EP1966231A1 - Verfahren zur ausbildung von disulfidbrücken - Google Patents

Verfahren zur ausbildung von disulfidbrücken

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EP1966231A1
EP1966231A1 EP06841161A EP06841161A EP1966231A1 EP 1966231 A1 EP1966231 A1 EP 1966231A1 EP 06841161 A EP06841161 A EP 06841161A EP 06841161 A EP06841161 A EP 06841161A EP 1966231 A1 EP1966231 A1 EP 1966231A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
optionally substituted
hydrogen
alkyl
group
radical
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06841161A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Karsten Knorr
Marco Emgenbroich
Carsten BÜNGENER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AplaGen GmbH
Original Assignee
AplaGen GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by AplaGen GmbH filed Critical AplaGen GmbH
Priority to EP06841161A priority Critical patent/EP1966231A1/de
Publication of EP1966231A1 publication Critical patent/EP1966231A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61Q5/04—Preparations for permanent waving or straightening the hair
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]

Definitions

  • disulfide bridges are known in the art. For example, in a standard method of cyclizing peptides by forming intramolecular disulfide bridges, it is known to use K 3 [Fe (CN) e] as the oxidant. This reagent ensures clean cyclization products at high yields; Side reactions are avoided. In addition, cyclizations due to the influence of oxygen or iodine are still known. However, these methods have the disadvantage that they are either too slow or result in a large number of unwanted by-products.
  • Another known method for the cyclization of peptides is the use of immobilized Ellmann's reagent (5,5; -dithiobis (2-nitrobenzoic acid)) as the oxidant.
  • This method allows the complete oxidation of, for example, a linear peptide; Impurities caused by the reagent are avoided.
  • This approach has recently been extended to cross-linked ethoxylate-acrylate-resin (CLEAR) supports. These are compatible with both organic and aqueous solvent mixtures.
  • the present invention is therefore based on the object to provide an alternative method for generating disulfide bridges.
  • This object is achieved by a method for forming disulfide bridges, which is characterized in that the reaction is carried out in a liquid mixture containing at least one heterocyclic compound having at least one nitrogen atom in the ring.
  • claim 1 relates to a process for forming disulfide bridges, characterized in that the reaction is carried out in a liquid medium containing at least one compound which promotes the formation of disulfide bridges, said compound being selected from the group consisting of:
  • the substituent A - is hydrogen, an optionally substituted alkyl radical, an optionally substituted aryl radical or a saturated or unsaturated heterocyclyl having 3 to 10 ring members and 1 to 3 heteroatoms, such as nitrogen, oxygen and / or sulfur, wherein the heterocyclyl unsubstituted or monosubstituted or polysubstituted by halogen, alkyl having 1 to 4 carbon atoms, cyano, nitro, Cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms, hydroxy, alkoxy having 1 to 4 carbon atoms and / or mercapto.
  • the compound according to alternative (a) has the following basic structure:
  • heterocycle is saturated or unsaturated depending on the choice of the substituents R1 to R6 and may accordingly have one or more double bonds;
  • V, W, X, Y and Z are either carbon atoms or nitrogen atoms, the heterocycle having a total of not more than three, preferably two, nitrogen atoms;
  • R6 represents hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical, or R6 together with R5 represents a five- or six-membered ring, which may also have heteroatoms and optionally carries further substituents, or R6 is missing.
  • substituents R 2 to R 6 may be absent if a nitrogen atom having a double bond is present at the linking position in the ring (see, for example, the compounds 2,6-dihydroxypyridine hydrochloride; uracil-6-carboxylic acid, 4,6 -Dihydroxypyrimidin).
  • Oxo group in the context of the invention means that the respective substituent forms an oxo group with the ring atom and, correspondingly, an oxygen atom is bonded to the ring via a double bond:
  • the heterocycle is unsaturated in the case of the presence of hydroxyl groups.
  • Tautomers are structural isomers that differ only in the position of a group (eg, hydrogen) and in the position of a double bond.
  • a group eg, hydrogen
  • oxo group 0
  • the aromatically present compounds such as the 2,6-dihydroxy-pyridine hydrochloride can tautomerize. This is especially true for the enol forms, which may preferentially tautomerize toward the keto form.
  • Tautomeric (isomeric) forms of the substances shown are therefore included according to the invention.
  • the six-membered heterocycle has two nitrogen atoms which may be positioned differently.
  • active compounds of this structure are uracil-6-carboxylic acid, 2,4-dihydroxy-6-methylpyrimidine, 2,4-dimethyl-6-hydroxypyrimidine, 2-isopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-dihydroxy 2-methylpyrimidine, 4,6-dihydroxypyrimidine, 1, 2-dihydro-3,6-pyridazinedione:
  • the compound has the following substructure:
  • heterocycle is saturated or unsaturated depending on the choice of the substituents R2, R3, R4 and R6 and may accordingly have one or more double bonds; in which
  • R6 is hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical or R6 is missing.
  • Active examples of this embodiment are, for example, barbituric acid, alloxan monohydrate and violuric acid
  • R4 and R6 are independently hydrogen or an optionally substituted alkyl or aryl radical, preferably hydrogen or a branched or unbranched C1 to C10 alkyl radical, particularly preferably a C1 to C4 alkyl radical or hydrogen.
  • the compound which promotes the formation of disulfide bonds is purine derivatives whose skeleton corresponds to the following general formula
  • R4 and R6, are hydrogen, an optionally substituted alkyl group or an optionally substituted aryl group; preferably hydrogen, an optionally substituted Ci- to Cio-alkyl radical or an optionally substituted C 6 - or Cio-aryl radical; particularly preferably hydrogen, an optionally substituted C 1 to C 6 alkyl radical or an optionally substituted C 6 aryl radical; in particular represent hydrogen or an optionally substituted C 1 to C 3 alkyl radical;
  • the cyclic compound can thus be based on a purestan skeleton.
  • the purine skeleton can be regarded as a condensed ring system composed of the two heterocycles pyrimidine and imidazole. Its systematic IUPAC name is 7H-imidazole [4,5-d] pyrimidine.
  • the 7H-purine is in a tautomeric equilibrium with its isomer, the 9H-PuHn, and in the context of the present invention, compounds based on both tautomeric forms are also considered:
  • At least one radical R4, R6, R7 and R9 is an alkyl group and at least one, preferably two of the radicals R4, R6, R7 and R9 represent hydrogen or a C 1 to C 3 alkyl group, preferably Methyl.
  • heterocyclic compounds based on purine are 3-methylxanthine, theobromine, theophylline, caffeine, isocaffeine, xanthine, theophylline-7-acetic acid, theophylline-8-butyric acid and 3-isobutyl-1-methylxanthine:
  • R2 and R3 together form an optionally substituted six-membered ring optionally having at least one heteroatom.
  • This embodiment is preferably compounds in which an aromatic has been fused to the basic heterocycle. This prefers a bridge of two carbon atoms. Examples in which a 5-membered ring has been condensed (for example imidazole) have already been explained above (compounds based on the purine skeleton). Further examples of fused ring structures are pyrazine and quinoxaline.
  • the compound has the following basic structure:
  • rings may be unsaturated depending on the choice of the substituents and may carry one or more double bonds, and accordingly
  • R4 and R6, each independently of the other, are or are absent for hydrogen, an optionally substituted alkyl radical or an optionally substituted aryl radical; preferably hydrogen, an optionally substituted branched or unbranched C r to C 10 alkyl radical or an optionally substituted C 6 - or C 10 -
  • Aryl radical particularly preferably represents hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C 6 -alkyl radical or a given if substituted C 6 aryl radical; in particular hydrogen or an optionally substituted C 1 to C 3 alkyl radical;
  • R10 and R13 are hydrogen, an optionally substituted alkyl radical or an optionally substituted aryl radical, or R10 and / or R13 are absent; are preferably hydrogen, an optionally substituted branched or unbranched C 1 to C 1 0 alkyl radical or an optionally substituted C 6 or C 10 aryl radical; particularly preferably hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C 6 -alkyl radical or an optionally substituted C 6 -aryl radical; in particular represent hydrogen or a C 1 to C 6 -alkyl radical substituted by at least one hydroxyl group;
  • substituents R2, R3, R4 and R5 may also independently represent hydrogen, an optionally substituted branched or unbranched C 1 - to C 10 -alkyl radical or an optionally substituted C 6 - or C 0 -
  • aryl preferably hydrogen, an optionally substituted branched or unbranched C 1 - to C 6 -alkyl radical or an optionally substituted C 6 -aryl radical; in particular hydrogen or an optionally substituted C 1 to C 3 -alkyl radical, in particular methyl radical.
  • R 6 is preferably hydrogen or an alkyl radical, C 1 to C 8 , preferably C 1 to C 4 , particularly preferably hydrogen or a methyl group.
  • Electron-withdrawing groups or atoms which may also be used herein as substituents on the heterocycle (see above), are, for example, electron-withdrawing groups or atoms which as substituents lower the electron density on a corresponding aromatic heterocyclic ring (also referred to as deactivating groups). Electron-withdrawing groups have an (-) - M and / or a (-) - I effect.
  • the resonance effect (M effect, mesomeric effect) generally only works when the group is directly attached to the unsaturated heterocyclic system. It acts via ⁇ -electrons, in contrast to the field effect (I-effect, inductive effect), which acts through space, through solvation molecules or preferably via ⁇ bonds of a system.
  • An electron-withdrawing effect can be either inductive (i.e., by the so-called (-) I effect) and / or mesomerically (i.e., by the so-called (-) - M effect).
  • the classification of aromatic substituents in substituents with (+) - l and (-) - l effect and with (+) - M effect and (-) - M effect is known in the art per se. For further details, reference is made to Beyer / Walter, "Lehrbuch der Organischen Chemie", 1998, 23rd revised and updated edition, pages 515 to 518, the disclosure of which is included in the present invention.
  • Corresponding groups are examples of useful substituents.
  • the compound according to alternative (b) has a substituent A which
  • heterocyclyl is hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C O alkyl group, an optionally substituted C 6 - or Cio-aryl or saturated or unsaturated heterocyclyl having 3 to 10 ring members and 1 heteroatom such as nitrogen, oxygen and / or sulfur, where the heterocyclyl is unsubstituted or mono- or polysubstituted by halogen, alkyl having 1 to 4 carbon atoms, cyano, nitro, cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms, hydroxy, alkoxy having 1 to 4
  • Carbon atoms and / or mercapto preferably represents hydrogen, an optionally substituted C 1 - to C 6 -alkyl radical, an optionally substituted C 6 -aryl radical or saturated heterocyclyl having 5 or 6 ring members and 1 heteroatom, such as nitrogen, oxygen and / or sulfur, wherein the heterocyclyl is unsubstituted or monosubstituted or polysubstituted by halogen, alkyl having 1 to 4 carbon atoms, cyano, nitro, cycloalkyl having 3 to 6 carbon atoms, hydroxy, alkoxy having 1 to 4 carbon atoms and / or mercapto; in particular hydrogen, an optionally substituted C 1 to C 3
  • heterocyclic compounds described above can be used both in pure form and as mixtures of various possible isomeric forms, in particular of stereoisomers, such as E and Z, threo and erythro, and optical isomers, such as R and S isomers or atropisomers and of tautomers.
  • the invention includes both the pure isomers and their mixtures.
  • the heterocyclic compounds have acidic or basic properties and can form salts, optionally also internal salts. If the compounds of the formula (I) bear hydroxy, carboxy or other groups which induce acidic properties, these compounds can be reacted with bases to form salts.
  • bases are, for example, hydroxides, carbonates, bicarbonates of the alkali and alkaline earth metals, in particular those of sodium, potassium, magnesium and calcium, furthermore ammonia, primary, secondary and tertiary amines having (C r C 4 -) - alkyl radicals and mono-, di and trialkanolamines of (C 1 -C 4 ) -alkanols.
  • acids are, for example, mineral acids, such as hydrochloric, sulfuric and phosphoric acids, organic acids, such as acetic acid or oxalic acid, and acidic salts, such as NaHSO 4 and KHSO 4 .
  • mineral acids such as hydrochloric, sulfuric and phosphoric acids
  • organic acids such as acetic acid or oxalic acid
  • acidic salts such as NaHSO 4 and KHSO 4 .
  • heterocyclic compounds which can be used according to the invention for promoting the formation of the disulfide bridges can also be described as follows:
  • radicals R 1 ', R 2 ' and R 3 ' are either the same or different; However, at least one of the radicals represents an alkyl group. It is understood that tautomers, in which Among other things, the double bond migrates, also be captured by the above formula. Corresponding structural isomers are therefore also encompassed by this formula. As has been stated, these compounds are particularly suitable for promoting the formation of disulfide bridges in amino acid-containing substances, in particular in peptides and proteins.
  • At least one, preferably two of the radicals R 1 ', R 2 ' and R 3 ' which are either identical or different, preferably represents either hydrogen or a Ci to C 5 alkyl group.
  • the radicals may include a functional group.
  • residues R 4 '(on the nitrogen) and R 5 ' are present at the remaining positions on the heterocyclic 5-membered ring (especially in the tautomeric forms).
  • These are customizable, preferably organic radicals. According to one embodiment, they are functional groups which allow the attachment of the substance to, for example, a carrier. This variant will be described in detail below.
  • Particularly suitable substances for use with the method according to the invention are, as already explained, caffeine and caffeine-like substances such as, for example, theobromine and theophylline.
  • peptides and proteins in particular peptides having an amino acid length between 5 and 100, preferably 10 and 50, more preferably between 15 to 40 amino acids in water even at higher peptide concentration at room temperature by the method according to the invention cyclize by formation of intramolecular disulfide bridges.
  • the method is therefore particularly suitable for the formation of intramolecular disulfide bridges and therefore in particular for the cyclization of peptides.
  • polypeptides and proteins can be cyclized with the appropriate method.
  • disulfide bridges with differently structured substances carrying SH groups.
  • disulfide bridges for example, in a cyclization, takes place due to the addition of the heterocyclic compound of the invention such as caffeine or a caffeine-like substance (see above formulas) in some peptides almost quantitatively. However, this is not mandatory. Surprisingly, it is not necessary (but possible) to add an oxidizing agent to accelerate the reaction, since the atmospheric oxygen in the presence of the above-characterized substance for the formation of disulfide bridges is sufficient.
  • the reaction rate may increase in the course of the reaction.
  • the positive Influencing by the inventive addition of the above-characterized substance is surprising in that it is mostly - in contrast to the substances used in the prior art DMSO or iodine - not oxidizing agent.
  • the atmospheric oxygen is sufficient for the oxidation, wherein the reaction rate increases in an advantageous manner due to the addition of the heterocyclic compound according to the invention.
  • Increasing the reaction rate might also suggest an autocatalytic mechanism, possibly through the cyclized product.
  • the process according to the invention can advantageously be carried out at room temperature.
  • the apparently autocatalytic course of the reaction occurs both in unbuffered and in buffered solutions (for example phosphate buffer, pH 6 - 9).
  • buffered solutions for example phosphate buffer, pH 6 - 9
  • the amount of substance added to the reaction mixture to promote the formation of the particular intramolecular disulfide bridges will vary depending on the compound and the substance to which disulfide bridges are to be formed. As a rule, small catalytic amounts are sufficient.
  • the amount to be employed is preferably at least about 0.0001 mg / ml, more preferably in a range of about 0.0001, 0.001 or 0.01 to 20 mg / ml, 0.001 or 0.01 to 15 mg / ml, 0.001 or 0.01 to 10 mg / ml, 0.001 or 0.01 to 5 mg / ml, preferably 0.001 or 0.01 to 1 mg / ml, and more preferably in a range of 0.03 to 0.5 mg / ml.
  • the amounts vary depending on the selected substance (eg caffeine or caffeine-like substance) and the peptide or protein to be treated and should therefore be individually optimized in each case.
  • a particularly suitable concentration range for peptides with a length of about 15 to 25 amino acids is 0.05 to 0.3 mg / ml, more preferably 0.075 to 0.15 mg / ml.
  • the amounts vary depending on the peptide and can also be significantly higher; the amounts should therefore preferably be optimized for the particular peptide.
  • the reaction rate can be further accelerated if an additional oxidizing agent is added to the reaction mixture. For example, glutathione in oxidized form (GSSG) may be mentioned.
  • a disulfide bridge is formed in a peptide or protein between two cysteines.
  • the disulfide bridge can also be formed between other natural and non-natural amino acids, provided that they have appropriate groups which are suitable for forming a disulfide bridge (-S-S-).
  • Thiolysin, homocysteine and other cysteine derivatives are to be mentioned as examples of suitable amino acids in addition to cysteine.
  • the term disulfide bridge is not to be equated with the term cysteine bridge, but includes the formation of corresponding -S-S bonds between any natural or non-natural SH-containing amino acids or other SH-containing compounds.
  • the method according to the invention can therefore also disulfide bridges in other SH-containing compounds, in particular polymers, train.
  • a plurality of disulfide bridges can also be formed with the method according to the invention.
  • the present process can be used particularly advantageously for the cyclization of EPO-mimetic peptides (see, for example, WO 96/40479).
  • Novel EPO mimetic peptides are described in PCT / EP2005 / 012075 (WO 2006/050959), the disclosure content of which with respect to the peptides is hereby made the subject of this application in its entirety.
  • these novel EPO mimetic peptides have no proline in position 10 of the EPO mimetic consensus motif (with regard to the Numbering is referred to Johnson et al, 1997). Rather, the proline is replaced by a non-conservative amino acid, in particular a basic amino acid, in particular lysine.
  • each amino acid represents a natural or non-natural amino acid
  • X 6 is C, A, E, ⁇ -amino- ⁇ -bromobutyric acid or homocysteine (Hoc);
  • X 7 is R, H, L, W or Y or S;
  • X 8 is M, F, I, homoserine methyl ether (Hsm) or norisoloisine;
  • X 9 is G or a conservative substitution of G; X 10 is a non-conservative substitution of proline; or X 9 and X 10 are substituted by a single amino acid;
  • X 11 may be any amino acid
  • X 12 is T or A
  • X 13 is W, 1-nal, 2-nal, A or F;
  • X 14 is D, E, I, L or V;
  • X 15 is C, A, K, ⁇ -amino- ⁇ -bromobutyric acid or homocysteine (Hoc) with either X 6 or X 15 C or Hoc.
  • Hoc homocysteine
  • EPO mimetic peptides show a particularly good activity in cyclized form.
  • two peptide monomers (the monomers correspond to binding domains) are each cyclized with an EPO mimetic consensus and linked to a dimer, since binding to the EPO receptor in this form is most effective.
  • the EPO mimetic monomers have an average of 10 to 25 amino acids.
  • they are synthesized as continuous dimers (bivalent peptides) to avoid separate dimerization steps.
  • the heterocyclic compound for example caffeine
  • the heterocyclic compound can be separated off by liquid-liquid extraction.
  • caffeine can be separated from an aqueous peptide solution by repeated extraction with dichloromethane.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the reaction time can be reduced to less than eight hours (for example by lowering the pH, choosing an additional oxidizing agent).
  • H-CYIQNCPLG-OH which is also cyclized by formation of an intramolecular cysteine bridge.
  • the intramolecular disulfide bridge is preferably formed between two amino acids. These may be natural or unnatural, the only prerequisite is the ability to form a disulfide bond by reacting the SH group.
  • Cysteine is arguably the best-known disulfide bridge-forming amino acid, which is also used in nature predominantly for the formation of disulfide bridges.
  • Disulfide bridges occur in nature especially in the formation of intra- and intermolecular disulfide bridges. Thus, for example, they effect the cohesion between the individual polypeptide chains of proteins (for example insulin) in the form of intermolecular disulfide bridges and regularly stabilize the conformation within a protein by forming intramolecular disulfide bridges.
  • the keratin of wool and hair contains, for example, more than 10% cysteine, which is why there are also many disulfide bridges. Are these disulfide bridges broken (For example, by lyes, light, heating, etc.), the tensile strength of the fibers decreases sharply.
  • the method according to the invention can therefore also be used to form disulfide bridges in fibers (natural and synthetic fibers). The same applies to the treatment of hair, in which disulfide bridges are also of great importance for structural strength.
  • the method according to the invention can therefore also be used to form disulfide bridges in hair, which also opens up a field of cosmetic application (for example shampoos, reagents for forming perms, etc.).
  • the method according to the invention can be used, for example, as means for closing the disulfide bridges in the context of a permanent wave treatment.
  • an oxidizing agent is added to promote disulfide bridge formation. It has been found that the reaction rate can be significantly accelerated and the disulfide bridges are closed correspondingly faster. This has the consequence that when applying the method according to the invention for hair, the contact time and thus the duration of the treatment for the customer is shortened in an advantageous manner.
  • a particularly suitable oxidizing agent is oxidized glutathione (GSSG). The resulting improvement in the closure of disulfide bridges in both quantitative and temporal terms is clearly described in the experimental examples.
  • the present invention also relates to the use of the previously described heterocyclic compounds in cosmetic preparations.
  • these cosmetic preparations can be promoted according to the formation of disulfide bridges, for example, hair.
  • the cosmetic preparations may contain, in addition to the previously described heterocyclic compound, suitable solvents as well as additives customary in such formulations.
  • suitable solvents such as emulsifiers and coemulsifiers, surfactants, oil, preservatives, perfume oils, cosmetic care and active ingredients such as AHA acids, fruit acids, ceramides, phytantriol, collagen, vitamins and pro-vitamins, such as vitamins A, E and C, retinol, bisabolol , Panthenol, natural and synthetic light stabilizers, natural substances, opacifiers, micropigments such as titanium oxide or zinc oxide, superfatting agents, pearlescent waxes, bodying agents, thickeners, solubilizers, complexing agents, fats, waxes, silicone compounds, hydrotropes, dyes, stabilizers, pH regulators, reflectors, Proteins and protein hydrolysates, protein hydrolysates, salts, gelling agents, bodying agents, silicones, humectants, moisturizer
  • Hair cosmetic preparations comprise, in particular, styling agents and / or conditioners in hair cosmetic preparations, such as hair treatments, hair foams,
  • the agent is a product for the hair selected from hair shampoo and hair products which are rinsed or not rinsed and applied before or after shampooing, coloring, decolorization, perming or wrinkling.
  • a method for the treatment of hair is provided, which is characterized in that the hair with the cosmetic agent, containing at least one of the previously explained in more detail heterocyclic compound are brought into contact and optionally rinsed with water.
  • the heterocyclic compound is preferably selected from the compounds and classes of compounds detailed above.
  • the method can also be used to form disulfide bridges of synthetic substances which have only functional groups bearing SH groups, but are not constructed from amino acids, for example (but for example from an organic polymer).
  • the separation of the substance promoting the formation of disulfide bridges is considerably facilitated.
  • a carrier is loaded with the disulfide bridge promoting substance.
  • the carrier may, for example, be a (hydrophilic) resin.
  • the binding of the substance to the carrier has the consequence that the separation of the supported substance, for example.
  • Formulas bound to a carrier to facilitate the separation.
  • caffeine derivatives are:
  • Both derivatives promote the formation of disulfide bridges and thus the cyclization of peptides in solution.
  • an immobilized reagent capable of accelerating the closure of disulfide bridges is obtained.
  • the reagent can be removed by simple filtration from the reaction solution.
  • R 1 'to R 3 ' radicals as here in the case of 8- (3-Carbo xypropyl) -1
  • 3-dimethylxanthine for example, a functional group as R 5 'for coupling to the carrier, attach.
  • the invention further relates to the use of the previously described heterocyclic compounds for the formation of disulfide bridges, in particular of intra- or intermolecular disulfide bridges in peptides and proteins.
  • the substances to be used according to the invention are particularly suitable for the cyclization of peptides, in particular EPO mimetic peptides, by the formation of intramolecular disulfide bridges.
  • Particularly preferred examples are N-methyl-2-pyridone, 2,6-dihydroxy-pyridine hydrochloride, uracil-6-carboxylic acid, 2,4-dihydroxy-6-methylpyrimidine, 2,4-dimethyl-6-hydroxypyrimidine, 2 isopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-dihydroxy-2-methylpyrimidine, 4,6-dihydroxypyrimidine, 1, 2-dihydro-3,6-pyridazinedione, 7-hydroxy-5-methyl [1, 2, 4] triazolo [1,5-a] pyrimidine, barbituric acid, alloxan monohydrate and violuric acid, uracil, 1-methyl-uracil, 3-methylxanthine, theobromine, theophylline,
  • Such disulfide bridges are formed between SH-containing groups.
  • natural and non-natural amino acids which have free SH groups are suitable disulfide bridge formers.
  • the substances of the above formula can be used, for example, for the treatment of SH-containing substances and materials to promote the formation of disulfide bridges.
  • the substances can be used, for example, for the treatment of hair or fibers (natural and Synthetikfasem). This applies in particular to cysteine-containing fibers.
  • the heterocyclic compounds to be used according to the invention can also be used, for example, in liquid formulations (for example in the form of rinses or shampoos or other agents for treating hair such as, for example, perming agents). Corresponding compositions are therefore also encompassed by the invention.
  • heterocyclic compounds characterized according to the invention Due to the catalytic effect of heterocyclic compounds characterized according to the invention on the formation of disulfide bridges, they can also be used, for example, for catalysis in the formation of intermolecular or intramolecular disulfide bridges for the preparation of dynamic combinatorial libraries. They can therefore serve to form disulfide bridges between synthetic or natural or modified natural molecules. Therefore, they can find application in the production of dynamic combinatorial libraries for drug discovery.
  • the individual units often crosslinked via disulfide bridges to macromolecules (see Fig. 15). Details of the libraries are described, for example, in "Dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides in water" by S. Otto, RLE Furlan and JKM Sanders, J.
  • EPO mimetic peptides and oxytocin were chosen as examples of the peptides that can be cyclized by the method according to the invention.
  • Fig. 2 shows the cyclization of the same peptide as in Fig. 1 (0.7 mg / ml) to its cyclized form in the absence of caffeine. As can be clearly seen, the reaction rate is considerably reduced.
  • Fig. 4 Shown is the dependence of Zyklmaschines Republic on pH.
  • the autocatalytic course of the reaction is not due to a change in the pH, since this effect also occurs in the illustrated buffered solutions (phosphate buffer, pH 6 to 9).
  • phosphate buffer, pH 6 to 9 phosphate buffer, pH 6 to 9
  • the yield of cyclized peptide decreases at higher pH values.
  • FIG. 6 shows chromatograms which were recorded in each case after one hour of reaction and which confirm the reaction of the EPO-mimetic peptide used with 0.5 equivalents of GSSG.
  • FIG. 7 shows a tabular overview which compares the method according to the invention with the methods known in the prior art.
  • the tested peptides had the following sequence:
  • EMP1 Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-At
  • APG1 Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-At
  • APG2 Ac-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCKKQRG-Am
  • FIG. 8 Shown is the cyclization of dimeric EPO mimetic peptides.
  • the cyclization of di- or multimeric peptides is preferably carried out in several steps.
  • FIG. 8 shows the synthesis scheme based on a bivalent (dimeric) EPO-mimetic peptide, which is cyclized in 2 steps by formation of two intramolecular disulfide bridges.
  • the first disulfide bridge is formed by the method according to the invention.
  • the second intramolecular disulfide bridge was performed using optimized iodine oxidation.
  • the first cyclization using caffeine according to the invention is preferably carried out at pH 6, while the second cyclization was carried out in 80% acetic acid according to the example shown.
  • the yield of the synthesis was typically between 60 and 90%.
  • EPO mimetic peptides are very difficult to cyclize.
  • An example of this is the following peptide:
  • Aad 2-aminoadipic acid, "homoglutamic acid” NaI: naphthylalanine
  • oxytocin, reduced (OyxR), crude product was dissolved in water (or H 2 O / ACN / TFA) and allowed to stand in air with various concentrations of caffeine (and possibly GSSG).
  • the reaction batch was measured by HPLC at regular intervals to determine the levels of OxyR and the product oxytocin (oxy).
  • the reaction time until complete conversion of OxyR correlates with the concentration of caffeine in the reaction solution. Up to a concentration of 0.5 mg / ml caffeine, the more caffeine the faster the oxidation proceeds. The peptide concentration has only a minor influence on the duration of the reaction.
  • Minoxidil as a further representative of the heterocyclic compounds according to the invention, therefore likewise has a positive effect on the formation of disulfide bridges.
  • the yield in solution of the minoxidil-catalyzed reaction is over 95%.
  • the fact that the reaction is a catalytically occurring reaction is shown by the fact that the concentration of minoxidil in the reaction does not decrease practically (decrease ⁇ 2% at 4.4 eq minoxidil based on BB57, see FIG. 14).
  • Oxidizing agent here oxidized glutathione-GSSG
  • the method according to the invention can be used advantageously also in the cosmetic field and in particular in the hairdressing sector for the treatment of hair.
  • Hair samples are a) in H 2 O, or an aqueous solution of b) 10 mg / ml caffeine, c)
  • the hair after removal of the reaction solution with Ellman's reagent (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), DTNB) is reacted.
  • Ellman's reagent (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), DTNB) is reacted.
  • additional reference samples are untreated hair and reduced hair, which was otherwise subjected to no further treatment.
  • the hair samples are each with 200 ⁇ l one Add 10 mM phosphate buffer, pH 8.0 and 1 mM EDTA, and 300 ⁇ l of a 1 mM DTNB solution in the same EDTA-containing buffer. The solution is measured after a few minutes in a UV-Vis spectrometer.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken bei SH-Gruppen tragenden Substanzen, insbesondere Peptiden bspw. durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken, bei dem eine heterozyklische, wenigstens ein Stickstoffatom aufweisende Verbindung (bspw. Koffein oder eine koffeinähnliche Substanz) zur Katalyse der Reaktion eingesetzt wird. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die Zugabe der heterozyklischen Substanz sowohl die Ausbeute als auch die Reinheit an Disulfidbrücken tragendem Produkt erhöht.

Description

AplaGen GmbH
Arnold-Sommerfeld-Ring 2, 52499 Baesweiler
Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken
Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken bekannt. So ist es beispielsweise bei einer Standardmethode zur Zyklisierung von Peptiden durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken bekannt, K3[Fe(CN)e] als Oxidationsmittel einzusetzen. Dieses Reagenz gewährleistet saubere Zyklisierungspro- dukte bei hohen Ausbeuten; Nebenreaktionen werden vermieden. Darüber hinaus sind noch Zyklisierungen durch den Einfluss von Sauerstoff oder Jod bekannt. Diese Methoden haben jedoch den Nachteil, dass sie entweder zu langsam sind oder eine Vielzahl unerwünschter Nebenprodukte zur Folge haben. Eine andere bekannte Methode zur Zyklisierung von Peptiden ist der Einsatz von immobilisierten Ellmann's-Reagenz (5,5;- Dithiobis(2-Nitrobenzoesäure)) als Oxidationsmittel. Diese Methode ermöglicht die vollständige Oxidation bspw. eines linearen Peptids; Unreinheiten durch das Reagenz werden vermieden. Dieser Ansatz wurde erst kürzlich zu Cross-Linked-Ethoxylate-Acrylate- Resin (CLEAR)-Trägern erweitert. Diese sind sowohl mit organischen als auch mit wässrigen Lösungsmittelmischungen kompatibel.
Eine weitere im Stand der Technik bekannte Methode zur Ausbildung von Disulfidbrücken bspw. zur Zyklisierung von Peptiden ist der Einsatz von DMSO als Oxidationsmittel. Dieses Verfahren führt ebenfalls zu einer vollständigen Oxidation des linearen Peptids. Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass die Reaktion sehr langsam ver- läuft und dass der Überschuss an DMSO vor der weiteren Prozessierung entfernt werden muss, was sich bei diesem organischen Lösungsmittel schwierig gestaltet.
Aus obigen Ausführungen ergibt sich, dass mehrere Methoden zur Ausbildung von Disulfidbrücken, was insbesondere bei der Zyklisierung von Peptiden durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken von Bedeutung ist, bekannt sind. Jede dieser Methoden hat jedoch entweder hinsichtlich der Ausbeute, der Reaktionsgeschwindigkeit oder der Reinheit Nachteile.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren zur Erzeugung von Disulfidbrücken bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, welches sich dadurch auszeichnet, dass die Reaktion in einem flüssigen Gemisch durchgeführt wird, das wenigstens eine heterozyklische Verbindung enthält, die mindestens ein Stickstoffatom im Ring aufweist.
Entsprechend betrifft Anspruch 1 ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Reaktion in einem flüssigen Medium durchgeführt wird, das wenigstens eine Verbindung enthält, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten
Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;
(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
in welcher der Substituent A - für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.
Es hat sich überraschender Weise gezeigt, dass die oben definierten Verbindungen die Ausbildung von Disulfidbrücken fördern und somit in der Reaktion als eine Art Katalysator wirken können. Es ist daher vorteilhaft, diese Verbindungen dem Reaktionsgemisch hinzuzufügen, um die Ausbildung von Disulfidbrücken bei unterschiedlichen SH-Gruppen tragenden Substanzen, wie insbesondere Peptiden und Proteinen, zu fördern.
Gemäß einer Ausführungsform weist die Verbindung gemäß Alternative (a) folgende Grundstruktur auf:
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;
- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei, Stickstoffatome aufweist;
- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, R5 zusammen mit R6 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt oder R4 und/oder R5 fehlen;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R6 fehlt.
Fehlen können die genannten Substituenten R2 bis R6 dann, wenn an der verknüpfenden Position im Ring ein Stickstoffatom sitzt, das eine Doppelbindung aufweist (siehe bspw. die Verbindungen 2,6-Dihydroxy-Pyridin-Hydrochlorid; Uracil-6- Carbonsäure, 4,6-Dihydroxypyrimidin).
Ein zentrales Merkmal der erfindungsgemäßen Substanzen gemäß der Alternative (a) ist das Vorhandensein des 6-gliedrigen, stickstoffhaltigen Heterozyklus sowie der Hydroxy- oder erfindungsgemäßen Oxogruppe (=0) am benachbarten Kohlenstoffatom. „Oxogruppe" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass der jeweilige Substituent mit dem Ringatom zusammen eine Oxogruppe bildet und entsprechend ein Sauerstoffatom über eine Doppelbindung an den Ring gebunden ist:
So haben umfangreiche Versuche gezeigt, dass Verbindungen ohne eine solche funktionelle Gruppe (Hydroxygruppe, Oxogruppe =0) regelmäßig nicht die Fähigkeit aufwiesen, die Ausbildung der Disulfidbrücken zu fördern (so bspw. Aminopyrazin, 2,4- Diaminopyrimidin, Melamin, Pyrazincarbonsäure und Pyrazinamid).
Wie sich aus der Definition der Substituenten ergibt, gibt es Verbindungen, die nur ein Stickstoffatom im Heterozyklus aufweisen und die vorteilhaften Wirkungen hinsichtlich der Förderung der Ausbildung der Disulfidbindungen aufzuweisen. Ein Beispiel für eine
Verbindung mit nur einem Stickstoffatom im Heterozyklus und einer erfindungsgemäßen Oxogruppe (=0) am benachbarten Kohlenstoffatom ist die Verbindung N-Methyl-2-Pyridon:
Ein weiteres Beispiel für eine Verbindung mit nur einem Stickstoffatom im Heterozyklus und mit einer Hydroxylgruppe am benachbarten Kohlenstoffatom ist die Verbindung 2,6- Dihydroxy-Pyridin-Hydrochlorid:
Wie im Anspruch festgelegt, ist der Heterozyklus im Falle des Vorhandenseins von Hydroxylgruppen ungesättigt. Versuche haben gezeigt, dass in diesem Fall das Vorhandensein wenigstens einer Doppelbindung für die katalytische Wirkung augenscheinlich bedeutsam ist. Ohne darauf festgelegt sein zu wollen, wird spekuliert, dass dies darauf zurückzuführen sein könnte, dass Verbindungen dieser Struktur tautomerisieren können. Tautomere sind Strukturisomere, die sich lediglich in der Stellung einer Gruppe (bspw. Wasserstoff) und in der Stellung einer Doppelbindung unterscheiden. Im Falle der Hydroxy- und der Oxogruppe (=0) spricht man auch von Keto-Enol-Tautomerie. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die aromatisch vorliegenden Verbindungen, wie das 2,6-Dihydroxy-pyridin Hydrochlorid tautomerisieren können. Dies trifft insbesondere auf die Enolformen zu, die vorzugsweise in Richtung der Ketoform tautomerisieren können. Tautomere (Isomere) Formen der dargestellten Substanzen sind daher erfindungsgemäß mit umfasst.
Vorzugsweise weist der sechsgliedrige Heterozyklus zwei Stickstoffatome auf, die unterschiedlich positioniert sein können. Beispiele für aktive Verbindungen dieser Struktur sind Uracil-6-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6- hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6-Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion:
Ein Beispiel für Verbindungen, bei denen R5 und R6 zusammen eine Ringstruktur bilden, ist 7-Hydroxy-5-methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin:
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Verbindung folgende Substruktur auf:
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.
Aktive Beispiele dieser Ausführungsform sind bspw. Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat und Violursäure
Weitere Beispiele dieser Ausführungsform sind Uracilderivate der folgenden allgemeinen Formel:
wobei R4 und R6 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen, vorzugsweise für Wasserstoff oder einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C10 Alkylrest, besonders bevorzugt für einen C1 bis C4 Alkylrest oder Wasserstoff stehen.
Beispiele mit guter Aktivität sind Uracil und 1-Methyl-Uracil:
Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung, die die Ausbildung von Disulfidbindungen fördert, um Purinderivate, deren Grundgerüst der folgenden allgemeinen Formel entspricht
wobei der Fünfring ungesättigt ist und entsprechend Doppelbindungen aufweist und wobei
R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci- bis Cio-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substitu- ierten C6- oder Cio-Arylrest; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten d- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3-Alkylrest stehen;
- R7, R8 und R9, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl oder eine funktionelle Gruppe stehen; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten d- bis CiO-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder Cio-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -{CH2)n-COOX mit n = 1 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Cr bis C8-Alkyl; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten d- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 6 und X gleich Wasserstoff oder Cr bis C6-Alkyl; insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 4 und X gleich Wasser- Stoff oder C1- bis C3-Alkyl stehen.
Wie dargelegt, kann die cyclische Verbindung demnach auf einem Puringrundgerüst basieren. Das Puringrundgerüst kann als kondensiertes Ringsystem, zusammengesetzt aus den beiden Heterocyclen Pyrimidin und Imidazol, aufgefasst werden. Sein systematischer lUPAC-Name ist 7H-lmidazol[4,5-d]pyrimidin. Das 7H-Purin steht mit seinem Isomer, dem 9H-PuHn, in einem tautomeren Gleichgewicht, wobei im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Verbindungen als umfasst gelten, welche auf beiden tautomeren Formen basieren:
7H Purin 9H Purin
Je nach Wahl der Substituenten am Pyrimidin-Ring kann dieser auch weniger Doppelbindungen aufweisen.
In einer ganz besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Rest R4, R6, R7 und R9 eine Alkylgruppe und mindestens einer, vorzugsweise zwei der Reste R4, R6, R7 und R9 stellen Wasserstoff oder eine d- bis C3-Alkylgruppe, vorzugsweise Methyl, dar.
Besondere Beispiele dieser heterozyklischen Verbindungen auf der Basis von Purin sind 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8-Buttersäure und 3-lsobutyl-1-Methylxanthin:
Wie diese ausgewählten Beispiele zeigen, sind tautomere Verbindungen, denen anstelle des oben dargestellten 7H-Puringrundgerüsts das 9H-Puringrundgerüst zugrunde liegt, ebenfalls umfasst. Gemäß einer weiteren Ausführungsform bilden R2 und R3 zusammen einen gegebenenfalls substituierten Sechsring, der optional wenigstens ein Heteroatom aufweist. Bei dieser Ausführungsform handelt es sich vorzugsweise um Verbindungen, bei denen ein Aromat an den Grundheterozyklus ankondensiert wurde. Dies bevorzugt an einer Brücke aus zwei C-Atomen. Beispiele, in denen ein 5-Ring ankondensiert wurde (bspw. Imidazol), wurden bereits vorstehend erläutert (Verbindungen auf Basis des Puringrundgerüsts). Weitere Beispiele für ankondensierte Ringstrukturen sind Pyrazin und Chinoxalin.
Ein Beispiel für eine Verbindung mit einem Benzolring als ankondensierten 6-Ring ist 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on:
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform weist die Verbindung folgende Grundstruktur auf:
wobei die Ringe je nach Wahl der Substituenten ungesättigt sein und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen tragen können und
R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;
R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten Cr bis C10-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-
Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenen- falls substituierten C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest stehen;
R5 für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) steht oder R5 fehlt;
R10 und R13, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder R10 und/oder R13 fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten Cr bis CiO-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder Cio-Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituierten C1 bis C6- Alkylrest stehen;
R11 und R12, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R11 und R12 bilden zusammen einen fünf oder sechsgliedrigen Ring aus, der optional weitere Heteroatome sowie Substituenten tragen kann.
Ausgesuchte Beispiele für unter diese Formel fallende Verbindungen sind bspw. (-)- Riboflavin, Lumazin und Alloxazin
Es hat sich als vorteilhaft für die Wirkung erwiesen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der Alternative (a) keine exozyklischen Aminogruppen tragen. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen daher keine exozyklischen Aminogruppen auf.
Die oben genannten Substituenten R2, R3, R4 und R5 können ferner unabhängig voneinander Wasserstoff, ein gegebenenfalls substituierter verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter C6- oder Ci0-
Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, ein gegebenenfalls substituierter verzweigter oder unverzweigter C1- bis C6-Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder ein gegebenenfalls substituierter C1 bis C3-Alkylrest, insbesondere Methylrest, sein.
R6 ist vorzugsweise Wasserstoff oder ein Alkylrest, C1 bis C8, vorzugsweise C1 bis C4, besonders bevorzugt Wasserstoff oder eine Methylgruppe.
Elektronenziehende Gruppen oder Atome, welche vorliegend auch als Substituenten an dem Heterocyclus verwendet werden können (siehe oben), sind bspw. elektronenziehende Gruppen oder Atome, welche als Substituenten die Elektronendichte an einem entsprechenden aromatischen heterozyklischen Ring erniedrigen (auch als deaktivierende Gruppen bezeichnet). Elektronenziehende Gruppen besitzen einen (-)-M- und/oder einen (-)-l-Effekt. Der Resonanz-Effekt (M- Effekt, mesomerer Effekt) wirkt im Allgemeinen nur, wenn die Gruppe direkt an dem ungesättigten heterozyklischen System gebunden ist. Er wirkt über π-Elektronen, im Gegensatz zum Feld-Effekt (I-Effekt, induktiver Effekt), welcher über den Raum, über Solvenz-Moleküle oder vorzugsweise über σ-Bindungen eines Systems wirkt.
Ein elektronenziehender Effekt kann entweder induktiv (d.h. durch den so genannten (- )-l-Effekt) und/oder mesomer (d.h. durch den so genannten (-)-M-Effekt) erfolgen. Die Einteilung von aromatischen Substituenten in Substituenten mit (+)-l- und (-)-l-Effekt sowie mit (+)-M-Effekt und (-)-M-Effekt ist dem Fachmann an sich bekannt. Für weitergehende Ausführungen wird auf Beyer/Walter, „Lehrbuch der Organischen Chemie", 1998, 23. überarbeitete und aktualisierte Auflage, Seiten 515 bis 518, verwiesen, dessen diesbezügliche Offenbarung in die vorliegende Erfindung eingeschlossen wird.
Einige, nicht-beschränkende Beispiele für Gruppen mit (-)-M-Effekt sind -SO2-, -SO2O-, -00-, -COO-, -CONH-, -CONR-, -SOR-, -CN, -NO2, -CHO, -CO-, -COSH, -COS", -SO3H und die erfindungsgemäße Oxogruppe (=0). Wie hieraus deutlich wird, können sich die Begriffe „elektronenziehende Gruppe" und „funktionelle Gruppe" überschneiden. Entsprechende Gruppen sind Beispiele für einsetzbare Substituenten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Verbindung gemäß Alternative (b) einen Substituenten A auf, der
für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituiertes C1- bis CiO-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder Cio-Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4
Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; - insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3-
Alkylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert ist; steht.
Besondere Beispiele dieser Pyrimidinderivate sind die folgenden Verbindungen:
Aminexil
Minoxidil Um die Anbindung der Substanz an den Trägerstoff zu ermöglichen, sind funktionelle Gruppen an der erfindungsgemäß zu verwendenden heterozyklischen Verbindung hilfreich. Daher können auch weitere, zuvor nicht explizit erwähnte Derivate der heterozyklischen Verbindungen erfindungsgemäß verwendet werden.
Die zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen können sowohl in reiner Form als auch als Mischungen verschiedener möglicher isomerer Formen, insbesondere von Stereoisomeren, wie E- und Z-, threo- und erythro-, sowie optischen Isomeren, wie R- und S-Isomeren oder Atropisomeren und von Tautomeren vorliegen. Die Erfindung umfasst sowohl die reinen Isomeren als auch deren Gemische.
Je nach Art der oben definierten Substituenten weisen die heterozyklischen Verbindungen saure oder basische Eigenschaften auf und können Salze, gegebenenfalls auch innere Salze bilden. Tragen die Verbindungen der Formel (I) Hydroxy, Carboxy oder andere, saure Eigenschaften induzierende Gruppen, so können diese Verbindungen mit Basen zu Salzen umgesetzt werden. Geeignete Basen sind beispielsweise Hydroxide, Carbonate, Hydrogencarbonate der Alkali- und Erdalkalimetalle, insbesondere die von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium, weiterhin Ammoniak, primäre, sekundäre und tertiäre Amine mit (CrC4-)-Alkylresten sowie Mono-, Di- und Trialkanolamine von (Ci-C4)-Alkanolen. Tragen die Verbindungen der Formel (I) Amino, Alkylamino oder andere, basische Eigenschaften induzierende Gruppen, so können diese Verbindungen mit Säuren zu Salzen umgesetzt werden. Geeignete Säuren sind beispielsweise Mineralsäuren, wie Salz-, Schwefel- und Phosphorsäure, organische Säuren, wie Essigsäure oder Oxalsäure, und saure Salze, wie NaHSO4 und KHSO4. Die so erhältlichen Salze sind ebenfalls einsetzbar.
Weitere bevorzugte Gruppen der oben genannten Verbindungen werden nachfolgend diskutiert.
Beispiele für heterozyklische Verbindungen, die erfindungsgemäß zur Förderung der Ausbildung der Disulfidbrücken eingesetzt werden können, können ferner wie folgt beschrieben werden:
Die Reste R1', R2' sowie R3' sind entweder gleich oder verschieden; wenigstens einer der Reste stellt jedoch eine Alkylgruppe dar. Es versteht sich, dass Tautomere, bei de- nen u.a. die Doppelbindung wandert, ebenfalls durch die obige Formel erfasst werden. Entsprechende Strukturisomere werden daher ebenfalls von dieser Formel umfasst. Diese Verbindungen eignen sich wie dargelegt insbesondere zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken in aminosäurehaltigen Substanzen, insbesondere in Peptiden und Proteinen.
Wenigstens einer, vorzugsweise zwei der Reste R1', R2' sowie R3', die entweder gleich oder verschieden sind, stellt vorzugsweise entweder Wasserstoff oder eine Ci bis C5 Alkylgruppe dar. Insbesondere kurzkettige Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methyl-Gruppe, haben sich als vorteilhaft erwiesen. Ferner kann wenigstens einer der Reste eine funktionelle Gruppe beinhalten. Ferner ist es auch möglich, dass an den verbleibenden Positionen am heterozyklischen 5-Ring Reste R4' (am Stickstoff) und R5' (am zwischen den Stickstoffatomen liegenden Kohlenstoff) vorliegen (insbesondere bei den tautomeren Formen). Diese sind beliebig gestaltbare, vor- zugsweise organische Reste. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich um funktionelle Gruppen, die die Anbindung der Substanz an bspw. einen Trägerstoff ermöglichen. Diese Variante wird nachfolgend noch im Detail beschrieben.
Besonders geeignete Substanzen zum Einsatz mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind wie bereits dargelegt neben Koffein auch koffeinähnliche Substanzen wie bspw. Theobromin und Theophyllin.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass sich insbesondere Peptide und Proteine, insbesondere Peptide mit einer Aminosäurelänge zwischen 5 und 100, vorzugs- weise 10 und 50, besonders bevorzugt zwischen 15 bis 40 Aminosäuren in Wasser selbst bei höheren Peptid konzentration bei Raumtemperatur nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken zyklisieren lassen. Das Verfahren ist daher besonders zur Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken und daher insbesondere zur Zyklisierung von Peptiden geeignet. Ferner lassen sich Polypeptide und Proteine mit dem entsprechenden Verfahren zyklisieren. Ferner lassen sich auch Disulfidbrücken bei anders strukturierten SH-Gruppen tragenden Substanzen ausbilden. Die Ausbildung der Disulfidbrücken, bspw. bei einer Zyklisierung, erfolgt aufgrund der Zugabe der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung wie bspw. Koffein bzw. einer koffeinähnlichen Substanz (siehe obige Formeln) bei einigen Peptiden beinahe quantitativ. Dies ist jedoch nicht zwingend. Überraschender weise ist es nicht erforderlich (jedoch möglich), ein Oxidationsmittel zur Beschleunigung der Reaktion zuzugeben, da der Luftsauerstoff in Anwesenheit der oben charakterisierten Substanz zur Ausbildung von Disulfidbrücken ausreichend ist.
Versuchsergebnisse haben ferner gezeigt, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktionsgeschwindigkeit im Laufe der Reaktion zunehmen kann. Die positive Beeinflussung durch die erfindungsgemäße Zugabe der oben charakterisierten Substanz ist insofern überraschend, da es sich zumeist - im Gegensatz zu den im Stand der Technik eingesetzten Substanzen DMSO oder lod - nicht um Oxidationsmittel handelt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der Luftsauerstoff zur Oxidation ausreichend, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit aufgrund der Zugabe der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung in vorteilhafter Weise zunimmt. Die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit könnte auch einen autokatalytischen Mechanismus ggf. durch das zyklisierte Produkt nahe legen.
Vorteilhafterweise hat sich gezeigt, dass trotz der Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit und selbst bei Einsatz von hohen Peptidkonzentrationen, oft keine oder nur wenig Oligomerisierungsprodukte auftreten. Die im Falle einer Zyklisierung eines Peptids unerwünschte Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken wurde daher nicht beobachtet. Die einzusetzende Peptidkonzentration hängt jedoch von dem jeweils ein- gesetzten Peptid ab und sollte daher für jedes Peptid optimiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafter Weise bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Der augenscheinlich autokatalytische Verlauf der Reaktion tritt sowohl in ungepufferten als auch in gepufferten Lösungen (bspw. Phosphatpuffer, pH 6 - 9) auf. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich erhöht werden kann, wenn der pH-Wert abgesenkt wird. Es ist daher vorteilhaft, den pH-Wert bei < = 7 einzustellen, vorzugsweise in einem pH Bereich von ca. 4 bzw. 5 bis 6,5, besonders bevorzugt ist ein pH Wert um die 6 (5.5 bis 6.5).
Die Menge an Substanz, die dem Reaktionsgemisch zugegeben wird, um die Ausbildung der insbesondere intramolekularen Disulfidbrücken zu fördern, variiert je nach Verbindung und dem Stoff, bei dem Disulfidbrücken ausgebildet werden sollen. In der Regel reichen kleine katalytische Mengen. Die einzusetzende Menge liegt vorzugsweise bei wenigstens ca. 0,0001 mg/ml, besonders bevorzugt in einem Bereich von ca. 0,0001 , 0,001 oder 0,01 bis 20mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 15mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 10mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 5mg/ml, vorzugsweise 0,001 oder 0,01 bis 1 mg/ml und besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,03 bis 0,5 mg/ml. Die Mengen variieren je nach gewählter Substanz (bspw. Koffein oder koffeinähnlicher Substanz) und zu behandelndem Peptid bzw. Protein und sollten daher jeweils individuell optimiert werden. Ein besonders geeigneter Konzentrationsbereich für Peptide mit einer Länge von ca. 15 bis 25 Aminosäuren (insbesondere im Falle von EPO-mimetischen Peptiden) liegt bei 0,05 bis 0,3mg/ml, besonders bevorzugt bei 0,075 bis 0,15 mg/ml. Die Mengen variieren jedoch wiederum je nach Peptid und können auch deutlich höher liegen; die Mengen sollten daher vorzugsweise für das jeweilige Peptid optimiert werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit kann weiter beschleunigt werden, wenn dem Reaktionsgemisch ein zusätzliches Oxidationsmittel zugegeben wird. Beispielsweise sei GIu- tathion in oxidierter Form (GSSG) genannt.
Überraschender Weise hat sich gezeigt, dass die Zyklisierung effektiv auch bei hohen Peptidkonzentrationen durchgeführt werden kann, ohne dass unerwünschte Oligomeri- sierungen auftreten. Hohe Peptidkonzentrationen sind daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei vielen Peptiden eher unproblematisch. Vielmehr hat sich bei einigen Peptiden später gezeigt, dass gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zykli- sierungsreaktion bei hohen Peptidkonzentrationen sogar besser abläuft. Je nach Peptid liegen geeignete Peptidkonzentrationen bei ca. 0,05 bzw.0,1 oder 0,5 bis 5 mg/ml, bevorzugt sind Konzentrationen in einem Bereich von 0,7 bis 1 ,5 mg/ml. Die genaue Konzentration hängt selbstverständlich von dem jeweiligen Peptid, seiner Länge sowie seiner Aminosäurezusammensetzung ab und variiert entsprechend. Die vorliegenden Angaben sind daher nicht beschränkend anzusehen. Für EPO-mimetische Peptide hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, eine Konzentration von ca. 0,7 bis 1 mg/ml einzusetzen. Sie lassen sich besonders effektiv durch die Zugabe von Koffein zyklisie- ren.
Üblicher Weise wird eine Disulfidbrücke in einem Peptid oder Protein zwischen zwei Cysteinen ausgebildet. Jedoch kann erfindungsgemäß die Disulfidbrücke auch zwischen anderen natürlichen und nicht natürlichen Aminosäuren ausgebildet werden, sofern diese entsprechende Gruppen aufweisen, die zur Ausbildung einer Disulfidbrücke (-S-S-) geeignet sind. Thiolysin, Homocystein und andere Cysteinderivate sind neben Cystein als Beispiele für geeignete Aminosäuren zu nennen. Der Begriff Disulfidbrücke ist jedoch nicht mit dem Begriff Cysteinbrücke gleichzusetzen, sondern umfasst die Ausbildung entsprechender -S-S- Bindungen zwischen irgendwelchen natürlichen oder nicht-natürlichen SH-haltigen Aminosäuren oder anderen SH-Gruppen haltige Verbindungen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich daher auch Disulfidbrücken bei anderen SH-Gruppen haltigen Verbindungen, insbesondere Polymeren, ausbilden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können selbstverständlich auch mehrere Disulfidbrücken ausgebildet werden.
Besonders vorteilhaft kann das vorliegende Verfahren zur Zyklisierung von EPO-mime- tischen Peptiden (siehe bspw. WO 96/40479) eingesetzt werden. Neuartige EPO mimetische Peptide sind in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschrieben, deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Peptide hiermit vollumfänglich zum Gegenstand dieser Anmeldung gemacht wird. Wie in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) ausführlich beschrieben ist, weisen diese neuartigen EPO mimetischen Peptide kein Prolin in der Position 10 des EPO mimetischen Konsensusmotivs auf (hinsichtlich der Nummerierung wird auf Johnson et al, 1997 verwiesen). Vielmehr ist das Prolin gegen eine nicht konservative Aminosäure, insbesondere eine basische Aminosäure wie insbesondere Lysin, ausgetauscht.
Die in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschriebenen Peptide weisen vorzugsweise folgenden Konsensus auf:
X6X7X8X9X10X11 Xi 2X13X14X15
wobei jede Aminosäure eine natürliche oder nicht natürliche Aminosäure darstellt und
X6 ist C, A, E, α-Amino-γ-Brombuttersäure oder Homocystein (Hoc);
X7 ist R, H, L, W or Y or S;
X8 ist M, F, I, Homoserinmethylether (Hsm) or Norisoleucin;
X9 ist G oder ein konservativer Austausch von G; X10 ist ein nicht-konservativer Austausch von Prolin; oder X9 und X10 sind durch eine einzige Aminosäure substituiert;
X11 kann eine beliebige Aminosäure sein;
X12 ist T oder A;
X13 ist W, 1-nal, 2-nal, A oder F; X14 ist D, E, I, L oder V;
X15 ist C, A, K, α-Amino-γ-Brombuttersäure oder Homocystein (Hoc) wobei entweder X6 oder X15 C oder Hoc sind.
EPO mimetische Peptide zeigen eine besonders gute Aktivität in zyklisierter Form. Übli- cherweise werden daher zwei Peptidmonomere (die Monomere entsprechen Bindungs- domänen) mit einem EPO mimetischen Konsensus jeweils zyklisiert und zu einem Dimer verbunden, da die Bindung an den EPO-Rezeptor in dieser Form am effektivsten ist. Die EPO mimetischen Monomere weisen durchschnittlich 10 bis 25 Aminosäuren auf. Vorzugsweise werden sie, wie in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschrieben, als kontinuierliche Dimere (bivalente Peptide) synthetisiert, um separate Dimerisierungsschritte zu vermeiden.
Im Stand der Technik sind verschiedene Methoden zur Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken zur Zyklisierung von EPO-mimetischen oder auch TPO-mimeti- sehen Peptiden bekannt. Kern der bekannten Lehren ist die Oxidation der Cystein- Reste (oder entsprechender anderer SH-Gruppen haltigen Aminosäuren) im EPO-mimetischen Konsensus. Als typisches Oxidationsmittel wurde bislang DMSO eingesetzt, was jedoch die eingangs geschilderten Nachteile aufweist. Die Zyklisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hat gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren einige entscheidende Vorteile. So werden bessere Ausbeuten sowie eine größere Reinheit des Produkts als mit dem im Stand der Technik bekannten Verfahren erzielt. Ein weiterer entscheidender Vorteil der erfindungsgemä- ßen Methode ist die einfache Trennbarkeit des erfindungsgemäßen Zyklisierungsrea- genz vom Reaktionsprodukt durch eine einfache HPLC. Gemäß einer weiteren Variante lässt sich die heterozyklische Verbindung (bspw. Koffein) durch Flüssig-Flüssig-Extrak- tion abtrennen. So lässt sich z.B. Koffein durch wiederholte Extraktion mit Dichlor- methan von einer wässrigen Peptidlösung abtrennen. Bei der Zyklisierung längerer Peptide ist auch die Anwendung von Grössenausschlusschromatographie (size exclu- sion chromatography, SEC) möglich. Die Aufreinigung ist daher erheblich vereinfacht.
Je nach SH-Gruppen haltiger Substanz bzw. Peptid und eingesetzten Reaktionsbedingungen kann die Reaktionszeit auf unter acht Stunden gesenkt werden (bspw. durch Absenkung des pH-Werts; Wahl eines zusätzlichen Oxidationsmittels). Üblicherweise liegt die Reaktionszeit < = vierundzwanzig Stunden, vorzugsweise unter zwanzig Stunden, besonders bevorzugt unter fünfzehn Stunden und ganz besonders bevorzugt zwischen fünf und zehn Stunden.
Neben den erwähnten EPO mimetischen Peptiden wurden jedoch auch andere Peptide erfolgreich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisiert. So unter anderem an dem von Oxytocin abgeleitetem Peptid, welches im Gegensatz zu Oxytocin eine Carbonsäure am C-Term anstelle eines Amides besitzt:
H-CYIQNCPLG-OH das ebenfalls durch Ausbildung einer intramolekularen Cysteinbrücke zyklisiert vorliegt.
Wie erwähnt, wird die intramolekulare Disulfidbrücke vorzugsweise zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet. Diese können natürlich oder nichtnatürlich sein, einzige Voraus- setzung ist die Fähigkeit zur Ausbildung einer Disulfidbrücke durch Reaktion der SH- Gruppe. Cystein ist wohl die bekannteste Disulfidbrücken ausbildende Aminosäure, die auch in der Natur überwiegend zur Ausbildung von Disulfidbrücken eingesetzt wird. Disulfidbrücken treten in der Natur insbesondere bei der Ausbildung intra- und intermolekularer Disulfidbrücken auf. So bewirken sie bspw. den Zusammenhalt zwischen den einzelnen Polypeptidketten von Proteinen (bspw. Insulin) in Form von intermolekularen Disulfidbrücken und bewirken innerhalb eines Proteins durch Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken regelmäßig eine Stabilisierung der Konformation.
Das Keratin der Wolle und des Haares enthält bspw. über 10% Cystein, weswegen dort auch viele Disulfidbrücken vorliegen. Werden diese Disulfidbrücken aufgebrochen (bspw. durch Laugen, Licht, Erwärmung etc.), nimmt die Reißfestigkeit der Fasern stark ab. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher auch dazu eingesetzt werden, um Disulfidbrücken in Fasern (Natur- und Synthetikfasem) auszubilden. Gleiches gilt für die Behandlung von Haaren, bei denen Disulfidbrücken ebenfalls eine große Bedeutung für die Strukturfestigkeit haben. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich daher auch zur Ausbildung von Disulfidbrücken in Haaren einsetzen, wodurch auch ein kosmetischer Anwendungsbereich eröffnet wird (bspw. Shampoos, Reagenzien zur Ausbildung von Dauerwellen etc.). So lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise als Mittel zur Schließung der Disulfidbrücken im Rahmen einer Dauerwellenbehandlung einsetzen. Hierzu ist es besonders vorteilhaft, wenn zusätzlich zu der oben näher charakterisierten Substanz zur Förderung der Disulfidbrückenbildung ein Oxidationsmittel zugegeben wird. Es hat sich gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit dadurch deutlich beschleunigt werden kann und die Disulfidbrücken entsprechend schneller geschlossen werden. Dies hat zur Folge, dass bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Haaren, die Einwirkzeit und somit auch die Dauer der Behandlung für den Kunden in vorteilhafter Weise verkürzt wird. Ein besonders geeignetes Oxidationsmittel ist oxidiertes Glutathion (GSSG). Die dadurch erzielte Verbesserung der Schließung der Disulfidbrücken in quantitativer als auch zeitlicher Hinsicht, ist anschaulich in den experimentellen Beispielen beschrieben.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen in kosmetischen Zubereitungen. Mit diesen kosmetischen Zubereitungen können entsprechend die Ausbildung von Disulfidbrücken beispielsweise bei Haaren gefördert werden.
Die kosmetischen Zubereitungen können neben der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindung geeignete Lösungsmittel sowie in derartigen Formulierungen übliche Zusätze enthalten. Zu nennen sind beispielsweise Emulgatoren und Coemulgatoren, Tenside, Ölkörper, Konservierungsmittel, Parfümöle, kosmetische Pflege und Wirkstoffe wie AHA-Säuren, Fruchtsäuren, Ceramide, Phytantriol, Collagen, Vitamine und Pro-Vitamine, beispielsweise Vitamin A, E und C, Retinol, Bisabolol, Panthenol, natürliche und synthetische Lichtschutzmittel, Naturstoffe, Trübungsmittel, Mikropigmente wie Titanoxid oder Zinkoxid, Überfettungsmittel, Perlglanzwachse, Konsistenzgeber, Verdicker, Solubilisatoren, Komplexbildner, Fette, Wachse, Silikonverbindungen, Hydrotrope, Farbstoffe, Stabilisatoren, pH-Wert-Regulatoren, Reflektoren, Proteine und Proteinhydrolysate, Eiweißhydrolisate, Salze, Gelbildner, Konsistenzgeber, Silikone, Feuchthaltemittel, Rückfetter und weitere übliche Additive. Des Weiteren können zur Einstellung der jeweils gewünschten Eigenschaften Polymere enthalten sein. Zum Schutz der Haare vor Beeinträchtigung durch UV-Strahlung können in den kosmetischen Zubereitungen auch UV-Lichtschutzmittel enthalten sein.
Haarkosmetische Zubereitungen umfassen insbesondere Stylingmittel und/oder Konditioniermittel in haarkosmetischen Zubereitungen wie Haarkuren, Haarschäume,
Haargele, Haarsprays, Haarlotionen, Haarspülungen, Haarshampoos, Haaremulsionen,
Egalisierungsmittel für Dauerwellen, Haarfärbe- und Bleichmittel, Festigerlotions oder ähnliche Produkte. Je nach Anwendungsgebiet können die haarkosmetischen
Zubereitungen als (Erosol-) Spray, (Erosol-) Schaum, Gel, Gelspray, Creme, Lotion, Milch oder Wachs appliziert werden.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Mittel um ein Produkt für das Haar, das unter den Haarwaschmitteln und Produkten für das Haar ausgewählt ist, die ausgespült oder nicht ausgespült werden und vor oder nach einer Haarwäsche, Färbung, Entfärbung, Dauerwelle oder Entkräuselung aufgetragen werden.
Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Behandlung von Haaren zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Haare mit dem kosmetischen Mittel, enthaltend wenigstens eine der zuvor näher erläuterten heterozyklischen Verbindung in Kontakt gebracht werden und ggf. mit Wasser gespült wird. Die heterozyklische Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus den oben eingehend erläuterten Verbindungen und Verbindungsklassen.
Ferner kann das Verfahren wie dargelegt auch zur Ausbildung von Disulfidbrücken von synthetischen Substanzen eingesetzt werden, die lediglich entsprechende SH-Gruppen tragende funktionelle Gruppe aufweisen, aber bspw. nicht aus Aminosäuren aufgebaut sind (jedoch bspw. aus einem organischen Polymer).
Gemäß einer vorteilhaften Weiterentwicklung wird die Abtrennung der die Ausbildung von Disulfidbrücken fördernden Substanz erheblich erleichtert. Gemäß dieser Idee wird ein Trägerstoff mit der Disulfidbrücken fördernden Substanz beladen. Der Trägerstoff kann bspw. ein (hydrophiles) Harz sein. Die Bindung der Substanz an den Trägerstoff hat zur Folge, dass die Abtrennung der geträgerten Substanz bspw. durch einfaches
Abfiltrieren möglich ist. Daher kann es vorteilhaft sein, in dem obigen Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken Koffein bzw. Koffeinähnliche Substanzen (siehe obige
Formeln) einzusetzen, die an einen Trägerstoff gebunden sind, um die Abtrennung zu erleichtern.
Um die Anbindung der Substanz an den Trägerstoff zu ermöglichen, sind funktionelle Gruppen an der Substanz hilfreich. Daher können auch Derivate der die Disulfidbrücken ausbildenden Substanz eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Koffein-Derivate sind:
Theophyllin-8-Buttersäure
und
Theophyllin-7-Essigsäure
Beide Derivate fördern die Ausbildung von Disulfidbrücken und damit auch die Zyklisie- rung von Peptiden in Lösung. Bindet man diese Substanzen über ihre funktionelle Gruppe kovalent an einen geeigneten Trägerstoff, so erhält man ein immobilisiertes Reagenz, das in der Lage ist, das Schließen von Disulfidbrücken zu beschleunigen. Nach der Reaktion kann das Reagenz durch einfaches Abfiltrieren von der Reaktionslösung entfernt werden. Wie anhand dieser Verbindungen deutlich wird, ist es erfindungsgemäß auch möglich, an die verbleibenden Positionen am heterozyklischen Ring auch unabhängig von den Resten R1' bis R3' Reste, wie hier im Falle von 8-(3-Carbo- xypropyl)-1 ,3-dimethylxanthin bspw. eine funktionelle Gruppe als R5' zur Kopplung an die Trägersubstanz, anzuhängen.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen zur Ausbildung von Disulfidbrücken, insbesondere von intra- oder intermolekularen Disulfidbrücken in Peptiden und Proteinen.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Substanzen sind besonders geeignet zur Zykli- sierung von Peptiden, insbesondere EPO mimetischen Peptiden, durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken. Besonders bevorzugte Beispiele sind N-Methyl-2- Pyridon, 2,6-Dihydroxy-pyridin-Hydrochlorid, Uracil-6-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6- methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6-hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6-Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6- pyridazindion, 7-Hydroxy-5-methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin, Barbitursäure, Alloxan- Monohydrat und Violursäure, Uracil, 1-Methyl-Uracil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8- Buttersäure, 3-lsobutyl-1-Methylxanthin, 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on, (-)-Riboflavin, Lumazin, Alloxazin, Minoxidil (= 6-(1-Piperidinyl)-2,4-pyrimidindiamin-3-oxid) und Aminexil (= 2,4-Diaminopyrimidin-3-oxid).
Diese Substanzen lassen sich erfindungsgemäß besonders gut zur Ausbildung von Disulfidbrücken einsetzten. Besonders bevorzugt sind:
N-Methyl-2-pyridon, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat, Violursäure, 4,6-Dihydroxy- pyrimidin, Uracil-6-carbonsäure, Minoxidil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, 3- lsobutyl-1-methylxanthin, Koffein, Isokoffein, Lumazin, Alloxazin.
Solche Disulfidbrücken werden zwischen SH-haltigen Gruppen ausgebildet. Insbesondere natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, die freie SH-Gruppen aufweisen, sind geeignete Disulfidbrückenbildner.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern, können die Substanzen der obigen Formel bspw. zur Behandlung von SH-Gruppen haltigen Sub- stanzen und Materialien eingesetzt werden, um die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern. So lassen sich die Substanzen bspw. zur Behandlung von Haaren oder Fasern (Natur- und Synthetikfasem) einsetzten. Dies trifft insbesondere auf cysteinhaltige Fasern zu. Die erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Verbindungen können bspw. auch in flüssigen Formulierungen (bspw. in Form von Spülungen oder Shampoos oder anderen Mitteln zur Behandlung von Haaren wie bspw. Dauerwellenreagenzien) zum Einsatz kommen. Entsprechende Zusammensetzungen werden daher ebenfalls von der Erfindung umfasst.
Augrund der katalytischen Wirkung der erfindungsgemäß charakterisierten heterozyklischen Verbindungen auf die Ausbildung von Disulfidbrücken können diese bspw. auch zur Katalyse bei der Ausbildung von inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken zur Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken eingesetzt werden. Sie können daher zur Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen synthetischen oder natürlichen oder modifizierten natürlichen Molekülen dienen. Sie können daher bei der Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken für die Wirkstoffsuche Anwendung finden. Bei dynamischen kombinatorischen Bibliotheken werden die einzelnen Einheiten oftmals über Disulfidbrücken zu Makromolekülen vernetzt (siehe Fig. 15). Einzelheiten zu den Bibliotheken sind bspw. in "Dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides in water. S. Otto, R. L. E. Furlan and J. K. M. Sanders, J. Amer. Chem. Soc, 2000, 122, 12063-12064"; „Selection and amplification of hosts from dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides. S. Otto, R. L. E. Furlan and J. K. M. Sanders, Science, 2002, 297, 590-593"; "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries. Ramström, Lehn. Nat Rev Drug Discov. 2002" und WO01/64605 beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren soll nachfolgend anhand einiger Beispiele verdeut- licht werden. Als Beispiele für die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisierbaren Peptide wurden EPO mimetische Peptide und Oxytocin gewählt.
Fig. 1
Gezeigt ist der Reaktionsverlauf der Zyklisierung eines EPO-mimetischen Peptids der folgenden Sequenz
GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am (BB57)
(0,7 mg/ml) zu dem entsprechenden zyklisierten Produkt in Anwesenheit von Koffein (0,3 mg/ml) mit Luft in Wasser bei Raumtemperatur. Wie die Kurve deutlich zeigt, nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit im Laufe der Reaktion zu, was einen autokatalytischen Mechanismus der Reaktion nahe legt. Die Abkürzung Am steht allgemein für eine Amidierung.
Fig. 2 Gezeigt ist die Zyklisierung desselben Peptids wie in Fig. 1 (0,7 mg/ml) zu seiner zyklisierten Form in Abwesenheit von Koffein. Wie deutlich erkennbar ist, ist die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich herabgesetzt.
Im Falle von EPO-mimetischen Peptiden hat sich eine optimale Konzentration von Koffein in einem Bereich von 0,075 bis 0,15 mg/ml ergeben. Der Umsatz ist bereits nach zehn Stunden quantitativ.
Fig. 3
Dargestellt ist die Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Umsetzung des in Fig. 1 ge- zeigten EPO-mimetischen Peptids von der Koffeinkonzentration. Wie dargestellt, sind sehr gute Ergebnisse in einem Konzentrationsbereich von 0,03 mg/ml bis 0,3 mg/ml erzielbar. Die optimalen Werte liegen in einem Bereich von 0,06 mg/ml bzw. 0.075 und 0,15 mg/ml.
Fig. 4 Dargestellt ist die Abhängigkeit der Zyklisierungsgeschwindigkeit vom pH-Wert. Wie deutlich erkennbar ist, ist der autokatalytische Verlauf der Reaktion nicht auf eine Änderung des pH-Werts zurückzuführen, da dieser Effekt auch in den dargestellten gepufferten Lösungen (Phosphatpuffer, pH 6 bis 9) auftritt. Jedoch hat sich gezeigt, dass die Ausbeute an zyklisierten Peptid bei höheren pH-Werten sinkt. Ferner hat sich überraschender gezeigt, dass die Reaktion schneller verläuft, je niedriger der pH-Wert der Lösung ist. Daher ist ein niedrigerer pH-Wert von unter 7 und vorzugsweise < = 6,5 bevorzugt.
Fig. 5
Dargestellt ist der Einfluss des milden Oxidationsmittels Glutathion (oxidierte Form) auf die Reaktionsgeschwindigkeit. Hier fand die Umsetzung des in Fig. 1 dargestellten Peptids (0,7 mg/ml H2O) in Anwesenheit von 0,1 mg/ml (0,5 Äquivalente) Glutathion, oxidierte Form (GSSG) und Koffein (0,3 mg/ml) statt. Innerhalb von fünf bis sechs Stun- den war die Reaktion bereits vollendet. Die Umsetzung des Peptids nur mit GSSG (in Abwesenheit von Koffein) erfolgt nur langsam. Ferner hat sich gezeigt, dass unerwünschte Nebenprodukte entstehen (s. Abb. 6).
Fig. 6 Dargestellt sind Chromatogramme, die jeweils nach einer Stunde Reaktion aufgezeichnet wurden und die die Umsetzung des eingesetzten EPO-mimetischen Peptids mit 0,5 äquivalenten GSSG belegen.
Fig. 7 Dargestellt ist eine tabellarische Übersicht, die das erfindungsgemäße Verfahren mit den im Stand der Technik bekannten Methoden vergleicht. Die getesteten Peptide wiesen folgende Sequenz auf:
EMP1 : Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-Am APG1 : Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am APG2: Ac-GGTYSCHFGKLT-NaI-VCKKQRG-Am
Die in wϊro-Experimente zeigten eine vergleichbare Aktivität der Peptide, die nach den verschiedenen Methoden zyklisiert wurden. Die erfindungsgemäße Methode zeichnet sich jedoch durch bessere Ausbeuten sowie Reinheiten im Verhältnis zu den anderen getesteten Zyklisierungsmethoden aus, wie Fig. 7 anschaulich belegt. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass das eingesetzte Zyklisie- rungsreagenz auf einfache Weise durch HPLC abgetrennt werden kann. Weitere Beispiele von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisierten EPO-mi- metischen Peptiden sind nachfolgend aufgeführt:
Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLT-Nal1 -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaH -VCKKQRG-Am (APG3) AC-C(MOb)-GGTYSCHFGKLT-NaII-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaII-VCKKQRG-Am (APG4)
Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am (APG5) (Sama)-GGTYSCHFGKLT-Nai -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQRG-Am (APG6)
Fig. 8 Gezeigt ist die Zyklisierung von dimeren EPO mimetischen Peptiden. Die Zyklisierung von di- oder multimeren Peptiden erfolgt vorzugsweise in mehreren Schritten. Fig. 8 zeigt das Syntheseschema anhand eines bivalenten (dimeren) EPO-mimetischen Peptids, das in 2 Schritten durch Ausbildung von zwei intramolekularen Disulfidbrücken zyklisiert wird. Nach diesem Verfahren wird die erste Disulfidbrücke nach dem erfin- dungsgemäßen Verfahren ausgebildet. Die zweite intramolekulare Disulfidbrücke wurde unter Einsatz einer optimierten lod-Oxidation durchgeführt. Zur Kupplung der Peptide an einen polymeren Carrier wurden ferner teilweise weitere Cystein-Reste ins Molekül eingebracht. Dieses Cystein wurde durch geeignete Schutzgruppen tBu or Mob) geschützt.
Die erste erfindungsgemäße Zyklisierung unter Einsatz von Koffein wird vorzugsweise bei pH 6 durchgeführt, während die zweite Zyklisierung gemäß dem gezeigten Beispiel in 80% Essigsäure erfolgte. Die Ausbeute der Synthese lag typischer Weise zwischen 60 und 90%.
Fig. 9
Einige der EPO mimetischen Peptide lassen sich nur sehr schwer zyklisieren. Ein Beispiel dafür ist das folgende Peptid:
Ac -GGTYSCHFG-Har-LT- 1 -NaI- VCK- Aad-Q-Aad-G-NH2
Har=Homoarginin
Aad = 2-Aminoadipinsäure, "Homoglutaminsäure" NaI: Naphtylalanin
Bei dieser Sequenz hat sich gezeigt, dass die Erhöhung der Konzentration an Zyklisie- rungsreagenz von Vorteil ist. So war die Zyklisierung mit 10mg/ml Koffein innerhalb von 24h erfolgreich. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Die Ausbeute lag nach ca. 21 h in Lösung bereits bei > 90%. Fig. 10 bis 12
Neben EPO mimetischen Peptiden wurde auch ein von Oxytocin abgeleitetes, reduziertes Peptid mit Koffein bzw. der Koffeinähnlichen Substanz (siehe obige Formel) zyklisiert.
Bei der Reaktionsdurchführung wurde Oxytocin, reduziert (OyxR), Rohprodukt, in Wasser (bzw. H2O/ACN/TFA) gelöst und mit verschiedenen Konzentrationen von Koffein (und evtl. GSSG) an der Luft stehen gelassen. Der Reaktionsansatz wurde per HPLC in regelmäßigen Abständen vermessen, um die Gehalte an OxyR und dem Produkt Oxytocin (Oxy) zu bestimmen.
Die in Fig. 10 bis 12 gezeigten Tabellen und die dazugehörige Graphik geben eine zusammenfassende Übersicht über die Ergebnisse.
Erkennbar ist, dass die Produktausbeute mit der Peptidkonzentration korreliert. Geringere Peptidmengen führen bei Oxytocin zu besseren Ergebnissen.
Die Reaktionszeit bis zum vollständigen Umsatz von OxyR korreliert mit der Konzentra- tion an Koffein in der Reaktionslösung. Bis zu einer Konzentration von 0.5mg/ml Koffein gilt je mehr Koffein, desto schneller läuft die Oxidation ab. Die Peptidkonzentration hat nur einen untergeordneten Einfluss auf die Dauer der Reaktion.
GSSG scheint keinen Einfluss auf Geschwindigkeit oder Ausbeute zu haben.
OxyR, HPLC gereinigt, cyclisiert schon spontan „recht" schnell. Die Reaktionsgeschwindigkeit lässt sich mit Koffein jedoch nochmals deutlich verkürzen. Geringe Mengen ACN/TFA haben geringen Einfluss auf die Ausbeute, die Reaktionszeit wird etwas verlängert.
Fig. 13 und 14
Gezeigt sind die Ergebnisse der Zyklisierung des Peptids BB57 mit der Substanz Minoxidil:
Dazu wurden 0,7mg BB57 und 0,3mg Minoxidil (6-(1-Piperidinyl)-2,4-pyrimidindiamin 3- oxid, Minox) in 1ml destilliertem Wasser gelöst und an der Luft stehen gelassen. Der Umsatz von BB57 zu oxidiertem BB57C wurde mit HPLC (UV-Detektion bei 216nm) beobachtet. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 gezeigt.
Wie Fig. 13 zeigt, ist die Oxidation in Anwesenheit von Minoxidil nach ca. 29h abge- schlössen (bei einer Vergleichsmessung mit Koffein sind es ca. 24h). Minoxidil hat als weiterer Vertreter der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindungen daher ebenfalls eine positive Wirkung auf die Ausbildung von Disulfidbrücken. Die Ausbeute in Lösung der Minoxidil-katalysierten Reaktion liegt über 95%. Daß es sich bei der Reaktion um eine katalytisch ablaufende Reaktion handelt, zeigt sich dadurch, daß die Konzentration von Minoxidil bei der Reaktion praktisch nicht abnimmt (Abnahme < 2% bei 4.4 eq Minoxidil bezogen auf BB57, siehe Fig. 14).
Fig. 15
Gezeigt sind mögliche Verknüpfungsstrategien über Disulfidbrücken zur Erzeugung vemetzter Makromoleküle. Derartige Bausteine finden oft in dynamischen kombinatorischen Bibliotheken Anwendung.
Fig. 16
Ferner wurden Versuche durchgeführt, um zu demonstrieren, dass Haare, welche zuvor im Sinne einer Dauerwellenbehandlung reduziert wurden, sich mit einer Kombination der erfindungsgemäßen Substanz (hier Koffein) und einem zusätzlichen
Oxidationsmittel (hier oxidiertes Glutathion-GSSG) in Anwesenheit von Luft beschleunigt oxidativ schließen. Damit lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren in vorteilhafter Weise auch im kosmetischen Bereich und insbesondere im Friseurbereich zur Behandlung von Haaren anwenden.
Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt:
Je 5-6 mg Haare werden mit 400μl einer 10%gen Lösung einer Ammoniumthioglykolat- haltigen „Well-Lotion" (Produkt „Poly Lock - starke Dauerwelle", Schwarzkopf & Henkel,
Germany) 0,5h bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wird entfernt und das Haar anschließend 6mal mit je 400μl H2O gewaschen. Je eine dieser so behandelten
Haarproben wird a) in H2O, bzw. einer wässrigen Lösung von b) 10mg/ml Koffein, c)
5mg/ml GSSG in H2O und d) 10mg/ml Koffein und 5mg/ml GSSG bei Raumtemperatur über 3 Tage behandelt.
Zur Bestimmung der freien, noch verbliebenen Thiolgruppen werden die Haare nach Abtrennung der Reaktionslösung mit Ellmansreagenz (5,5'-Dithiobis(2- nitrobenzoesäure), DTNB) umgesetzt. Als zusätzliche Referenzproben dienen unbehandeltes Haar sowie reduziertes Haar, welches ansonsten keiner weiteren Behandlung unterworfen wurde. Die Haarproben werden dazu mit je 200μl eines 10OmM Phosphatpuffers, pH 8.0 und 1mM EDTA, und 300 μl einer 1 mM DTNB-Lösung in demselben EDTA-haltigen Puffer gegeben. Die Lösung wird nach einigen Minuten in einem UV-Vis-Spektrometer vermessen.
Die UV-Vis-Spektren der Proben zeigen, dass die Reduktion der Haare durch die Behandlung mit der Ammoniumthiolglykolathaltigen „Well-Lotion" erfolgreich war (siehe Abb. 29, Kurven e und f, die einmal unbehandelte und einmal reduzierte Haare zeigen). Dies kann man daran erkennen, dass die Bande bei 412nm - ein Maß für die Zahl freier Thiolgruppen - am größten ist. Eine Behandlung in Anwesenheit von Luft mit a) H2O, b), mit einer koffeinhaltigen Lösung, c) der GSSG-haltigen Lösung führt jeweils nur zu einer teilweisen Oxidation der Thiolgruppen. Jedoch lässt sich bereits hier erkennen, dass das Koffein einen positiven Einfluss auf die Schließung der Disulfidbrücken hat. Die Kombination d) aus Koffein und dem Oxidationsmittel GSSG führte jedoch zu einer nahezu quantitativen Oxidation der Thiolgruppen bei Haaren. Dieser Versuch belegt daher, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Schließung von Disulfidbrücken auch erfolgreich an Haaren eingesetzt werden kann.
Fig. 17 bis 39
Gezeigt sind die Ergebnisse der Zyklisierung des Referenzpeptids BB57 mit verschiedenen Substanzen, die erfindungsgemäß die Ausbildung von Disulfidbrücken fördern können.
Die Versuche wurden wie zuvor dargelegt durchgeführt (siehe oben). Die getestete Substanz sowie die getesteten Mengen sind jeweils angegeben.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem flüssigen Medium durchgeführt wird, das wenigstens eine Verbindung enthält, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese
Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum
Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;
(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
in welcher der Substituent A für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung gemäß Alternative (a) folgende Grundstruktur aufweist
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;
- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei Stickstoffatome aufweist;
- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen;
- R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden
Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, R5 zusammen mit R6 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt oder R4 und/oder R5 fehlen;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder
Arylrest steht, oder R6 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R6 fehlt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgende Substruktur enthält
wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere
Doppelbindungen aufweisen kann; wobei
- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich
Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen;
- R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt;
- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Uracilderivat der folgenden allgemeinen Formel darstellt:
wobei R4 und R6 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen, vorzugsweise für Wasserstoff oder einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C10 Alkylrest, besonders bevorzugt für einen C1 bis C4 Alkylrest oder Wasserstoff stehen.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Verbindung um Purinderivate handelt, deren Grundgerüst der folgenden allgemeinen Formel entspricht
in der der Fünfring ungesättigt ist und entsprechend Doppelbindungen aufweist und in welcher die Substituenten
R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci- bis CiO-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substitu- ierten C6- oder CiO-Arylrest; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest stehen;
- R7, R8 und R9, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl oder eine funktionelle Gruppe stehen; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C10-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -{CH2)n-COOX mit n = 1 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C8-Alkyl; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 6 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C6-Alkyl; insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 4 und X gleich Wasserstoff oder d- bis C3-Alkyl, stehen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R2 und R3 zusammen einen Sechsring bilden, der optional wenigstens ein Heteroatom aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgende Grundstruktur aufweist:
wobei die Ringe je nach Wahl der Substituenten ungesättigt sein und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen tragen können,
R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;
R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten C1- bis C10-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10- Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder einen ge- gebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest stehen;
R5 für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) steht oder R5 fehlt; R10 und R13, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder R10 und/oder R13 fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten d- bis CiO-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder Cio-Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten (V bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituierten C1 bis C6-
Alkylrest stehen;
R11 und R12, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie eine
Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R11 und R12 bilden zusammen einen fünf oder sechsgliedrigen Ring aus, der optional weitere Heteroatome sowie Substituenten tragen kann.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung gemäß Alternative (b) einen Substituenten A aufweist, der
- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituiertes Cr bis C10-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro,
Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto;
bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis Ce-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie
Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen,
Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3- Alkylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert ist;
steht.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorherigen Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Verbindung zur Förderung der Ausbildung der
Disulfidbrücken folgende Struktur aufweist
wobei Rv, R2', R3' gleich oder verschieden sind und wenigstens einer der Reste Rr, R2', R3' eine Alkylgruppe ist.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Rv, R2', R3' gleich oder verschieden sind und entweder Wasserstoff oder eine Ci bis C5-Alkylgruppe, insbesondere eine Ci bis C3 Alkylgruppe, besonders bevorzugt eine Methylgruppe darstellen.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-Methyl-2-Pyridon, 2,6-Dihydroxy-pyridin-Hydrochlorid, Uracil-6- carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6-hydroxypyrimidin,
2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6- Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion, 7-Hydroxy-5- methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat und Violursäure, Uracil, 1-Methyl-Uracil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8-
Buttersäure, 3-lsobutyl-1-Methylxanthin, 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on, (-)- Riboflavin, Lumazin, Alloxazin, Minoxidil und Aminexil.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine intramolekulare Disulfidbrücke in aminosäurehaltigen Substanzen, insbesondere in Peptiden und Proteinen, ausgebildet wird, wobei die Reaktion in einem wässrigen Medium durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine intramolekulare Disulfidbrücken zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet wird, die eine SH-Gruppe aufweisen, vorzugsweise zwischen zwei Cysteinresten.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsgemisch ein Oxidationsmittel, vorzugsweise Glutathion in oxidierter Form, zugegeben wird.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide eine Länge zwischen 5 und 100, 5 und 50 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 10 und 40, besonders bevorzugt zwischen 15 und 25 Aminosäuren, aufweisen.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz an einen Trägerstoff gebunden vorliegt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz über funktionelle Gruppen an den Trägerstoff gebunden wird.
18. Verwendung einer heterozyklischen Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Ausbildung von Disulfidbrücken.
19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die heterozyklische Verbindung zur Zyklisierung von Peptiden und/oder Proteinen eingesetzt wird, wobei die Peptide vorzugsweise eine Länge zwischen 5 und 250, 5 und 100, 5 und 50, vorzugsweise 10 bis 40, besonders bevorzugt zwischen 15 und 25 Aminosäuren, aufweisen.
20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz zur Zyklisierung von Zytokin-mimetischen Peptiden, insbesondere EPO-mimetischen oder TPO-mimetischen Peptiden, eingesetzt wird.
21. Verwendung nach einem oder mehren der Ansprüche 18 bis 20 zur Ausbildung einer intramolekularen Disulfidbrücke zwischen wenigstens zwei SH-Gruppen tragenden Aminosäuren.
22. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 18 bis 21 zur Behandlung von SH-Gruppen tragenden Substanzen und Produkten zur Ausbildung von Disulfidbrücken.
23. Verwendung nach Anspruch 22 zur Behandlung von Haaren und Fasern, insbe- sondere cysteinhaltigen Fasern.
24. Zusammensetzung enthaltend eine heterozyklische Verbindung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 zur Ausbildung und/oder Förderung von Disulfidbrücken.
25. Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 24 zur Behandlung von Haaren und/oder Fasern.
26. Verwendung einer heterozyklischen Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Katalyse bei der Ausbildung von inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken zur Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken.
27. Kosmetisches Mittel zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken, dadurch gekennzeichnet, dass es eine heterozyklische Verbindung enthält, die mindestens zwei Stickstoffatome aufweist, gemäß wenigstens einem der
Ansprüche 1 bis 12.
28. Verfahren zur Behandlung von Haaren, dadurch gekennzeichnet, dass die Haare mit dem kosmetischen Mittel gemäß Anspruch 28 in Kontakt gebracht werden und ggf. mit Wasser gespült wird.
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