CN117720660A - 抗人鸟苷酸环化酶c抗体及其试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及抗体领域,本公开公开了抗人鸟苷酸环化酶C抗体及其试剂盒和应用。本公开公开的抗人鸟苷酸环化酶C抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区,能够特异性结合人GUCY2C,具有显著的抗肿瘤作用。
Description
本公开请求2022年09月19日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为202211138356.2,发明名称为“抗人鸟苷酸环化酶C抗体及其试剂盒和应用”的中国专利申请的优先权和权益,并且通过参照将其全文并入本申请。
技术领域
本公开涉及抗体领域,具体而言,涉及抗人鸟苷酸环化酶C抗体及其试剂盒和应用。
背景技术
鸟苷酸环化酶C(guanylyl cyclase C,缩写:GUCY2C)是一种主要表达于肠腺和绒毛细胞顶部的跨膜受体。GUCY2C的内源性配体为尿鸟苷素鸟苷蛋白。当GUCY2C被配体激活后,可启动一系列下游信号传导,调节体液和电解质的稳态,维持肠道屏障的完整性。在正常生理情况下,仅有肠道组织存在一定的表达。而在结肠直肠肿瘤中,约95%的肿瘤细胞均可检测到高表达的GUCY2C,此外,部分胃食管肿瘤,胰腺肿瘤也存在GUCY2C的高表达。因此,GUCY2C目前已成为一个全新的肿瘤治疗靶点。
发明内容
鉴于目前尚无抗GUCY2C抗体药物上市,通过GUCY2C抗体药物治疗肿瘤可能会减轻药物副作用,提高患者生存率,为结直肠肿瘤患者、胃食管肿瘤患者、胰腺肿瘤患者提供新的治疗策略。特提出本公开,本公开提供抗人鸟苷酸环化酶C抗体及其试剂盒和应用。
本公开:
第一方面,本公开提供了一种抗人GUCY2C抗体,所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其选自(a)~(c)中的任一项;
(a)所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:16、7、26、33、43、53、57、59或61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:18、9、28、35、45、55、58、60或62中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT编号系统定义,或由Kabat编号系统定义,或由Chothia编号系统定义,或由Contact编号系统定义,或由AbM编号系统定义。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包括SEQ IDNo:16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ IDNo:18中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:7中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:9中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:26中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:28中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:33中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:35中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:43中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:45中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:53中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:55中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:57中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ IDNo:58中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:59中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:60中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:59中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:58中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQIDNo:62中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:60中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
(b)所述抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ IDNo:11、SEQID No:12和SEQ ID No:13所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:14、SEQ ID No:5和SEQ ID No:15所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ IDNo:3所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQID No:4、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:23、SEQ IDNo:24和SEQ ID No:25所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:30所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:31、SEQ ID No:24和SEQ IDNo:32所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQID No:37、SEQ ID No:38和SEQ ID No:39所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:40、SEQ ID No:41和SEQ ID No:42所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:47、SEQ IDNo:48和SEQ ID No:49所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ IDNo:50、SEQ ID No:51和SEQ ID No:52所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述抗体包含分别如SEQ ID No:11、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ IDNo:14、SEQ ID No:5和SEQ ID No:15所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3;在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:11、SEQ ID No:12和SEQ ID No:67所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:14、SEQ ID No:5和SEQ ID No:15所示的氨基酸序列;
(c)所述重链可变区包含与SEQ ID No:16、7、26、33、43、53、57、59或61具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含与SEQ ID No:18、9、28、35、45、55、58、60或62具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述重链可变区和轻链可变区包括如前任一项所述(a)或(b)所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中,所述重链可变区包含SEQ IDNo:16的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:18的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:7的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:9的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:26的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:28的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQID No:33的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:35的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:43的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:45的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:53的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQID No:55的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述抗体包含如SEQ ID No:16所示的重链可变区和如SEQ ID No:18所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述重链可变区包含SEQID No:61的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:62的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:57的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:58的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:59的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQID No:60的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:59的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:58的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:61的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:60的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述抗体包含如SEQ ID No:61所示的重链可变区和如SEQ ID No:62所示的轻链可变区。
第二方面,本公开提供了一种抗体偶联物,其包括如前任一项所述的抗人GUCY2C抗体。
第三方面,本公开提供了一种试剂或试剂盒,其包括如前任一项所述的抗人GUCY2C抗体或如前任一项所述的抗体偶联物。
第四方面,本公开提供了一种分离的核酸,其编码如前任一项所述的抗人GUCY2C抗体。
第五方面,本公开提供了一种载体,其含有如前任一项所述的核酸。
第六方面,本公开提供了一种细胞,其含有如前任一项所述的核酸或如前任一项所述的载体。
第七方面,本公开提供了一种CAR或CAR-T细胞,所述CAR的抗原结合结构域为如前任一项所述的抗人GUCY2C抗体。
第八方面,本公开提供了如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的试剂或试剂盒、如前任一项所述的核酸、如前任一项所述的细胞、或如前任一项所述的CAR或CAR-T细胞在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用:诊断或辅助诊断鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、治疗或辅助治疗鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、预测或辅助预测鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病的预后疗效和检测人GUCY2C的表达。
第九方面,本公开还提供了一种药物组合物,其包含如如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的核酸、如前任一项所述的细胞、或如前任一项所述的CAR或CAR-T细胞。在一些实施方案中,其还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
第十方面,本公开提供一种药物,其为如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的试剂或试剂盒、如前任一项所述的核酸、如前任一项所述的细胞、或如前任一项所述的CAR或CAR-T细胞或如前任一项所述的药物组合物。在一些实施方案中,所述药物用于:诊断或辅助诊断鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、治疗或辅助治疗鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、预测或辅助预测鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病的预后疗效或检测人GUCY2C的表达。
第十一方面,本公开提供一种诊断/治疗疾病方法,所述方法包括向有需要的个体施用诊断/治疗有效量的如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的试剂或试剂盒、如前任一项所述的核酸、如前任一项所述的细胞、如前任一项所述的CAR或CAR-T细胞或如前任一项所述的药物组合物。在一些实施方案中,所述方法用于:诊断或辅助诊断鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、治疗或辅助治疗鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、预测或辅助预测鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病的预后疗效。
第十二方面,本公开提供一种检测或测定人GUCY2C的方法,所述方法包括使用如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的试剂或试剂盒来检测或测定人GUCY2C。
第十三方面,本公开提供了一种制备如前任一项所述的抗人GUCY2C抗体的方法,其包括培养如前任一项所述的细胞。
本公开具有以下有益效果:本公开公开的抗鸟苷酸环化酶C抗体包括能够特异性结合人GUCY2C;在一些实施方案中,所述抗体在体外和体内均具有显著的抗肿瘤作用;在一些实施方案中,还具有很好的ADCC活性。
附图说明
图1为杂交瘤纯化抗体与K562-hGUCY2C的结合检测结果图;
图2为杂交瘤纯化抗体与K562-cyno GUCY2C的结合检测结果图;
图3为杂交瘤纯化抗体与K562细胞系的结合检测结果图;
图4为GUCY2C单克隆抗体对GUCY2C的阻断活性结果图;
图5为GUCY2C单克隆抗体对GUCY2C的激活活性结果图;
图6为GUCY2C单克隆抗体的ADCC活性实验结果图;
图7为mIgG2a亚型的重组抗体与K562-hGUCY2C的结合活性结果;
图8为mIgG2a亚型的重组抗体与LS1034的结合活性结果;
图9为mIgG2a亚型的重组抗体与T84的结合活性结果;
图10为mIgG2a亚型的重组抗体的ADCC活性;
图11为mIgG2a亚型重组抗体抑制肿瘤生长实验结果图;
图12为重组抗体体内活性分析图;
图13为人源化抗体与K562-hGUCY2C细胞的结合实验结果图;
图14为人源化抗体与K562-cynoGUCY2C细胞的结合实验结果图;
图15为人源化抗体与LS1034细胞的结合实验结果图;
图16为人源化抗体激动活性检测实验结果图;
图17为人源化抗体阻断活性检测实验结果图;
图18为人源化抗体ADCC杀伤活性检测实验结果图;
图19为人源化抗体抑制肿瘤生长实验结果图;
图20为人源化抗体实验结束各组肿瘤体积图。
具体实施方式
为使本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,但是描述和实施例不应被解释为限制本披露的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。除非另外定义,本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。
本公开实施例提供了一种抗人GUCY2C抗体,所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其选自(a)~(c)中的任一项:
(a)所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:16、7、26、33、43、53、57、59或61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:18、9、28、35、45、55、58、60或62中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT编号系统定义,或由Kabat编号系统定义,或由Chothia编号系统定义,或由Contact编号系统定义,或由AbM编号系统定义。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包括SEQ IDNo:16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ IDNo:18中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:7中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:9中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:26中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:28中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:33中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:35中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:43中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:45中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:53中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:55中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:57中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ IDNo:58中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:59中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:60中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:59中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:58中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQIDNo:62中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:60中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本公开中,术语“抗体”在最广义上使用,并且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等等),鼠源抗体,嵌合抗体,全长抗体或其抗原结合片段(或称抗原结合部分),只要它们展示出所期望的抗原结合活性。
“天然抗体”指天然存在的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白,由两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端,每条重链具有一个重链可变区(VH,又称作可变重域),接着是重链恒定区,其包括三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地,从N至C端,每条轻链具有一个轻链可变区(VL,又称作可变轻域),接着是一个轻链恒定区(CL,也称轻链恒定域)。
术语“全长抗体”或“完整抗体”指包含与天然抗体结构基本类似的结构,或重链包含Fc区的抗体。
在本公开中,术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区,其是抗体可变结构域内主要促成与抗原特异性结合的区域。在本公开具体实施方式中,CDRs是指所述抗体的重链和轻链中2个以上高度可变区。
在本公开中,重链互补决定区用HCDR表示,重链可变区中含有的3个CDR区:HCDR1、HCDR2和HCDR3;轻链互补决定区用LCDR表示,轻链可变区中含有的3个CDR区:LCDR1、LCDR2和LCDR3。可以通过各种公知方案来确定CDR的氨基酸序列边界,例如:“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)、“Chothia”编号规则、“ABM”编号规则、“contact”编号规则(参见Martin,ACR.Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc,M.P.等,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003);FrontImmunol.2018Oct 16;9:2278)等;各种编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的,示例性的,如下表1中所示。
表1.CDR编号系统之间的关系
CDR | IMGT | Kabat | AbM | Chothia | Contact |
HCDR1 | 27-38 | 31-35 | 26-35 | 26-32 | 30-35 |
HCDR2 | 56-65 | 50-65 | 50-58 | 52-56 | 47-58 |
HCDR3 | 105-117 | 95-102 | 95-102 | 95-102 | 93-101 |
LCDR1 | 27-38 | 24-34 | 24-34 | 24-34 | 30-36 |
LCDR2 | 56-65 | 50-56 | 50-56 | 50-56 | 46-55 |
LCDR3 | 105-117 | 89-97 | 89-97 | 89-97 | 89-96 |
备注:表中具体数字编号为依照对应的编号系统确认的CDR所对应的位点,例如第二排第二列的“27-38”是指IMGT编号系统的第27至第38位
另一方面,本公开实施例还提供了一种抗人GUCY2C抗体,所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中:
(b)所述抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ IDNo:11、SEQID No:12和SEQ ID No:13所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:14、SEQ ID No:5和SEQ ID No:15所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ IDNo:3所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQID No:4、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:23、SEQ IDNo:24和SEQ ID No:25所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:30所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:31、SEQ ID No:24和SEQ IDNo:32所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQID No:37、SEQ ID No:38和SEQ ID No:39所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:40、SEQ ID No:41和SEQ ID No:42所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:47、SEQ IDNo:48和SEQ ID No:49所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:50、SEQ ID No:51和SEQ ID No:52所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述抗体包含分别如SEQ ID No:11、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ IDNo:14、SEQ ID No:5和SEQ ID No:15所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中,所述抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:11、SEQ ID No:12和SEQ ID No:67所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:14、SEQ ID No:5和SEQ ID No:15所示的氨基酸序列。本公开的权利要求和说明书中,SEQ ID No:5的氨基酸序列(单字母氨基酸表示)为:AAS,SEQ ID No:24的氨基酸序列(单字母氨基酸表示)为:WAS,SEQ ID No:41的氨基酸序列(单字母氨基酸表示)为:STS,SEQ ID No:51的氨基酸序列(单字母氨基酸表示)为:YAS。
另一方面,本公开实施例还提供了一种抗人GUCY2C抗体,所述抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中:
(c)所述重链可变区包含与SEQ ID No:16、7、26、33、43、53、57、59或61具有至少80%同一性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性)的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含与SEQ ID No:18、9、28、35、45、55、58、60或62具有至少80%同一性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述重链可变区和轻链可变区包括如前任一项所述(a)或(b)所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中,所述重链可变区包含SEQ ID No:16的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:18的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:7的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:9的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQIDNo:26的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:28的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:33的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:35的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:43的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQID No:45的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:53的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:55的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述抗体包含如SEQ IDNo:16所示的重链可变区和如SEQ ID No:18所示的轻链可变区。在一些实施方案中,所述重链可变区包含SEQ ID No:61的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:62的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:57的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQID No:58的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:59的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:60的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:59的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:58的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQID No:61的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:60的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述抗体包含如SEQ ID No:61所示的重链可变区和如SEQ ID No:62所示的轻链可变区。
在本公开中,“框架区”或“FR”区是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域;框架区可以被进一步细分成被CDRs分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4),其中,重链框架区可以被进一步细分成被HCDR分隔开的毗邻区域,包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区;轻链框架区可以被进一步细分成被LCDR分隔开的毗邻区域,包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。重链可变区由以下编号的CDR与FR(从氨基末端排到羧基末端)排列连接获得:HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4;轻链可变区由以下编号的CDR与FR(从氨基末端排到羧基末端)排列连接获得:LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。在可选的实施方式中,前面任一项所述抗体包括SEQ ID No:7、16、26、33、43和53中的任一种所示的重链可变区中的重链框架区,和SEQ ID No:9、18、28、35、45和55中的任一种所示的轻链可变区中的轻链框架区。在可选的实施方式中,所述抗体的框架区氨基酸序列与上述框架区具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
术语“同一性”或“序列同一性”是指当对两条序列进行最佳比对时(必要时引入间隙,以获取最大序列同一性百分比,且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分),两条序列的氨基酸/核酸在等价位置相同的程度(也即百分比)。为测定序列同一性百分比,比对可以通过本领域技术人员所熟知的多种方式来实现,例如使用公知的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数,包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
在可选的实施方式中,前面任一项所述抗体还包含恒定区。在可选的实施方式中,所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。全长抗体轻链包括轻链可变区结构域VL及恒定区结构域CL,VL处于轻链的氨基末端,CL结构域处于羧基末端,轻链包括κ链及λ链;全长抗体重链包括重可变区结构域VH及恒定区CH,VH处于重链的氨基末端,CH结构域处于羧基末端。
在可选的实施方式中,所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区;所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中,所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种。
在可选的实施方式中,所述恒定区的种属来源为小鼠。在可选的实施方式中,所述重链恒定区优选为mIgG2a。
在可选的实施方式中,所述恒定区的种属来源为人。
在可选的实施方式中,所述重链恒定区包括与SEQ ID No:63具有至少80%同一性的氨基酸序列,和所述轻链恒定区包括与SEQ ID No:64具有至少80%同一性的氨基酸序列;在可选的实施方式中,所述恒定区序列可以与前面任一项所述恒定区具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
在可选的实施方式中,所述重链恒定区包括SEQ ID No:63的氨基酸序列,和所述轻链恒定区包括SEQ ID No:64的氨基酸序列;
在可选的实施方式中,所述抗人GUCY2C抗体重链包括与SEQ ID No:65具有至少80%(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)同一性的氨基酸序列,和轻链包括与SEQ ID No:66具有至少80%(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方式中,所述抗人GUCY2C抗体包括SEQ ID No:65的重链和SEQIDNo:66的轻链。
术语“嵌合”抗体指抗体中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生,而重链和/或轻链的剩余部分来自另外的不同来源或物种衍生的抗体
术语“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性同时在人体中具有较低免疫原性的抗体。例如,可以通过保留非人抗体的CDR区并用其人对应物(即,人抗体的重链可变区的框架区、轻链可变区的框架区和人抗体恒定区)替换抗体的其余部分来实现。
在可选的实施方式中,前面任一项所述的抗体,其为F(ab’)2、Fab’、Fab、scFab、dsFv、Fv和scFv中的任意一种的抗原结合片段。“F(ab’)2”包含在铰链区通过二硫键连接的两个F ab’片段的二价片段;“Fab’”包含部分铰链区的Fab片段;“Fab”是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;“scFab”是由VH,CH1,VL,CL和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头在N端至C端方向具有以下顺序之一:a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL;“dsFv”是二硫键稳定化的Fv片段;“Fv”由VH和VL组成;“scFv”是包含轻链可变区和重链可变区的融合蛋白,其中轻链可变区和重链可变区通过肽接头连接,能够表达为单链多肽,并且scFv具有其所源自的完整抗体的特异性,scFv可以以任何一种顺序具有VL和VH可变区,例如scFv多肽的N端至C端,可以包含:a)VL-接头-VH或b)VH-接头-VL。
“抗原结合片段”是完整抗体的部分,所述部分与完整抗体所结合的抗原特异性结合。本领域技术人员根据本公开记载的内容容易理解到,抗原结合片段可以通过本领域已知方法制备获得,例如,酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得,还可以通过重组遗传学技术或通过自动肽合成仪(如AppliedBioSystems的自动肽合成仪)合成获得。
另一方面,本公开实施例还提供了一种抗人GUCY2C抗体,所述抗体与前面任一项所述的抗人GUCY2C抗体竞争性结合人GUCY2C的抗体,或与前面任一项所述的抗人GUCY2C抗体结合相同表位。
术语“表位”指能够与抗体特异性结合的抗原上的区域。表位可以由连续氨基酸串形成(线性表位)或包含非连续氨基酸(构象表位),例如因抗原的折叠(即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠)而变成空间接近。构象表位和线性表位的差别在于:在变性溶剂的存在下,抗体对构象表位的结合丧失。表位包含处于独特空间构象的至少3个,至少4个,至少5个,至少6个,至少7个或更多个氨基酸。筛选结合特定表位的抗体(即那些结合相同表位的)可以使用本领域公知方法来进行,包括但不限于丙氨酸扫描,肽印迹,肽切割分析,表位切除,表位提取,抗原的化学修饰(见Prot.Sci.9(2000)487-496),和交叉阻断等等。
与参照抗体结合相同表位的抗体或与参照抗体竞争结合的抗体意指在竞争测定法中,将参照抗体对其抗原的结合阻断50%或更多的抗体,或其对抗原的结合被参照抗体阻断50%或更多的抗体。例如,为了测定待测抗体是否与参照抗体结合相同表位,在饱和条件下容许参照抗体结合抗原,然后在去除过量的参照抗体后,评估待测抗体结合抗原的能力;如果该待测抗体能够在参照抗体的饱和结合之后结合抗原,那么可以得出结论,该待测抗体与参照抗体结合不同表位;而如果该待测抗体在参照抗体的饱和结合之后不能够结合抗原,那么该待测抗体可结合与参照抗体结合相同的表位。为了确认待测抗体是否结合相同表位,可以使用常规实验(例如,肽突变和使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定的结合分析)检测。在一些实施方案中,如在竞争性结合测定中所测量的(参见例如,Junghans等,Cancer Res.50(1990)1495-1502),如果一个过量(例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍的量)的抗体将另一个抗体与抗原的结合抑制至少50%、至少75%、至少90%或甚至99%或更多,则认为两个抗体结合相同或重叠的表位。术语“特异性地结合”、“特异性结合”是指抗体以比针对其他抗原或表位更高的亲和力结合至某个抗原或该抗原内的表位。通常,抗体以约1×10-7M或更小(例如约1×10-8M或更小、约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小,或者约1×10-12M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或抗原内的表位。可使用常规程序来测量抗体的KD,例如通过表面等离子体共振测定法所测量的。
术语“抗人GUCY2C抗体”或“结合人GUCY2C抗体”是指能够以足够的亲和力结合人GUCY2C的抗体,使得该抗体可用作靶向人GUCY2C的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施例中,与人GUCY2C结合的抗体具有<约1μM、<约100nM、<约10nM、<约1nM、<约0.1nM、<约0.01nM或<约0.001nM(例如10-8M或更小、例如10-8M至10-12M、例如10-9M至10-10M)的解离常数(KD)。在某些实施例中,抗人GUCY2C抗体结合来自不同物种(例如猴)的GUCY2C中保守的GUCY2C表位。
在一些可选实施例中,前面任一项所述的抗人GUCY2C抗体,所述抗体具有以下特性中的至少一种:
A.能与人GUCY2C特异性结合;在一些可选实施例中,其能以≤1nM的EC50值与表达人GUCY2C的细胞结合,其中,所述EC50值通过流式细胞分析法测定;在一些可选实施例中,所述EC50值通过本公开的实施例2的方法测定;在一些可选实施例中,其能以≤1nM(例如≤1nM、≤0.1nM、<约0.5nM、≤0.02nM或更小)的KD值与表达人GUCY2C的细胞结合,其中,所述KD值通过Octet分子相互作用仪(ForteBio)检测;在一些可选实施例中,所述KD值通过本公开的实施例6的方法测定;
B.具有ADCC活性;在一些可选实施例中,所述ADCC活性通过本公开的实施例4的方法测定;
C.具有抑制肿瘤生长;在一些可选实施例中,所述抗体抑制肿瘤生长功能通过本公开的实施例7的方法测定;
D.对GUCY2C不具有阻断活性和/或不具有激活活性。在一些可选实施例中,所述抗体对GUCY2C的阻断活性和激活活性通过本公开的实施例3的方法测定。
术语“ADCC”是抗体依赖性细胞的细胞毒性或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。本领域技术人员为了评估目的分子的ADCC活性,可进行体内外ADCC测定(例如Clynes等人(PNASUSA 95:652-656(1998)、美国专利号US5500362、US5821337等所述)。在一些可选实施例中,所述ADCC通过本公开的实施例4方法进行检测。
另一方面,本公开实施例还提供了一种抗体偶联物,其包括如前任一项所述的抗人GUCY2C抗体。
在可选的实施方式中,所述抗体偶联物还包括与所述抗人GUCY2C抗体偶联的治疗剂或显像剂。在可选的实施方式中,所述抗体偶联物中,所述抗人GUCY2C抗体偶联与治疗剂偶联;在可选的实施方式中,所述治疗剂为细胞毒剂;在可选的实施方式中,所述治疗剂可选自毒素、化疗剂、抗生素、放射性同位素和核溶酶。本公开中,“细胞毒剂”是指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质;“毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的物质(例如美登素类、卡利奇霉素、紫杉烷类、长春新碱、秋水仙碱、澳瑞他汀等);“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。
在可选的实施方式中,所述抗体偶联物还包括与所述抗体偶联的生物素或生物素衍生物。在可选的实施方式中,所述抗体偶联物还包括与所述抗体偶联的标记物。
在可选的实施方式中,上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质,通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中,所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种。
在实际的使用过程中,本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择其它合适的标记物,无论使用何种标记物,均属于本公开的保护范围。
在可选的实施方式中,所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中,所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中,所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中,所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中,所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中,所述胶体包括但不限于胶体金属、胶体硒、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中,所述胶体金属包括但不限于胶体金或胶体银。
在可选的实施方式中,所述胶体金属为胶体金。
在可选的实施方式中,所述抗体偶联物还可包括与所述抗体偶联的固相载体。抗体偶联物中,所述抗体偶联至固相载体。
在可选的实施方式中,所述固相载体选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中,所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中,所述固相载体为硝酸纤维素膜。
另一方面,本公开实施例还提供了一种分离的核酸,其编码如前任一项所述的抗人GUCY2C抗体。在可选的实施方式中,编码所述抗体的重链可变区的核酸包含SEQ IDNo:17、SEQ ID No:8、SEQ ID No:27、SEQ ID No:34、SEQ ID No:44或SEQ ID No:54所示的核苷酸序列,编码所述抗体轻链可变区的核酸包含SEQ ID No:19、SEQ ID No:10、SEQ ID No:29、SEQ ID No:36、SEQ ID No:46或SEQ ID No:56所示的核苷酸序列。
另一方面,本公开实施例还提供了一种载体,其含有如前任一项所述的分离的核酸。本公开中,载体是能够转运与其连接的另一多核苷酸的构建体。表达载体是适用于对宿主细胞进行转化,且含有指导或控制与其连接的异源编码区的表达的核酸的载体,载体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其连接的编码区的RNA剪接的序列。在可选的实施方式中,所述载体是“质粒”,其是环状双链DNA环,其中可以连接附加的DNA区段。在可选的实施方式中,所述载体是病毒载体,例如腺相关病毒载体(AAV或AAV2),其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。在可选的实施方式中,载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制。在可选的实施方式中,载体可以在引入宿主细胞后,整合到宿主细胞的基因组中与宿主基因组一起复制。
另一方面,本公开实施例还提供了一种细胞,其含有如前任一项所述的分离的核酸或如前任一项所述的载体。在可选的实施方式中,所述细胞为宿主细胞,宿主细胞是已经导入外源核酸的细胞或其后代细胞。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代,而不考虑传代的次数,包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞包括原核和真核宿主细胞,其中真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞系植物细胞和真菌细胞。示例性的宿主细胞如下:NSO、SP2细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、3T3细胞和HEK-293细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如,Hep G2)、A549细胞、巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)。
另一方面,本公开实施例还提供了一种CAR或CAR-T细胞,所述CAR的抗原结合结构域为如前任一项所述的抗体。
本文中“CAR”为嵌合抗原受体,是人工改造受体,例如其是能够将识别肿瘤细胞表面抗原或病毒抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上,使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原并杀死肿瘤细胞或病毒的受体。通常,嵌合抗原受体依次包含抗原结合结构域、跨膜区域和胞内信号结构域。可采用本领域已知的用于构建CAR的跨膜区域和胞内信号结构域来构建本公开的嵌合抗原受体。
在可选的实施方式中,所述CAR为嵌合抗原受体,其主要成分还可以包括跨膜结构域和胞内结构域。
在可选的实施方式中,所述CAR还可以包括共刺激分子。“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面,能与Th细胞上的共刺激分子受体结合,产生协同刺激信号的分子。T淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合,还需要接受共刺激分子信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80、CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS,或者通过补体成分,或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。可采用本领域已知的用于构建CAR的共刺激分子,包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、B7-H3和/或它们的任何组合。
另一方面,本公开实施例还提供了一种试剂或试剂盒,其包括如前任一项所述的抗体或如前任一项所述的抗体偶联物。可选地,所述试剂还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药学上可接受的载体是指制剂中用于递送抗体等药物的无活性物质。药学上可接受的载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂、b稀释剂、防腐剂、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。
另一方面,本公开实施例还提供了一种检测鸟苷酸环化酶C的方法,其包括:将如前任一项所述的抗体或如前任一项所述的抗体偶联物或如前任一项所述的试剂或试剂盒与待检测样品混合,使所述抗体与待测样本中的鸟苷酸环化酶C接触,形成免疫复合物。在优选的实施方式中,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与所述抗体结合。在优选的实施方式中,所述免疫复合物还包括第二抗体,所述第二抗体与鸟苷酸环化酶C结合。
术语“样品”是指从受试者分离的类似流体、细胞、或组织的采集物,以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体,诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液,例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等,组织活检样本、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。
另一方面,本公开实施例还提供了如前任一项所述的抗体或如前任一项所述的抗体偶联物或如前任一项所述的试剂或试剂盒在检测鸟苷酸环化酶C或制备检测鸟苷酸环化酶C的产品中的应用。
另一方面,本公开实施例还提供了一种药物组合物,其包含如如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的核酸、如前任一项所述的细胞、或如前任一项所述的CAR或CAR-T细胞。在一些实施方案中,其还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
另一方面,本公开实施例还提供了如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的试剂或试剂盒、如前任一项所述的核酸、如前任一项所述的细胞、或如前任一项所述的CAR或CAR-T细胞、或如前任一项所述的药物组合物在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用:诊断或辅助诊断鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、治疗或辅助治疗鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、预测或辅助预测鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病的预后疗效、或检测人GUCY2C的表达。
另一方面,本公开实施例还提供了一种作为药物的如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的试剂或试剂盒、如前任一项所述的核酸、如前任一项所述的细胞、或如前任一项所述的CAR或CAR-T细胞、或如前任一项所述的药物组合物。在一些实施方案中,所述药物用于:诊断或辅助诊断鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、治疗或辅助治疗鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、预测或辅助预测鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病的预后疗效、或检测人GUCY2C的表达。
另一方面,本公开实施例还提供了一种诊断/治疗疾病方法,所述方法包括向有需要的个体施用诊断/治疗有效量的如前任一项所述抗人GUCY2C抗体、如前任一项所述的抗体偶联物、如前任一项所述的试剂或试剂盒、如前任一项所述的核酸、如前任一项所述的细胞、或如前任一项所述的CAR或CAR-T细胞、或如前任一项所述的药物组合物。在一些实施方案中,所述方法用于:诊断或辅助诊断鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、治疗或辅助治疗鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、预测或辅助预测鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病的预后疗效。在可选的实施方式中,所述治疗进一步包括向受试者施用治疗有效量的第二治疗剂。
在可选的实施方式中,前面任一项所述鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病可选自肿瘤,在一些实施方案中,其选自结直肠肿瘤、大肠癌、胃食管肿瘤及胰腺肿瘤中的至少一种。
在可选的实施方式中,前面任一项所述产品包括药物、试剂和试剂盒中的任意一种。
“施用”或“给予”,当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时,是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。
“有效量”是足以降低症状的严重程度或频率的量、或消除这些症状或潜在病因的量、或预防症状或其潜在病因出现的量、或改良或改善由疾病状态引起或与其相关的损伤的量。在一些实施例中,有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状,或者以其他方式阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的其他不理想症状的进展的量。“预防有效量”是当给予受试者时将具有预定预防效应,例如预防或延迟该疾病状态的发作(或复发),或者降低该疾病状态或相关症状的发作(或复发)可能性的量。
另一方面,本公开实施例还提供了一种制备如前任一项所述的抗体的方法,其包括:培养如前任一项所述的细胞步骤。还包括纯化回收抗体的步骤。
在本公开公开了抗体的氨基酸序列的基础上,本领域技术人员可以采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体,例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体,这对本领域技术人员来说是容易实现的,基于此,无论采用何种技术制备本公开的抗体,其均属于本公开的保护范围。
为使本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试,但现在描述一些方法和材料。除非另有说明,否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明,否则实践本公开将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术,所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术,如《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》,第二版(Sambrook等人,1989);《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.);《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994);以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,1991),所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本公开的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1.GUCY2C单克隆抗体的制备
制备GUCY2C ECD-His tag蛋白(人GUCY2C蛋白的胞外段C末端连接His标签(6个连续的组氨酸))作为免疫原,对Balb/c小鼠进行多次免疫。每周进行一次免疫,共5-7次。从第四次免疫后开始,每周取小鼠血清用以检测抗人GUCY2C抗体的血清效价。将小鼠血清倍比稀释后与过表达人GUCY2C的K562(人慢性髓系白血病细胞)细胞系(K562-hGUCY2C)及K562细胞系共同孵育,并通过PE标记的山羊抗小鼠Fc抗体(Biolegend)进行染色,通过流式细胞术检测血清效价。同时,将GUCY2C ECD-His tag蛋白包被至96孔板中,加入倍比稀释的血清孵育,随后加入HRP标记的山羊抗小鼠Fc抗体,通过ELISA检测血清效价。根据流式细胞术及ELISA的结果确定效价最高的小鼠,对小鼠进行安乐死,收集脾细胞,与SP20细胞系进行融合。将融合后的细胞铺入96孔板,待细胞长满后通过流式细胞术及ELISA检测细胞上清与K562-hGUCY2C的结合情况,挑选上清与K562-hGUCY2C结合较强的细胞进行单克隆化,待单克隆细胞长满后,通过流式细胞术检测细胞上清中的抗体与K562-hGUCY2C及K562细胞系的结合情况。
挑选出与K562-hGUCY2C结合活性强、且不与K562细胞系结合的上清的单克隆细胞用以扩大培养。一周后收集上清,对上清中的抗体进行纯化。
实施例2.GUCY2C单克隆抗体的结合活性检测
对K562-hGUCY2C细胞、K562-cynoGUCY2C细胞(过表达猴GUCY2C的K562细胞)、K562细胞进行计数,调整密度至2E6/ml,加入100μL/孔细胞悬液至96孔板中,400×g离心5分钟,弃上清。配置浓度为200nM的杂交瘤纯化抗体和阴性对照抗体R0512(无关靶点的同型mIgG抗体),并进行3倍梯度稀释。用100μL稀释好的杂交瘤纯化抗体重悬细胞,4℃孵育30分钟。用PBS洗涤2次后,加入100μl按1:500稀释的PE标记的山羊抗小鼠Fc抗体重悬细胞,4℃孵育30分钟。用PBS洗涤1次后,加入100μL/孔PBS重悬细胞,通过流式细胞术分析PE荧光强度。
挑选活性较好的6株杂交瘤纯化抗体:F021-36、F021-3、F021-15、F021-18、F021-43及F021-14抗体,所述抗体与K562-hGUCY2C的结合检测实验结果见图1和表2,所述抗体与K562-cyno GUCY2C的结合检测结果见图2所示,所述抗体与K562细胞系的结合检测结果如图3所示。
表2.杂交瘤纯化抗体与K562-hGUCY2C的结合检测结果
杂交瘤纯化的抗体 | EC50(nM) |
F021-43 | 0.142 |
F021-36 | 0.646 |
F021-15 | 0.515 |
F021-18 | 0.554 |
F021-3 | 0.933 |
F021-14 | 0.447 |
实验结果表明,本公开筛选出的F021-36、F021-3、F021-15、F021-18、F021-43及F021-14抗体与K562-hGUCY2C均具有较强的结合活性,且均能与猴GUCY2C结合,但均不与K562细胞结合。
实施例3.抗GUCY2C抗体的阻断/激活活性检测
T84(人结肠直肠癌细胞系,ATCC)细胞系为天然表达GUCY2C的结直肠癌细胞系。通过R&D Systems公司的cGMP Parameter Assay Kit检测抗GUCY2C抗体对GUCY2C的阻断及激活活性。具体步骤如下:
首先,按2E6/500μL/孔的密度将T84细胞在24孔板中铺板过夜。用含有15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲剂(HEPES)的DMEM洗涤细胞一次,并用含有15mM HEPES和1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的DMEM 400mL处理20分钟,吸弃上清。检测抗体阻断活性时,加入配体STp 0.1μM,同时加入抗体50μg/ml,刺激45min,取上清至离心管中,1000×g离心5min,取上清进行cGMP检测。检测抗体激活活性时,加入抗体50μg/ml,刺激45min,取上清至离心管中,1000×g离心5min,取上清进行cGMP检测。
抗GUCY2C抗体对GUCY2C的阻断活性实验结果如图4所示,抗GUCY2C抗体对GUCY2C的激活活性实验结果如图5所示。实验结果表明,本公开所筛选得到的杂交瘤纯化抗体均不具有GUCY2C的激活活性,也不具有GUCY2C的阻断活性,因此在人体内给药时不会影响GUCY2C的正常生理功能,具有更好的安全性。
实施例4.抗GUCY2C抗体的ADCC活性实验
本实施例通过NK-92mCD16系统(NK-92,人恶性非霍奇金淋巴瘤患者NK细胞,北纳生物)对抗GUCY2C抗体的ADCC活性进行评估。用CFSE对Jurkat-hGUCY2C细胞(表达hGUCY2C的Jurkat细胞,Jurkat(人外周血白血病T细胞系,ATCC))进行染色。按2E4/孔的密度将Jurkat-hGUCY2C细胞加入96孔板中。按1E5/孔的密度将NK-92mCD16细胞加入96孔板中,随后加入GUCY2C单克隆抗体,37度孵育6小时。取出96孔板加入PI染色,通过流式细胞术检测CSFE及PI荧光,计算PI、CFSE双阳性的细胞在CFSE阳性细胞群中的比例,即为细胞杀伤率。
实验过程中,以R0859(无关靶点的同型mIgG抗体)作为同型对照。实验结果见图6所示,本公开的抗人GUCY2C抗体均具有良好的ADCC活性。
实施例5.抗GUCY2C抗体的基因调取及重组抗体的制备
对F021-36、F021-15、F021-18、F021-3、F021-43及F021-14抗体,测定其对应的序列,抗GUCY2C抗体序列见表3和表4。将F021-36、F021-15、F021-18、F021-3、F021-43及F021-14杂交瘤抗体的Fc替换为小鼠mIgG2a Fc并克隆至pCDNA3.4A表达质粒中,将质粒转染至EXPI293细胞系中,7天后收取上清,经protein A纯化后得到重组抗体,重组抗体分别命名为R1325、R1323、R1324、R1322、R0985及R0981。
小鼠IgG2a Fc的氨基酸序列:AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK。
表3.抗人GUCY2C抗体可变区序列表
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表4.抗人GUCY2C抗体CDRs氨基酸序列表
备注:上述表4中,其中所述抗人GUCY2C抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据IMGT编码系统确认。
实施例6.重组抗体体外活性分析
分别检测mIgG2a亚型的重组抗体与K562-hGUCY2C、LS1034(人结肠直肠癌细胞系,ATCC)及T84的结合活性。实验方法同前述实施例2,mIgG2a亚型的重组抗体与K562-hGUCY2C、LS1034及T84的结合活性结果如图7-9所示,重组抗体均展现出了较好的结合活性。
通过NK-92mCD16系统检测mIgG2a亚型的重组抗体的ADCC活性,实验方法同前述实施例4,以R0860(无关靶点的同型mIgG2a抗体)作为同型对照。实验结果如图10所示,重组抗体均展现出了较强的ADCC活性。
通过Octet分子相互作用仪(ForteBio)检测重组抗体的亲和力。方法:将OctetHIS1KBiosensor(SARTORIUS)浸入至固化溶液中捕获GUCY2C ECD-His tag,随后浸入至PBST中检测基线水平,再分别浸入至不同浓度的待测抗体溶液中结合240秒,然后浸入至PBST中解离300秒。将结合和解离曲线与1:1结合模型拟合,,计算每种抗体的kon/kdis/KD值。实验结果如下表5所示,重组抗体均展现出了较强的亲和力。
表5.重组抗体的亲和力检测实验结果
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实施例7.重组抗体体内活性分析
通过慢病毒系统构建过表达人GUCY2C的小鼠结肠癌MC38单克隆细胞系即MC38-hGUCY2C。将MC38-hGUCY2C接种至野生型C57小鼠(C57小鼠购自浙江维通利华实验动物技术有限公司)体内,构建肿瘤模型。待肿瘤长至平均大小达100mm3时,将重组抗体进行静脉注射给药。给药剂量为10mg/kg,一周2次,共给药4次(第4、8、11和第14天分别给药一次,共给药4次)。每周测量两次小鼠肿瘤体积,按照肿瘤体积=(肿瘤长径×肿瘤短径2)/2计算。肿瘤接种29天后,计算小鼠肿瘤抑制率,按公式计算:[1-(治疗组给药后肿瘤体积-治疗组给药前肿瘤体积)/(对照组给药后肿瘤体积-对照组给药前肿瘤体积)]×100%。
实验结果见表6及附图11-12所示,本公开构建的重组抗体在体内均有显著的抗肿瘤作用。
表6.重组抗体体内抑制肿瘤实验结果
给药方案 | 平均体积(mm3) | 肿瘤抑制率(%) | P值(VS R0860) |
R0860,10mg/kg | 1381.86 | -- | -- |
R0981,10mg/kg | 472.17 | 69.5 | <0.05 |
R0985,10mg/kg | 172.21 | 92.4 | <0.05 |
R1322,10mg/kg | 330.40 | 80.4 | <0.05 |
R1323,10mg/kg | 47.19 | 102.0 | <0.05 |
R1324,10mg/kg | 82.35 | 99.3 | <0.05 |
R1325,10mg/kg | 355.20 | 78.5 | <0.05 |
实施例8.抗体人源化设计
结合重组抗体的体外活性数据和体内药效数据,挑选R0985进行人源化设计。人源化设计采用“CDR移植”的方法进行,即将小鼠的VH的CDR移植到人抗体VH的框架区,将小鼠的VL的CDR移植到人抗体的VL的框架区。R0985的轻链人源化设计使用IGKV7-3*01及IGKV4-1*01两个胚系基因作为人源化模板框架结构,重链人源化设计使用IGHV3-7*01及IGHV3-30*15两个胚系基因作为人源化模板框架结构,在生成对应的人源化序列之后对关键氨基酸进行逐个检查,并对重要差异残基进行突变,生成最终的人源化可变区序列(重链可变区序列:SEQ ID No.57、59、61;轻链可变区序列:SEQ ID No.58、60、62,其中重链可变区SEQID No.57的HCDR3的第一位氨基酸残基由原G突变为了A,形成新的序列ARHDQNDRYFDV(SEQID No.67))。构建的人源化抗体R1535、R1538、R1540、R1550、R1552的氨基酸序列如下:
表7.抗人GUCY2C人源化抗体可变区序列表
备注:表7中,下划线部分为根据IMGT编码系统确认的CDRs序列部分
人源化抗体的重链恒定区序列(SEQ ID No.63):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人源化抗体的轻链恒定区序列(SEQ ID No.64):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
将表7人源化抗体R1535、R1538、R1540、R1550、R1552的重链可变区分别与人源化抗体的重链恒定区序列(SEQ ID No.63)直接连接,轻链可变区分别与人源化抗体的轻链恒定区序列(SEQ ID No.64)直接连接,从而获得人源化抗体R1535、R1538、R1540、R1550、R1552的全长序列,示例性地,R1550的全长氨基酸序列为:
R1550重链氨基酸序列(SEQ ID No.65):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISTGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNILYLQMNSLRAEDTAIYYCGRHDQNDRYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
R1550轻链氨基酸序列(SEQ ID No.66):
DIVLTQSPASLAVSPGQRATISCRASESVEYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASIVESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEADDTANYFCHQSRNFYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例9.人源化抗体体外活性检测
对实施例8人源化抗体进行表达纯化,获得R1535,R1538,R1540,R1550,R1552人源化抗体,另外,将人的轻链恒定区(Kappa亚型)与重链恒定区(hIgG1亚型)替换R0985的小鼠轻链恒定区与重链恒定区,获得人鼠嵌合抗体R1039作为母本对照。
1.检测人源化抗体与K562-hGUCY2C细胞、K562-cynoGUCY2C细胞、LS1034细胞的结合活性。实验方法同实施例2。人源化抗体与K562-hGUCY2C细胞的结合实验结果见附图13所示,与K562-cynoGUCY2C细胞的结合实验结果见附图14所示,与LS1034细胞的结合实验结果见附图15所示,实验结果显示,本公开的人源化抗体与表达GUCY2C的细胞具有较好的结合活性。
2.检测人源化抗体对GUCY2C的激动活性及阻断活性。实验方法同实施例3。实验结果见附图16,17,实验结果表明,R1538,R1540,R1550同母抗体R1039一致,均为非激动型,非阻断型抗体。
3.通过荧光素酶报告基因系统评估人源化抗体的ADCC杀伤能力。以K562-hGUCY2C为靶细胞,调整浓度至5E5个/ml,按50μL/孔加入96孔板。以Jurkat-Lucia-NFAT-CD16为效应细胞,调整浓度至3E6个/ml,按50μL/孔加入96孔板。调整人源化抗体浓度至50μg/ml,10倍梯度稀释,按100μL/孔加入96孔板。37℃孵育15小时后,将细胞吹匀,取出100μL至96孔白色平底板,再加入100μL Bright-LumiTM萤火虫萤光素酶检测试剂(碧云天,RG051M)水平震荡仪上震荡5分钟。在酶标仪中使用化学发光模块读数。根据结果绘制杀伤曲线。实验结果见附图18所示,实验结果显示,R1538,R1540,R1550均能有效激活CD16受体,传递ADCC活化信号。
实施例10.人源化抗体体内药效分析
以R0861为同型对照,评估R1538,R1540,R1550的体内药效。实验方法同实施例7,肿瘤接种31天(D31)后计算小鼠肿瘤抑制率。实验结果见表8及附图19、20。实验结果显示,本公开的人源化抗体具有良好的抗肿瘤作用,尤其是R1550,其在体内抗肿瘤作用更为显著。
表8.人源化抗体体内药效实验结果(D31)
以上所述仅为本公开的优选实施例而已,并不用于限制本公开,对于本领域的技术人员来说,本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种抗人GUCY2C抗体,所述抗体包含重链可变区和轻链可变区,其特征在于:其选自(a)~(c)中的任一项;
(a)所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:16、7、26、33、43、53、57、59或61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:18、9、28、35、45、55、58、60或62中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;可选地,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3由IMGT编号系统定义,或由Kabat编号系统定义,或由Chothia编号系统定义,或由Contact编号系统定义,或由AbM编号系统定义;可选地,所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:16中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:18中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:7中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:9中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:26中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ IDNo:28中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:33中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:35中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:43中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:45中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:53中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQIDNo:55中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:57中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:58中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:59中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:60中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:59中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ IDNo:58中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:62中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或者所述抗体的重链可变区包括SEQ ID No:61中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且所述抗体的轻链可变区包括SEQ ID No:60中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
(b)所述抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ IDNo:11、SEQ IDNo:12和SEQ ID No:13所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:14、SEQ ID No:5和SEQ ID No:15所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ IDNo:3所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQID No:4、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:22所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:23、SEQ IDNo:24和SEQ ID No:25所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:20、SEQ ID No:21和SEQ ID No:30所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:31、SEQ ID No:24和SEQ IDNo:32所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQID No:37、SEQ ID No:38和SEQ ID No:39所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:40、SEQ ID No:41和SEQ ID No:42所示的氨基酸序列;或所述抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:47、SEQ IDNo:48和SEQ ID No:49所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ IDNo:50、SEQ ID No:51和SEQ ID No:52所示的氨基酸序列;或者所述抗体的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包括如SEQ ID No:11、SEQ ID No:12和SEQ ID No:67所示的氨基酸序列,并且所述抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包括如SEQ ID No:14、SEQ ID No:5和SEQ ID No:15所示的氨基酸序列;可选地,所述抗体包含分别如SEQ ID No:11、SEQ ID No:12、SEQ ID No:13、SEQ ID No:14、SEQ ID No:5和SEQID No:15所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3;
(c)所述重链可变区包含与SEQ ID No:16、7、26、33、43、53、57、59或61具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含与SEQ ID No:18、9、28、35、45、55、58、60或62具有至少80%同一性的氨基酸序列;可选地,所述重链可变区和轻链可变区包括(a)或(b)所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3;可选地,所述重链可变区包含SEQ IDNo:61的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:62的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:57的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:58的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:59的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ IDNo:60的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:59的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:58的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:61的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:60的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ IDNo:16的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:18的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:7的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:9的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:26的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ IDNo:28的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:33的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:35的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ IDNo:43的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:45的氨基酸序列;或所述重链可变区包含SEQ ID No:53的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含SEQ ID No:55的氨基酸序列;可选地,所述抗体包含如SEQ ID No:61所示的重链可变区和如SEQ IDNo:62所示的轻链可变区;或者所述抗体包含如SEQ ID No:16所示的重链可变区和如SEQ ID No:18所示的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的抗人GUCY2C抗体,其特征在于,所述抗体还包含恒定区;
可选地,所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区;
可选地,所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中任一项的重链恒定区;所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区;
可选地,所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅和人中的任意一种;
可选地,所述恒定区的种属来源为小鼠;所述重链恒定区优选为mIgG2a;
可选地,所述重链恒定区包括与SEQ ID No:63具有至少80%同一性的氨基酸序列,和所述轻链恒定区包括与SEQ ID No:64具有至少80%同一性的氨基酸序列;
可选地,所述抗人GUCY2C抗体重链包括与SEQ ID No:65具有至少80%同一性的氨基酸序列,和轻链包括与SEQ ID No:66具有至少80%同一性的氨基酸序列;
可选地,所述抗人GUCY2C抗体包括SEQ ID No:65的重链和SEQ ID No:66的轻链。
3.根据权利要求1所述的抗人GUCY2C抗体,其特征在于,所述抗体为F(ab’)2、Fab’、Fab、scFab、dsFv、Fv和scFv中的任意一种的抗原结合片段。
4.与权利要求1至3任一项所述的抗体竞争性结合人GUCY2C的抗体,或与权利要求1至3任一项所述的抗人GUCY2C抗体结合相同表位的抗体。
5.根据权利要求1至4任一项所述的抗人GUCY2C抗体,其特征在于,其中所述抗体具有以下特性中的至少一种:
A.能与人GUCY2C结合;可选地,其能以≤1nM的EC50值与表达人GUCY2C的细胞结合,其中,所述EC50值通过流式细胞分析法测定;
B.具有ADCC活性;
C.具有抑制肿瘤生长功能;
D.对GUCY2C不具有阻断活性和/或不具有激活活性。
6.一种抗体偶联物,其特征在于,其包括权利要求1至5任一项所述的抗人GUCY2C抗体;
可选地,所述抗体偶联物还包括与所述抗体偶联的治疗剂或显像剂;
可选地,所述抗体偶联物还包括与所述抗体偶联的生物素或生物素衍生物;
可选地,所述抗体偶联物还包括与所述抗体偶联的固相载体;
可选地,所述抗体偶联物还包括与所述抗体偶联的标记物;可选地,所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种;可选地,所述标记物为胶体金。
7.一种试剂或试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1至5任一项所述的抗人GUCY2C抗体或权利要求6所述的抗体偶联物;可选地,所述试剂或试剂盒还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
8.一种分离的核酸,其特征在于,其编码权利要求1至5任一项所述的抗人GUCY2C抗体;可选地,编码所述抗人GUCY2C抗体的重链可变区的核酸包含SEQ ID No:17、SEQ ID No:8、SEQ ID No:27、SEQ ID No:34、SEQ ID No:44或SEQ ID No:54所示的核苷酸序列,编码所述抗人GUCY2C抗体的轻链可变区的核酸包含SEQ ID No:19、SEQ IDNo:10、SEQ ID No:29、SEQID No:36、SEQ ID No:46或SEQ ID No:56所示的核苷酸序列。
9.一种载体,其特征在于,其含有权利要求8所述的核酸。
10.一种细胞,其特征在于,其含有权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体。
11.一种CAR或CAR-T细胞,其特征在于,所述CAR的抗原结合结构域包括如权利要求1至5任一项所述的抗人GUCY2C抗体。
12.一种药物组合物,其包含:权利要求1至5任一项所述的抗人GUCY2C抗体、权利要求6所述的抗体偶联物、权利要求8所述的核酸、权利要求10所述的细胞、或权利要求11所述的CAR或CAR-T细胞,可选地,其还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
13.如权利要求1至5任一项所述的抗人GUCY2C抗体、如权利要求6所述的抗体偶联物、如权利要求7所述的试剂或试剂盒、如权利要求8所述的核酸、如权利要求10所述的细胞、如权利要求11所述的CAR或CAR-T细胞、或如权利要求12所述的药物组合物,在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用:诊断或辅助诊断鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、治疗或辅助治疗鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病、预测或辅助预测鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病的预后疗效、或检测人GUCY2C的表达;
可选地,所述鸟苷酸环化酶C表达异常的相关疾病为肿瘤;可选地,所述肿瘤选自结直肠肿瘤、大肠肿瘤、胃肿瘤、食管肿瘤、胃食管肿瘤及胰腺肿瘤中的至少一种。
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