ES2973518T3 - Anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47 - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno carcinoembrionario humano CEACAM5 y CD47 humano, polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos biespecíficos y vectores y células huésped que comprenden dichos polinucleótidos. La invención proporciona además métodos para seleccionar y producir tales anticuerpos y métodos para usar dichos anticuerpos en el tratamiento de enfermedades en monoterapia así como en combinación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos biespecíficos contra CEACAM5 y CD47
REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS
El contenido del listado de secuencias presentado electrónicamente ("4130_002PC08_SeqUsting_ST25.txt", 122.709 bytes, creado el 31 de mayo de 2019) se presentó con la solicitud.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno carcinoembrionario humano CEACAM5 (CEA) y CD47 humano (anticuerpos biespecíficos CEAxCD47). Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos biespecíficos y a vectores y células hospedadoras que comprenden dichos polinucleótidos. La invención se refiere además a métodos de selección y producción de dichos anticuerpos y a dichos anticuerpos para su uso en el tratamiento de enfermedades. La invención también se refiere a los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 para el uso terapéutico en monoterapia y en terapia de combinación, especialmente con anticuerpos biespecíficos de linfocitos T (TCB) CEAxCD3 y/o inhibidores de PD-1 o PD-L1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La familia de CEA humano contiene 29 genes, de los cuales se expresan 18: 7 que pertenecen al subgrupo de CEA y 11 al subgrupo de la glucoproteína específica del embarazo. Se cree que varios miembros de subgrupos de CEA poseen propiedades de adherencia celular. Se cree que CEA tiene una función en la inmunidad innata (Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). El antígeno carcinoembrionario (CEA, CEACAM5 o CD66e; UniProtKB -P06731) es un miembro de la familia de las moléculas de adhesión a células relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM) y un antígeno asociado al tumor (Gold y Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). CEACAM6 (CD66c; UniProtKB - P40199) también pertenece a la familia de antígenos carcinoembrionarios (CEA). Se han producido múltiples anticuerpos monoclonales contra CEA para fines de investigación, como herramientas diagnósticas y para fines terapéuticos (véase, por ejemplo, el documento de patente WO2012117002, véase también el Ejemplo 8 f)). El CEA soluble -también llamado en la presente solicitud CEA o sCEA eliminado- es un marcador tumoral establecido. Los niveles en plasma de pacientes con cáncer pueden ir en algunos casos a más de 1000 ng/ml, mientras que las concentraciones plasmáticas en individuos sanos son inferiores a 10 ng/ml (por ejemplo, Sandler B. et al., Anticancer Res 1999, 19(5B), 4229-33). Hao C., Zhang G. y L. en Progress in Molecular Biology and Translational Science (2019) informan que las concentraciones plasmáticas de CEA entre 100 y 250 ng/ml se pueden encontrar en un % significativo de pacientes con cáncer pancreático, cáncer de colon y recto, cáncer de pulmón y cáncer gástrico. Dichos altos niveles se observan especialmente cuando estos cánceres están localmente avanzados y/o son metastásicos. Según Wanebo et al., New Eng. J. Med. (1978), el 21 % de los cánceres de colon recurrentes/metastáticos tienen sCEA por encima de 100 ng/ml. Hohenberger et al., Annals Surgery (1994) informan en pacientes colorrectales, estadio 4 de Duke y metástasis hepática, que el 26 % de los pacientes tienen sCEA por encima de 50 ng/ml. Jurgensmerier et al., Br. J. Cancer (2013) informan en estudios bastante grandes con varios cientos de pacientes que padecen cáncer colorrectal metastásico sCEA por encima de 225 ng/ml en 24 % respectivamente 25 % de estos pacientes. El CEA soluble puede competir con anticuerpos anti-CEA terapéuticos para unirse al CEA en las células tumorales causando potencialmente una disminución de la eficacia del anticuerpo anti-CEA. Esto se puede evitar en la mayoría de los pacientes con cáncer, por ejemplo, pacientes con cáncer colorrectal, usando anticuerpos anti-CEA con reactividad cruzada limitada a CEA soluble de hasta concentraciones plasmáticas de sCEA de 100 a 250 ng/ml
El anticuerpo monoclonal de ratón PR1A3 se obtuvo por fusión de células de mieloma NS1 (P3/NS 1/I-Ag-4-1) con células del bazo de ratones inmunizados con epitelio colorrectal normal Richman P. I. y Bodmer W. F., Int. J. Cancer, 39:317-328, 1987 describen el anticuerpo monoclonal de ratón PR1A3. El mapeo de epítopos de PR1 A3 muestra que el anticuerpo se dirige al dominio B3 y al anclaje GPI de la molécula CEA (Durbin H. et al., Proc. Natl. Scad. Sci.<u>S<a>, 91 :4313-4317, 1994). Por consiguiente, el anticuerpo PR1A3 se une principalmente al CEA unido a la membrana, y no a la forma de CEA soluble que puede encontrarse en el torrente sanguíneo de los pacientes con cáncer. El epítopo unido por PRl A3 es un epítopo conformacional, no un epítopo lineal (Stewart et al., Cancer Immunol Immunother, 47 (1999) 299-06). Los anticuerpos PRl A3 humanizados (hPRl A3) se describen, por ejemplo, en Conaghhan P. J., et al., Br. J. Cancer, 98 (2008)1217-1225 y el documento de patente WO2012117002.
Un método de tratamiento del cáncer mediante una combinación de un antagonista del eje PD-1 humano y un anticuerpo biespecífico anti-CEA/anti-CD3 se menciona en los documentos de patente US20140242079 y WO2017118657 y los resultados clínicos se han publicado en la conferencia ASCO 2017 (Tabernero et al, J Clin Oncol 35, 2017 (supl; resumen 3002)). En el documento de patente WO2015112534 se menciona un método de tratamiento de tumores mediante la administración de antagonistas del punto de control inmunitario que se unen a dos o más dianas diferentes de una vía del punto de control inmunitario, y un agente de redirección de linfocitos T que se une a CEA y a un antígeno de superficie de linfocitos T. Un conjugado que consiste en un anticuerpo anti-CEACAM6 de dominio único y ureasa se encuentra actualmente en ensayos clínicos (NCT02309892; documento de patente WO2016116907). En el documento de patente US20110064653 se menciona un anticuerpo de clase I que se une a CEACAM5, CEACAM6 y granulocitos.
Un anticuerpo anti-CD3£ descrito en el estado de la técnica es SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 reacciona tanto con CD3 de primate como con CD3 humano. SP34 está disponible de BD Biosciences. Otro anticuerpo anti-CD3 descrito en el estado de la técnica es UCHT-1 (véase el documento de patente WO2000041474). Otro anticuerpo anti-CD3 descrito en el estado de la técnica es BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; usado en ensayos de fase VII de GvHD, Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 difiere de UCHT-1 y BC-3 en que SP-34 reconoce un epítopo presente únicamente en la cadena £ de CD3 (véase Salmeron et al., (1991) J. Immunol. 147: 3047) mientras que UCHT-1 y BC-3 reconocen un epítopo aportado tanto por las cadenas £ como y. Los anticuerpos anti-CD3 también se describen en los documentos de patente WO2007042261, WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010037837, WO2010037838 y US8236308 En el documento US20140242079A1 se describe un anticuerpo biespecífico que comprende una parte de unión específica por CEA y una parte de unión específica por CD3£.
CD47 humano (UniProtKB - Q08722 (CD47_HUMAN; IAP) es una proteína transmembranaria que se une a los ligandos trombospondina-1 (TSP-1) y proteína reguladora de señales alfa (SIRPa; CD172a; UniProtKB P78324) y puede actuar como señal de "no me comas" para el sistema inmunitario, especialmente para los macrófagos. El CD47 está involucrado en una diversidad de procesos celulares, incluida la apoptosis, la proliferación, la adhesión y la migración. Además, desempeña un papel clave en las respuestas inmunitarias y angiogénicas. CD47 se sobreexpresa en diferentes células tumorales. En el estado de la técnica se describen anticuerpos contra CD47 y algunos se encuentran en ensayos clínicos como agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores (Weiskopf K. European Journal of Cancer 76 (2017) 100-109; Huang Y et al., J Thorac Dis 2017;9(2):E168-E174. Los anticuerpos de la subclase IgG1 que se unen a CD47 pueden provocar el agotamiento de plaquetas y la reducción de glóbulos rojos RBC de hemoglobina de manera dependiente de Fc (véase, por ejemplo, el documento de patente US20140140989). Para evitar este efecto adverso, en el documento de patente WO2017196793 se describe una forma mutante de la subclase IgG4 de un anticuerpo anti-CD47 (IgG4PE, con la mutación S228P, así como una mutación L235E para reducir la unión a FcyR). Dicho anticuerpo anti-CD47 con unión a FcyR y función efectora muy reducidas no da como resultado dicho agotamiento de plaquetas. Un anticuerpo biespecífico de dominio único contra CD47 y CD20 fue descrito por von Bommel PE et al., Oncoimmunol. 7 (2018) e386361 y Piccione EC et al. mAbs 7 (2015)946-956. Dheilly E. et al., Mol. Thera. 25 (2017) 523-533 (véase también el documento de patente WO2014087248) describen un anticuerpo biespecífico contra CD19 y CD47. En el documento WO2014087248 se describe un anticuerpo biespecífico contra CD19 y CD47 que comprende una cadena pesada común de SEQ ID NO:5 y un dominio ligero variable VL de SEQ ID NO:10. El documento de patente WO2018098384 se refiere a una molécula biespecífica que comprende Fab contra CEACAM5 y CD47
FcRI humano (CD64) está restringido a monocitos/macrófagos y células dendríticas (DC) y se expresa induciblemente en neutrófilos y mastocitos; hFc RIIA (CD32A) se expresa en todas las células mieloides pero no en linfocitos; hFc RIIB (CD32B) se expresa altamente únicamente en linfocitos B circulantes y basófilos (L. Cassard, F. Joensson, S. Arnaud, M. Daeron, J. Immunol. 189) (2012(2995-3006), poco expresado en 20% de los monocitos y 4 % de los neutrófilos, y expresado en macrófagos tisulares y DC, pero no en mastocitos, hFc RIIC (CD32C) se expresa en células NK, monocitos y neutrófilos. hFc RIIIA (CD16A) se expresa en células NK y monocitos/macrófagos; hFcRIIIB CD16B) se expresa en neutrófilos y, como se ha demostrado recientemente, en subconjuntos de basófilos. Estos patrones de expresión ponen de relieve que hFc RIIA es el único receptor IgG activador expresado constitutivamente por mastocitos, basófilos, neutrófilos y eosinófilos (Bruhns P., Blood 119 (2012) 5640). Las actividades biológicas de cada subclase de IgG son poco conocidas. Los receptores de IgG (F<cy>R) son sorprendentemente numerosos en los seres humanos. Comprenden receptores de alta afinidad y baja afinidad. Tanto los FcyR de alta afinidad como los de baja afinidad se unen a complejos inmunitarios de IgG con gran avidez, pero únicamente los F<cy>R de alta afinidad se unen a IgG monomérica. En los seres humanos existe un receptor IgG de alta afinidad, el hFcYRI (CD64), y dos familias de receptores de IgG de baja afinidad, hFcY RIIA, IIB y IIC (CD32), y hFcYRIIIA y IIIB (CD16). hFcYRI y hFcYRIIIA son receptores activadores asociados a F<cy>R, hFcYRIIA y hFcYRIIC son receptores activadores de un solo dominio, hFcYRIIB son receptores inhibidores de un solo dominio y hFcYRIIIB son receptores anclados a GPI cuya función es incierta (Bruhns P. Blood 113 (2009) 3716). Varios grupos de investigación han demostrado que los anticuerpos que carecen de la 1,6-fucosa en la glucosilación de su cadena pesada tienen una mayor afinidad de unión al receptor F<cy>RIII y una mayor actividad de ADCC (Shields, R. L., et al., (2002) J Biol. Chem. 277, 26733-26740.; (2002) J Biol. Chem. 8, 8). Además, se ha establecido una correlación entre la afinidad de unión al receptor FcyRIII y la actividad de ADCC (Okazaki, A., et al., (2004) J Mol. Biol. 336, 1239-1249; Dall'Ozzo, 2004). Una molécula de IgG porta dos oligosacáridos unidos a N en su región Fc, uno en cada cadena pesada. Como cualquier glucoproteína, un anticuerpo se produce como una población de glucoformas que comparten el mismo esqueleto polipeptídico pero tienen diferentes oligosacáridos unidos a los sitios de glucosilación. Los oligosacáridos que se encuentran normalmente en la región Fc de la IgG sérica son de tipo biantenario complejo (Wormald et al., Biochemistry 36: 130-38 (1997), con un bajo nivel de ácido siálico terminal y N-acetilglucosamina bisectante (GlcNAc), y un grado variable de galactosilación terminal y fucosilación del núcleo. Algunos estudios sugieren que la estructura mínima de carbohidratos necesaria para la unión del FcyR se encuentra en el núcleo del oligosacárido. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). Los anticuerpos con un contenido reducido de fucosa en los restos de glucano presentan una mayor actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en comparación con un anticuerpo normalmente fucosilado (Niwa R et al., Cancer Res, 64, 2127-33, 2004). El mecanismo que subyace a la ADCC mejorada de un anticuerpo bajo en / sin fucosa es su mayor afinidad por FcyRIIIa (CD16). En los documentos US6946292, US7425446, US8067232 y en http://www.potelligent.com se describe una línea celular con atenuación de ambos alelos del gen responsable de la adición de fucosa (a1,6-fucosiltransferasa; FUT8).
La sobreexpresión en células de ovario de hámster chino (CHO) de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos bisecados, aumenta significativamente la actividad de ADCC in vitro de los anticuerpos producidos por las células CHO modificadas. (Umaña, P. et al., Nature Biotechnol.
17:176-180 (1999), documentos de patente WO199954342, US20030175884. Las mutaciones dentro del dominio Fc también pueden alterar las propiedades de unión del dominio Fc a los diferentes receptores Fc (documentos de patente WO2004063351, WO2004099249; WO2005018669, WO2005063815, WO2005110474, WO2005056759, WO2005092925, WO2005018572, WO2006019447, WO2006116260, WO2006023420, WO2006047350, WO2006085967, WO2006105338, WO2007021841, WO2007008943, WO2007024249, WO2007041635, WO2007048077, WO2007044616, WO2007106707, WO2008022152, WO2008140603, WO2008036688, WO2008091798, WO2008091954, WO2008092117, WO2008098115, WO2008121160, WO2008150494, WO2010033736, WO2014113510.
Se han logrado avances considerables en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas. Esto contrasta con la progresión lograda en el tratamiento de varios tipos de tumores sólidos avanzados. La supervivencia sin progresión (PFS) y la supervivencia global (OS) de esos tipos de tumores avanzados, muchos de ellos bastante frecuentes, mejoraron en cierta medida por los nuevos esquemas de quimioterapia con y sin anticuerpos monoclonales contra, por ejemplo, VEGFR o ERGFR como componente de combinación a la quimioterapia. Sin embargo, en los últimos años, en muchos de los tumores sólidos avanzados o metastásicos el progreso de la farmacoterapia ha sido limitado. Se han puesto muchas esperanzas en la inmunoterapia contra el cáncer y se han logrado determinados éxitos, pero limitados. Los tumores desarrollan medidas para proteger sus células de la destrucción por parte de los linfocitos T efectores y otras células inmunitarias tales como los macrófagos. En las últimas décadas, la inmunoterapia contra el cáncer se ha centrado y ha tenido bastante éxito en conseguir que los linfocitos T vuelvan a ser aptos y en redirigirlos contra las células cancerosas. Los ejemplos más destacados son los inhibidores/activadores de determinados puntos de control inmunitarios. Por ejemplo, los inhibidores de puntos de control, como los antagonistas del eje PD-1, han demostrado que reactivan los linfocitos T efectores para luchar contra determinados cánceres sólidos. Pero no todos los tipos de tumores sólidos responden e incluso en aquellos que responden, a menudo mucho menos del 50 % de los pacientes obtienen un beneficio relevante de, por ejemplo, el tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1 o PD-L1.
La terapia adoptiva con linfocitos T con linfocitos T-CAR y también la terapia con anticuerpos biespecíficos de linfocitos T ofrecieron resultados clínicos prometedores en neoplasias hematológicas. Pero los estudios clínicos con terapias adoptivas de linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T-CAR, en diversos tumores sólidos mostraron en su mayoría tasas de respuesta nulas o solo menores (por ejemplo, Xu et al. Expert Review of Anticancer Therapy 2017, 17, 1099-1106).
Los documentos de patente US20140242079 y WO2017055389 describen anticuerpos biespecíficos de linfocitos T CEAxCD3. Un anticuerpo del documento de patente US20140242079 y otro del documento de patente WO2017055389 están ambos en desarrollo clínico (véase clinicaltrials.gov; RO6958688 en NCT3866239 y RO7172508 en NCT03539484). Estos anticuerpos biespecíficos de linfocitos T se unen a diferentes epítopos de CEAxCD3 y tienen diferente potencia para destruir células tumorales. En cuanto a la destrucción de células tumorales en un ensayo in vitro con linfocitos T humanos, los anticuerpos biespecíficos de linfocitos T CEAxCD3 más potentes descritos en el documento de patente WO201705389 son un factor de 10 a 100 o más potentes que RO6958688/cibisatamab (CEA-TCB).
Hasta hace poco, los resultados de los ensayos clínicos con anticuerpos biespecíficos de linfocitos T TAA x CD3 (TAA = antígeno asociado al tumor) en pacientes con tumores sólidos avanzados eran decepcionantes. Pero en ASCO 2017 se han publicado resultados preliminares de fase 1 para el anticuerpo biespecífico de linfocitos T CEAxCD3 CEA-TCB (RO6958688/cibisatamab, véase, por ejemplo, Bacac et al., Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016); y el documento de patente US20140242079) que muestra en pacientes con cáncer colorrectal avanzado en monoterapia respuestas parciales y enfermedad estable (J. Tabernero et al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (resumen supl. 3002)). A dosis clínicamente activas se han alcanzado concentraciones plasmáticas de, por ejemplo, 300 Nm para cibisatamab. Se produjeron más respuestas parciales y enfermedad estable cuando CEA-TCB se combinó con un anticuerpo inhibidor de PD-L1. Estos datos demuestran que se puede conseguir eficacia con CEA-TCB en tumores sólidos avanzados. Pero en monoterapia y también en combinación con un inhibidor de PD-L1, la mayoría de los pacientes seguían progresando y los que reaccionaban mostraban en el mejor de los casos respuestas parciales y enfermedad estable, pero no se han logrado respuestas completas. Un enfoque para obtener mejores resultados podría ser añadir a los anticuerpos biespecíficos de linfocitos T no solo un inhibidor del eje del punto de control PD-1, sino añadir más inhibidores o agonistas del punto de control. Sin embargo, por lo que sabemos hasta ahora, no se dispone de datos clínicos prometedores para este enfoque combinado. La disponibilidad limitada de linfocitos T en tumores sólidos avanzados es, sin duda, un mecanismo importante que limita la eficacia alcanzable con anticuerpos biespecíficos de linfocitos T más inhibidores del eje PD-1 y/u otros inhibidores o agonistas del punto de control de los linfocitos T.
En lugar de añadir a la combinación de un anticuerpo biespecífico de linfocitos T y un inhibidor del eje PD-1 otro agente terapéutico destinado a redirigir los linfocitos T contra las células tumorales de tumores sólidos avanzados, puede tener más éxito añadir un agente terapéutico que redirija hacia las células tumorales otras células inmunitarias, especialmente macrófagos o macrófagos y células NK citolíticas naturales. La presente invención trata de anticuerpos biespecíficos que redirigen macrófagos y también células NK contra tumores sólidos que expresan CEA como monoterapia o en combinación con, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de linfocitos T y/o anticuerpos inhibidores de PD-1/PD-L1.
Los decepcionantes resultados con linfocitos T-CAR en tumores sólidos pueden tener una explicación sencilla - el número de linfocitos T-CAR que penetran en el tumor sólido y se distribuyen en él no es suficiente. Esto es ciertamente diferente en la mayoría de las neoplasias malignas hematológicas; los linfocitos T-CAR pueden acceder bien a las células tumorales, lo que explica la diferencia de alta eficacia en estas neoplasias malignas frente a la decepcionante eficacia en tumores sólidos. Además, los linfocitos T-CAR pueden verse fuertemente suprimidos por el microambiente tumoral (TME), que en la mayoría de los casos es fuertemente inmunosupresor.
Los anticuerpos monoclonales y también los anticuerpos biespecíficos usados en la terapia pueden causar diversos efectos adversos. Un importante problema de toxicidad es el síndrome de liberación de citocinas (CRS), que se encontró, por ejemplo, en la terapia con alemtuzumab, muromonab-CD3, rituximab y el anticuerpo biespecífico CD19 x CD3 blinatumomab. También se ha descubierto que el tratamiento con anticuerpos anti-CD47 induce un aumento de las cantidades de citocinas proinflamatorias después de la fagocitosis mediada por anticuerpos anti-CD47 (véase, por ejemplo, el documento de patente US20160144009). Los acontecimientos adversos conocidos de los anticuerpos monoclonales anti-CD47 con Fc IgG1 wt son el aumento de la fagocitosis/lisis de glóbulos rojos RBC y la activación plaquetaria (véase, por ejemplo, en las figuras 8 y 10 la fagocitosis de RBC y la activación plaquetaria inducida por el anticuerpo anti-CD47 B6H12.2 que porta un Fc IgG1 wt).
En el presente documento se proporcionan anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano designados para el tratamiento de tumores sólidos. Estos anticuerpos biespecíficos combinan alta eficacia con baja toxicidad, baja inmunogenicidad y propiedades farmacocinéticas favorables. Los anticuerpos biespecíficos según la presente invención inducen sus efectos antitumorales principalmente a través de ADCP optimizada (fagocitosis celular dependiente de anticuerpos) y ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) debido a la participación de células inmunitarias, especialmente macrófagos y células NK. En el presente documento también se proporcionan anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano designados para el tratamiento combinado con anticuerpos biespecíficos de linfocitos T CEAxCD3 como RO6958688, RO7172508 y otros anticuerpos biespecíficos de linfocitos T CEAxCD3, por ejemplo, como se describe a continuación, y que muestran una fuerte fagocitosis de células tumorales como MKN-45 en presencia de macrófagos humanos.
SUMARIO
La divulgación técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no entran en el ámbito de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.
En el sentido más amplio, la presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano, caracterizado por que a) la primera parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende como CDR una CDRH1 de SEQ ID NO:25, una CDRH2 de SEQ ID NO:26 y una CDRH3 de SEQ ID NO:27 y una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:31, 32 y 33; y SEQ ID NO:34, 35 y 36, b) y la segunda parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende como CDR una CDRH1 de SEQ ID NO:25, CDRH2 de SEQ ID NO:26 y CDRH3 de SEQ ID NO:27 y una región variable de cadena ligera que comprende como CDR un CDRL1 de SEQ ID NO:28, un CDRL2 de SEQ ID NO:29 y un CDRL3 de SEQ ID NO:30.
El anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano puede tener una región Fc que se ha glucomanipulado para tener un número reducido de residuos de fucosa en comparación con el mismo anticuerpo biespecífico pero no glucomanipulado.
En un aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano, comprendiendo el anticuerpo biespecífico una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a<c>D47 humano, caracterizado por que la primera parte de unión se une al dominio tipo Ig-V de CEACAM5 de los aminoácidos 35 - 144.
En un aspecto, se divulga un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano, comprendiendo el anticuerpo biespecífico una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a c D47 humano, caracterizado por que dicho anticuerpo biespecífico compite con el anticuerpo anti-CEA SM3E, que comprende como dominios VK y VH Vk y VH de secuencias SEQ ID NO:100 y 101 para la unión a CEACAM5.
En un aspecto divulgado es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano, comprendiendo el anticuerpo biespecífico una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a<c>D47 humano, caracterizado por que dicho anticuerpo biespecífico no compite con los anticuerpos anti-CEA SM3E, MEDI, que comprenden como dominios VL y VH VL y VH de las secuencias SEQ ID NO:102 y 103, labetuzumab (Lab), que comprende como dominios VK y VH VK y VH de las secuencias SEQ ID NO:110 y 111, SAR, que comprende como dominios VK y VH VK y VH de las secuencias SEQ ID NO:104 y 105, T86.66, que comprende como dominios VK y VH VK y VH de las secuencias SEQ ID NO:108 y 109, CH1A1A, que comprende como dominios VK y VH VK y VH de las secuencias SEQ ID NO:106 y 107 para la unión a CEACAM5.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano, comprendiendo el anticuerpo biespecífico una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, caracterizado por que el valor de CE50 de la curva de índice de fagocitosis de dicho anticuerpo biespecífico está en el intervalo de 0,1 a 3 veces del valor E50 del anticuerpo de referencia K2AC22 en las mismas condiciones experimentales y en presencia o sin 1 mg/ml de IgG humana. En otras realizaciones, el intervalo es 0,2 a 3,0, 0,3 a 3,0, 0,5 a 2,5 o 1,0 a 2,5. Los valores de CE50 de fagocitosis se miden como valores CE50 de la curva de índice de fagocitosis (ensayo de fagocitosis basado en imágenes, véanse el Ejemplo 9 y la Figura 12 y la Tabla 3).
En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano, comprendiendo el anticuerpo biespecífico una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, caracterizado por que en presencia de 1 mg/ml de IgG humana el índice de fagocitosis máximo (véase el ejemplo 9.2; ensayo basado en CellInsight™) de dicho anticuerpo biespecífico no disminuye en 30 % o más en comparación con el índice de fagocitosis máximo medido en las mismas condiciones experimentales pero sin adición de IgG humana (véase, por ejemplo, la Figura 17).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por comprender una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, caracterizado por que:
a) la primera parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende un CDRH1 de SEQ ID NO: 1, un CDRH2 de SEQ ID NO: 2 y un CDRH3 de SEQ ID N<o>:3 y un dominio constante de cadena ligera de tipo lambda humano y de SEQ ID NO: 13, y
la segunda parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende un CDRH1 de SEQ ID NO: 1, un CDRH2 de SEQ ID NO:2 y un CDRH3 de SEQ ID No :3 y una región variable de cadena ligera que comprende un CDRL1 de SEQ ID NO:7, un CDRL2 de Ala Ala Ser, incluido en SEQ ID NO:8, y un CDRL3 de SEQ ID NO:9, o bien
b) la primera parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende como CDR una CDRH1 de SEQ ID NO:25, una CDRH2 de SEQ ID NO:26 y una CDRH3 de SEQ ID NO:27 y un dominio constante de cadena ligera de tipo lambda humano y de SEQ ID NO: 13 y la segunda parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende como CDR una CDRH1 de SEQ ID NO:25, una CDRH2 de SEQ ID NO:26 y una CDRH3 de SEQ ID N<o>:27 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO:28, una CDRL2 de SEQ ID NO:29 y una CDRL3 de SEQ ID NO:30.
El anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, caracterizado por que:
a) la primera parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende como CDR una CDRH1 de SEQ ID NO:25, una CDRH2 de SEQ ID NO:26 y una CDRH3 de SEQ ID NO:27 y una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en:
SEQ ID NO:31, 32 y 33; y SEQ ID NO:34, 35 y 36, y
b) la segunda parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende como CDR una CDRH1 de SEQ ID NO:25, CDRH2 de SEQ ID NO:26 y CDRH3 de SEQ ID NO:27 y una región variable de cadena ligera que comprende como CDR una CDRL1 de SEQ ID NO:28, CDRL2 de SEQ ID NO:29 y CDRL3 de SEQ ID NO:30.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por comprender en la primera parte de unión como dominio constante de cadena ligera un dominio de tipo lambda humano de SEQ ID NO: 13
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por comprender una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, caracterizada por que:
a) la primera parte de unión comprende una región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO:4 y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo de VL incluidas en las regiones VLCL que consisten en: SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, y
b) la segunda parte de unión comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:4 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:10.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por comprender una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, caracterizada por que:
a) la primera parte de unión comprende una cadena pesada de SEQ ID NO:5 y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en.
SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65,
b) la segunda parte de unión comprende una cadena pesada de SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de SEQ ID NO:11.
El anticuerpo biespecífico se caracteriza por ser monovalente para la primera parte de unión y monovalente para la segunda parte de unión.
En una realización, las secuencias de la región estructural constante y variable son humanas.
El anticuerpo biespecífico se caracteriza por que cada una de la primera y segunda partes de unión comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina. En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por ser de tipo IgG1 humano. En una realización, el anticuerpo biespecífico es un anticuerpo de longitud completa.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender una primera parte de unión que se une específicamente a CEA, que comprende un dominio variable de cadena ligera kappa y un dominio constante de cadena ligera lambda y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47, que comprende un dominio variable de cadena ligera kappa y un dominio constante de cadena ligera kappa (anticuerpo biespecífico kA, cuerpo kA, tipo 1).
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender una primera parte de unión específica de CEA, que comprende un dominio variable de cadena ligera lambda y un dominio constante de cadena ligera lambda y una segunda parte de unión específica de CD47, que comprende un dominio variable de cadena ligera kappa y un dominio constante de cadena ligera kappa (anticuerpo biespecífico kA, cuerpo kA, tipo 2). En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención es de formato IgG biespecífico totalmente humano (especialmente IgG1) y además un anticuerpo kA biespecífico de tipo 1 o tipo 2.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por ser un anticuerpo kA biespecífico de tipo 1 o tipo 2 y comprender una cadena pesada común (cHC).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse a CD47 humano con una afinidad de unión de 100 nM a 600 nM, en una realización con una afinidad de unión de 100 nM a 500 nM.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse a células MKN-45 con un valor de CE50 de 1 a 200 nM. En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse a células MKN-45 con un valor de CE50 de 1 a 50 nM. En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse a células MKN-45 con un valor de CE50 de 50 a 100 nM. En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse a células MKN-45 con un valor de CE50 de 100 a 200 nM.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que el índice de fagocitosis máximo alcanzable para la fagocitosis de células MKN-45 en presencia de macrófagos humanos, por dicho anticuerpo biespecífico, no se reduce en más del 20 % en presencia de 5000 ng/ml de CEA soluble en comparación con el índice de fagocitosis medido sin CEA soluble.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que la CE50 para la curva del índice de fagocitosis de células MKN-45 en presencia de macrófagos humanos, por dicho anticuerpo biespecífico, no se desplaza en más de un factor 4 hacia concentraciones más altas en presencia de 200 ng/ml de CEA soluble en comparación con la CE50 medida sin CEA soluble y/o que el máximo de la curva del índice de fagocitosis no se reduce en 10 % o más, 15 % o más, o 20 % o más por la adición de 200 ng/ml de sCEA (véase, por ejemplo, la Figura 20B).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que la CE50 para la curva de unión a células MKN-45 de dicho anticuerpo biespecífico no se desplaza en más de un factor 2 hacia concentraciones más altas en presencia de 200 ng/ml de CEA soluble en comparación con la CE50 medida sin CEA soluble (véase, por ejemplo, la Figura 20A).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza porque no presenta reacción cruzada con CEACAM1 humana.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse a CEACAM6 humana expresada en células CHO-K1 recombinantes (ATCC® CCL-61 ™) con un valor de CE50 de 1 a 50 nM (las células CHO CEACAM6 negativas se transfectan con un vector que contiene ADNc de CEACAM6 humana para obtener la expresión de la proteína CEACAM6).
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CEACAM5 humana (denominado también MAB CEA), que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera de s Eq ID NO:21 en una concentración de 300 nM no desplaza la CE50 de la curva de unión del anticuerpo biespecífico de la invención a células MKN-45 en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas. En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 y CD3<e>humanos (denominado también CEA-TCB), que comprende como cadenas pesadas las cadenas pesadas de SEQ ID NO:97 y 98 y como cadenas ligeras las cadenas ligeras de SEQ ID NO: 96 y 99 en una concentración de 300 nM no desplaza la CE50 de la curva de unión del anticuerpo biespecífico de la invención a células MKN-45 en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas. En tal caso, el anticuerpo biespecífico según la invención y CEA-TCB se definen como "no competitivos" y se consideran capaces de unirse simultáneamente a CEA sin interferir significativamente en la unión a dicho CEA.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 y CD3e humanos (denominado también CEA-TCB 1), que comprende como cadenas pesadas y ligeras las cadenas de secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 92 a 95 en una concentración de 30 nM no desplaza la CE50 de la curva de unión del anticuerpo biespecífico de la invención a células MKN-45 en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas. En tal caso, el anticuerpo biespecífico según la invención y CEA-TCB 1 se definen como "no competitivos" y se consideran capaces de unirse simultáneamente a CEA sin interferir significativamente en la unión a dicho CEA. En tal caso, el anticuerpo biespecífico según la invención y MAB CEA, CEA-TCB y/o CEA-TCB 1 se definen como "no competitivos" y se consideran capaces de unirse simultáneamente a CEA sin interferir significativamente en su unión a dicho CEA.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 y CD3<e>humanos (denominado también CEA-TCB 1), que comprende como cadenas pesadas y ligeras las cadenas de secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 92 a 95, en una concentración de 30 nM no desplaza la CE50 de la curva de índice de fagocitosis del anticuerpo biespecífico de la invención a células MKN-45 en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas. En tal caso, el anticuerpo biespecífico según la invención y CEA-TCB1 se definen como "no competitivos" y se consideran capaces de unirse simultáneamente a CEA sin interferir significativamente en su unión a dicho CEA y, por lo tanto, pueden desarrollar su efecto sobre la fagocitosis (CEAxCD47) sin perturbaciones y también su efecto sobre la activación de linfocitos T (CEAxTCB1) sin perturbaciones, incluso si los niveles terapéuticos de ambos fármacos están presentes simultáneamente en el tejido tumoral (véase la Figura 18).
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 y CD3<e>humanos (denominado también CEA-TCB), que comprende como cadenas pesadas y ligeras las cadenas de secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 96 a 99 en una concentración de 300 nM no desplaza la CE50 de la curva del índice de fagocitosis del anticuerpo biespecífico de la invención a células MKN-45 en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas. En tal caso, el anticuerpo biespecífico según la invención y el CEA-TCB se definen como "no competitivos" y se consideran capaces de unirse simultáneamente al CEA sin interferir significativamente en su unión a dicho CEA y, por tanto, pueden desarrollar su efecto sobre la fagocitosis (CEAxCD47) sin perturbaciones y también su efecto sobre la activación de linfocitos T (CEA-TCB) sin perturbaciones, incluso si los niveles terapéuticos de ambos fármacos están presentes simultáneamente en el tejido tumoral (véase la Figura 18). Esto facilita el tratamiento combinado de CEA-TCB/TCB1 con CEAxCD47 de la presente invención (véase la Figura 18).
Las secuencias de SEQ ID NO 88 a 99 son según el documento de patente US20140242079, respectivamente WO2017055389.
En una realización, los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención combinados con anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 como CEA-TCB y CEA-TCB 1 muestran al menos un % aditivo o incluso sinérgico de destrucción de células tumorales en un ensayo que contiene, por ejemplo, células tumorales MKN-45 y macrófagos humanos y linfocitos T derivados del mismo donante humano voluntario (véanse las figuras 19 A y B).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por comprender una cadena pesada común (cHC) como cadena pesada de la primera parte de unión y como cadena pesada de la segunda parte de unión. El anticuerpo biespecífico de la invención se caracteriza por que dicha cadena pesada común de cada parte de unión comprende como CDR CDRH1 de SEQ ID NO:25, CDRH2 de SEQ ID NO:26 y CDRH3 de SEQ ID NO:27. En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que dicha cadena pesada común de cada parte de unión comprende como dominio pesado variable común (cVH) SEQ ID NO:4. En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza porque comprende una cadena pesada común (cHC) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24. En una realización, la cadena pesada común de SEQ ID NO:5 está codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO:6.
El anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender como segunda parte de unión específica de CD47 una cadena pesada común que comprende como CDR CDRH1 de SEQ ID NO:25, CDRH2 de SEQ ID NO:26 y CDRH3 de SEQ ID NO:27 y una cadena ligera (LC) que comprende como CDR CDRL1 de SEQ ID NO:28, CDRL2 de SEQ ID NO:29 y CDRL3 de SEQ ID NO:30.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender como segunda parte de unión una cadena pesada que comprende como dominio pesado variable (cVH) SEQ ID NO:4 y un dominio ligero variable (VL) de SEQ ID NO:10.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender como segunda parte de unión una cadena pesada (cHC) que comprende SEQ ID NO:5 y una cadena ligera (CL) de SEQ ID NO: 11. En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender como segunda parte de unión una cadena pesada (cHC) que comprende SEQ ID NO:23 y una cadena ligera (CL) de SEQ ID NO: 11. En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender como segunda parte de unión una cadena pesada (cHC) que comprende SEQ ID NO:24 y una cadena ligera (CL) de SEQ ID NO: 11. En una realización, la cadena ligera (CL) de SEQ ID NO:11 está codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 12.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse específicamente a CEA y comprender un dominio constante de cadena ligera de SEQ ID NO:13.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por inhibir la interacción entre CD47 en células MKN-45 con una C i50 de 0,1 a 10 nM. SIRPa (SIRPa, CD172a; UniProtKB P78324) se usa en una concentración de 200 ng/ml (SIRPalpha soluble marcado con His). Los detalles del ensayo se describen en el ejemplo 8 (actividad bloqueante de SIRPa de anticuerpos contra CD47), y los resultados se muestran en la Tabla 2.
En una realización, el anticuerpo biespecífico de la invención se caracteriza por una fagocitosis dependiente de la concentración (ADCP) de líneas celulares tumorales que expresan CEA como las células MKN-45 por macrófagos humanos a una CE50 del anticuerpo biespecífico inferior a 10 nM. La ADCP se mide según la invención como índice de fagocitosis (CE50 o máximo) por imagen, normalmente con una relación E:T de 1:3 (macrófagos humanos;células diana (células tumorales); véanse, por ejemplo, las figuras 12, 15 y 16). Los resultados de la Figura 3B se han obtenido con E:T de 1:1. Los detalles del ensayo se describen en el ejemplo 9.2.
Para más información, la fagocitosis (ADCP) de líneas celulares tumorales que expresan CEA como las células MKN-45 por macrófagos humanos a una CE50 del anticuerpo biespecífico inferior a 10 nM. La ADCP también puede medirse por citometría de flujo con una relación E:T de, por ejemplo, 3:1 (macrófagos humanos; células diana (células tumorales); véase, por ejemplo, la Fig. 3A). Los detalles del ensayo se describen en el ejemplo 9 (1. Ensayo de ADCP basado en citometría de flujo).
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse específicamente a CEACAM5 pero no compite por unirse a CEACAM5 en células tumorales como MKN-45 con MAB CEA, CEA-TCB y/o CEA-TCB 1.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que el valor de CE50 para la unión a células MKN-45 (CE50 entre 1 y 200 nM) aumenta en menos de un factor de tres por adición de MAB CEA o CEA-TCB a una concentración de 300 nM respectivamente por adición de CEA-TCB 1 a una concentración de 30 nM (sin competencia).
En una realización, los anticuerpos CEAxCD47 de la invención muestran una CE50 100 o más veces mayor para la fagocitosis de RBC en comparación con la CE50 medida en el mismo ensayo (Ejemplo 15) con B6H12.2.
En una realización, los anticuerpos CEAxCD47 de la invención (portadores de Fc IgG1 wt sin o con afucosilación) no muestran activación plaquetaria significativa en concentraciones de hasta 200 |jg/ml (véase el Ejemplo 15 y los resultados mencionados en el Ejemplo 15 para los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 K2AC5 y K2AC22).
En otra realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención que se ha glucomanipulado para tener una región Fc con oligosacáridos modificados. Sorprendentemente, se descubrió que dicho anticuerpo biespecífico glucomanipulado según la invención se caracteriza por un valor de CE50 al menos 3 veces menor para la curva de índice de fagocitosis medida mediante el ensayo basado en imágenes) que el mismo anticuerpo biespecífico no glucomanipulado (parental) si se mide en las mismas condiciones experimentales. En una realización, la CE50 para el índice de fagocitosis es 5 a 10 veces inferior, o 10 a 30 veces inferior). En una realización, la región Fc se ha modificado para tener un número reducido de residuos de fucosa en comparación con el mismo anticuerpo biespecífico pero no glucomanipulado. En otra realización, la región Fc tiene una mayor proporción de oligosacáridos bisecados en comparación con el anticuerpo biespecífico no glucomanipulado. En otra realización, los oligosacáridos bisecados son predominantemente complejos bisecados. En otra realización, las moléculas de unión a antígeno glucomanipuladas de la invención tienen una mayor proporción de oligosacáridos bisecados no fucosilados en la región Fc de dicho anticuerpo biespecífico en comparación con el anticuerpo biespecífico no glucomanipulado. Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden tener una mayor relación entre residuos de GIcNAc y residuos de fucosa en la región Fc en comparación con el anticuerpo biespecífico no glucomanipulado. En una realización, los oligosacáridos bisecados no fucosilados están predominantemente en forma híbrida. Alternativamente, los oligosacáridos bisecados no fucosilados son predominantemente de tipo complejo.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que del 50 % al 100 % de los oligosacáridos ligados a N en la región Fc son no fucosilados.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que del 50 % al 100 % de los oligosacáridos ligados a N de la región Fc están bisecados.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza porque del 80 % al 100 % de los oligosacáridos ligados a N de la región Fc están bisecados y no fucosilados.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que la curva concentración/ADCC (disminución de la CE50 o aumento del máximo de ADC<c>(véanse las figuras 13 y 14) inducida por dicho anticuerpo glucomanipulado aumenta en al menos un factor de 1,2 en comparación con la ADCC inducida por el mismo anticuerpo biespecífico pero no glucomanipulado. En una realización, la ADCC aumenta en un factor de 1,2 a 2,0.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por un valor de CE50 al menos 3 veces inferior para la curva de índice de fagocitosis medida por el ensayo basado en imágenes en comparación con el mismo anticuerpo biespecífico no glucomanipulado (parental) si se mide en las mismas condiciones experimentales. En una realización, la CE50 para el índice de fagocitosis es 5 a 10 veces menor, o 10 a 30 veces menor.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que el índice máximo de fagocitosis inducido por dicho anticuerpo glucomanipulado y medido por citometría de flujo aumenta en al menos un factor de 1,2 en comparación con el índice máximo de fagocitosis inducido por el mismo anticuerpo biespecífico pero no glucomanipulado. En una realización, el índice máximo de fagocitosis aumenta en un factor de 1,2 a 2,0.
En una realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que el índice de fagocitosis máximo inducido por dicho anticuerpo glucomanipulado y medido por imagen aumenta en al menos un factor de 1,2 en comparación con el índice de fagocitosis máximo inducido por el mismo anticuerpo biespecífico pero no glucomanipulado. En una realización, el índice máximo de fagocitosis aumenta en un factor de 1,2 a 2,0.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en la región Fc ("sustitución de aminoácidos Fc") seleccionadas del grupo que consiste en monosustituciones S239D, I332E, G236A, en bisustituciones I332E y G236A, S239D e I332E, S239D y G236A, y en sustituciones triples S329D e I332E y G236A.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por comprender una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en la región Fc seleccionadas del grupo que consiste en monosustituciones S239D, I332E, G236A, en bisustituciones I332E y G236A, S239D e I332E, S239D y G236A, y en sustituciones triples S329D e I332E y G236A, y una región Fc que se ha glucomanipulado para tener un número reducido de residuos de fucosa en comparación con el mismo anticuerpo biespecífico pero no glucomanipulado.
En una realización, el anticuerpo biespecífico que comprende dichas sustituciones en la región Fc se caracteriza por que la curva concentración/ADCC (disminución de la CE50 o aumento del máximo de ADCC) inducida por dicho anticuerpo con aminoácidos sustituidos aumenta en al menos un factor de 1,2 en comparación con la ADCC inducida por dicho anticuerpo que no comprende ninguna de dichas sustituciones de aminoácidos en la región Fc. En una realización, la ADCC aumenta en un factor de 1,2 a 2,0.
En una realización, el anticuerpo biespecífico que comprende dichas sustituciones en la región Fc se caracteriza por un valor de CE50 al menos 3 veces inferior para la curva de índice de fagocitosis medida por el ensayo basado en imágenes en comparación con el mismo anticuerpo biespecífico (parental) que no comprende ninguna de dichas sustituciones de aminoácidos en la región Fc, si se mide en las mismas condiciones experimentales. En una realización, la CE50 para el índice de fagocitosis es 5 a 10 veces menor, o 10 a 30 veces menor.
En una realización, el anticuerpo biespecífico que comprende dichas sustituciones en la región Fc se caracteriza por que la fagocitosis máxima determinada por citometría de flujo (ADCP) inducida por dicho anticuerpo sustituido con aminoácidos aumenta en al menos un factor de 1,2 en comparación con la ADCP inducida por dicho anticuerpo que no comprende ninguna de dichas sustituciones de aminoácidos en la región Fc. En una realización, la ADCP aumenta en un factor de 1,2 a 2,0. En una realización, el anticuerpo biespecífico que comprende dichas sustituciones en la región Fc se caracteriza por que el índice máximo de fagocitosis determinado por imagen inducido por dicho anticuerpo sustituido con aminoácidos aumenta en al menos un factor de 1,2 en comparación con la ADCP inducida por dicho anticuerpo que no comprende ninguna de dichas sustituciones de aminoácidos en la región Fc. En una realización, la ADCP aumenta en un factor de 1,2 a 2,0.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que del 50 % al 100 %, del 60 % al 100 %, del 70 % al 100 % o del 80 % al 100 % de los oligosacáridos ligados a N en la región Fc no están fucosilados. En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que del 50 % al 100 %, del 60 % al 100 %, del 70 % al 100 % o del 80 % al 100 % de los oligosacáridos N-ligados en la región Fc están bisecados. En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que del 50 % al 100 %, del 60 % al 100 %, del 70 % al 100 % o del 80 % al 100 % de los oligosacáridos ligados a N en la región Fc están bisecados, no fucosilados.
En una realización, el anticuerpo biespecífico glucomanipulado comprende funciones efectoras aumentadas en comparación con el anticuerpo biespecífico glucomanipulado que comprende como cadena pesada común SEQ ID NO:5 (anticuerpo biespecífico parental, producido en una línea celular CHO K1 CHO-K1 (ATCC® CCL-61™ en condiciones estándar como se define a continuación).
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se caracteriza por que dicho anticuerpo biespecífico glucomanipulado comprende una o más funciones efectoras aumentadas, tales como las del grupo que consiste en afinidad de unión aumentada por FcyR, unión aumentada de macrófagos (fagocitosis celular dependiente de anticuerpo aumentada; ADCP), unión aumentada de células NK (citotoxicidad celular mediada por anticuerpo aumentada; ADCC) y unión aumentada a monocitos.
La curva concentración/índice de fagocitosis medida para el anticuerpo monoclonal anti-CD47 hu5F9-G4 (probado en ensayos clínicos desde 2014, véase, por ejemplo, clintrial.gov) se reduce fuertemente con la adición de huIgG añadida en concentraciones fisiológicas de 1 mg/ml al ensayo (aumento de la CE50 y disminución del máximo de la curva de fagocitosis medida en el ensayo basado en imágenes, véase, por ejemplo, la Figura 17).
Sorprendentemente, los anticuerpos CEAxCD47 de la invención solo muestran un pequeño desplazamiento por debajo de un factor de 3 de la CE50 y ninguna disminución significativa del máximo de la curva de concentración/índice de fagocitosis si se añade IgG humana (véase la Tabla 4).
En una realización, los anticuerpos CEAxCD47 de la invención se caracterizan por que la adición de 1 mg/ml de huIgG al ensayo de fagocitosis basado en imagen causa una reducción de menos de un factor de 0,9 del máximo de la curva de índice de concentración/fagocitosis y/o un desplazamiento de menos de un factor de 3 de la CE50 hacia concentraciones más altas (véase la Tabla 4).
Otro aspecto de la divulgación es un polinucleótido aislado caracterizado por codificar un anticuerpo biespecífico según la invención.
Otro aspecto de la divulgación es un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la divulgación.
Otro aspecto de la divulgación es una célula hospedadora que comprende el vector de expresión según la divulgación.
Otra realización de la invención es un método para la producción de un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que comprende.
a) cultivar una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que codifica dicho anticuerpo biespecífico en condiciones que permitan la producción de dicho anticuerpo de la invención, y
b) aislar dicho anticuerpo en donde dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente a CEA y CD47.
En una realización, la invención se caracteriza por comprender un método de producción de un anticuerpo biespecífico glucomanipulado según la invención en una célula hospedadora, comprendiendo dicho método:
a) cultivar una célula hospedadora glucomanipulada para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III en condiciones que permiten la producción de dicho anticuerpo biespecífico de la invención, y que permiten la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fc de dicho anticuerpo biespecífico; y
b) aislar dicho anticuerpo biespecífico glucomanipulado en donde dicho anticuerpo biespecífico glucomanipulado es capaz de unirse específicamente a CEA y CD47.
En una realización, la invención se caracteriza por comprender un método de producción de un anticuerpo biespecífico glucomanipulado en una célula hospedadora, comprendiendo dicho método:
a) cultivar una célula hospedadora glucomanipulada por inactivación dirigida del gen FUT8 en condiciones que permiten la producción de dicho anticuerpo biespecífico de la invención, y que permiten la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fc de dicho anticuerpo biespecífico, y
b) aislar dicho anticuerpo biespecífico glucomanipulado en donde dicho anticuerpo biespecífico glucomanipulado es capaz de unirse específicamente a CEA y CD47.
En una realización, la invención se caracteriza por comprender un método de producción de un anticuerpo biespecífico sustituido por Fc según la invención en una célula hospedadora, comprendiendo dicho método:
a) cultivar una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que codifica un anticuerpo biespecífico sustituido por Fc de la invención en condiciones que permiten la producción de dicho anticuerpo biespecífico, y
b) aislar dicho anticuerpo biespecífico sustituido por Fc en donde dicho anticuerpo biespecífico es capaz de unirse específicamente a CEA y CD47.
Un aspecto de la divulgación es un método de inducción de la lisis celular de una célula tumoral que comprende poner en contacto la célula tumoral con un anticuerpo biespecífico según la invención. La célula tumoral es una célula tumoral humana, preferentemente de un paciente.
Otro aspecto de la divulgación es un método de inducción de la lisis celular de una célula tumoral caracterizado por que la célula tumoral es una célula de cáncer colorrectal, una célula de NSCLC (carcinoma broncopulmonar no microcítico), una célula de cáncer gástrico, una célula de cáncer de páncreas, una célula de cáncer de mama u otra célula tumoral que exprese CEA.
Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención para uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico según la invención.
Un aspecto adicional de la divulgación es un método de aumento del tiempo de supervivencia en un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico según la invención.
Otro aspecto de la divulgación es un método de aumento del tiempo de supervivencia, caracterizado por que el cáncer es cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
Otro aspecto de la divulgación es un método de aumento del tiempo de supervivencia, caracterizado por que un anticuerpo biespecífico según la invención se administra en combinación con quimioterapia o radioterapia a un sujeto humano.
Otro aspecto de la divulgación es un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico caracterizado por que el valor de CE50 de fagocitosis de dicho anticuerpo biespecífico está en el intervalo de 0,1 a 3 veces del valor de E50 del anticuerpo de referencia K2AC22 en las mismas condiciones experimentales y en presencia y/o sin 1 mg/ml de IgG humana. En otras realizaciones, el intervalo es 0,2 a 3,0, 0,3 a 3,0, 0,5 a 2,5 o 1,0 a 2,5. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por unirse a CD47 humano con una afinidad de unión de 100 nM a 600 nM, en un aspecto con una afinidad de unión de 100 nM a 500 nM.
Otra realización de la invención es el anticuerpo biespecífico según la invención para uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespecífico según la invención.
Como puede observarse en las figuras 13 a 17, los valores de ADCC y ADCP/índice de fagocitosis de los anticuerpos según la invención no se ven afectados, o únicamente en escasa medida, por IgG humana en una concentración de 1 mg/ml (en la mayoría de los pacientes está presente IgG humana de 1 mg/ml o incluso superior), mientras que para un anticuerpo anti-CD47 del estado de la técnica (hu5F9-G4), los valores de ADCC y ADCP se reducen fuertemente en presencia de 1 mg/ml de IgG humana.
Otro aspecto de la divulgación es el uso del anticuerpo biespecífico según la invención en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA.
Otro aspecto de la divulgación es el uso del anticuerpo biespecífico según la invención en la fabricación de un medicamento, caracterizado por que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama.
Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una cuarta parte de unión que se une específicamente a CD3<e>humano en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA. Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana y una cuarta parte de unión que se une específicamente a un epítopo de CD3e humano, comprendiendo dicho epítopo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22 en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA.
Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con CEA-TCB y/o CEA/TCB1 en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA.
Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 y una cuarta parte de unión que se une específicamente a un epítopo de CD3e humano, comprendiendo dicho epítopo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22 en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA. Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por no competir con dicho segundo anticuerpo biespecífico para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con dicho segundo anticuerpo biespecífico en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA.
Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por no competir con CEA-TCB o CEA-TCB 1 para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con dicho CEA-TCB o CEA-TCB 1 en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA.
Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por competir con CEA-TCB o CEA-TCB 1 para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con dicho CEA-TCB o CEA-TCB 1 en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA.
Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:88 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:89 y una cuarta parte de unión que se une específicamente a CD3e humano, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:90 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91.
Una realización adicional de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso según la invención, caracterizado por que el anticuerpo biespecífico según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico se administran a dicho sujeto de forma alterna en intervalos de 6 a 15 días.
Una realización adicional de la invención es un anticuerpo biespecífico según la invención para su uso según la invención, caracterizado por que el anticuerpo biespecífico según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico se administran a dicho sujeto simultáneamente en intervalos de 6 a 15 días.
Otra realización de la invención es un primer anticuerpo biespecífico según la invención, que comprende una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, con un segundo anticuerpo biespecífico, que comprende una tercera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 y una cuarta parte de unión que se une específicamente a un epítopo de CD3<e>humano, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO:22, por lo que dicho segundo anticuerpo biespecífico en una concentración de 300 nM no desplaza el valor de CE50 de la curva del índice de fagocitosis a células MKN-45 del anticuerpo biespecífico según la invención en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas.
Otra realización de la invención es un primer anticuerpo biespecífico según la invención, que comprende una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:88 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:89 y una cuarta parte de unión que se une específicamente a CD3e humano, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:90 y una región variable de cadena ligera de<s>E<q>ID NO:91, por lo que dicho segundo anticuerpo biespecífico en una concentración de 30 nM no desplaza la CE50 de la curva de unión a células MKN-45 del anticuerpo biespecífico según la invención en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas.
Otra realización de la invención es un primer anticuerpo biespecífico según la invención, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, con CEA-TCB o CEA-TCB1, en donde dicho CEA-TCB en una concentración de 300 nM o CEA-TCB1 en una concentración de 30 nM no desplazan la CE50 de la curva de unión a células MKN-45 del anticuerpo biespecífico según la invención en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas.
Una realización adicional de la invención es un primer anticuerpo biespecífico según la invención que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano según la invención para su uso según la invención, caracterizado por que dicho cáncer es cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama.
Otra realización de la invención es una composición que comprende un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por que no compite con dicho segundo anticuerpo biespecífico como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA.
Otra realización de la invención es una composición que comprende un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por no competir con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 y una cuarta parte de unión que se une específicamente a un epítopo de CD3<e>humano, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA.
Otra realización de la invención es una composición que comprende un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por no competir con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:88 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:89 y una cuarta parte de unión que se une específicamente a CD3<e>humano, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:90 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91, para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA. Otra realización de la invención es una composición que comprende un anticuerpo biespecífico según la invención, caracterizado por no competir con CEA-TCB y/o CEA-TCB 1.
Otra realización de la invención es un anticuerpo biespecífico de la invención para su uso en el tratamiento de un paciente humano diagnosticado con un tumor (cáncer), especialmente un tumor sólido, especialmente un cáncer sólido que expresa CEA, especialmente cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama, que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo biespecífico según la invención y un segundo anticuerpo biespecífico como se ha descrito anteriormente, contra<c>E<a>y c D3 (en una realización CEA-TCB o CEA-TCB 1), al paciente humano, comprendiendo el método posteriormente:
administrar al paciente una dosis de 0,1 a 10 mg/kg, en una realización adicional de 0,5 a 10 mg/kg, en una realización adicional de 1 a 2 mg/kg de dicho segundo anticuerpo anti-CEAxCD3, por ejemplo semanalmente durante 4 a 12 semanas.
administrar al paciente dicho segundo anticuerpo q1, q2w, q3w u opcionalmente q4w,
administrar al paciente después de estas 4 a 12 semanas y después de 2 o 3 o 4 semividas de eliminación adicionales de dicho anticuerpo anti-CEAxCD3 una dosis de 0,1 a 20 mg/kg de un anticuerpo según la invención,
administrar al paciente dicho anticuerpo según la invención q1, q2w, q3w u opcionalmente q4w,
esperar 2, 3 o 4 semividas de eliminación de dicho anticuerpo según la invención y a continuación
opcionalmente repetir dicho ciclo de administración de anticuerpo biespecífico CEAxCD3 seguido de administración de anticuerpo biespecífico CEAxCD47 y opcionalmente repetir de nuevo ese ciclo.
Este método "alternante" se aplica si el anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo biespecífico son competitivos.
En caso de que dicho anticuerpo biespecífico CEAxCD3 y el anticuerpo biespecífico CEAxCD47 según la presente invención no sean competitivos, los dos anticuerpos biespecíficos también pueden administrarse de manera ("manera simultánea") que el paciente experimente concentraciones plasmáticas y tisulares terapéuticamente eficaces de ambos anticuerpos biespecíficos en paralelo, por ejemplo, administrando al paciente aproximadamente al mismo tiempo una dosis de 0,1 a 10 mg/kg, en otra realización de 0,5 a 10 mg/kg, en otra realización de 1 a 2 mg/kg del anticuerpo biespecífico CEAxCD3 y 1 a 20 mg/kg del anticuerpo biespecífico CEAxCD47 de la presente invención, seguido de una o más de estas administraciones combinadas con una frecuencia de q1w o q2w o q3w u opcionalmente q4w.
El término "q1w" significa administración una vez por semana; q2w significa administración cada dos semanas, etc.
Otra realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otra realización preferida de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como medicamento.
Otra realización preferida de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como medicamento en el tratamiento de trastornos tumorales sólidos.
Otra realización preferida de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención para su uso como medicamento en el tratamiento de cáncer colorrectal, NSCL<c>(carcinoma broncopulmonar no microcítico), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
Otra realización de la invención es una composición que comprende un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, con un segundo anticuerpo biespecífico, que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 y una cuarta parte de unión que se une específicamente a un epítopo de CD3<e>humano, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22, por lo que dicho segundo anticuerpo biespecífico en una concentración de 300 nM no desplaza la CE50 de la curva de unión a células MKN-45 del anticuerpo biespecífico según la invención en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas.
Otra realización de la invención es una composición que comprende un anticuerpo biespecífico según la invención, para su uso en combinación simultánea, separada o secuencial en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa CEA, con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:88 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:89 y una cuarta parte de unión que se une específicamente a CD3e humano, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID n O:90 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91, por lo que dicho segundo anticuerpo biespecífico en una concentración de 30 nM no desplaza la CE50 de la curva de unión a células MKN-45 del anticuerpo biespecífico según la invención en más de un factor de 3, hacia concentraciones más altas.
Otra realización de la invención es una composición según la invención, caracterizada por que el cáncer es cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
Otro aspecto de la divulgación es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de una composición farmacéutica.
Otro aspecto de la divulgación es el uso de un anticuerpo según la invención y un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable para la fabricación de una composición farmacéutica.
Otro aspecto de la divulgación es un anticuerpo según la invención para su uso en la fabricación de un medicamento en el tratamiento de trastornos tumorales sólidos.
Una realización adicional de la invención es un anticuerpo según la invención para su uso en el tratamiento del cáncer colorrectal, NSCLC (carcinoma broncopulmonar no microcítico), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
Otro aspecto de la divulgación proporciona un método de inducción de la lisis celular de una célula tumoral que comprende poner en contacto la célula tumoral con el anticuerpo biespecífico de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En algunos aspectos, la célula tumoral es una célula de cáncer colorrectal, NSCLC (carcinoma broncopulmonar no microcítico), célula de cáncer gástrico, célula de cáncer pancreático o célula de cáncer de mama.
La lisis celular puede ser inducida por fagocitosis celular dependiente de anticuerpos y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos del anticuerpo biespecífico.
Otro aspecto de la divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.
Otro aspecto de la divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en combinación con un anticuerpo biespecífico que se une a CEA humano y CD3 humano. Si el anticuerpo CEAxCD47 y el anticuerpo CEAxCD3 son competidores, competirán por los receptores de CEA en la superficie de la célula tumoral, y la ocupación del receptor y la eficacia de cada componente de combinación dependen de su afinidad de unión y de sus concentraciones plasmáticas y, por lo tanto, son difíciles de predecir y también variables con el tiempo si las concentraciones de los dos fármacos tienen una semivida de eliminación diferente respectivamente eliminación del organismo. Por lo tanto, los anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 y CEAxCD47 competidores deben administrarse de forma secuencial (alterna). Si los anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 y CEAxCD47 no compiten o solo compiten mínimamente, no solo pueden administrarse secuencialmente, sino también en paralelo (simultáneamente), lo que puede ser una ventaja porque la destrucción de células tumorales mediante el acoplamiento de linfocitos T por el anticuerpo biespecífico CEAxCD3 y al mismo tiempo mediante el acoplamiento de macrófagos por el anticuerpo biespecífico CEAxCD47 es aditiva o incluso sinérgica, lo que significa que la eficacia aumenta si ambos fármacos se administran en paralelo.
Otro aspecto de la divulgación proporciona un método de aumento de la supervivencia sin progresión y/o el tiempo de supervivencia global en un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. En una realización, el cáncer es cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama u otro cáncer que exprese CEA.
En ciertos aspectos de estos métodos, el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con quimioterapia o radioterapia. En una realización, el sujeto es un paciente que padece cáncer colorrectal o cáncer de pulmón o cáncer gástrico o cáncer de páncreas o cáncer de mama u otro cáncer que exprese CEA.
Otro aspecto de la divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en combinación con un anticuerpo biespecífico contra CEA humano y CD3epsilon humano.
Otro aspecto de la divulgación proporciona un método de aumento del tiempo de supervivencia sin progresión y/o el tiempo de supervivencia global en un sujeto que tiene un cáncer que expresa anormalmente CEA, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico de cualquiera de los aspectos descritos anteriormente. En un aspecto, el cáncer es cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de mama.
En ciertos aspectos de estos métodos, el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con quimioterapia o radioterapia. En un aspecto, el sujeto es un paciente con cáncer colorrectal o cáncer de pulmón o cáncer gástrico o cáncer de páncreas o cáncer de mama u otro cáncer que exprese CEA.
Otro aspecto proporciona el uso de un anticuerpo biespecífico según la invención para cualquiera de los métodos de tratamiento descritos anteriormente. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
LaFigura 1muestra el formato molecular general de los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la presente invención; estructura de IgG1 totalmente humana indistinguible del anticuerpo monoclonal IgG y sin puentes de aa para minimizar la inmunogenicidad y la formación de ADA anticuerpos anti-fármaco; cadena pesada común (véase la lista de secuencias); cadena ligera kappa (CL y VL) en la parte de unión a CD47 (véase la lista de secuencias); CL lambda en la parte de unión a CEA (véase la lista de secuencias) y VL lambda o kappa en la parte de unión a CEA (A); glucomanipulación (baja en fucosa) de la(s) mutación (mutaciones) de Fc o aa, o ambas, para aumentar la ADCP y la ADCC (B).
LaFigura 2muestra la unión de un anticuerpo biespecífico TAAxCD47 a células tumorales que llevan en la superficie el TAA así como CD47. La unión del TAAxCD47 con una CE50 entre 1 y 50 nM (línea continua, véase también la Figura 11 para las curvas de unión de diversos anticuerpos CEAxCD47 de la invención); la línea discontinua muestra a modo de ejemplo y esquemática un posible desplazamiento de la curva de unión por, por ejemplo, CEA soluble; para datos concretos véase la Figura 20A que muestra, por ejemplo, la influencia de 200 ng/ml de CEA soluble en la curva de unión a células MKN-45 de anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención como K2AC5 y 22.
LaFigura 3Amuestra el aumento de la fagocitosis dependiente de la concentración (evaluada por citometría de flujo y expresada como % de fagocitosis) de la línea celular de cáncer de páncreas humano HPAC (expresa CEA y otros TAA como mesotelina MSLN) con un anticuerpo biespecífico TAAxCD47 que lleva el brazo de unión de CD47 de la invención, el correspondiente anticuerpo monovalente contra CD47 y TAA, así como el anticuerpo monoclonal anti-TAA de alta afinidad (MSLN), Amatuximab. Todos los anticuerpos llevan porciones Fc de IgG1 naturales. El anticuerpo biespecífico muestra la mayor fagocitosis.
LaFigura 3Bmuestra el aumento de la fagocitosis dependiente de la concentración (evaluado con el ensayo CellInsight y expresado como índice de fagocitosis) inducido por diversos anticuerpos; curva 1: hIgG1 de control que no se une a TAA ni a CD47; curva 2: anticuerpo biespecífico TAAxCD47 con Fc de hIgG1 natural; curva 3: anticuerpo anti-CD47 B6H12.2 con hIgG1 natural; curva 4: anticuerpo biespecífico TAAxCD47 con sustituciones de aa de d Ea (S329D, I332E y G236A) en la parte Fc de hIgG1. La mayor fagocitosis se consiguió con TAAxCD47 con Fc con mutaciones DEA.
LaFigura 4muestra un ejemplo de curvas ADCC dosis-respuesta (evaluadas con el ensayo Cr51 y expresadas como % de eliminación específica) para varios anticuerpos biespecíficos TAAxCD47 (TAA es mesotelina MSLN), todos ellos portadores del mismo brazo de unión de CD47 de la presente invención, usando células cancerosas de cáncer de pulmón NCI-H226 como células diana (CMSP de voluntarios humanos a células tumorales 50: 1). Todos los anticuerpos biespecíficos muestran una ADCC más fuerte que el anticuerpo monoclonal anti-TAA de alta afinidad, Amatuximab, un mAb anti-MSLN.
LaFigura 5muestra las curvas ADCC dosis-respuesta (evaluadas mediante el ensayo Cr51 y expresadas como % de destrucción específica) para un anticuerpo biespecífico TAAxCD47 con Fc natural, el correspondiente anticuerpo biespecífico TAAxCD47 con Fc portador de mutaciones DEA, un anticuerpo monoclonal anti-TAA de alta afinidad (TAA en esta Figura no es CEA) y un anticuerpo de control IgG1 humano; usando células cancerosas de pulmón NCI-H226 como células diana (efector a células tumorales 50: 1). La ADCC más fuerte se observó con el anticuerpo biespecífico portador de las mutaciones DEA.
LaFigura 6muestra el bloqueo dependiente de la concentración de la unión de SIRPalpha soluble a CD47 expresado en células MKN-45 que coexpresan CEA (el TAA) por un anticuerpo biespecífico TAAxCD47 (línea continua) y el correspondiente anticuerpo monovalente anti-CD47 (línea discontinua). La mayor potencia de bloqueo del anticuerpo biespecífico se debe a una unión más potente a las células diana y al bloqueo de CD47 dependiente del coacoplamiento del TAA.
LaFigura 7Amuestra la liberación de citocinas IFNy y TNFa en sangre humana completa incubada con 200 pg/ml de los siguientes anticuerpos: Erbitux como control negativo, anticuerpo anti-CD52 Campath como control positivo, y tres anticuerpos biespecíficos que tienen idénticas regiones de unión al antígeno pero diferentes regiones Fc (de izquierda a derecha): Fc de IgG1 humana natural, Fc de IgG1 con mutaciones DEA (S329D e I332E), Fc de IgG1 con mutaciones DE. biAb CD47lo y CD47lo se refieren al mismo anticuerpo biespecífico CD47xTAA. La liberación de IFN<y>y TNFa observada con el anticuerpo biespecífico portador de mutaciones DEA no es mayor que con el anticuerpo biespecífico con Fc natural.
LaFigura 7Bmuestra la liberación de las citocinas IL-6 e IL-8 en sangre humana completa incubada con 200 pg/ml de los siguientes anticuerpos: Erbitux como control negativo, anticuerpo anti-CD52 Campath como control positivo y tres anticuerpos biespecíficos que tienen idénticas regiones de unión a antígeno pero diferentes regiones Fc (de izquierda a derecha): Fc de IgG1 humana natural, Fc de IgG1 con mutaciones DEA, Fc de IgG1 con mutaciones DE.
biAb CD47lo y CD47lo se refieren al mismo anticuerpo biespecífico CD47xTAA. La liberación de IL-6 e IL-8 observada con los anticuerpos biespecíficos con mutaciones D<e>o<d>E<a>no es mayor que con el anticuerpo biespecífico con Fc natural.
LaFigura 8muestra la fagocitosis dependiente de la concentración de glóbulos rojos (RBC), un importante "sumidero de antígenos" para los anticuerpos monoclonales anti-CD47 (cada RBC expresa entre 20.000 y 25.000 moléculas de CD47 en la superficie celular) inducida por varios anticuerpos: el anticuerpo huIgG1 anti-CD47 B6H12.12 con Fc natural, un anticuerpo biespecífico CD47xTAA con Fc natural y el mismo anticuerpo biespecífico CD47xTAA con Fc portador de mutaciones DEA. B6H12 muestra fagocitosis de<r>B<c>a concentraciones de 10 a 100 ng/ml (aprox. 0,07 a 0,7 nM), mientras que un anticuerpo biespecífico TAAxCD47 con Fc huIgG1 natural no muestra fagocitosis de RBC a concentraciones de hasta 200.000 ng/ml (aprox. 1350 nM); el mismo anticuerpo biespecífico pero con una porción Fc portadora de mutaciones DEA muestra un aumento de la fagocitosis de RBC en comparación con Fc natural, a concentraciones superiores a 1000 ng/ml, (aprox. 7 nM), que sigue siendo 2-2,5 logaritmos mayor que con el anticuerpo huIgG1 anti-CD47 B6H12.
LaFigura 9muestra los recuentos de glóbulos rojos y plaquetas en primates no humanos (NHP; macacos cangrejeros) que recibieron cuatro infusiones iv semanales del anticuerpo hIgG1 de control o del anticuerpo biespecífico TAAxCD47 (30 mg/kg durante las dos primeras semanas y 100 mg/kg durante las dos últimas semanas). No se observó una disminución significativa de los recuentos hematológicos con el anticuerpo biespecífico TAAxCD47 a pesar de la elevada exposición (la concentración plasmática del anticuerpo biespecífico TAAxCD47 al final de la segunda dosis, a 30 mg/kg, fue de aproximadamente 500 nM).
LaFigura 10muestra la activación plaquetaria in vitro (evaluada por citometría de flujo y expresada como % de expresión de CD62P), inducida por la incubación de sangre completa humana con los anticuerpos indicados a diferentes concentraciones (de 0 a 200 pg/ml). A diferencia del B6H12-hIgG1, que induce la activación plaquetaria a 2 pg/ml, el anticuerpo biespecífico TAAxCD47 con Fc de IgG1 natural no induce la activación plaquetaria ni siquiera a la concentración más alta probada (200 pg/ml). También se probaron los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 K2AC5 y K2AC22, las versiones con Fc de IgG1 wt, así como las versiones afucosiladas no mostraron una activación plaquetaria significativa de hasta 20 pg/ml (véase el ejemplo 15).
LasFiguras 11A y Bmuestran la unión dependiente de la concentración de los anticuerpos biespecíficos CD47xCEA de la invención en comparación con el anticuerpo monovalente anti-CD47 correspondiente. La unión a las células diana (MKN-45) que expresan CD47 y CEA se evaluó mediante FACS. La Figura 11A muestra los anticuerpos clasificados en la caja 1, unión a células MKN-45 inhibida por el anticuerpo SM3E en más del 80 %; la Figura 11B muestra los anticuerpos clasificados en cajas 2, unión a células MKN-45 no inhibida por los anticuerpos anti-CEA SM3E, MEDI, T84.66, SAR, Lab y CH1A1A (en menos del 20 %).
LaFigura 12muestra el aumento de la fagocitosis dependiente de la concentración (evaluada mediante el ensayo Celllnsight y expresada como índice de fagocitosis) de células MKN-45 inducida por diferentes anticuerpos biespecíficos CD47xCEA a diferentes concentraciones (K2AC5, K2AC22, K2AC23, k2a C25, K2AC26, K2AC27, K2AC28 y K2AC29) en comparación con el anticuerpo monovalente anti-CD47 correspondiente. En este experimento se añade 1 mg/ml de hIgG (inmunoglobulina humana) para cada anticuerpo ensayado. Los valores de CE50 establecidos en este experimento están comprendidos entre 0,2 y 20 pg/ml y el índice máximo de fagocitosis (a 10 pg/ml) oscila entre 32,5 % y 69 % (véase la Tabla 3 del Capítulo de Ejemplos para el resumen de datos de cada anticuerpo biespecífico CD47xCEA individual ensayado).
LasFiguras 13 y 14muestran el aumento dependiente de la concentración de ADCC (evaluado usando el ensayo de liberación de LDH y expresado como % de lisis específica de células cancerosas MKN45) inducido por dos anticuerpos biespecíficos CD47xCEA seleccionados (K2AC5 y K2AC22) de la invención, y el correspondiente anticuerpo monovalente CD47, que lleva una parte Fc de IgG1 humana natural o una parte Fc afucosilada. El análogo de secuencia idéntica del anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 (5F9 que lleva una porción Fc de IgG4 humana, descrita en el documento de patente US20160333093) se usó para comparación. Los experimentos se realizaron en ausencia (Figura 13) o en presencia (Figura 14) de 1 mg/ml de IgG humana. En ambas condiciones experimentales, las versiones de anticuerpos con Fc afucosilado inducen una mayor actividad de lisis/eliminación en comparación con las correspondientes versiones con Fc natural (CE50 5-9 veces menor para los anticuerpos biespecíficos K2AC5 y K2AC22 afucosilados en comparación con la versión wt).
LasFiguras 15 y 16muestran el aumento de la fagocitosis dependiente de la concentración (evaluado con el ensayo basado en imágenes Celllnsight y expresado como índice de fagocitosis) inducido por los anticuerpos biespecíficos CD47xCEA K2AC5 y K2AC22 con una porción de Fc de IgG1 humana natural o una porción de Fc afucosilada. Para la comparación se usaron el anticuerpo monovalente CD47 correspondiente (con Fc de hIgG1 natural) y el análogo de secuencia idéntica del anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 (5F9). Los experimentos se realizaron en ausencia (Figura 15) o en presencia (Figura 16) de 1 mg/ml de IgG humana. En ambas condiciones experimentales, las versiones de anticuerpos biespecíficos con Fc afucosilado muestran una mayor potencia fagocítica en comparación con las correspondientes versiones con Fc naturales (CE50 de 3 a 10 veces menor para los anticuerpos biespecíficos K2AC5 y K2AC22 afucosilados en comparación con la versión wt).
LaFigura 17muestra el aumento de la fagocitosis dependiente de la concentración (evaluado con imágenes basadas (CellInsight) y expresado como índice de fagocitosis) inducido por dos anticuerpos biespecíficos CD47xCEA seleccionados, es decir, K2AC5 y K2AC22, en presencia o no de 1 mg/ml de IgG humana. El análogo de secuencia idéntica del anticuerpo anti-CD47 Hu5F9-G4 (5F9 que lleva una porción Fc de IgG4 humana, descrito en el documento de patente US20160333093) se usó para comparación. La adición de 1 mg/ml de IgG humana (incluso por debajo de las concentraciones plasmáticas fisiológicas de IgG en los hombres) afecta ligeramente a la potencia (es decir, CE50) de los anticuerpos biespecíficos CD47xCEA, mientras que la actividad impulsada por el mAb 5F9 se ve drásticamente afectada (CE50 y fagocitosis máxima).
LaFigura 18muestra el efecto de los anticuerpos biespecíficos CEA-TCB1 (30 nM) y CEA-TCB (300 nM) del redireccionamiento de linfocitos T (anticuerpos biespecíficos CEAxCD3 CEA-TCB: RO6958688/cibisatamab, véase, por ejemplo, Bacac et al., Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016) y el documento de patente US20140242079; CEA-TCB1: del documento de patente WO2017055389) sobre la fagocitosis (evaluada con ensayo basado en imágenes (CellInsight) y expresada como índice de fagocitosis) inducida por el anticuerpo biespecífico K2AC22 CEAxCD47. Los anticuerpos biespecíficos de redireccionamiento de linfocitos T, el anticuerpo biespecífico CD47xCEA y el correspondiente anticuerpo monovalente contra CD47 se ensayaron solos a efectos comparativos. Ni CEA-TCB ni CEA-TCB1 perjudican la actividad dependiente de la concentración en la fagocitosis de K2AC22.
LaFigura 19muestra la eliminación (evaluada por luminiscencia y expresada como % de eliminación) de células cancerosas MKN45 en un ensayo mixto (con CMSP y macrófagos añadidos, obtenidos del mismo donante humano voluntario) por 2 anticuerpos biespecíficos CD47xCEA seleccionados de la invención (K2AC5 (Figura 19A) y K2AC22 (Figura 19B) a dos dosis (es decir, es decir, 0,37 pg/ml o 1,1 pg/ml) solos, o en combinación con CEA-TCB a 0,16 nM o 0,8 nM, y comparados con el CEA-TCB solo o con un control de hIgG1 irrelevante. (A) Efecto al menos aditivo de la combinación del anticuerpo biespecífico CEAxCD3 CEA-TCB (SEQ ID NO:96 a 99) y el anticuerpo biespecífico CEAxCD47 K2AC5; (B) Efectos al menos aditivos también para C<e>A-TCB K2AC22.
LaFigura 20muestra los efectos dependientes de la concentración de los anticuerpos CEAxCD47 K2AC5 y 22 sobre la unión (20A) y la fagocitosis (20B) (evaluados con un ensayo basado en imágenes (CellInsight) y expresados como índice de fagocitosis) en presencia o no de 200 ng/ml de CEA eliminado. Ninguna influencia significativa de 200 ng/ml de CEA soluble en las curvas de unión de ambos anticuerpos CEAxCD47. Ningún efecto significativo del CEA soluble sobre la fagocitosis máxima, las CE50 se desplazan en menos de un factor de 4.
LaFigura 21Amuestra la unión dependiente de la concentración de los anticuerpos biespecíficos CD47xCEA de la invención contra células MKN-45 en comparación con el correspondiente anticuerpo monovalente anti-CD47 y un control de hIgG1 irrelevante. K2AC39 es un candidato a anticuerpo biespecífico CD47xCEA de reacción cruzada con CEACAM5 humana y CEACAM6 humana; mientras que K2AC22 no presenta reacción cruzada con CEACAM6. La unión a las células diana (MKN-45) que expresan CD47, CEACAM5 y CEACAM6 se evaluó mediante FACS.
LaFigura 21Bmuestra el aumento de la fagocitosis dependiente de la concentración (evaluado mediante el ensayo basado en imágenes (CellInsight) y expresado como índice de fagocitosis) de células MKN-45 inducido por 2 anticuerpos biespecíficos CD47xCEA diferentes (K2AC22 y K2AC39) en comparación con el anticuerpo monovalente anti-CD47 correspondiente y un control de hIgG1 irrelevante. K2AC39 es un candidato biespecífico CD47xCEA de reacción cruzada con CEACAM5 humana y CEACAM6 humana; mientras que K2AC22 no presenta reacción cruzada con CEACAM6. En este experimento se añade 1 mg/ml de IgG humana. K2AC39 muestra una mayor fagocitosis de células MKN45 en comparación con K2AC22.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La divulgación técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no entran en el ámbito de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo.
Los términos se utilizan en el presente documento tal como se utilizan generalmente en la técnica, a menos que se definan de otra forma en lo sucesivo.
Como se usa en el presente documento, el término "parte de unión a antígeno, parte de unión" se refiere en su sentido más amplio a una parte de un anticuerpo que se une específicamente a un determinante antigénico como CEA, CD47 y CD3.
Más específicamente, tal como se utiliza en el presente documento, una parte de unión que se une al antígeno carcinoembrionario humano (CEA, lo mismo que CEACAM5) unido a la membrana o a CD47 se une específicamente a CEA o CD47, más particularmente a CEA o CD47 unido a la superficie celular o a la membrana. Por lo tanto, cada parte de unión se une o bien a CEA o bien a CD47. Por "unión específica, específico para, unión a" se entiende que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas. En algunos aspectos, el grado de unión de un anticuerpo anti-diana a una proteína no diana, no relacionada, es aproximadamente 10 veces, preferiblemente >100 veces menor que la unión del anticuerpo a dicha diana como se mide, por ejemplo, por resonancia de plasmón superficial (SPR), por ejemplo Biacore®, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) o citometría de flujo (FACS). Las dianas son las proteínas analizadas en el presente documento, por ejemplo CEA, CD47 y CD3e. En un aspecto, la parte de unión a c Ea se une además a CEACAM6.
"Que se une específicamente a CEA, CD47, que se une a CEA, CD47, específico de CEA, CD47" se refiere en una realización a un anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo biespecífico, que es capaz de unirse a las dianas CEA y CD47 con afinidad suficiente de manera que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico dirigido a células tumorales que expresan CEA y CD47. El término "que se une a células MKN-45 con un valor de CE50 de" se refiere a condiciones de ensayo en las que las concentraciones de anticuerpo biespecífico ensayadas están entre 0,1 y 1000 nM en presencia del anticuerpo anti-CD47 B6H12.2 (ATCC® HB-9771™, también denominado B6H12 en el presente documento) en una concentración de 300 nM.
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención se une a CEACAM5 de cangrejero, así como a CEACAM5 humana.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cadena pesada de anticuerpo" se refiere a una cadena pesada de anticuerpo, que consiste en una región variable y una región constante tal como se definen para un anticuerpo de longitud completa. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cadena ligera de anticuerpo" se refiere a una cadena ligera de anticuerpo, que consiste en una región variable y una región constante tal como se definen para un anticuerpo de longitud completa.
El término "anticuerpo de longitud completa" indica un anticuerpo que consiste en dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa". Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste en la dirección aminoterminal a carboxiterminal de un dominio variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo, un dominio constante 1 de cadena pesada (CH1) de anticuerpo, una región bisagra (HR) de anticuerpo, un dominio constante 2 de cadena pesada (CH2) de anticuerpo y un dominio constante 3 de cadena pesada (CH3) de anticuerpo, abreviado como VH-CH1-HR-CH2-CH3. Una "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido que consiste en la dirección aminoterminal a carboxiterminal de un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo, y un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo, abreviado como VL-CL. El dominio constante de cadena ligera (CL) del anticuerpo puede ser k (kappa) o A (lambda). Los dos dominios del anticuerpo de longitud completa están unidos entre sí mediante enlaces disulfuro interpolipeptídicos entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de anticuerpos de longitud completa típicos son anticuerpos naturales tales como IgG (por ejemplo, IgG 1 e IgG2), IgM, IgA, IgD e IgE. El anticuerpo de longitud completa según la invención es en una realización de tipo IgG1 humano, en una realización adicional que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la parte Fc como se define a continuación y/o que está glucomanipulado en Asn297. El anticuerpo de longitud completa según la invención comprende dos partes de unión formadas cada una por un par de VH y VL, una que se une a CEA y la otra que se une a CD47.
Como se usa en el presente documento, "región (regiones) determinante(s) de la complementariedad" ("CDR") describe(n) los sitios no contiguos de combinación de antígenos (también conocidos como regiones de unión a antígenos) que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las CDR también se denominan "regiones hipervariables" y este término se usa indistintamente en el presente documento con el término "CDR" en referencia a las porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health y Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), donde las definiciones incluyen solapamientos o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. La definición de las regiones FR-IMGT y CDR-IMGT de IG y TR se basa en "IMGT unique numbering for all IG and TR V-REGIONs of all species: interest for structure and evolution" (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) y, para CDR3-IMGT reordenados y para FR4-IMGT, en "IMGT unique numbering for V-DOMAIN and V-LIKE-DOMAiN" (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). No obstante, la aplicación de cualquiera de las dos definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo pretende estar dentro del alcance del término como se define y usa en el presente documento. Los residuos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR definidas por IMGT y Kabat se exponen a continuación en la tabla de lista de secuencias. Los números exactos de residuos que abarcan una CDR particular variarán dependiendo de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la técnica pueden determinar de forma rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el término "que comprende una CDRL1 de SEQ ID NO:x" se refiere a que la parte CDRL1 de la cadena ligera variable referida es de SEQ ID NO:x (que comprende como CDRL1 una CDRL1 de SEQ ID NO:x). Esto también se aplica para las demás CDR.
Como se usa en el presente documento, el término "región Fc; dominio Fc" se refiere a una región carboxiterminal de una cadena pesada de IgG; en el caso de un anticuerpo IgG1, la región carboxiterminal comprende -CH2-CH3 (véase más arriba). Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana normalmente se define de forma que se extienda desde el residuo de aminoácido de la posición Cys226 hasta el extremo carboxilo terminal.
Las regiones constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y, por ejemplo, se describen por Kabat, E.A., (véase, por ejemplo, Johnson, G., y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785- 2788).
El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. "Epítopo" incluye agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo, y puede tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de una diana que se une mediante un anticuerpo. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico de la invención se une al dominio aminoterminal de CEACAM5 (dominio de tipo V similar a Ig de aminoácidos 35 - 144, UniProtKB - P06731). La ubicación de unión de los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 a CEACAM5 se logra mediante una combinación de epítopos. En una combinación de epítopos, los anticuerpos se someten a ensayo de forma combinatoria por pares y los anticuerpos que compiten por la misma región de unión se agrupan en combinaciones. Los ensayos de competencia se realizan en el presente documento con anticuerpos anti-CEA según el estado de la técnica y tal como se describe en el presente documento. El anticuerpo biespecífico de la invención compite por la unión a CEACAM5 con el anticuerpo de referencia SM3E (caja 1). El anticuerpo biespecífico de la invención no compite por la unión a CEACAM5 con los anticuerpos de referencia SM3E, MEDI, T84.66, SAR, Lab y CH1A1A (caja 2). La competencia se mide mediante un ensayo en el que CEACAM5 humana biotinilada en una concentración de 0,5 pg/ml se inmoviliza y se incuba con 10 pg/ml de la referencia. Los anticuerpos CEACAM5 que comprenden la parte de unión de CEACAM5 del anticuerpo biespecífico CEAxCD47 de la presente invención se añaden a 0,2 pg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava la placa y se detectan los mAb CEACAM5 unidos.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico se une al dominio B3 y al anclaje GPI de CEACAM5. En un aspecto, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-CEA (mAb CEA), que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21.
Como se usa en el presente documento, el término "una cadena pesada común (cHC)" se refiere a un polipéptido que consiste en dirección aminoterminal a carboxiterminal de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH), un dominio constante de cadena pesada de anticuerpo 1 (CH1), una región bisagra de anticuerpo (HR), un dominio constante de cadena pesada de anticuerpo 2 (CH2) y un dominio constante de cadena pesada de anticuerpo 3 (CH3), abreviado como VH-CH1-HR-CH2-CH3. Las cadenas pesadas comunes adecuadas para los anticuerpos biespecíficos según la invención son cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CD47 como se describe en los documentos de patente WO2012023053, WO2013088259, WO2014087248 y WO2016156537. En un aspecto, la cHC del anticuerpo biespecífico comprende como CDR de cadena ligera una CDRL1 de SEQ ID NO: 1, una CDRL2 de SEQ ID NO:2 y una CDRL3 de SEQ ID NO:3, y como CDR de cadena pesada una CDRH1 de SEQ ID NO:25, una CDRH2 de SEQ ID NO:26 y una CDRH3 de SEQ ID NO:27 . En una realización, el cHC del anticuerpo biespecífico según la invención comprende como región variable de cadena pesada VH una región VH de SEQ ID NO:4. En una realización, el cHC del anticuerpo biespecífico según la invención es de SEQ ID NO:5. En una realización el anticuerpo según la invención es un anticuerpo<k>A biespecífico que comprende una cHC (cuerpo<k>A).
"El formato de cuerpo kA permite la purificación por afinidad de anticuerpos biespecíficos que no se distinguen de una molécula de IgG estándar y con características que no se distinguen de un anticuerpo monoclonal estándar (véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO2013088259, WO2012023053), prometiendo un potencial de inmunogenicidad nulo o bajo en pacientes.
Los anticuerpos biespecíficos de la invención, que comprenden una cadena pesada común, pueden fabricarse, por ejemplo, según el documento de patente WO2012023053.
Los métodos descritos en el documento de patente WO2012023053 generan anticuerpos biespecíficos que son idénticos en estructura a una inmunoglobulina humana. Este tipo de molécula está compuesta por dos copias de un polipéptido de cadena pesada único, una primera región variable de cadena ligera fusionada a un dominio constante Kappa y una segunda región variable de cadena ligera fusionada a un dominio constante Lambda. Un sitio de unión muestra especificidad por CEA y el otro sitio muestra especificidad por CD47, contribuyendo a cada uno la cadena pesada y la cadena ligera respectiva. Las regiones variables de cadena ligera pueden ser de la familia Lambda o Kappa y están preferentemente fusionadas a dominios constantes Lambda y Kappa, respectivamente. Esto se prefiere para evitar la generación de uniones polipeptídicas no naturales. Sin embargo, también es posible obtener anticuerpos biespecíficos de la invención fusionando un dominio variable de cadena ligera Kappa con un dominio constante Lambda para una primera especificidad o fusionando un dominio variable de cadena ligera Lambda con un dominio constante Kappa para la segunda especificidad. La otra cadena ligera es entonces siempre totalmente kappa (VL y CL) o totalmente lambda). Los anticuerpos biespecíficos descritos en el documento de patente WO 2012023053 son "cuerpos kA". Este formato de cuerpo kA permite la purificación por afinidad de un anticuerpo biespecífico que no se distingue de una molécula de IgG estándar con características que no se distinguen de un anticuerpo monoclonal estándar y, por lo tanto, es favorable en comparación con formatos anteriores que incluyen, por ejemplo, puentes de aminoácidos u otros elementos no naturales.
Una etapa esencial del método es la identificación de dos regiones Fv del anticuerpo (cada una compuesta por un dominio variable ligero y un dominio variable pesado) que tienen diferentes especificidades de antígeno que comparten el mismo dominio variable de cadena pesada. Se han descrito numerosos métodos para la generación de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos. (Véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E y Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los anticuerpos totalmente humanos son moléculas de anticuerpo en las que la secuencia tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluidas las CDR 1 y 2, proceden de genes humanos. La región CDR3 puede ser de origen humano o diseñada por medios sintéticos. Dichos anticuerpos se denominan "anticuerpos humanos" o "anticuerpos totalmente humanos". Los anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse usando la técnica del trioma; la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos (véase Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica del hibridoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase Cole, et al., 1985, en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Pueden usarse anticuerpos monoclonales humanos y pueden producirse usando hibridomas humanos (véase Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando linfocitos B humanos con el virus de Epstein Barrin vitro(véase Cole, et al., arriba).
Como se usa en el presente documento, el término "CEA, CEACAM5" se refiere al antígeno carcinoembrionario humano (CEA, CEACAM-5 o CD66e; UniProtKB - P06731) que es una glucoproteína de la superficie celular y un antígeno asociado a tumores (Gold and Freedman, J Exp. Med., 121:439-462, 1965; Berinstein NL, J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Como se usa en el presente documento, el término "CEACAM6" se refiere a CEACAM6 humana (CD66c; UniProtKB - P40199), que también es miembro de la familia de las moléculas de adhesión a células relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CEACAM1" se refiere a CEACAM1 humano (UniProtKB - P13688 (CEAM1_HUMAN) que también es miembro de la familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM). Más información e información sobre otros miembros de la familia CEA se puede encontrar en http://www.uniprot.org.
Como se usa en el presente documento, el término "MAB CEA" se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:20 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21. Como se usa en el presente documento, el término "MAB CEA1" se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CEACAM5 humana, que comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:88 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID<n>O:89. En un aspecto, el anticuerpo biespecífico es competitivo con MAB CEA, MAB CEA1, CEA-TCB o CEA-TCB 1; en otro aspecto, el anticuerpo biespecífico no es competitivo con MAB CEA, MAB CEA1, CEA-TCB o CEA-TCB1. MAB CEA y dichas cadenas variables se describen en el documento de patente US20140242079 (SEQ ID NO:21 y 27 del documento de patente US20140242079. Un anticuerpo biespecífico anti-CEA x anti-CD3£ (CEA-TCB) que comprende VH y VL de<m>A<b>CEA se describe en Bacac et al Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016)). Otro mAb biespecífico CeAxCD3 que comprende VH y VL de MAB CEA1 (CEA-TCB 1) se describe en el documento de patente WO2017055389 como la molécula B "2+1 IgG CrossFab, invertida" con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en el ligante CD3, modificación de carga en el ligante CEA, ligante CEA humanizado) (véase la Figura 3B y SEQ ID NO: 34, 36-38 del documento de patente WO2017055389).
Como se usa en el presente documento en una realización, el "anticuerpo CEA x CD3 biespecífico" se refiere al anticuerpo CEA-TCB o anticuerpo CEA-TCB 1.
"Como se usa en el presente documento, los términos "que se une específicamente a CD47, que se une a CD47, parte de unión a CD47" se refieren en el contexto de los anticuerpos biespecíficos según la invención a especificidad para CD47. CD47 es una proteína de membrana de paso múltiple y comprende tres dominios extracelulares (aminoácidos 19-141, 198-207 y 257-268; véase UniProtKB - Q08722). Como se usa en el presente documento, el término "afinidad de unión a CD47" se mide mediante SPR.
En una realización, la unión del anticuerpo biespecífico según la invención a CD47 se produce a través de uno o más de dichos dominios extracelulares. En una realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención inhiben la interacción entre CD47 humano y SIRPa humano.
Como se usa en el presente documento, los términos "que se une específicamente a CEA, que se une a CEA, parte de unión a CEA" se refieren en el contexto de los anticuerpos biespecíficos según la invención a especificidad para CEACAM5 en la superficie de una célula. La unión a CEA (CEACAM5) en células se mide preferentemente con células de adenocarcinoma gástrico MKN-45 que comprenden de 200.000 a 600.000 copias de CEA por célula. La concentración del anticuerpo según la invención se varía en un intervalo apropiado con respecto a un valor de CE50 resultante para la unión a células MKN-45 como se ha definido anteriormente. Los anticuerpos biespecíficos según la invención se unen específicamente a dicha CEACAM5 unida a la membrana celular y no se unen, o lo hacen únicamente mínimamente, en una realización adicional a CEACAM5 soluble, en concentraciones como las que se encuentran en la sangre/plasma de los pacientes, es decir, CEA soluble en dichas concentraciones, no influye, o lo hace únicamente mínimamente, en la eficacia de un anticuerpo biespecífico de la invención. Esto se mide por la influencia de CEA soluble en la fagocitosis de células MKN-45 por los anticuerpos biespecíficos de la presente invención como se describe.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CEA humano unido a membrana" se refiere al antígeno carcinoembrionario (CEA) humano que está unido a una porción de membrana de una célula o a la superficie de una célula, en particular, la superficie de una célula tumoral. El término "CEA humano unido a la membrana" puede, en determinadas circunstancias, referirse a CEA que no está unido a la membrana de una célula, pero que se ha construido para preservar el epítopo de CEA unido a la membrana al que se une el anticuerpo según la invención.
Como se usa en el presente documento, el término "sin reactividad cruzada sustancial frente a CEACAM5 soluble, no unión a CEACAM5 soluble" se refiere en el contexto de los anticuerpos biespecíficos según la invención a que dichos anticuerpos no muestran unión relevante a CEACAM5 soluble, en particular en comparación con CEACAM5 unida a membrana. Dicha no unión puede determinarse indirectamente por la baja influencia del CEA soluble en la actividad de fagocitosis del anticuerpo biespecífico en un ensayo de fagocitosis con células MKN-45 como se describe a continuación, preferentemente medición basada en imágenes del índice de fagocitosis, véase el Ejemplo 9). La ausencia de reactividad cruzada sustancial frente a CEACAM5 soluble significa, por tanto, que el índice de fagocitosis máximo alcanzable (las curvas típicas de concentración-índice de fagocitosis del anticuerpo biespecífico CEAxCD47 y el índice de fagocitosis máximo alcanzable se muestran, por ejemplo, en las Figuras 12, 15, 16, 17, 20A, el ensayo se explica en el Ejemplo 9.2) para la fagocitosis de células MKN-45 en presencia de macrófagos humanos, por dicho anticuerpo biespecífico no se reduce en más del 20 % si se añaden 200 ng/ml de CEA soluble al ensayo de fagocitosis. Alternativamente, puede determinarse el desplazamiento de la CE50 para la curva concentración - índice de fagocitosis. La adición de 200 ng/ml de CEA soluble no desplazará esta CE50 en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas. Alternativamente, no se espera ninguna o mínima influencia de CEA soluble en la unión de un anticuerpo biespecífico de la presente invención a CEA en células por la influencia de CEA soluble en la curva de unión medida por citometría de flujo (tal curva de unión se muestra en la Figura 20B). La adición de 200 ng/ml de CEA soluble al ensayo de citometría de flujo no desplazará la curva de unión, respectivamente la CE50, en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas.
El término "CEA soluble", "CEA eliminado", "sCEA" se refiere a CEACAM5 que no está unido a una membrana celular o superficie celular (por ejemplo, la superficie de una célula tumoral) o que está escindido de ellas. El CEA soluble puede, por ejemplo, encontrarse en el torrente sanguíneo de un sujeto con cáncer. Cuando el CEA se elimina de la membrana celular, se supone que el anclaje GPI se interrumpe, y CEACAM5 experimenta un cambio conformacional que puede impedir o al menos debilitar la unión del CEA soluble al anticuerpo según la invención.
Como se usa en el presente documento, los términos "reactividad cruzada contra CEACAM6, unión específica a CEACAM6, unión a CEACAM6, parte de unión a CEACAM6" se refieren en el contexto de los anticuerpos biespecíficos a que el anticuerpo biespecífico reconoce específicamente CEACAM5 y CEACAM6 en la superficie (membrana) de una célula. En un aspecto, los anticuerpos biespecíficos se unen específicamente a CEACAM6 unida a la membrana, en comparación con la unión a CEA unido a la membrana. La relación de la ocupación entre los receptores CEACAM5 y CEACAM6 en una superficie celular por un anticuerpo biespecífico dado depende de las afinidades de unión a CEACAM5 respectivamente CEACAM6 y puede calcularse fácilmente si estas afinidades de unión se han medido, por ejemplo, por SPR.
En ciertos aspectos, un anticuerpo que se une específicamente a CEACAM5 no se une a proteínas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario, tales como CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8. En ciertos aspectos, un anticuerpo que se une específicamente a CEACAM5 también se une a CEACAM6 a una CE50 similar.
Como se usan en el presente documento, los términos "sin reactividad cruzada sustancial frente a CEACAM1 y/o CEACAM3, CEACAM4, CEACAM6, CEACAM7 y CEACAM8, no unión a dicha CEACAM" se refieren en el contexto de los anticuerpos biespecíficos según la invención a que dichos anticuerpos no muestran ninguna unión relevante a dicha CEACAM unida a membrana a concentraciones plasmáticas terapéuticas (1 a 1000 nM), en comparación con CEACAM5 unida a membrana. La no unión a CEACAM1 y/o CEACAM5, CEACAM6 y CEACAM8 puede determinarse mediante la medición basada en citometría de flujo de la curva de unión a células CHO recombinantes que expresen dicha CEACAM y a CEACAM3 y/o CEACAM4, y CEACAM7 mediante la medición de la curva de unión a células PEAK recombinantes que expresen dicha CEACAM o mediante un ensayo ELISA que mida la unión a las proteínas CEACAM recombinantes. Como se usan en el presente documento, los términos "no se une, que no se une a" un compuesto mencionado en el presente documento (por ejemplo, IgG humana), se refieren también a dicha unión no relevante o no reactividad cruzada. Por ejemplo, en un ELISA, los valores de DO para dichos compuestos no relacionados serán aproximadamente iguales a los del límite de detección.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo biespecífico que se une a CEA humano y CD3 humano, mAb CEAxCD3" significa un anticuerpo biespecífico que se une a CEACAM5 y CD3e humanos. Dichos anticuerpos son, por ejemplo, "CEA-TCB" y "CEA-TCB1". Como se usa en el presente documento, "CEA-TCB "se refiere a un anticuerpo biespecífico que se une a CEA y CD3, como se describe en el documento de patente US20140242079 como SEQ ID NO:1,2, 21 y 22.
Las secuencias de aminoácidos de CEA-TCB también se describen como SEQ ID NO:96 a 99. Como se usa en el presente documento, "CEA-TCB 1" se refiere a la molécula B en el formato "2+1 IgG CrossFab, invertido" con modificaciones de carga (intercambio VH/VL en el ligante de CD3, modificación de carga en el ligante de CEA, ligante de CEA humanizado); Figura 3B, SEQ ID NO:34, 36-38 del documento de patente WO2017055389). Las secuencias de aminoácidos de CEA-TCB 1 se describen como SEQ ID NO:92 a 95.
Otros mAb CEAxCD3 se describen en los documentos de patente WO2007071426, WO2013012414, WO2015112534, WO2017118675, US20140242079 y WO2017055389.
Otro mAb CEAxCD3 es RO6958688 (véase, por ejemplo, Bacac et al Clin. Cancer Res., 22(13), 3286-97 (2016). En una realización, dicho mAb CEAxCD3 es competitivo y/o se une al mismo epítopo de CEACAM5 humana que MAB CEA. En una realización, dicho mAb CEAxCD3 es competitivo y/o se une al mismo epítopo de CEACAM5 humana que MAB CEA1.
Como se usa en el presente documento "mAb contra CD3, anticuerpo contra CD3" se refiere a CD3£ humano (UniProtKB - P07766 (CD3E_HUMAN). El término "anticuerpo contra CD3£, anticuerpo anti-CD3£" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a CD3£. En una realización, el anticuerpo contra CD3£ se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo anti-CD3 SP34 (BD Biosciences, catálogo n.° 565983). En una realización, el anticuerpo contra CD3£ se une específicamente a un epítopo de CD3£ humano, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22. En una realización, el anticuerpo contra CD3£ se une específicamente a CD3£ humano y comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:90 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91.
En un aspecto, el anticuerpo biespecífico de la invención no compite con CEA-TCB y/o CEA-TCB 1 por la unión a CEA como se presenta en células MKN-45. Por lo tanto, CEA-TCB en una concentración de 300 nM (CEA-TCB) o 30 nM (CEA-TCB1) no desplazan la CE50 de la curva de índice de fagocitosis de dicho anticuerpo biespecífico de la invención para células MKN-45 en más de un factor de 3, en un aspecto hacia concentraciones más altas.
300 nM son una concentración medida en plasma de pacientes a dosis terapéuticamente eficaces de CEA-TCB ((J.Tabernero et.al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (resumen supl. 3002)). CEA-TCB 1 es en investigaciones preclínicas aproximadamente 10 a 100 veces más potente que CEA-TCB (afinidad de unión, lisis de células tumorales, documento de patente WO2017055389), por lo que el desplazamiento de la CE50 se ensaya a 30 nM.
La competencia en la unión puede determinarse mediante medición basada en citometría de flujo de la curva de unión a células MKN-45 y la determinación de la CE50 de esta curva de unión (véanse, por ejemplo, la Figura 2 y la Figura 11 para dichas curvas de unión). No competencia significa que la CE50 se desplaza en menos de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas, si se añaden 300 nM de MAB CEA o CEA-TCB al ensayo. 300 nM es una concentración en el intervalo de dosis/concentraciones plasmáticas terapéuticamente activas del anticuerpo biespecífico CEA*CD3 (CEA-TCB) (J.Tabernero et.al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (resumen supl. 3002)). La no competencia por MAB CEA1 o CEA-TCB1 significa que la CE50 se desplaza en menos de un factor de 3 si se añaden 30 nM de MAB CEA1 respectivamente CEA-TCB 1 al ensayo.
La competencia en la unión puede determinarse mediante medición basada en citometría de flujo de la curva de unión a células MKN-45 y la determinación de la CE50 de esta curva de unión (véanse la Figura 2 y la Figura 11 para dichas curvas de unión). No competencia significa que la CE50 cambia en menos de un factor de 3 si se añaden 300 nM de MAB CEA, o CEA-TCB al ensayo. 300 nM es una concentración en el intervalo de dosis/concentraciones plasmáticas terapéuticamente activas del anticuerpo biespecífico CEA*CD3 (CEA-TCB) (J.Tabernero et.al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (resumen supl. 3002)).
La no competencia por MAB CEA1 o CEA-TCB 1 significa que la CE50 se modifica en menos de un factor de 3 si se añaden 30 nM de MAB CEA1 respectivamente CEA-TCB1 al ensayo.
Como se usa en el presente documento, el término "no competitivo" significa que un segundo anticuerpo (MAB CEA, MAB CEA1 o un anticuerpo biespecífico CEAxCD3£, como CeA-TCB o CEA-TCB1) en una concentración de 300 nM (MAB-CEA, CEA-TCB) o 30 nM (MAB CEA1, CEA-TCB 1) no desplaza la CE50 de la curva de unión del anticuerpo biespecífico de la invención a células MKN-45 en más de un factor de 3, en una realización hacia concentraciones más altas. Como se usa en el presente documento, el término "competitivo" significa que un segundo anticuerpo (MAB CEA, MAB CEA1 o anticuerpo biespecífico CEAxCD3£, como CEA-TCB o CEA-TCB1) en una concentración de 300 nM respectivamente 30 nM (MAB CEA1 o CEA-TCB1) desplaza la CE50 de la curva de unión del anticuerpo biespecífico de la invención a células MKN-45 en más de un factor de 3, preferiblemente en más de un factor de 5 hacia concentraciones más altas.
Como se usa en el presente documento, el término "región determinante de la complementariedad" ("CDR") describe los sitios de combinación de antígenos no contiguos (también conocidos como regiones de unión a antígenos) que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las CDR también se denominan "regiones hipervariables" y este término se usa indistintamente en el presente documento con el término "CDR" en referencia a las porciones de la región variable que forman las regiones de unión a antígeno. Esta región particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. Como se usa en el presente documento, la "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de residuos de aminoácidos en el anticuerpo biespecífico según la invención son según el sistema de numeración de Kabat.
Como se usa en el presente documento, el término "ADCP" se refiere a la fagocitosis mediada por células dependientes de anticuerpos.
Como se usa en el presente documento, los términos "fagocitosis, valor de CE50 de fagocitosis, máximo de fagocitosis, índice de fagocitosis" se refieren a la fagocitosis medida con células MKN-45 mediante "formación de imágenes". Un método de obtención de imágenes apropiado, con incubación en una relación de células efectoras (macrófagos):célula diana (tumoral) de, por ejemplo 1: 1 o 1:3 y con el "índice de fagocitosis" como lectura (ADCP determinado por formación de imágenes") se describe en el Ejemplo 9.. La Figura 3B muestra el índice de fagocitosis máximo alcanzable como se determina en el intervalo de concentración ensayado de 0,1 o incluso inferior a aprox. 500 nM de anticuerpos biespecíficos TAA*CD47. Las figuras 12, 15 y 16 muestran los resultados de ADCP para anticuerpos biespecíficos según la invención K2AC5 y K2AC22 como se define en las reivindicaciones.
Tal como se utiliza en el presente documento "fagocitosis de dicho anticuerpo biespecífico" significa fagocitosis provocada/inducida por dicho anticuerpo. El anticuerpo K2AC22 comprende una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, en donde la primera parte de unión comprende una cadena pesada de SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de SEQ ID NO:65, y que la segunda parte de unión comprende una cadena pesada de SEQ ID<n>O:5 y una cadena ligera de SEQ ID NO:11. El anticuerpo K2AC5 comprende una primera parte de unión, que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una segunda parte de unión, que se une específicamente a CD47 humano, de modo que la primera parte de unión comprende una cadena pesada de SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de SEQ ID NO:64, y que la segunda parte de unión comprende una cadena pesada de SEQ ID<n>O:5 y una cadena ligera de SEQ ID NO:11. Los anticuerpos K2AC10, K2AC13 K2AC18, K2AC23, K2AC25, K2AC26, K2AC27, K2AC28, K2AC29 comprenden las mismas cadenas pesadas y cadena ligera de la segunda parte de unión, pero difieren en la cadena ligera de la primera parte de unión (véase la tabla 1, lista de secuencias).
Para más información sobre la fagocitosis en el campo, la fagocitosis también puede medirse mediante un método basado en citometría de flujo como el % de fagocitosis (véase el Ejemplo 9 y la Figura 3A para la dependencia del % de fagocitosis de las concentraciones de anticuerpos monovalentes TAA y CD47 y anticuerpo biespecífico contra TAA*CD47) y a una proporción de, por ejemplo, 3 macrófagos humanos por 1 célula diana/tumoral ("ADCP determinado por citometría de flujo").
Los términos "IgG humana, hIgG" se refieren a un preparado homogéneo de calidad clínica de inmunoglobulina IgG humana disponible comercialmente (de la empresa Bio-rad.com) que no se une específicamente a CD47 ni a CEACAM5.
Los anticuerpos producidos en células CHO suelen tener estructuras biantenarias complejas con muy poca o ninguna N-acetilglucosamina bisecante (GlcNAc bisecante) y altos niveles de fucosilación del núcleo. La sobreexpresión de la N-acetilglucosaminiltransferasa III se ha usado para aumentar la fracción de GlcNAc bisecante que reside en los anticuerpos con el fin de mejorar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). También se han usado tecnologías de ARNi y de deleción de genes para disminuir o eliminar la fucosa de los anticuerpos para aumentar drásticamente la actividad de ADCC (Davis J. et al.; Biotechnol. Bioeng. 2001;74:288-294; Saba jA, et al.; Anal. Biochem. 2002;305:16-31; Kanda Y, et al.; J. Biotechnol. 2007;130:300-310; Mori K, et al.; Biotechnol. Bioeng.
2004;88:901-908).
En una realización, el anticuerpo biespecífico según la invención es glucomanipulado. En una realización, el anticuerpo biespecífico glucomanipulado según la invención ha aumentado la actividad ADCC y/o ADCP (disminución de la CE50 y/o mayor índice máximo de fagocitosis) en comparación con el anticuerpo biespecífico que comprende una parte Fc incluida en SEQ ID NO:5 (anticuerpo parental), que comprende glucosilación según una producción en una línea celular CHO K1 (ATCC® Cc L-61™) en condiciones estándar (recipiente de 1000 ml, temperatura 37 °C, pH 7,0, velocidad del impulsor 80 rpm, oxígeno disuelto mínimo 30 %; tiempo de cultivo 14 días).
En una realización más particular, el aumento de la ADCC (disminución de la CE50 y/o aumento del máximo) es de un factor de 1,2 a 2,0 o incluso al menos 2,0 en comparación con dicho anticuerpo parental (véanse, por ejemplo, las figuras 13 y 14).
En una realización más particular, el aumento de la ADCP (disminución de la CE50 de la curva del índice de fagocitosis) es de un factor de al menos 3 o incluso 5 o más en comparación con dicho anticuerpo original (véanse, por ejemplo, las figuras 15 y 16).
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad GnTIII, GnTIII" se refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la adición de un residuo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en el enlace p-1-4 al manósido unido en p del núcleo trimanosílico de oligosacáridos unidos en N, por ejemplo, p-1,4-manosilglucoproteína-4-p-N-acetilglucosaminil-transferasa (EC 2.4.1.144).
Como se usa en el presente documento, el término "FUT8" se refiere a la a1,6-fucosiltransferasa (EC 2.4.1.68).
Como se usa en el presente documento, el término "función efectora, citotoxicidad celular mediada por Fc" se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, la afinidad de unión al receptor Fc, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCc ), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), la secreción de citocinas, la captación de antígenos mediada por complejos inmunitarios por parte de células presentadoras de antígenos, la regulación a la baja de receptores de la superficie celular, etc. Dicho mecanismo inmunitario conduce a la lisis de las "células diana" por las "células efectoras inmunitarias humanas".
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo glucomanipulado" se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención que comprende una cantidad reducida de oligosacáridos fucosilados y/o bisecados unidos a la región Fc de dicho anticuerpo, normalmente en el aminoácido Asn297, en comparación con un anticuerpo parental.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo parental, anticuerpo biespecífico parental" en el contexto de la glucomanipulación se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención que comprende la misma composición de aminoácidos que el anticuerpo glucomanipulado, pero que no está glucomanipulado. Para dicha comparación, el anticuerpo parental y el anticuerpo glucomanipulado se producen en la misma célula hospedadora, pero en el primer caso en la célula hospedadora sin glucomanipulación, y en el segundo caso en la misma célula hospedadora pero glucomanipulada mediante inactivación dirigida del gen FUT8 o manipulada expresando un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnTIII en condiciones estándar (véase más arriba).
Como se usa en el presente documento, el término "células efectoras inmunitarias humanas" se refiere a una población de leucocitos que muestran receptores de Fc en sus superficies, a través de los cuales se unen a la región Fc de moléculas de unión a antígeno o de proteínas de fusión de Fc y realizan funciones efectoras. Dicha población puede incluir, pero no se limita a, células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y/o linfocitos citolíticos naturales (NK) y/o macrófagos.
Como se usa en el presente documento, el término "aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fc" se define como un aumento del número de "células diana" que se lisan en un tiempo dado, a una concentración dada del anticuerpo biespecífico de la invención en el medio que rodea a las células diana, por el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc definido anteriormente, y/o una reducción en la concentración del anticuerpo biespecífico de la invención, en el medio que rodea a las células diana, necesaria para conseguir la lisis de un número dado de "células diana" en un tiempo dado, por el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc. El aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fc es relativo a la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo biespecífico de la invención producido por el mismo tipo de células hospedadoras, usando las mismas condiciones estándar, pero que no ha sido producido por células hospedadoras manipuladas para tener un patrón alterado de glucosilación (por ejemplo, para expresar la glucosiltransferasa, GnTIII, u otras glucosiltransferasas o la inactivación de FUT8) por los métodos descritos en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "vector de expresión" se refiere a uno o más vectores que comprenden las cadenas pesada y ligera del anticuerpo según la invención de una manera apropiada como se conoce del estado de la técnica.
Como se usa en el presente documento, "células hospedadoras manipuladas mediante inactivación dirigida del gen FUT8" se refiere a células hospedadoras capaces de expresar un anticuerpo según la invención y que además han sido glucomanipuladas mediante inactivación dirigida del gen FUT8 como se describe, por ejemplo, en los documentos de patente US8067232, US7425446, US6946292
y Yamane-Ohnuki N. et al., Biotech. Bioeng.; 87 (2004) 614-622. Un anticuerpo según la invención expresado en dicha célula hospedadora comprende una región Fc que comprende cadenas de azúcar complejas unidas con N-glucósido unidas a la región Fc, que comprenden un extremo reductor que contiene una N-acetilglucosamina, en donde las cadenas de azúcar no contienen fucosa unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de las cadenas de azúcar.
La presente invención se refiere además a un método para la producción de un anticuerpo biespecífico según la presente invención caracterizado por comprender una no fucosilación del 50 % al 100 %, 60 % al 100 %, 70 % al 100 %, 80 % al 100 %, o 90 % al 100 %, que son producidos por una célula hospedadora, que comprende expresar en dicha célula hospedadora un ácido nucleico que codifica un anticuerpo biespecífico de la invención y un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad de glucosiltransferasa, o un vector que comprende dichos ácidos nucleicos. Los genes con actividad de glucosiltransferasa incluyen (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), amanosidasa II (Manll), (1,4)-galactosiltransferasa (GalT), (1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnTI) y p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnTII). En una realización, se expresa una combinación de genes con actividad de glucosiltransferasa en la célula hospedadora (por ejemplo, GnTIII y Man II). Asimismo, el método también abarca la expresión de uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo biespecífico en una célula hospedadora en la que se ha inactivado o desactivado de otro modo un gen de glucosiltransferasa (por ejemplo, una célula hospedadora en la que se ha inactivado la actividad del gen que codifica la fucosiltransferasa de núcleo al-6). En otra realización, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención pueden producirse en una célula hospedadora que expresa además un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnTIII para modificar el patrón de glucosilación. En una realización específica, el polipéptido que tiene actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización de Golgi de un polipéptido residente de Golgi. En otra realización preferida, la expresión de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención en una célula hospedadora que expresa un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de GnTIII da como resultado anticuerpos biespecíficos con mayor afinidad de unión al receptor de Fc y mayor función efectora.
La presente invención se dirige además a un método para la producción de un anticuerpo biespecífico según la presente invención caracterizado por comprender no fucosilación del 50 % al 100 %, 60 % al 100 %, 70 % al 100 %, 80 % al 100 %, o 90 % al 100 %, que son producidos por una célula hospedadora, que comprende expresar en dicha célula hospedadora un ácido nucleico que codifica un anticuerpo biespecífico de la invención y un gen FUT8 inactivado.
En una realización, los anticuerpos biespecíficos con glucosilación alterada producidos por las células hospedadoras de la invención presentan una afinidad de unión al receptor de Fc aumentada y/o una función efectora aumentada como resultado de la modificación de la célula hospedadora (por ejemplo, mediante la expresión de un gen de glucosiltransferasa). Preferiblemente, el aumento de la afinidad de unión al receptor de Fc es un aumento de la unión a un receptor activador de Fcy, tal como el receptor FcYRIIIa.
En una realización, el porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es del 50 % al 100 %, específicamente del 60 % al 100 %, del 70 % al 100 %, y más específicamente, del 80 % al 100 %. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser de tipo híbrido o complejo. En otra realización, el anticuerpo biespecífico producido por los métodos de la divulgación
tiene una proporción aumentada de oligosacáridos bisecados en la región Fc como resultado de la modificación de sus oligosacáridos por los métodos de la presente divulgación. En una realización, el porcentaje de oligosacáridos bisecados es del 50% al 100%, específicamente 50%, 60% a 70%, y más específicamente, 80%. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo biespecífico producido por las células hospedadoras y los métodos de la divulgación tiene una proporción aumentada de oligosacáridos bisecados no fucosilados en la región Fc. Los oligosacáridos bisecados no fucosilados pueden ser híbridos o complejos.
Como se usa en el presente documento, el término "célula hospedadora" abarca cualquier tipo de sistema celular que pueda manipularse para generar los anticuerpos biespecíficos de la presente invención. En una realización, la célula hospedadora está manipulada para permitir la producción de una molécula de unión a antígeno con glucoformas modificadas. En ciertas realizaciones, las células hospedadoras han sido manipuladas adicionalmente para expresar niveles aumentados de uno o más polipéptidos que tienen actividad de GnTIII. Las células hospedadoras incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO (véase más arriba), células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido vegetal o animal cultivado. Se han descrito células hospedadoras para la producción de anticuerpos biespecíficos glucomanipulados de la presente invención, por ejemplo, en los documentos de patente US6602684, US20040241817, US20030175884; y WO 2004065540. Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención pueden glucomanipularse alternativamente para que tengan residuos de fucosa reducidos en la región Fc según las técnicas descritas en los documentos de patente US2003/0157108, EP1176195, WO2003084570, WO2003085119 y US2003/0115614, US2004/093621, US2004/110282, US2004/110704, US2004/132140.
Los anticuerpos biespecíficos glucomanipulados de la invención también pueden producirse en sistemas de expresión que producen glucoproteínas modificadas, tales como las descritas en los documentos de patente WO2003/056914, WO2004/057002 y WO2004/024927.
En otra realización de la invención, el anticuerpo según la invención comprende una o dos o tres sustituciones de aminoácidos en la región Fc ("sustitución de aminoácidos Fc") seleccionadas del grupo que consiste en monosustituciones S239D, I332E, G236A, bisustituciones I332E y g 236A, S239D e I332E ("sustitución DE"), S239D y G236A, y sustituciones triples S329D e I332E y G236A ("sustitución DEA"); (Richards JO, et al., Mol. Cáncer Ther.
7 (2008) 2517-2527). Debido al diferente recuento de una cadena pesada, estos números de aminoácidos pueden ser diferentes para /- uno, dos o tres aminoácidos, pero con el mismo desplazamiento para los tres. En el caso de la cadena pesada de SEQ ID NO:5 hay un cambio de un aminoácido y S329D e I332E y G236A por lo tanto denota S328D e I331E y G235A. SEQ ID: NO:5 con sustitución DE se muestra en SEQ ID NO:23 y SEQ ID: NO:5 con sustitución DEA se muestra en SEQ ID NO:24. La actividad de ADCC y/o ADCP del anticuerpo biespecífico puede aumentarse mediante dicha modificación de aminoácidos de la parte Fc.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo parental, anticuerpo biespecífico parental" en el contexto de la sustitución Fc se refiere a un anticuerpo biespecífico según la invención que comprende la misma composición de aminoácidos que el anticuerpo sustituido Fc, pero sin dicha(s) sustitución (sustituciones). Para dicha comparación, el anticuerpo parental y el anticuerpo sustituido en Fc se producen -como en el caso de los anticuerpos glucomanipulados- en la misma célula hospedadora en las mismas condiciones, pero en el primer caso en la célula hospedadora sin sustitución de Fc, y en el segundo caso en la misma célula hospedadora pero con dicha(s) sustitución (sustituciones) de Fc. Una línea de células hospedadoras útil es, por ejemplo, CHO-K1.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo parental, anticuerpo biespecífico parental" en el contexto de un anticuerpo biespecífico según la invención que comprende la sustitución de Fc y está glucomanipulado, dicho anticuerpo parental es, por tanto, el anticuerpo biespecífico respectivo que comprende la misma composición de aminoácidos que el anticuerpo sustituido de Fc, pero sin dicha(s) sustitución (sustituciones) y no está glucomanipulado.
En otra realización de la invención, la actividad ADCC y/o ADCP del anticuerpo biespecífico se aumenta mediante la sustitución de aminoácidos de la parte Fc en combinación con la glucomanipulación de la parte Fc en comparación con la actividad de ADCC y/o ADC<p>del anticuerpo parental respectivo.
La invención comprende, por lo tanto, en una realización un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a CEACAM5 humana y CD47 humano como se define en las reivindicaciones, caracterizado por comprender una o dos o tres sustituciones de aminoácidos en la región Fc ("sustitución de aminoácidos de Fc") seleccionadas del grupo que consiste en monosustituciones S239D, I332E, G236A, bisustituciones I332E y G236A, S239D e I332E, sustituciones triples S329D e I332E y G236A y que comprenden una no fucosilación de la parte Fc del 50 % al 100 %, del 60 % al 100 %, del 70 % al 100 %, del 80 % al 100 %, o del 90 % al 100 %.
El Ejemplo 9 describe ensayos usados para la determinación de la actividad de ADCC y también de la actividad de ADCP
La ADCC puede medirse mediante un ensayo de ADCCin vitrocomo sigue:
1) el ensayo usa células diana que se sabe que expresan CEA reconocido por la región de unión a CEA del anticuerpo biespecífico;
2) el ensayo usa células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana, aisladas de la sangre de un donante sano elegido al azar, como células efectoras.
3) el ensayo se lleva a cabo según el siguiente protocolo:
i) las CMSP se aíslan usando procedimientos estándar de centrifugación por densidad y se suspenden a 6,25 x 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI;
ii) las células diana se cultivan mediante métodos estándar de cultivo tisular, se recogen de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior al 90 %, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 microCuries de 51Cr por 1 x 106 células, se lavan dos veces con medio de cultivo celular y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 0,25 x 106 células/ml;
iii) se transfieren 20 microlitros de la suspensión final de células diana anterior a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos;
iv) el anticuerpo biespecífico se diluye en serie de 4000 ng/ml a 0,12 ng/ml en medio de cultivo celular y se añaden 20 microlitros de las disoluciones de anticuerpo resultantes a las células diana en la placa de microtitulación de 96 pocillos, probando por triplicado varias concentraciones de anticuerpo que cubran todo el intervalo de concentraciones anterior;
v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pocillos adicionales de la placa que contiene las células diana marcadas, reciben 50 microlitros de una disolución acuosa al 5 % (V/V) de detergente no iónico (Tritón, Sigma, St. Louis), en lugar de la disolución de anticuerpos biespecíficos (punto iv anterior).
vi) para los controles de liberación espontánea (SR), 3 pocillos adicionales de la placa que contiene las células diana marcadas, reciben 20 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la disolución de anticuerpos biespecíficos (punto iv anterior)
vii) a continuación, se centrifuga la placa de microtitulación de 96 pocillos a 50 * g durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4 °C;
viii) se añaden 40 microlitros de la suspensión de CMSP (punto i anterior) a cada pocillo para obtener una proporción de células efectoras:diana (E:T) de 50:1 y se colocan las placas en una incubadora con una atmósfera al 5 % de CO2 a 37 °C durante 4 horas;
ix) se recoge el sobrenadante sin células de cada pocillo y se cuantifica la radiactividad liberada experimentalmente (ER) usando un contador gamma;
x) se calcula el porcentaje de lisis específica para cada concentración de anticuerpo biespecífico según la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) * 100, donde ER es la radiactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para esa concentración de anticuerpo, MR es la radiactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles Mr (véase el punto v anterior) y SR es la radiactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles SR (véase el punto vi anterior).
Como se usa en el presente documento, "aumento de ADCC" se define como un aumento del porcentaje máximo de lisis específica observado dentro del intervalo de concentración de anticuerpos biespecíficos ensayado anteriormente, y/o una reducción en la concentración de anticuerpo biespecífico necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje máximo de lisis específica (CE50) observado dentro del intervalo de concentración de anticuerpos biespecíficos ensayado anteriormente. El aumento de ADCC es con respecto a ADCC, medido con el ensayo anterior, mediado por el mismo anticuerpo biespecífico, producido por el mismo tipo de células hospedadoras, usando los mismos métodos estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento, pero que no ha sido producido por células hospedadoras manipuladas para sobreexpresar GnTIII o por células hospedadoras manipuladas por inactivación dirigida del gen FUT8 ("anticuerpo parental"). En el caso de sustituciones de aminoácidos en el Fc, el aumento en ADCC es relativo a ADCC medido con el anticuerpo biespecífico parental que no lleva la(s) sustitución (sustituciones). En el caso de un anticuerpo biespecífico que contenga sustituciones de aminoácidos en la parte Fc y esté glucomanipulado, el aumento en ADCC es con respecto a ADCC medido con el anticuerpo biespecífico parental no glucomanipulado que no contenga la(s) sustitución (sustituciones).
Aplicaciones terapéuticas y métodos de uso de moléculas de unión al antígeno anti-CEA
Los anticuerpos biespecíficos CEACAM * CD47 según la invención están optimizados para el tratamiento de tumores sólidos principalmente mediante la fagocitosis de los células tumorales mediada por macrófagos, ya sea en monoterapia o en terapia combinada especialmente junto con un anticuerpo biespecífico de linfocitos T CEAxCD3 como CEA-TCB o CEA-TCB 1 y/o antagonista del eje PD-1. El anticuerpo según la invención y el anticuerpo biespecífico de células T CEAxCD3 se pueden administrar tal como se describe más adelante.
En una realización particular, la enfermedad o tumor sólido es un cáncer que expresa o incluso sobreexpresa CEA, que incluye, pero no se limita a, el grupo de tumores colorrectales, tumores broncopulmonares no microcíticos, tumores gástricos, tumores pancreáticos y tumores de mama. En una realización particular, el tumor es un tumor colorrectal. Todas las aplicaciones terapéuticas, métodos de uso, usos, combinaciones, etc., descritos en el presente documento son especialmente realizaciones para el tratamiento de estos tumores/enfermedades.
Los inventores reconocen que los anticuerpos según la invención muestran bajo o ningún potencial de formación de ADA respectivamente pérdida de exposición debido a la neutralización de ADA respectivamente pérdida de eficacia.
En una realización, los anticuerpos biespecíficos según la invención son para uso en un método de tratamiento de carcinomas (cáncer, tumores, por ejemplo, carcinomas humanos), especialmente tumores que expresan CEA,in vivo.Este método comprende administrar a un sujeto una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición que contiene un anticuerpo biespecífico de la invención. Por "sujeto" se entiende un sujeto humano, en una realización un paciente que padece cáncer/tumor/carcinoma.
La expresión de CEA en diversas entidades tumorales es generalmente muy alta, especialmente en carcinoma colorrectal, adenocarcinoma pancreático, cáncer gástrico, carcinoma broncopulmonar no microcítico, cáncer de mama, carcinoma de cabeza y cuello, cánceres uterino y de vejiga, entre otros. En los epitelios glandulares sanos y normales del tubo gastrointestinal, el CEA se expresa principalmente en un patrón polarizado en la superficie apical de las células. Este patrón de expresión polarizado limita la accesibilidad de los anticuerpos mono o biespecíficos antiCEA que se administran por vía sistémica y, por tanto, su posible toxicidad. Junto con la unión a CD47 de baja afinidad del anticuerpo de la invención, esto da lugar a una fagocitosis limitada o nula de dichas células normales por el anticuerpo de la invención. Este patrón de expresión polarizado se pierde en las células de los tumores gastrointestinales y otros tumores malignos. CEA se expresa por igual en toda la superficie celular de las células cancerosas, lo que significa que las células cancerosas son mucho más accesibles a un anticuerpo de la invención que las células sanas normales y pueden ser eliminadas selectivamente por los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención, respectivamente por las combinaciones mencionadas anteriormente.
En una realización, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención pueden usarse en monoterapia para el tratamiento de tumores sólidos avanzados, en una realización tumores que expresan CEA. En una realización un anticuerpo biespecífico según la invención es para uso en combinación con un mAb CEAxCD3 en combinación simultánea, separada o secuencial. En una realización, un anticuerpo biespecífico según la invención se usa en combinación con un mAb CEAxCD3 y/o un antagonista del eje PD-1 en combinación simultánea, separada o secuencial. En una realización, un anticuerpo biespecífico según la invención se usa en combinación con un antagonista del eje PD-1 en combinación simultánea, separada o secuencial. Dichos antagonistas del eje PD-1 se describen, por ejemplo, en el documento de patente WO2017118675. Estas combinaciones atacan el cáncer sólido mediante macrófagos y células T. Dos mAb CEAxCD3 están en desarrollo clínico (CEA-TCB y CEA-TCB1; véase clinicaltrials.gov; RO6958688 en NCT3866239 y RO7172508 en NCT03539484). M<e>DI-565 estaba en desarrollo clínico pero no se pudo identificar ningún ensayo clínico activo en clinicaltrials.gov. En una realización como anticuerpo biespecífico contra CEA y CD3, se usa el anticuerpo CEA-TCB o CEA-TCB 1.
El ligando a CEA usado en CEA-TCB ha derivado del anticuerpo anti-CEA PR1A3 (véase, por ejemplo, el documento de patente EP2681244B1). Este anticuerpo se une al denominado dominio B3 del CEA. CEA-TCB tiene una baja afinidad de unión en nM al CEA y muestra eficacia en dosis altas (entre 40 y 600 mg por dosis y paciente; (véase, por ejemplo, J.Tabemero et.al., J. Clin. Oncol. 35, 2017 (resumen supl. 3002)). A estas dosis, casi todas las dianas de CEA en las superficies celulares están ocupadas por el CEA-TCB. La combinación de CEA-TCB o CEA-TCB 1 y CEAxCD47 genera niveles plasmáticos terapéuticos de ambos fármacos al mismo tiempo y consigue mejores resultados (aditivos o incluso sinérgicos), si ambos fármacos no son competitivos para el antígeno CEA.
Como se usa en el presente documento, los términos "combinación, combinación simultánea, separada o secuencial" de un anticuerpo según la invención y un segundo anticuerpo biespecífico, que se une a CEA humano y CD3<e>humano, se refieren a cualquier administración de los dos anticuerpos (o tres anticuerpos en caso de la combinación de un anticuerpo de la invención, un mAb CEAxCD3 y un antagonista del eje PD-1), ya sea por separado o conjuntamente, donde los dos o tres anticuerpos se administran como parte de un régimen de dosis apropiado diseñado para obtener el beneficio de la terapia combinada, por ejemplo en administración separada, secuencial, simultánea, concurrente, escalonada cronológicamente o alternada. Por lo tanto, los dos o tres anticuerpos pueden administrarse como parte de la misma composición farmacéutica o en composiciones farmacéuticas separadas. El anticuerpo según la invención se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de la administración del segundo anticuerpo biespecífico, o en alguna combinación de los mismos. Cuando el anticuerpo según la invención se administra al paciente a intervalos repetidos, por ejemplo, durante un ciclo estándar de tratamiento, el segundo anticuerpo biespecífico puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de cada administración del anticuerpo de la invención o alguna combinación de los mismos, o a intervalos diferentes en relación con el tratamiento con el anticuerpo de la invención, o en una dosis única antes, en cualquier momento durante o después del ciclo de tratamiento con el anticuerpo de la invención. En una realización, el anticuerpo según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico se administran en administración alterna, en una realización en intervalos de 6 a 15 días entre la administración del anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo. En dicha administración alterna, la primera dosis puede ser el anticuerpo de la invención o el segundo anticuerpo.
El término "antagonista del eje PD-1" se refiere a un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1. Los anticuerpos anti-PD-1 son, por ejemplo, pembrolizumab (Keytruda®, MK-3475), nivolumab, pidilizumab, lambrolizumab, MEDI-0680, PDR001 y REGN2810. Los anticuerpos anti-PD-1 se describen, por ejemplo, en los documentos de patente WO200815671, WO2013173223, WO2015026634, US7521051, US8008449, US8354509, WO20091 14335, WO2015026634, WO2008156712, WO2015026634, WO2003099196, WO2009101611, WO2010/027423, WO2010/027827, WO2010/027828, WO2008/156712 y WO2008/156712.
Los anticuerpos anti-PD-Ll son, por ejemplo, atezolizumab, MDX-1 105, durvalumab y avelumab. Los anticuerpos anti-PD-Ll se describen, por ejemplo, en los documentos de patente WO2015026634, WO2013/019906, WO2010077634, US8383796, WO2010077634, WO2007005874 y WO2016007235.
Con respecto a la administración combinada del anticuerpo según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico, ambos compuestos pueden estar presentes en una forma de dosificación única o en formas de dosificación separadas, por ejemplo en dos formas de dosificación diferentes o idénticas.
Si el anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo no compiten con respecto a CEACAM5, en una realización, ambos anticuerpos, si lo desea el médico, pueden administrarse simultáneamente. Si el anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo compiten con respecto a CEACAM5, en una realización ambos anticuerpos se administran en administración alterna.
El anticuerpo de la invención normalmente se administrará al paciente en un régimen de dosis que proporcione el tratamiento más eficaz del cáncer (tanto desde el punto de vista de la eficacia como de la seguridad) del que se está tratando al paciente, tal como se conoce en la técnica. Preferiblemente, los células tumorales son atacadas al mismo tiempo por linfocitos T y macrófagos, para alcanzar el pleno potencial terapéutico de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos CEA-CD3 y CEAxCD47 tienen que ser no competitivos con respecto a la unión al CEA en la superficie celular.
Tal como se ha explicado anteriormente, la cantidad de anticuerpo administrada y el momento de la administración del anticuerpo de la invención pueden depender del tipo (por ejemplo, sexo, edad, peso) y la condición general del paciente que se está tratando, la gravedad de la enfermedad o afección que se está tratando y de la vía de administración. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención y el segundo anticuerpo se pueden administrar a un paciente en dosis que varían de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal por día o por semana en dosis únicas o divididas, o mediante infusión continua. En una realización, cada uno de los anticuerpos de la invención y el segundo anticuerpo se administra a un paciente en dosis que oscilan de 0,1 a 20 mg/kg. En algunos casos, pueden ser adecuados niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aún mayores sin causar ningún efecto secundario perjudicial.
Como se usa en el presente documento, el término "semivida del anticuerpo" se refiere a la semivida de dicho anticuerpo como se mide en un ensayo farmacocinético habitual, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 17. Un anticuerpo según la invención y el segundo anticuerpo biespecífico contra CEA y CD3 tienen una semivida de eliminación de 3 a 14 días.
En otro aspecto, la invención también se refiere al anticuerpo biespecífico según la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades, particularmente trastornos de proliferación celular en donde se expresa CEA, particularmente en donde CEA se expresa anormalmente (por ejemplo, se sobreexpresa o se expresa en un patrón diferente en la superficie celular) en comparación con tejido normal del mismo tipo celular. Dichos trastornos incluyen, entre otros, cáncer colorrectal, NSCLC (carcinoma broncopulmonar no microcítico), cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama. Los niveles de expresión de CEA pueden determinarse por métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, mediante ensayo inmunohistoquímico, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo inmunoenzimático, ELISA, citometría de flujo, radioinmunoensayo, etc.).
En un aspecto, los anticuerpos biespecíficos de la presente invención pueden usarse para dirigirse a célulasin vivooin vitroque expresan CEA. Los anticuerpos biespecíficos de la invención son particularmente útiles en la prevención de la formación de tumores, la erradicación de tumores y la inhibición del crecimiento o metástasis de tumores mediante la inducción de ADCP y ADCC de células tumorales. Los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden usarse para tratar cualquier tumor que exprese CEA. Los tumores malignos particulares que pueden tratarse con los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen, pero no se limitan a, cáncer colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico, cáncer gástrico, cáncer de páncreas y cáncer de mama.
Los anticuerpos biespecíficos de la invención se administran a un mamífero, preferentemente un ser humano, en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable tal como las que se analizan a continuación, incluidas aquellas que se pueden administrar a un ser humano por vía intravenosa en embolada o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los anticuerpos biespecíficos de la invención también se administran adecuadamente por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para que ejerzan efectos terapéuticos tanto locales como sistémicos.
Para el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpos biespecíficos de la invención dependerá del tipo de enfermedad que hay que tratar, la gravedad y el curso de la enfermedad, la terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico tratante. El anticuerpo biespecífico de la invención se administra adecuadamente al paciente de una sola vez o durante una serie de tratamientos. La presente divulgación proporciona un método para eliminar selectivamente células tumorales que expresan CEA.
Este método comprende la interacción de los anticuerpos biespecíficos de la invención con dichas células tumorales. Estas células tumorales pueden ser de un carcinoma humano, incluyendo carcinoma colorrectal, carcinoma broncopulmonar no microcítico (NSCLC), carcinoma gástrico, carcinoma pancreático y carcinoma de mama.
En otro aspecto, la invención se refiere a los anticuerpos biespecíficos de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con la expresión anormal de CEA. En una realización particular, la enfermedad es un cáncer que expresa o incluso sobreexpresa CEA, que incluye, pero no se limita a, tumor colorrectal, tumor broncopulmonar no microcítico, tumor gástrico, tumor pancreático y tumor de mama. En una realización particular, el tumor es un tumor colorrectal.
Composiciones, formulaciones, dosificaciones y vías de administración
En un aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos biespecíficos de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere además a dichas composiciones farmacéuticas para su uso en el método de tratamiento de la enfermedad, tal como cáncer. Específicamente, el anticuerpo biespecífico de la presente invención es para uso en un método para el tratamiento de la enfermedad, y más particularmente, para el tratamiento del cáncer, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención.
En un aspecto, la presente invención abarca composiciones y combinaciones farmacéuticas, adecuadas para su uso en métodos para el tratamiento de carcinomas humanos, tumores, como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, la invención incluye composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de carcinomas humanos que comprenden una cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones de anticuerpos biespecíficos de la invención se pueden administrar usando modos de administración convencionales que incluyen, pero sin limitación, administración intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática o intratumoral directa. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea.
En un aspecto de la invención, las formulaciones terapéuticas que contienen los anticuerpos biespecíficos de la invención se preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o formulaciones líquidas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Las formulaciones que se utilizarán para la administraciónin vivodeben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. El modo más eficaz de administración y régimen de dosificación para las composiciones farmacéuticas de la presente invención depende de la gravedad y el curso de la enfermedad, la condición general del paciente y la respuesta al tratamiento y el criterio del médico tratante. En consecuencia, las dosis de las composiciones pueden ser dosis fijas o pueden adaptarse al paciente individual, por ejemplo el peso corporal. Sin embargo, una dosis eficaz de las composiciones de esta invención se encontrará generalmente en el intervalo de 0,1 a 20 mg/kg.
Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención tienen un peso molecular en una magnitud de 150kD por mol. Llevan en una realización una parte Fc. La semivida de eliminación en pacientes se encuentra en el intervalo de 3 a 14 días. Esta semivida permite, pero no se limita a, la administración una vez al día, una vez a la semana o una vez cada dos semanas.
Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención y sus respectivas composiciones pueden estar presentes en una diversidad de formas de dosificación que incluyen, pero sin limitación, soluciones o suspensiones líquidas, comprimidos, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas y soluciones inyectables o infundibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica.
La composición que comprende un anticuerpo biespecífico de la presente invención se formulará, dosificará y administrará de forma consistente con la buena práctica médica. Los factores que se deben considerar en este contexto incluyen la enfermedad o trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el lugar de administración del agente, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos.
Artículos de fabricación
En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de solución intravenosa, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz por sí misma o combinada con otra composición para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un principio activo de la composición es un anticuerpo biespecífico de la invención. La etiqueta o el prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo biespecífico de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o terapéutico adicional. El artículo de fabricación en esta realización de la invención puede comprender además un prospecto que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Tabla 1: LISTA DE SECUENCIAS
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Clonación, expresión y purificación de CD47 humano
Clonación
La secuencia correspondiente al dominio extracelular de CD47 humano (hCD47) se amplifica a partir de ADNc humano mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando oligonucleótidos específicos. El producto de la amplificación se purifica en gel y se clona en el vector de expresión de mamíferos pEAK8 (Edge Biosystems, Gaithersburg, Md.). El vector se modifica además para introducir una marca Avitag™ (Avidity, Denver, Colorado) y una marca de hexa-histidina en el extremo C, lo que permite la biotinilación de la proteína en un solo sitio y la purificación por IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados), respectivamente. Las construcciones se verifican mediante secuenciación del ADN.
Expresión
A continuación, el plásmido se transfecta en células de mamífero usando un reactivo de transfección basado en liposomas, como Lipofectamine2000 (Thermofisher Scientific). La etapa de transfección solo requiere pequeñas cantidades de ADN y células, normalmente 2*105 células y 2 |jg de ADN plasmídico por pocillo, y la transfección se lleva a cabo en una placa de 6 pocillos. Aunque pueden usarse diferentes líneas celulares de mamíferos, en los ejemplos que se dan a continuación se transfectan células epiteliales de monocapa de riñón de embrión humano transformadas (células PEAK). Estas células expresan de forma estable el gen EBNA-1, apoyando aún más el proceso de replicación episómica, son semiadherentes y pueden crecer en condiciones de cultivo celular estándar (5 % de CO2; 37 °C en medio DMEM complementado con 10 % de suero fetal de ternera). Tras 24 h, las células se colocan en condiciones selectivas añadiendo medio que contenga 0,5-2 jg/m l de puromicina: las células que albergan el vector episómico son resistentes a este antibiótico.
De dos a tres semanas después de la transfección, las células amplificadas y seleccionadas se inyectaron en biorreactores desechables CELLine™ para la etapa de producción. CELLine™ es un biorreactor de dos compartimentos que puede usarse en una incubadora de cultivo celular estándar. El compartimento más pequeño (15 ml) contiene las células y está separado de un compartimento más grande (un litro) que contiene el medio por una membrana semipermeable con un tamaño de corte de 10 kDa (Bruce et al. 2002, McDonald et al. 2005). Este sistema permite la difusión de nutrientes, gases y productos metabólicos de desecho, a la vez que retiene las células y las proteínas secretadas en el compartimento más pequeño. El cultivo se mantiene durante 7-10 días antes de recoger el sobrenadante. Como el medio contiene suero, las células mantienen una buena viabilidad y pueden generarse varias series de producción usando las mismas células y envases.
Purificación
Tras la cosecha, los sobrenadantes del cultivo celular se clarifican por centrifugación. A continuación, el sobrenadante se complementa con imidazol 100 mM y se carga en resina de cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). La concentración relativamente alta de imidazol minimiza la unión de contaminantes a la resina. Tras lavar la columna, las proteínas se eluyen a un caudal de 2 ml/min usando un gradiente de imidazol de 30 ml (imidazol 20-400 mM) en un sistema de cromatografía AKTA Prime (Amersham Pharmacia Biotech). El gradiente de elución mejora aún más la pureza de la proteína recombinante, pero puede sustituirse por un enfoque de elución en etapas si no se dispone de un sistema de cromatografía. Las fracciones eluidas pueden analizarse por SDS-PAGE o ELISA para determinar su contenido en proteína recombinante. Las fracciones de interés se agrupan y desalan en columnas Amicon 10KD (Millipore) equilibradas con tampón fosfato salino u otro tampón apropiado. A continuación, las proteínas desaladas pueden cuantificarse mediante diversas técnicas y su pureza puede analizarse por SDS-PAGE. La CD47 recombinante se biotinilain vitrousando biotina ligasa (Avidity, Denver Colo.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la desalación, el nivel de biotinilación se evalúa mediante ensayos de captura usando perlas magnéticas de estreptavidina y análisis de SDS-PAGE.
Ejemplo 2 Clonación, expresión y purificación de miembros humanos de la familia CEACAM
Clonación
La secuencia correspondiente al dominio extracelular completo (ECD) y los dominios A3-B3 de CEACAM5 fueron sintetizados por Eurofins y Twist Bioscience. Estos genes sintéticos se subclonaron en el vector de expresión para mamíferos pEAK8 (Edge Biosystems, Gaithersburg, Md.). Los vectores se modificaron para introducir un Avitag™ (Avidity, Denver Colo.) y una marca de hexa-histidina, una región Fc humana o una región Fc de ratón en el extremo carboxiterminal. Las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN. La purificación de la proteína soluble recombinante se llevó a cabo mediante IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados), FcXL o CaptureSelect™ IgG-Fc (ms) Affinity Matrix (Thermofisher Scientific).
También se generaron vectores que codifican la versión de longitud completa de CEACAM humana 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 18, 19, 20, 21 y CEACAM5 de cangrejero para su expresión en la superficie celular de células PEAK y/o CHO. También se clonó de forma similar la CEACAM16 humana soluble y de longitud completa.
Expresión y purificación
La expresión, purificación y biotinilación de las proteínas recombinantes mencionadas se llevó a cabo como se detalla en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3 Selección mediante presentación en fagos de Fv de CEACAM5 usando bibliotecas de scFv humanos que contienen un dominio pesado variable fijo
Los procedimientos generales para la construcción y manipulación de bibliotecas de scFv humanos presentadas en el bacteriófago M13 se describen en Vaughan et al. (Nat. Biotech. 1996, 14:309-314). Las bibliotecas para selección y cribado codifican scFv que comparten todos el mismo dominio VH y se diversifican únicamente en el dominio VL. Los métodos para la generación de bibliotecas VH fijas y su uso para la identificación y el ensamblaje de anticuerpos biespecíficos se describen en los documentos de patente US 2012/0184716 y WO 2012/023053.
Los procedimientos para identificar la unión de scFv a CECAM5 humana se describen a continuación.
Selecciones de proteínas
Se bloquean alícuotas de bibliotecas de fagos scFv (1012 ufp) con PBS que contiene 3 % (p/v) de leche desnatada durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. Los fagos bloqueados se deseleccionan en perlas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads™ M-280) durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador giratorio. Los fagos deseleccionados se incuban con 100 nM de CEACAM5 humana biotinilada o del dominio A3-B3 capturado en perlas magnéticas de estreptavidina durante dos horas a temperatura ambiente en un mezclador giratorio. Las perlas se capturan usando un soporte magnético seguido de cinco lavados con PBS/0,1 % de Tween 20 y dos lavados con PBS. Los fagos se eluyen con TEA 100 nM durante 30 minutos a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. El fago eluido y las perlas se neutralizan con Tris-HCl 1 M pH 7,4 y se añaden directamente a 10 ml de células TG1 de crecimiento exponencial y se incuban durante una hora a 37 °C con agitación lenta (90 rpm). Se diluye en serie una alícuota de TG1 infectadas para valorar el producto de selección. Las TG1 infectadas restantes se centrifugan a 3800 rpm durante 10 minutos, se resuspenden en 2 ml de 2xTY y se extienden en placas de bioensayo de agar 2xTYAG (medio 2xTY que contiene 100 pg/ml de ampicilina y 2 % de glucosa). Tras una incubación durante la noche a 30 °C, se añaden 10 ml de 2xTY a las placas y se raspan las células de la superficie y se transfieren a un tubo de polipropileno de 50 ml. Se añade una disolución de glicerol al 50 % a la suspensión celular para obtener una concentración final de 17 % de glicerol. Las alícuotas de las rondas de selección se conservan a -80 °C.
Rescate de fagos
Se añaden 50 pl de la suspensión celular obtenida de las rondas de selección anteriores a 50 ml de 2xTYAG y se cultivan a 37 °C con agitación (240 rpm) hasta una DO600 de 0,3 a 0,5. A continuación, se superinfecta el cultivo con 1,2*1011 fagos auxiliares M13K07 y se incuba durante una hora a 37 °C (90 rpm). El medio se cambia centrifugando las células a 3800 rpm durante 10 minutos, eliminando el medio y resuspendiendo el sedimento en 50 ml de 2xTYAK (medio 2xTY que contiene 100 pg/ml de ampicilina y 50 pg/ml de kanamicina). A continuación, se hace crecer el cultivo durante toda la noche a 30 °C (240 rpm). Al día siguiente, el sobrenadante que contiene fagos se usa para la siguiente ronda de selección.
Selecciones de la superficie celular
Se bloquean los sobrenadantes que contienen fagos con PBS que contiene un 3 % (p/v) de leche desnatada durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. A continuación, los fagos bloqueados se deseleccionan durante una hora en MKN45 CEACAM5KO que no expresan CEACAM5 humana. El fago deseleccionado se incuba con 2*107 células MKN45 que expresan CEACAM5 (bloqueadas en PBS 3 % de BSA 0,1 % de NaN3) durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave. Las células se sedimentan y se lavan seis veces con PBS. El fago unido se eluye con ácido cítrico 76 mM y agitación durante 10 minutos. Tras la neutralización con Tris-HCl 1 M pH 8, las células se añaden directamente a 10 ml de TG1 en crecimiento exponencial y se incuban durante una hora a 37 °C con agitación lenta. Se diluye en serie una alícuota de TG1 infectadas para valorar el producto de selección. Las TG1 infectadas se centrifugan a 3800 rpm durante 10 minutos, se resuspenden en 2 ml de medio 2xTY y se extienden en una placa de bioensayo de agar 2xTYAG. Tras incubar toda la noche a 30 °C, se añaden 10 ml de 2xTY a la placa y se raspan las células de la superficie, que se transfieren a un tubo de polipropileno de 50 ml. Se añade una disolución de glicerol al 50 % a la suspensión celular para obtener una concentración final de 17 % de glicerol. Las alícuotas de las rondas de selección se conservan a -80 °C.
Ejemplo 4 Cribado de scFv de unión/no unión a CEACAM5, CEACAM6 y CEACAM1 solubles
Preparación periplásmica de scFv para pruebas de unión y funcionales
Los clones individuales se inoculan en una placa de microtitulación de pocillos profundos que contiene 0,9 ml por pocillo de medio 2xTYAG (medio 2xTY que contiene 100 pg/ml de ampicilina, 0,1 % de glucosa) y se cultivan a 37 °C durante 5-6 horas (240 rpm). A continuación, se añaden 100 pl por pocillo de IPTG 0,2 mM en medio 2xTY para obtener una concentración final de IPTG 0,02 mM. La placa se incuba durante toda la noche a 30 °C con agitación a 240 rpm. La placa de pocillos profundos se centrifuga a 3200 rpm durante 10 minutos a 4 °C y se elimina cuidadosamente el sobrenadante. Las pellas se resuspenden en 150 pl de tampón TES (Tris-HCl 50 mM (pH 8), EDTA 1 mM (pH 8), 20 % de sacarosa, complementado con inhibidor de proteasa completo, Roche). Se produce un choque hipotónico añadiendo 150 |jl de tampón TES diluido (dilución 1:5 de TES:agua) y se incuba en hielo durante 30 minutos. La placa se centrifuga a 4.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para separar las células y los residuos. Los sobrenadantes se transfieren cuidadosamente a otra placa de microtitulación y se mantienen en hielo para su análisis inmediato en ensayos funcionales o ensayos de unión.
Unión
El cribado de scFv para la unión a CEACAM5 se prueba en un ensayo homogéneo usando la tecnología CellInsight™. Los siguientes reactivos se mezclan en cada pocillo de una placa de pocillos de fondo transparente 384 (Corning): 30 j l de una suspensión de microesferas de poliestireno con estreptavidina (Polysciences; 3000 microesferas/pocillo) recubiertas con CEACAM5 biotinilada, dominio A3-B3 biotinilado o NusA biotinilada para una proteína de control; 60 j l de preparación periplásmica de scFv bloqueada; 10 j l de tampón de detección (p Bs que contiene anticuerpo antic-myc de ratón a 5 jg/ml; AlexaFluor® 647 anti-Fc de ratón diluido 1:200). Tras mezclar a 600 rpm durante 5 minutos, la placa de 384 pocillos se incuba a temperatura ambiente y se lee después de 2 horas en una plataforma CellInsight™ CX5 High-Content Screening (ThermoFisher Scientific). Los clones que expresan scFv que dan una señal específica para CEACAM5 y no para NusA se seleccionan para análisis posteriores o secuenciación.
La unión a CEACAM1, CEACAM6 y otras CEACAM pueden medirse de la misma manera.
Secuenciación de clones de fagos
Los clones individuales se inoculan en una placa de microtitulación de 96 pocillos profundos que contiene 1 ml de medio LBAG (medio LB con 100 jg/m l de ampicilina y 2 % de glucosa) por pocillo y se cultivan durante la noche a 37 °C, 240 rpm. El ADN se extrae usando el kit Zyppy-96 Plamis Miniprep (Zymo Research) y se secuencia.
Ejemplo 5 Candidatos a VH fijos reformateados en IgG y expresión transitoria en células de mamífero
Tras el cribado y la secuenciación, los candidatos a scFv con las propiedades de unión deseadas se reformatean en IgG y se expresan mediante transfección transitoria en células PEAK. Las secuencias de VH y VL de los scFv seleccionados se amplifican con oligonucleótidos específicos y se clonan en un vector de expresión que contiene las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera, y las construcciones se verifican mediante secuenciación. Los vectores de expresión se transfectan en células de mamífero usando Lipofectamine 2000 (Thermofisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se cultivan 3,5*106 células PEAK en matraces T75 en 25 ml de medio de cultivo con suero bovino fetal. Las células transfectadas se cultivan durante 5-6 días a 37 °C, la producción de IgG se cuantifica mediante el instrumento OctetRED96. El sobrenadante se recoge para la purificación de IgG en resina de afinidad FcXL (Thermofisher Scientific) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los sobrenadantes de células transfectadas se incuban durante la noche a 4 °C con una cantidad apropiada de resina FcXL. Tras el lavado de la resina con PBS, las muestras se cargan en la columna Amicon Pro y la IgG se eluye consecuentemente en glicina 50 mM pH 3,5. A continuación, la fracción de IgG eluida se dializa con Amicon 50kDa contra tampón NaCl de histidina pH 6,0 y el contenido de IgG se cuantifica por absorción a 280 nm. La pureza y la integridad de la IgG se verifican por el fabricante del bioanalizador Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., EE.UU.).
Ejemplo 6 Caracterización de anticuerpos contra CEACAM5
a) Unión de anticuerpos contra CEACAM5 a células transfectadas con diferentes miembros de la familia CEACAM
Según el conocimiento de los inventores, la especificidad de los anticuerpos monoclonales (mAb) contra CEACAM5 puede demostrarse mediante citometría de flujo usando células PEAK y/o CHO transfectadas con diferentes miembros de la familia CEACAM. Los vectores que codifican la versión de longitud completa de CEACAM humana 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 18, 19, 20 y 21 y 20 se usan para expresar estas proteínas en la superficie de células PEAK y/o CHO como se describe en el Ejemplo 2. Las células PEAk y/o CHO no transfectadas se usan como control negativo. Se cosechan las células, se cuentan, se comprueba su viabilidad y se resuspenden a 3 * 106 células/ml en tampón FACS (PBS 2 % BSA, 0,1 % de NaN3). Se distribuyen 100 j l de la suspensión celular en placas de 96 pocillos con fondo en V (3*105 células/pocillo). El sobrenadante se elimina por centrifugación 3 minutos a 4 °C, 1300 rpm y las células se incuban durante 15 minutos a 4 °C con concentraciones crecientes del anticuerpo según la invención. Los anticuerpos se diluyen en tampón FACS y el intervalo de concentración es de 30 pM-500 nM. Las células se lavan dos veces con tampón FACS frío y se vuelven a incubar durante otros 15 minutos a 4 °C con el anticuerpo secundario Fc anti-IgG humana de ratón conjugado con PE (R-ficoeritrina) (SouthernBiotech, prediluido 1: 100 en tampón FACS). Las células se lavan dos veces con tampón FACS frío y se resuspenden en 300 j l de tampón FACS con TOPRO-3 diluido 1:1500 (Invitrogen). La fluorescencia se mide con un FACSCalibur™ (BD Biosciences). Las curvas de unión dosis-respuesta se ajustan usando el software GraphPad Prism7. Del mismo modo, pueden caracterizarse CEACAM1, CEACAM6 y otras CEACAM. En resumen, los mAb purificados se incuban con células que expresan una de las proteínas de la familia CEACAM a una concentración final de 10 jg/m l durante 30 minutos. Tras dos lavados, los anticuerpos unidos se detectan usando un anticuerpo secundario anti-Fc humano conjugado con Cy-5 (BD biosciences).
Se considera que un anticuerpo según la invención no se une a dicha CEACAM si el anticuerpo secundario anti-IgG humana Fc conjugado con PE no detecta ningún anticuerpo unido.
b) Reactividad cruzada de los anticuerpos CEACAM5 con CEACAM5 de cangrejero
Según el conocimiento de los inventores, la capacidad de los anticuerpos monoclonales CEACAM5 de la presente invención para reaccionar de forma cruzada con CEACAM5 de mono cangrejero puede probarse mediante citometría de flujo usando células CHO PEAK transfectadas con un vector que expresa CEACAM5 de cangrejero de longitud completa. La citometría de flujo permite detectar si dicho anticuerpo se está uniendo a las células CHO PEAK que expresan CEACAM5 de cangrejero o si dicho anticuerpo no se está uniendo a las células CHO PEAK o no se está uniendo a dicha CEACAM.
Ejemplo 7 Expresión y purificación de anticuerpos biespecíficos portadores de una cadena ligera lambda y kappa
La expresión simultánea de una cadena pesada y dos cadenas ligeras en la misma célula puede dar lugar al ensamblaje de tres anticuerpos diferentes. La expresión simultánea puede lograrse de diferentes maneras, tales como la transfección de múltiples vectores que expresen una de las cadenas a coexpresar o mediante el uso de vectores que impulsen la expresión de múltiples genes. El vector que codifica los diferentes anticuerpos anti-CEACAM5 se cotransfecta con otro vector que expresa la cadena pesada y ligera del anticuerpo anti-CD47 Ka3 (SEQ ID NO:5 y 11), un anticuerpo anti-CD47 que lleva la misma cadena pesada común y que se describe en el documento de patente US 2014/0303354. Alternativamente, las dos cadenas ligeras se clonan en el vector pNovi<k>HA que se genera previamente para permitir la coexpresión de una cadena pesada, una cadena ligera Kappa y una cadena ligera Lambda como se describe en los documentos de patente US 2012/0184716 y WO 2012/023053.
La expresión de los tres genes está impulsada por promotores del citomegalovirus humano (hCMV) y el vector también contiene un gen de glutamina sintetasa (GS) que permite la selección y el establecimiento de líneas celulares estables. Los genes VH y VL comunes de la IgG anti-CEACAM5 y de la IgG anti-CD47 se clonan en el vector pNovi kHA, para su expresión transitoria en células de mamífero. Las células PEAK se cultivan en un matraz apropiado con el número de células y el volumen de medio de cultivo adecuados (que contiene suero bovino fetal). El ADN plasmídico se transfecta en las células utilizando Lipofectamine 2000) según las instrucciones del fabricante. La concentración de anticuerpos en el sobrenadante de las células transfectadas se mide durante la producción utilizando OctetRED96. Según la concentración de anticuerpos, los sobrenadantes se recogen de 5 a 7 días después de la transfección y se clarifican mediante centrifugación a 1300 g durante 10 min. El proceso de purificación se compone de tres etapas de afinidad. En primer lugar, la matriz de afinidad FcXL (Thermofisher Scientific) se lava con PBS y se añade al sobrenadante clarificado. Después de la incubación durante la noche a 4°C, los sobrenadantes se centrifugan a 2000 g durante 10 minutos, se almacena el flujo y la resina se lava dos veces con PBS. Después, la resina se transfiere a columnas Amicon Pro y se usa para la elución una solución que contiene glicina 50 mM a pH 3,0. Se generan varias fracciones de elución, se agrupan y se desalan contra PBS usando unidades de filtro centrífugo Amicon™ Ultra de 50 kDa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). El producto eluido, que contiene IgG humanas totales del sobrenadante, se cuantifica usando un espectrofotómetro Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, Del.) y se incuba durante 15 min a TA y 20 rpm con el volumen apropiado de matriz de afinidad Kappa select (GE Healthcare). Las etapas de incubación, recuperación de resina, elución y desalinización se realizan tal como se ha descrito anteriormente. La última etapa de purificación por afinidad se realiza utilizando la matriz de afinidad lambda Fab select (GE Healthcare) aplicando el mismo proceso que para las dos purificaciones anteriores. El producto final se cuantifica utilizando el Nanodrop. Los anticuerpos biespecíficos purificados se analizan mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes y reductoras. El bioanalizador Agilent 2100 se utiliza con el kit Protein 80 tal como describe el fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., Estados Unidos). Se mezclan 4 pl de muestras purificadas con tampón de muestra suplementado con ditiotreitol (DTT; Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las muestras se calientan a 95°C durante 5 minutos y después se cargan en el chip. Todas las muestras se analizan para detectar contaminación por endotoxinas utilizando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL; Charles River Laboratories, Wilmington, Mass.).
Ejemplo 8: Caracterización de anticuerpos monovalentes y biespecíficos
a) Los anticuerpos biespecíficos de doble diana se unen a dos antígenos diferentes en la superficie de la misma célula.
Según el conocimiento de los inventores, la unión simultánea de los dos brazos del anticuerpo a dos antígenos en la superficie de la célula (denominada coacoplamiento) puede dar lugar a un aumento aditivo o sinérgico de la afinidad debido al mecanismo de avidez. Como consecuencia, el coacoplamiento confiere una alta selectividad hacia las células que expresan ambos antígenos en comparación con las células que expresan un solo antígeno. Además, las afinidades de los dos brazos de un anticuerpo biespecífico con sus respectivas dianas pueden configurarse de tal manera que la unión a las células diana sea impulsada principalmente por uno de los brazos del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo<k>A de doble diana compuesto por un brazo que se une con alta afinidad a CEACAM5 o a CEACAM5 y CEACAM6, y un segundo brazo que se une con menor afinidad a CD47, pero suficiente para inhibir CD47/SIRPa en el coacoplamiento de CEACAM5 o CEACAM5 y CEACAM6 con CD47, debería permitir la inhibición preferente de CD47 en células cancerosas frente a normales.
b) Medición de la afinidad a CD47 humano
Según el conocimiento de los inventores, la afinidad de unión de los anticuerpos según la invención a CD47 humano puede evaluarse mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial usando un instrumento Biacore T200. La proteína recombinante soluble CD47 humano biotinilada puede capturarse en un chip sensor recubierto de estreptavidina (Series S Sensor Chip SA). A continuación, se puede inyectar una serie de concentraciones del anticuerpo de prueba sobre la superficie, con regeneración de la superficie entre cada inyección.
Dichas mediciones se realizaron con un anticuerpo CD19xCD47 kA biespecífico. La afinidad de unión medida en determinaciones repetidas fue entre 400 y 500 nM. El brazo de unión a CD47 de este anticuerpo es el mismo que el brazo de unión a CD47 de los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la presente invención. Según el conocimiento de los inventores, esos mismos experimentos realizados con los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención proporcionarán resultados similares dentro de la desviación estándar de dichos experimentos.
c) Actividad de bloqueo de SIRPa de los anticuerpos monovalentes y biespecíficos para demostrar el coacoplamiento de CEACAM5 y CD47 en la superficie de células tumorales diana.
Según el conocimiento de los inventores, se puede realizar otra serie de experimentos, que puede proporcionar que una prueba del coacoplamiento de TAA (como CEACAM5) y CD47 en la superficie de la célula diana son experimentos que muestran que la neutralización de la interacción CD47-SIRPa por anticuerpos CD47x CEACAM5<k>A es dependiente de CEACAM5. En dichos experimentos, la actividad de los cuerpos CD47x CEACAM5<k>A y los correspondientes anticuerpos monovalentes puede probarse en el ensayo de inhibición de CD47-SIRPa. La Figura 6 muestra resultados con un anticuerpo biespecífico TAAxCD47 (TAA no es CEA) que contiene el mismo brazo de unión a CD47 que los anticuerpos biespecíficos de la presente invención en comparación con el correspondiente anticuerpo monovalente anti-CD47.
d) Actividad de bloqueo de SIRPa de los anticuerpos CD47
Configuración experimental para la medición de los datos de potencia de inhibición de SIRPa mostrados para los anticuerpos biespecíficos de la presente invención (resultados, véase la Tabla 2).
Para la detección de la actividad de bloqueo se usa la detección del ensayo basado en células a SIRPa unida que monitoriza la interacción de SIRPa soluble con CD47 humano expresado en la superficie de MKN45. Los experimentos dosis-respuesta con anticuerpos biespecíficos según la invención permiten determinar un valor de CI50.
Las células cancerosas MKN45, que expresan tanto CD47 como CEACAM5, se tiñen con violeta CFSE para permitir que el sistema de formación de imágenes (CX5) detecte las células. Brevemente, se siembran 3.000 células MKN45 teñidas por pocillo en una placa óptica de 384 pocillos (Costar) y se incuban durante 50 minutos con concentraciones crecientes de anticuerpos biespecíficos de la invención (1,9 pM a 333 nM, por cuadruplicado). A continuación, se añade una concentración fija de SIRPa-Fc de ratón premezclado con anticuerpo acoplado anti-IgG-Fc de ratón AF647 (Jackson Immunoresearch diluido 1:2000) a 50 ng/ml final. Tras una incubación de 3H30, las placas se adquieren con el sistema de imagen (CX5, Thermofisher) y las señales de fluorescencia emitidas por la SIRPa unida detectada se registran con el software dedicado al sistema de imagen. Las señales de fluorescencia se representan según el intervalo de dosis ensayado y la CI50 se calcula mediante el software (Prism, Graphpad).
La Tabla 2 muestra la potencia de varios anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 en la inhibición de la unión CD47/SIRPa mostrando un intervalo de CI50, de 0,22 nM a 7 nM.
e) Agrupación de epítopos de anticuerpos contra CEACAM5 por competición con anticuerpos de referencia
La agrupación de epítopos es un inmunoensayo competitivo usado para caracterizar la unión de anticuerpos según la invención o, por ejemplo, la unión de los anticuerpos anti-CEA relacionados (proteína diana) de la primera parte de unión. Se crea un perfil de bloqueo competitivo de un anticuerpo que se une a la proteína diana frente a anticuerpos que también se unen a esta proteína diana y para los que ya se ha establecido/publicado el epítopo de unión. La competencia con uno de estos anticuerpos de referencia indica que el anticuerpo tiene el mismo epítopo o un epítopo estrechamente localizado y se "agrupan" juntos. La capacidad de los mAb CEACAM5, que forman parte de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención, para competir con anticuerpos de referencia CEACAM5 se prueba mediante ELISA en CEACAM5 humana recombinante con los siguientes anticuerpos de referencia que llevan una región Fc de ratón: SM3E, secuencias de mAb derivadas de SM3E descritas en la patente US20050147614A1, mAb producido mediante métodos estándar; MEDI, mAb derivado de MEDI-565 descrito en la patente WO2016036678A1; SAR, mAb derivado de Mab2_VLg5VHg2 descrito en la patente EP3199552A1; CH1A1A, mAb derivado de CH1A1A-2F1 descrito en la patente US20120251529 y por Klein et al. en Oncoimmunology, 11 de enero de 2017;6(3); mAb T84.66 humanizado derivado de la variante 1 descrito en la patente WO2017055389; mAb LAB derivado de hMN14 descrito en la patente US 2002/0165360 A1. SM3E se une, por ejemplo, más a la parte aminoterminal, distal a la membrana celular de CEA, MEDI a la parte media y CH1A1A se une cerca de la membrana.
La CEACAM5 humana biotinilada se recubre a 0,5 pg/ml en una placa de 96 pocillos recubierta de estreptavidina y se incuba con 10 pg/ml de los mAb de referencia o un mAb irrelevante portador de una región Fc de ratón durante 1 hora. Los mAb CEACAM5 (como anticuerpos monoclonales bivalentes anti-CEA y no como anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 respectivos) se añaden a 0,2 pg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava la placa y los mAb CEACAM5 unidos se detectan con una IgG(Fc)-HRP anti-humana (Jackson ImmunoResearch). Después del lavado, la placa se revela con el reactivo Amplex Red. La señal de fluorescencia se mide en un lector de placas Synergy HT (Biotek).
Los resultados se muestran en la Tabla 2. Caja 1 significa que el anticuerpo respectivo compite con SM3E para unirse a CEACAM5. Caja 2 significa que el anticuerpo respectivo no compite con ninguno de los anticuerpos herramienta mencionados anteriormente. Los experimentos de competición se realizaron para todos los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 enumerados en la Tabla 2 con los respectivos anticuerpos monoclonales bivalentes anti-CEA. En caso de que la unión de dicho anticuerpo monoclonal a CEACAM5 fuera reducida por el anticuerpo herramienta respectivo en un 80 % o más, se concluyó que el anticuerpo biespecífico CEAxCD47 está clasificado para unirse competitivamente con el anticuerpo herramienta. Un anticuerpo CEAxCD47 se identifica como no competitivo con un anticuerpo herramienta en caso de que la unión del respectivo mAb bivalente anti-CEA a CEACAM5 se reduzca en un 20 % o menos si se comparan los resultados con y sin adición de un anticuerpo herramienta.
Caja 1: K2AC13, K2AC18, K2AC23, K2AC27, K2AC29
Caja 2: K2AC10, K2AC25, K2AC28 K2AC26
En las Tablas 2, 3 y 4 se muestran los resultados de la caracterización de cajas, los valores de CE50 de unión a CEA, la potencia de inhibición de SIRPa y CE50, así como el índice máximo de fagocitosis de los anticuerpos biespecíficos según la invención.
Tabla 2: Característicasin vitrode los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47
Tabla 3: Actividad funcionalin vitrode los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47
Tabla 4: CE50 e índice máximo de fagocitosis para dos anticuerpos biespecíficos CD47xCEA en presencia o no de 1 mg/ml de hIgG1 usando células MKN45.
Tabla 5: CE50 de unión a CEACAM5 humana o CEACAM6 humana por ELISA usando proteínas recombinantes por ELISA.
f) Unión de anticuerpos anti-CEA a CEACAM5 humana y CEACAM6 humana
Las proteínas CEACAM5 o CEACAM6 recombinantes humanas biotiniladas se capturan a 0,5 pg/ml en una microplaca de 96 pocillos recubierta de estreptavidina. Se lava la placa y se añaden anticuerpos bivalentes monoclonales anti CEA de la presente invención en un amplio intervalo de concentración (por ejemplo, de 5*10'4 a 1 pg/ml) y se incuba durante 1 h. La placa se lava y los anticuerpos unidos se detectan con una IgG(Fc)-HRP anti-humana (Jackson ImmunoResearch). Tras el lavado, la placa se revela con el reactivo Amplex Red (Molecular Probes). La señal de fluorescencia se mide en un lector de placas Synergy HT (Biotek).
Los resultados obtenidos para el anticuerpo monoclonal AC39 están contenidos en la Tabla 5; este anticuerpo muestra una unión equilibrada de CEACAM5 y CEACAM6, lo que significa que las CE50 de unión a CEACAM5 y CEACAM6 son similares (intervalo de la relación entre la CE50 de unión a CEACAM5 y CEACAM6 de los anticuerpos equilibrados de 0,33 a 3). Los anticuerpos con una relación fuera de este intervalo se consideran no equilibrados.
Ejemplo 9: ADCC y ADCP mediados por anticuerpos biespecíficos (únicamente a título ilustrativo)
a) La ADCP y ADCC mediados por anticuerpos biespecíficos TAAxCD47 depende del TAA
La capacidad de los anticuerpos biespecíficos TAAxCD47<k>A de unirse conjuntamente a CD47 y TAA se traduce en un aumento significativo de la afinidad de unión a las células TAA positivas en comparación con las células TAA negativas y en una neutralización de la interacción CD47-SIRPa dependiente de TAA. Esto, a su vez, podría traducirse en una eliminación eficiente y selectiva de células cancerosas mediada por anticuerpos CEAxCD47 kA.
Los resultados como se demuestra a partir de los experimentos de ADCP (ensayo basado en citometría de flujo) mostrados en la Figura 3A demuestran una mayor ADCP del anticuerpo biespecífico TAAxCD47 en comparación con el TAA monovalente correspondiente, así como con el anticuerpo contra CD47 monovalente. La Figura 4 muestra un mayor ADCC (ensayo basado en Cr51) de cuatro anticuerpos biespecíficos TAAxCD47 (TAA es mesotelina MSLN) en comparación con el anticuerpo monoclonal de alta afinidad anti-TAA Amatuximab (TAA es MSLN) (se usan células tumorales de cáncer de pulmón NCI-H226 portadoras de MSLN.
b) Ensayo de liberación de Cr51+, medido con anticuerpos TAAxCD47
Se activaron CMSP sanas durante la noche a 37 °C con RPMI/10 % de FCS inactivado por calor suplementado con 10 ng/ml de hIL-2 recombinante. Al día siguiente, las células diana (es decir, las células cancerosas que expresan el TAA) se incubaron con 100 pCi de Cr51 (Perkin Elmer, 37 °C, 1 h). Tras el lavado, las células se opsonizaron con anticuerpos de prueba (30 min, 37 °C). A continuación, las células cancerosas cargadas con Cr51 se mezclaron con células CMSP para obtener la proporción final 80:1 o 50:1 entre células efectoras (CMSP) y células diana (células que expresan TAA). La mezcla de células se incubó durante 4 h a 37 °C antes de centrifugarse durante 10 min a 1500 rpm. El sobrenadante se transfirió a una LumaPlate (recubierta de centelleante) y se contó en un contador y . Los controles negativos (liberación espontánea de Cr51) consistieron en células diana cargadas con Cr51 incubadas con medio en ausencia de células efectoras. El control de lisis total consistió en células diana cargadas con Cr51 incubadas con 5 ^l de solución de lisis celular (Triton X-100). El control de lisis inespecífica (línea de base) consistió en células diana cargadas con Cr51 incubadas con células efectoras, sin Ab. El porcentaje de ADCC se calculó mediante la siguiente fórmula: % de ADCC específica = ((recuentos por minuto (cpm) de la muestra - cpm del control de lisis inespecífica)/(cpm del control de lisis total - cpm del control negativo)) x 100 %.
La Figura 5 muestra los resultados para ADCC (ensayo basado en Cr 51) del experimento de comparación entre la versión Fc de IgG1 wt frente a la versión Fc mutada adicionalmente en DEA de un anticuerpo biespecífico CD47xTAA (TAA no CEA) que lleva el mismo brazo CD47 que los anticuerpos CEAxCD47 de la invención. También se muestran los resultados de un mAb bivalente anti-TAA de alta afinidad. La ADCC más alta corresponde al anticuerpo biespecífico contra TAAxCD47 que porta Fc de IgG1 con mutaciones DEA, seguido por el biAb CEAxCD47 con Fc de IgG1 y por el mAb bivalente con la Fc de IgG1 wt.
c) ADCC medida por ensayo de liberación de LDH
La ADCC de los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 se probó en el siguiente ensayo:
Se activaron CMSP sanas durante la noche a 37 °C con RPMI/10 % de FCS inactivado por calor suplementado con 10 ng/ml de hIL-2 recombinante. Al día siguiente, las células diana (por ejemplo, células cancerosas MKN45) se opsonizan con diferentes concentraciones de anticuerpos probados. Las CMSP y las células diana opsonizadas se coincuban en una proporción efectoras/diana de 50/1 en placas de fondo redondo durante 6 horas a 37 °C en una incubadora de cultivos celulares. Tras esta incubación, los sobrenadantes se transfieren a una placa óptica de fondo plano y la liberación de LDH se cuantifica con un kit comercial de Roche midiendo la DO con un lector de microplacas. El % de lisis específica se calcula con la siguiente fórmula.
/LDH Muestra - (LDH Efectoras Células diana) \
L<isis>especifica = I ------------------------------------- ;-------------------------------- ) x 100
\ LDH Máximo - LDH Células diana solas /
La Figura 13 muestra los resultados de los experimentos de comparación entre anticuerpos biespecíficos de la invención con sus formas glucomanipuladas y con el anticuerpo 5F9. La Figura 14 muestra los resultados de experimentos de comparación entre anticuerpos biespecíficos de la invención con sus formas glucomanipuladas y con el anticuerpo 5F9 en presencia de 1 mg/ml de inmunoglobulina humana (IgG).
d) Ensayo de ADCP
Se usan dos métodos. En el método basado en FACS se determina el porcentaje de fagocitosis (que representa el porcentaje de macrófagos que han engullido al menos una célula tumoral). La Figura 3A muestra los resultados obtenidos con este ensayo basado en FACS para un anticuerpo TAAxCD47 que lleva el brazo de unión de CD47 también usado en los anticuerpos CEAxCD47. Con el método basado en imágenes, que usa la plataforma de cribado de alto contenido Celllnsight CXS, se determina el índice de fagocitosis, definido como el número medio de células diana engullidas por 100 macrófagos. La Figura 3B muestra los resultados obtenidos con un anticuerpo biespecífico contra TAAxCD47 (TAA no CEA) que lleva el brazo de unión de CD47 de los anticuerpos CEAxCD47. Las Figuras 12, 15, 16, 17, 18, 20B y 21B muestran resultados obtenidos con anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la invención. La Figura 15 muestra los resultados de experimentos de comparación entre anticuerpos biespecíficos de la invención con sus formas glucomanipuladas y con el anticuerpo anti-CD47 5F9. La Figura 16 muestra los resultados de los experimentos de comparación entre anticuerpos biespecíficos de la invención con sus formas glucomanipuladas y con el anticuerpo 5F9 en presencia de 1 mg/ml de inmunoglobulina humana (IgG) como la que suele estar presente en los pacientes. La Figura 17 muestra los resultados de los experimentos de comparación entre anticuerpos biespecíficos de la invención en presencia o no de 1 mg/ml de inmunoglobulina humana (hulgG, 1 mg/ml o incluso más están presentes en los pacientes). La Figura 18 muestra las curvas de concentración/índice de fagocitosis de K2AC22 en presencia o no de 30 nM de CEA-TCB1 o 300 nM de CEA-TCB.
e) Ensayos de fagocitosis: 1. Ensayo de imagen basado en la plataforma de cribado de alto contenido Celllnsight CXS y 2. Ensayo basado en citometría de flujo.
Preparación de los macrófagos: Se aíslan células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) de capas leucoplaquetarias mediante gradiente de Ficoll. Los macrófagos se generan cultivando las CMSP durante 7 días en medio completo (RPMI 1640, 10 % de suero fetal de ternera inactivado por calor [Invitrogen]), 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 10 mM de tampón HEPES, 25 mg/ml de gentamicina (todos de Sigma-Aldrich) y 2-mercaptoetanol 50 mM (Thermo Fisher Scientific) en presencia de 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (M-CSF) (PeproTech). Las células no adherentes se eliminan posteriormente en la fase de diferenciación (día+1) intercambiando el medio de cultivo celular, y las células adherentes que representan macrófagos se separan usando tampón de disociación celular (Sigma-Aldrich) y se lavan en medio completo el día de uso (día 8 o día 9) para el experimento de ADCP basado en citometría. Para el experimento de ADCP basado en imágenes celulares, los macrófagos se separan en el día 6 usando tampón de disociación celular y se siembran a 30.000 por pocillo en una placa óptica de 96 (Costar).
1. Ensayo basado en CellInsight
Los macrófagos (teñidos con rojo anaranjado de calceína) adheridos a los pocillos de la microplaca se coincuban con células tumorales diana marcadas con calceína AM en una proporción de células efectoras: diana de 1:3 durante 2,5 horas a 37 °C en presencia de diferentes concentraciones del anticuerpo que se va a analizar. Al final del periodo de incubación, se sustituyen los sobrenadantes por medio de cultivo completo y se obtienen imágenes de las microplacas con la plataforma CellInsight™ CXS High Content Screening Platform. Se adquieren y analizan 1500 macrófagos por pocillo. La fagocitosis se evidencia como eventos doblemente positivos (macrófago célula tumoral diana) y los índices de fagocitosis se calculan con el software del fabricante CellInsight™.
Todos los resultados de las Figuras 12, 15, 16, 17, 18, 20B y 21B, así como los valores de CE50 y de índice máximo de fagocitosis que se muestran en las Tablas 3 y 4, se obtienen con células MKN-45 que expresan CEA y con una proporción de células efectoras a células diana/tumorales de 1:3. Los datos de la Figura 3B se obtienen con células NCI-N87 portadoras del TAA (que no es CEA) y con una proporción de células efectoras para diana/tumoral de 1:1. Cuantas más células tumorales se ofrezcan por macrófago mayor será el índice de fagocitosis esperado, esta es probablemente la razón principal del menor índice de fagocitosis global y también de la señal de fondo mostrada en la Figura 3 B para el anticuerpo biespecífico contra TAAxCD47 (TAA no CEA) en comparación con las otras figuras que demuestran el resultado para anticuerpos biespecíficos según la invención.
Todos los valores, rangos y similares de ADCP (fagocitosis) en la presente invención se basan en el ensayo basado en imágenes si no se indica explícitamente lo contrario (los datos de la Figura 3A se obtienen con el ensayo basado en flujo).
2. Ensayo de ADCP basado en citometría de flujo
Según el conocimiento de los inventores, la ADCP también puede medirse mediante un método como el que se describe a continuación: Los macrófagos se coincuban con células tumorales diana marcadas con CSFE (por ejemplo, células tumorales MKN-45, LS174T o HPAC) en una proporción células efectoras: diana de, por ejemplo, 3:1 durante 2,5 horas a 37 °C en presencia de diferentes concentraciones del anticuerpo probado. Al final del periodo de incubación, se añade anticuerpo anti-CD14 humano biotinilado y Strep-Cy5 para marcar los macrófagos. A continuación, se lavan las células y se someten a análisis de citometría de flujo. La fagocitosis se evidencia por la doble positividad CD14+ y CFSE+. El porcentaje de fagocitosis se presenta como la relación entre los eventos doblemente positivos CD14+/CSFE+ y el total de células diana multiplicado por 100. Los datos de la Figura 3A se han obtenido con células HPAC portadoras del TAA (que no es c Ea ) y con una relación células efectoras para diana/tumoral de 1:1. Se ha usado un ensayo basado en citometría de flujo. Los datos de la Figura 3B se obtienen con células NCI-N87 portadoras del TAA (que no es CEA) y con una proporción de células efectoras para diana/tumoral de 1:1. Se usó un ensayo basado en imágenes.
Ejemplo 10: Unión de CEAxCD47 y CEAxCD3 a células MNK-45; competencia de unión con CEAxCD3
a) La unión del anticuerpo biespecífico CD47xCEACAM5 se ensaya, por ejemplo, en células de adenocarcinoma gástrico humano que expresan CEA (MKN-45, DSMZ ACC 409).
Las células se recogen, se cuentan, se comprueba su viabilidad y se resuspenden a 3*10® células/ml en tampón FACS (PBS 2 % de BSA, 0,1 % de NaN3). Se distribuyen 100 pl de la suspensión celular en placas de 96 pocillos con fondo en V (3*105 células/pocillo). El sobrenadante se elimina por centrifugación 3 minutos a 4 °C, 1300 rpm. A continuación, se añaden concentraciones crecientes del anticuerpo según la invención en los pocillos y se incuban durante 15 minutos a 4 °C. Las células se lavan dos veces con tampón FACS frío y se vuelven a incubar durante otros 15 minutos a 4 °C con el anticuerpo secundario anti-IgG-Fc humana de ratón conjugado con PE (R-ficoeritrina) (SouthernBiotech, prediluido 1:100 en tampón de FACS). Las células se lavan dos veces con tampón de FACS frío y se resuspenden en 300 pl de tampón FACS con SytoxBlue diluido 1:15000 (Life Technologies). La fluorescencia se mide con un Cytoflex (Millipore). Las curvas de unión y los valores de CE50 se obtienen y calculan usando el software GraphPad Prism7. De la misma manera se puede probar la unión de MAB CEA o m Ab CEA1 a células MKN-45. En la Figura 11 se muestran las curvas de unión de varios anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 contra células MKN-45.
b) Desplazamiento de la curva de unión de un anticuerpo CEAxCD47 contra una línea celular tumoral positiva para CEA (MKN-45) mediante la adición de un anticuerpo biespecífico de linfocitos T CEAxCD3.
Según el conocimiento de los inventores para experimentos de competición del anticuerpo biespecífico CD47xCEACAM5 según la invención y anticuerpos biespecíficos de linfocitos T CEAxCD3 como CEA-TCB o CEA-TCB1, la unión del CEACAM5xCD47 a células MKN-45 puede determinarse como se ha descrito anteriormente, pero con y sin adición del anticuerpo biespecífico de linfocitos T CEAxCD3 para estudiar si un anticuerpo biespecífico de linfocitos T CEAxCD3 como componente de combinación para los anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 de la presente invención es competitivo para la unión a CEA o no.
Ejemplo 11: Producción y purificación de anticuerpos biespecíficos K2AC5 y K2AC22 fucosilados y afucosilados
Producción de anticuerpos biespecíficos K2AC5 y K2AC22 fucosilados y afucosilados:
Se inocula un conjunto de CHO (uno para K2AC5 y otro para K2AC22) a una concentración de células viables de 0,3 x 106 células/ml en un dispositivo Thomson erlen con un volumen de trabajo de 700 ml o 100 ml para la producción de anticuerpos fucosilados y afucosilados, respectivamente. Todos los conjuntos se hacen funcionar en un modo de lote alimentado de 15 días de duración usando el medio CDACF CDCHO y un régimen de alimentación adaptado. Para la producción de anticuerpos afucosilados, se añade un bolo de 200 pM de inhibidor de la fucosa (1,3,4-tri-O-acetil-2-desoxi-2-fluoro-L-fucosa) los días 0, 5, 8 y 11 durante el proceso de alimentación por lotes basado en la estrategia de afucosilación descrita por Rillahan et al. Nature Chem. Biol. 2012 Jul;8(7):661-8 y basada en el documento de patente EP2282773. La cosecha de los sobrenadantes de los conjuntos K2AC5 y K2AC22 que contienen anticuerpos fucosilados o afucosilados se realiza después de 15 días de cultivo por lotes alimentados. Las cosechas de sobrenadantes de conjuntos CHO se clarifican usando el sistema Sartoclear Dynamics® Lab V Cell Harvesting Sartorius (véanse las instrucciones del proveedor).
Purificación de anticuerpos biespecíficos K2AC5 y K2AC22 fucosilados y afucosilados
La purificación de anticuerpos biespecíficos K2AC5 y K2AC22 fucosilados y afucosilados es un proceso de purificación de tres etapas de afinidad. Antes de iniciar la purificación, se mide la concentración de anticuerpos en el sobrenadante de los conjuntos de K2AC5 y K2AC22 usando OctetRED96 para usar columnas con el volumen apropiado de matriz de afinidad. Cada sobrenadante del conjunto de CHO clarificado que contiene anticuerpos biespecíficos fucosilados o afucosilados se carga en una columna MabSelect SuRe (MSS) (GE Healthcare) sin ajuste previo, para eliminar la mayor parte de los contaminantes del cultivo celular. A continuación, el eluido de MSS se trata mediante retención a pH bajo para inactivar los virus, y se neutraliza a pH 6 con Tris 1 M pH 9. A continuación, el eluido de MSS se carga en la columna LambdaFabSelect (LFS) (GE Healthcare) para eliminar k monoespecífico (mono k). A continuación, se ajusta el pH del eluido de LFS a pH 6. LFS se carga en la columna Capto L (CL) (GE Healthcare) para eliminar A monoespecífico (mono A). El eluido de CL se ajusta a pH antes de su almacenamiento. A continuación, el material final se concentra y se diafiltra en el tampón de formulación final, ajustándose su concentración con el Nanodrop. Los anticuerpos biespecíficos K2AC5 y K2AC22 fucosilados y afucosilados se toman alícuotas y se almacenan a -80 °C hasta su entrega. Los anticuerpos biespecíficos purificados se analizan por tamaño mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes y reductoras con el bioanalizador Agilent 2100 usando el kit Protein 80 tal y como describe el fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., EE.UU.). El nivel de agregación se evalúa mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-UPLC) usando ACQUITY UPLC H-Class Bio System (Waters). El análisis de las variantes de carga de los anticuerpos biespecíficos purificados se realiza mediante la técnica de enfoque isoeléctrico (IEF) usando el sistema de electroforesis Multiphor II (GE Healthcare). La distribución relativa de las glucoformas biantenarias complejas unidas a N de los anticuerpos K2AC5 y K2AC22 fucosilados y afucosilados se determina mediante el método de microchip-CE de alto rendimiento enLabChip GXII Touch(Perkin Elmer). Todos los anticuerpos se analizan para detectar contaminación por endotoxinas mediante la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL; Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts). K2AC5 glucosilado muestra una afucosilación del 79,68 % y K2AC22 glucosilado muestra una afucosilación del 89,13 %.
Estos anticuerpos biespecíficos CEAxCD47 afucosilados se han usado para obtener los resultados mostrados en las Figuras 13, 14, 15 y 16.
Ejemplo 12: Expresión y purificación en la línea celular FUT8(-) (únicamente a título ilustrativo)
Alternativamente, y según el conocimiento de los inventores, los anticuerpos biespecíficos afucosilados según la invención también se pueden producir según el procedimiento siguiente:
El material y los métodos según Naoko Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng.; 87 (2004) 614-622.
Aislamiento del ADNc de FUT8 de hámster chino
El ARN total se aísla a partir de células CHO/DG44 usando el RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y se transcribe inversamente con oligo-dT usando un sistema de síntesis de primera cadena Superscript para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Invitrogen, Carlsbad, c A). El ADNc de FUT8 de hámster chino se amplifica a partir de ADNc de células CHO/DG44 monocatenarias mediante PCR utilizando los cebadores
5V-GTCTGAAGCATTATGTGTTGAAGC-3V (SEQ ID NO: 14) y
5V-GTGAGTACATTCATTGTACTGTG-3V (SEQ ID NO:15), diseñados a partir del ADNc de FUT8 murino (Hayashi, 2000; DNA Seq 11:91-96).
Construcción de orientación del locus FUT8
La inactivación dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 se lleva a cabo usando dos vectores de sustitución, pKOFUT8Neo y pKOFUT8Puro. El fragmento de 9,0 kb del gen FUT8 que incluye el primer exón codificante se aísla examinando la biblioteca genómica E de células CHO-K1 (Stratagene, La Jolla, CA) con el ADNc de FUT8 del hámster chino como sonda para establecer las construcciones de direccionamiento. Un segmento de 234 pb que contiene el sitio de inicio de la traducción se reemplaza por el casete del gen de resistencia a la neomicina (Neor) o el casete del gen de resistencia a la puromicina (Puror) del plásmido pKOSelectNeo o pKOSelectPuro (Lexicon, TX), respectivamente, flanqueados por sitios loxP. El casete del gen de la toxina diftérica (DT) del plásmido pKOSelectDT (Lexicon) se inserta en la región homóloga 5V. Las construcciones de direccionamiento resultantes, pKOFUT8Neo y pKOFUT8Puro, incluían la secuencia homóloga de 5V de 1,5 kb y la secuencia homóloga de 3V de 5,3 kb. Antes de la transfección, las construcciones de direccionamiento se linealizan en un sitio SalI único.
Transfección y cribado de recombinantes homólogos
Se electroporan células CHO/DG44 subconfluentes (1,6 106) con 4 Ag de pKOFUT8Neo linealizado a 350 V y 250 AF usando un Bio-Rad GenePulser® II. Después de la electroporación, los transfectantes se seleccionan con 600 Ag/ml de G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). La PCR genómica se realiza en placas de 96 pocillos mediante el método de microextracción modificado informado anteriormente (Ramirez-Solis et al., 1992; Anal Biochem 201:331- 335.) usando los siguientes cebadores.
5V-TTGTGTGACTCTTAACTCTCAGAG-3V (SEQ ID NO: 16) y
5V-GAGGCCACTTGTGTAGCGCCAAGTG-3V (SEQ ID NO: 17).
Los recombinantes homólogos se identifican mediante el fragmento de 1,7 kb obtenido mediante PCR genómica y se confirman mediante análisis de inmunotransferencia Southern utilizando el fragmento de 221 pb amplificado con los siguientes cebadores:
5V-GTGAGTCCATGGCTGTCACTG-3V (SEQ ID NO: 218) y
5V-CCTGACTTGGCTATTCTCAG-3V (SEQ ID NO: 19).
El clon hemicigoto se somete a una segunda ronda de recombinación homóloga utilizando pKOFUT8Puro linealizado y selección de fármaco con 15 Ag/ml de puromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tal como se ha descrito anteriormente. Los disruptores homocigotos identificados se electroporan con el vector de expresión Cre-recombinasa pBS185 (Invitrogen) para eliminar los casetes del gen de resistencia a los fármacos de ambos alelos FUT8.
Producción de anticuerpos monoclonales por células FUT8(-)
Las líneas celulares FUT8(-) se electroporan con un vector de expresión que codifica un anticuerpo biespecífico según la invención y se seleccionan en medios que carecen de hipoxantina y timidina. Las transfectantes confluentes se cultivan en medio Ex-Cell® 301 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) durante 1 semana. El anticuerpo se purifica a partir de los sobrenadantes de cultivo usando MabSelect™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Otras etapas de purificación pueden ser cromatografía de intercambio aniónico/catiónico, cromatografía de exclusión molecular y especialmente purificación usando resinas selectivas kappa o lambda tal como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 13: Actividad antitumoral in vivo de anticuerpos biespecíficos
Según el conocimiento de los inventores, la actividad antitumoral de un anticuerpo biespecífico según la invención puede evaluarse en modelos de xenoinjerto, por ejemplo, mediante el siguiente modelo: 1 o 2*106 células tumorales CEA positivas como las células MKN-45 o LS174T se implantan por vía subcutánea en ratones NOD/SCID. Los volúmenes tumorales se miden 3 veces por semana. Una vez que el injerto tumoral alcanza aproximadamente 0,1 cm3, los ratones se distribuyen aleatoriamente en grupos (por ejemplo, de 4 a 6 ratones por grupo) y se inicia el tratamiento con anticuerpos. Este experimento podría, por ejemplo, comparar el efecto del anticuerpo biespecífico según la invención y los mAb de control positivo, por ejemplo, el mAb CD47 Anticuerpo B6H12.2 se inyecta, por ejemplo, i.v. cada semana hasta el final del experimento (d25). Los anticuerpos se administran a una dosis de, por ejemplo, 50 a 1200 |jg por ratón por inyección.
Las combinaciones de un anticuerpo biespecífico de la presente invención con un anticuerpo biespecífico CEAxCD3 pueden probarse en un modelo apropiado. Los modelos en los que puede probarse la combinación de un anticuerpo según la invención junto con MAB c Ea , MAB CEA1 o CEA-TCB CEA-TCB1 son, por ejemplo, los descritos por Bacac et al. (Clin. Cáncer Res., 22(13);3286-97;2016) y también se usan, especialmente para estudios de combinación de CEACAMSxCD47 y CEA-TCB o CEA-TCB 1.
Ejemplo 14: Liberación de citocinas probadas en sangre completa y CMSP de sangre humana de donantes humanos sanos
Según el conocimiento de los inventores, puede realizarse un ensayo de liberación de citocinasin vitrousando sangre completa (WB CRA) con dilución mínima por los anticuerpos de ensayo (95 % v/v de sangre) en presentación acuosa. Se considera que este formato de ensayo imita más de cerca el entornoin vivo,que contiene factores en concentraciones fisiológicas que pueden influir en los mecanismos de liberación de citocinas. Sin embargo, se cree que este formato es poco predictivo de la liberación de citoquinas mediada por linfocitos T (por ejemplo, anti-CD28).
El ensayo también puede realizarse usando células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de donantes humanos sanos y con una presentación de mAb inmovilizado (fase sólida, SP) para evaluar la liberación de citocinas mediada por linfocitos T (CMSP SP CRA). Este formato de ensayo simula la reticulación y la presentación de alta densidad de mAb, que puede ocurririn vivo(por ejemplo, la agrupación de la diana a través de la interacción de la parte Fc del anticuerpo con los receptores de F<cy>en otras células inmunitarias o la reticulación de mAb por anticuerpos antifármaco). Este formato es predictivo de la liberación de citocinas mediada por linfocitos T.
Pueden ensayarse controles negativos, así como controles positivos específicos para cada formato de ensayo en paralelo a un anticuerpo TAAxCD47 como un anticuerpo biespecífico CD47xCEA. Véanse las Figuras 7A y B.
Ejemplo 15: Unión de anticuerpos a eritrocitos, fagocitosis de eritrocitos y activación y agregación plaquetaria
Unión a sangre completa
Según el conocimiento de los inventores, pueden mezclarse muestras de sangre completa humana recogidas de donantes sanos en citrato con 3 pg/ml de anticuerpos biespecíficos CEA * CD47 acoplados a AF488 de la presente invención, B6H12.2 o control de isotipo y anticuerpos de tinción de superficie (PE-Cy7 anti-hCD45 y PE anti-hCD41a, únicamente para plaquetas) durante 30 min a 4 °C. Tras la incubación, la sangre completa se divide en dos muestras: 5 pl se diluyen y lavan en PBS para el análisis eritrocitario, mientras que 150 pl se incuban con disolución de lisado eritrocitario y se lavan para el análisis plaquetario. Las muestras se adquieren en un instrumento CytoFLEX y se analizan con el software FlowJo para determinar los valores de IMF.
Eritrofagocitosis
Según el conocimiento de los inventores, los glóbulos rojos humanos (RBC) pueden ser aislados de sangre completa humana por centrifugación a 300xg, lavados dos veces en PBS, marcados con CFSE-(carboxifluoresceína succinimidil éster) y preincubados con el anticuerpo de prueba durante 1 hora a 37 °C antes de la adición de macrófagos. Los glóbulos RBC se pueden cultivar con macrófagos humanos en presencia de un anticuerpo según la invención o de control (anticuerpo IgG1 de no unión) durante una hora a una proporción diana-efectoras de 200:1. Tras el cultivo, las células se tiñen con anti-CD 14-APC y se analizan por citometría de flujo. La fagocitosis se cuantificó como el porcentaje de eventos CD14+ (macrófagos) que también son CFSE+ y que, por tanto, habían engullido al menos un RBC (los eventos se agrupan en singletes). La fagocitosis y el análisis FAC<s>se realizan como se describe en el Ejemplo 9, excepto que los eritrocitos se lisaron con disolución de lisis de FACS después de la tinción de macrófagos.
La Figura 8 muestra que la fagocitosis de eritrocitos para el anticuerpo monoclonal IgG1 anti-CD47 B6H12.2 es mucho más potente que para un anticuerpo IgG1 TAA * CD47 (no CEAxCD47)<k>A biespecífico que contiene el brazo de unión a CD47 de los anticuerpos biespecíficos CEA * CD47 de la presente invención. El anticuerpo biespecífico TAA * CD47 con Fc natural no mostró fagocitosis en el intervalo de concentración probado, si Fc lleva las mutaciones de aa DEA (S329D e I332E y G236A), se detecta fagocitosis pero a concentraciones más altas que para el anticuerpo B6H12.2.
Activación y agregación plaquetaria in vitro
En un experimento estándar de citometría de flujo se midió la capacidad de los anticuerpos biespecíficos TAAxCD47 y CEAxCD47 para inducir la activación de plaquetas humanas en sangre completa de siete donantes humanos sanos mediante la regulación al alza del marcador de superficie CD62P. Brevemente, se incuban 5 pl de sangre completa con 10 pl de cada muestra (preparada a 2X) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Cada anticuerpo analizado se añade a diferentes concentraciones (0, 0,02, 0,2, 2, 20 y 200 pg/ml). El adenosín difosfato (ADP) y el anti-CD9 (ALB6), incluidos como reactivos de control positivo conocidos por inducir la activación plaquetaria, se añaden a una concentración de 10 pM y 10 pg/ml, respectivamente. A continuación, se añaden 10 pl de anti-CD41a-PE y 10 pl de anti-CD62P-APC y se incuban durante 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Por último, se añaden 500 pl de CellFix (BD Biosciences, diluido 1/10 en agua) y se transfieren 200 pl de cada muestra en una placa de 96 pocillos con fondo en U adecuada para la adquisición CytoFLEX. Las plaquetas se identifican por la tinción positiva CD41a-PE. La activación plaquetaria se evalúa mediante la expresión del marcador CD62P.
La Figura 10 muestra los resultados obtenidos en sangre de siete donantes voluntarios. Se observó que ni el anticuerpo monoclonal anti-TAA ni el anticuerpo biespecífico TAAxCD47 inducían una activación plaquetaria relevante (ambos con Fc IgG1 wt). En cambio, el anticuerpo anti-CD47 B6H12.2 con Fc IgG1 wt indujo la activación plaquetaria y también el biAb TAAxCD47 con Fc portador de mutaciones DEA mostró activación plaquetaria.
También se han estudiado los anticuerpos CEAxCD47 K2AC5 y K2AC22 (con y sin afucosilación) en el intervalo de concentración que se muestra en la Figura 10 para la activación plaquetaria en sangre completa. En la sangre de 6 de 7 donantes no se observó una activación plaquetaria significativa, como la mostrada para TAAxCD47 en la Figura 10. Un donante mostró ya con los agentes de control positivo una activación plaquetaria poco común y después también cierta activación plaquetaria con K2AC5 y 22. Los resultados de este donante no se tuvieron en cuenta debido a la activación plaquetaria poco común.
Según el conocimiento de los inventores, el potencial de agregación en presencia del anticuerpo biespecífico CD47/CEA podría evaluarse en plasma rico en plaquetas (PRP). El PRP se expone a ADP a 10 pM y 5 pM o a los artículos de prueba a 200, 100, 20, 25 y 12,5 pg/ml, así como con disolución salina o el control de isotipo. La agregación plaquetaria puede evaluarse durante toda la estimulación plaquetaria (es decir, 10 min) con un tromboagregómetro TA 4V con agitación constante. Puede usarse el software Thrombosoft 1.6 (SD Innovation, Frouard, Francia) para el análisis de los datos.
Ejemplo 16: Evaluación hematológica en cangrejero. (únicamente a título ilustrativo)
Según el conocimiento de los inventores, los anticuerpos de reacción cruzada en monos cangrejero podrían probarsein vivoen macacos cangrejeros para cualquier efecto sobre los parámetros hematológicos (incluidos<r>B<c>y las plaquetas). Un anticuerpo según la invención se administra, por ejemplo, a macacos cangrejeros por vía intravenosa, a dosis de hasta 100 mg/kg, semanalmente. Los parámetros hematológicos, incluidos los recuentos de glóbulos rojos y plaquetas, se monitorizan a lo largo del tiempo y se comparan con los valores de control en los macacos (valores predosis). Los parámetros hematológicos se determinan mediante métodos rutinarios.
Los resultados de la Figura 9 se han obtenido con un anticuerpo biespecífico IgG1 TAA * CD47 (no CEAxCD47)<k>A que contiene el brazo de unión a CD47 de los anticuerpos biespecíficos CEA * CD47 según la presente invención. A pesar de la administración repetida con dosis altas, no hay diferencias significativas entre los animales de control y los animales tratados en cuanto a los recuentos de RBC y plaquetas. Esto contrasta con los resultados publicados con el anticuerpo IgG4 anti-CD47 hu5F9-G4 (Jie Liu et al (Open access article, PLOS ONE 10(9) septiembre de 2015)) que muestran una disminución de la hemoglobina dependiente de la dosis que comienza ya con dosis únicas de aproximadamente 1 mg/kg. El formato de IgG4 se usó para minimizar los efectos en glóbulos rojos y plaquetas, en comparación con el formato de IgG1. A pesar de esta medida, incluso a dosis ya bastante bajas de 1 mg/kg y menos, se observan reducciones dependientes de la dosis de, por ejemplo, hemoglobina en macacos cangrejeros.
Ejemplo 17: Determinación de las propiedades farmacocinéticas en macacos cangrejeros
Según el conocimiento de los inventores en estudios farmacocinéticos de dosis única, los animales pueden distribuirse aleatoriamente en 2 a 5 grupos de tratamiento de n=2 a 4 monos por grupo (incluyendo machos y hembras). Los animales se administran con dosis IV únicas de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención (infusión durante 15 a 30 minutos). Las dosis en los grupos de tratamiento oscilan entre 0,01 mg/kg y 100 mg/kg. Los volúmenes de administración son de hasta 5 ml/kg. Las extracciones de sangre se programan según el protocolo experimental en múltiples puntos temporales, por ejemplo, 0,25, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 336, 504 (día 22), 672 (día 29), 840 (día 36), 1008 (día 43), 1176 (día 50) y 1344h (día 57) después de la administración intravenosa del anticuerpo biespecífico. Se recogieron muestras de sangre de aproximadamente 2 ml por animal y momento de tiempo. Las concentraciones de los anticuerpos se midieron en suero o en plasma. Se desarrolla y valida una prueba de ELISA para medir las concentraciones. Cada muestra se mide por duplicado.
A partir de las curvas de concentración-tiempo se pueden determinar parámetros FC como Cmáx, depuración, semivida de eliminación, área bajo la curva, etc., usando software estándar de la industria (Phoenix WinNonlin; análisis no compartimental).
Se espera que las semividas de eliminación de los anticuerpos biespecíficos CEA x CD47 kappa-lambda estén en el intervalo de 3 a 14 días, lo que sugiere administraciones q1w o q2w o q3w o q4w a los pacientes.
Ejemplo 18: ADCP mediada por anticuerpos biespecíficos en presencia de CEA eliminado
Las células MKN45 usadas como células diana se tiñen con calceína AM. Paralelamente, las concentraciones de anticuerpos probados se incuban o no con una dosis fija (200 ng/ml) de CEA eliminado comercial (BioRad). Tras esta incubación, los MKN-45 teñidos se opsonizan durante 20 minutos a temperatura ambiente con los anticuerpos previamente mezclados con CEA eliminado. A continuación, los macrófagos (teñidos con rojo anaranjado de calceína) adheridos a los pocillos de la microplaca se coincuban con células tumorales diana marcadas y opsonizadas en una proporción células efectoras: diana de 1:3 durante 2,5 horas a 37 °C. La ADCP se realiza en presencia de 1 mg/ml de IgG humana. Al final del periodo de incubación, se sustituyen los sobrenadantes por medio de cultivo completo y se obtienen imágenes de las microplacas con la plataforma CellInsight™ CX5 High Content Screening Platform. Se obtienen y analizan 1500 macrófagos por pocillo. La fagocitosis se evidencia como eventos doblemente positivos (macrófago célula tumoral diana engullida) y los índices de fagocitosis se calculan mediante el software del fabricante CellInsight™. Los resultados se muestran en la Figura 20B.
Ejemplo 19: ADCP mediada por anticuerpos biespecíficos en presencia de CEA-TCB y CEA-TCB1
Las células MKN45 marcadas con calceína AM usadas como células diana se incuban previamente o no con una dosis fija de CEA-TCB (300 nM) o CEA-TCB1 (30 nM) durante 20 min a TA. Tras esta incubación, se añaden diferentes concentraciones del anticuerpo probado en el pocillo apropiado durante 20 minutos. A continuación, los macrófagos (teñidos con rojo naranja de calceína) adheridos a los pocillos de la microplaca se coincuban con células tumorales diana marcadas opsonizadas en una proporción células efectoras:diana de 1:3 durante 2,5 horas a 37 °C. La ADCP se realiza en presencia de 1 mg/ml de hIgG humana. Al final del periodo de incubación, se sustituyen los sobrenadantes por medio de cultivo completo y se obtienen imágenes de las microplacas con la plataforma CellInsight™ CX5 High Content Screening Platform. Se adquieren y analizan 1500 macrófagos por pocillo. La fagocitosis se evidencia como eventos doblemente positivos (macrófago célula tumoral diana engullida) y los índices de fagocitosis se calculan mediante el software del fabricante CellInsight™.
La Figura 18 muestra que ni CEA-TCB ni CEA-TCB 1 añadidos disminuyen la fagocitosis inducida por K2AC22. Sorprendentemente, la fagocitosis de K2AC22 incluso aumentó ligeramente con la adición de CEA-TCB1 30 nM.
Ejemplo 20: Ensayo de destrucción por combinación de CD47xCEA y CEAxCD3
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) a partir de capas leucoplaquetarias. Parte de estas CMSP se congelaron en medio de congelación (90 % de FCS 10 % de DMSO) (para usarlas como fuente de linfocitos T) y parte se usaron para preparar macrófagos (como se explica en la sección Fagocitosis). Tras 6 días de diferenciación de macrófagos, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C. El día del ensayo (2 días después del cultivo de macrófagos), se descongelaron las CMSP congeladas del donante de macrófagos correspondiente y se añadieron a las placas de macrófagos. Las células diana (MKN45 diseñadas para expresar luciferasa) se opsonizaron con una combinación de anticuerpos, es decir, con un anticuerpo biespecífico de linfocitos T CEAxCD3 a determinadas concentraciones junto con determinadas concentraciones de un anticuerpo biespecífico CEAxCD47. Las dianas opsonizadas se añadieron a las placas que contenían macrófagos y CMS<p>autólogas; y las placas se incubaron a 37 °C durante 48 h. Después de 48 h, se retiró la mitad del medio de los pocillos y se añadió una disolución de luciferina 2X a las placas para obtener una concentración final de 150 pg/ml. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, las placas se leyeron usando un Synergy NEO. El porcentaje de viabilidad se calculó dividiendo el valor de luminiscencia (menos el fondo) por el control que contenía únicamente las células diana y multiplicando por 100. A continuación, se extrapoló el porcentaje de destrucción restando el porcentaje de viabilidad a 100.
Las Figuras 19A y B muestran los resultados obtenidos con combinaciones de CEA-TCB y K2AC5 y K2AC22 a diversas concentraciones.
Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos 0002, 0016, 0099 - 0103, 0088 -0095, 0097,230, 0107,0108, 0109, 0111 - 0114, 0119 - 0128, 0138, 0227,0228, 0232, 0234, 0239, 0242, 0245, 0248, 0249, 0251, 0255, 0306, 0309, 0310, 0311, 0314, 0315, de la presente descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo biespecífico que comprende una primera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana y una segunda parte de unión que se une específicamente a CD47 humano,caracterizado por quea) la primera parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende como CDR una CDRH1 de SEQ ID NO:25, una CDRH2 de SEQ ID NO:26 y una CDRH3 de S<e>Q ID NO:27 y una región variable de cadena ligera que comprende una combinación de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:31, 32 y 33; y SEQ ID NO:34, 35 y 36.
b) y la segunda parte de unión comprende una región variable de cadena pesada que comprende como CDR una CDRH1 de SEQ ID NO:25, una CDRH2 de SEQ ID NO:26 y una CDRH3 de SEQ ID NO:27 y una región variable de cadena ligera que comprende como CDR una CDRL1 de SEQ ID NO:28, una CDRL2 de SEQ ID NO:29 y una CDRL3 de SEQ ID NO:30.
2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1,caracterizado por que
a) la primera parte de unión comprende una región variable (VH) de cadena pesada de SEQ ID NO:4 y una cadena ligera seleccionada del grupo de cadenas ligeras que consiste en SEQ ID NO:64 y SEQ ID NO:65,
b) y la segunda parte de unión comprende una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:4 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:10.
3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1,caracterizado por que
a) la primera parte de unión comprende una cadena pesada de SEQ ID NO:5 y una cadena ligera seleccionada del grupo de cadenas ligeras que consiste en SEQ ID NO:64 y SEQ ID NO:65,
b) y la segunda parte de unión comprende una cadena pesada de SEQ ID NO:5 y una cadena ligera de SEQ ID NO:11.
4. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,caracterizado por quedicha primera parte de unión específica para CEACAM5 comprende un dominio variable de cadena ligera lambda y un dominio constante de cadena ligera lambda y dicha segunda parte de unión específica para CD47 comprende un dominio variable de cadena ligera kappa y un dominio constante de cadena ligera kappa o dicha primera parte de unión específica para CEACAM5 comprende un dominio variable de cadena ligera kappa y un dominio constante de cadena ligera lambda y dicha segunda parte de unión específica para CD47 comprende un dominio variable de cadena ligera kappa y un dominio constante de cadena ligera kappa.
5. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 4,caracterizado por quedicho anticuerpo biespecífico comprende una cadena pesada común.
6. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes,caracterizado por quecomprende una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en la región Fc seleccionadas del grupo que consiste en monosustituciones S239D, I332E, G236A, bisustituciones I332E y G236A, S239D e I332E, S239D y G236A, y sustituciones triples S329D e I332E y G236A.
7. Un método para la producción de un anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende a) cultivar una célula hospedadora, que comprende un vector de expresión, que comprende un polinucleótido que codifica un anticuerpo biespecífico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en condiciones que permiten la producción de dicho anticuerpo biespecífico, y b) aislar dicho anticuerpo.
8. El anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer que expresa CEACAM5 en un sujeto.
9. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en combinación simultánea, separada o secuencial con un segundo anticuerpo biespecífico que comprende una tercera parte de unión que se une específicamente a CEACAM5 humana, y una cuarta parte de unión que se une específicamente a CD3e humano para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa CEACAM5 en un sujeto.
10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, para su uso como medicamento.
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