KR20130099126A - 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 또는 이러한 펩타이드와의 융합 단백질을 포함하는, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 의약 조성물은, 특히 관절염이나 류마티즘의 치료에 유효하다.

Description

이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드{PEPTIDE CAPABLE OF BINDING TO IMMUNOGLOBULIN}

본 발명은 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 또는 이러한 펩타이드와의 융합 단백질을 포함하는, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물 등에 관한 것이다.

C1q는 보체 단백질의 하나이며, 보체 활성화 경로에서 작용한다는 것이 알려져 있다. 예컨대, 고전 경로의 활성화는, C1q가 이뮤노글로불린 분자의 Fc 부분에 결합함으로써 야기된다고 되어 있다.

C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환에는 많은 종류가 있고, 전신성 에리테마토데스(SLE), 사구체 신장염, 혈관염, 관절염 등의 면역 복합체 병이나 류마티즘이 전형적인 예로서 들 수 있다. 관절 류마티즘(RA) 환자의 피 중에는 C1q가 많이 존재하여, 장래 관절 파괴에 걸린다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 이러한 병태에는 전술한 C1q에 의한 활성화가 관여하고 있다고 생각되고 있고, C1q와 이뮤노글로불린 분자의 결합의 저해제의 개발이 요망되고 있다.

현재, 관절 류마티즘의 치료약으로서 메토트렉세이트(methotrexate) 및 레플루마이드(leflumide)가 많이 사용되고 있지만, 이들의 약제는 부작용이 있어, 대량으로 투여할 수 없다.

Ochi T et al., Arthritis Rheum. 1988 Jan; 31(1): 37-43

본 발명의 해결 과제는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 및 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 또는 이러한 펩타이드와의 융합 단백질을 포함하는, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 유효하고 안전한 의약 조성물 등을 제공하는 것이다.

본 발명자는, C1q 유래의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드가, 관절 류마티즘 등의 C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환에 있어서 치료 및 예방 효과를 나타낸다는 것을 발견했지만(국제공개 제2009/025300호 팜플렛 및 국제공개 제2010/084851호 팜플렛 참조), 추가로 펩타이드의 수용성을 높이기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 상기 펩타이드 중의 특정 위치의 아미노산을 치환함으로써, 펩타이드의 수용성이 개선되고, 더구나 이뮤노글로불린 결합능 등과 같은 생물학적 활성이 유의미하게 저하되지 않는다는 것을 발견해내어, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하의 것을 제공하는 것이다:

(1) 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드로서,

Pro-Gly-Leu-X₄-X₅-Phe (I)

(여기서, X₄ 및 X₅는 동시에 Tyr가 아닌 아미노산이다)

로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 펩타이드;

(2) (1)에 있어서, X₄ 및 X₅ 중 한쪽 또는 양쪽이 친수성 아미노산인 펩타이드;

(3) (1)에 있어서, X₄ 및 X₅ 중 양쪽이 친수성 아미노산인 펩타이드;

(4) (3)에 있어서, X₄ 및 X₅가 독립적으로 Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser 및 Thr로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인 펩타이드;

(5) (1)에 있어서, 배열 번호 9 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드;

(6) (1)에 있어서, 배열 번호 12의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드;

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 식 (I)의 아미노산 배열 중의 1개 또는 복수의 아미노산(Gly를 제외한다)이 대응되는 D-아미노산으로 치환되어 있는 펩타이드;

(8) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 식 (I)의 아미노산 배열 중의 모든 아미노산(Gly를 제외한다)이 대응되는 D-아미노산으로 치환되어 있는 펩타이드;

(9) (8)에 있어서, D-Pro-Gly-D-Leu-D-Glu-D-Lys-D-Phe인 아미노산 배열을 갖는 펩타이드;

(10) 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산으로서, (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 펩타이드를 인코딩하는 핵산;

(11) (10)에 있어서, (5)의 펩타이드를 인코딩하는 핵산;

(12) (10)에 있어서, (6)의 펩타이드를 인코딩하는 핵산;

(13) (10) 내지 (12) 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 벡터;

(14) (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 펩타이드가, 목적하는 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가되어 있는 융합 단백질;

(15) (7) 내지 (9) 중 어느 하나의 펩타이드가, 목적하는 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가되어 있는 융합 단백질;

(16) (14)의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산;

(17) (16)의 핵산을 포함하는 벡터;

(18) (10) 내지 (12) 중 어느 하나의 핵산, (16)의 핵산, 또는 (13) 또는 (17)의 벡터를 포함하는 세포;

(19) 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드의 제조 방법으로서,

(a) (13)의 벡터를 이용하여 세포를 형질 전환하는 공정, 및

(b) 상기 세포를 배양하여, 펩타이드를 생산시키는 공정을 포함하는 방법;

(20) (19)의 방법에 의해 얻을 수 있는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드;

(21) 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드가, 목적하는 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가된 융합 단백질의 제조 방법으로서,

(a) (17)의 벡터를 이용하여 세포를 형질 전환하는 공정, 및

(b) 상기 세포를 배양하여, 융합 단백질을 생산시키는 공정을 포함하는 방법;

(22) (21)에 있어서, 융합 단백질로부터 목적 단백질을 취출(取出)하는 공정을 추가로 포함하는 방법;

(23) (21) 또는 (22)의 방법에 의해 얻을 수 있는 융합 단백질;

(24) (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 펩타이드, 또는 (14) 또는 (15)의 융합 단백질을 포함하는, 이뮤노글로불린을 결합시키기 위한 조성물;

(25) (24)에 있어서, 이뮤노글로불린의 존재 또는 양을 결정하기 위하거나, 또는 이뮤노글로불린을 단리하기 위한 것인 조성물;

(26) (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 펩타이드, 또는 (14) 또는 (15)의 융합 단백질을 고정화한, 이뮤노글로불린을 결합시키기 위한 수단;

(27) (26)에 있어서, 이뮤노글로불린의 존재 또는 양을 결정하기 위하거나, 또는 이뮤노글로불린을 단리하기 위한 것인 수단;

(28) 이뮤노글로불린을 결합시키는 방법으로서,

(a) (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 펩타이드, 또는 (14) 또는 (15)의 융합 단백질을 시료에 첨가하는 공정, 및

(b) 펩타이드 또는 융합 단백질과 이뮤노글로불린의 결합체를 조사하는 공정을 포함하는 방법;

(29) (28)의 방법에 이용하기 위한, (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 펩타이드 또는 (14) 또는 (15)의 융합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 키트;

(30) 표지되어 있는 (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 펩타이드 또는 (14) 또는 (15)의 융합 단백질;

(31) (30)의 표지되어 있는 펩타이드 또는 융합 단백질을 시료 중의 항체와 반응시키고, 이어서 항체와 결합된 상기 펩타이드 또는 융합 단백질을 검출하는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 항체의 검출 방법;

(32) (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 펩타이드, (14) 또는 (15)의 융합 단백질, (10) 내지 (12) 중 어느 하나의 핵산, (16)의 핵산, 또는 (13) 또는 (17)의 벡터를 유효 성분으로서 포함하는, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물;

(33) (32)에 있어서, 질환이 관절 류마티즘인 의약 조성물;

(34) (32)에 있어서, 질환이 전신성 에리테마토데스(SLE), 사구체 신장염, 혈관염, 관절염 등의 면역 복합체 병인 의약 조성물.

본 발명에 의하면, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 있어서 보다 유용한 의약 조성물 등의 제공이 가능하게 된다. 또한, 수용성이 개선된 본 발명의 펩타이드를 상기 의약 조성물에 이용함으로써 종래에 비하여 실질적인 투여량이 높아진 의약 조성물을 제공할 수도 있다.

도 1은, 펩타이드 R1 및 4 내지 6이 C1q와 이뮤노글로불린의 결합을 저해한다는 것을 나타낸다. 도면 중, NC는 펩타이드를 포함하지 않는 DMSO를, 알칼리 포스파타제(ALP) 표지 사람 이뮤노글로불린(IgG)을 포함하지 않는 반응액에 첨가한 샘플의 결과이며, PC는 펩타이드를 포함하지 않는 DMSO를, 알칼리 포스파타제(ALP) 표지 사람 이뮤노글로불린(IgG)을 포함하는 반응액에 첨가한 샘플의 결과이다.
도 2는, 펩타이드 SP1 내지 7이 C1q와 이뮤노글로불린의 결합을 저해한다는 것을 나타낸다. 도면 중, NC는 펩타이드를 포함하지 않는 DMSO를, 알칼리 포스파타제(ALP) 표지 사람 이뮤노글로불린(IgG)을 포함하지 않는 반응액에 첨가한 샘플의 결과이며, PC는 펩타이드를 포함하지 않는 DMSO를, 알칼리 포스파타제(ALP) 표지 사람 이뮤노글로불린(IgG)을 포함하는 반응액에 첨가한 샘플의 결과이다.
도 3은, 사람 RA 환자로부터 채취한 골막 세포를 TNF-α로 자극함으로써 유도되는 IL-1β, TNF-α, MMP-1 및 MMP-3의 생산이 본 발명의 펩타이드의 첨가에 의해서 각각 억제되었다는 것을 나타낸다. 도면 중, 대조는 펩타이드 미첨가된 샘플의 결과를 나타내고, SP3-100, SP3-10 및 SP3-1은 SP3의 펩타이드를 각각 100㎍, 10㎍ 및 1㎍ 첨가한 샘플의 결과를 나타내고, SP4-100, SP4-10 및 SP4-1은 SP4의 펩타이드를 각각 100㎍, 10㎍ 및 1㎍ 첨가한 샘플의 결과를 나타낸다.
도 4는, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 a의 관절염 억제 작용을 임상 스코어로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 a 10mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 5는, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 α의 관절염 억제 작용을 임상 스코어로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 α 10mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 6은, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 VII-1의 관절염 억제 작용을 임상 스코어로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 VII-1 10mg/kg 투여군, △는 피검 물질 VII-1 100mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 7은, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 VII-2의 관절염 억제 작용을 임상 스코어로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군, △는 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 8은, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 a의 관절염 억제 작용을 뒷다리 용적으로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 a 10mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 9는, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 α의 관절염 억제 작용을 뒷다리 용적으로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 α 10mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 10은, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 VII-1의 관절염 억제 작용을 뒷다리 용적으로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 VII-1 10mg/kg 투여군, △는 피검 물질 VII-1 100mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 11은, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 VII-2의 관절염 억제 작용을 뒷다리 용적으로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군, △는 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 12는, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 a의 관절염 억제 작용을 뒷다리 용적 증가율로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 a 10mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 13은, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 α의 관절염 억제 작용을 뒷다리 용적 증가율로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 α 10mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 14는, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 VII-1의 관절염 억제 작용을 뒷다리 용적 증가율로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 VII-1 10mg/kg 투여군, △는 피검 물질 VII-1 100mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 15는, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염 마우스를 이용한 피검 물질 VII-2의 관절염 억제 작용을 뒷다리 용적 증가율로 나타낸 그래프이다. ○는 대조군, ●는 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군, △는 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군, ■는 메토트렉세이트 0.15mg/kg 투여군을 나타낸다.
도 16a는, 아서스(Arthus) 반응에서의 피검 물질 VII-2의 복강 내 투여의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 16b는, 아서스 반응에서의 피검 물질 VII-2의 꼬리 정맥 내 투여의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 17은, 골막 세포와 B 세포가 공존하는 류마티즘 관절 모델계에서의 피검 물질 VII-2의 IgG 생산 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은, 하나의 태양에 있어서,

Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe (a)

로 표시되는 아미노산 배열(배열 번호 1)을 갖는 펩타이드와 거의 동등하거나 그 이상의 이뮤노글로불린 결합능 등의 생물학적 활성을 갖고, 또한 수용성이 개선된 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드의 생물학적 활성은 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의해 조사할 수 있다. 예컨대, 펩타이드를 이뮤노글로불린 존재 하에서 인큐베이팅하여, 결합량을 조사하여도 좋다. 본 발명의 펩타이드는 배열 번호 1의 아미노산 배열(a)에서, 1개 또는 복수(예컨대, 2, 3, 4 또는 5개)의 아미노산이 치환된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드에 있어서, 치환되는 아미노산은 어떠한 아미노산이어도 좋지만, 바람직하게는 상기 아미노산 배열(a)의 N 말단으로부터 4번째 및/또는 5번째의 아미노산이며, 더욱 바람직하게는 상기 배열(a)의 N 말단으로부터 4번째 및 5번째의 양쪽의 아미노산이다.

한편, 본 명세서에서, 아미노산을 명칭이 아니라, 3문자 표기 또는 1문자 표기로 나타내는 경우가 있지만, 3문자 표기 또는 1문자 표기는 당업자에 잘 알려져 있다.

본 발명의 펩타이드는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖고, 또한 양호한 수용성을 나타내는 한, 상기 아미노산 배열(a)의 어느 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어도 좋고, 예컨대, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 아스파라진산, 글루타민산, 아스파라진, 글루타민, 라이신, 아르지닌, 시스테인, 메싸이오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 히스티딘 또는 프롤린 등의 천연 단백질을 구성하고 있는 아미노산, 또는 β-알라닌, γ-아미노뷰티르산(GABA), 5-아미노레블린산, 5-아미노발레르산, 호모시스테인, 오르니틴, 5-하이드록시트립토판, 3,4-다이하이드록시페닐알라닌(도파), 트라이아이오도타이로닌, 타이록신, 호모라이신, 노류신, 크레아틴, 데스모신, 노발린 또는 아이오도타이로신 등의 천연 단백질을 구성하고 있지 않은 아미노산으로 치환되어도 좋다.

상기 아미노산 배열(a)에서 1개 또는 복수의 아미노산을 친수성 아미노산으로, 또는 펩타이드의 수용성을 높이는 아미노산 유도체 또는 수식(修飾)체 등으로 치환함으로써, 상기 아미노산 배열을 갖는 펩타이드의 수용성을 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 식 (a)의 아미노산 배열 중의 아미노산은 친수성 아미노산 또는 펩타이드의 수용성을 높이는 아미노산 유도체 또는 수식체 등으로 치환되어 있다. 친수성 아미노산의 예로서는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라진산(Asp), 글루타민산(Glu), 아스파라진(Asn), 글루타민(Gln), 라이신(Lys), 아르지닌(Arg) 또는 히스티딘(His)을 들 수 있지만, 이들의 아미노산으로 한정되지 않는다.

일반적으로, 펩타이드 의약에 있어서는, 소화관에서의 이(易)분해성을 고려하여, 정맥 주사나 피하 주사에 의한 투여 방법을 이용하는 경우가 많다. 그 때문에, 수용성이 낮은 펩타이드는 임상 적용이 어려워진다. 그러나, 경구 투여를 선택하여도, 펩타이드가 분해되기 쉽다고 하는 문제가 있다. 본 발명의 수용성이 개선된 펩타이드는 상기 결점이 해소되어, 정맥 주사나 피하 주사의 경우에 우수한 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명의 수용성이 개선된 펩타이드는 소재로서 취급하기 쉽다고 하는 이점을 갖고 있다.

바람직한 태양에 있어서, 본 발명은,

Pro-Gly-Leu-X₄-X₅-Phe (I)

(여기서, X₄ 및 X₅는 동시에 Tyr가 아닌 아미노산이다)

로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 펩타이드에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 펩타이드는, 상기 아미노산 배열(I) 중의 아미노산 잔기 X₄, X₅ 중 한쪽 또는 양쪽이 Tyr 이외의 아미노산 잔기인 아미노산 배열을 갖는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 상기 아미노산 배열(I) 중의 아미노산 잔기 X₄, X₅의 양쪽이 Tyr 이외의 아미노산 잔기인 아미노산 배열을 갖는 것이다. Tyr 이외의 아미노산 X₄, X₅로서는, 위에서 열거한 아미노산을 들 수 있지만, 바람직하게는 친수성 아미노산이며, 더욱 바람직하게는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라진산(Asp), 글루타민산(Glu), 아스파라진(Asn), 글루타민(Gln), 라이신(Lys), 아르지닌(Arg) 또는 히스티딘(His) 등의 친수성 아미노산이다. Tyr 이외의 아미노산 X₄, X₅로 바람직한 것으로서, 펩타이드의 수용성을 높이는 아미노산 유도체 또는 수식체이어도 좋다. X₄, X₅는 같은 종류의 아미노산이어도 좋고, 서로 다른 종류의 아미노산이어도 좋다. 어느 쪽의 아미노산 배열을 갖는 경우이어도, 본 발명의 펩타이드는 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 것이며, 또한 배열 번호 1의 아미노산 배열(a)을 갖는 펩타이드보다 높은 수용성을 갖는 것이다.

바람직한 본 발명의 펩타이드로서, 배열 번호 9 내지 15 중 어느 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 들 수 있다. 이들의 펩타이드도 이뮤노글로불린 결합능을 갖는다.

또한, 본 발명의 펩타이드는, 아미노산 배열(I) 중의 1개 또는 복수(예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 아미노산이, 대응되는 D-아미노산으로 추가로 치환되어 있는 아미노산 배열을 갖는 것이어도 좋다. 본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 식 (I)의 아미노산 배열 중의 모든 아미노산은, 대응되는 D-아미노산으로 치환되어도 좋다. 한편, 어느 쪽의 아미노산 배열을 갖는 경우이어도, 본 발명의 펩타이드는 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 것이다.

식 (I)의 아미노산 배열 중의 아미노산을 대응되는 D-아미노산으로 치환함으로써, 본 발명의 펩타이드는 단백질 분해되기 어려워져, 투여한 대상의 체내에서 높은 안정성 및 긴 반감기를 갖게 된다.

본 발명의 펩타이드는, 상기 아미노산 배열(I)로 이루어지는 것이어도 좋고, 또는 상기 아미노산 배열(I)을 코어 배열로서 포함하고, 또한 이러한 아미노산 배열의 N 말단 및/또는 C 말단에, 또는 이러한 아미노산 배열의 어느 아미노산 잔기에, 펩타이드 또는 아미노산, 그들의 유사체, 폴리에틸렌글리콜, 당, 다당, 뉴클레오타이드 등의 여러가지의 물질(이들로 한정되지 않는다)이 결합된 것이어도 좋다. N/C 말단 또는 어느 아미노산 잔기에, 아미노산 또는 펩타이드를 통해서, 또는 이용 가능한 작용기를 이용하여 아미노산 배열의 내부에, 형광 표지, 바이오틴, 스트렙타비딘, 다이곡시게닌(DIG), 자기 비드, 라텍스 비드, 금 콜로이드 등의 물질(이들로 한정되지 않는다)이 결합되어 있어도 좋다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드에 다른 펩타이드가 결합하는 경우, 이러한 펩타이드는, 1개 내지 50개, 예컨대, 1 내지 20개, 1 내지 15개 또는 1 내지 9개의 아미노산으로 이루어지는 것이어도 좋다(상기 아미노산의 개수는 예시이며, 한정되는 것은 아니다). 또한, 이러한 펩타이드가 히스티딘 태그, GST 태그, S 태그, Myc 태그, HA 태그 또는 E 태그로서의 기능을 갖는 것(이들로 한정되지 않는다)이어도 좋다.

본 발명의 펩타이드는, 또한 상기한 펩타이드에 더하여, 상기 펩타이드의 아미노산 배열에서, 1개 또는 수개, 예컨대, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 갖는 펩타이드, 및 상기 펩타이드의 아미노산 배열과 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상(예컨대, 95, 97, 98 또는 99% 이상)의 상동성을 갖는 아미노산 배열을 갖는 펩타이드도 포함한다. 아미노산 배열의 상동성은, 예컨대, FASTA, BLAST, DNASIS(히타치 소프트웨어 엔지니어링(주)제), GENETYX((주)제네틱스제)를 이용하여 측정할 수 있다. 또는, 단쇄 펩타이드의 경우는 단순히 배열을 비교하여 계산할 수도 있다. 또한, 이들의 아미노산 중 어느 것이 적절히 수식된 것이어도 좋다. 어느 쪽의 아미노산 배열을 갖는 경우이어도, 본 발명의 펩타이드는 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 것이며, 배열 번호 1의 아미노산 배열(a)을 갖는 펩타이드보다 높은 수용성을 갖는 것이다.

본 발명의 펩타이드는 당업자에 알려진 여러가지의 방법에 의해 제조 및 취득할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드를 펩타이드 고상 합성법 등에 따라서 화학적으로 합성하여도 좋고, 본 발명의 펩타이드 인코딩하는 뉴클레오타이드 배열에 기초하여 유전자 공학적으로 제조하여도 좋고, 또는 이들의 방법을 조합시켜 얻어도 좋다.

본 발명은, 추가적인 태양에 있어서, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 본 발명의 펩타이드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에서 핵산이란, 1본쇄 또는 2본쇄의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 본 발명의 핵산은, 당업자에 공지된 여러가지의 방법에 의해 제조 및 취득될 수 있다. 본 발명은, 또한 어떤 태양에 있어서, 배열 번호 9 내지 15의 아미노산 배열 중 어느 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드 배열을 갖는 핵산에 관한 것이다. 본 발명에서, 배열 번호 9 내지 15의 아미노산 배열 중 어느 것을 인코딩하는 뉴클레오타이드 배열로서는, 배열 번호 16 내지 22의 뉴클레오타이드 배열이 예시된다. 그 때문에, 본 발명은, 또한 배열 번호 16 내지 22의 뉴클레오타이드 배열 중 어느 것을 갖는 핵산에 관한 것이다. 또한, 배열 번호 9 내지 15의 아미노산 배열 중 어느 것을 인코딩하는 상기 이외의 뉴클레오타이드 배열(예컨대, 축중(縮重) 배열)을 갖는 핵산도 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 핵산은, 또한 상기 핵산 이외에, (a) 상기 핵산의 뉴클레오타이드 배열에서, 1 또는 수개, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 뉴클레오타이드가 결실, 치환 또는 부가된 뉴클레오타이드 배열을 갖는 핵산, (b) 상기 핵산 또는 그 상보쇄와 가혹한 조건 하에서 하이브리드 형성할 수 있는 핵산, 또는 (c) 상기 핵산의 뉴클레오타이드 배열과 50% 이상(예컨대, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 또는 99% 이상)의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 배열을 갖는 핵산 등이다. 또한, 본 발명의 핵산은, 상기 핵산 중의 뉴클레오타이드 중 어느 것이 적절히 수식된 것이어도 좋다. 어느 쪽의 뉴클레오타이드 배열을 갖는 경우이어도, 본 발명의 핵산은 이뮤노글로불린 결합능을 갖고, 배열 번호 1의 아미노산 배열(a)을 갖는 펩타이드보다 높은 수용성을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 것이다.

상기 가혹한 조건으로서는, 예컨대, J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재되는 것과 같은 조건을 들 수 있다. 예컨대, 6×SSC, 5×덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS, 100㎍/ml 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중 68℃에서 프로브와 하이브리드 형성시킨 후, 세정 조건을 2×SSC, 0.1% SDS 중 실온 내지 0.1×SSC, 0.5% SDS 중 68℃까지 변화시키는 조건, 65℃에서 2×SSPE(Frederick M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.에 기재) 및 0.1% SDS를 포함하는 용액 중에서 15분을 2회, 0.5×SSPE 및 0.1% SDS를 포함하는 용액 중에서 추가로 15분을 2회, 이어서, 0.1×SSPE 및 0.1% SDS를 포함하는 용액 중에서 15분을 2회의 조건, 또는 65℃에서 2×SSPE, 0.1% SDS 및 폼아마이드(5 내지 50%)를 포함하는 용액 중에서 15분을 2회, 0.5×SSPE, 0.1% SDS 및 폼아마이드(5 내지 50%)를 포함하는 용액 중에서 추가로 15분을 2회, 이어서, 0.1×SSPE, 0.1% SDS 및 폼아마이드(5 내지 50%)를 포함하는 용액 중에서 15분을 2회의 조건 등이다.

상기 뉴클레오타이드 배열의 상동성은, 예컨대, FASTA, BLAST, DNASIS(히타치 소프트웨어 엔지니어링(주)제), GENETYX((주)제네틱스제)를 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 핵산은, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 배열을 갖는 것이면 어느 것이어도 좋다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 배열로 이루어지는 핵산이어도 좋고, 또는 상기 뉴클레오타이드 배열을 코어 배열로서 포함하고, 또한 이러한 배열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 그들의 유사체 등의 여러가지의 물질이 결합된 것이어도 좋다. 예컨대, 본 발명의 핵산에 폴리뉴클레오타이드가 결합되는 경우, 이러한 폴리뉴클레오타이드는, 1 내지 150개, 예컨대, 1 내지 60개, 1 내지 45개 또는 1 내지 18개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 것이어도 좋다(상기 뉴클레오타이드의 개수는 예시이며, 한정되는 것이 아니다).

본 발명은, 추가적인 태양에 있어서, 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는, 상기 핵산을 포함하고 있으면 어느 것이어도 좋다. 벡터를 도입하는 숙주의 종류, 필요로 되는 산물, 사용 목적 등의 여러가지의 조건에 따라 벡터를 적절히 선택 또는 설계하여 얻을 수 있다. 본 발명의 벡터는, 예컨대, 배열 번호 16 내지 22 중 어느 것으로 나타내는 뉴클레오타이드 배열의 5' 말단 또는 3' 말단에 인프레임(in-frame)으로 목적하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 배열을 삽입함으로써, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드가, 목적하는 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 부가된 융합 단백질의 발현용 벡터로서 이용될 수도 있다. 융합 단백질로부터 목적하는 단백질의 단리를 쉽게 하기 위해서, 본 발명의 벡터는, 상기 뉴클레오타이드 배열과 목적하는 단백질의 뉴클레오타이드 배열 삽입부 사이에, 예컨대, HRV 3C, 트롬빈, Factor Xa, 엔테로키나아제 등의 프로테제(prothese)에 의해 인식되는 배열을 포함하고 있어도 좋다. 본 발명의 벡터를 세포에 도입하여, 본 발명의 펩타이드나 융합 단백을 생산시킬 수 있다.

본 발명은, 다른 태양에 있어서, 본 발명의 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드가 원하는 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가된 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질은, 당업자에 기지의 여러가지의 방법에 의해 제조 및 취득할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드를 포함하기 때문에, 이러한 펩타이드를 태그 배열로서 이용하여, 목적하는 단백질을 단리 및/또는 정제하는 것 등이 가능해진다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 Protein A 또는 Protein G 만큼 이뮤노글로불린과의 결합능이 높지 않기 때문에, 본 발명의 융합 단백질은, 예컨대, 정제용 컬럼에 고정된 경우, Protein A 또는 Protein G에 비하여, 온건한 조건 하에서의 이뮤노글로불린의 정제 및 이러한 컬럼의 반복 사용(열화가 억제된다)을 가능하게 하고, 예컨대, 이뮤노글로불린의 검출용 프로브로서 이용한 경우, 리프로빙(reprobing)이 용이하다는 등의 이점을 갖는다.

본 발명의 융합 단백질에 포함되는 목적하는 단백질은 어느 단백질이어도 좋다. 본 발명의 융합 단백질이, 예컨대, 알칼리 포스파타제(ALP), 페록시다아제(HRP), 루시퍼라아제 및 그린 형광 단백질(GFP) 등의 형광 단백질, β-갈락토시다아제, 글루타싸이온 S-트랜스퍼라아제, 말토오즈 결합 단백질 등의 효소를 목적하는 단백질로서 포함하는 경우, 본 발명의 융합 단백질에 포함되는 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드와 이뮤노글로불린의 결합을 검출하는 것 등이 용이해진다. 본 발명의 융합 단백질은, 또한, 예컨대 히스티딘 태그, GST 태그, S 태그, Myc 태그, HA 태그, 또는 E 태그 등의 태그 배열, 핵 이행 시그널, 실리카 결합 단백질, Protein A 등을 포함하고 있어도 좋다.

본 발명의 융합 단백질은, 본 발명의 펩타이드와 목적하는 단백질 사이에 프로테아제에 의해 인식되는 펩타이드를 포함하고 있어도 좋다. 이러한 펩타이드를 포함하는 것에 의해, 융합 단백질로부터 목적하는 단백질을 용이하게 단리할 수 있다.

본 발명은, 추가적인 태양에 있어서, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터를 세포에 도입하여, 단백질을 생산시키는 것에 의해, 본 발명의 융합 단백질을 얻어도 좋다.

본 발명은, 하나의 태양에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 그들의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 세포는, 예컨대, 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등의 숙주 세포를 상기 핵산 또는 벡터를 이용하여 형질 전환함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 세포를 배양하여, 생산된 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드, 또는 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 회수함으로써 본 발명의 펩타이드 또는 융합 단백질을 제조할 수도 있다.

본 발명은, 추가적인 태양에 있어서, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드의 제조 방법으로서,

(a) 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 이용하여 세포를 형질 전환하는 공정, 및

(b) 상기 세포를 배양하여, 펩타이드를 생산시키는 공정

을 포함하는 방법에 관한 것이다. 세포의 형질 전환은, 당업자에 알려진 수단 및/또는 방법에 의해 실시될 수 있다.

그 때문에, 본 발명은, 상기 펩타이드의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖고, 또한 수용성이 개선된 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명은, 다른 태양에 있어서, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드가, 목적하는 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가된 융합 단백질의 제조 방법으로서,

(a) 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드가, 목적하는 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 부가된 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 이용하여 세포를 형질 전환하는 공정, 및

(b) 상기 세포를 배양하여, 융합 단백질을 생산시키는 공정

을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 융합 단백질의 제조 방법은, 융합 단백질로부터 목적 단백질을 취출하는 공정을 추가로 포함하고 있어도 좋다.

그 때문에, 본 발명은, 상기 융합 단백질의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖고, 또한 수용성이 개선된 펩타이드가 목적하는 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가된 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명은, 추가적인 태양에 있어서, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드, 또는 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 이뮤노글로불린을 결합시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 상기 펩타이드 또는 융합 단백질 이외의 성분은, 본 발명의 조성물이 사용된 목적 등 여러가지의 조건에 따라 적절히 선택될 수 있다. 전술한 대로, 본 발명의 조성물은 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드를 포함하는 것이기 때문에, 본 발명의 조성물은, 예컨대, 이뮤노글로불린의 존재 또는 양을 결정하기 위한 조성물이어도 좋고, 이뮤노글로불린을 단리하기 위한 조성물이어도 좋다. 본 발명의 조성물에 의해, 시료 중의 이뮤노글로불린의 양을 결정하는 것, 시료로부터 이뮤노글로불린을 단리하는 것 등이 가능하게 된다.

본 발명은, 또 하나의 태양에 있어서, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드, 또는 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 고정화한, 이뮤노글로불린을 결합시키기 위한 수단에 관한 것이다. 본 발명의 수단은, 예컨대, 플레이트, 수지, 컬럼, 비드, 아가로스, 세파로스 등의 당을 포함하는 수지, 실리카 기판, 유리(슬라이드 글라스 등), 금속(금 등), 아파타이트 등의 담체에 상기 펩타이드 또는 융합 단백질이 고정된 것이다. 고정화는, 펩타이드, 또는 단백질의 아미노기 또는 카복실기를 통한 방법, 아미노산 측쇄의 SH기를 사이에 통한 방법, 이온적인 결합에 의한 방법, 소수적인 결합에 의한 방법 등의 당업자에 알려진 수단·방법에 의해 실시될 수 있다.

전술한 대로, 본 발명의 수단은 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드가 고정화된 것이기 때문에, 본 발명의 수단은, 이뮤노글로불린의 존재 또는 양을 결정하기 위한 수단, 및 이뮤노글로불린을 단리하기 위한 수단을 포함하는 것이다. 본 발명의 수단을, 예컨대, ELISA용 플레이트, 이뮤노글로불린 정제용 컬럼, 검출용 유리 어레이, 마이크로 유로계, SPR용 센서칩, 검출용 실리카 기판, 항체 의약품 정제 시스템 등으로서 이용할 수 있다.

본 발명은, 추가적인 태양에 있어서, 이뮤노글로불린을 결합시키는 방법으로서,

(a) 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드, 또는 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 시료에 첨가하는 공정, 및

(b) 펩타이드 또는 융합 단백질과 이뮤노글로불린의 결합체를 조사하는 공정

을 포함하는 방법에 관한 것이다. 시료는, 이뮤노글로불린이 포함되어 있을 가능성이 있으면 어느 것이어도 좋다. 이뮤노글로불린과의 결합체의 존재 및/또는 양을 조사하는 것에 의해, 시료 중에 이뮤노글로불린이 존재하는지 여부, 추가로는, 시료 중에 존재하는 이뮤노글로불린의 양을 결정하는 것 등이 가능해진다. 본 발명의 방법에 이용하는 펩타이드 또는 융합 단백질은 표지된 것이어도 좋다. 표지로서는, 바이오틴화, 형광 표지, RI 표지, 효소 표지 등 당업자에 알려진 여러가지의 것을 들 수 있다. 이러한 표지를 붙이는 것에 의해, 펩타이드 또는 융합 단백질과의 결합체를 조사하는 것이 용이해진다. 또한, 본 발명의 방법은, 결합체로부터 이뮤노글로불린을 단리하는 공정을 포함하고 있어도 좋다.

따라서, 본 발명은, 이뮤노글로불린을 결합시키는 방법에 이용하기 위한, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드 또는 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트에는, 상기 펩타이드 또는 융합 단백질 이외에, 예컨대, 표지, 결합체를 조사하는 수단 등을 포함할 수 있다.

본 발명은, 다른 태양에 있어서, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 본 발명의 펩타이드, 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 이러한 펩타이드 또는 융합 단백을 인코딩하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터를 유효 성분으로서 포함하는, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물에 관한 것이다. C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환이란, 이러한 결합에 의해 직접적 또는 간접적으로 생기는 질환을 말하며, 예컨대, 관절 류마티즘, 관절염, 전신성 에리테마토데스(SLE), 혈관 염증군, 신장염 등의 면역 복합체 병, 그 밖의 염증성 질환, 건선증 및 악성 종양 등을 들 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 포함되는 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드가 C1q와 이뮤노글로불린의 결합을 저해함으로써 상기 질환을 치료 및 예방할 수 있다.

한편, 본 발명의 펩타이드는, 원래 사람의 체내에 존재하는 C1q에 유래되는 것이기 때문에, 본 발명의 펩타이드를 사람에게 투여함으로써 생기는 부작용은 생기지 않거나, 있다고 해도 적다. 또한, 본 발명의 펩타이드는, 천연의 단백질 유래의 아미노산 배열을 개변함으로써 수용성이 개선되어 있어, 의약 조성물로서 대상에 투여한 경우, 실질적인 투여량이 높아진다는 등의 이점을 갖는다. 또한, D-체 아미노산을 구성 성분에 포함하는 것으로 단백질 분해에의 저항성이 높아지기 때문에, 본 발명의 펩타이드는, 투여한 대상의 체내에서 높은 안정성 및 긴 반감기를 갖는다.

본 발명의 의약 조성물의 유효 성분으로서 사용 가능한 본 발명의 펩타이드는 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드로서,

Pro-Gly-Leu-X₄-X₅-Phe (I)

(여기서, X₄ 및 X₅는 동시에 Tyr가 아닌 아미노산이다)

로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 펩타이드이다. 본 발명의 의약 조성물의 유효 성분으로서 바람직한 본 발명의 펩타이드의 예는, 상기 아미노산 배열(I)에서 X₄, X₅가 모두 친수성 아미노산인 것이다. 이러한 친수성 아미노산으로서는 Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser 및 Thr 등을 들 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 유효 성분으로서, 보다 바람직한 본 발명의 펩타이드의 예는, 배열 번호 9 내지 15 중 어느 아미노산 배열을 갖는 펩타이드이다. 더욱 바람직하게는, 식 (I)의 아미노산 배열 중의 1개 또는 복수의 아미노산(Gly를 제외한다), 또는 모든 아미노산(Gly를 제외한다)이 대응되는 D-아미노산으로 치환되어 있는 아미노산 배열을 갖는 펩타이드이다.

본 발명의 의약 조성물의 투여 방법은, 질환의 종류, 대상의 상태 및/또는 표적 부위 등의 조건에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 방법으로서는, 피내(皮內) 투여, 피하 투여, 근육 내 투여, 정맥 내 투여, 경비 투여, 경구 투여, 경폐 투여, 좌제 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 펩타이드의 양, 의약 조성물의 제형, 투여 빈도 등은, 질환의 종류, 대상의 상태, 표적 부위 등의 조건에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예컨대, 1회당 펩타이드 투여량을 0.01 내지 100mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 10mg/kg으로 하여도 좋지만, 본 발명의 펩타이드의 투여량은 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은, 추가적인 태양에 있어서, 유효량의 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드, 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 이러한 펩타이드 또는 융합 단백을 인코딩하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터를 대상에 투여하는 것을 포함하는, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.

본 발명은, 추가로 다른 태양에 있어서, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 사용되는, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드, 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 이러한 펩타이드 또는 융합 단백을 인코딩하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은, 추가적인 태양에 있어서, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 사용되는 의약의 제조를 위한, 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드, 이러한 펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 이러한 펩타이드 또는 융합 단백을 인코딩하는 핵산, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터의 사용을 제공한다.

이하에 실시예를 기재하여 본 발명을 구체적이고 상세하게 설명하지만, 실시예는 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안된다.

실시예

실시예 1

펩타이드의 수용성의 검토

본 발명자는, C1q 유래의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드에 대하여 검토하여, 배열 번호 1로 나타내는 아미노산 배열(Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe)을 갖는 펩타이드 또는 그 수식물이, 관절 류마티즘 및 전신성 에리테마토데스(SLE), 사구체 신장염, 혈관염, 관절염 등의 면역 복합체 병 등과 같은, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환에서 치료 및 예방 효과를 나타내는 것을 발견했지만(국제공개 제2009/025300호 팜플렛 및 국제공개 제2010/084851호 팜플렛을 참조), 상기 펩타이드의 수용성을 더욱 높이기 위해서, 이하의 검토를 행했다.

(1) 변이 도입 부위의 검토

이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드를 갖고, 여러가지의 치료 및 예방 효과를 나타내는, 배열 번호 1로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩타이드에 대하여, 상기 결합능에 관여하지 않고, 변이를 도입할 수 있는 부위를 알라닌 스크리닝에 의해 탐색했다.

표 1에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 펩타이드를 GL Biochem사(상하이)에 위탁하여 제작했다.

사람 C1q 단백질(Carbiochem사제)을 10mM HEPES, 300mM NaCl, 40% 글리세롤(pH7.2)에 용해하여, 200㎍/ml 사람 C1q 단백질 용액을 조제했다. 사람 C1q 단백질 용액을 5mm×15mm의 크기의 나이트로셀룰로스막(Hybond C: 애머샴사제)에 2㎕(400ng)씩 스폿팅하고, 실온에서 약 1시간 공기 중에서 건조시켰다. 나이트로셀룰로스막을 TBS에 침지하고, 5분간 인큐베이팅하고, 5% 블록킹제(Amersham ECL blocking reagent: GE Healthcare사제)를 포함하는 TBS(20mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl)를 이용하여 실온에서 1시간 블록킹을 행했다. TBS로 가볍게 세정한 후, 알칼리 포스파타제(ALP) 표지 사람 이뮤노글로불린(IgG)(BECKMAN COULTER사제)을 TBS로 1000배 희석하고, 각 펩타이드의 농도가 500㎍/ml가 되도록 혼합한 용액 20㎕에 침지하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. TTBS 용액(TBS에 최종 농도 0.05%로 Tween 20을 가한 것)으로 가볍게 세정한 후, 동일한 액에서 10분간, 3회 진탕하면서 세정했다.

ALP 표지 이뮤노글로불린(IgG)을 이용하여, 사람 C1q 단백질과 IgG의 결합체를 검출했다. 나이트로셀룰로스막을 ALP 발색 버퍼(100mM NaCl, 5mM MgCl₂ 함유 Tris-HCl pH9.5)로 가볍게 세정 후, BCIP/NBT 용액(프로메가사제)을 포함하는 ALP 발색 버퍼 30㎕에 침지하고, 실온에서 10분간 발색시켰다. 염색상(像)이 수득된 때에 나이트로셀룰로스막을 충분한 양의 증류수에 침지하고, 발색(發色) 버퍼를 씻어 냈다. 세정 후, 나이트로셀룰로스막을 공기 중에서 건조시켜 Multi Gauge(FUJIFILM)를 이용하여 염색상을 획득했다.

결과를 도 1에 나타낸다. 배열 번호 1로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 3 내지 5번째의 아미노산을 알라닌으로 치환한 펩타이드에서, 이뮤노글로불린 결합능은 유지되어 있었다. 특히, 4번째 또는 5번째의 아미노산을 원래의 아미노산과 다른 종류의 것으로 치환하여도, 이뮤노글로불린 결합능에는 거의 영향이 없다는 것이 나타났다.

(2) 펩타이드에의 친수성 아미노산 도입의 검토

(1)에서 변이를 도입할 수 있음이 확인된 4번째 및 5번째의 아미노산을 여러가지의 친수성 아미노산으로 치환한 펩타이드의 수용성을 검토했다. 표 2에 나타내는 아미노산을 GL Biochem사(상하이)에 위탁하여 제작했다. 표 2에 기재된 펩타이드 중, SP1 내지 7은 4번째 및 5번째의 아미노산을 여러가지의 친수성 아미노산으로 치환한 펩타이드이다.

결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에서, 10mg/ml 이상의 농도에서도 용매(PBS 또는 생리 식염수)에 녹은 펩타이드에는 ○를 붙이고, 1mg/ml의 농도에서 용매에 녹지 않은 펩타이드에 ×를 붙였다. 배열 번호 1로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 원래의 배열을 갖는 펩타이드(R1)에서는 1mg/ml의 농도에서 용매에 녹지 않았지만, N 말단으로부터 4번째 및 5번째의 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환한 펩타이드에서는 10mg/ml 이상의 농도에서도 충분히 용매에 녹았다. 이후의 실험에서는, 4번째 및 5번째의 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환한 펩타이드를 이용했다.

일반적으로, 펩타이드 의약에 있어서는, 소화관에서의 이분해성을 고려하여, 정맥 주사나 피하 주사에 의한 투여 방법을 이용하는 경우가 많다. 그 때문에, 수용성이 낮은 펩타이드는 임상 적용이 어려워진다. 경구 투여를 선택하여도, 펩타이드가 분해되기 쉽다고 하는 문제가 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드는 수용성이 높기 때문에, 고용량으로 정맥 주사나 피하 주사를 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 수용성이 높기 때문에, 소재로서 취급하기 쉽다고 하는 이점도 갖고 있다.

실시예 2

수용성을 부여한 펩타이드의 이뮤노글로불린 결합능의 확인

실시예 1(2)에서 수득된 펩타이드에 대하여, 이뮤노글로불린 결합능의 확인을 행했다.

SP1 내지 7의 펩타이드를 각각 10mg/ml가 되도록 DMSO에 용해했다. 또한, 국제공개 제2009/025300호 및 국제공개 제2010/084851호에서 이뮤노글로불린 결합능이 확인되어 있는 STGKFTCKVPGLYYF의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드(R8), dPGdLdYdYdF 및 dSdKdVdPGdLdYdYdF의 아미노산 배열(배열 중, 「dL」, 「dP」, 「dA」, 「dY」, 「dF」, 「dS」, 「dK」, 「dV」 및 「dT」는, 각각 류신, 프롤린, 알라닌, 타이로신, 페닐알라닌, 세린, 라이신, 발린 및 트레오닌의 D체를 각각 의미한다)을 갖는 펩타이드(각각 R9 및 10)에 대해서도 동일하게 용액을 조제하고, 이하의 실험에 제공했다.

사람 C1q 단백질(Carbiochem사제)을 10mM HEPES, 300mM NaCl, 40% 글리세롤(pH7.2)에 용해하여, 200㎍/ml 사람 C1q 단백질 용액을 조제했다. 사람 C1q 단백질 용액을 5mm×15mm의 크기의 나이트로셀룰로스막(Hybond C: 애머샴사제)에 2㎕(400ng)씩 스폿팅하여, 실온에서 약 1시간 공기 중에서 건조시켰다. 나이트로셀룰로스막을 TBS에 침지하고, 5분간 인큐베이팅하고, 5% 블록킹제(Amersham ECL blocking reagent: GE Healthcare사제)를 포함하는 TBS(20mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl)를 이용하여 실온에서 1시간 블록킹을 행했다. TBS로 가볍게 세정한 후, 알칼리 포스파타제(ALP) 표지 사람 이뮤노글로불린(IgG)(BECKMAN COULTER사제)을 TBS로 1000배 희석하고, 각 펩타이드의 농도가 500㎍/ml가 되도록 혼합한 용액 20㎕에 침지하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. TTBS 용액(TBS에 최종 농도 0.05%로 Tween 20을 가한 것)로 가볍게 세정한 후, 동일한 액에서 10분간, 3회 진탕하면서 세정했다.

ALP 표지 이뮤노글로불린(IgG)을 이용하여, 사람 C1q 단백질과 IgG의 결합체를 검출했다. 나이트로셀룰로스막을 ALP 발색 버퍼(100mM NaCl, 5mM MgCl₂ 함유 Tris-HCl pH9.5)로 가볍게 세정 후, BCIP/NBT 용액(프로메가사제)을 포함하는 ALP 발색 버퍼 30㎕에 침지하고, 실온에서 10분간 발색시켰다. 염색상이 수득된 때에 나이트로셀룰로스막을 충분한 양의 증류수에 침지하고, 발색 버퍼를 씻어 냈다. 세정 후, 나이트로셀룰로스막을 공기 중에서 건조하여 Multi Gauge(FUJIFILM)를 이용하여 염색상을 획득하여 수치화했다.

결과를 도 2에 나타낸다. 도면 중, NC는 펩타이드를 포함하지 않는 DMSO를, 알칼리 포스파타제(ALP) 표지 사람 이뮤노글로불린(IgG)을 포함하지 않는 반응액에 첨가한 샘플의 결과이며, PC는 펩타이드를 포함하지 않는 DMSO를, 알칼리 포스파타제(ALP) 표지 사람 이뮤노글로불린(IgG)을 포함하는 반응액에 첨가한 샘플의 결과를 나타낸다. 배열 번호 1로 나타내는 아미노산 배열에 있어서, 4번째 및 5번째의 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환한 아미노산 배열을 갖는 각 펩타이드는 C1q와 이뮤노글로불린의 결합을 저해했다.

실시예 3

TNF-α 자극에 의해 유도되는 염증 관련 단백의 생산에 대한 본 발명의 펩타이드의 억제 효과

사람 RA 환자로부터 채취한 골막 세포를 TNF-α에 의해 자극함으로써 생산되는 사이토카인이나 세포 외 프로테아제 등의 염증 관련 단백이, 본 발명의 펩타이드를 첨가하는 것에 의해 감소하는지 여부를, 리얼 타임(real time) PCR 법을 이용하여 검토했다.

10% FBS, 1% L-Glu 및 1% P/S를 포함하는 DMEM(GIBCO)을 이용하여, 골막 세포(Passage 3-5)를 10cm 직경의 배양 디쉬에서 80 내지 90%의 융합(confluent)이 될 때까지 배양했다. 배양한 세포를 24웰 플레이트에 5×10⁵ 세포/웰의 비율로 파종하고, 24시간 인큐베이션했다. 10㎍/ml의 rhTNF-α(R&D Recombinant Human TNF-α/TNFSF1A #210-TA)를 10배 희석한 것을 10㎕/웰로 첨가하여, 골막 세포를 자극했다. 각각의 펩타이드 첨가량이 1, 10 또는 100㎍이 되도록, 생리 식염수(오쯔카제약사제)로 각 농도로 조제한 본 발명의 펩타이드 용액을 10㎕/웰로 첨가하여, 24시간 인큐베이션했다. 배지를 제거하고 PBS(-)로 세정했다. TRIzol(invitrogen TRIzol Reagent #15596-018)을 1ml/웰로 첨가하고, 셀 스크레이퍼(cell scraper)로 세포를 긁어내고, 1.5ml 에펜도프 튜브로 회수했다. RNA를 추출한 후에, High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applide Biosystems)를 이용하여 cDNA를 조제하고, 리얼 타임 PCR(ABI PRISM 7900HT)로 각 유전자의 발현량을 반(半)정량화하여 평가했다.

결과를 도 3에 나타낸다. SP3 및 SP4 등의 본 발명의 펩타이드는, TNF-α로 자극하는 것에 의해 유도되는 IL-1β, TNF-α, MMP-1 및 MMP-3 등의 각종 염증 관련 단백의 생산을 억제한다는 것이 나타났다.

실시예 4

단클론 항체 칵테일 관절염 마우스 모델에서의 본 발명의 펩타이드의 관절염 억제 작용

1. 재료 및 방법

1-1 마우스(BALB/c Cr Slc (SPF))를 이용하여, 단클론 항체 칵테일 유발 관절염에 대한 발명의 펩타이드의 관절염 억제 작용을 검토했다. 보통 사료를 주어 6일간 순화하고 나서 시험에 사용했다.

1-2 시험에 이용한 펩타이드의 아미노산 배열

·펩타이드 R1: PGLYYF(피검 물질 a)

·펩타이드 R9: dPGdLdYdYdF(피검 물질α)

·펩타이드 SP4: PGLEKF(피검 물질 VII-1)

·D-아미노산(글리신 이외)으로 구성된 펩타이드 SP4: dPGdLdEdKdF(피검 물질 VII-2)

1-3 실험 개략

관절염 야기용 단클론 항체 칵테일 2mg/개체를 정맥 내 투여하고, 그 3일 후에 리포다당(LPS)을 50㎍/개체로 복강 내 투여하여, 관절염을 야기했다. 펩타이드 R1 및 R9를 LPS 투여 다음날(4일째) 내지 14일째까지, 1일 1회, 10mg/kg으로 복강 내 투여, 및 펩타이드 SP4 및 D-아미노산(글리신 이외)으로 구성된 펩타이드 SP4를 LPS 투여 다음날(4일째) 내지 14일째까지, 1일 1회, 10mg/kg 또는 100mg/kg으로 복강 내 투여했다. 양성 대조약의 메토트렉세이트(MTX)를 4일째부터 1일 1회, 0.15mg/kg으로 복강 내 투여했다. 대조군에는 생리 식염수를, 4일째부터 1일 1회, 10mL/kg 투여했다. 0일째 내지 14일째까지의 짝수일에 사지(四肢)의 임상 스코어를 관찰하여, 뒷다리 용적을 측정했다.

또한, 이하와 같이 하여 관절 조직 표본 제작 및 연(軟) X선 사진 촬영을 행했다. 마취 하에서 헤파린 함유 생리 식염액으로 탈혈(脫血)을 행하고, 빙냉 4% 파라폼알데하이드 액을 지속 주입하여 전신 관류 고정했다. 관류 고정 후, 양 뒷다리의 무릎 관절(대퇴골 중심부 및 경골 중심부를 절단하고, 피부 및 근육을 제거) 및 발 뒤꿈치 관절(경골 중심부에서 발끝까지)을 적출하고, 추가로 4% 파라폼알데하이드 액에서 밤새 침지 고정(4℃)했다. 그 후, 양 무릎 및 양발 뒤꿈치 관절을 50mM PBS(4℃)로 옮긴 후, 발 뒤꿈치 관절의 연 X선 사진 촬영을 2방향(내측면 방향 및 상면 방향)에서 행했다.

1-4 펩타이드 용액의 조제

펩타이드 R1 및 R9를 칭량하여 마노 막자 사발에 넣고, 막자로 분쇄한 후에 생리 식염액을 서서히 가하여 현탁하고, 1mg/ml가 되도록 조제하여, 사용 시까지 조제물을 냉장 보존했다. 또한, 펩타이드 SP4 및 D-아미노산(글리신 이외)으로 구성된 펩타이드 SP4는 생리 식염액을 1.0ml 첨가하여 용해시키고, 10mg/ml 및 1mg/ml이 되도록 조제하여, 사용 시까지 조제물을 냉장 보존했다.

1-5 메토트렉세이트 용액의 조제

메토트렉세이트를 1mg 칭량하고, 0.1M 수산화 나트륨 용액 1ml를 가하여 용해했다. 제작한 1mg/ml 액을 0.15ml 분취하고, 이것에 생리 식염액을 9.85ml 가하여, 0.015mg/ml가 되도록 조제했다. 사용 시까지 조제물을 냉장 보존했다.

1-6 체중 측정, 일반 증상 관찰 및 군 분류

동물의 체중 측정은 시험 기간 중, 관절염 야기용 단클론 항체 칵테일 투여일을 0일째로 하여, 0, 3, 6, 9, 12 및 14일째에 측정했다. 일반 상태 관찰은 매일 실시했다.

1-7 관절염 모델의 제작

0일째에 7주령의 마우스 40마리에 관절염 야기용 단클론 항체 칵테일 2mg/개체를 정맥 내 투여하고, 3일째에 LPS를 50㎍/개체로 복강 내 투여했다.

1-8 펩타이드 용액의 투여

펩타이드 용액은, 4일째부터 1일 1회 10mg/kg 또는 100mg/kg 복강 내 투여했다. 대조로서, 4일째부터 생리 식염액을 1일 1회 복강 내 투여했다. 투여량은 10ml/kg으로 했다. 메토트렉세이트는 4일째부터 1일 1회 0.15mg/kg 복강 내 투여했다. 투여량은 10ml/kg으로 했다. 투여에는 주사 바늘(26G; 테루모) 및 주사통(1.0ml 용량; 테루모)을 이용했다.

1-9 임상 스코어 관찰

임상 스코어의 관찰은, 0일째 내지 14일째까지의 짝수일에 이하에 따라서 관찰했다. 사지의 합계로 최대 12 스코어로 했다. 발의 붓기를 육안으로 관찰했다.

<임상 스코어>

0: 정상 관절

1: 약간의 염증 및 발적

2: 손발 전체에, 및 손발의 사용을 방해하는 중증 홍반 및 붓기

3: 강직, 관절 경직, 기능 상실을 수반하는 손발 또는 관절의 변형

1-10 시험군

시험군은 이하와 같았다.

1-11 통계학적 해석 처리 방법

시험 성적은 평균값±표준 오차로 표시하고, EXSAS(Version7.1.6, 주식회사 암 시스텍스)를 이용하여 해석을 행했다. 임상 스코어는 Wilcoxon 검정을 행했다. 체중 및 발 용적 등의 정량적 데이타는 Bartlett 검정을 행하고, 분산이 균일하면 Dunnett의 다중 비교 검정을 행하고, 분산이 불균일하면 Steel의 다중 비교 검정을 행했다. 유의 수준은 양측 5%로 했다.

2. 결과

2-1 동물의 체중 변화 및 일반적 상태

대조군의 체중은 0일째에서 22.5±0.2g이며, LPS 투여 후의 6일째에서 18.1±0.2g으로 저하되었다. 9일째에서 19.6±0.3g, 12일째에서 21.1±0.4g, 14일째에서 22.2±0.4g으로 서서히 체중이 회복됐다. 다른 피검 물질 투여군의 체중도 대조군과 동일하게 추이되어, 유의차는 확인되지 않았다. 또한, 시험 기간 중 모든 동물에 대하여 부작용이라고 생각되는 증상은 확인되지 않았다.

2-2 임상 스코어

결과를 도 4 내지 7에 나타낸다.

대조군의 임상 스코어는, 0일째에서 0.0±0.0, 2일째에서 0.6±0.2이며, LPS 투여 후인 4일째에서 3.0±0.3, 6일째에서 6.6±0.7, 8일째에서 6.8±0.6, 10일째에서 8.4±0.5, 12일째에서 11.0±0.3, 14일째에서 11.2±0.4로 경시적으로 증가했다. 14일째의 스코어는, 앞다리 및 뒷다리의 스코어가 5개 예 모두 2 내지 3이며, 총 스코어는 10 내지 12였다(도 4 내지 도 7).

피검 물질 a 10mg/kg 투여군의 임상 스코어는 최대값의 14일째에서 9.6±0.8로 대조군과 비교하여 낮은 값으로 추이하고, 스코어 0을 확인한 예의 개수가 2개 예이며, 총 스코어는 7 내지 12였다(도 4).

피검 물질 α 10mg/kg 투여군의 임상 스코어는 12일째에서 7.0±0.7, 14일째에서 7.4±0.9이며, 대조군과 비교하여 유의한 낮은 값을 나타내었다. 14일째에서는, 스코어 0을 확인한 예의 개수가 3개 예이며, 총 스코어는 5 내지 10이었다(도 5).

피검 물질 VII-1 10mg/kg 투여군의 임상 스코어는 12일째에서 7.2±1.0, 14일째에서 7.4±1.1이며, 대조군과 비교하여 유의한 낮은 값을 나타내었다. 14일째에서는, 스코어 0을 확인한 예의 개수가 3개 예이며, 총 스코어는 5 내지 10이었다(도 6).

피검 물질 VII-1 100mg/kg 투여군의 임상 스코어는 12일째에서 7.2±0.9, 14일째에서 8.0±0.9이며, 대조군과 비교하여 유의한 낮은 값을 나타내었다. 14일째에서는, 스코어 0을 확인한 예의 개수가 2개 예이며, 총 스코어는 5 내지 10이었다(도 6).

피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군의 임상 스코어는 10일째에서 5.0±0.8, 12일째에서 5.8±0.9, 14일째에서 6.0±1.0이며, 대조군과 비교하여 유의한 낮은 값을 나타내었다. 14일째에서는, 스코어 0을 확인한 예의 개수가 4개 예이며, 총 스코어는 4 내지 10이었다(도 7).

피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군의 임상 스코어는 10일째에서 5.8±0.5, 12일째에서 6.8±0.7, 14일째에서 7.2±0.8이며, 대조군과 비교하여 유의한 낮은 값을 나타내었다. 14일째에서는, 스코어 0을 확인한 예의 개수가 4개 예이며, 총 스코어는 4 내지 8이었다(도 7).

MTX 0.15mg/kg 투여군의 임상 스코어는 12일째에서 8.2±0.9, 14일째에서 8.6±0.9이며, 대조군과 비교하여 유의한 낮은 값을 나타내었다. 14일째에서는, 스코어 0을 확인한 예의 개수가 1개 예이며, 총 스코어는 6 내지 11이었다(도 4 내지 도 7).

2-3 뒷다리 용적

결과를 도 8 내지 11, 도 12 내지 15에 나타낸다.

대조군의 뒷다리 용적은 0일째 0.212cm³이며, LPS 투여 후인 4일째 내지 6일째에서 뒷다리 용적은 현저한 증가를 보였다. 뒷다리 용적은 4일째에서 0.287cm³, 6일째에서 0.419cm³, 8일째에서 0.460cm³으로 최대값에 달하고, 그 후 저하되어, 14일째에서는 0.331cm³이었다(도 8 내지 도 11). 0일째의 용적을 100%로 한 때의 증가율은 4일째에서 136.0%, 6일째에서 198.3%, 8일째에서 217.8%로 최대의 증가율을 나타내고, 14일째에서는 156.8%로 저하되었다(도 12 내지 도 15).

피검 물질 a 10mg/kg 투여군의 뒷다리 용적은 0일째에서 0.213cm³이며, 6일째에서 0.403cm³(증가율 190.2%), 8일째에서 0.452cm³(증가율 213.2%)으로 최대값에 달하고, 그 후 서서히 저하되어, 14일째에서는 0.343cm³(증가율 161.8%)이며, 대조군과 비교하여 유의차는 확인되지 않았다(도 8, 도 12).

피검 물질 α 10mg/kg 투여군의 뒷다리 용적은 0일째에서 0.212cm³이며, 6일째에서 0.367cm³(증가율 173.7%), 8일째에서 0.455cm³(증가율 215.1%)으로 최대값에 달하고, 그 후 서서히 저하되어, 14일째에서는 0.328cm³(증가율 155.1%)였다. 대조군과 비교하여 6일째의 용적에서 유의한 저하가 확인되었다(도 9, 도 13).

피검 물질 VII-1 10mg/kg 투여군의 뒷다리 용적은 0일째에서 0.223cm³이며, 6일째에서 0.368cm³(증가율 165.2%), 8일째에서 0.438cm³(증가율 196.6%)으로 최대값에 달하고, 그 후 서서히 저하되어, 14일째에서는 0.332cm³(증가율 149.1%)이었다. 대조군과 비교하여 6일째의 용적 및 증가율에서 유의한 저하가 확인되었다(도 10, 도 14).

피검 물질 VII-1 100mg/kg 투여군의 뒷다리 용적은 0일째에서 0.219cm³이며, 6일째에서 0.362cm³(증가율 165.5%), 8일째에서 0.418cm³(증가율 191.4%)으로 최대값에 달하고, 그 후 서서히 저하되어, 14일째에서는 0.329cm³(증가율 150.3%)이었다. 대조군과 비교하여 6일째의 용적 및 증가율에서 유의한 저하가 확인되었다(도 10, 도 14).

피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군의 뒷다리 용적은 0일째에서 0.211cm³이며, 6일째에서 0.363cm³(증가율 172.0%), 8일째에서 0.429cm³(증가율 204.0%)으로 최대값에 달하고, 그 후 서서히 저하되어, 14일째에서는 0.340cm³(증가율 161.8%)이었다. 대조군과 비교하여 6일째의 용적의 유의한 저하와 증가율 저하 경향(P=0.0753)이 확인되었다(도 11, 도 15).

피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군의 뒷다리 용적은 0일째에서 0.223cm³이며, 6일째에서 0.373cm³(증가율 167.4%), 8일째에서 0.420cm³(증가율 188.5%)으로 최대값에 달하고, 그 후 서서히 저하되어, 14일째에서는 0.356cm³(증가율 159.6%)이었다. 대조군과 비교하여 6일째의 용적의 저하 경향(P=0.0876)과 유의한 증가율의 저하가 확인되었다(도 11, 도 15).

MTX 0.15mg/kg 투여군의 뒷다리 용적은 0일째에서 0.216cm³이며, 6일째에서 0.381cm³(증가율 176.2%), 8일째에서 0.441cm³(증가율 204.2%)으로 최대값에 달하고, 그 후 서서히 저하되어, 14일째에서는 0.356cm³(증가율 165.4%)이었다. 대조군과 비교하여 유의차는 확인되지 않았다(도 8 내지 도 11, 도 12 내지 도 15).

3. 고찰

대조군의 뒷다리 용적은 2일째부터 증가하기 시작하여, 8일째(LPS 투여 5일 후)에 최대값에 달하고, 그 후 서서히 저하되었다. 대조군의 뒷다리 용적의 현저한 증가는 4일째 내지 6일째에서 확인되었다. 대조군과 비교하여, 6일째에서 피검 물질 α 10mg/kg 투여군, 피검 물질 VII-1 10mg/kg 투여군 및 100mg/kg 투여군, VII-2 10mg/kg 투여군 및 100mg/kg 투여군에 뒷다리 용적 및 증가율에서 유의한 저하 작용이 확인되었다. 이들의 결과는, 가장 부종이 악화될 때에 이들의 피검 물질이 억제적으로 효과를 발휘한 것을 나타낸다. 또한, 용적이 최대값에 달한 8일째에서, 대조군과의 용적률의 차이는, 양성 대조군의 MTX 투여군에서 -13.6%, 피검 물질 VII-1 10mg/kg 투여군 및 100mg/kg 투여군에서 각각 -21.2% 및 -26.4%, 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군 및 100mg/kg 투여군에서 각각 -13.8% 및 -29.3%이며, 대조군과 비교하여 유의차는 확인되지 않은 것의 부종에 대한 억제 효과가 확인되었다.

대조군의 임상 스코어는 2일째부터 악화되기 시작하여, 4일째 내지 6일째의 부종을 수반하는 스코어의 증가, 그 후 8일째 내지 14일째까지의 관절의 경화에 수반하는 2상성(相性)의 스코어의 증가가 확인되었다. 4일째 내지 6일째까지의 1상째에서는, 스코어의 유의차는 확인되지 않았지만, 피검 물질 α 10mg/kg 투여군, 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군 및 100mg/kg 투여군에서 대조군과 비교하여 스코어의 저하가 확인되었다. 8일째 내지 14일째까지의 2상째에서는, 피검 물질 α 10mg/kg 투여군, 피검 물질 VII-1 10mg/kg 투여군, 100mg/kg 투여군 및 양성 대조군의 MTX 투여군에서, 12일째 및 14일째에서 유의한 스코어의 개선 효과가 확인되었다. 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군 및 100mg/kg 투여군에서는, 10일째, 12일째 및 14일째에서 유의한 스코어의 개선 효과가 확인되었다. 대조군의 14일째의 스코어는, 앞다리 및 뒷다리의 스코어가 5개 예 모두 2 내지 3이며, 총 스코어는 10 내지 12이었던 것에 대하여, 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군 및 100mg/kg 투여군에서는 스코어 0을 확인한 예의 개수가 각각 4개 예이며, 총 스코어는 각각 4 내지 10 및 4 내지 8이었다.

이상의 결과로부터, 이 동물 모델에서의 피검 물질의 관절염 억제 효과는, VII-2≥VII-1≥α> a의 순이었다. 또한, 이들의 피검 물질의 관절염 억제 효과는 메토트렉세이트와 동일한 정도이거나 그것보다도 크고, 특히 VII-2 및 VII-1의 관절염 억제 효과가 컸다. 이 이유로서는, 피검 물질 VII-2 및 VII-1의 수용성이 높다는 것이 관련되어 있다고 생각되었다.

이들의 결과로부터, 본 발명의 펩타이드는, 임상에서 이미 사용되고 있는 의약품(메토트렉세이트)보다 우수한 관절염 억제 작용을 갖고 있고, 관절염 및 관련된 질환의 처치 및 예방에 유용하다는 것이 밝혀졌다. 한편, 메토트렉세이트는 미량의 사용으로도 중대한 부작용을 가져오는 것이 알려져 있다. 한편으로, 본 발명의 펩타이드는 천연 유래의 것이며, 상기 시험에서 부작용은 일체 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는, 안전성의 면에서도 종래 사용되고 있는 의약에 비하여 유리하다고 할 수 있다.

실시예 5

애주번트(adjuvant) 관절염 랫트 모델에 있어서의 본 발명의 펩타이드의 관절염 억제 작용

단클론 항체 칵테일 관절염 마우스 모델에 있어서 본 발명의 펩타이드가 양호한 염증 억제 효과를 나타내었기 때문에, 애주번트 관절염 랫트 모델에 있어서의 본 발명의 펩타이드의 염증 억제 효과에 대해서도 조사했다. 애주번트 관절염 모델은 전신성 염증을 평가하는 모델이며, 사람 관절 류마티즘의 병태에 가장 가까운 모델이라고 불리고 있다.

1. 재료 및 방법

1-1 랫트

수컷 Lewis/CrlCrlj(SPF)를 이용하여, 애주번트 유발 관절염에 대한 발명의 펩타이드의 관절염 억제 작용을 검토했다. 랫트 45마리를 닛폰 챨스 리버 주식회사로부터 구입하여, 보통 사료를 주어 7일간 순화하고 나서 사용했다(사용 개시 시의 체중 범위는 193.3g 내지 218.3g).

1-2 피검 물질

시험에 이용한 펩타이드의 아미노산 배열은 이하의 것이었다.

·D-아미노산(글리신 이외)으로 구성된 펩타이드 SP4: dPGdLdEdKdF(피검 물질 VII-2)

1-3 애주번트 관절염 모델의 작성

마노 막자 사발 상에서 결핵 사균(Mycobacterium butyricum; Lot No. 0260570, Difco)을 미분화 후, 유동 파라핀을 소량씩 가하여 섞으면서 1.0mg/mL가 되도록 유화시켰다. 수득된 유화액은 NK MICRONIZER(닛폰정기)를 이용하여 확실히 미세하게 유화되었음을 확인 후에 사용했다.

랫트의 오른쪽 뒷다리를 노출시켜, 오른쪽 뒷다리 족척(足蹠) 피내에 25G 주사 바늘 부착 시린지를 이용하여 상기 유화액 100μL를 주사(1회)하여 관절염을 야기했다(야기 0일). 음성 대조군에는 유동 파라핀을 동일하게 접종했다.

1-4 시험군 및 투여 방법

피검 물질의 조제 및 시험군은 표 5에 설명하는 대로였다. 각 군을 5마리로 했다.

동물은 각 군을 5마리로 하고, 투여액량은 전부 5ml/kg으로 투여했다.

메토트렉세이트 전(前)투여군을 제외하고, 애주번트 투여 후 10일째(야기 10일) 내지 21일째(야기 21일)까지 매일, 피검 물질을 투여했다(11회). 메토트렉세이트 전투여군에는 야기 전에 메토트렉세이트를 예방적으로 1회 투여하고, 야기일부터 매일, 메토트렉세이트를 투여했다(21회).

시험 일수의 표시 방법은 애주번트 접종일(야기 0일)을 기산일로 했다.

1-5 관찰 및 측정 방법

(i) 체중 측정

야기 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21일의 오전 중에 전체 생존예에 대하여 체중 측정했다.

(ii) 관절염 스코어의 측정

뒷다리만을 대상으로, 이하에 나타내는 기준에 따라서 평가했다.

발가락 관절의 종창(腫脹)에 대하여

0점: 종창 없음

1점: 2 발가락 이하의 종창

2점: 3 발가락의 종창

3점: 4 발가락의 종창

4점: 전체 발가락의 종창

뒷다리의 발등의 종창에 대하여

0점: 종창 없음

1점: 경도의 종창

2점: 중간 정도의 종창

3점: 약간 중증도의 종창

4점: 중증도의 종창

발적의 정도

0점: 발적 없음

1점: 경도의 발적

2점: 중간 정도의 발적

3점: 약간 중증도의 발적

4점: 중증도의 발적

(iii) 좌우 뒷다리의 발 용적의 측정

플레시스모메터(plethysmometer)(UNICOM TK105)를 이용하여 측정했다. 발 용적의 증가율(족척 종창율, paw swelling %)은 이하의 계산식에 의해 산출했다.

족척 종창율(%)=[(Vt-Vo)/Vo]×100

Vt: 애주번트 접종 후의 발 용적(mL)

Vo: 애주번트 접종 전의 발 용적(mL)(야기 0일에 측정)

한편, 본 시험에서는, 피검 물질에 의해 치료적 효과를 평가하기 위해서, 야기 10일에 대한 부종의 변화율도 계산했다.

(iv) 혈장 중의 TNF-α 및 IL-1β의 측정

TNF-α ELISA 키트(Lbis(등록상표) TNF-α-랫트) 및 IL-1β ELISA 키트(Quantikine(등록상표) Rat IL-1β/IL-1F2)를 이용하여 더블 포인트법으로 측정했다.

1-6 통계학적 해석

통계학적 해석

데이타는 평균±표준 편차로 나타내고, 음성 대조군과 양성 대조군의 검정에서는 분산에 균일성이 확인되지 않았기 때문에, Aspin-Welch의 t-검정에 의한 유의차 검정을 행했다. 양성 대상군에 대한 각 투여군의 유의차 검정에는 분산에 균일성이 확인되지 않았기 때문에, 논-파라메트릭 수법을 이용하여 Kruskal-Wallis 검정 후의 Dunnett형 다중 비교 검정으로 평가했다. p<0.05를 유의차 있는 것으로 했다.

2. 결과

2-1 동물의 체중 및 상태

음성 대조군에 비하여 각 야기군에서 약간의 체중의 증가 억제가 보였지만, 어떤 군도 유의한 억제가 아니었다. 시험 기간 중에 사망, 이상 및 부작용으로 보이는 증상을 나타내는 동물은 없었다.

2-2 발 용적 증가율(표 6a, 6b, 7a, 7b)

음성 대조군에서는 좌우 뒷다리 모두 성장에 수반하는 자연스러운 발 용적의 증가가 확인되어, 야기 21일에서의 발 용적 증가율은 왼쪽 뒷다리에서 9.20%, 오른쪽 뒷다리에서 7.65%가 되었다. 관절염 대조군에서는, 좌우 뒷다리 모두 애주번트에 의한 야기에 의한 경일(經日)적으로 현저한 발 용적의 증가가 확인되어, 모두 야기 3일 이후, 대조군과 비교하여 유의하며, 야기 21일에서의 발 용적 증가율은 왼쪽 뒷다리에서 22.03%, 오른쪽 뒷다리에서 53.04%가 되었다.

메토트렉세이트 전투여군에서는, 왼쪽 뒷다리에서 야기 14일까지는 음성 대조군과 같은 추이를 나타내고, 야기 14일만 유의한 증가 억제 효과가 확인되었지만, 야기 17 및 21일에서는 발 용적이 급격히 증가하여, 후자에서의 발 용적 증가율은 12.47%로 음성 대조군과의 차이가 벌어졌다. 또한, 오른쪽 뒷다리의 증가율에서는 경일적인 증가가 확인되었지만, 그 증가율은 관절염 대조군의 그것의 최대에서도 7할 이하이며, 야기 14일에서는 유의한 증가 억제 효과가 확인되었다.

야기 10일부터 투여를 시작한 메토트렉세이트 투여군에서는, 야기 10일에 대한 왼쪽 뒷다리의 발 용적 증가율이 야기 14일에서는 전혀 증가하지 않았지만, 야기 17일에서는 증가로 바뀌고, 야기 21일에서는 관절염 대조군의 그것과 동등해졌다. 오른쪽 뒷다리에서는, 야기 10 내지 21일의 기간에 있어서, 야기 14일에서는 유의한 저하를 나타내었지만, 그 밖의 일에서는 야기 10일에 대한 발 용적 증가율에는 큰 변화는 확인되지 않았다.

레플루마이드군에서는 야기 10일에 대한 좌우 뒷다리의 발 용적 증가율에는 큰 변화는 확인되지 않았지만, 야기 21일에서는 야기 10일에 대하여 모두 음의 값이 되었다.

피검 물질 VII-2의 10mg/kg 군에서는, 양 뒷다리에서 야기 14일부터 현저하고 유의한 발 용적 증가 억제가 확인되어, 야기 10일에 대한 왼쪽 뒷다리의 발 용적 증가율은 야기 14일, 17일, 21일에서는 각각 -4.0%, -7.2% 및 -6.8%가 되고, 오른쪽 뒷다리의 야기 10일에 대한 발 용적 증가율은 야기 14일, 17일, 21일에서는 각각 -6.4%, -9.9% 및 -9.7%가 되었다.

피검 물질 VII-2의 100mg/kg 군은, 그의 10mg/kg 군과, 양 뒷다리에서 거의 같은 추이를 나타내었지만, 야기 14일부터 현저하고 유의한 발 용적 증가 억제가 확인되어, 야기 10일에 대한 왼쪽 뒷다리의 발 용적 증가율은 야기 14일, 17일, 21일에서는 각각 -5.0%, -7.0% 및 -7.0%가 되고, 오른쪽 뒷다리의 야기 10일에 대한 발 용적 증가율은 야기 14일, 17일, 21일에서는 각각 -6.6%, -6.3% 및 -4.8%로, 야기 14일에서만 유의가 되었다.

2-3 발가락 관절의 종창의 스코어(표 8a, 8b)

음성 대조군에서는 좌우 뒷다리 모두 이상은 확인되지 않았다. 관절염 대조군에서는, 좌우 뒷다리 모두 야기 7일부터 스코어 변화가 확인되어, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 7일과 야기 14 내지 21일에 음성 대조군과 비교하여 유의하고 경일적인 스코어 상승이 확인되었다. 오른쪽 뒷다리에서는 야기 14 및 17일에 유의한 스코어 상승이 확인되었다.

메토트렉세이트 전투여군에서는, 좌우 뒷다리 모두 관절염 대조군보다 작은 스코어를 나타내었지만, 유의로 되는 관찰 시점은 없었다.

야기 10일부터 투여를 시작한 메토트렉세이트 투여군에서는, 좌우 뒷다리 모두 관절염 대조군보다 작은 스코어를 나타내었지만, 유의로 되는 관찰 시점은 없고, 메토트렉세이트 전투여군보다 낮은 스코어가 확인되었던 것은 좌우 뒷다리의 야기 17일뿐이었다.

레플루마이드군에서는 야기 10일의 투여 전에 확인된 좌우 뒷다리에서의 스코어 1.4 및 1.6을 경일적으로 저하시켜, 야기 21일에서의 스코어는 전자에서 0.4, 후자에서 0.6이 되었다.

피검 물질 VII-2의 10mg/kg 군에서도, 야기 10일의 좌우 뒷다리에서의 스코어 0.8 및 1.0을 경일적으로 저하시켜, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 17일 이후의 스코어는 0으로서 유의한 발가락 관절의 종창 감퇴 작용을 나타내었다. 오른쪽 뒷다리에서는, 야기 21일에서의 스코어는 0.2로 발가락 관절의 종창을 감퇴시켰다.

피검 물질 VII-2의 100mg/kg 군에서는, 야기 10일의 좌우 뒷다리에서의 스코어 0.6 및 1.0을 경일적으로 저하시켜, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 17일 이후 스코어는 0으로 유의한 발가락 관절의 종창 감퇴 작용을 나타내고, 오른쪽 뒷다리에서는, 야기 21일에서의 스코어는 0.2로 발가락 관절의 종창을 감퇴시켰다.

2-4 발등의 종창 스코어(표 9a, 9b)

음성 대조군에서는 좌우 뒷다리 모두 이상은 확인되지 않았다. 관절염 대조군에서는, 좌우 뒷다리 모두 야기 7일부터 스코어 변화가 확인되어, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 10 내지 21일에 음성 대조군과 비교하여 유의하고 경일적인 스코어 상승이 확인되었다. 오른쪽 뒷다리에서는 야기 7일 이후, 유의한 스코어 상승이 확인되었다.

메토트렉세이트 전투여군에서는, 좌우 뒷다리 모두 관절염 대조군보다 작은 스코어를 나타내고, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 10 및 14일에 관절염 대조군과 비교하여 유의한 스코어 저하가 확인되었다. 오른쪽 뒷다리에서는 야기 7일부터 14일까지 유의한 스코어 저하가 확인되었지만, 양 뒷다리 모두 야기 17일 및 21일의 스코어는 급격히 커졌다.

야기 10일부터 투여를 시작한 메토트렉세이트 투여군에서는, 야기 14일의 왼쪽 뒷다리에서만 스코어의 개선 경향을 나타낸 것 이외는, 관절염 대조군과는 차이가 없었다.

레플루마이드군에서는, 왼쪽 뒷다리에서 야기 10일의 스코어 0.6보다 낮은 스코어가 야기 14일 이후 확인되었지만, 오른쪽 뒷다리에서는 야기 10일의 스코어를 야기 14일 이후 악화시키지 않는다고 하는 정도였다.

피검 물질 VII-2의 10mg/kg 군에서는, 왼쪽 뒷다리의 야기 10일의 스코어가 0.2로 낮지만, 야기 14일 이후에는 스코어가 0이 되는 유의한 작용을 나타내고, 오른쪽 뒷다리에서는 야기 10일의 스코어 0.8을 야기 14일 이후 악화시키지 않았다.

피검 물질 VII-2의 100mg/kg 군에서는, 왼쪽 뒷다리의 야기 10일의 스코어 0이었지만, 야기 21일에 발등의 종창을 나타내는 1개 예가 확인되고, 스코어는 0.2가 되었다. 오른쪽 뒷다리에서는 야기 10일의 스코어 1.0을 야기 14일 이후 악화시키지 않고, 야기 17일까지는 유의하였다.

2-5 발적의 스코어(표 10a, 10b)

음성 대조군에서는 좌우 뒷다리 모두 이상은 확인되지 않았다. 관절염 대조군에서는, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 10일부터 스코어 변화가 확인되고, 야기 14일에 음성 대조군과 비교하여 유의한 스코어 상승이 확인되었다. 오른쪽 뒷다리에서는 야기 7일부터 스코어 변화가 확인되고, 야기 10 및 14일에 유의한 스코어 상승이 확인되었다.

메토트렉세이트 전투여군에서는, 좌우 뒷다리 모두 관절염 대조군보다 작은 스코어를 나타내었지만, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 14일에 관절염 대조군과 비교하여 유의한 스코어 저하가, 오른쪽 뒷다리에서는 야기 10 및 14일에 유의한 스코어 저하가 확인되었다.

야기 10일부터 투여를 시작한 메토트렉세이트 투여군에서는, 왼쪽 뒷다리에서는 관절염 대조군보다 작은 스코어를 나타낸 것은 야기 14일만이며, 오른쪽 뒷다리에서는 야기 14일 이후에 관절염 대조군보다 스코어는 작았지만, 모두 유의한 스코어 저하가 아니었다.

레플루마이드군에서는 야기 10일의 투여 전에 확인된 좌우 뒷다리에서의 스코어 0.8 및 1.2를, 왼쪽 뒷다리에서는 약간 저하시키는 경향을 나타내었지만, 야기 21일의 오른쪽 뒷다리에서의 스코어는 1.4로 상승했다.

피검 물질 VII-2의 10mg/kg 군에서는, 야기 10일의 왼쪽 뒷다리에서의 스코어 0.2를 야기 14일 이후에는 0으로 하는 유의한 발적 감퇴 작용을 나타내었지만, 오른쪽 뒷다리에서는 야기 17일까지 스코어는 변화되지 않고, 야기 21일에서 0.6으로 가까스로 저하되었다.

피검 물질 VII-2의 100mg/kg 군에서는, 왼쪽 뒷다리의 야기 10일의 스코어 0이었지만, 야기 17일 및 21일에 발적을 나타내는 각 1개 예가 확인되고, 모두 스코어는 0.2로 상승했다. 오른쪽 뒷다리에서는 야기 10일의 스코어 1.0을 야기 14일 이후 악화시키지 않았다.

2-6 스코어 합계(표 11a, 11b)

음성 대조군에서는 좌우 뒷다리 모두 이상은 확인되지 않았다. 관절염 대조군에서는, 좌우 뒷다리 모두 야기 7일부터 스코어 변화가 확인되고, 음성 대조군과 비교하여 유의한 스코어 상승이 확인되었다. 왼쪽 뒷다리의 스코어는 야기 14일에 최대 2.8에 달하며, 그 후 거의 변화하지 않았다. 또한, 오른쪽 뒷다리의 최대 스코어는 야기 17일의 5.8이었다.

메토트렉세이트 전투여군에서는, 좌우 뒷다리 모두 관절염 대조군보다 작은 스코어를 나타내었지만, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 10일과 14일에 관절염 대조군과 비교하여 유의한 스코어 저하가, 오른쪽 뒷다리에서는 야기 7일 및 10일에 유의한 스코어 저하가 확인되었다. 그러나, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 17일 및 21일에는 각각 1.4, 0.8로 높은 스코어를 나타내어 유의로는 되지 않았다. 오른쪽 뒷다리에서도, 마찬가지로 야기 14, 17 및 21일에는 각각 1.8, 3.2 및 2.8로 높은 스코어를 나타내어 유의로는 되지 않았다.

야기 10일부터 투여를 시작한 메토트렉세이트 투여군에서는, 왼쪽 뒷다리에서의 스코어는 야기 14, 17 및 21일에는 각각 1.2, 1.8 및 1.8로 높은 스코어를 나타내어 유의로는 되지 않았다. 오른쪽 뒷다리에서의 스코어도 야기 14, 17 및 21일에는 각각 3.6, 3.8 및 4.2로 높은 스코어를 나타내어 유의로는 되지 않았다.

레플루마이드군에서는 야기 10일의 투여 전에 확인된 좌우 뒷다리에서의 스코어 2.8 및 4.2를, 왼쪽 뒷다리에서는 야기 14일 이후 절반 이하로 저하시키는 경향을 나타내었지만, 유의로는 되지 않았다. 한편, 오른쪽 뒷다리에서는 야기 17일의 스코어는 2.0으로서 유의적으로 저하되었다.

피검 물질 VII-2의 10mg/kg 군에서는, 양 뒷다리 모두 야기 14일 이후에는 유의한 스코어 저하를 나타내었다.

피검 물질 VII-2의 100mg/kg 군에서는, 왼쪽 뒷다리의 야기 14일 이후에는 유의한 스코어 저하를 나타내고, 오른쪽 뒷다리에서는 야기 14일 이후에서 스코어의 저감 작용을 나타내어, 야기 14일 및 21일에서는 유의로 되었다.

2-7 혈장 중 IL-1β 및 TNF-α(표 12)

야기 21일에 동물을 부검하고, 혈장을 조제하여, 혈장 중 IL-1β 및 TNF-α 농도를 측정했다. 측정한 모든 군에서, TNF-α 농도는 검출 한계(8pg/mL) 이하였다.

한편, IL-1β 농도는 음성 대조군에서 20.6pg/mL이고, 관절염 대조군에서는 15.1pg/mL로 낮게 되었다. 메토트렉세이트 전투여군 및 야기 10일부터 투여를 시작한 메토트렉세이트 투여군에서는 각각 18.4pg/mL, 22.6pg/mL였다.

레플루마이드군에서는 13.0pg/mL로 낮은 값을 나타내었다.

피검 물질 VII-2는 10mg/kg 군 및 100mg/kg 군의 값은 각각 10.5pg/mL, 13.9pg/mL였다.

3. 고찰

피검 물질 VII-2의 항염증 작용을 확인하기 위해, 랫트를 이용한 애주번트 관절염 모델에 있어서의 관절염 스코어, 뒷다리 부종량, 및 애주번트 접종 21일 후의 동물로부터 얻은 혈장 중 TNF-α 및 IL-1β 양을 지표로 양성 대조약의 그것들과 비교 검토했다.

음성 대조군에서는 좌우 뒷다리 모두 성장에 수반하는 자연스러운 발 용적의 증가가 확인되고, 야기 21일에서의 발 용적 증가율은 왼쪽 뒷다리에서 9.20‰, 오른쪽 뒷다리에서 7.65%였다.

관절염 대조군에서는, 좌우 뒷다리 모두 애주번트에 의한 야기에 의해, 현저한 발 용적의 증가가 확인되고, 모두 야기 3일 이후, 경일적이고 유의적으로 증가됐다. 또한, 모든 스코어 증가는 야기 10일에는 왼쪽 뒷다리에도 확인되고, 뒷다리 용적의 증가뿐만 아니라, 류마티즘과 같은 면역 반응에 수반하는 염증이 양호하게 재현된 결과가 되었다.

메토트렉세이트를 야기 0일의 야기 전부터 투여한 메토트렉세이트 전투여군에서는, 왼쪽 뒷다리에서 야기 14일까지는 음성 대조군과 동일한 추이를 나타내고, 야기 14일에서는 유의한 증가 억제 효과가 확인되었지만, 그 후, 야기 17 및 21일에서는 발 용적 및 각 스코어가 급격히 증가했다. 본 모델이나 콜라겐 관절염 모델에서, 보통 확인되는 메토트렉세이트가 완전히 염증을 억제하지 않는다고 하는 결과를 양호하게 재현한 결과가 되었다.

야기 10일부터 투여를 시작한 메토트렉세이트의 치료적 투여군에서는, 뒷다리 용적은 야기 17일 이후에 증가로 바뀌고, 야기 21일에서는 관절염 대조군의 그것과 동등해졌다. 스코어에서도, 금번 사용한 피검 물질 중에서 제일 높고, 거의 관절염 대조군의 값에 가깝기 때문에, 메토트렉세이트의 치료적 투여는 유효하지 않다는 데이타를 재현할 수 있었다고 생각되었다.

레플루마이드군에서는 야기 10일에 대한 좌우 뒷다리의 발 용적 증가율에는 큰 변화는 확인되지 않았지만, 야기 21일에서는 야기 10일에 대하여 모두 가까스로 음의 값으로 된다고 하는 증가 억제를 나타낼 뿐이며, 강한 발 부종량 감소 작용은 확인할 수 없고, 또한, 스코어에서도 유의가 된 것은, 오른쪽 뒷다리에 있어서 야기 17일의 합계 스코어뿐이었다. 그러나, 야기 21일의 시점에서 악화됐다는 평가는 오른쪽 뒷다리의 발적 스코어만이며, 그것도 야기 10일의 투여 전에 확인된 오른쪽 뒷다리에서의 스코어 1.2가 1.4로 상승한 정도이며, 그 외는 모두 감소 경향을 나타내고 있기 때문에, 본 실험에서의 부종 억제 효과는 약하지만 약효는 충분히 발현되고 있는 것으로 생각되었다.

피검 물질 VII-2의 10mg/kg 군 및 피검 물질 VII-2의 100mg/kg에서는, 양 뒷다리에서 야기 14일부터 현저하고 유의한 발 용적 증가 억제를 나타내고, 그 효과는 마찬가지이고 또한 같은 정도의 항염증 작용이었기 때문에, 10mg/kg의 투여에서도 충분한 항염증 작용을 갖는 것으로 생각되었다. 특히, 오른쪽 뒷다리의 발 용적 증가 억제의 경향 때문에, 애주번트나 약제가 투여된 발에 나타나는 급성 염증과 면역성 염증의 복합예에도 항염증 작용을 갖는다는 것이 생각되었다.

관절 파괴의 지표로서의 발가락 관절의 종창에서는 피검 물질 VII-2의 10mg/kg 및 100mg/kg의 억제 효과는 강력하고, 야기 14일째 이후는 메토트렉세이트 전투여군, 메토트렉세이트 투여군 및 레플루마이드 투여군의 억제 효과와 동등하거나 그것을 상회하는 효과가 얻어졌다. 발등의 종창에 나타나는 부종의 경감 효과에서도 피검 물질 VII-2의 효과는 강하고, 야기 14일째 이후는 메토트렉세이트 전투여군, 메토트렉세이트 투여군 및 레플루마이드 투여군의 억제 효과와 동등하거나 그것을 상회하는 효과가 얻어졌다.

음성 대조군을 제외하고, 각 군을 야기 21일에서의 IL-1β 농도가 낮은 것으로부터 늘어놓으면, 피검 물질 VII-2의 10mg/kg 군, 레플루마이드 군, 피검 물질 VII-2의 100mg/kg 군, 관절염 대조군, 메토트렉세이트 전투여군 및 메토트렉세이트 군이 되고, 이것은 금번 시험에 있어서 야기 21일에서의 항염증 효과의 발현 상황을 그대로 반영하는 것이었다. 한편, 야기 21일에서의 혈장 중 TNF-α 농도는 전체 군에서 검출 한계(8pg/mL) 이하였다.

이들의 결과를 종합하면, 피검 물질 VII-2는 10mg/kg의 투여로, 100mg/kg과 동일한 강한 항염증 작용을 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 피검 물질 VII-2의 수용성이 높다는 것이 기여하고 있을 가능성이 있다. 그리고, 피검 물질 VII-2는, 야기 14일 이후는 메토트렉세이트 전투여군과 동등 또는 그 이상의 관절염 억제 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 또한, 피검 물질 VII-2는, 항류마티즘 약인 레플루마이드보다도 강력한 관절염 억제 효과를 나타낸다는 것도 확인되었다.

이들의 시험 결과로부터, 피검 물질 VII-2는, 메토트렉세이트나 레플루마이드와 동등 또는 그들을 상회하는 강한 관절염 억제 효과를 갖고, 특히 류마티즘 등의 면역성의 염증에 대하여 유효하다고 결론 지어졌다.

한편, 메토트렉세이트는 미량의 사용으로도 중대한 부작용을 가져온다는 것이 알려져 있다. 한편으로, 본 발명의 펩타이드는 천연 유래의 것이며, 상기 시험에서도 부작용은 일체 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는, 안전면에서도 종래 사용되고 있는 의약품과 비교하여 유리하다고 할 수 있다. 또한, 피검 물질 VII-2는, 10mg/kg의 투여량으로도 100mg/kg의 투여량에 손색없는 관절염 억제 효과를 갖고 있었다. 이들의 결과는, 피검 물질 VII-2 자체가 높은 유효성을 가질 뿐만 아니라, 그의 수용성이 높다는 것에 의한 것으로 생각되었다.

실시예 6

본 발명의 펩타이드의 면역 복합체 병 억제 작용의 검증

III형 알러지(아서스) 반응 유발 랫트 모델에 있어서의 본 발명의 펩타이드의 면역 복합체 병 억제 작용

1. 재료 및 방법

1-1 동물 및 실험 조작

7주령의 Slc:Wistar계 랫트의 수컷 42마리를 이용하여, 피검 물질 VII-2에 대하여, 복강 내 투여와 꼬리 정맥 내 투여의 각각으로 시험을 행했다. 순화는, 고형 보통 사료 CRF-1을 주어 6일 이상 행했다. 투여 전일에 동물의 등 부위를 전모(剪毛)하고, 투여 당일, 난백 Ovalbumin(MP Biomedicals제)(이하, 「OVA」)+에반스 블루 색소 혼합 용액을 꼬리 정맥 내 투여했다. 복강 내 투여할 때는 OVA+에반스 블루 색소 혼합 용액의 투여 30분 후에, 꼬리 정맥 내 투여할 때는 50분 후에, 피검 물질 용액을 각각 투여했다. 항OVA(Nordic immunological Laboratories제) 용액의 피내 투여에 대해서는, 피검 물질을 복강 내 투여하는 경우는 피검 물질 투여 30분 후에, 피검 물질을 정맥 내 투여하는 경우는 10분 후에, 동물의 등 부위에 0.1ml/부위의 용량으로 피내 투여하여, 국소적으로 아서스 반응을 야기시켰다. 야기 4시간 후, 동물을 안락사시켜 충분히 탈혈한 후에, 등 부위 피부를 박리했다. 박리한 피부의 아서스 반응 부위를 꿰뚫어, 그 피부로부터 에반스 블루 색소를 밤새 걸쳐서 추출했다. 누출 색소량은, 분광 광도계로 에반스 블루 색소에 관한 흡광도를 측정하고, 검량선을 이용하여 정량화했다.

1-2 대상 물질 및 피검 물질

음성 대조 물질은 생리 식염수, 양성 대조 물질은 하이드로코티손 용액으로 했다.

하이드로코티손 용액은, 소정량 칭량한 하이드로코티손을 막자 사발에 넣어 막자로 파쇄한 후, 최종 농도가 10mg/mL로 되도록 생리 식염액을 가함으로써 조제하고, 이것을 양성 대조 물질 투여액으로 했다.

피검 물질 용액은 이하와 같이 하여 조제했다.

소정량 칭량한 피검 물질 VII-2를 생리 식염액에 용해하여, 20mg/mL 용액으로 하고, 이것을 100mg/kg 복강 내 투여군의 투여액으로 했다. 10mg/kg 복강 내 투여군의 투여액은, 상기 투여액을 생리 식염액으로 10배 희석함으로써 2mg/mL 용액으로 하여 조제했다. 100mg/kg 꼬리 정맥 내 투여군의 투여액은, 소정량 칭량한 피검 물질 VII-2를 생리 식염액으로 용해하여, 50mg/mL 용액으로 한 것을 투여액으로 했다.

1-3 아서스 반응

OVA+에반스 블루 색소 혼합 용액을 2ml/kg 꼬리 정맥 내 투여했다. 복강 내 투여하는 경우는 OVA+에반스 블루 색소 혼합 용액의 투여 30분 후에, 꼬리 정맥 내 투여하는 경우는 50분 후에, 각 펩타이드 용액을 각각 투여했다. 항OVA 용액의 피내 투여에 대해서는, 복강 내 투여의 경우는 피검 물질 투여 30분 후에, 정맥 내 투여의 경우는 10분 후에, 동물의 등 부위에 0.1mL/부위의 용량으로 피검 물질 용액을 피내 투여하여, 국소적으로 아서스 반응을 야기시켰다. 피내 투여는 동물 1마리에 대하여, PBS 2개소(PBS(1), PBS(2)), 항OVA 용액 2개소(항OVA(1), 항OVA(2))로 했다. 야기 4시간 후에, 동물을 에터 마취 하의 단두에 의해 안락사시키고, 충분히 탈혈시킨 후에 등 부위 피부를 박리했다. 박리한 피부의 아서스 반응 부위를 펀치로 꿰뚫어, 색소 추출에 사용했다.

1-4 색소 추출 및 측정

펀치로 꿰뚫은 피부편 직사각형 상에 수개소의 벤 자국을 넣고, 2ml의 색소 추출액 중에 침지하여 10분간 진탕하며 교반했다. 그 후, 실온에서 밤새 정치했다. 밤새 정치한 후, 재차 10분간 진탕하며 교반하고, 원심 분리(1500rpm, 15분)를 행하여, 그 상청을 색소 측정용 시료로 했다. 측정에는 UV-1600(주식회사시마즈제작소)을 사용하고, OD 620nm의 파장에서 측정했다. 누출 색소량은, 색소량 표준 곡선으로부터 산출했다.

1-5 시험군

시험군은 이하와 같았다.

1-6 데이타의 처리 및 통계 처리

체중 측정치 및 누출 색소량에 대하여, 군 평균값(mean)±표준 편차(SD)를 산출했다. 누출 색소량에 대해서는, 항OVA 용액 투여 2개소의 평균값으로부터 PBS 투여 2개소의 평균값을 뺀 것을 각 동물의 값으로 했다. 누출 색소량에 대하여 이하의 통계 해석을 행했다.

피검 물질의 복강 내 투여 시험에서는, 각 군 사이에서 Bartlett의 등분산 검정을 행한 결과, 분산에 차이가 없었기 때문에, Dunnett의 다중 비교 검정으로, 음성 대조군과 그 외의 각 군 사이의 평균값의 차이를 검정했다. 음성 대조군과 양성 대조군 사이에서는 F 검정을 행한 결과, 분산에 차이가 있었기 때문에, Aspin-Welch의 t 검정으로 2군 사이의 평균값의 차이를 검정했다.

피검 물질의 꼬리 정맥 내 투여 시험에서는, 음성 대조군과 피검 물질 투여군 사이에서 F 검정을 행하고, 분산에 차이가 없기 때문에 Student의 t 검정으로, 2군 사이의 평균값의 차이를 검정했다. 유의 수준은 Bartlett의 등분산 검정에서는 5%, 그 외의 검정에서는 양측 5%로 했다.

2. 결과

2-1 동물의 체중 변화 및 일반적 상태

시험 기간 중 모든 군의 동물에서 순조로운 체중 증가가 보였다. 군 사이에서의 체중 변화에 유의차는 확인되지 않았다. 또한, 시험 기간 중 모든 동물에 대하여 일반 상태에 이상은 확인되지 않고, 부작용으로 생각되는 증상도 보이지 않았다.

2-2 누출 색소량 측정 결과 및 통계 처리 결과

동물의 각 아서스 반응 야기부(피내 투여 부위)에서의 누출 색소 농도(㎍/mL)를 산출했다. 산출한 각 부위의 누출 색소 농도를 이하의 계산식에 대입하여, 동물 1마리당의 누출 색소량(㎍/동물)을 산출했다.

* 계산식:[{(항OVA(1)+항OVA(2))/2}-{(PBS(1)+PBS(2))/2}]×2

2-2-1 복강 내 투여 시험 결과(도 16(a) 참조)

각 군에서의 누출 색소량 평균값(mean)±표준 편차(SD)는, 음성 대조 물질 투여군: 11.099±3.071㎍/동물, 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군: 8.705±1.116㎍/동물, 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군: 6.991±0.918㎍/동물, 양성 대조 물질 50mg/kg 투여군: 5.665±0.674㎍/동물이었다. 음성 대조 물질 투여군과 양성 대조 물질 투여군 사이에 유의차가 확인되었다(P=0.0157).

또한, 음성 대조 물질 투여군과 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군 사이에 유의차가 확인되었다(P=0.0094).

2-2-2 꼬리 정맥 내 투여 시험 결과(도 16(b) 참조)

각 군에서의 누출 색소량 평균값(mean)±표준 편차(SD)는, 음성 대조 물질 투여군: 10.816±2.093㎍/동물, 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군: 8.308±2.050㎍/동물이었다. 통계 처리의 결과, 음성 대조 물질 투여군과 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군 사이에 유의차는 확인되지 않았지만, 평균값에 대하여 약간의 낮은 값이 확인되었다.

3. 고찰

복강 내 투여 시험에서는, 양성 대조 물질(Hydrocortisone) 50mg/kg 투여군과 음성 대조 물질 투여군 사이에 유의한 억제 효과가 확인되었기(P=0.0157) 때문에, 동물 모델을 이용한 본 시험의 타당성에 문제는 없다고 생각되었다. 피검 물질 VII-2 10mg/kg 투여군에서는 아서스 반응에 대한 억제 효과에 유의차는 확인되지 않았지만(P=0.1765), 평균값에 차이가 보였다. 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군에서는 유의한 억제 효과가 확인되었다(P=0.0094). 꼬리 정맥 내 투여 시험에서는, 피검 물질 VII-2 100mg/kg 투여군에서는 아서스 반응에 대한 억제 효과에 통계학적인 유의차는 확인되지 않았지만(P=0.0920), 누출 색소량은 대조군과 비교하여 그 평균값보다도 낮은 값을 나타내어, 아서스 반응에 대한 억제 경향이 확인되었다.

이상으로부터, 피검 물질 VII-2는, III형 알러지(아서스) 반응에 대하여 억제 효과를 나타낸다는 것이 분명해졌다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는, 명확하고 충분한 면역 복합체 병 억제 작용을 갖고 있고, SLE, 사구체 신장염, 관절염, 혈관염 등의 면역 복합체 병의 처치 및 예방에 유용하다는 것이 밝혀졌다. 또한, 이 시험에서, 본 발명의 펩타이드를 투여한 것에 의한 이상이나 부작용은 모든 시험동물에서 보이지 않았다.

실시예 7

관절 류마티즘 환자의 골막 세포를 이용한 B 세포와의 공배양에 의한 IgG 생산에 대한 본 발명의 펩타이드의 억제 효과의 검증

류마티즘 관절에서, 골막 세포와 B 세포가 공존하여 서로 자극하여 염증성 물질인 IgG가 생산된다는 것이 알려져 있다. 그래서, 모델계를 이용하여 본 발명의 펩타이드의 IgG 생산 억제 효과에 대하여 조사했다.

1. 실험 방법

관절 류마티즘 환자의 골막 세포(Passage 3-7)를 24웰 플레이트에 살포하고(3×10⁴개/웰), 밤새 배양했다. 피검 물질 VII-2를 10㎍/ml가 되도록 첨가하고, 30분간 전처리를 행했다. 다음으로, B 세포를 첨가하여(1×10⁶개/웰), 골막 세포와의 공배양을 행했다. 5일간 배양하여, 상청을 회수하고, ELISA로 IgG 양을 측정했다(Human IgG EIA Kit(TaKaRa, #MK136)를 사용). 피검 물질 VII-2를 첨가하지 않고서 동일한 조작을 행한 계를 대조계로서 이용했다.

2. 결과

결과를 도 17에 나타낸다. 피검 물질 VII-2는 10㎍/ml 등의 저농도에서도 IgG의 생산을 대조의 약 4분의 3으로까지 억제한다는 것을 알 수 있었다. 게다가, 본 발명의 펩타이드가 골막 세포뿐 아니라, B 세포계의 활성화 억제에도 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는, 피검 물질 VII-2가 실제의 관절 류마티즘에서도 염증을 억제할 수 있다는 것을 나타내는 것이며, 상기의 실시예의 결과와도 모순되지 않는다.

본 발명에 의하면, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에 있어서, 보다 유용한 의약 조성물의 제공이 가능해진다. 수용성이 개선된 본 발명의 펩타이드를 상기 의약 조성물에 이용함으로써 종래와 비교하여 실질적인 투여량이 높아진 의약 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 의약 조성물은, 특히 관절염이나 류마티즘의 치료에 유효하다. 따라서, 본 발명은, 제약 분야, 연구용 시약 분야 등에서 이용 가능하다.

[배열표 프리-텍스트]

SEQ ID NO:1: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:2: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:3: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:4: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:5: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:6: Immunoglobulin bind ing peptide

SEQ ID NO:7: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:8: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:9: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:10: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:11: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:12: Immunoglobul in binding peptide

SEQ ID NO:13: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:14: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:15: Immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:16: Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:17: Nucleic acid encoding im munoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:18: Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:19: Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:20: Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:21: Nucleic acid e ncoding immunoglobulin binding peptide

SEQ ID NO:22: Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide

SEQUENCE LISTING <110> MMT CO., LTD. <120> Peptide having ability of binding to immunoglobulin <130> 670475 <150>?JP 2010-224211 <151>?2010-10-01 <160> 22 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 1 Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 2 Ala Gly Leu Tyr Tyr Phe 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 3 Pro Ala Leu Tyr Tyr Phe 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 4 Pro Gly Ala Tyr Tyr Phe 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 5 Pro Gly Leu Ala Tyr Phe 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 6 Pro Gly Leu Tyr Ala Phe 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 7 Pro Gly Leu Tyr Tyr Ala 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 8 Ser Thr Gly Lys Phe Thr Cys Lys Val Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 9 Pro Gly Leu Asp Lys Phe 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 10 Pro Gly Leu Asp Arg Phe 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 11 Pro Gly Leu Asp His Phe 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 12 Pro Gly Leu Glu Lys Phe 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 13 Pro Gly Leu Glu Arg Phe 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 14 Pro Gly Leu Glu His Phe 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin binding peptide <400> 15 Pro Gly Leu Ser Ser Phe 1 5 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide <400> 16 cccggtctcg ataaattc 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide <400> 17 cccggtctcg atcgtttc 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide <400> 18 cccggtctcg atcatttc 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide <400> 19 cccggtctcg aaaaattc 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide <400> 20 cccggtctcg aacgtttc 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide <400> 21 cccggtctcg aacatttc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding immunoglobulin binding peptide <400> 22 cccggtctct cttctttc 18

Claims (13)

1. 이뮤노글로불린 결합능을 갖는 펩타이드로서,
   Pro-Gly-Leu-X₄-X₅-Phe (I)
   (여기서, X₄ 및 X₅는 동시에 Tyr가 아닌 아미노산이다)
   로 표시되는 아미노산 배열을 갖는 펩타이드.
2. 제 1 항에 있어서,
   X₄ 및 X₅ 중 양쪽이 친수성 아미노산인 펩타이드.
3. 제 1 항에 있어서,
   X₄ 및 X₅가 독립적으로 Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Ser 및 Thr로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산인 펩타이드.
4. 제 1 항에 있어서,
   배열 번호 9 내지 15 중 어느 아미노산 배열을 갖는 펩타이드.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   식 (I)의 아미노산 배열 중의 1개 또는 복수의 아미노산(Gly를 제외한다)이 대응되는 D-아미노산으로 치환되어 있는 펩타이드.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   식 (I)의 아미노산 배열 중의 모든 아미노산(Gly를 제외한다)이 대응되는 D-아미노산으로 치환되어 있는 펩타이드.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드가 목적하는 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 부가되어 있는 융합 단백질.
8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 인코딩하는 핵산.
9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩타이드가 N 말단 및/또는 C 말단에 부가되어 있는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드, 제 7 항의 융합 단백질, 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산, 또는 제 8 항 또는 제 9 항의 핵산을 포함하는 벡터를 유효 성분으로서 포함하는, C1q와 이뮤노글로불린의 결합에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방용 의약 조성물.
11. 제 10 항에 있어서,
    질환이 관절 류마티즘인 의약 조성물.
12. 제 10 항에 있어서,
    질환이 전신성 에리테마토데스(SLE), 사구체 신장염, 혈관염, 관절염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 의약 조성물.
13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유효 성분이 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 펩타이드인 의약 조성물.

Images