实施方案中，可将至少两种施用途径的组合用于诱导免疫应答。例如，可使用粘膜施用途径和全身性施用途径的组合。
在某些实施方案中，不全身性地施用本申请中描述的佐剂组合物。
施用途径可基于个体受试剂者和疾病的阶段以及对于本领域技术人员来说是显然的其它因素而变化。
在某些实施方案中，本申请中描述的佐剂组合物可通过粘膜表面被施用而不损坏粘膜表面。
可将所述主题佐剂组合物与或不与抗原一起使用。当与抗原一起使用时，可同时施用所述佐剂组合物和抗原，或可在施用抗原之前或之后施用所述佐剂组合物。当与抗原一起使用时，可将抗原与所述佐剂组合物混合。
本申请中公开的佐剂组合物可作为微粒或纳米颗粒以凝胶或片剂(例如，快速溶解的)的形式被提供。例如，可通过口服或舌下途径施用此类制剂。为了进行鼻内施用，例如，可将所述佐剂组合物以乳剂形式或滴剂配制为鼻腔喷雾剂。为了进行经皮肤施用，可以凝胶、洗剂或软膏剂的形式提供所述佐剂组合物。为了进行全身性注射，可将所述佐剂组合物配制为乳剂和/或微粒/纳米颗粒而提供。为了进行直肠施用，例如，可将所述佐剂组合物配制为栓剂或凝胶。为了进行阴道施用，例如，可将所述佐剂组合物配制为凝胶、乳剂、软膏剂。
在某些实施方案中，例如，可以如下所示的顺序通过不同途径的组合向受试者施用本申请中公开的佐剂组合物：
i.全身性，粘膜；
ii.全身性，全身性，粘膜，粘膜；
iii.全身性，粘膜，全身性；
iv.粘膜，粘膜，全身性，全身性；
v.粘膜，全身性，全身性；
vi.粘膜，全身性，粘膜。
当超过一次全身性或经粘膜施用佐剂组合物时，所述2次或更多次全身性或经粘膜施用可以是通过相同的全身性(例如，2次肌内注射)或粘膜途径(2次IN/SL施用)，或通过不同的途径(例如，1次肌内注射和1次静脉内注射；1次IN施用和1次SL施用)。
剂量
待向受试者施用的本申请中描述的佐剂组合物的剂量可基于施用的途径和体重来确定，其范围可以是0.001ml/kg体重至1ml/kg体重。施用佐剂组合物的次数可变化并且可基于许多因素来确定。此类因素对于本领域技术人员来说是显而易见的并且可包括待预防或治疗的疾病、病原体或癌症的种类、抗原的结构性质、施用的途径、受试者中被诱导的免疫应答的水平、免疫应答的类型等。
受试者
本申请中描述的佐剂组合物可用于在各种能够发动(mounting)免疫应答的受试者中引起免疫应答。在某些情况下，可将本申请中描述的佐剂组合物向脊索动物亚门(subphylum chordata)的任何成员(包括哺乳动物(人、其它非人灵长类动物、驯养的动物(例如家畜类))、鸟类、鱼类)或有此需要的任何其它动物施用。在某些情况下，可向人施用所述佐剂组合物。在某些情况下，可向牛施用所述佐剂组合物。在某些情况下，可向鸡、马、绵羊、山羊施用所述佐剂组合物。在某些情况下，可向猪施用所述佐剂组合物。在某些情况下，可向猫和狗施用所述佐剂组合物。
免疫应答的检测
免疫应答的调节可以是体液的和/或细胞的，并且可使用本领域内的标准技术进行测量。受试者中的免疫应答可以以许多方式来检测，包括测量抗原特异性抗体、IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-22和其它细胞因子的一种或多种的表达水平，以及检测应答例如B细胞扩增、淋巴细胞的特定群体(例如CD4+T细胞、NK细胞或CTL和树突细胞)的活化以及巨噬细胞的成熟及活化。
用于测量特定抗体应答的方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)并且在本领域内是公知的。可以例如利用荧光激活细胞分类法(FACS)来实现对特定类型的淋巴细胞(例如CD4+T细胞)的数目的测量。细胞毒性和CTL测定可以是如例如Raz等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9519-9523中所描述的。可以例如通过ELISA来测量细胞因子浓度。评估针对免疫原的免疫应答的此类和其它测定在本领域内是公知的。参见，例如，SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY(1980)Mishell和Shiigi，eds.，W.H.Freeman and Co.。
试剂盒
还提供了包括一个或多个无菌容器的试剂盒，所述一个或多个无菌容器含有本申请中描述的佐剂组合物的组分。单个组分可存在于分开的无菌容器中，或者两种或更多种组分可存在于单一的容器中。任选地，所述试剂盒还可包括含有所需抗原的容器。
在一些实施方案中，无菌容器可任选地具有用于抽取特定体积/量的组分的接入口(access port)，例如，用于引入注射器以抽取一定体积的药学上可接受的油的口。
在一些实施方案中，含有本申请中描述的佐剂组合物的组分的容器可以不是无菌的但是相当干净的。
所述试剂盒还可包括一套适当的说明书(通常为书面说明书)，所述说明书涉及佐剂组合物用于免疫调节的用途(例如，改善传染病的症状，增加IFN-γ水平，增加IFN-α水平或改善IgE-相关的病症)。
所述试剂盒可包括包装在任何方便、适当的包装中的佐剂组合物的组分。例如，如果组分是干制剂(例如，冻干的或干燥的粉剂)，那么可使用具有弹性塞子的小瓶，从而可通过经所述弹性塞子注射液体来容易地重悬浮所述组分。具有无弹性的可移除封口(closures)(例如，密封的玻璃)或弹性塞子的安瓿瓶可被用于所述佐剂组合物的液体组分。还包括的是与特定装置、粘膜施用装置(例如吸入器)、经鼻施用装置(例如喷雾器)或眼滴剂组合使用的包装。
涉及佐剂组合物的用途的说明书通常包括关于用于免疫调节的剂量、给药方案和施用途径的信息。含有佐剂组合物的组分或预混合的佐剂组合物的容器可以是单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本申请中公开的试剂盒中所提供的说明书通常是标签或包装说明书(例如，试剂盒中包括的纸页)上的书面说明书，但也可包括机器可读的说明书(例如，磁盘或光盘上携带的说明书)。
实施例
提供了下列实施例以进一步阐明本发明的优势和特征，但无意限制本发明的范围。虽然它们是可能被使用的典型实施例，但备选地可使用本领域技术人员已知的其它过程、方法或技术。
材料和方法
下列材料和方法用于实施例1-4。
佐剂和疫苗制备物。以0.5μg/剂使用A/Caledonia/20/99(H1N1)-样病毒(储液浓度0.33μg/μl)的重组HA蛋白。将维生素A(VA；视黄酸，Sigma-Aldrich；Cat#R2625)、维生素E(VE；α生育酚，Sigma-Aldrich/Fluka Biochemika；Cat#95240)和儿茶素水合物(Cat；Sigma-Aldrich，C1251，同义名：(+)-儿茶素-3，(2R，3S)-2-(3，4-二羟苯基)-3，4-二氢-1(2H)-苯并吡喃-3，5，7-三醇)溶解在200酒精度的无水乙醇(Sigma-Aldrich，Cat#459844)中。储液浓度为3μg/μl(对于VA)、2000μg/μl(对于VE)和50μg/μl(对于儿茶素水合物)。将维生素C(VC；Sigma-Aldrich，Cat#A4544)以100μg/μl(pH 5.5)的浓度溶解在碳酸氢钠缓冲液(pH 10.6)中。芥子油(MO)购自BotanicOil Innovations Inc.(Spooner，WI)。
用于疫苗接种的各剂量的量为30μg(对于VA)、500μg(对于VC)、2000μg(对于VE)和120μg(对于Cat)。用于各IM大腿剂量的总体积为100μl(用Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液(PBS)(Cat#21-030-CV)调整的)。利用无内毒素的试剂并且在无内毒素的2.0ml管(Eppendorf biopur safe-lock微量离心管)中制备全部疫苗。
一共制备22种不同的具有疫苗的佐剂组合。没有MO而制备前11组，利用MO(50％的总体积)制备后11组。对于具有MO的全部组合，以0.1％的终浓度加入
Figure BDA0000081914470000311
-20(Sigma，Cat#P1379)用于乳化。通过使用BD的1/2CC 1/2 In.27G结核菌素注射器(Cat#305620)反复抽出-释放至少15次来乳化具有MO的组合。对于各个组合制备4剂。
22组HA疫苗的组合显示在下面的表2中。各组包含重组的HA蛋白。
表2
  组   疫苗组合物
  1   VA
  2   VC
  3   VE
  4   Cat
  5   VA+VC
  6   VC+VE
  7   VC+Cat
  8   VE+Cat
  9   VC+VE+Cat
  10   VA+VC+VE+Cat
  11   PBS
  12   VA+MO
  13   VC+MO
  14   VE+MO
  15   Cat+MO
  16   VA+VC+MO
  17   VC+VE+MO
  18   VC+Cat+MO
  19   VE+Cat+MO
  20   VC+VE+Cat+MO
  21   VA+VC+VE+Cat+MO
  22   MO
动物和免疫。将66只6至8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成22组(3只小鼠/组)。按照IACUC指导方针在Murigenics Inc.的动物饲养所(Vallejo，CA 94592)中饲养小鼠。用异氟醚麻醉小鼠，并使用与用于乳化的相同的结核菌素注射器在两个大腿上通过肌内(IM)注射而进行疫苗接种。各小鼠接受100μl的疫苗制备物，即，各大腿上50μl。
免疫后1天收集的血清中的细胞因子的测试。在疫苗接种后1天，对小鼠进行眶后采血，并从单只小鼠制备血清。按照制造商的说明书，使用来自Biolegend的ELISA MaxTM Deluxe装置就TNFα和IL-12(分别为Cat#433606和Cat#430906)测试血清。为了增强测试的灵敏度，使用了由PerkinElmer生产的ELISA放大系统(Cat#NEP116E001EA)。简要地，在于Biolegend试剂盒中进行抗生物素蛋白-HRP步骤后，加入生物素化的酪胺(10μl/ml于酪胺稀释剂中)。将平板在室温下温育15分钟。在用PBS-Tween20(PBS-T)洗涤5次后，以2μl/ml加入封闭溶液(1％山羊血清和PBS中的0.02％Tween-20)中的链霉抗生物素蛋白-HRP。在室温下温育30分钟后，用PBS-T洗涤平板5次，加入底物TMB(BioFXLaboratories，Cat#TMBS-0100-01)。密切观察显色，当背景颜色开始出现在空白孔中时，立即用1N H2SO4终止显色。使用Molecular Devices UV max动力学酶标仪(Sunnyvale，CA)在450nm处读取吸光度。使用Softmax Pro软件(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)并且基于试剂盒制造商提供的标准测定各样品中各个细胞因子的浓度。
通过ELISA进行的血清抗体的测试。在疫苗接种后3周，对小鼠进行眶后采血。收集单只小鼠的血清并且在测试之前将血清保存在-20℃。为了进行IgG1 ELISA，以0.66μg/ml(于PBS中)的浓度用100μl的重组HA蛋白在4℃包被nunc
Figure BDA0000081914470000332
96孔微量培养板过夜。在用PBS-T洗涤4次后，用200μl封闭溶液(1％山羊血清，PBS中0.02％的Tween-20)在室温下封闭平板1小时。起初在封闭溶液中将血清样品以1/600稀释，然后对于各个样品在96孔微量培养板的各列中进行3倍的系列稀释。第1列用作空白。分别在第2和3列中以相同的方式稀释阳性参考血清和阴性参考血清。在加入和稀释血清样品后，将平板在室温下温育2小时。然后用PBS-T洗涤平板5次，随后加入100μl在封闭溶液中1/8000稀释的山羊抗-小鼠I gG1-HRP缀合物(Southern Biotech，Cat#1070-05)。将平板在室温下温育1小时。在用PBS-T洗涤5次后，加入100μl TMB底物进行显色。在30分钟时通过加入100μl 1N的硫酸终止显色。使用酶标仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)在450nm处读取平板。截止值被确定为背景值(空白孔的平均值)的2.5倍。使用基于log-logit曲线的软件自动计算各血清样品的滴度。对于IgG2a滴定，除了二抗缀合物外，所有步骤和试剂与用于IgG1 ELISA的相同。使用了以1/8000稀释的山羊抗-小鼠IgG2a-HRP缀合物(Southern Biotech，Cat#1080-05)。对于IgA滴定，除了起初将血清样品以1/20稀释，然后在各列中进行3倍系列稀释并使用了以1/8000稀释的山羊抗-小鼠IgA-生物素(Southern Biotech，Cat#0106-08)之外，所使用的步骤和试剂与上述步骤和试剂相同。还需要用抗生物素蛋白-HRP进行的额外步骤。
脾细胞培养物和通过ELISA测试上清液中的细胞因子。在第二次疫苗接种后1周，处死66只小鼠，收集脾(SP)和阴道灌洗。将各个单个的脾挤压通过Falcon 70um尼龙滤网(Cat#353910)，然后用约4.5ml含有5％FBS和抗生素的完全RPMI1640培养基(完全RPMI)冲洗所述滤网。将细胞收集到50ml离心管中，然后将其转移至5ml Nalgene管(Cat#5000-0050)中。在4℃下于Eppendorf台式离心机(5702R)中以600xg离心5分钟后，将细胞轻轻地重悬浮在4.5ml完全RPMI中。离心细胞，将其再次重悬浮。为了进行细胞计数，将20μl细胞悬浮液与180μl PBS混合以产生1/10的稀释，将10μl稀释的细胞悬浮液与10μl台盼蓝混合，然后利用血细胞计数器将10μl的混合物用于细胞计数。在计数后，将各脾样品中的细胞浓度稀释至2X106/ml的终浓度。
对于细胞培养，使用Corning 24-孔细胞培养板(Cat#3526)。将0.5ml的细胞加入至各孔(1X106个细胞/ml)。对于各个样品使用2个孔。一个孔含有0.5ml的完全RPMI 1640，另一个孔含有0.5ml具有2μg/ml HA蛋白(从而导致1μg/ml的终浓度)的完全RPMI 16490。在于CO2培养箱中在37℃温育24小时后，收获细胞和上清液(SN)，以600xg离心5分钟。将上清液收集在2ml微量离心管中，于-20℃下贮存并在1周内进行测定。
为了测试上清液中的细胞因子，按照制造商的说明书，使用来自Biolegend的ELISA MaxTM Deluxe装置测试IFNγ、IL-5、IL-10(分别为Cat#430806、Cat#431206和Cat#431406)。为了增强测试的灵敏度，使用由PerkinElmer生产的
Figure BDA0000081914470000351
ELISA放大系统，并且步骤与上文所述的步骤相同。
通过ELISA进行的阴道灌洗中IgG1和IgA的测试。使用自动移液器通过在阴道穹窿内抽吸约100μl PBS5至7次从单只小鼠收集约100μl阴道灌洗。将阴道灌洗保持在干冰上以待以后使用。在收集阴道灌洗后无菌地从单只小鼠中移除脾脏，立即将其置于4.5ml冷RPMI 1640基础培养基(UCSF细胞培养设施)中。将上述收集的阴道洗液融化，涡旋，然后以3000xg离心5分钟。将各组中的3份阴道灌洗集中，并对于单个组进行测试。除了IgG1和IgA的初始稀释为1/3继而进行3倍的系列稀释外，以与上文中针对血清IgG1和IgA所描述的方式相似的方式进行ELISA测试。测试也采用了上文中描述的PerkinElmer
Figure BDA0000081914470000352
ELISA放大系统以增加灵敏度。对于IgG1，在山羊抗小鼠IgG1-HRP步骤后加入生物素化的酪胺。对于IgA，在抗生物素蛋白-HRP步骤后加入生物素化的酪胺。
实施例1：单次肌内(IM)注射后的免疫调节
观察到在用HA+选择的组分疫苗接种后血清IgG1抗体应答的显著增强。虽然与单独的HA相比较，HA+MO增强了应答，但含有其它的组分时有进一步的增强。一般地，与单一维生素、cat或cat+VE相比，MO的加入增强了IgG1应答(图1)。与单独利用PBS中的HA的疫苗接种相比，MO产生的增强在用HA+cat+MO疫苗接种的组中最高(其诱导15倍的增强)，然后是HA+cat+VE+MO和HA+VA+MO(图1)。用表1中所列的其它组合物疫苗接种的小鼠组与单独的PBS中的HA相比，不显示增强的血清IgG1抗体应答。这些结果表明在测试的全部22种组合物中，与HA混合的cat+MO诱导最高的IgG1应答。有趣地，含有维生素C的佐剂组合物似乎抑制免疫应答。然而，假设的是对免疫应答的抑制可能是由向小鼠施用的维生素C的高剂量或含有维生素C的佐剂组合物与不含维生素C的佐剂组合物相比之间一个pH单位的差异引起的假像。
将血清抗-HA IgG2a应答作为TH1应答的潜在替代而测量。与IgG1应答相反，在只用VA疫苗接种的组中测量到了最高的血清IgG2a应答(图1)。
实施例2：两次肌内(IM)注射后的免疫调节
与在单次IM疫苗接种后3周获得的数据相比较，在第二次IM疫苗接种后1周，血清抗-HA IgG1应答通常增加到至少10倍(图2)。与单次IM疫苗接种后的结果相似，与单独使用PBS中的HA的疫苗接种相比，抗-HA IgG1应答在用HA+MO、HA+MO+VA和HA+MO+Cat疫苗接种的组中更高。此外，与单独的PBS中的HA相比，用HA+MO+VE疫苗接种的组也显示增强的IgG1应答。向任意的所述组中加入MO增强了IgG1应答。与单独的PBS中的HA相比(数据未显示)，表1中所列的其它组合物中没有一种引起IgG1应答的增强。这些数据显示在两次IM疫苗接种后，与只使用PBS中的HA的疫苗接种相比，当将MO与cat、VA或VE混合时，血清抗-HA应答得到显著地增强。
在用HA+VA+MO进行了第二次IM疫苗接种后，与第一次疫苗接种后测量的IgG2a应答相比，IgG2a应答增强了(图1和2)。
为了确定用各种组分进行的疫苗接种是否引起重链同种型转换为IgA，测定了血清抗-HA IgA应答。与单独的PBS中的HA相比，用HA+VA+MO、HA+VC+MO、HA+Cat+MO和HA+VE+cat疫苗接种的小鼠的组显示血清IgA应答增强(图3)。
表1中所列的其它组合物没有一种引起增强的血清IgA应答。
这些数据表明VA+MO和Cat+MO作为佐剂而诱导抗原特异性同种型分别转换为IgA和IgG的效用。
实施例3：肌内(IM)注射后的粘膜免疫应答
在阴道灌洗中测量的应答。雌性阴道是主要的粘膜组织并且作为许多重要的细菌和病毒试剂的传输途径。因为该组织中抗体应答的诱导对于抗粘膜传播的疾病(例如HIV和衣原体)的保护作用是重要的，测量了第二次IM疫苗接种后1周时收集的阴道灌洗中的抗-HA IgG1和IgA应答。在用HA+VA+MO、HA+VE+MO和HA+VE+cat+MO疫苗接种的小鼠中观察到了最高的阴道抗-HA IgG1应答(图4)。此外，与单独的PBS中的HA相比，唯一显示增强的抗-HA IgA应答的组是用VA+MO疫苗接种的组(图5)。这些数据表明MO与VA、VE、cat的组合引起增强的血清IgG1、IgG2a以及阴道IgG1和IgA的诱导。
实施例4：肌内(IM)注射后的TH1、TH2和TREG应答
用HA进行第二次IM疫苗接种后的TH1、TH2和Treg应答。测定了第二次IM疫苗接种后1周时制备的、并且用HA离体活化过夜的脾细胞中的TH1(IFNγ)、TH2(IL-5)和Treg(IL-10)应答。与单独用PBS中的HA注射的小鼠的IFNγ应答相比，在用HA+MO疫苗接种的小鼠的组中检测到了增强的IFNγ应答，当将MO与其它组分混合时，应答进一步增强(图6)。在用MO+cat疫苗接种的组中检测到了最高量的IFNγ(图6)。虽然与单独的HA相比，用VC+MO、单独的MO、VE+cat+MO和VE±MO疫苗接种的组显示增强的IFNγ应答，但所述应答低于用MO+cat疫苗接种的组(图6)。这些数据表明用VA和cat+MO进行的疫苗接种诱导了最高的TH1应答。与TH1应答相反，仅在用VA或VE进行疫苗接种后TH2(IL-5)应答才被增强，因为在用PBS中的单独的HA疫苗接种的组中IL-5应答通常是高的。有趣地，用MO+VA、VC、VE和VE+cat进行的疫苗接种降低IL-5应答，而与用cat进行的疫苗接种相比，用cat+MO进行的疫苗接种诱导更高的IL-5应答(但与单独用PBS中的HA进行的疫苗接种水平相当)(图6)。重要地是，IL-10Treg抑制性应答主要与差的血清IgG或脾IFNγ或IL-5应答相关，因为在单独用PBS中的HA疫苗接种的组中测量到了最高的IL-10应答(图6)。这些数据表明用cat+MO进行的IM疫苗接种诱导最好地平衡的TH1和TH2应答，而缺少Treg应答。
实施例5：鼻内(IN)和舌下(SL)疫苗接种后的免疫调节
材料和方法
佐剂和疫苗制备物。HIV-1gp120cn54蛋白获自NIH AIDS研究和参考试剂项目并且以5μg/小鼠的剂量被使用。将维生素A(视黄酸，Sigma-Aldrich；Cat#R2625)和儿茶素水合物(Sigma-Aldrich，C1251)溶解在200酒精度的无水乙醇(Sigma-Aldrich，Cat#459844)中。储液浓度为3μg/μl(对于维生素A(VA))、50μg/μl(对于儿茶素水合物(Cat))。芥子油(MO)购自Botanic Oil Innovations inc.(Spooner，WI)。异硫氰酸烯丙酯(AIT)购自Sigma Aldrich(Cat#W203408-500G-K)。用于各个疫苗接种剂量的量为30μg(对于维生素A)、120μg(对于Cat)和1μl(对于AIT)。各个剂量的总体积为40μl并且用Dubecco’s磷酸缓冲盐溶液(Cat#21-030-CV)进行调整。利用Genscript试剂盒(Piscataway，NJ08854；Cat#L00350)就内毒素测试疫苗中使用的全部组分，包括维生素A、Cat、Tween-20、MO和PBS，发现各个组分中的内毒素含量低于0.005EU/ml。在无内毒素的2.0ml管(Eppendorf biopur safe-lock微量离心管)中制备全部疫苗。以0.1％的终浓度将
Figure BDA0000081914470000381
-20(Sigma，Cat#P1379)加入所有的组中。通过使用BD的1/2CC1/2In.27G结核菌素注射器(Cat#305620)反复抽出-释放至少15次来乳化与MO的组合。对于每一次组合的鼻内/舌下(IN/SL)疫苗接种，总剂量体积/小鼠为38.8μl，即19.4μl用于IN途径和19.4μl用于SL途径。用HIVenvgp120cn54+MO+VA+Cat+AIT(组1)疫苗接种一组的3只雌性BALB/c小鼠。单独用PBS中的HIVenvgp120cn54疫苗接种另一组的3只雌性BALB/c小鼠。两个组的小鼠都为6至8周龄。两组小鼠以2周的间隔接受组合的IN/SL疫苗接种二次。在第二次疫苗接种后2周收集血清和阴道灌洗。
按照IACUC指导方针在Murigenics Inc.的动物饲养所(Vallejo，CA 94592)中饲养小鼠。在第一次疫苗接种前，用异氟醚麻醉小鼠，用于同时鼻内(IN)和舌下(SL)疫苗接种，而对于第二次疫苗接种，没有为了IN施用而麻醉小鼠。
通过ELISA进行血清抗体的测试。第二次疫苗接种后2周时对小鼠进行眶后采血。将血清贮存在-20℃。为了测量抗-HIV gp120cn54IgG1和IgG2a滴度，用PBS中的2μg/ml HIV gp120cn54蛋白(100μl/孔)在4℃包被nunc96孔微量培养板过夜。在用PBS-T(0.02％Tween-20于PBS中)洗涤4次后，用200μl封闭溶液(1％山羊血清，0.02％Tween-20于PBS中)在室温下封闭平板1小时。起初将血清样品在封闭溶液中以1/600稀释，然后对于各个样品在96孔微量培养板的各列中进行3倍的系列稀释。第1列用作空白。阴性对照血清来自幼稚
Figure BDA0000081914470000392
小鼠。在加入和稀释血清样品后，将平板在室温下温育2小时。然后用PBS-T洗涤平板5次，随后加入100μl在封闭溶液中1/8000稀释的山羊抗-小鼠IgG1-HRP缀合物(Southern Biotech，Cat#1070-05)。将平板在室温下温育1小时。在用PBS-T洗涤5次后，加入100μl TMB底物用于显色。在约15-30分钟内通过加入100μl 1N的硫酸终止显色。使用酶标仪(Molecular Devices)在450nm处读取平板。截止值被确定为背景值(空白孔的平均值)的2.5倍。使用基于log-logit曲线的软件自动计算各血清样品的滴度。对于IgG2a滴定，除了二抗缀合物外，所有步骤和试剂与用于IgG1 ELISA的相同。使用了以1/8000稀释的山羊抗-小鼠IgG2a-HRP缀合物(Southern Biotech，Cat#1080-05)。对于IgA滴定，除了起初将血清样品以1/20稀释，然后在各列中进行3倍系列稀释并使用了以1/8000稀释的山羊抗-小鼠IgA-生物素(Southern Biotech，Cat#0106-08)之外，所使用的步骤和试剂与上述步骤和试剂相同。使用抗生物素蛋白-HRP来检测山羊抗-小鼠IgA-生物素。
通过ELISA进行的阴道灌洗中IgG1和IgA的测试。使用自动移液器通过在阴道内抽吸约100μl PBS数次而从单只小鼠收集约100μl阴道灌洗。将阴道灌洗保持在干冰上以待以后使用。将阴道灌洗融化，涡旋，然后以3000x g离心5分钟。通过ELISA就IgG1和IgA测试所述阴道灌洗。除了IgG1和IgA的初始稀释为1/3继而进行3倍的系列稀释外，以与上文中针对血清IgG1和IgA所描述的方式相似的方式进行ELISA测试。测试也根据生产商的方案采用了上文中描述的PerkinElmer
Figure BDA0000081914470000401
ELISA放大系统来增加灵敏度。
结果。在两次组合的鼻内和舌下疫苗接种后2周时，与用单独的PBS中的HIVgp120cn54疫苗接种的小鼠相比，用MO+VA+cat+AIT中的HIVgp120cn54疫苗接种的小鼠中的血清IgG1抗-HIVgp120应答平均增强至198倍(图7)。此外，血清IgG2a抗-HIVgp120应答也增强了(图7)。与用单独的PBS中的HIVgp120cn54疫苗接种的小鼠相比，在用MO+VA+cat+AIT中的HIVgp120cn54疫苗接种的小鼠中，阴道灌洗中也有IgG1和IgA滴度的增加(图8)。
实施例6：通过IN/SL和IM疫苗接种产生的免疫调节
材料和方法
用只在PBS中的HIVenvgp120cn54或用HIVenvgp120cn54+MO+VA+Cat+AIT通过2次IN/SL途径继以2次IM疫苗接种3只雌性BALB/c小鼠的组(每一只为6-8周龄)。
在第一次疫苗接种之前，用异氟醚麻醉小鼠用于同时的鼻内(IN)和舌下(SL)疫苗接种，而对于第二次疫苗接种，没有为了IN施用而麻醉小鼠。儿茶素和VA的剂量如同上文对于用HA的IM疫苗接种所描述的，即分别为120μg和30μg。HIVgp120的剂量为5μg(对于IN/SL疫苗接种和第一次IM疫苗接种)和2.5μg(对于第二次(最终)IM疫苗接种)。AIT的剂量为1μl。对于IN和IM疫苗接种，均以50％v/v使用MO。因此，下列组的小鼠接受了两次组合的IN/SL，然后以2周的间隔继以2次IM疫苗接种：
组1：HIVenvgp120cn54+MO+VA+Cat+AIT
组2：只在PBS中的HIVenvgp120cn54
在第4次且为最终的疫苗接种后1周时收集了血清和阴道灌洗，并通过ELISA测量gp120-特异性IgG1、IgG2a和IgA。
结果。与用只在PBS中的HIVenvgp120cn54疫苗接种的小鼠的组相比，血清中的IgG1、IgG2a和IgA应答在用HIVenvgp120cn54+MO+VA+Cat+AIT疫苗接种的小鼠的组中显著增强了(图9)。
还接着测定了阴道灌洗中的IgG1和IgA应答。与用只在PBS中的HIVenvgp120cn54疫苗接种的小鼠的组相比，用HIVenvgp120cn54+MO+VA+Cat+AIT疫苗接种的小鼠的组中阴道灌洗中的IgG1和IgA应答显著增强了(图10)。这些数据显示了显著增强的血清和阴道抗-gp120抗体应答并且强烈支持了MO+VA+Cat+AIT用于诱导抗HIV-1gp120表面糖蛋白的阴道和全身性体液免疫的免疫增强能力。
实施例7：用于向人受试者施用的含有抗原的佐剂组合物
下面的表3中提供了包含药学上可接受的植物油载体、AIT、类黄酮和维生素A、E和C的佐剂组合物的实例：
表3
  组分   量
  芥子油   3-80％体积/体积
  维生素A1   0.1-100mg
  维生素E2   0.1-100mg
  维生素C3   0.1-2000mg
  儿茶素水合物4   0.1-2000mg
  乳化剂5   0.1-7％w/w
  异硫氰酸烯丙酯   0.001-10mg
上述组合物可包含一种或多种下面的表4中所示的组分：
表4
  组分   量
  抗原6   0.01-10mg
  PBS   1-50％体积/体积
  明胶   1-20mg
  抗生素7   0.1pg-30μg
  山梨醇   1-20mg
  蔗糖8   1-100mg
  透明质酸9   1-30％w/w
  蜂蜡   1-50％w/w
1维生素A可以作为胡萝卜素、β胡萝卜素、视黄酸、棕榈酸视黄酯或其衍生物或盐而提供；2维生素E可以作为α-生育酚或其衍生或盐而提供；3维生素C或其衍生物或盐，4儿茶素水合物或另一种类黄酮，5乳化剂可以是卵磷脂、山梨聚糖、聚山梨醇酯类；6包膜gp120或流感血凝素蛋白，7新霉素或多粘菌素B，8蔗糖、乳糖或另一种糖，9透明质酸或其衍生物(HYAFF)或聚氧化乙烯同聚物或壳聚糖。
包含(50％v/v芥子油，0.1％Tween(聚山梨酯)，50％水相v/v)的组合物，乳化的组合物中微粒/胶束的大小范围在大小为0.1μm至5μm之间，最大为约5μm，最小为约0.1μm，并且大部分(70-80％)在0.5-1μm的范围内。
如本申请中所使用的，体积/体积是指组分在佐剂组合物的总体积中的体积。如本申请中所使用的，w/w是指组分在佐剂组合物的总重量中的量(按重量计)。

Claims (29)

1.一种组合物，其包含：
芥子油；和如下至少一种：
(a)类黄酮或类黄酮衍生物或类黄酮衍生物的盐；和
(b)维生素或者其衍生物或盐，其中所述维生素选自维生素A、维生素E、维生素D、维生素C。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述类黄酮。
3.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述维生素。
4.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含所述类黄酮和所述维生素。
5.权利要求1的组合物，其中所述类黄酮是儿茶素。
6.权利要求1的组合物，其中所述维生素是维生素E。
7.权利要求1的组合物，其中所述维生素是维生素A。
8.权利要求5的组合物，其还包含维生素A。
9.权利要求1的组合物，其中所述维生素是维生素C。
10.权利要求5的组合物，其中所述维生素是维生素E。
11.权利要求1的组合物，其还包含异硫氰酸烯丙酯。
12.权利要求1的组合物，其还包含抗原。
13.调节受试者中免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1的佐剂组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
15.权利要求13的方法，其中所述施用是通过选自下列的途径：鼻内、经肺、舌下、口服、含服、阴道内、直肠内、经眼、真皮内和血管内。
16.制备权利要求1的组合物的方法，所述方法包括将所述芥子油与下列的至少一种混合：
所述类黄酮，或所述类黄酮衍生物或所述类黄酮衍生物的盐；和
所述维生素或者其衍生物或盐，其中所述维生素选自维生素A、维生素E、维生素D、维生素C。
17.一种组合物，其包含：
药学上可接受的植物油；
类黄酮，或类黄酮衍生物，或类黄酮衍生物的盐；和
维生素，或者其衍生物或盐，其中所述维生素选自维生素A、维生素E、维生素D、维生素C。
18.权利要求17的组合物，其中所述药学上可接受的油是发红剂油。
19.权利要求17的组合物，其中所述类黄酮是儿茶素。
20.权利要求17的组合物，其中所述维生素是维生素E。
21.权利要求17的组合物，其中所述维生素是维生素A。
22.权利要求17的组合物，其中所述维生素是维生素C。
23.权利要求19的组合物，其还包含维生素A。
24.权利要求17的组合物，其还包含异硫氰酸烯丙酯。
25.权利要求17的组合物，其还包含抗原。
26.调节受试者中免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求17的佐剂组合物。
27.权利要求17的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
28.权利要求17的方法，其中所述施用是通过选自下列的途径：鼻内、经肺、舌下、口服、含服、经眼、阴道内、直肠内、真皮内和血管内。
29.制备权利要求17的组合物的方法，所述方法包括将下列混合：
所述药学上可接受的油；
所述类黄酮，或所述类黄酮衍生物，或所述类黄酮衍生物的盐；和
所述维生素，或者其衍生物或盐，其中所述维生素选自维生素A、维生素E、维生素D、维生素C。
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