CN102028951B - RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒的制备方法。本发明在用改良自乳化溶剂扩散法制备冬凌草甲素聚乳酸纳米粒的基础上，选择复合多肽缩合剂EDC·HCl和NHS-sulfo，采用两步缩合反应，制备ORI-NP-RGDfK。本发明制备的ORI-NP-RGDfK具有明显的缓释特征，对肿瘤具有良好的选择性分布；对小鼠移植性肝癌具有良好的抑瘤作用，肿瘤坏死明显，生存期显著延长，生存质量得到改善，ORI-NP-RGDfK抗肿瘤效果显著优于ORI组和ORI-NP组(P＜0.05)。

Description

RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明属于化学制药领域，具体地说，涉及RGDFK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒及其制备方法。

背景技术

在纳米粒(nanoparticles，NP)表面进行修饰，连接特定的配基，通过配体-受体相互作用，使纳米粒与靶部位表达的受体特异性结合，可以达到主动靶向。常用的配体、受体等包括特定的表面活性剂、糖类、叶酸、低密度脂蛋白受体、尿激酶受体、肿瘤坏死因子受体家族、转铁蛋白和多肽等。目前研究较多的多肽类介导的靶向给药系统多为单抗、转铁蛋白、谷胱甘肽、RGD多肽及其类似物等。其中RGD多肽及其类似物作为肿瘤靶向介导的配体是近年研究的热点领域。

整合素(integrin)是一类细胞膜表面糖蛋白受体家族分子，由a、β两个亚基通过非共价键连接而成的异二聚体蛋白质，主要介导细胞与细胞之间及细胞与细胞外间质(ECM)之间的黏附。目前研究发现受体家族包括至少18个a亚单位和9个β亚单位，共同组成超过25种不同的整合素。a、β两种亚基均由长的胞外段(氨基端)、跨膜段、短的胞内段(羧基端)三部分组成。a亚基的胞外段识别ECM的RGD序列(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)介导细胞与ECM之间的黏附；β亚基的胞内段与细胞骨架相连。整合素参与构成的ECM，广泛影响细胞的生长、生存、增殖、分化、侵袭和转移等生物学行为。

整合素在肿瘤血管新生的过程中起着不可缺少的作用。在体外和体内实验中，a₁β₁、a₂β₁、a_vβ₃、a_vβ₅整合素均影响血管生成。a_vβ₃整合素的作用最为重要且研究最多。a_vβ₃在肿瘤血管生成中的作用主要表现在：参与内皮细胞的激活和迁移、介导内皮细胞增殖、抑制内皮细胞凋亡、参与bFGF诱导的血管生成、参与VEGF诱导的血管生成、诱导环加氧酶的产生等。

整合素主要是通过识别配体分子中特定的氨基酸短肽序列“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)而介导细胞的各种生理作用。RGD序列是多种生物细胞外基质和血浆蛋白结构中常见的基本成分，也是广泛存在于细胞间识别系统的基本单位，能与细胞表面整合素特异性结合，从而介导许多重要的生命活动。外源性RGD肽可与体内含RGD序列的物质竞争结合，从而竞争性抑制RGD-整合素介导的各种生命活动。

研究证明，整合素家族中a_vβ₃的配体即含有RGD序列的多肽及其类似物对肿瘤血管内皮细胞的粘附和迁移有明显的抑制作用；RGD肽还可诱导肿瘤细胞中caspase-3和caspase-7表达的增高，从而促进肿瘤细胞的凋亡。整合素a_vβ₃在多种肿瘤细胞表面和新生血管内皮细胞上有高表达，但在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统中a_vβ₃不表达或者很少量的表达。因此，a_vβ₃是理想的肿瘤靶向治疗靶点，其配体RGD肽可以作为靶向载体，携带效应分子，抑制肿瘤生长和新生血管的形成，使肿瘤组织供养系统中断，细胞萎缩、凋亡。

RGD用于介导纳米给药系统的主动靶向和抗肿瘤研究，已成为近年来药物新型给药系统研究的前沿领域。

主动靶向给药系统通过载体结构修饰或生物识别作用将药物定向运送至病变部位发挥药效，而不损伤周围的正常细胞、组织和器官。在纳米粒表面进行修饰，连接特定的配基，通过配体一受体相互作用，使NP与靶部位表达的受体特异性结合，可达到主动靶向。常用的配体、受体等包括特定的表面活性剂、糖类、叶酸、低密度脂蛋白受体、尿激酶受体、肿瘤坏死因子受体家族、转铁蛋白和多肽等。多肽类物质多数源于内源性肽或其他天然肽，其具有活性高、剂量小、毒副作用低、代谢终产物为氨基酸等突出特点。其中RGD多肽及其类似物是近几年围际上研究较为热点的领域。

冬凌草甲素(Oridonin，ORI)，是我国首先从冬凌草中分离的抗癌活性成分，属于贝壳杉烯二萜类化合物，具有抑制肿瘤细胞的增殖、抑制癌细胞DNA、RNA和蛋白质的合成、诱导细胞凋亡、抗突变和β受体阻断作用；对体外培养的Hela细胞、人体食管癌细胞、肝癌细胞及白血病细胞等多种人体癌细胞有明显的细胞毒作用。由于其良好的抗肿瘤效果和较小的毒副作用，近年来得到广泛关注，已有β-环糊精包合物、固态类脂纳米粒、PCL-PEO-PCL载药纳米粒和聚乳酸纳米粒的研究报道。目前临床用药主要有冬凌草片剂、冬凌草糖浆剂，由于冬凌草甲素水溶性不好、稳定性差、生物半衰期短、口服后血药浓度和肿瘤细胞周围的药物浓度低，生物利用度低，限制了其疗效的发挥；另有冬凌草素注射剂，但是注射时有局部有刺激性、可发生静脉炎等副作用，限制了其使用。冬凌草甲素固态类脂纳米粒、PCL-PEO-PCL载药纳米粒等纳米给药系统，仅能达到被动靶向，限制了其在非网状内皮系统肿瘤上的应用，且存在药物易泄漏等问题。

RGDfK(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-L-苯丙氨酸-赖氨酸，分子式C₂₇H₄₃N₉O₈，分子量621)是一种含有RGD序列的五肽，易吸潮，呈白色结晶粉末或片状，-20℃冰箱存放。其中RGD序列用于识别癌细胞膜上的整合素a_vβ₃受体；f作为稳定肽链空间结构的基团。

RGDfK的结构

本发明制备了多肽RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒(ORI-NP-RGDfK)，更好地实现了冬凌草甲素对肿瘤的主动靶向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提出一种RGDFK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒(ORI-NP-RGDfK)，以更好地实现冬凌草甲素对肿瘤的主动靶向，达到提高抗肿瘤疗效的目的。

本发明所要解决的另一技术问题是提出上述ORI-NP-RGDfK的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明ORI-NP-RGDfK的制备包括如下步骤：

一、用改良自乳化溶剂扩散法制备了冬凌草甲素聚乳酸纳米粒(ORI-NP)

冬凌草甲素与聚乳酸(PLA)共溶于丙酮-乙醇混合液中，在搅拌下与质量浓度为0.5-2％的F-68水溶液混合，持续搅拌2-10min，60℃以下减压除去有机溶剂，0.8μm以下微孔滤膜滤过，制得冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒(ORI-NP)溶液；

二、采用两步缩合反应，选择复合多肽缩合剂EDC·HCl和NHS-sulfo，制备ORI-NP-RGDfK

在ORI-NP溶液中加入5-15倍PLA摩尔浓度的1-乙基-3-(二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，C₈H₁₇N₃·HCl，MW 191.7)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS，C₄H₄NNaO₆S，MW 217.13)，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，C₆H₁₃NO₄S，MW 213.25)调pH＝5-6，搅拌使活化，活化温度为0℃-25℃，活化时间为4h-24h，过凝胶柱，保持温度10℃以下，除去过量的EDC·HCl、sulfo-NHS、MES和反应副产物；收集纳米粒胶体溶液，加入RGDfK，RGDfK和PLA的摩尔比为0.1∶1-2∶1，置冰浴中搅拌4-24h，上凝胶柱除去过量的RGDfK和副产物，收集带乳光的胶体溶液，即得ORI-NP-RGDfK胶体溶液。

本发明上述方法中，丙酮-乙醇混合液中丙酮和乙醇的体积比最好为3∶2。

本发明上述方法中，RGDfK和PLA的摩尔比最好为0.5∶1。

本发明上述方法制得的RGDFK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒中，90％的纳米粒子的粒径分布在50-190nm。

本发明以聚乳酸(PLA)作为冬凌草甲素纳米粒的载体材料，以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-L-苯丙氨酸-赖氨酸(RGDfK)作为载药纳米粒的修饰材料，以1-乙基-3-(二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)作为复合多肽缩合剂，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)调溶液pH5～6，以保证活化中间体ORI-NP-sulfo-NHS的稳定性。

本发明随后对小鼠移植性肝癌的治疗作用表明，本发明制备的ORI-NP-RGDfK对小鼠移植性H22型肝肿瘤有明显的抗肿瘤的作用，显著优于ORI-NP(P＜0.05)。

本发明随后的靶向性评价表明，本发明制备的ORI-NP-RGDfK具有良好的主动靶向性。

本发明制备的ORI-NP-RGDfK具有明显的缓释特征，对肿瘤具有良好的选择性分布；对小鼠移植性肝癌具有良好的抑瘤作用，肿瘤坏死明显，生存期显著延长，生存质量得到改善，ORI-NP-RGDfK抗肿瘤作用显著优于ORI组和ORI-NP组(P＜0.05)。

附图说明

图1是ORI-NP-RGDfK的粒径分布图。

图2是ORI-NP-RGDfK的透射电镜照片(×43000)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

实施例1(ORI-NP-RGDfK的制备)

冬凌草甲素12mg、PLA-15K50mg共溶于20mL丙酮-乙醇3∶2的混合液中，在磁力搅拌下倒入到30mL的1％F-68水溶液中，持续搅拌5min，40℃减压除去有机溶剂，0.8μm微孔滤膜滤过，即得。制得的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒呈球形，颗粒圆整，分散均匀；包封率28.86％，载药量8.23％；平均粒径95.8nm，多分散系数0.075，pH3.82±0.23；Zeta电位-10.19mV。

将ORI-NP胶体溶液适量置于具塞锥形瓶中，精密加入10倍于PLA摩尔浓度的EDC·HCl和sulfo-NHS，再加入适量MES调pH5～6，置不同的温度下磁力搅拌一定时间，过凝胶柱，收集纳米粒胶体溶液，加入RGDfK适量，置冰浴中搅拌，反应一定时间后上凝胶柱，收集带乳光的胶体溶液，即得ORI-NP-RGDfK胶体溶液。

活化温度：分别置室温和冰浴下搅拌；

活化时间：分别置于室温下中磁力搅拌不同的时间(4h、8h、12h、24h)；

RGDfK加入量：分别加入适当RGDfK的量，使RGDfK∶PLA的摩尔比分别为0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1；

偶联时间：加入RGDfK后，分别置于冰浴中磁力搅拌不同时间(4h、8h、12h、24h)；

按照上述方法分别制备ORI-NP-RGDfK。

实施例2(ORI-NP-RGDfK的表征)

1.粒径分布图见图1。

测得平均粒径105.2nm，P.I.为0.142，其中90％的纳米粒子的粒径分布在50～190nm之间。

2.透射电镜观察

在透射电镜下(图2)，ORI-NP-RGDfK粒子圆整，分散较均匀，粒径在110nm左右，与粒度测定结果一致。

3.傅里叶红外光谱分析

PLA-NP-sulfo-NHS中在1024cm^-1 1091cm^-1处的峰强明显比NP的1025cm^-1和1089cm^-1峰弱，低频移动；其1741cm^-1的羰基C＝O峰，比纳米粒中PLA的羰基C＝O峰1756cm^-1明显向低频移动了15个波数，这可能是由NHS引入的两个五环上的羰基C＝O所产生的振动峰，因其在表面活化后，形成了酯键并和一个有两个羰基C＝O相连的N相连，形成共轭，造成羰基C＝O的振动峰向低频移动，初步可以判断活化中间体PLA-NP-sulfo-NHS已经形成。

PLA-NP-RGDfK中在3550cm^-1处的峰形较为分裂、尖锐，推测为RGDfK中NH₂的振动峰，峰较弱；2800～2960cm^-1处的亚甲基峰明显加强，可能是RGDfK引入的CH₂的振动峰；在1631cm^-1处有明显的酰胺v_N-C＝O的振动峰，且该处峰较多而密，可能是RGDfK中不同的氨基酸中的酰胺键所形成。1751cm^-1处有较强羰基C＝O峰，可能为纳米粒中PLA的羰基形成的振动峰，但在1710cm^-1处，另有较弱的羰基C＝O峰，可能为RGDfK与PLA偶联形成的酰胺键振动而成。PLA-NP-RGDfK的IR图谱与NP在峰形、峰位和峰强上有明显不同，可以推测PLA-NP-RGDfK已经形成。

4.热分析(DSC)

DSC图谱显示，RGDfK在204.9℃有明显的吸收峰；除去支架保护剂，ORI-NP的吸热峰在308.5℃；ORI-NP-sulfo-NHS有三个吸热峰，分别为84.7℃、291.6℃和344.9℃；ORI-NP-sulfo-NHS的84.7℃吸热峰可能是由破坏活化的ORI-NP-sulfo-NHS所产生的吸热峰，291.6℃左右为纳米粒的峰，较ORI-NP的峰前移；344.9℃的吸热峰推测为脱离纳米粒的活化产物的峰；ORI-NP-sulfo-NHS的特征峰与ORI-NP的特征峰，在峰形、峰位上都有变化推测ORI-NP-sulfo-NHS活化中间体已经形成。

RGDfK与ORI-NP的物理混合物的吸热峰分别在60.7℃、200.9℃和309.2℃。ORI-NP-RGDfK三个吸收峰为92.0℃、208.9℃和310.7℃；物理混合物中60.7℃可能为破坏RGDfK与纳米粒的物理吸附作用而产生的吸热峰。ORI-NP-RGDfK中92.0℃的吸热峰可能为破坏RGDfK偶联在纳米粒表面的作用力而产生的吸热峰；而在208.9℃左右，有一较为平缓的吸热峰，可能是脱离纳米粒的多肽产生的特征吸热峰，它比物理混合物中的RGDfK峰位要略微靠后；在310.7℃吸收峰的左侧约300℃处，有两个小峰，可能为偶联破坏后纳米粒产生的峰。RGDfK与ORI-NP的物理混合物和ORI-NP-RGDfK的特征峰不同，推断偶联成功。

实施例3(靶向性评价)

相对摄取率r_e用于评价两种制剂对某一组织的靶向性，r_e＞1，即表示药物在该组织和器官中有靶向性。靶向效率t_e表示药物对组织器官的选择性，其数值越大，表示药物在该组织中的选择性越高，分布也越多；两种剂型的t_e相比，说明剂型靶向性增强的倍数。其计算公式为：

$r_e=\frac{{\left({\mathrm{AUC}}_{0~\∞}\right)}_{\mathrm{TDDS}}}{{\left({\mathrm{AUC}}_{0~\∞}\right)}_{\mathrm{CDDS}}}$

$t_e=\frac{{\mathrm{AUC}}_{0~\∞}}{\mathrm{\Σ}{\left({\mathrm{AUC}}_{0~\∞}\right)}_i}$

式中，(AUC_0～8)_TDDS是靶向制剂在某组织中的药时曲线下面积，(AUC_0～8)_CDDS是普通制剂在该组织中的药时曲线下面积，∑(AUC_0～∞)_i为非靶组织的药时曲线下之和。

ORI-NP和ORI-NP-RGDfK的相对摄取率r_e和靶向效率t_e结果：

ORI溶液剂中ORI主要分布在血、肝、肺和肾中；ORI-NP的血、脾、肺和肿瘤的相对摄取率r_e大于1.5，显示出明显的选择性分布，尤其在肿瘤的分布最高；而ORI-NP-RGD对肿瘤的相对摄取率r_e为9.63，是ORI-NP的2.2倍。

比较三者的靶向效率t_e，ORI-NP比ORI溶液剂对心、肝的靶向分布减少，对脾、肿瘤的靶向分布增加，肺和肾的分布改变不明显，其对肿瘤的靶向效率t_e是ORI溶液剂的2倍；ORI-NP-RGD比ORI-NP对血、脾、肿瘤的分布增加，对肝、肾的分布减少，对心、肺分布的影响不明显，对肿瘤的t_e是ORI-NP的2.5倍，是ORI的的6倍，显示出良好的肿瘤靶向性。

实施例4(对小鼠肝肿瘤生长的影响)

用在体小鼠移植性肝癌模型考察了ORI-NP-RGDfK经尾静脉注射给药，观察其对肿瘤的生长抑制率和抑瘤率，以及生存质量的影响，以评价其治疗小鼠肝癌的作用。

首先制备小鼠异体移植性肝癌模型。待肿瘤生长至0.6～0.8cm时，淘汰掉肿瘤未长出的、太大以及太小的的荷瘤小鼠，选取48只肿瘤大小较为均一的小鼠，随机分为4组，每组12只，分别为生理盐水组(NS组)；ORI组(阳性对照组)；ORI-NP组和ORI-NP-RGDfK组。上述4组，分别按照20ml·kg^-1和20mg·kg^-1的给药剂量，尾静脉注射，每天1次，连续给药10天。实验过程中注意观察小鼠用药前后的体重变化、生存质量等。

末次给药24h后，各组分别随机处死6只小鼠，剖取肿瘤组织并称重，用游标卡尺分别测量瘤体长径(a)和短径(b)，计算各组肿瘤体积(V)和抑瘤率。计算公式如下：

$V=\frac{{\mathrm{ab}}^2}{2}$

实验结果表明，生理盐水组小鼠肿瘤生长迅速，瘤体体积和重量较大；ORI组次之；ORI-NP-RGDfK组的小鼠肿瘤生长缓慢，瘤体体积和重量最小。ORI组、ORI-NP组和ORI-NP-RGDfK相对NS组的抑瘤率分别为27.22％、56.69％、77.49％。ORI-NP-RGDfK组的抑瘤率明显优于ORI-NP组。

NS组与ORI游离药物组、ORI-NP组和ORI-NP-RGDfK组相比，肿瘤重量均有极显著性差异(P＜0.01)，肿瘤体积ORI组与NS组呈现显著性差异，NS组与ORI-NP组和ORI-NP-RGDfK组相比有极显著性差异(P＜0.01)；各组之间的肿瘤重量均有显著性差异(P＜0.05)；对肿瘤体积，除了ORI组与ORI-NP组、ORI-NP组与ORI-NP-RGDfK组差异不显著(P＞0.05)之外，各组之间的肿瘤体积均有显著性差异。ORI-NP-RGDfK对小鼠皮下移植性肝癌肿瘤具明显的抑瘤效果；显著优于ORI和ORI-NP(P＜0.05)。

Claims (5)

1.一种RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒的制备方法，其特征是，该方法包括如下步骤：

冬凌草甲素与聚乳酸PLA共溶于丙酮-乙醇混合液中，在搅拌下与质量浓度为0.5-2％的F-68水溶液混合，持续搅拌2-10min，60℃以下减压除去有机溶剂，0.8μm以下微孔滤膜滤过，制得冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒ORI-NP溶液；

在ORI-NP溶液中加入5-15倍PLA摩尔浓度的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和N-羟基硫代琥珀酰亚胺sulfo-NHS，用2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES调pH＝5-6，搅拌使活化，活化温度为0℃-25℃，活化时间为4h-24h，过凝胶柱，保持温度10℃以下，除去过量的EDC·HCl、sulfo-NHS、MES和反应副产物；收集纳米粒胶体溶液，加入RGDfK，RGDfK和PLA的摩尔比为0.1∶1-2∶1，置冰浴中搅拌4-24h，上凝胶柱除去过量的RGDfK和副产物，收集带乳光的胶体溶液，即得ORI-NP-RGDfK胶体溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，丙酮-乙醇混合液中丙酮和乙醇的体积比为3∶2。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，RGDfK和PLA的摩尔比为0.5∶1。

4.权利要求1或2或3所述方法制得的RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒。

5.根据权利要求4所述的RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒，其特征是，90％的纳米粒子的粒径分布在50-190nm。

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