MXPA04001458A - Oligonucleotidos inmunoestimuladores de motivos combinados con actividad mejorada. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una clase de acidos nucleicos inmunoestimuladores que tienen al menos dos dominios definidos funcional y estructuralmente. Esta clase de acidos nucleicos inmunoestimuladores de motivo combinado activan una respuesta inmune y son utiles para tratar una variedad de trastornos inmunorrelacionados como el cancer, enfermedades infecciosas y trastornos alergicos. Los acidos nucleicos tambien estimulan la activacion de celulas asesinas naturales y la produccion de interferon del tipo I.

Description

WO 03/015711 A2 l III!l IIUI!ll II IlliU Itlll ???? I II Ul II!Il lllll 11111 lllll lllllUll 111IIU llíl 1111 Published: For two-letter codes andother abbreviations, refer to ike "G id- ¦ — mthout international search report and to be republished ance Notes on Codes and Abbreviations" appearingat the begin- upon receipt of that report ning of each regular issue of the PCT Gazeite.

OLIGONUCLEOTIDOS INMUNOESTIMULADORES DE MOTIVOS COMBINADOS CON ACTIVIDAD MEJORADA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona, de manera general con ácidos nucleicos inmunoestimuladores, composiciones de los mismos, y métodos de uso de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En la técnica se conocen dos clases principales de secuencias inmunoestimuladoras las cuales tienen diferentes perfiles de actividad inmunoestimuladora. Krieg AM (2001) Trends Microbiol 9:249-52. Esas son los llamados oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG de la clase B, los cuales son fuertes activadores de las células B, y ODN CpG de la clase A, los cuales son fuertes activadores de las células asesinas naturales (NK) . Además de esas secuencias inmunoestimuladoras, se conocen al menos dos clases de secuencias neutralizantes, incluyendo secuencias de CpG en las cuales CG son precedidas por C o seguidas por una G (Krieg AM et al. (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:12631-12636), y secuencias de ADN en las cuales CG está metilado. Un motivo neutralizante es un motivo el cual tiene algún grado de capacidad inmunoestimuladora cuando está presente en 2 un motivo en otras circunstancias no estimulador, pero que, cuando está presente en el contexto de otros motivos inmunoestimulado es sirve para reducir el potencial inmunoestimulador de los otros motivos.

SUMARIO DE LA INVENCION Aqui se proporciona una nueva clase de ácidos nucleicos inmunoestimuladores . En algunos casos esos ácidos nucleicos tienen un palíndromo rico en CG o motivo neutralizante rico en CG. Las solicitantes previamente reconocieron y describieron motivos neutralizantes que contienen oligodesoxinucleótidos (ODN) que consisten de repeticiones de la secuencia de CG como CGCGCC o un dinucleótido CG precedido por una C (es decir, CCG) y/o seguido por una G (es decir CGG, CCGG) . Se creia que esos motivos neutralizantes producían alguna reducción en los efectos estimuladores de los ODN que contienen CpG tras lecturas múltiples, como una secreción de IL-6, IL-12, IFN-?, TNF-a e inducción de una respuesta inmune especifica del antigeno. Krieg ?? et al. (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:12631-6. La presente invención se basa en parte en el descubrimiento sorprendente efectuado por la Solicitante de que ciertos ODN que contienen una combinación de un motivo 3 estimulante y un motivo neutralizante son altamente inmunoestimuladores . La presente invención también se basa en parte en el descubrimiento sorprendente hecho por las solicitantes de que los ODN tienen ciertas secuencias palindrómicas ricas en CG, incluyendo secuencias palindrómicas que tienen motivos neutralizantes, son altamente inmunoestimuladores. El motivo neutralizante de este modo, puede, pero no necesariamente ocurrir dentro del contexto de una secuencia palindrómica para ser altamente inmunoestimulador . Además, el ODN inmunoestimulador de la presente invención tiene efectos inmunoestimuladores previamente asociados con ambas de las dos clases distintas de ODN CpG, aquellos que activan de manera característica células B (ODN CpG clase B) y aquellos que" activan de manera característica células NK activas- e inducen la producción de interferon (IFN)- (ODN CpG clase A). El ODN inmunoestimulador novedoso de la presente invención tiene de este modo un espectro de efectos inmunoestimuladores distinto al de cualquiera del ODN CpG de la clase A u ODN CpG de la clase B. La nueva clase de ODN inmunoestimulador de la presente invención es referido como un ODN CpG del tipo C. Como se describe con mayor detalle más adelante, en ciertas modalidades el ODN de la presente invención implica una combinación de motivos, donde un motivo es un palíndromo rico en CG o un motivo 4 neutralizante, y otro motivo es un motivo estimulador, por ejemplo, un motivo CpG de la secuencia TCGTCG. En algunos aspectos se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulador con una longitud de 14-100 nucleótidos . El ácido nucleico tiene la fórmula: h' XT.DCGHX2.3' . Xi y X2 son independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 nucleótidos de longitud. D es un nucleótido diferente a C. C es citosina, G es guanina. H es un nucleótido diferente de G. La secuencia de ácido nucleico también incluye una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de P y N colocadas inmediatamente 5' a ?? o inmediatamente 3 ' a X2. N es una secuencia neutralizante de células B que comienza con un trinucleótido CGG y es de al menos 10 nucleótidos de longitud. P es un palíndromo rico en CG que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud. En lagunas modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador es 5' NXiDCGHX23' , 5 ' XiDCGHX2N3 ' , 5' PXXDCGHX23' , 5 ' X!DCGHX2P3 ' , 5 ' X!DCGHX2PX33 ' , 5 ' XiDCGHPX33 ' , 5'X1DCGHX2PX33' , 5' TCGHX2PX33' , o 5'DCGHPX33'. X3 es cualquier secuencia de 0 a 10 nucleótidos de longitud. En otras modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador es 5'DCGHP3'. Opcionalmente D y/o H son timina (T) . En otras modalidades H es T y X2 es CG, CGT, CGTT, CGTTT, o CGTTTT. H es T y X2 es CG o CGTTTT de acuerdo a las otras modalidades . De acuerdo a otra modalidad C no está metilado. N incluye al menos cuatro dinucleótidos CG y no más de dos trinucleótidos CCG en algunas modalidades. Opcionalmente P incluye al menos una Inosina. El ácido nucleico también puede incluir una secuencia de poli T en el extremo 5' o el extremo 3' . Se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulador de 13-100 nucleotidos de longitud de acuerdo a otros aspectos de la invención. El ácido nucleico tiene la forma: 5'NiPyGN2P3' . G es guanina. ? es cualquier secuencia de 1 a 6 nucleotidos de longitud. En algunas modalidades Ni es al menos 50% pirimidinas y preferiblemente al menos 50% T. En otras modalidades, Nx incluye al menos un motivo CG, al menos un motivo TCG, al menos un motivo CI, al menos un motivo TCI, al menos un motivo IG, o al menos un motivo TIG. Ni es TCGG o TCGH en otras modalidades. H es un nucleótido diferente de G. Py es pirimidina. En algunas modalidades Py es C no metilado . N2 es cualquier secuencia de 0 a 30 nucleotidos de longitud. En algunas modalidades N2 es al menos 50% pirimidinas o es al menos 50% T. En otras modalidades N2 no incluye ningún motivo de poli G o poli A. P es un palíndromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades P es completamen e palindrómico . En otras modalidades P es un palíndromo que tiene entre 1 y 3 nucleótidos intervinientes consecutivos. Opcionalmente los nucleótidos intervinientes pueden ser TG. En otras modalidades, P incluye al menos 3, 4 ó 5 nucleótidos C y al menos 3, 4, ó 5 nucleótidos G. De acuerdo a otras modalidades P incluye al menos una Inosina. En una modalidad el palíndromo rico en GC tiene un contenido base de al menos dos tercios de G y C. En otra modalidad el palíndromo rico en GC tiene un contenido base de al menos 81 por ciento de G y C. En algunas modalidades el palíndromo rico en GC es de al menos 12 nucleótidos de longitud. El palíndromo rico en GC puede estar constituido exclusivamente de C y G. En algunas modalidades el palíndromo rico en GC puede incluir al menos un nucleótido que no sea C ni G. En algunas modalidades el palíndromo rico en GC incluye al menos un trímero CGG, al menor un trímero CCG, o al menos un tetrámero CGCG. En algunas modalidades el palíndromo rico en GC incluye al menos cuatro dinucleótidos CG. En ciertas modalidades preferidas, el palíndromo rico en GC tiene un dinucleótido rico en CG central. En ciertas modalidades el palíndromo rico en GC es CGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 23), CGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO: 28), 7 CGACGATCGTCG (SEQ ID NO: 68) o CGACGTACGTCG (SEQ ID NO: 69) . En ciertas modalidades el palíndromo rico en GC no es CGCGCGCGCGCG (SEQ ID NO: 29), GCGCGCGCGCGC (SEQ ID NO: 30), CCCCCCGGGGGG (SEQ ID NO: 31), GGGGGGCCCCCC (SEQ ID NO: 32), CCCCCGGGGG ( SEQ ID NO: 33) o GGGGGCCCCC (SEQ ID NO: 34). En algunas modalidades NiPyGN2 es una secuencia seleccionada del grupo que consiste de TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, y TCGTCGT. Se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulador de 13-100 nucleótidos de longitud de acuerdo a otros aspectos de la invención. El ácido nucleico tiene la fórmula: 5'NiPyG/IN2P3' . G/I se refiere a un solo nucleótido el cual es una G o una I. G es guanina e I es inosina. i es cualquier secuencia de 1 a 6 nucleótidos de longitud. Py es pirimidina, N2 es cualquier secuencia de 0 a 30 nucleótidos de longitud. P es un palíndromo que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades P es un palíndromo rico en GC. En otras modalidades P es un palíndromo rico en IC. NiPyIN2 en algunas modalidades es TCITCITTTT (SEQ ID NO: 47) . Las moléculas de ácido nucleico descritas aquí pueden tener cualquier tipo de composición estructural. En algunas modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura completamente resistente a la nucleasa. La estructura resistente a la nucleasa puede estas compuestas de enlaces fosforotioato . En otras modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura completamente fosfodiéster . En otras modalidades más el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura quimérica. En una modalidad el ácido nucleico inmunoestimulador tiene al menos un enlace fosfodiéster entre un motivo GC, CI o IG. De manera alternativa, los ODN de la presente invención son formulados con microparticulas, emulsiones, u otros medios para evitar la digestión rápida in vivo. Las moléculas de ácido nucleico inmunoestimuladoras descritas aquí tienen una variedad de longitudes. En algunas modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador es de 13-100, 13-40, 13-30, 14-103, 14-40, ó 14-30 nucleótidos de longitud o cualquier número entero entre ellos. También se proporciona un ácido nucleico inmunoestimulador que tiene una de las siguientes secuencias: TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 1), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO: 4), TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEQ ID NO: 5), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEQ ID NO: 6), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (SEQ ID NO: 7), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (SEQ ID NO: 12), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 13), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (SEQ ID NO: 14), donde Z es 5-metilcitosina, TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO: 19), TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (SEQ ID NO: 11), TCCTGACGTTCGTCGCGCGCCC (ODN 21, SEQ ID NO: 19), TCGTCGGTTTCGGCGGCCGACG (ODN 5513, SEQ ID NO: 64), TCGTCGTTTTCGTCGTCCGCCT (ODN 5514, SEQ ID NO: 65), TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG (ODN 9515, SEQ ID NO: 76) y TCGTCGTTTTCGTCGGCCGTCG (ODN 5516, SEQ ID NO: 67) . Además de acuerdo a otras modalidades de la invención el ácido nucleico inmunoestimulador es uno de las siguientes secuencias: TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (ODN 2395), TCGTCGTTTTCGTCGTCCGCCG (ODN 2429), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCGG (ODN 2430), TCGTCGGTTTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGTCGGCGGCCGTTTTT (ODN 2452), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (ODN 5327, donde Z es 5-metilcitosina) , TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (ODN 2136) , TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG (ODN 5513), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG (ODN 5515), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCTG (ODN 5516), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (ODN 2395), TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 2429), TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (ODN 2430), TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (2452), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (ODN 5327, donde Z es 5-metilcitosina) , TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (ODN 2136) , TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG (ODN 5513) , TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG (ODN 5515), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGTCG (ODN 5516) , TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTG (ODN 2451) , TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20173 , SEQ ID NO: 71), TCGTCGTTTCGATGATCGTCG (ODN 20176, SEQ ID NO: 72) , TCGTCGTTTTGACGTACGTCG (ODN 20177, SEQ ID NO: 73) , TCGTCGCGACGGCCGTCG (ODN 20178, SEQ ID NO: 74) , TCGTCGCGACGATCGTCG (ODN 20179, SEQ ID NO: 75) , TCGTCGCGACGTACGTCG (ODN 20180, SEQ ID NO: 76) , TCGTTTTTTTCGACGGCCGCTG (ODN 20184, SEQ ID NO: 77) , TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG (ODN 20185, SEQ ID NO: 78 ) , y TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG (ODN 20186, SEQ ID NO: 79). De acuerdo a ciertas modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador incluye la secuencia TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTT (ODN 2451, SEQ ID NO: 11) . En ciertas modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador es la secuencia TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (ODN 2451) . Se proporciona una composición farmacéutica, que comprende los ácidos nucleicos inmunoestimuladores descritos aquí y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable de acuerdo a otros aspectos de la invención. En otros aspectos de la invención se proporciona un método para inducir una expresión de interferón (IFN) del tipo 1. El método implica poner en contacto una célula capaz de expresar IFN del tipo 1 con una cantidad efectiva de un 11 ácido nucleico inmunoestimulador descrito aquí para inducir la expresión de IFN del tipo 1. La invención en otros aspectos es un método para activar una célula asesina natural (NK) . El método implica poner el contacto una célula NK con una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador descrito aqui para activar la célula NK. En otros aspectos más de la invención es un método para tratar una infección administrando a un sujeto que tenga o este en riesgo de desarrollar una infección una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador descrito aqui, para tratar o prevenir la infección. En algunas modalidades el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una infección seleccionada del grupo que consiste de una infección viral, bacteriana, fungal y parasítica. En ciertas modalidades el método implica administrar un ácido nucleico inmunoestimulador de la invención solo para tratar o evitar prevenir la infección. En ciertas modalidades, el método de acuerdo a este aspecto de la invención incluye además administrar al sujeto un agente antibiótico, el cual puede ser un agente antibacteriano, un agente antiviral, un agente antifungal, o un agente antiparasitico . En otros aspectos la invención es un método para tratar una condición alérgica administrando a un sujeto que 12 tenga o este en riesgo de desarrollar una condición alérgica una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador descrito aqui, para tratar o prevenir la condición alérgica. En algunas modalidades la condición alérgica es el asma alérgico. En una modalidad la condición alérgica es el asma. En ciertas modalidades el método implica administrar el ácido nucleico inmunoestimulador de la invención solo para tratar o prevenir la condición alérgica. En ciertas modalidades el método de acuerdo a este aspecto de la invención incluye además administrar al sujeto un medicamento contra el asma/alergia, por ejemplo, esferoides, antihistaminas, o inductores de prostaglandina . De acuerdo a otros aspectos de la invención se proporciona un método para tratar el cáncer. El método implica administrar a un sujeto que tenga o este en riesgo de desarrollar un cáncer una actividad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador descrito aqui, para tratar o prevenir el cáncer. En algunas modalidades el cáncer es seleccionado del grupo que consiste de carcinoma celular basal, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga; cáncer óseo, cáncer cerebral y del SNC; cáncer de mama; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon y recto; cáncer del tejido conectivo; cáncer del sistema digestivo; cáncer endometrial; cáncer esofágico; cáncer ocular; cáncer de cabeza y cuello; cáncer gástrico; neoplasma intra-epitelial ; 13 cáncer de riñon; cáncer de laringe; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo células pequeñas y células no pequeñas) ; linfoma, incluyendo el linfoma de Hodgkin y no Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de la cavidad oral (por ejemplo, labio, lengua, boca y faringe) ; cáncer de ovario; cáncer pancreático; cáncer de próstata; retinoblastoma; radiomiosarcoma; cáncer rectal; cáncer renal; cáncer del sistema respiratorio; sarcoma; cáncer de piel; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer tiroideo; cáncer uterino; cáncer del sistema urinario, y otros carcinomas y surcamos. En ciertas modalidades el método implica administrar un ácido nucleico inmunoestimulador de la invención solo para tratar el cáncer. En ciertas modalidades el método de acuerdo a este aspecto de la invención incluye además administrar al sujeto un medicamento o tratamiento anticáncer, por ejemplo, agentes quimioterapeuticos, radiación. Cada una de las limitaciones de la invención puede abarcar varias modalidades de la invención. Por lo tanto, se anticipó que cada una de las limitaciones de la invención que implican a cualquier elemento o combinaciones de elementos pueden ser incluidas en cada aspecto de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las siguientes Figuras se proporcionan para 14 propósitos ilustrativos únicamente' y no se requieren para componer o practicar la invención. La Figura 1 es una gráfica de barras que describe las cantidades de IFN-oc (pg/ml) inducidas en PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas ,. con IL-2, o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas. la Figura 2 es una gráfica de barras que describe las cantidades de MCP-1 (pg/ml) inducidas en PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas, con IL-2, o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas. La Figura 3 es una gráfica de barras que describe las cantidades de IP-10 (pg/ml) inducidas en PMBC humanas 24 horas después de cultivo solas, con IL-2, o en presencia del ODN indicada a las concentraciones indicadas. La Figura 4 es una gráfica de barras que describe las cantidades de IFN-oc (pg/ml) inducidas en PBMC humanas después de 48 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 1.0 µg/ml. La Figura 5 es un par de gráficas de barras que describen una tinción superficial sobre células B para CD86 (MFI) después de 48 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 0.25 µ?/??? (panel A) o 1.0 µg/ml (panel B) . La Figura 6 es un par de gráficas de barras que 15 describen los resultados de un ensayo de proliferación de células B de 72 horas (cpm de incorporación de 3H-timidina) solas (N/A) o en presencia de ODN indicado a 0.25 g/ml (panel A) o 1.0 µq/ l (panel B) . La Figura 7 es un par de gráficas de barras que describen las cantidades IL-10 (pg/ml) inducidas en PBMC humana después de 24 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 0.25 mg/ml (panel A) o 1.0 µg/ml (panel B) . La Figura 8 es una gráfica de barras que describen las cantidades de IFN-oc (pg/ml) inducidas en PBMC de dos donadores (D127, barras sólidas, y D124 barras abiertas) después de 24 horas de cultivo solas (w/o) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6 . La Figura 9 es una gráfica d¾ barras que describe la activación de células B de acuerdo a lo medido por el por ciento de células positivas a CD86 en PBMC humanas cultivadas 24 horas solas (w/o) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (0.4, 1.0, ó 10.00 µg/ml) . La Figura 10 es una gráfica de barras que describe la cantidad de IF -cc (pg/ml) secretada por PBMC de dos donadores (D141, barras abiertas, y D142, barras sólidas), después de 24 horas de cultivo solas (w/o) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6 µg/ml) . 16 La Figura 11 es una gráfica de barras que describe la cantidad de IFN-cc (pg/ml) secretadas por PBMC de dos donadores (D141, barras' abiertas, y ?142, barras sólidas) después de 48 horas de cultivo solas (w/o) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1 ó 6 µg/ml) . La Figura 12 es una gráfica de barras que describe la cantidad de IFN-a (pg/ml) secretada por PBMC de dos donadores (D141, barras sombreadas, y D142, barras abiertas) después de 24 horas de cultivo solas (w/o) en presencia de ODN indicado a 6 µg/ml. La Figura 13 es una serie de tres gráficas de barra que describen la cantidad de IFN-? (pg/ml) secretadas por PBMC después de 24 horas de cultivo solas (n/a) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (1, 3, ó 10 µg/???l en los paneles A, B y C, respectivamente) . La Figura 14 es una gráfica de barras que describe el porcentaje de tinción positiva de células CD3+ para IFN-? después de 48 horas de cultivo solas (NA) o en presencia del ODN indicado. La Figura 15 es una gráfica de barras que describe la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la tinción de IFN-? en células T después de 48 horas de cultivo solas (NA) o en presencia del ODN indicado. La Figura 16 es una gráfica de barras que describe 17 la cantidad de IFN- (pg/ml) secretada por PBMC humanas después de 24 horas de cultivo solas (N/A) o en presencia del ODN indicado a 1.0 µg/ l. La Figura 17 es un par de gráficas de barras que describen la cantidad de IFN-cc (pg/ml) secretada por PBMC humanas después de 24 ó 48 horas de cultivo solas (vi/o) o en presencia del ODN indicado a la concentración indicada (1 ó 6 µg/ml) . El panel A describe los resultado de PBMC reunidos de dos donadores. El panel B describe los resultados de PBMC obtenidos de dos donadores (D141 y D142) . La Figura 18 es una gráfica de barras que describe el por ciento de células CD86-positivas después de 24 horas de cultivo solas (w/o) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (0.4 y 1.0 µg/ml) . La Figura 19 es una serie de tras gráficas de barras que describe la concentración de IFN-? (pg/ml) en sobrenadantes de cultivo de PBMC humanas después de incubación solas (w/o) , con LPS, o con el ODN indicado a las concentraciones indicadas (0.2 a 1.0 µg/:ml) durante 6 horas (panel A) , 24 horas (panel B) , o 48 horas (panel C) . La Figura 20 es una gráfica de barras que describe la cantidad de IFN-? (pg/ml) generada en una reacción de linfocitos mezclados bidireccional (MLR) en la cual los linfocitos obtenidos de los dos donadores fueron cultivados 18 durante 24 horas solos (w/o) o en presencia del ODN indicado a 6 µg/ml y a continuación mezclados. La Figura 21 es una serie de tres gráficas de barras que describen la concentración de IL-10 (pg/ml) en sobrenadantes de cultivo de PBMC humanas después de incubarlas solas (w/o) con LPS, o con el ODN indicado a las concentraciones indicadas (0.2 a 1.0 µg/ml) durante 6 horas (panel A) , 24 horas (panel B0, o 48 horas (panel C) . La Figura 22 es una gráfica de barras que describe las cantidades de IP-10 (pg/ml) en sobrenadantes de PBMC 24 horas después de la incubación solas (n/a) o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 (GGGGTCAACGTTGAGGGGGG, SEQ ID NO: 13) y ODN 2118 (GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG, SEQ ID NO: 36)) o varios ODN indicadas a cualquiera de 0.6 µg/ml (barras abiertas) o 3.0 µg/ml (barras sólidas). La Figura 23 es un par de gráficas de barras que describen las cantidades de IFN-cc (pg/ml) en sobrenadantes de PBMC después de 24 horas de incubación solas (n/a) o en presencia de controles (IL-2 ODN 1585, 'y ODN 2118) o varios ODN indicados a cualquiera de 0.6 µg/ml (panel A) o 3.0 µg/ml (panel B) . La Figura 24 es una gráfica de barras que describe las cantidades de IFN-? (pg/ml) en sobrenadante de PBMC 24 horas después de la incubación solas (n/a) o en presencia de 19 controles (IL-2, ODN 1585, y ODN 2118) o varios ODN indicados a cualquiera de 0.6 µg/ml (barras abiertas) o 3.0 µg/ml (barras llenas) . La figura 25 es una gráfica de barras que describe las cantidades de IL-6 (pg/ml) en sobrenadantes de PBMC después de 24 horas de incubación solas (n/a) o en presencia de controles (IL-2, ODN 1585 y ODN 2118) o varios ODN indicados a cualquiera de 0.6 µg/ml (barras abiertas) o 3.0 µg/ l (barras llenas) . La Figura 26 es una gráfica de barras que describe las cantidades de secreción de IFN-? (pg/ml) por PBMC después de 24 horas de cultivo solas (w/o) o en presencia del ODN indicado a las concentraciones indicadas (3.0 y 6.0 µg/ml) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se ha descubierto que ciertos oligodesoxinucleótidos (ODN) , los cuales contienen al menos dos motivos distintos tienen efectos estimuladores únicos y deseables sobre células del sistema inmune. Algunos de esos ODN tienen una secuencia CpG "estimuladora" tradicional y un motivo "rico en GC" o "neutralizante de células B" . Esos ácidos nucleicos de motivos combinados tienen efectos inmunoestimuladores que caen un tanto entre aquellos efectos asociados con el ODN CpG "clase B" tradicional, los cuales 20 son fuertes inductores de la activación de células B y la activación de células dendriticas (DC) , y aquellos efectos asociados con una clase mas recientemente descrita de ácidos nucleicos inmunoestimuladores (ODN CpG "clase A") los cuales son fuertes inductores de IFN-a y la activación de células asesinas naturales (NK) pero inductores relativamente pobres en la activación de células B y DC . Krieg AM et al. (1995) Nature 374:546-9; Bailas ZK et al. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S et al. (1992) J Immunol 148:4072-6. Aunque los ODN CpG clase B preferidos con frecuencia tienen estructura de fosforotioato y los ODN CpG clase A preferidos tienen estructuras mezcladas o quiméricas, la nueva clase de ácidos nucleicos inmunoestimuladores de motivos combinados pueden tener estructuras estabilizadas, por ejemplo, de fosforotioato, quiméricas, o fosfodiéster . En un aspecto la invención proporciona ácidos nucleicos inmunoestimuladores que pertenecen a esta nueva clase de ácidos nucleicos inmunoestimuladores de motivos combinados. El dominio estimulador de células B es definido con una fórmula: 5 ' iDCGHX23' . D es un nucleótido diferente de C. C es citosina. G es guanina. H es un nucleótido diferente de G. Xi y X2 son cualquier secuencia de ácido nucleico de 0 a 10 nucleótidos de longitud. Xi puede incluir un CG, el cual en este caso es preferiblemente una T inmediatamente 21 precedente a este CG. En algunas modalidades DGC es TCG. ?? es preferiblemente de 0 a 6 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades X2 no contiene ningún motivo de poli G o poli A. En otras modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una secuencia de poli T en el extremo 5' o en el extremo 3' . Como se usa aquí, "poli A" o "poli ?" se referirá a una extensión de 4 o más ' o ?" consecutiva, respectivamente, por ejemplo, 5'????3' o 5'TTTT3' . Como se usa aquí, "extremo poli G" se referirá a una extensión d 4 o más G consecutivas, por ejemplo 5'GGGG3', que ocurren en el extremo 5' o el extremo 3' de un ácido nucleico. Como se usa aquí, "ácido nucleico de poli G" se referirá a un ácido nucleico que tiene la fórmula 5' X1X2GGGX3X43 f donde Xi, X2, X3 y X4 son nucleótidos, y de manera preferible, al menos uno de X3 y X4 es una G. Algunos de los diseños preferidos para el dominio estimulador de células B bajo esta fórmula comprende TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, TCGTCGT . El segundo motivo del ácido nucleico es referido como P o N y está conectado inmediatamente 5' a X1 o inmediatamente 3' a X2. N es una secuencia neutralizante de células B que comienza con un trinucleótido CGG y es de al menos 10 nucleótidos de longitud. Un motivo neutralizante de células B incluye al menos una secuencia CpG en la cual el CG es precedido por una C o seguido por una G (Krieg AM et al. (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:12631-12636) o una secuencia de ADN que contiene CG en la cual la C del CG está metilada. Como se usa aquí, "CpG" se referirá a una citosina (C) 5' seguida por una guanina (G) 3' y ligada por un enlace fosfato. Al menos la C de 5'CG3' debe estar metilada. Los motivos neutralizantes son motivos los cuales tienen algún grado de capacidad inmunoestimuladora cuando están presentes en un motivo en otras circunstancia no estimulador, pero, cuando están presentes en el contexto de otros motivos inmunoestimuladores sirven para reducir el potencial inmunoestimulador de los otros motivos. P es un palindromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud. Como se usa aqui, "palindromo" y, de manera equivalente, "secuencia palindrómica" se referirá a una repetición invertida, es decir, una secuencia como ABCDEE' D'C'B'ñ' en la cual A y A' , B y B' , etc, son bases capaces de formar los pares de bases de Watson-Crick usuales. Como se usa aqui, "palíndromo rico en GC" se referirá a un palíndromo que tenga composición de base de al menos dos tercios de G' y C . En algunas modalidades el dominio rico en GC está preferiblemente 3' al "domino estimulador de células B" . En el caso de un palíndromo rico en GC de 10 bases de longitud, el palíndromo que contiene de 23 este modo al menos 8 G' y C . En el caso de un palíndromo rico en GC de 12 bases de longitud, el palíndromo también contiene al menos 8 G' y C . En el caso de un palíndromo rico en GC 14-mérico, al menos 10 bases del palíndromo son G' y C . En algunas modalidades el palíndromo rico en GC está constituido exclusivamente de G' y C . En algunas modalidades el palíndromo rico en GC tiene una composición de bases de al menos 81 por ciento de G' y C . En el caso de palíndromo rico en GC de 10 bases de longitud, el palíndromo está constituido de este modo exclusivamente de G' y C . En el caso del palíndromo rico en GC de 12 bases de longitud, se prefiere que al menos 10 bases (83 por ciento) del palíndromo sean G' y C . En algunas modalidades preferidas, un palíndromo rico en GC de 12 bases de longitud está constituido exclusivamente de G' y C . En el caso del palíndromo rico en GC 14-mérico, al menos doce bases (86 por ciento) del palíndromo son G' y C . En algunas modalidades preferidas, un palíndromo rico en GC de 14 bases de longitud está constituido exclusivamente de G' y C . Las C del palíndromo rico en GC pueden no estar o estar metiladas. En general este dominio tiene al menos 3 C y G, de manera más preferible 4 de cada uno, y de manera más preferible 5 o más de cada una. El número de C y G en este dominio no necesita ser idéntico. Se prefiere que las C y G estén arregladas de modo que puedan formar un dúplex 24 autocomplementario, o palíndromo, como CCGCGCGG. Esto puede ser interrumpido por As o Ts, pero se prefiere que la autocomplementaridad se preserve al menos parcialmente por ejemplo en los motivos CGACGTTCGTCG (SEQ ID NO: 80) o CGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO: 81) . Cuando no se preserve la complementariedad, se prefiere que los pares de bases no complementarias sean TG. En una modalidad preferida no existen más de tres bases consecutivas que no son parte del palíndromo, preferiblemente no más de dos, y de manera más preferible solo 1. En algunas modalidades el palíndromo rico en GC incluye al menos un trímero CGG, al menos un trímero CCG, o al menos un tetrámero CGCG. En otras modalidades el palíndromo rico en GC no es CCCCCCGGGGGG (SEQ ID NO: 31) o GGGGGGCCCCCC (SEQ ID NO: 32), CCCCCGGGGG (SEQ ID NO: 33) o GGGGGCCCCC (SEQ ID NO: 34) . Al menos una de las G' de la región rica en GC puede ser sustituida con una inosina (1) . En algunas modalidades P incluye más de una I. En ciertas modalidades el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una de las siguientes fórmulas 5'NXiDCGHX23' , 5 ' X!DCGHX2N3 ' , 5' PX!DCGHX23 ' , 5 ' X;iDCGHX2P3 ' , 5'XiDCGHX2PX33' , 5' X1DCGHPX33' , 5 ' DCGHX2PX33 ' , 5 ' TCGHX2PX33 ' , 5'DCGHPX33', o 5OCGHP3'. En otro aspecto la invención proporciona ácidos nucleicos inmunoestimuladores los cuales son definidos por una fórmula: 5'NiPyGN2P3' . Ni es cualquier secuencia de 1 a 6 nucleótidos de longitud. Py es una pirimidina, G guanina, N2 es cualquier secuencia de 0 a 30 nucleótidos de longitud, P es un palíndromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud. Ni y N2 pueden contener más de 50 por ciento de pirimidinas, y de manera más preferible más de 50% de T. Ni puede incluir un CG, caso en el cual existe preferiblemente una T precediendo inmediatamente a este CG. En algunas modalidades NiPyG es TCG (como el ODN 5376, el cual tiene una 5'TCGG) , y de manera más preferible una TCGN2, donde N2 no es G. NiPyGN2P pueden incluir uno o más nucleótidos inosina (I) . Cualquiera de C o G en Ni puede ser reemplazada por inosina, pero se prefiere Cpl sobre IpG. Para sustituciones de inosina como IpG, la actividad óptima puede ser lograda con el uso de una estructura "semisuave" o quimérica, donde el enlace entre IG o CI es fosfodiéster . i puede incluir al menos un motivo de CI, TCI, IG o TIG. En ciertas modalidades NiPyGN2 es una secuencia seleccionada del grupo que consiste de TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, y TCGTCG . En otros aspectos la invención proporciona ácidos nucleicos inmunoestimuladores los cuales son definidos por una fórmula: 5' NiPyG/IN2P3' . i es cualquier secuencia de 1 a 6 nucleótidos de longitud. Py es una pirimidina, G/I se refiere a un solo nucleótido el cual es una G o una I. G es guanina e I es inosina. N2 es cualquier secuencia de 0 a 30 nucleótidos de longitud, P es un palíndromo rico en GC o IC que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades NiPyIN2 es TCITCITTTT (SEQ ID NO: 47) . Algunos ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos ínmunoestimuladores de motivos combinados, que son descritos por las fórmulas anteriores incluyen a los siguientes: TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (ODN 2395), TCGTCGTTTTCGTCGTCCGCCG (ODN 2429) , TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCGG {ODN 2430), TCGTCGGTTTCGGCGCCGGCCG (ODN 2431), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (ODN 2432), TCGTCGTTTTCGTCGGCGGCCGTTTTT (ODN 2452), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (ODN 5315), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (ODN 5327, donde Z es 5-metilcitosina) , TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG (ODN 2136) , TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG (ODN 5513), TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG (ODN 5514), TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG (ODN 5515) , TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCTG (ODN 5516),. TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTG (ODN 2451), TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG (ODN 20173), TCGTCGTTTCGATGATCGTCG (ODN 20176), TCGTCGTTTTGACGTACGTCG (ODN 20177), TCGTCGCGACGGCCGTCG (ODN 20178), TCGTCGCGACGATCGTCG (ODN 20179), TCGTCGCGACGTACGTCG (ODN 20180), TCGTTTTTTTCGACGGCCGCTG (ODN 27 20184), TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG (ODN 20185), TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG (ODN 20186), TIGTIGTTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 5569, SEQ ID NO: 63), y TCITCITTTTCGGCGGCCGCCG (ODN 5570, SEQ ID NO: 70) . Como se usa aquí, "ácido nucleico" y " oligonucleótido" son usados de manera intercambiable y se referirán a nucleótidos múltiples (es decir, moléculas que comprenden un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) ligada a un grupo fosfato y a una base orgánica intercambiable, la cual es cualquiera de una pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C) , timina (T) o uracilo (U) ) o una purina sustituida (por ejemplo adenina (A) o guanina (G) ) . Como se usan aqui, los términos se refieren a oligorribonucleótidos asi como oligodesoxiribonucleótidos (ODN) . Los términos también incluirán polinucleosidos (es decir, polinucleótido menos el fosfato) y cualesquier otros polímeros que contengan bases orgánicas. Las moléculas de ácidos nucleico pueden ser obtenidas de las fuentes de ácido nucleico existentes (por ejemplo, genómico o ADNc) , pero son preferiblemente sintéticas (por ejemplo producidas por síntesis de ácido nucleico) . Los términos ácido nucleico y oligonucleótido también abarca ácidos nucleicos u oligonucleótidos con sustituciones o modificaciones, como en las bases y/o azucares. Por ejemplo, ellos incluyen ácidos nucleicos que 28 tienen azucares estructurales los cuales están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular diferentes a un .grupo hidroxilo en la posición 3' y diferentes a un grupo fosfato en la posición 5' . De este modo los ácidos nucleicos modificados pueden incluir un grupo ribosa 2 ' -O-alquilado . Además, los ácidos nucleicos modificados pueden incluir azucares como la arabinosa en lugar de la ribosa. De este modo los ácidos nucleicos pueden ser heterogéneos en la composición estructural, conteniendo por lo tanto cualquier combinación posible de unidades poliméricas ligadas juntas como péptido-ácidos nucleicos (los cuales tienen una estructura de aminoácidos con bases de ácido nucleico) . En algunas modalidades, los ácidos nucleicos son homogéneas en la composición de su estructura. Los ácidos nucleicos también incluyen purinas y pirimidinas sustituidas como bases modificadas con propilo de C-5. agner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Las purinas y pirimidinas incluyen pero no se limitan a la adenina, citosina, guanina, timidina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2, 6-diaminopurina, hipoxantina, y otras nucleobases naturales y no naturales, porciones aromáticas sustituidas y no sustituidas. Otras de esas modificaciones son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la presente invención pueden abarcar varias modificaciones y sustituciones químicas, en comparación con el ADN y ARN natural, que implican un puente internucleosidico fosfodiéster, una unidad de ß-D-ribosa y/o una base nucleosidica natural (adenina, quanina, citosina, tiamina, uracilo) . Los ejemplos de modificaciones químicas son conocidos por aquellos expertos en la técnica y son descritos, por ejemplo, en Uhlmann E et al. (1990) Che Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" , Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; y Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Un oligonucleótido de acuerdo a la invención puede tener una o más modificaciones, donde cada modificación se localiza en un puente internucleosidico de fosfodiéster particular y/o en una ß-D-ribosa particular y/o en una posición de base nucleosidica natural particular en comparación con un oligonucleótido de la misma secuencia que este compuesto de ADN a ARN natural. Por ejemplo, la invención se relaciona con un oligonucleótido el cual puede comprender una o más modificaciones y donde cada modificación es seleccionada independientemente de: a) la colocación de una unidad de fosfato de 30 azúcar de la estructura del fosfato de azúcar por otra unidad; b) el reemplazo de una unidad de ß-D-ribosa por una unidad de azúcar modificada; y c) el reemplazo de una base nucleosidica natural por una base núcleosidica modificada. Los ejemplos más detallados para la modificación química de un oligonucleotido son como sigue. Una unidad de fosfato de azúcar (es decir, una ß-D-ribosa y un puente internucleosídico fosfodiéster juntos forman una unidad de fosfato de azúcar) de la estructura de fosfato de azúcar (es decir, que una estructura de fosfato de azúcar está compuesta de unidades de fosfato de azúcar) puede ser reemplazada por otra unidad, donde la unidad es por ejemplo adecuada para construir un oligómero "derivado de morfolino" (de acuerdo a lo descrito, por ejemplo, en Stirchak EP et al. (1998) Nucleic Acids Res 17:6129-41), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una unidad derivada de morfolino; o para construir un ácido poliamidonucleico ("PNA"; de acuerdo a lo descrito por ejemplo, en Nielsen Patente Estadounidense Et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una unidad de la estructura de PNA, por ejemplo, por 2-aminoetilglicina . Una unidad de ß-ribosa o una unidad de ß-?-2'- 31 desoxirribosa puede ser reemplazada por una unidad de azúcar modificada, donde la unidad de azúcar modificada es seleccionada por ejemplo de ß-D-ribosa, cc-D-2 ' -desoxirribosa, L-2 ' -desoxirribosa, 2' -F-2' desoxirribosa, 2' -O-alquilo (de Ci-Ce) -ribosa, preferiblemente 2 '-O-alquilo (de ??-?d) -ribosa o 2 ' -O-metilrribosa, 2 ' -O-alquenilo (de Ci-C6) -ribosa, 2'-[0-alquilo(de 0?-06) -O-alquilo (de Ci-C6) ] -ribosa, 2'-NH2-2'-desoxirribosa, ß-D-xilo-furanosa, a-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi- -D-eritro-hexo-piranosa, y análogos de azúcar carboxilicos (descritos, por ejemplo, en Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320) y/o de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) y/o análogos de bicicloazúcar (descritos, por ejemplo, en Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481) . Una base nucleosidica natural puede ser reemplazadas por una base nucleosidica modificada, donde la base nucleosidica modificada es seleccionada por ejemplo de hipoxantina, uracilo, dihidrouracilo, seudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquil(de Ci-Ce) uracilo, 5-alquenil ( de 02-0d) -uracilo, 5-alquinil (de C2-Cs) , 5- (hidroximetil ) uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquil(de Ci-C6) citosina, 5-alquenil (de C2-Ce) citosina, 5-alquinil (de C2-Ce) citosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5- 32 bromocitosina, N2-dimetilguanosina, 2 , 4-diamino-purina, 8-azapurina, una 7-desazapurina sustituida, preferiblemente purina 7-desaza-7-sust±tuida y/o 7-desaza-8-sustituida u otras modificaciones de bases nucleosidicas naturales. Esta lista es ejemplar y no deber ser interpretada como limitante. Como se usa aqui, "ácido nucleico inmunoestimulador" y, de manera equivalente, "ácido nucleico inmunoestimulador" se referirán a una molécula de ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleíco, derivado o análogo de la misma, caracterizado por su capacidad para inducir un aspecto funcional de una célula del sistema inmune. Ese aspecto funcional de una célula del sistema inmune puede incluir, por ejemplo, elaboración de una citosina o quimosina, expresión de un marcador de la superficie celular, secreción de un anticuerpo, proliferación, u otra actividad en respuesta a o dirigida contra un antigeno o un objetivo unido a una membrana que contenga un antigeno. Para usarse en la presente invención, los ácidos nucleicos de la invención pueden ser sintetizados de novo usando cualquiera de un número de procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el método de la ß-cianoetil fosforamidita (Beaucage SL y Caruthers MH (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); y el método del H-fosfonato de nucleósido (Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler et al. (1986) Nucí Acid Resl : 5399-407; Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney et al. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22) . Esos métodos químicos pueden ser efectuados por una variedad de sintetizadores de ácido nucleico automatizados disponibles en el mercado. Esos ácidos nucleicos son referidos como ácidos nucleicos sintéticos. De manera alternativa, los ácidos nucleicos de la invención pueden ser producidos a gran escala en plásmidos, (véase Sambrook T et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) y separados en piezas más pequeñas o administrados completos. Los ácidos nucleicos pueden ser preparados a partir de secuencias de ácido nucleico existentes (por ejemplo, genómico o ADNc) usando técnicas conocidas como aquellas que emplean enzima de restricción, exonucleasa sobre endonucleasas . Los ácidos nucleicos preparados de esta manera son referidos como ácidos nucleicos aislados. Un ácido nucleico aislado se refiere generalmente a un ácido nucleico el cual está separado de componentes con los cuales normalmente está asociado dentro de la naturaleza. Como un ejemplo, un ácido nucleico aislado el cual está separado de una célula, de un núcleo, de mitocondrias o de cromatina. Los ácidos nucleicos de motivos combinados de la presente invención abarcan ácidos nucleicos de motivos combinados sintéticos y aislados. Para usarse in vivo, los ácidos nucleicos 34 inmunoestimuladores de motivos combinados pueden ser, de manera opcional, relativamente resistentes a la degradación (por ejemplo, están estabilizados) . Una "molécula de ácido nucleico estabilizada" significará una molécula de ácido nucleico que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, via una exonucleasa o endonucleasa) . La estabilización del ácido nucleico puede ser lograda via modificaciones de la estructura del fosfato. Los ácidos nucleicos estabilizados preferidos de la presente invención tienen una estructura modificada. Se ha demostrado que la modificación de la estructura del ácido nucleico proporciona un aumento de la actividad de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de motivos combinados cuando se administran in vivo. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de motivos combinados que tienen enlaces fosforotioato en algunos casos proporcionan actividad máxima y protegen el ácido nucleico contra la degradación por exonucleasas y endonucleasas intracelulares . Otros ácidos nucleicos modificados incluyen ácidos nucleicos con fosfodiéster modificados, combinaciones de ácidos nucleicos con fosfodiéster y fosforotiato (es decir quiméricos) , metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi y combinaciones de los mismos. Las estructuras modificadas como los fosforotioatos pueden ser sintetizadas usando técnicas automatizadas 35 empleando cualquiera de los métodos químicos de fosforoamidita o H-fosfonato. Pueden ser producidos aril- y alquil-fosfonatos , por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,469,863; y alquilfosfotriésteres (en los cuales la porción de oxígeno cargada está alquilada como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,023,243 y la Patente Europea No. 092,574) pueden ser preparados por síntesis por fase sólida automatizada usando reactivos comercialmente disponibles. Han sido descritos métodos para producir otras modificaciones y sustituciones a la estructura de ADN. ühlmann E y Peyman A (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. Otros ácidos nucleicos estabilizados incluyen: análogos de ADN no iónicos, como alquil- y aril-fosfatos (en los cuales el oxígeno del fosfonato cargado está reemplazado por un grupo alquilo o arilo) , fosfodiéster y alquilfosfotriésteres , en los cuales la porción de oxígeno cargada está alquilada. Los ácidos nucleicos que contienen diol, como el tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en cualquiera o ambos términos también han mostrado sustancialmente resistencia a la degradación con nucleasa. En otras modalidades los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden tener estructuras de fosfodiéster o quiméricas, por ejemplo, blandas o semiblandas. Una estructura quimérica incluye una combinación de enlace de 36 estructura fosfodiéster y modificados . Un oligonucleótido quimérico, por ejemplo, puede ser un oligonucleótido blando o un oligonucleótido semiblando. Un oligonucleótido blando es un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene una estructura parcialmente estabilizada, en la cual los enlaces internucleosidicos, fosfodiéster o similares al fosfodiéster ocurren únicamente dentro de e inmediatamente adyacentes a al menos un dinucleótido de nucleosido pirimidina-guanosina (YG) interno. Al menos un dinucleótido YG tiene en si un enlace internucleosidico fosfodiéster o similar al fosfodiéster. Un enlace internucleosidico fosfodiéster o similar al fosfodiéster ocurre inmediatamente adyacente a al menos un dinucleótido YG interno puede estar 5', 3' o ambos 5' y 3' a al menos un dinucleótido YG interno. Preferiblemente un enlace internucleosidico fosfodiéster o similar al fosfodiéster que ocurre inmediatamente adyacente a al menos un dinucleótido YG interno es en si un enlace internucleosidico interno. De este modo para una secuencia NiYGN2, donde Ni y N2 son cada uno, independientemente entre si, cualquier nucleótido simple, el dinucleótido YG tiene un enlace internucleosidico ' fosfodiéster o similar al fosfodiéster, y además (a) Ni y Y están ligados por un enlace internucleosidico fosfodiéster o similar al fosfodiéster cuando i es un nucleótido interno, (b) G y N2 están ligados 37 por un enlace internucleosidico fosfodiéster o similar al fosfodiéster cuando N2 es un nucleótido interno, o (c) ?? y Y están ligados por un enlace internucleosidico fosfodiéster o similar al fosfodiéster cuando ?? es un nucleótido interno y G y N2 están ligados por un enlace internucleosidico fosfodiéster o similar al fosfodiéster cuando 2 es un nucleótido interno. Un oligonucleótido semiblando es un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene un esqueleto parcialmente estabilizado, en el cual los enlaces internucleosidicos fosfodiéster y similares al fosfodiéster ocurren únicamente dentro de al menos un dinucleótido de nucleósido pirimidina-guanosina (YG) interno. Los oligonucleótidos semiblandos pueden tener un número de ventaja sobre los oligonucleótidos inmunoestimuladores con esqueletos completamente estabilizados. Por ejemplo, los oligonucleótidos semiblandos pueden poseer una mayor potencia inmunoestimuladora en relación a oligonucleótidos inmunoestimuladores completamente estabilizados correspondientes. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser usados para tratar a un sujeto para inducir una respuesta inmune o tratar una enfermedad relacionada con el sistema inmune como, por ejemplo, una enfermedad infecciosa, cáncer, y trastornos alérgicos. Como se usa aqui, "sujeto" se referirá a un humano o animal vertebrado incluyendo, pero sin 38 limitarse a un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, mono, conejo, rata, ratón, etc. Como se usan aqui, los términos "tratar", "tratamiento", "tratado" se referirán a un tratamiento profiláctico el cual incrementa la resistencia de un sujeto a desarrollar una enfermedad o, en otras palabras, disminuir la probabilidad de que el sujeto desarrolle una enfermedad o aletargar el desarrollo de la enfermedad, asi como a un tratamiento después de que el sujeto ha desarrollado la enfermedad para combatir la enfermedad, por ejemplo, reducir o eliminar ésta en conjunto o evitar que empeore. Por ejemplo, cuando se usan con respecto al tratamiento de una enfermedad infecciosa los términos se refieren a un tratamiento profiláctico el cual incrementa la resistencia de un sujeto o microorganismo, o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle una enfermedad infecciosa al microorganismo, asi como a un tratamiento después de que el sujeto ha sido infectado para combatir la enfermedad infecciosa, por ejemplo, reducir o eliminar ésta en conjunto o evitar que empeore. Cuando se usan con respecto a una enfermedad como el cáncer los términos se refieren a la prevención o retraso del desarrollo de un cáncer, reducción de los síntomas del cáncer, y/o inhibición o aletargamiento del crecimiento de un cáncer establecido. De este modo, los ácidos nucleicos son útiles como agentes profilácticos para la inducción de inmunidad de un sujeto en riesgo de desarrollar una infección con un organismo infeccioso o un sujeto en riesgo de desarrollar un trastorno alérgico o cáncer. Un "sujeto en riesgo" como se usa aquí es un sujeto que tiene cualquier riesgo de exposición a un patógeno infeccioso que cause infección, exposición a un alérgeno, o desarrollo de cáncer. Por ejemplo, un sujeto en riesgo puede ser un sujeto que esté planeando viajar a un área donde se encuentre un tipo particular de agente infeccioso o alérgeno o puede ser un sujeto que a través de su tipo de vida o procedimientos médicos se exponga a fluidos corporales que puedan contener organismos infecciosos o aún cualquier sujeto que vive en un área en la que hayan sido identificados organismos infecciosos o alérgenos y esté expuesto directamente al agente infeccioso o alérgeno. Este también puede ser un sujeto en riesgo de guerra biológica como el personal militar o aquellos que viven en áreas en riesgo de ataques terroristas. Los sujetos en riesgo de desarrollar infección también incluyen poblaciones generales a las cuales una agencia médica recomiende la vacunación con un antigeno de organismo infeccioso particular. Si el antigeno es un alérgeno y un sujeto desarrolla respuestas alérgicas a ese antigeno particular y el sujeto es expuesto al antigeno, es decir, durante la estación de polinización, entonces ese 40 sujeto está en riesgo de exposición al antigeno. Los sujetos en riesgo de desarrollar cáncer incluyen aquellos con predisposición genética o previamente tratados para el cáncer, y aquellos expuestos a carcinógenos como el tabaco, asbestos, y otras toxinas químicas o luz solar excesiva y otros tipos de radiación. Los ácidos nucleicos también son útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer y trastornos alérgicos. Un "sujeto que tiene una infección" es un sujeto que ha sido expuesto a un patógeno infeccioso y tiene niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el cuerpo. Los ácidos nucleicos pueden ser usados solos, o en conjunto con otros agentes terapéuticos como un antígeno o un medicamento antimicrobiano para montar una respuesta inmune que es capaz de reducir el nivel de o erradicar el patógeno infeccioso. El método implica administrar a un sujeto que tenga o esté en riesgo de desarrollar una infección una cantidad efectiva de ácido nucleico estimulador inmune de motivos combinados de la invención para tratar la infección. El método puede ser usado para tratar infecciones virales, bacterianas, micóticas y parasitarias en sujetos humanos y vertebrados no humanos. Como se usa aquí, "infección" y de manera equivalente, "enfermedad infecciosa" se referirá a una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo extraño en el cuerpo de un sujeto. Un microorganismo extraño 41 o externo puede ser un virus, bacteria, un hongo, o un parásito . Los ejemplos de virus infecciosos incluyen: Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana, como el VIH-1 (también referido como HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o VIH-III; y otros aislados, como el VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus de coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus) ; Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola) ; Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla) ; Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus) ; Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia) ; Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola) ; Paramyxoviridae (por ejemplo virus de la parainfluenza, virus vasculares, virus del sarampión, virus sincitial respiratorios) ; Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la influenza) ; Bungaviridae (por ejemplo, virus de Hantaan, virus de bunga, flebovirus y virus de Nairo) ; Arena viridade (virus de la fiebre hemorrágica) ; Reoviridade (por ejemplo reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridade; Hepadnaviridade (Virus de la hepatitis B) ; Parvoviridae (parvovirus) ; Papovaviridae (virus del papiloma, 42 virus del polioma) ; Adenoviridade (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridade (virus del herpes simple (HSV) 1 y 2, virus zoster de varicela, citomegalovirus (C V) , virus del herpes); Poxviridae (virus de la varicela, vaccinia virus, virus de la viruela) ; y Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre porcina africada) ; y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de las encefalopatías Espongiformes, el agente de la hepatitis delta (aunque sea un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B) , los agentes de la hepatitis no A, no B (clase l=transmitida internamente; clase 2=transmitida parenteralmente (es decir, Hepatits C) ; virus de Norwalk y relacionados, y astrovirus) . Los ejemplos de bacterias infecciosas incluyen: Actinomyces israelii r Bacillus anthracis, Bacteroides spp. , Bozrelia burgdorferi, Chlamydia trachomatis, Clostridium perfxingens, Clostridium tetrani, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium spp., Enterobacter aerogenes, Enterococcus sp. r Erysipelothrix rhusiopathiae, Fusobacterium nucleatum, Haemophílus influenzae, Helicobacter pyloris, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophilia , eptospira , Listeria monocitogenes, Mycobacteria spp. (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii , M. gordonae) , Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasturella ultocida , Campylobacter sp. patogénico, 43 Staphylococcus aureus, ' Streptobacillus moniliformis , Streptococcus (ssp. anaeróbico) , Streptococcus (grupo viridaneo) , Streptococcus agalactias [Streptococcus Grupo B) , Streptococcus . bovis, Streptococcus faecalls , Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Streptococcus Grupo A) , Treponema pallldlum, y Treponema pertenue . Los ejemplos de hongos infecciosos incluyen: Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatu , Coccidioldes immítis, y Blastomyces dermatitidis . Otros organismos infecciosos (es decir, protistas) , incluyen Plas odium sp . como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y Plasmodium vivax, y Toxoplasma gondii. Los parásitos de la sangre y/o tejidos incluyen Plasmodium spp., Babesia microti, Babesi divergens, Leishmania trópica,- Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani , Trypanosoma gambiense y Trypanosoma rhodesiense (enfermedad del sueño Africana) , Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas), y Toxoplasma gondii. Debe comprenderse que las listas anteriores de virus, bacterias, hongos y otros microorganismos infecciosos es representativa y no limitante. Otros microorganismos médicamente relevantes han sido descritos exhaustivamente en la literatura, por ejemplo, véase C.G.A. Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Gran Bretaña 1983, todo el 44 contenido de la cual se incorpora aquí como referencia. Aunque muchos de los agentes microbianos descritos anteriormente se relacionan con trastornos humanos, la invención también es útil para tratar vertebrados no humanos . Los vertebrados no humanos también son capaces de desarrollar infecciones las cuales pueden ser prevenidas o tratadas con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores descritos aqui . Por ejemplo, además del tratamiento de enfermedades humanas infecciosas, los métodos de la invención son útiles para tratar infecciones de animales. Los virus infecciosos de vertebrados humanos y no humanos incluyen retrovirus, ARN virus y ADN virus. Este grupo de retrovirus incluye retrovirus simples y retrovirus complejos. Los retrovirus simples incluyen los subgrupos de retrovirus del tipo B, retrovirus del tipo C, y retrovirus del tipo D. Un ejemplo de un retrovirus del tipo B es el virus del tumor mamario de ratón (MMTV) . Los retrovirus del tipo C incluyen subgrupos del grupo A y posee (incluyendo el virus del sarcoma de Rous (RSV) , virus de la leucemia aviaria (ALV) , virus de la mieloblastosis aviaria (AMV) ) y grupo B tipo C (incluyendo el virus de la leucemia felina (FeLV) , virus de la leucemia del simio gibbon (GALV) , virus de la necrosis del bazo (SNV) , virus de la reticuloendoteliosis (RV) y virus de sarcoma simio (SSV) ) . Los virus del tipo D incluyen virus del mono de Mason-Pfizer (MPMV) y retrovirus 45 simio del tipo 1 (SRV-1 ) . Los retrovirus complejos incluye el subgrupo del lentivirus, virus de la leucemia de células T y virus esponjosos. Los lentivirus incluyen al VIH-1, pero también incluyen al VIH-2, SIV, Visna Virus, Virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) y virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) . Los virus de la leucemia de células T incluyen HTVL-1, HTVL-II, virus de la leucemia de células T simio (STLV) , y virus de la leucemia bovina (BLV) . Los virus espumosos incluyen virus espumosos humanos (HFV) , virus espumoso simio (SFV] y virus espumoso bovino (BFV) . Ejemplos de otros ARN virus que son agentes infecciosos . en animales vertebrados incluyen, pero no se limitan a, miembros de la familia Reoviridae, incluyendo el genero Orthoreovirus (serotipos múltiples de retrovirus de mamíferos y aves) , el genero Orbivirus (virus de la lengua azul, virus de Eugenangee, virus de Kemerovo, virus de la enfermedad de los caballos africanos, y virus de la fiebre de la garrapata de colorado) , el genero Rotavirus (rotavirus humano, virus de la diarrea del carnero de Nebraska, rotavirus simio, rotavirus bovinos u ovinos, rotavirus aviarios); la familia Picornaviridae, incluyendo el genero enterovirus (polivirus, virus de Coxsacki A y B, virus huérfanos humanos citopáticos entéricos (ECHO) , virus de la hepatitis A, enterovirus simios, virus de la encefalomielitis murina (ME), Poiiovirus muris, enterovirus bovinos, 46 enterovireus porcinos, el genero Cardiovirus (virus de la encefalomiocarditis (EMC) , Mengovirus) , el genero Rhinovirus (rinovirus humanos incluyendo al menos 113 subtipos; otro rinovirus) , el genero Apthovirus (virus de la enfermedad de los pies y la boca (FMDV) ; la familia Calciviridae, incluyendo virus del exantema vesicular de los cerdos, virus de león del mar de San Miguel, picornavirus felinos y virus de Norwalk; la familia Togaviridae, incluyendo el genero Alphavirus (virus de la encefalitis equina oriental, virus del bosque de Semliki, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus de 0' yong-Nyong, virus del rio Ross, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina occidental, el genero Flavivirus (virus de la fiebre amarilla portado por mosquitos, virus del dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Louis, virus de la encefalitis del valle de Murray, virus del Nilo occidental, virus de Kunjin, virus portado por las garrapatas de Europa Central, virus portado por las garrapatas del lejano oriente, virus del bosque de Kyasanur, virus de Louping III, virus de Powassan, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk) , el genero Rubivirus (virus de la rubéola) , el genero Pestivirus (virus de la enfermedad mucosa, virus del cólera de Hog, virus de la enfermedad de la frontera) ; la familia Bunyavirída, incluyendo el género Bunyvirus (virus de Bunyamera y relacionados, virus del grupo 47 de la encefalitis californiana) , el genero Phlebovirus (virus siciliano de la fiebre del mosquito simulido, virus de la fiebre del valle de Rift) , el genero Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Cogo, virus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi) , y el genero Uukuvirus (virus de Uukuniemi y relacionados) ; la familia Orthomyxoviridae, incluyendo el genero de virus de la influenza (virus de la influenza tipo A, muchos subtipos humanos) ; virus de la influenza porcina, y virus de la influenza aviaría y equina; influenza tipo B (muchos subtipos humanos) , e influenza tipo C (posible genero separado) ; la familia paramyxoviridae, incluyendo el genero Paramyxovirus (virus de la parainfluenza tipo 1, virus de Sendai, virus de Hemadsorción, virus de la parainfluenza tipos 2 a 5, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de las paperas), el genero Morbíllivirus (virus del sarampión, virus de la panencefalitis esclerosante subaguda, virus de moquillo, virus de Rinderpest) , el genero Pneumovirus (virus sincitial respiratorio, (RSV) , virus sincitial respiratorio bovino y virus de la neumonía) ; la familia Rahbdoviridaer incluyendo el genero Vesiculovirus (VSV) , virus de Chandipura, virus de Flanders-Hart Park) , el genero Lyssavirus (virus de la rabia) , rabdovirus de peses y dos Rabdovirus probados (virus de Marburg y virus de Ebola) ; la familia Arenaviridae, incluyendo el virus de la coriomeningitis linfocitica (LCM) , complejo del virus de 48 tacaribe, y virus de Lassa; la familia de Coronoaviridae, incluyendo el virus de la bronquitis infecciosa (IBV) , virus de la hepatitis, coronavirus entéricos humanos, y peritonitis infecciosa felina (coronavirus felinos) . Los ADN virus ilustrativos que son agentes infecciosos en animales vertebrados incluyen, pero no se limitan a, la familia Poxviridae, incluyendo el género Orthopoxvirus (varicela mayor, varicela menor, Vaccinia de la Viruela de los Monos, viruela de la vaca, viruela del búfalo, viruela del conejo, Ectromelia) , el genero Leporipoxvirus (Myxoma, Fibroma) , el genero Avípoxvirus (viruela de pollo, otros poxvirus aviarios) , el genero Capripoxvirus (viruela de la oveja, viruela de la cabra), el genero Suípoxvírus (viruela porcina) , el genero Parapoxvirus (virus de la dermatitis muscular contagiosa, seudoviruela de vaca, virus de la estomatitis papular bovina) la familia Iridoviridae (virus de la fiebre porcina africana, virus de la rana 2 y 3, virus linfoquisticos de los peces) ; la familia Herpesviridae, incluyendo los alfa-Herpesvirus (Herpes simple Tipos 1 y 2, Varicela-Zoster, virus del aborto equino, herpes virus equinos 2 y 3, virus de la seudorrabia, virus de la queratoconjuntivitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa, virus de la rinotraqueitis felina, virus de la larinj otraqueitis infecciosa), los beta-herpesvirus (citomegalovirus humano y citomegalovirus de cerdos y monos) ; los gama-herpesvirus (virus de Epstein-Barr (EBV) , virus de la enfermedad de Marek, Herpes saimirí, Herpesvirus áteles, Herpesvirus silvilagus, virus del herpes del cobayo, virus del tumor de Lucke) ; la familia Adenoviridae, incluyendo el genero Mastadenovirus (subgrupos humanos A, B, C, D, E, y no agrupados; adenovirus de simio (al menos 23 serotipos) , hepatitis canina infecciosa, y adenovirus del ganado bovino, cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el genero Aviadenovirus (Adenovirus aviarios) ; y adenovirus no cultivables; la familia Papoviridae, incluyendo el genero Papilomavirus (virus del papiloma humano, virus del papilomas bovino, virus del papiloma de conejo de Shope, y varios virus del papiloma patógenos de otras especies) , el genero Polyomavírus (poliomavirus, agente vacuolante simio (SV-40) , agente vacuolante de conejo (RKV) , virus K, virus BK, virus JC, y otros virus de polioma de primates como el virus del papiloma linfotrofico) , la familia Parvoviridae incluyendo el genero de virus adenoasociados, el genero Parvovirus (virus de la panleucofenia felina, parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de la enfermedad del bison Aleutiano, etc) . Finalmente, los ADN virus pueden incluir virus los cuales no se ajusten a las familias anteriores, como los virus de la enfermedad de Kuru y Creutzfeldt-Jacob y agentes neuropaticos infecciosos crónicos (virus de CHINA) . 50 Los ácidos nucleicos pueden ser administrados a un sujeto con un agente antimicrobiano. Un agente antimicrobiano, como se usa aquí, se refiere a un compuesto natural, sintético o semisintético el cual es capaz de matar o inhibir microorganismos infecciosos. El tipo de agente antimicrobiano útil de acuerdo a la invención dependerá del tipo de microorganismo con el cual este infectado el sujeto o este en riesgo de ser infectado. Los agentes antimicrobianos incluyen pero se limitan a agentes antibacterianos, agentes antivírales, agentes antifungales y agentes antiparasíticos. Frases como "agente antiinfeccioso", "agente antibacteriano", "agente antiviral", "agente antifungal" , "agente antiparasítico", y "parasiticida" tienen los significados bien establecidos por aquellos expertos en la técnica y son definidos en textos médicos estándar. Brevemente, los agentes antibacterianos matan o inhiben bacterias, e incluyen antibióticos así como otros compuestos sintéticos o naturales que tienen funciones similares . Los antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que son producidas como metabolitos secundarios por células, como microorganismos. En general, los antibióticos interfieren con una o más de las funciones o estructuras bacterianas que son específicas para el microorganismo y que no está presentes en células hospederas . Los agentes antivirales pueden ser aislados de fuentes naturales o ser sintetizados o son útiles para matar o inhibir virus. Los agentes antifungales son usados para tratar infecciones fúngales superficiales asi como infecciones fúngales oportunistas y sistémicas primarias. Los agentes antiparásitos matan o inhiben parásitos. Los agentes antibacterianos matan o inhiben el crecimiento o función de bacterias. Una clase grande de agentes antibacterianos son los antibióticos. Los antibióticos, los cuales son efectivos para matar o inhibir una amplia gama de bacterias, son referidos como antibióticos de amplio espectro. Otros tipos de antibióticos son predominantemente efectivos contra las bacterias de la clase gram positivas o gram negativas. Esos tipos de antibióticos son referidos como antibióticos de espectro estrecho. Otros antibióticos que son efectivos contra un solo organismo o enfermedad y no contra otros tipos de bacterias, son referidos como antibióticos de espectro limitado. Los agentes antibacterianos son algunas veces clasificados sobre la base de su modo de acción primario. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de la pared celular, inhibidores de la membrana celular, inhibidores de la síntesis de proteína, inhibidores de la síntesis de ácido nucleico o funcionales, e inhibidores competitivos. Los agentes antivirales son compuestos que previenen la infección de células por virus o la reproducción de virus dentro de la célula. Existen muchos menos fármacos antivirales que fármacos antibacterianos debido a que el proceso de reproducción viral está estrechamente relacionado a la reproducción del ADN dentro de la célula hospedera, y a que los agentes antivirales no específicos con frecuencia serían tóxicos al hospedero. Existen varias etapas dentro del proceso de la infección viral que pueden ser bloqueadas o inhibidas por agentes antivirales. Esas etapas incluyen, unión del virus a la célula hospedera (inmunoglobulina o péptidos de unión) , descubrimiento del virus (por ejemplo, amantadina) , síntesis o traducción de ARNm viral (por ejemplo, inteferón) , reproducción del ARN o ADN viral (por ejemplo, análogos nucleosídicos ) , maduración de nuevas proteínas virales (por ejemplo, inhibidores de proteasa) , y brote y liberación del virus. i Los análogos nucleotídicos son compuestos sintéticos los cuales son similares a los nucleótidos, pero que tienen un grupo desoxirribosa o ribosa incompleto o anormal. Una vez que los análogos nucleotídicos están en la célula, ellos son fosforilados , produciendo el trifosfato formado, el cual compite con nucleótidos normales por la incorporación en el ADN o ARN viral. Una vez que esa forma de trifosfato del análogo nucleotídico es incorporada en la cadena de ácido nucleico en crecimiento, esta produce una asociación irreversible con la polimerasa viral y de este modo la terminación de la cadena. Los análogos nucleotídicos 53 incluyen, pero no se limitan a, aciclovir, (usado para el tratamiento del virus del herpes simple y virus zoster varicosa) , ganciclovir (útil para el tratamiento de citomegalovirus) , idoxuridina, ribavirina (útil para el tratamiento sincitial respiratorio) , didesoxiinosina, didesoxicitidina, y zidovudina (azidotimidina) . Los agentes antifungales son útiles para el tratamiento y prevención de hongos infecciosos. Los agentes antifungales son algunas veces clasificados por su mecanismo de acción. Algunos agentes antifungales funcionan como inhibidores de la pared celular inhibiendo las glucosas sintasa. Esos inclu2en, pero no se limitan a, basiungina/ECB . Otros agentes antifungales funcionan desestabilizando la integridad de la membrana. Esos incluyen, pero no se limitan a imidazoles, como el clotrimazol, sertaconazol, fluconazol, itraconazol, cetoconazol, micronazol, y voriconacol, asi como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 391, pradimicina, UK 292, butenafina, y terbinafina. Otros agentes antifungales funcionan rompiendo la quitina (por ejemplo, quitinasa) o inmunosupresión (crema 501) . Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser usados, solos o en combinación con una terapia anticáncer, para el tratamiento del cáncer. El método implica administrar a un sujeto que tenga o este en riesgo de desarrollar cáncer una cantidad efectiva de un ácido nucleico estimulador inmune de motivos combinados de la invención para tratar el cáncer. Un "sujeto que tiene un cáncer" es un sujeto que tiene células cancerosas detectables . El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen pero no se limitan a cáncer del tracto biliar; cáncer de cerebro; cáncer de mama; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer endometrial; cáncer esofágico; cáncer gástrico; neplasmas intraepiteliales ; linfornas; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo, células pequeñas y células no pequeñas) ; melanoma; neuroblastomas ; cáncer oral; cáncer de ovario; cáncer de páncreas, cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer tiroideo; y cáncer renal; así como otros carcinomas y sarcomas. En una modalidad, el cáncer es leucemia de células pilosas, leucemia mielógena crónica, leucemia de células T cutánea, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata; carcinoma de células de vejiga, o carcinoma de colon. El cáncer es una de las causas principales de muerte en animales de compañía (es decir, gatos y perros) . Los trastornos malignos comúnmente diagnosticados en perros y gatos incluyen pero no se limitan a linfosarcoma, ostiosarcoma, tumores mamarios, mastocitoma, tumor de cerebro, melanoma, carcinoma adenoescamoso, tumor pulmonar carcinoide, tumor glandular bronquial; adenocarcinoma bronquiolar, fibroma, mixocondroma, sarcoma pulmonar, neurosarcoma, osteoma, papiloma, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, tumor de Wilms, linfoma de Burkitt, microglioma, neuroblastoma, osteoclastoma, neoplasia oral, fibrosarcoma, osteosarcoma y rabdomiosarcoma . Otros neoplasmas en perros incluyen carcinomas de células escamosas genitales, tumores venéreos transmisibles, tumor testicular, seminoma, tumor de células de Sertoli, hemangioperícitoma, histiocitoma, cloroma (sarcoma granulocitico) , papiloma corneal, carcinoma de células escamosas corneal, hemangiosarcoma, mesotelioma pleural, tumor de células básales, tinoma, tumor de estómago, carcinoma de la glándula adrenál, papilomatosis oral, hemangioendotelioma y cistadenoma. Las enfermedades malignas adicionales diagnosticadas en gatos incluyen linfoma folicular, linfosarcoma intestinal, fibrosarcoma y carcinoma de células escamosas pulmonar. Se sabe que el uron, una mascota doméstica cada vez más popular, desarrolla insulinoma, linfoma, sarcoma, neuroma, tumor de células de los islotes pancreáticos, linfoma de MALT gástrico y adenocarcinoma gástrico. Los ácidos nucleicos inmuoestimuladores también pueden ser administrados en conjunto con una terapia anticáncer. Las terapias anticáncer incluyen medicamentos para el cáncer, radiación y procedimientos quirúrgicos. Como se usa aquí, un "medicamento para el cáncer" se refiere a un agente el cual es administrado a un sujeto para el propósito de tratar un cáncer. Varios tipos de medicamentos para el tratamiento de cáncer son descritos aquí. Para el propósito de esta especificación, los medicamentos para el cáncer son clasificados como agentes quimioterapéuticos , agentes inmunoterapéuticos , vacunas contra el cáncer, terapia de hormonas, modificadores de la respuesta biológica. El uso de ácidos nucleicos inmunoestimuladores en conjunto con agentes inmunoterapéuticos como anticuerpos monoclonales puede incrementar la sobrevivencia a largo plazo a través de un número de mecanismos incluyendo un aumento significativo de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , activación de células NK y un incremento en los niveles de IFN-oc. La ADCC también puede ser efectuada usando un ácido nucleico inmunoestimulador en combinación con un anticuerpo especifico para un objetivo celular, como una célula de cáncer. Cuando el ácido nucleico inmunoestimulador es administrado a un sujeto en conjunto con el anticuerpo, el sistema inmune del sujeto es inducido a matar las células tumorales. Los anticuerpos útiles en el procedimiento ADCC incluyen anticuerpos los cuales interactúan con una célula en el cuerpo. Muchos de esos anticuerpos específicos para objetivos celulares han sido descritos en la técnica y muchos se encuentran comercialmente disponibles . Los ácidos 57 nucleicos cuando son usados en conjunto con anticuerpos monoclonales sirven para reducir la dosis de anticuerpos requerida para lograr un resultado biológico. Otros tipos de agentes quimioterapéuticos pueden ser usados de acuerdo a la invención incluyen a la A inoglutetimida, Asparaginasa, Busulfan, Carboplatina, Clorombucil, Citarabina HC1, Dactinomicina, Daunorrubicina HC1, Fosfato sódico de estramustina, Etoposito (VP16-213) , Floxuridina, Fluorouracilo (5-FU) , Flutamida, Hidroxiurea (hidroxicarbamida) , Ifosfamida, Interferón Alfa-2A, Alfa-2b, acetato de Leuprolida (análogo del factor de liberacoon de LHRH) , Lomustina (CCNU) , Mecloretamina HC1 (mostaza nitrogenada), Mercaptopurina, Mesna, Mitotan (o . p' -DDD) , Mitoxantron HC1, Octreotida, Plicamicina, Procarbacina HC1, Estreptozocina, citrato de Tomoxifen, Tioguanina, Tiotepa, sulfato de Vinblastina, Amsacrina (m-AMSA) , Azacitidina, Eritropoietina, Hexametilmelamina (HMM) , Interleucina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanilhidrazona; MGBG) , Pentostatina ( 2 ' desoxiconformicina ) , Semustina (metil-CCNU), Teniposido (VM-26) y sulfato de Vindesina. Las vacunas contra el cáncer son medicamentos los cuales se pretende estimulen una respuesta inmune endógena contra células cancerosas. Las vacunas producidas actualmente activan predominantemente al sistema inmune humoral (es decir, la respuesta inmune dependiente de anticuerpos) . Otras 58 vacunas actualmente en desarrollo se enfocan sobre la activación del sistema inmune mediado por células incluyendo linfocitos T citotóxicos los cuales son capaces de matar células tumorales. Las vacunas contra el cáncer generalmente mejoran la presentación de antigenos de cáncer para células presentadoras de antigenos (por ejemplo, macrófagos y células dendriticas) y/o a otras células inmunes como células T, células B y células NK. En algunos casos, las vacunas contra el cáncer pueden ser usadas junto con adyuvantes, como aquellos descritos anteriormente. Algunas células cancerosas son antigénicas y de este modo pueden ser objetivo del sistema inmune. En un aspecto, la administración combinada de ácidos nucleicos inmunoestimuladores y medicamentos contra el cáncer, particularmente aquellos que son clasificados como inmunoterapias contra el cáncer, es útil para estimular una respuesta inmune especifica contra un antigeno de cáncer. Como se usan aqui, los términos "antigeno de cáncer" y "antigeno tumoral" son usados de manera intercambiable para referirse a antigenos los cuales son expresados de manera diferencial por células cancerosas y que por lo tanto puedan ser explotados para células cancerosas objetivo o blanco. Los antigenos del cáncer son antigenos los cuales estimulan potencialmente respuestas inmunes especificas de un tumor aparentemente. Algunos de esos antigenos son codificados, aunque no necesariamente expresados, por células normales. Esos antigenos pueden ser caracterizados como aquellos que normalmente son silenciosos (es decir, no expresado) en células normales, aquellos que son expresados únicamente en ciertas etapas de la diferenciación y aquellos que son expresados temporalmente como antigenos embriónicos y fetales. Otros antigenos del cáncer son codificados por genes celulares mutantes, como oncogenes (por ejemplo, el oncogen ras activado) , genes supresores (por ejemplo, mutante p53) , proteínas de fusión resultante de supresiones internas o translocaciones cromosomales . Otros antigenos del cáncer más pueden ser codificados por genes virales como aquellos portados en ARN o ADN virus tumorales. Los antígenos "asociados con tumores" están presentes en células tumorales y células normales pero presentes en una cantidad diferente o en una forma diferente en las células tumorales. Los ejemplos de esos antígenos son antígenos oncofetales (por ejemplo antígeno carcinoembriónico) , antxgeno de diferenciación (por ejemplo, antígenos T y Tn) , y productos de oncogenes (por ejemplo, HER/neu) . Los antígenos del cáncer, como aquellos presentes en vacunas contra el cáncer o aquellos usados para preparar inmunoterapias contra el cáncer, pueden ser preparados a partir de extractos de células cancerosas crudas, como se describe en Cohén PA et al (1994) Cáncer Res 54:1055-8, o 60 purificando parcialmente los antigenos, usando la tecnología recombinante, o la síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos del cáncer pueden ser usados en forma de porciones inmunogénicas de un antígeno particular o en algunos casos puede ser usada una célula completa o una masa tumoral como antígeno. Esos antígenos pueden ser aislados o preparados de manera recombinante o por cualesquier otros medios conocidos en la técnica. Otras vacunas toman la forma de células dendríticas las cuales han sido expuestas a antígenos cancerosos in vitro, ha procesado los antígenos y son capaces de expresar los antígenos cancerosos en sus superficies celulares en el contexto de moléculas MHC par la presentación efectiva del antígeno a otras células del sistema inmune. Las células dendríticas forman en enlace entre el sistema inmune innato y adquirido presentando antígenos y a través de su expresión de receptores de reconocimiento de patrón que detectan moléculas microbianas como LPS en su ambiente local. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de motivos combinados son útiles para el tratamiento de alergias, incluyendo el asma. Los ácidos nucleicos estimuladores inmunes de motivos combinados pueden ser usados, solos o en combinación con un medicamento contra alergias/asma para tratar alergias. El método implica administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una condición 61 alérgica o asmática una cantidad efectiva de una combinación de ácido nucleico estimulador inmune de motivos combinados de la invención para tratar la condición alérgica o asmática. Como se usa aquí, alergia" se referirá a la hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alérgeno) . Las condiciones alérgicas incluyen al eczema, rinitis alérgica o coriza, fiebre de heno, asma bronquial, urticaria y alergia a alimentos, y otras condiciones atópicas. Un v sujeto que tiene una alergia" es un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una reacción alérgica en respuesta a un alérgeno. "Alérgeno" se refiere a una sustancia que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto susceptible. La lista de alérgenos es enorme y puede incluir pólenes, venenos de insecto, caspa de animales, polvo, espora fúngales y fármacos (por ejemplo penicilina). Los ejemplos de alérgenos de animales y plantas naturales incluye proteínas específicas para los siguientes géneros: Canine (Canis familiaris) ; Dermatophagoides (por ejemplo, Dematophagoid.es farinae) ; Felis (Felis domesticus) ; Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia ; Lolium (por ejemplo, Lolium perenne o Lolium multiflorum) ; Cryptomeria (Cryptomeria japónica) ; Alternaría (Alternaría alternata) ; Alder; Alnus (Alnus ' gultinosa) ; Betula (Betula verrucosa) ; Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa) ; Artemisia (Artemisia vulgaris) ; Plantago (por ejemplo Plantago lanceolata) ; 62 Parietaria (por ejemplo Parietaria officinalis o Parietaria judaica) ; Blatella (por ejemplo, Blatella germánica) ; Apis (por ejemplo, Apis multiformis) ; Cupressus (por ejemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa) ; Juniperus (por ejemplo, Juniperus sabinoides , Juniperus virginiana , Juniperus communis y Juniperus ashei) ; Periplaneta (por ejemplo, Periplaneta americana) ; Agropyron (por ejemplo Agropiron repens) ; Sécale (por ejemplo, Sécale cereale) ; Triticum (por ejemplo, Triticum astivu ) ; Dactylis (por ejemplo, Dactylis glomerata) ; Festuca (por ejemplo, Festuca elatior) ; Poa (por ejemplo, Poa pratensis o Poa compressa) ; Avena (por ejemplo, Avena sativa) ; Holcus (por ejemplo, Holcus lanatus) ; Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxanthum odoratum) ; Arrhenatherum (por ejemplo, Arrhenatherum elatius) ; Agrostis (por ejemplo, Agrostis alba); Phleum (por ejemplo Phleum pratense) ; Phalaris (por ejemplo, Phalaris arundinacea) ; Paspalum (por ejemplo, 'Paspalum notatum) ; Sorghum (por ejemplo, Sroghum halepensis) ; y Bromus (por ejemplo, Bromus inermis) . Como se usa aquí, "asma" se referirá a un tras-torno del sistema respiratorio caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías aéreas e incremento de la reactividad de las vías aéreas a agentes inhalados. El asma con frecuencia, aunque no exclusivamente, se asocia con 63 síntomas atópicos o alérgicos. Un "medicamento para el asma/alergia" como se usa aquí es una composición de materia que reduce los síntomas, inhibe la reacción asmática o alérgica, o evita el desarrollo de una reacción alérgica o asmática. Varios tipos de medicamentos para el tratamiento del asma y alergia son descritos en la Guía para el Diagnóstico y Manejo del Asma, Reporte 2 del Panel de Expertos, Publicación NIH No. 97/4051, Julio 19, 1997 todo el contenido de la cual se incorpora aquí como referencia. El sumario de los medicamentos como se describe en la publicación NIH se presenta más adelante. En la mayoría de las modalidades los medicamentos para el asma/alergia son útiles en algún grado para tratar el asma y la alergia. Algunos medicamentos para el asma/alergia son usados preferiblemente en combinación con el ácido nucleico inmunoestimulador para tratar el asma. Esos son referidos como medicamentos para el asma. Los medicamentos para el asma incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de PDE-4, broncodilatadores/agonistas beta-2, abridores del canal de K+, antagonistas de VLA-4, antagonistas de neurocina, inhibidores de la síntesis TXA2, xantanina, antagonistas de ácido araquidónico, inhibidores de la 5-lipoxigenasa, antagonistas del receptor A2 de tromboxina, antagonistas A2 de tromboxano, inhibidor de las proteínas de activación de 5-lipoxigenasa, e inhibidores de proteasa. 64 Otros medicamentos para el asma/alergia son usados preferiblemente en combinación con los ácidos nucleicos inmunoestimuladores para tratar la alergia. Esos son referidos como medicamentos para la alergia. Los medicamentos para la alergia incluyen, pero no se limitan, a antihistaminas , esteroides, inmunomoduladores e inductores de prostaglandina . Las antihistaminas son compuestos que contrarrestan la histamina liberada por los mastócitos o basófilos. Esos compuestos son bien conocidos en la técnica y usados 'comúnmente para el tratamiento de la alergia. Las antihistaminas incluyen, perno no se limitan a, loratidina, cetirizina, buclizina, análogos de ceterizina, fexofenadina, terfenadina, desloratadina, norastemizol, epinastina, ebastina, ebastina, astemizol, levocabastina, azelastina, tranilast, terfenadina, mizolastina, betatastina, CS 560, y HSR 609. Los inductores de prostaglandina son compuestos los cuales inducen la actividad de prostaglandina. Las prostaglandinas funcionan regulando la relajación del músculo liso. Los inductores de prostaglandina incluyen, pero no se limitan a, S-5751. Los esteroides incluyen pero no se limitan a, beclometasona, fluticasona, tramcinolona, budesonida, corticosteroides y budesonida. La combinación de ácidos nucleicos inmunoestimuladores y esteroides es particularmente muy adecuada para el tratamiento de sujetos jóvenes (por 65 ejemplo niños) . A la fecha, el uso de esferoides en niños ha sido limitado por la observación de que algunos tratamientos con esferoides han sido asociados con el retardo del crecimiento. De este modo, de acuerdo a la presente invención, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser usados en combinación con esferoides retardantes del crecimiento, y por lo tanto pueden proporcionar un "efecto adicional esteroideo" . La combinación de los dos agentes puede dar como resultado que se requieran dosis más bajas de esferoides . Los inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, el grupo que consiste de agentes antiinflamatorios, antagonistas de leucotrieno, muteinas de IL-4, receptores de 11-4 solubles, inmunosupresores (como la vacuna peptidica tolerizante) , anticuerpos anti-IL-4, antagonistas de IL-4, anticuerpos anti-IL-5, proteínas de fusión de receptor de IL-13-FC solubles, anticuerpos anti-IL-9, antagonistas de CCR3, antagonistas de CCR5, inhibidores de VLA-4, y desreguladores de IgE. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de la invención pueden ser usados para inducir el IFN del tipo 1, es decir, IFN- e IFN-ß. El método implica poner en contacto una célula capaz de expresar un IFN del tipo 1 con una cantidad efectiva de un ácido nucleico estimulador inmune de motivos combinados de la invención para inducir la expresión 66 del IFN tipo 1 por la célula. Recientemente se ha apreciado el tipo de célula productora principal de IFN-a en humanos es la célula dendritica plasmacitoide (pDC) . Este tipo de célula ocurre a muy baja frecuencia (0.2-0.4 por ciento) en PBMC y se caracteriza por un fenotipo que es de linaje negativo (es decir, que no se tiñe para CD3 , CD14, CD19, o CD56) y CDllc negativa, aunque positiva para CD4, CD123, (IL-3Ra) , y complejo de histocompatibilidad mayor de la clase II (MHC clase II). Grouard G et al. (1997) J Exp Med 185:1101-11; Rissoan M-C et al. (1999) Science 283:1183-6; Siegal FP et al. (1999) Science 284:1835-7; Celia M et al. (1999) Nat Med 5:919-23. Los métodos para medir el IFN del tipo 1 son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, ellos incluyen, por ejemplo, ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) , bioensayo, y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Los ensayos de este tipo pueden ser efectuados usando reactivos y equipos fácilmente disponibles comercialmente . Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores de la invención pueden ser usados para activar células NK. El método implica poner en contacto una célula NK con una cantidad efectiva de un ácido nucleico estimulador inmune de motivos combinados de la invención para activar la célula NK. 67 La activación a las células NK puede ser la activación directa o activación indirecta. La activación indirecta se refiere a la inducción de citocinas u otros factores que producen una activación posterior de las células NK. La activación de la célula NK puede ser evaluada por varios métodos, incluyendo la medición de la actividad litica, medición de la inducción de marcadores de activación como DC 69, y medición de inducción de ciertas citocinas. Además de su capacidad característica para matar ciertos objetivos tumorales espontáneamente, las células NK participan en ADCC y son productoras mayores de IFN-?, TNF-a, GM-CSF e IL-3. El objetivo de la célula sensible fototípicamente NK para células NK de ratón es un cromosoma artificial de levadura (YAC)-l, un timoma derivado de una cepa de ratón infectada con el virus de Moloney A. Para células NK humanas, un objetivo estándar es K562, una línea celular derivada de un linaje eritroleucémico . En placas microtituladoras, se inocula un número constante de objetivos marcados radioactivamente (por ejemplo, K562 marcado con 51Cr) solos (espontáneos) , con detergente (máxima) , o con varios números de células efectoras (experimental) . La relación de efectoras a células objetivos es referida como relación E:T. Las células NK activadas, enriquecidas, típicamente son efectivas a relaciones de E:T de menos de 10:1, mientras que las PBMC o esplenocitos no fraccionados requieren relaciones de E:T de 68 100:1 o más . Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores también son útiles como adyuvantes para inducir una respuesta inmune sistémica y/o mucosa. Los ácidos nucleicos estimuladores inmunes de motivos combinados de la invención pueden ser proporcionados a un sujeto expuesto a un antigeno para producir una respuesta inmune mejorada al antigeno. De este modo por ejemplo, los ácidos nucleicos estimuladores inmunes de motivos combinados son útiles como adyuvantes de vacuna. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser administrados en combinación con adyuvantes de ácido no nucleico. Un adyuvante de ácido no nucleico es cualquier molécula o compuesto excepto los ácidos nucleicos inmunoestimuladores descritos aquí, los cuales pueden estimular la respuesta inmune humoral y/o celular. Los adyuvantes de ácido no nucleico incluyen, por ejemplo, adyuvantes que crean un efecto de depósito, adyuvantes inmunoestimulantes , y adyuvantes que crean un efecto de depósito y estimular al sistema inmune. Un adyuvante mucoso de ácido no nucleico como se usa aquí es un adyuvante diferente a un ácido nucleico inmunoestimulador que es capaz de inducir una respuesta inmune mucosa en un sujeto cuando se administra a una superficie mucosa en conjunto con un antígeno . Los ¦ ácidos nucleicos inmunoestimuladores de la invención pueden ser formulados como composiciones farmacéuticas en un portador farmacéuticamente aceptable. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden ser administrados directamente al sujeto o pueden ser administrados en conjunto con un complejo de liberación de ácido nucleico. Un complejo de liberación de ácido nucleico significará una molécula de ácido nucleico asociada con (por ejemplo, unida iónica o covalentemente a; o encapsulada dentro) medios objetivo (por ejemplo, una molécula que da como resultado una unión de mayor afinidad a la célula objetivo (por ejemplo, superficies de célula B) y/o incremento de absorción celular por células objetivo) . Los ejemplos de complejos de liberación de ácido nucleico incluyen ácidos nucleicos asociados con un esterol (por ejemplo, colesterol) , un lipido (por ejemplo un lipido catiónico, virosoma o liposoma) , o un agente de unión especifico de célula objetivo (por ejemplo, un ligando reconocido por el receptor especifico de la célula objetivo) . Los complejos preferidos pueden ser suficiente estables in vivo para evitar un desacoplamiento significativo antes de la internalización por la célula objetivo. Sin embargo, el complejo puede ser escindible bajo condiciones apropiadas dentro de la célula, de modo que el ácido nucleico sea liberado en una forma funcional. El ácido nucleico inmunoestimulador y/o el antigeno y/u otros agentes terapéuticos pueden ser administrados solos 70 (por ejemplo solos en solución salina o amortiguador) o usando cualesquier vehículos de liberación conocidos en la técnica. Por ejemplo los siguientes vehículos de liberación han sido descritos: Cochleatos (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOM (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et . , 1998, Morein et al., 1999); Liposomas (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); Microesferas (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); Polímeros (por ejemplo, carboximetilcelulosa, quitosán) (Hamajima et al.,- 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); anillos poliméricos (Wyatt et al., 1998); Proteosomas (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); Virosomas (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); partículas similares a virus (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Otros vehículos de liberación son conocidos en la técnica. Las dosis objetivo de los compuestos descritos aquí para la liberación mucosa o local típicamente fluctúan de aproximadamente 0.1 µg a 10 mg por administración, lo cual depende de la aplicación que pudiera darse diariamente, semanalmente, o mensualmente y cualquier otra cantidad de tiempo entre ellos. De manera más típica las dosis mucosas y locales fluctúan de aproximadamente 10 µg a 5 mg por 71 administración, y de manera más típica de aproximadamente 100 µg a 1 mg, con 2-4 administraciones siendo separadas por días o semanas. De manera más típica, las dosis inmunoestimulantes fluctúan de 1 µ a 10 mg por administración, y de manera más típica de 10 µg a 1 mg, con administraciones diarias o semanales. Las dosis objetivo de los compuestos descritos aquí para la liberación parenteral para el propósito de inducir una respuesta inmune específica de antígeno, donde los compuestos son proporcionados por un antígeno pero no otro agente terapéutico son típicamente de 5 as 10,000 veces mayores que la dosis mucosa efectiva para el adyuvante de vacuna o aplicaciones inmunoestimulantes, y de manera más típica de 10 a 1, 000 veces mayor, y de manera más típica de 20 a 100 veces mayores. Las dosis de los compuestos descritos aquí para la liberación parenteral para el propósito de inducir una respuesta inmune innata o para incrementar la ADCC o inducir una respuesta inmune específica de antígeno cuando son administrados ácidos nucleicos inmunoestimuladores en combinación con otros agentes terapéuticos o en vehículos de liberación especializados típicamente fluctúan de 0.1 µg a 10 mg por administración, la cual dependiendo de la administración podría ser dada diariamente, semanalmente, o mensualmente o cualquier otra cantidad de tiempo entre ellas. De manera más típica las dosis parenterales para esos 72 propósitos fluctúan de aproximadamente 10 µg a 5 mg por administración, y de manera más típicamente de aproximadamente 10C µg a 1 mg, con 2-4 administraciones siendo separadas por días o semanas. En algunas modalidades, sin embargo, las dosis parenterales para esos propósitos pueden ser usadas en un intervalo de 5 a 10,000 veces mayores que las dosis típicas descritas anteriormente. Como se usa aquí, "cantidad efectiva" se referirá a la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador para tratar una infección es aquella cantidad necesaria para tratar la infección. Combinada con las enseñanzas proporcionadas aquí, la elección entre los diferentes compuestos activos y factores ponderantes como la potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, severidad de los efectos laterales adversos y modo preferido de aoministración, puede ser planeado un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico efectúo cuya dosis no cause una toxicidad sustancial y sea aún totalmente efectivo para tratar al sujeto particular. La cantidad efectiva para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores como la enfermedad o condición que esté siendo tratada, el ácido nucleico inmunoestimulador particular que esté siendo edministrado, el antígeno, la talla del sujeto, o la 73 severidad de la enfermedad o condición. Un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador particular y/o antigeno y/o u otro agente terapéutico sin necesitar experimentación indebida. Para cualesquier compuestos descritos aquí la cantidad terapéuticamente efectiva puede ser determinada inicialmente a partir de modelos animales. Una dosis terapéuticamente efectiva también puede ser determinada de datos de humanos para oligonucleótidos CpG que han sido probados en humanos (ya han sido iniciados ensayos clínicos con humanos) y para compuestos que se sepa exhiben actividades farmacológicas similares como otros adyuvantes mucosos, por ejemplo, LT y otros antígenos para propósitos de vacunación, para la administración mucosa o local. Se requieren dosis altas para la administración parenteral . La dosis aplicada puede ser ajustada sobre la base de la biodisponibilidad y potencia relativa del compuesto administrado. El ajuste de la dosis para lograr una eficacia máxima basada en los métodos descritos anteriormente y otros métodos es bien conocida en la técnica y también está dentro de las capacidades de un experto en la técnica. Las formulaciones de la invención son administradas en soluciones farmacéuticamente aceptables, las cuales pueden contener de manera rutinaria concentraciones 74 farmacéuticamente aceptables de sal, agentes amortiguadores, preservativos, portadores o excipientes compatibles, adyuvantes, opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Para usarse en terapia, una cantidad efectiva del ácido nucleico inmunoestimulador puede ser administrada a un sujeto por cualquier modo que proporcione el ácido nucleico a la superficie deseada, por ejemplo, mucosa, sistémica. La administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede ser efectuada por cualesquier medios conocidos por los expertos. Las rutas de administración preferidas incluyen, pero no se limitan a la oral, parenteral, intramuscular, intranasal, intratraqueal, inhalación, ocular, sublingual, vaginal y rectal. Para la administración oral, los compuestos (es decir, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores , antigenos y otros agentes terapéuticos) pueden ser formulados fácilmente combinando los compuestos activos con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Esos portadores excipientes permiten que los compuestos de la invención sean formulados como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para ingestión oral por el sujeto a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral- pueden ser obtenidas como excipiente sólido, triturando opcionalmente una mezcla resultante, y procesando 75 la mezcla , de gránulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular cargas como azúcares, incluyendo la lactosa, sucrosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea, pueden ser agregados agentes desintegrantes, como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácidos algínico o una sal del mismo como el alginato de sodio. Opcionalmente, las formulaciones orales también pueden ser formuladas en solución salina o amortiguadores para neutralizar las condiciones ácidas internas o pueden ser administradas sin ningún portador o excipientes . Los núcleos para grageas son provistos con recubrimientos adecuados. Para este propósito, pueden ser usadas soluciones de azúcar concentradas, las cuales pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilen glicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes o mezclas de solventes orgánicos adecuados. Pueden ser agregados colorantes o pigmentos a las tabletas o recubrimientos para gragea para la identificación para caracterizar diferentes 76 combinaciones de dosis de compuestos activos. Las preparaciones farmacéuticas que pueden ser usadas oralmente incluyen cápsulas ajustables por presión hechas de gelatina, asi como cápsulas blandas, selladas, hechas de gelatina y un plastificante , como el glicerol o sorbitol. Las cápsulas ajustables por presión que suelen contener los ingredientes activos en mezcla con cargas como la lactosa, aglutinantes como almidones, y/o lubricantes como el talco y estearato de magnesio, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden ser disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida, o polietilen glicoles líquidos. Además, pueden ser agregados estabilizadores. También pueden ser usadas microesferas formuladas para administración oral. Esas microesferas han sido bien definidas en la técnica. Todas las formulaciones para administración oral estarán en dosis adecuadas para esa administración . Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera conveniente . Para la administración por inhalación, los compuestos para usarse de acuerdo a la presente invención pueden ser proporcionados convenientemente en forma de una presentación de rocío de aerosol de paquetes presurizados o 77 un nebulizador, con el uso de un propeiente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando una válvula para liberar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo gelatina para usarse en un inhalador o insuflador que contenga una mezcla de polvo del compuesto y una base pulvorizada adecuada como la lactosa o almidón . los compuestos, donde es deseable proporcionarlos sistémicamente, pueden ser formulados para administración parenteral para inyección, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes multidosis, con un preservativo agregado. Las composiciones pueden tomar formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Las formulaciones farmacéuticas para la administración - parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, pueden ser preparadas suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas para inyección apropiadas. Los 78 solventes de vehículo lipofilicos adecuados incluyen aceites grasos como el aceite de ajonjolí, o ásteres de ácido grasos sintético, como el oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, como la carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextran. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que incrementen la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. o De manera alternativa, los compuestos activos pueden estar en forma de polvo para reconstituirse con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos, antes de su uso. Los compuestos también pueden ser formulados con composiciones rectales o vaginales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contengan las bases para supositorios convencionales como manteca de cacao y otros glicéridos . Además las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también pueden ser formulados como una preparación de depósito. Esas formulaciones de acción prolongada pueden ser formuladas con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite adecuado) o resinas de intercambio iónico, o como 79 derivados poco solubles, por ejemplo, una sal poco soluble. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender portadores o excipientes en fase sólida o gel adecuados. Los ejemplos de esos portadores o excipientes incluyen pero no se limitan al carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros como los polietilen glicoles. Las formas de preparaciones farmacéuticas líquida o sólida adecuadas, por ejemplo, soluciones acuosas o salinas para inhalación, microencapsuladas, encocleadas, recubiertas sobre partículas de oro microscópicas, contenidas en liposomas, nebulizadas, aerosoles, pastillas para implantación en la piel, o secadas sobre un objeto puntiagudo a ser tallado sobre la piel. Las composiciones farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, tabletas, tabletas recubiertas, "microcápsulas" , supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación son usados comúnmente excipientes y aditivos y/o auxiliares, desintegrantes, aglutinantes, agentes de recubrimientos, agentes para alimentar el volumen, lubricantes, saborizantes , edulcorantes o solubilizantes como se describió anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para usarse en una variedad de sistemas de liberación de fármacos. Para una breve revisión de los 80 métodos para la liberación de fármacos, véase Langer (1990) Science 249:1527-33, la cual se incorpora aquí como referencia . Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores y opcionalmente otros agentes terapéuticos y/o antigenos pueden ser administrados per se (puros) o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando son usadas en medicina las sales deberán ser farmacéuticamente aceptables, pero pueden ser usadas, de manera conveniente, sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Esas sales incluyen, pero no se limitan a aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluen sulfónico, tartárico, cítrico, metan sulfónico, fórmico, malónico, succíníco, naftalen-2-sulfónico y bencen sulfónico. También, esas sales pueden ser preparadas como sales de metal alcalino o alcalinotérreo, como las sales de sodio, potasio o calcio del grupo de ácidos carboxílicos . Los agentes amortiguadores adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2% peso/volumen) ; ácido cítrico y una sal (1-3% peso/volumen) ; ácido bórico y una sal (0.5-2.5% peso/volumen); y ácido fosfórico y una sal (0.8-2% peso/volumen) . Los preservativos adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0.003-0.03% peso/volumen); clorobutanol (0.3- 81 0.9% peso/volumen); parabenos (0.01-0.25% peso/volumen) y timerosal (0.004-0.02% peso/volumen). Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador y opcionalmente antigenos y/u otros agentes terapéuticos incluidos opcionalmente en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador o excipiente farmacéuticamente aceptable" significa una o más cargas, diluentes o sustancias encapsulantes sólidas o liquidas compatibles que sean adecuadas para la administración a un humano u otro animal vertebrado. El término "portador" o excipiente denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual el ingrediente activo es combinado para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas no pueden ser combinadas con los compuestos de la presente invención y entre si, de tal manera que no existe interacción. Para el tratamiento de un sujeto, dependiendo de la actividad del compuesto, la forma de administración, el propósito de inmunización, (es decir profiláctico o terapéutico) , la naturaleza y severidad del trastorno, la edad y peso corporal del paciente, pueden ser necesarias dosis diferentes. La administración de una dosis dada puede ser llevada a cabo por medio de una administración simple en forma de una unidad de dosificación individual o también 82 varias unidades de dosificación más pequeñas. La administración múltiple de dosis a intervalos específicos de semanas o meses de separación es usual para reforzar las respuestas específicas a antígenos . Otros sistemas de liberación pueden incluir sistemas de liberación temporal, liberación retardada o liberación sostenida. Esos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los compuestos, incrementando la conveniencia al sujeto y el médico. Muchos tipos de sistemas de liberación se encuentran disponibles y son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ellos incluyen sistemas basados en polímeros como poli (lactída-glicólida) , copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas , poliortoesteres, ácido polihidroxibutírico, y polianhídricos . Las microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen fármacos son descritos en, por ejemplo, la Patente Estadounidense 5,075,109. Los sistemas de liberación también incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos, incluyendo esteróles como el colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos de grasas neutras como mono-, di- y tri-glicéridos ; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos cerosos; tabletas comprimidas usando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fundidos; y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) 83 sistemas erosiónales en los cuales un agente de la invención está contenido en una forma dentro de una matriz como aquellos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,452,775, 4,675,189 y 5,736,152 y (b) sistemas de difusión en los cuales un componente activo se filtra a una velocidad controlada desde un polímero como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 3,854,480, 5,133,974 y 5,407,686. Además, pueden ser usados sistemas de liberación con equipos basados en bombas, algunos de los cuales están adaptados para su implantación. La presente invención es ilustrada además por los siguientes ejemplos, los cuales de ninguna manera deben de constituirse en limitantes adicionales. Todo el contenido de todas las referencias (incluyendo las referencias a la literatura, patentes otorgadas, solicitudes de patente publicadas, solicitudes de patente copendientes) , citadas a través de esta solicitud son por lo tanto incorporadas expresadamente como referencia.

E emplos E emplo 1. El ODN 2395 es un activador notablemente fuerte de células NK y de la producción de IFN-cc. Anteriormente reconocimos y describimos oligodesoxinucleótidos (ODN) que contienen motivos neutralizantes que consisten de repeticiones de las 84 secuencias CG como CGCGCG o donde el CG es precedido por una C y/o seguido por una G. Se creía que esos motivos neutralizantes reducían los efectos estimuladores de ODN o lecturas múltiples, como la secreción de 11-6, IL-12, IFN-?, TNF-oc e inducción de una respuesta inmune específica de un antígeno. Krieg AM et al. (1998) Proc Nati Acad Scí EUA 95:12631-6. En muchos casos, se creía que la presencia de un motivo neutralizante en un oligonucleótido junto con un motivo estimulador prevenía la activación inmune. Uno de esos ODN que contiene motivos estimuladores y neutralizantes es el ODN 2136, el cual tiene la secuencia TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO: 19) . El extremo 3' de este ODN contiene un motivo muy típicamente neutralizante, CGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO: 37), derivado del extremo 3' del ODN 2010 inhibidor (GCGGCGGGCGGCGCGCGCCC, SEQ ID NO: 38) .

De manera sorprendente, el ODN 2136 tuvo una fuerte actividad para inducir la actividad lítica de células NK (unidades líticas, U.L.). Como se muestra en la Tabla 1, el ODN 2136 a una concentración de 3 µg/ml fue en realidad más fuerte que nuestro fosforotioato estimulador de células B y células NK estándar ODN 2006 (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT, SEQ ID NO: 39) para la inducción de U.L. De manera más extraña, aunque el ODN 2006 únicamente indujo la producción de 2,396 pg/ml de IFN- , el ODN 2136 indujo la producción de 14,278 pg/ml (Figura 1) . Esto indicó que, de manera sorprendente, que la presencia de esta secuencia neutralizante no necesariamente fue evitada. Tabla 1. PBL Humanos Cultivados Durante la Noche con Varios OD .

ODN RELACION DE ?:? U.L. 3.1 6.3 12.5 25.0 50.0 100.0 SOLO 0.86 1.47 4.15 7.25 11.66 18.57 0.13 IL-2 (100 U/ml) 12.21 29.21 46.63 67.88 78.28 76.65 33.26 1585 (3 µg/?^l) 6.47 12.61 24.65 36.82 49.30 53.00 11.69 1585 (10 g/ml) 8.52 18.17 33.20 51.26 72.13 73.89 20.94 1585 (30 µ?/p??) 5.75 13.05 20.00 34.34 45.02 56.49 10.66 2118 (10 µg/ l) 0.62 2.08 3.90 8.53 12.79 15.93 0.09 2006 (0.6 µg/ml) 1.62 2.88 8.24 14.10 21.85 31.91 1.73 2006 (3 µg/ml) 7.07 17.02 30.28 50.66 69.13 74.27 19.41 2169 (0.6 µg/ l) 3.65 3.81 6.67 13.45 24.48 32.42 1.84 2169 (3 µ9/p?1) 11.20 21.47 38.15 59.66 78.96 77.72 25.76 1760 (0.6 g ml) 0.35 2.70 6.85 8.59 16.09 20.63 0.33 1760 (3 µg/ml) 7.57 12.94 27.50 46.63 62.43 66.97 16.60 1758 (0.6 µg/ml) 2.07 6.05 12.80 23.25 34.57 44.93 5.43 1758 (3 µg/ml) 8.40 17.84 33.411 52.20 69.52 74.46 20.78 2398 (0.6 µ?/??) 1.83 1.92 6.21 11.21 20.38 26.71 0.98 2398 (3 µg/ml) 4.36 12.90 24.10 42.37 60.51 70.03 15.02 2397 (0.6 µg/ml) 2.14 3.15 8.79 17.37 28.71 42.45 3.80 2397 (3 µ?/?a?) 10.09 22.52 38.96 61.85 77.69 74.87 26.12 2396 (0.6 µ?/?a?) 2.93 5.80 13.22 25.32 36.83 46.77 6.13 86 Tabla 1. (Continuación) Secuencias ODN para la Tabla 1 1585 GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO: 35) 1758 TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO: 40) 1760 ATAATCGACGTTCAAGCAAG (SEQ ID NO: 41) 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 39) 2118 GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG (SEQ ID NO: 36) 2136 TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO: 19) 2169 TCTATCGACGTTCAAGCAAG (SEQ ID NO: 42) 2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 1) 2396 TCGTCGTTTTTGTCGTTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 43) 2397 TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTTT (SEQ ID NO: 44) 2398 TTCGTGTTTTCGTGTTTTCGTCGT (SEQ ID NO: 45) Sin embargo, en un esfuerzo por comprender esta observación, se creo un activador de NK e inductor de IFN-a aún más fuerte combinado al extremo 3' del ODN 2136 en el 87 extremo 5' del ODN 2006. El ODN 2395 resultante (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG, SEQ ID NO: 1) incorporó de manera casual un cambio de al menos una base sobre el extremo 3' de una C a una G. Este solo cambio de base tiene un efecto de crear un palíndromo de 12 bases de longitud perfecto en el extremo 3' del ODN 2395 donde en el ODN 2136 el palíndromo es de solo 10 bases de longitud. La Tabla 2 muestra otro ejemplo de datos donde el ODN2395 es notablemente potente en la inducción de Ü.L. de células NK en comparación con la mayoría de los otros ODN de estructura totalmente de fosforotioato . En este ensayo el ODN 2395 es más débil que el ODN 1585 del control positivo, el cual tiene una estructura de fosforotioato/fosfodiéster (SOS) quimérica. El ODN 1585 (ggGGTCAACGTTGAgggggG, SEQ ID NO: 35), es descrito en la Solicitud PCT publicada WO 01/22990. A la baja concentración de 0.6 µ9/p?1 probada en este experimento, el ODN 2136 no indujo un U.L. por encima del fondo de 0.03 en el control sin ODN. La Figura 2 y la Figura 3 muestran un nivel de proteína quimotáctica monocítica (MCP)-l y proteína inducible por IFN (IP)-10, respectivamente en los sobrenadantes de cultivos de células NK en la Tabla 2. La MCP-1 es una quimocina que es un ligando para CCR2 y está asociada con respuestas inmunes tipo Thl y Th2. La IP-10 es una quimocina CXC que es un ligando para CXCR3 y está asociada con respuestas Thl. Loetscher P et al. (2001) J Biol 88 Chem 276:2986-91. Esos datos muestran que el ODN 2395 es un inductor relativamente fuerte de la producción de IP-10, pero induce únicamente niveles promedio de MCP-1. Tabla 2. PBL Humanos Cultivados Durante la Noche con Varios ODN. ODN RELACION DE ?:? U.L. 3.1 6.3 12.5 25.0 50.0 100.0 SOLO 1.73 3.10 4.25 7.72 12.07 14.56 0.03 IL-2 (100 U/ml) 16.68 29.41 49.42 74.78 87.64 92.63 37.17 1585 (10 ng/ml) 9.60 17.25 35.63 55.76 77.53 87.14 22.94 2118 (10 µ9 p?1) 2.99 2.88 3.41 6.72 9.26 14.18 0.01 2183 (0.6 2.13 2.28 3.26 8.17 10.47 17.87 0.07 2186 (0.6 g/ml) 1.23 2.18 3.50 6.26 9.58 14.51 0.02 2133 (0.6 µ?/ta?) 2.13 3.45 9.69 18.85 32.72 44.67 4.63 2135 (0.6 µg/ml) ' 2.07 4.06 7.70 12.63 21.90 34.58 1.92 2139 (0.6 µg/ml) 2.94 5.15 9.63 15.15 24.90 38.71 2.83 2117 (0.6 µg/ml) 1.21 2.32 4.08 7.61 10.09 16.27 0.05 2137 (0.6 µg/:ml) 1.66 2.79 4.43 7.92 10.64 16.91 0.06 2006 (0.6 µg/ml) 1.92 3.38 5.06 11.57 16.82 25.30 0.65 2006 (0.6 µg/Inl) 0.91 2.19 4.52 7.39 13.86 21.57 0.28 2006 (0.6 µ?/? ?) 1.92 3.59 7.67 12.51 18.99 28.03 1.04 2395 (0.6 µg/ml) 2.88 7.20 10.80 23.96 37.97 54.38 7.02 2396 (0.6 µg/ml) 0.92 2.18 4.07 5.78 10.18 14.95 0.03 2397 (0.6 µg/ml) 3.05 5.24 10.51 17.50 33.51 46.50 4.92 89 Tabla 2. (Continuación) Secuencias de ODN para la Tabla 2 1585 GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO: 35) 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 39) 2007 TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 46) 2013 TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID NO: 48) 2102 TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 49) 2103 TCGTCGTTTTGACGTTTTGACGTT (SEQ ID NO: 50) 2117 TZGTZGTTTTGTZGTTTTGTZGTT (SEQ ID NO: 51) 2118 GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG (SEQ ID NO: 36) 2133 TCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTT (SEQ ID NO: 17) 2135 ACCATGGACGAGCTGTTTCCCCTC (SEQ ID NO: 18) 90 2136 TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO: 19) 2137 TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT (SEQ ID NO: 20) 2139 TCGTCGTTTCGTCGTTTTGACGTT (SEQ ID NO: 21) 2142 TCGCGTGCGTTTTGTCGTTTTGACGTT (SEQ ID NO: 22) 2180 TCGTCGTTTTTTGTCGTTTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 52) 2183 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ ID NO: 53) 2186 TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTGCC (SEQ ID NO: 54) 2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 1) 2396 TCGTCGTTTTTGTCGTTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 43) 2397 TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTTT (SEQ ID NO: 44) 2398 TTCGTGTTTTCGTGTTTTCGTCGT (SEQ ID NO: 45) Sobre la base de esos y otros datos, concluimos la secuencia del ODN 2395 fue un activador notablemente fuerte de células NK y producción de IFN-cc.

Ejemplo 2. Los ODN relacionados con el ODN 2395 también son fuertes activadores de células NK y de la producción de IFN-a. Fueron diseñados y sintetizados ODN 2427-2433 (SEQ ID NO: 2-8) adicionales para probar la posibilidad de que el palíndromo en el extremo 3' de ODN 2395 pudiera ser importante en su actividad estimuladora inmune. La Tabla 3 compara la capacidad de esos diferentes ODN para activar U.L. de NK. Como es evidente de esos datos, el ODN más fuerte a la 91 concentración de 1 pg/ml es el ODN 2429 (TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG, SEQ ID NO: 4), el cual induce una U.L de 2.85 de actividad de NK. El ODN 2006 fue muy débil en el experimento, y todos los otros oligos que fueron probados excepto por el ODN 2118 (GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG, SEQ ID NO: 36) que no tiene CG fueron más fuertes que el 2006. El ODN 2429 es notable debido a que es el único que mantiene un palíndromo de 12 bases, aunque este es un palíndromo diferente del que estuvo presente en el 2395. El ODN 2430 ( TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG, SEQ ID NO: 5) , el cual es el segundo ODN más fuerte a la concentración de 1 es similar; pero el palíndromo ha sido ligeramente acortado a 10 bases de longitud. El resto de los ODN no tienen o tienen secuencias palindrómicas más cortas, e inducen menos actividad de NK. Tabla 3. PBL Humanos Cultivados Durante la Noche con Varios ODN. ODN RELACION DE E:T U.L. 3.1 6.3 12.5 25.0 50.0 100.0 SOLO 0.37 0.64 0.25 1.02 2.15 3.23 0.00 IL-2 (100 U/ml) 3.01 4.20 9.01 18.92 27.37 38.17 3.22 1585 (10 µg/ml) 1.35 2.30 4.38 8.07 13.96 22.31 0.31 2118 (10 µg ml) -0.31 -0.21 0.22 1.57 1.24 2.41 0.00 2395 (1 \i.q/ l) 1.01 2.61 5.73 11.39 18.92 28.16 1.04 2395 (3 g/ml) 1.59 2.55 5.96 12.09 20.46 33.87 1.71 2006 (1 ng/ml) -0.08 0.73 1.45 3.03 7.11 12.49 0.01 92 Tabla 3. (Continuación) Secuencias de ODN para la Tabla 3 1585 GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO: 35) 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 39) 2118 GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG (SEQ ID NO: 36) 93 2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 1) 2427 TCGTCGTTTTCGTCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 2) 2428 TCGTCGTTTTCGTCGCGCGGCG (SEQ ID NO: 3) 2429 TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO: 4) 2430 TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEQ ID NO: 5) 2431 TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEQ ID NO: 6) 2432 TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG (SEQ ID NO: 7) 2433 TCGTCGTTTTCCGCCGCCGGGG (SEQ ID NO: 8) La Figura 4 muestra la capacidad de esos oligos para inducir la producción de IFN-oc en comparación con el control positivo ODN 2216 SOS (GGGGGACGATCGTCGGGGG, SEQ ID NO: 55), 2334 (GGGGTCGACGTCGACGTCGAGGGGGGG, SEQ ID NO: 56), y 2336 (GGGG7ACGACGTCGTGGGGGG, SEQ ID NO: 57) . Todos los ODN relacionados con el 2395 inducen un nivel mayor de producción de IFN-cc que el ODN 2006, aunque los niveles son inferiores a los niveles inducidos por el ODN SOS quimérico. El orden del rango de inducción de expresión de IFN-cc es aproximadamente similar al de la U.L de NK, con los efectos más fuertes observados por el ODN 2395 y el 2429.

Ejemplo 3. Los efectos estimuladores fuertes sobre las células NK y la producción de IFN-a no corresponden a efectos de célula B. Como se muestra en la Figura 5A, el ODN 2395 y sus 94 parientes fueron significativamente más débiles a una concentración de 0.25 ^/ta? que el ODN 2006 o su pariente 2397, en términos de su capacidad para inducir la capacidad de CD86 de célula B en 48 horas. Como hemos notado anteriormente, a concentraciones de ODN mayores como de 1 µ?/???, se observó una diferencia menos entre varios ODN (Figura 5B) . En el mismo experimento, también medimos la activación de célula B por un ensayo de proliferación (incorporación de. 3H-timidina; Figura 6) . Nuevamente, el ODN 2006 y el ODN 2397 (SEQ ID NO: 44) a la concentración de 0.25 µ9/??1 fueron por micho los más fuertes (Figura 6A) . Sin embargo, a concentraciones mayores, los ODN relacionado con el ODN 2395 fueron similares en su eficacia (Figura 6B) .

Ejemplo 4: El ODN 2395 y los ODN relacionados son inductores débiles de IL-10. Nuestros estudios anteriores han sugerido que la mayoría de la producción de IL-10 que es inducida por CpG derivada de células B. Como se muestra en la Figura 7, la expresión de IL-10 se correlacionó bien con la proliferación de células B. Nuevamente, el ODN 2006 y su pariente el ODN 2397 fueron los más fuertes a la concentración baja de 0.25 µg/ml. El ODN 2395 y sus parientes indujeron menos producción de IL-10 a esta concentración. 95 Ejemplo 5. Dependencia de la concentración del efecto estimulador inmune. ¦ Estudios adicionales sobre esta clase de oligonucleótidos y los derivados implicaron los ODN números 2427-2433 (SEQ ID NOS: 2-8) . Los dato para esos ODN son mostrados en la Figura 8. Esto demuestra nuevamente que el ODN 2006 son muy débil en su inducción de producción de IFN-a a una concentración de 1 ó 6 µg/ml. Sin embargo, el ODN 2395 indujo cantidades sustanciales de IFN-cc, especialmente la concentración más baja de 1 Ocasionalmente observamos ODN donde la actividad estimuladora se redujo a concentraciones mayores, como 6 µg/ml, en comparación con los efectos observados' a concentraciones más bajas como 1 µg ml . En los experimentos mostrados en la Figura 8, el ODN 2395 fue más potente a la concentración más baja que a la concentración más alta, pero el ODN 2429 fue más potente a la concentración más alta. En contraste con la curva dosis-respuesta invertida común del ODN de fosforotioato, el ODN quimérico, como el ODN 2336 en este experimento típicamente mostró un incremento en los efectos estimuladores inmunes a concentraciones mayores. El efecto estimulador del ODN 2432 en este experimento mostrado en la Figura 8 fue interesante, considerando que este ODN no tiene un buen palíndromo. Este sistema con la actividad estimuladora de células B 96 relativamente débil se muestra en la Figura 5 y la Figura 6.

Ejemplo 6. Relación reciproca entre la estimulación de células B y estimulación de NK y la secreción de IFN-cc. La Figura 9 muestra otro experimento, donde el ODN 2395 a una concentración baja de 0.4 \x.q/ml fue significativamente más débil que el ODN 2006 en la inducción de expresión de CD86 de célula B. Los otros parientes del 2395 muestran una pérdida menos notable de estimulación de células B. De manera interesante, existe la sugerencia del mismo orden de rango para la pérdida de estimulación de células B que había sido observado anteriormente para la ganancia de estimulación de NK: el ODN 2429, seguido por el ODN 2430, son estimuladores de células B más débiles entre los parientes de 2395. Esto eleva la posibilidad de que la pérdida de estimulación de células B por el ODN similar al 2395 está estrechamente relacionada con la ganancia de estimulación de NK y secreción de IFN-a. La Figura 10 y la Figura 11 muestran la inducción de IFN-a observada con el ODN 2395 y el ODN 2429, seguida por el ODN 2430. La Tabla 4 y la Figura 12, de un experimento separado, también muestran la fuerte capacidad del ODN 2395 y el ODN 2429 para inducir secreción de IFN-cc en dos donadores humanos diferentes (D141 y D142) . 97 Tabla 4. Secreción de IFN-ot por Variantes del ODN 1Datos expresados en unidades de pg/ml como media + desviación estándar. Secuencias de ODN para la Tabla 4 2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 39) 2336 GGGGACGACGTCGTGGGGGGG (SEQ ID NO: 57) 2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 1) 2429 TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO: 4) 98 5293 TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCC (SEQ ID NO: 58) 5294 TCGTCGTTTTCGGCCGCCGCC (SEQ ID NO: 59) 5295 TCGTCGTTTTCGGCCGCCGCCG (SEQ ID NO: 60) 5296 TCGTCGTTTTCGCCGCCGCCG (SEQ ID NO: 61) 5297 TGCTGCTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO: 62) Ejemplo 7. Características del dominio rico en GC De manera sorprendente, ninguno de los otros ODN 5293-5298 demostró respuestas estimuladoras inmunes fuertes. El ODN 5293 contiene un palíndromo de 10 bases, pero el palíndromo difiere del 2395 en que el CG central está invertido a GC. Sin embargo, se cree que este cambio por sí mismo no puede explicar la pérdida de actividad puesto que el ODN 2429 también tiene tal inversión. En su lugar, pueden ocurrir niveles mayores de actividad con un palíndromo de 12 bases a menos que exista un GC central en el palíndromo. Sin embargo, el ODN 2430 también tiene solo un palíndromo de 10 bases con un dinucleótido GC central. La actividad estimuladora inmune del ODN 2430 puede ser mejorada por el hecho de que contiene cinco dinucleótidos CpG en el término 3', mientras que el ODN 5293 contiene solo tres. El ODN 5294 contiene solo un palíndromo de 6 bases, el cual posiblemente podría estar relacionado con su baja actividad. El ODN 5295 de igual modo no tiene un buen palíndromo. La baja actividad del ODN 5296 sugiere que la 99 repetición simple de CCG no es suficiente para conferir los efectos estimuladores inmunes del ODN 2395. El ODN 2397 tiene un palíndromo de 12 bases perfecto en el extremo 3' , pero no motivos de CpG con el extremo 5' . Puesto que el palíndromo de 12 bases en el ODN 5297 es el mismo que en el ODN 2429, puede concluirse que el motivo 5' TCGTCG del ODN 2429 es importante para su actividad estimuladora inmune. Es decir, que se cree que la presencia del palíndromo neutralizante del ODN 2429 en un extremo de un oligonucleótido será suficiente para proporcionar actividad estimuladora inmune en ausencia de al menos un motivo estimulador en el otro extremo.

Ejemplo 8. Efectos sobre la producción de IFN-? Han sido efectuados varios tipos de ensayos adicionales para comprender mejor la gama de efectos estimuladores inmunes de esta nueva clase de ácidos nucleicos inmunoestimuladores . La Figura 13 muestra algunos de los efectos de esos ODN sobre la producción de IFN-? de los sobrenadantes de PB C humanas. Esas células fueron las mismas que aquellas mostradas en los experimentos mostrados en la Tabla 3, pero los sobrenadantes de los cultivos fueron ensayados por sus niveles de IFN-?. El panel C en la Figura 13 muestra que los ODN CpG SOS como el ODN 1585 inducen alguna producción IFN-?, mientras que los ODN sin el motivo 100 CpG (por ejemplo, el ODN 2118 control) no. Los paneles A y B de la Figura 13 muestran que el ODN 2006 es relativamente débil en su inducción de producción de IF -?, mientras que el ODN 2395 y sus primos son un tanto más fuertes. Se efectuó otro conjunto de estudios para examinar los efectos de esos diferentes ODN sobre células dendriticas. El DC plasmacitoide (pDC) es la fuente del IFN-oc que es producido en respuesta al ODN 2395 y sus parientes. Los efectos de los diferentes ODN sobre el DC mieloide (mDC) son relativamente similares dado que todos los ODN inducen parcialmente mDC modificado para activar células CD4+ a producir IFN-? (Figura 14 y Figura 15) . Se aislaron DC mieloides de un recubrimiento amarillento y se incubaron con GM-CSF (4.4 ng/ml) y varios ODN durante 2 días. Las células T Cándidas CD4+ fueron entonces aisladas de un donador diferente y mezcladas con DC a relaciones de efector a objetivo (E:T) seleccionadas e incubadas durante 6 dias más. Las células fueron entonces teñidas y analizadas por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . Los resultados fueron medidos en términos del porcentaje de células CD3+ que se tiñeron para IFN-?. La Figura 14 muestra el porcentaje de células T que se tiñeron positivas para IFN-? y la Figura 15 muestra la intensidad de la fluorescencia media ( FI) de la tinción de IFN-? en esas células T. 101 Ejemplo 9. No todos los palíndromos ricos en GC son efectivos . Se sintetizaron varios ODN adicionales para comprender mejor los requerimientos estructurales de esa nueva clase de ODN. Puesto que notamos que los ODN inmunoestimuladores potentes contenían palíndromos ricos en GC, se sintetizaron el ODN 2449 (TCGTCGTTTTCGGGGGCCCCC, SEQ ID NO: 9) y 2450 (TCGTCGTTTTCCCCCCCGGGGGG, SEQ ID NO: 10) para tener palíndromos ricos en GC que fueron simplemente G sequidas por C, o C solas sequidas por G lineales. Como se muestra en la Figura 16, ninguno de esos ODN indujo la producción de IFN-cc.

Ejemplo 10. Efecto de la orientación de la secuencia inmunoestimuladora y motivo neutralizante. El ODN 2451 (TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTT, SEQ ID NO: 11) fue sintetizado para probar la probabilidad de que la orientación 5' y 3' del motivo TCGTCG "estimulador" y el palíndromo CGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 23) "neutralizante" pudiera ser invertido sin perder actividad inmunoestimuladora. En realidad, el ODN 2451 es altamente estimulador (Figura 16) . El ODN 2 52 (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT, SEQ ID NO: 12) fue sintetizado 102 para determinar si podría ser agregada una secuencia adicional al extremo 3' del palíndromo CGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 23) sin reducir la actividad estimuladora inmune, siempre que el motivo TCGTCG estimulador no estuviera sobre el extremo 5r . En realidad, este ODN también fue altamente inmunoestimulador (Figura 16) .

Ejemplo 11. Variantes del ODN 2395 y su inducción de IFN-oc Para estudiar con mayor detalle los requerimientos estructurales de esta nueva clase de ODN para inducir la secreción de IFN- r fueron sintetizadas variantes del ODN 2395 y probadas por su actividad inmunoestimuladoras . La Tabla 5 resume los datos relacionados con la inducción de IFN- . Tabla 5. Variantes de ODN 2395 y su inducción de IFN-a1'2 ODN SEQ ID Secuencia Palíndromo Descripción Inducción NO: de IEN-OC 2006 39 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt / ODN clase B 2336 57 ggGCACGACGTCCTGgggggG + ODN clase A +++++ 2395 1 tcgtcgttttcggcgcgcgccg + 2006-2136 ++ 2427 2 tcgtcgttttcgtcgcgcgccg — 2428 3 tcgtcgttttcgtcgcgcggcg 103 Tabla 5. (Continuación) ODN SEQ ID Secuencia Palíndromo Descripción Inducción NO: de IEN-a 2429 4 tcgtcgttttcggcggccccg + cg?gc +++ preservando el palíndromo 2430 5 tcgtcgttttcggcgcgccgcg — + 2431 6 tcgtcgttttcggcgcgcccfccf +/- 2432 7 tcgtcgttttcggcccgcgcgg + 2433 8 tcgtcgttttccgccgccgggg — 5293 58 tcgtcgttttcggcg ccgcc (+) 2429 con/o 3'g 5294 59 tcgtcgttttcggccgccgcc 3xgcc con/o 3' g 5295 60 tcgtcgttttcggccgccgccg 5295 con/3' g 5296 61 tcgtcgttttcgccgccgccg — — 5297 62 tgctgcttttcggcggccgccg + ge de 2429 5327 14 tgctzgttttzggzgzgzgzzg + 2395 + con/metil- c(z) 5328 15 tgctgcttttcggcgcgcgccg + ge de 2395 2136 19 tcctgacgttcggcgcgcgccc (+) +/- 5315 13 tcctgacgttcggcgcgcgccg + 2136 con/3' +? g palíndromo más largo 104 Tabla 5. (Continuación) Los subrayados son nucleótidos que difieren de 2395; las secuencias palindrómicas están en itálicas. 2 Todos excepto el ODN 2336, que representan un ODN de estructura quimérica (las mayúsculas indican enlace fosfodiéster y las minúsculas representan enlace fosforotioato) , son ODN completamente de fosforotioato . Del primer conjunto de experimentos usando los ODN 2395 y 2427-2433 de fosforotiato se vuelve claro que la secuencia palindrómica en la secuencia en el extremo 3' del ODN tiene un papel importante en la inducción de la secreción de IFN- por células dendriticas que son las productoras principales de IFN-? (véase 2395 y 2429) , aunque algunos ODN sin ese palíndromo en el extremo 3' (por ejemplo, el ODN 2430 y el ODN 2432) también inducen IFN-oc en cantidades un tanto menores (ejemplo en la Figura 17A) . El ODN 2395 y el ODN 2429 indujeron las cantidades más altas de IFN-a, mientras que el 2006 (ODN de la clase B) no indujo o indujo cantidades 105 mínimas, y el ODN 2336 (ODN de la clase A) indujo cantidades grandes de esta citocina. La mayoría de los experimentos demostraron que el ODN 2429 indujo cantidades aún mayores de esta citocina (Figura 17B) . Una introducción de un motivo TCG adicional (por ejemplo, ODN 2427 y ODN 2428) pareció tener efectos negativos sobre la secreción de IFN-oc. Sobre la base de los datos de esos y otros estudios de ODN 2186, el gcc en el extremo 3' pareció jugar un posible papel en los efectos observados . Por lo tanto, probamos otro conjunto de ODN que tienen todos secuencias de GCC en el extremo 3' . No se observó que ninguno de esos ODN indujera IFN-oc. Por lo tanto, únicamente GCC en si en un palíndromo parece no ser suficiente para los efectos observados. Además, el ODN 5297 con un TGC en el extremo 5' no indujo ningún IFN-oc a pesar de contener la secuencia palindrómica 3' . Esto condujo a la conclusión de que no solo la secuencia palindrómica 3' sino también el motivo TCG 5' es importante para la actividad de esos ODN. Esto fue confirmado usando el ODN 5328 (2395 con el motivo TGC 5' ) . En contraste con la metilación de los ODN de la clase A, la metilación de al menos el motivo 5' hizo disminuir, pero nc abrogo, la secreción de IFN-oc. Este descubrimiento concuerda con los resultados obtenidos con los 106 ODN de la clase B. No obstante, un ODN con parte del palíndromo 3' pero una secuencia diferente en el extremo 5' con solo un dinucleótido CpG (ODN 2136) también indujo IFN-oc. En resultados preliminares usando este ODN y un ODN con todo el palíndromo 3' (ODN 5315), el ODN 5315 fue mejor que el ODN 2136 pero no tan bueno como el ODN 2395. El hecho de que el ODN 5329 parezca inducir no o únicamente cantidades muy bajas de IFN-a. aunque tenga un palíndromo CG completo en el extremo 3' indica que las secuencias palindrómicas específicas son las preferidas por la actividad del IFN-a. Ejemplo 12 : Relación reciproca entre la activación de células B y la inducción de IFN-a. Se efectuaron experimentos de activación de células B adicionales con un panel de algunos de los ODN del ejemplo 11 (Figura 18) . Los resultados indican que lo mejor es un ODN para la inducción de IFN- , el menos activo es sobre las células B (comparable especialmente a los ODN 2006, 2336, 2395, 2429) . No obstante, también se demostró que todos esos ¦ ODN fueron superiores al 2336 (ODN de la clase A) para estimular células B. Ejemplo 13: Efectos sobre la secreción de IFN-?.

También determinados la secreción de IFN-? tras la 107 incubación de PBMC con diferentes concentraciones de ODN a diferentes puntos en el tiempo (Figura 19A-C) . Los ODN probados indujeron la secreción de IFN-? con el orden del rango de 2336>2395>, 2429>2006. No obstante, la diferencia entre los ODN no fue tan clara como usando IFN-a como lectura . Ejemplo 14: Efecto sobre IFN-? en MLR. También determinados el efecto de esos ODN sobre la inducción de IFN-? en una reacción linfocítica mezclada (MLR) . En este escenario los linfocitos de un donador responden a antígenos expresados sobre células de otro donador. Los resultados demostraron que los ODN 2006, 2336, así como el 2395 fueron capaces de mejorar la secreción de IFN-? durante esa respuesta especifica del antígeno (Figura 20) . Esto indicó que todos esos ODN fueron capaces de mejorar la reactividad a antígenos específicos. Ejemplo 15: El ODN 2395 induce menos IL-10 que el ODN 2006. Un conjunto adicional de experimentos enfocados sobre la inducción de la citocina proinflamatoria IL-10. Nuevamente, como antes para el IFN-?, se incubaron PBMC durante diferentes tiempos y con diferentes concentraciones de ODN (Figura 21A-C) . Los resultados demuestran que, como se 108 demostró anteriormente, el ODN 2006 induce cantidades relativamente altas de IL-10 en contraste con el ODN 2336 que induce solo cantidades mínimas o bajas. En contraste, los ODN 2395, así como el ODN 2429 inducen más IL-10 que el ODN 2336 pero menos que el ODN 2006. Esto confirma nuevamente que los ODN de esta nueva clase de ODN inmunoestimuladores tienen actividades inmunes que las colocan entre aquellas descritas para los ODN de la clase A y la clase B. Ejemplo 16: El ODN 2395 induce menos TNF-a que el ODN 2006 pero más que el ODN 8954. Se cultivaron PBMC humanas durante 6 horas, con 1.6 µ /ml de ODN 2006, 8954, 2395, 2429, o LPS, y se cosecharon entonces los sobrenadantes y se midió el TNF-a por medio de una ELISA específico. Los resultados se muestran en la tabla 6. Tabla 6. Inducción de TNF-a por ODN representativos de diferentes clases ODN TNF-a, pg/ml (LPS) >120 2006 40 2429 35 2395 21 8954 14 ninguno 16 109 Experimentos adicionales indicaron que las citocinas IL-5 asi como la IL-15 pudieron ser detectadas en nuestro escenario experimental tras la incubación de las PBMC con esos ODN. Ejemplo 17: Inducción de IP-10 Se cultivarón PBMC humanas solas, o en presencia de IL-2, en presencia de ODN 1585 control u ODN 2118 control a 10 µ?/?a?, o en presencia de varios ODN a 0.6 o 3.0 µg/ml. Los sobrenadantes fueron cosechados después de 24 horas y la IP-10 fue medida por ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) especifico. Los resultados se muestran en la Figura 22. Los ODN 2395, 2429, 2430, 2432 y 2451 a 3.0 ]xq/ml y ODN 2452 a 0.6 µg/ml, inducen todos grandes cantidades de IP-10. Ejemplo 18; Inducción de INF-a Se cultivaron PBMC humanas solas, en presencia de IL-2, en presencia de ODN 1585 control u ODN 2118 control a 10 µg/ml, en presencia de varios ODN a 0.6 o 3.0 µg/ml. 24 horas después fueron cosechados los sobrenadantes y se midió el IFN-a por medio de un ELISA especifico. Los resultados se muestran en la figura 23A (ODN a 0.6 µg/ml) y la Figura 23B (ODN a 3.0 µg/ml) . Los ODN 2395, 2427, 2429, 2430, 2431, 2432, y 2451 a 3.0 µg/ml y el ODN 2452 a 0.6 µg ml, indujeron todos grandes cantidades de IFN-a. 110 Ejemplo 19: Inducción de IFN-? Se cultivaron PBMC humanas solas, en presencia de IL-2, en presencia de ODN 1585 control u ODN 2118 control a 10 µg/ml, o en presencia de varias ODN a 0.6 ó 3.0 µg/ l. 24 horas después fueron cosechados los sobrenadantes y se midió el IFN-? por medio de un ELISA especifico. Los resultados se muestran en la Figura 24. Los ODN 2395, 2427, 2429, 2430, 2431, 2432, 2451 y 2452 a 3.0 µg/ml, y el ODN 2352 a 0.6 µg/ml, indujeron todos grandes cantidades de IFN-?. Ejemplo 20: Inducción de IL-6. Se cultivaron PBMC humanas solas, en presencia de IL-2, en presencia de ODN 1585 control u ODN 2118 control a 10 µg/ml, o en presencia de varios ODN a 0.6 ó 3.0 µg/ml. 24 horas después fueron cosechados los sobrenadantes y se midió la IL-6 por medio de un ELISA especifico. Los resultados se muestran en la Figura 25. Los ODN 2395, 2430, 2432, 2433, 2136, 2449, 2450, 2451 y 2452 0.6 µg/ml, y el ODN 2449 y el ODN 2451 a 3.0 µg/ml, indujeron todos grandes cantidades de IL-6. Ejemplo 21: Inducción de IFN- Se cultivaron PBMC humanas solas o en presencia de varios ODN a 3.0 ó 6.0 µg/ml. Los ODN incluyeron a los 2006, 111 8954, 2395, 2449, 2450, 2451, 2452, 5373 (CGGCGCGCGCCG SEQ ID NO: 23), 5374 (CGGCGCGCGCCGCGGCGCGCGCCG, SEQ ID NO: 24), 5375 (CGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT, SEQ ID NO: 25), 5376 (TCGGCGCGCGCCGTGCTGCTTT, SEQ ID NO: 26), y 5377 (CCGCCGTTTTCGGCGCGCGCCG, SEQ ID NO: 27) . 24 horas después fueron cosechados los sobrenadantes y se midió el IFN-oc por medio de un ELISA especifico. Los resultados se muestran en la Figura 26. Los ODN 2395, 2451, 2452, y 5376 indujeron todos IFN-a. Ejemplo 22: Inducción del IFN-a por el ODN 5515 y el ODN 5516. Se cultivaron PBMC humanas obtenidas de dos donadores (D346 y D240) solas o en presencia de ODN 2006, ODN 5515, u ODN 5516, a 0.8, 2.4 ó 6.0 µ p?1. 24 horas después fueron cosechados los sobrenadantes y se midió el IFN-? por medio de un ELISA específico. Los resultados se muestran en la tabla 7. El ODN 5515 y el ODN 5516 indujeron IFN-a de manera más efectiva que el ODN 2006, particularmente a concentraciones de ODN de 2.4 y 6.0 µ?/t?. Ejemplo 23: Inducción de IFN-a por el ODN 20184, 20185 y 20186. Se cultivaron PBMC humanas obtenidas de tres donadores (D445, D446, y D448) solas o en presencia de ODN 112 2006, ODN 20184, ODN 20185 u ODN 20186 a 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 ó 1.0 µg/ml. 24 horas después fueron cosechados los sobrenadantes y se midió el IFN-a por medio de un ELISA especifico. Los resultado se muestran en la tabla 8. Los ODN 20184, ODN 20185 y ODN 20186 indujeron IFN-cc más efectivamente que el ODN 2006, particularmente a 0.2-0.5 µ%/t1.

Tabla 7. Inducción de IFN-a (pg/ml) por el ODN 5515 y el ODN 5516. ODN Conc . D346 D240 µg/ml Media ± DE Media + DE 0.8 18.5 + 13.8 36 ± 3.3 2006 2.4 0 ± 0 19.7 ± 6.4 6 2.7 ± 0 2.8 ± 0 0.8 34.1 + 6.9 16.5 + 2.8 5515 2.4 36.6 ± 2.1 106.7 ± 17.3 6 39.2 ± 26.5 127.3 ± 7.7 0.8 4.3 + 0 22.3 + 0.1 5516 2.4 31.9 ± 0 172.5 + 82.3 6 26.6 ± 19 90.4 ± 15.4 ninguo 0 + 0 20.9 + 6,5 113 Tabla 8. Inducción de IFN-oc (pg/ml) por los ODN , 20185, y 20186 ODN Conc . D445 D446 D448 µg/ml Media ± DE Media ± DE Media ± DE 0.05 5.2 ± 0.0 58.8 ± 1.9 0.9 ± 0.0 0.1 27.7 ± 14.4 283.5 ± 16.1 23.5 ± 3.8 2006 0.2 54.9 ± 17.6 503.7 ± 9.7 39.1 ± 5.0 0.5 61.1 ± 14.6 227.8 ± 12.7 49.8 ± 0.4 1.0 26.4 ± 15.5 142.6 ± 23.1 48.7 ± 29.8 0.05 25.6 ± 2.1 88.0 ± 12.2 0.0 ± 0.0 0.1 32.9 ± 7.3 691.2 ± 32.3 129.1 ± 24.8 20184 0.2 256.2 ± 8.2 2155.1 ± 35.1 314.0 ± 22.2 0.5 757.2 ± 5.7 2171.8 ± 95.9 268.7 ± 15.9 1.0 194.3 ± 5.7 1181.9 ± 15.1 5.8 ± 3.4 0.05 65.0 ± 10.8 217.9 ± 28.4 54.3 ± 14.2 0.1 63.6 ± 1.3 467.4 + 23.7 150.9 + 5.9 20185 0.2 79.3 ± 2.4 1420.5 ± 83.7 160.2 ± 5.5 0.5 281.3 ± 0.2 1965.7 ± 72.3 162.4 ± 3.8 1.0 176.9 ± 12.5 1710.3 ± 19.7 181.1 ± 0.1 0.05 21.9 ± 1.7 223.1 ± 1.2 79.8 ± 1.6 0.1 58.3 ± 7.6 812.2 ± 28.1 111.3 ± 6.8 20186 0.2 153.6 ± 1.5 1302.5 ± 56.2 193.5 ± 10.5 0.5 267.7 ± 7.9 1744.1 ± 54.7 227.4 ± 6.9 1.0 153.0 ± 0.3 1113.6 ± 6.4 13.7 ± 15.4 — 0.0 ± 00 12.8 ± 2.0 64.8 ± 32.7 Medio — 0.0 ± 0.0 45.3 ± 12.9 36.4 ± 2.6 114 Ejemplo 24: Inducción de IFN-ot por los ODN 8954, 5569 y 5570. Se cultivaron PBMC humanas obtenidos de tres donadores (D521, D525, y D526) solas o en presencia de los ODN 2006 (SEQ ID NO: 39), ODN 8954, ODN 5569 (TIGTIGTTTTCGGCGGCCGCCG SEQ ID NO: 63), y (TCITCITTTTCGGCGGCCGCCG SEQ ID NO: 70) a 0.03, 0.06, 0.125 ó 1.0 µg/ml. 24 horas- después fueron cosechados los sobrenadantes y se midió el IFN-cc y la IL-10 por medio de un ELISA especifico. Los resultados se muestran en las Tablas 9 y 10.

Tabla 9. Inducción de IFN-cx (pg/ml) por los ODN 8954, 5596, y 5570 ODN Conc . D521 D525 D526 µg/ml Media ± DE Media ± DE Media ± DE 0.03 238.674 239.286 216.393 0.06 2405.63 385.161 126.516 2006 0.125 3826.53 549.612 86.173 0.25 2248.94 532.67 74.493 l.C 362.74 161.892 57.087 115 Tabla 9. Inducción de IFN-cc (pg/ml) por ODN 8954, 5596 , y 5570 ODN Conc . D521 D525 D526 Media ± DE Media ± DE Media ± DE 0 03 305.626 309. 581 599. 971 0 06 6039.51 2028 .52 4707 .01 8954 0. 125 7322.45 4669 .31 5340 .21 0 25 7651.13 4641.1 5324 .55 1 .0 7078.59 4679 .59 5474 .94 0 03 112.784 121. 422 87.751 0 06 110.723 65.753 47. E 588 5569 0. 125 104.547 49.365 41.046 0 25 111.755 62.383 43.216 1 .0 2247.97 115 77 1101 .58 0 03 822.648 427. 535 250. 196 0 06 1858.16 1021 .18 218. 201 5570 0. 125 3470.67 1657.3 477. 938 0 25 5612.53 3369 .99 669. 706 1 .0 6798.3 3501 .59 2560 .93 — 145.436 214. 212 66.853 Medio — 245.121 218. 622 0 116 Tabla 10. Inducción de IL10 (pg/ml) por los ODN 8954, 10101-2, 5569, y 5570 ODN Conc . D521 D525 D526 g/ml Media ± DE Media ± DE Media ± DE 0.3 151 .976 112 .414 485 .823 0.06 384 .377 218 .651 898 .299 2006 0.125 404 .352 242 .289 991 .614 0.25 357 .657 247 .405 1150.94 1.0 255 .344 162 .444 1171.72 0.3 7. 456 6. 617 6. 919 0.06 5 34 5. 721 19 787 8954 0.125 10 723 2. 986 35 892 0.25 15 308 13 056 67 .18 1.0 48 904 30 892 230 .725 0.3 0 1. 287 1. 348 0.C6 0 0. 127 4. 592 5569 0.125 18 815 3. 615 62 963 0.25 105.32 30 094 350 .529 1.0 256 .785 136 .833 1156.07 0.3 0 0 31 5. 867 0.06 6. 599 7. 027 29 879 5570 0.125 98 553 38 528 455 .145 0.25 259 .812 107 .164 1169.46 1.0 312 .189 206 .126 1595.63 — 1. 755 10 543 0 Medio — 0 29 11 192 0 117 La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir a un experto en la técnica practicar la invención. La presente invención no debe ser limitada en alcance por los ejemplos proporcionados, puesto que se pretende que los ejemplos sean solo1 ilustrativos de un aspecto de la invención y otras modalidades funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y caerán dentro de las reivindicaciones anexas. Las ventajas y objetos de la invención no son necesariamente abarcados por cada modalidad de la invención. Todas las referencias, patentes y publicaciones de patente que sean expuestas en esta aplicación son incorporada en su totalidad como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (72)

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REIVINDICACIONES

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un ácido nucleico inmunoestimulador de 14-100 nucleótidos de longitud, caracterizado porque comprende la fórmula: 5'X1DCGHX2N3' donde Xi y X2 son independientemente cualquier secuencia de 0 a 10 nucleótidos de longitud, D es un nucleótido diferente de C, C es citosina, G es guanina, H es un nucleótido diferente de G, que comprende además una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de P y N colocada inmediatamente 5' a ?? o inmediatamente 3' a X2, y N es una secuencia neutralizante de células B, donde N comienza con un trinucleótido CGG y es de al menos 10 nucleótidos de longitud, y P es un palíndromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud. 2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5' NX1DCGHX23'' . 3. El ácido nucleico de conformidad con la 119 reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5 ' X!DCGHX23' .

4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5' PX1DCGHX23'' .

5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5' XiDCGHX2P3' .

6. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5'XiDCGH 2PX33' , donde X3 es cualquier secuencia de 0 a 10 nucleótidos de longitud.

7. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5' XiDCGHPX33' , donde X3 es cualquier secuencia de 0 a 10 nucleótidos de longitud.

8. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5 ' DCGHX2PX33 ' , donde X3 es cualquier secuencia de 0 a 10 nucleótidos de longitud.

9. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5' TCGHX2PX33' , donde X3 es cualquier secuencia de 0 a 10 nucleótidos de longitud. 120

10. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5 ' DCGHPX33 ' , donde X3 es cualquier secuencia de 0 a 10 nucleótidos de longitud.

11. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador comprende 5'DCGHP3'.

12. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque D es timina (T) .

13. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque H es T.

14. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque H es T y X2 es seleccionado del grupo que consiste de CG, CGT, CGT , CGTTT , y CGTTTT.

15. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque H es T y X2 es CG.

16. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque H es T y X2 es CGTTTT.

17. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque C no está metilada.

18. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque N comprende al menos cuatro dinucleótidos CG y más de dos trinucleótidos CCG. 121

19. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque P incluye al menos una inosina .

20. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido inmunoestimulador tiene una estructura resistente a la nucleas .

21. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura de fosforotioato .

22. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además una secuencia de poli T en el extremo 5' .

23. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además una secuencia de poli T en el extremo 3' .

24. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador es de 14-40 nucleótidos de longitud.

25. El ácido nucleico de' conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador es de 14-30 nucleótidos de longitud.

26. Un ácido nucleico inmunoestimulador de 13-100 nucleótidos de longitud caracterizado porque comprende la 122 fórmula 5'NiPyGN2P3' donde i es cualquier secuencia de 1 a 6 nucleótidos de longitud, Py es una pirimidina, G es guanina, 2 es cualquier secuencia de 0 a 30 nucleótidos de longitud, y P es un palíndromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 nucleótidos de longitud.

27. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque Ni es al menos 50% de pirimidinas .

28. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque i es al menos 50% de T.

29. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque N2 incluye al menos un motivo de CG.

30. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque i incluye al menos un motivo de TCG.

31. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque Na incluye al menos un motivo de CI . -

32. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque i incluye al menos 123 un motivo de TCI .

33. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque Ni incluye al menos un motivo de IG.

34. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque Ni incluye al menos un motivo de TIG.

35. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque Ni TCGG.

36. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque ?? es TCGH, donde H es un nucleotido diferente de G.

37. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque Py es una C no metilada .

38. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque N2 es al menos 50 de pirimidinas .

39. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque N2 es al menos 50% T.

40. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque N2 no incluye ninqún motivo de poli G o poli A.

41. El ácido nucleico de conformidad con la 124 reivindicación 26, caracterizado porque NiPyG 2 es una secuencia seleccionada del grupo que consiste de TTTTTCG, TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT, TTCGT, TTTCGT, y TCGTCGT.

42. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura completamente resistente a la nucleasa.

43. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la estructura resistente a la nucleasa está compuesta de enlaces fosforotioato .

44. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura completamente fosfodiéster .

45. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una estructura quimérica.

46. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador tiene al menos un enlace fosfodiéster entre un motivo de CG, CI o IG.

47. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque P es completamente 125 palindrómica .

48. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque P es un palíndromo que tiene entre 1 y 3 nucleótidos intervinientes consecutivos .

49. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque los nucleótidos intervinientes son TG.

50. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque P incluye al menos 3 nucleótidos C y al menos 3 nucleótidos G.

51. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque P incluye al menos 4 nucleótidos C y al menos 4 nucleótidos G.

52. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque P incluye al menos 5 nucleótidos C y al menos 5 nucleótidos G.

53. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque P incluye al menos una inosina.

54. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador es de 13-40 nucleótidos de longitud.

55. El ácido nucleico de conformidad con la 126 reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador es de 13-30 nucleotidos de longitud.

56. Un ácido nucleico inmunoestimulador de 13-100 nucleotidos de longitud caracterizado porque comprende la fórmula: 5'NiPyG/IN2P3' donde Ni es cualquier secuencia de 1 a 6 nucleotidos de longitud, Py es una pirimidina, G/I se refiere a un solo nucleótido el cual es una G o una I, G es guanina e I es inosina, N2 es cualquier secuencia de 0 a 30 nucleotidos de longitud, y P es un palíndromo rico en GC que contiene una secuencia de al menos 10 nucleotidos de longitud.

57. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque NxPyIN2 es TCITCITTTT (SEQ ID NO: 47) .

58. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque P es un palíndromo rico en GC.

59. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque P es un palíndromo rico en IC.

60. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque G/I es G.

61. El ácido nucleico de conformidad con la 127 reivindicación 56, caracterizado porque G/I es I.

62. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el ácido nucleico inmunoestimulador es de 13-30 nucleótidos de longitud.

63. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un ácido nucleico inmunoestimulador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-62, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

64. Un método para inducir la expresión de interferón (IFN) del tipo 1, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula capaz de expresar IFN del tipo 1 con una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador de cualquiera de las reivindicaciones 1-62 para inducir la expresión de IFN del tipo 1.

65. Un método para activar una célula asesina natural (NK) , caracterizado porque comprende poner en contacto una célula NK con una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-62, para activar la célula NK.

66. Un método para tratar una infección, caracterizada porque comprende administrar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador de conformidad con cualquiera de 128 las reivindicaciones 1-62, para tratar o prevenir la infección .

67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una infección seleccionada del grupo que consiste de una infección viral, bacteriana, fungal o parasitaria.

68. Un método para tratar una condición alérgica, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que tenga o este en riesgo de desarrollar una condición alérgica a una cantidad efectiva de un ácido nucleico inmunoestimulador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-62, para tratar o prevenir la condición alérgica .

69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la condición alérgica es el asma alérgico.

70. Un método para tratar el cáncer, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que tenga o este en riesgo de desarrollar cáncer una cantidad efectiva de un ácido nucleico imunoestimulador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-62 para tratar o prevenir el cáncer.

71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo 129 que consiste de carcinoma celular basal, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga; cáncer óseo, cáncer cerebral y del SNC; cáncer de mama; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon y recto; cáncer del tejido conectivo; cáncer del sistema digestivo; cáncer endometrial; cáncer esofágico; cáncer ocular; cáncer de cabeza y cuello; cáncer gástrico; neoplasma intra-epitelial; cáncer de riñon; cáncer de laringe; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; linfoma, incluyendo el linfoma de Hodgkin y no Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de la cavidad oral; cáncer de ovario; cáncer pancreático; cáncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer rectal; cáncer renal; cáncer del sistema respiratorio; sarcoma; cáncer de pie; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer tiroideo; cáncer uterino; cáncer del sistema urinario, y otros carcinomas y sarcomas.

72. Un ácido nucleico inmunoestimulador, caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 1) , TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO: 4) , TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG (SEQ ID NO: 5) , TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG (SEQ ID NO: 6), TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGC (SEQ ID NO: 7) , 130 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT (SEQ ID NO: 12), TCCTGACGTTCGGCGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 13), TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG (SEQ ID NO: 14), donde Z es -metilcitosina, TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO: 19), y TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT (SEQ ID NO: 11) .