KR100570846B1 - 안정한 활성 인체 ｏｂ 단백질 및 항체 ｆｃ 사슬 복합체를 함유하는 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 OB 단백질 조성물 및 그와 관련된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 생리학적 pH 에서 안정한 활성 OB 단백질 현탁액을 제공한다. 그러한 OB 단백질 현탁액은 비만 체중 수치, 당뇨병 및 다른 증상의 치료 또는 조절에 있어 유용하다.

Description

안정한 활성 인체 ＯＢ 단백질 및 항체 ＦＣ 사슬 복합체를 함유하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS COMPRISING CONJUGATES OF STABLE, ACTIVE, HUMAN OB PROTEIN WITH ANTIBODY FC CHAIN AND METHODS}

본 발명은 안정한 활성 인체 OB 단백질 조성물에 관한 것으로, 이러한 조성물은 농도가 높고 생리학적 pH 또는 그 부근의 pH 를 갖는다. 또한 본 발명은 조성물 및 이러한 조성물의 제조방법과 이용방법을 제공한다.

비만증에 대한 분자적 근거는 잘 알려져 있지 않지만, "OB 유전자" 와 코딩 단백질("OB 단백질")을 확인함으로써 체지방 침착을 조절하는 데에 신체 메카니즘을 이용하는 방법이 부분적으로 밝혀졌다[Zhang 등의 Nature 372 : 425 - 432 (1994) ; 및 Nature 374 : 479 (1995) 의 교정본 참조]. 발명의 명칭이 "체중 조절 인자, 그에 해당하는 핵산과 단백질 및 그것의 진단적 용도와 치료학적 용도" 이고, 1996 년 2 월 22 일자로 공개된 PCT 공개 번호 제 WO 96/05309 호에는 OB 단백질 및 이와 관련된 조성물 및 방법에 관하여 상세히 기술되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용되었다. 인체 OB 단백질에 대한 아미노산 서열은 제 WO 96/05309 호(본원에서 참고문헌으로 인용됨)의 서열 번호 : 4 및 6(공개의 p 172 - 174 에 기술되어 있음)에 기술되어 있으며, 성숙 단백질의 초기 아미노산 잔기는 22 에 위치하며 발린 잔기이다. 성숙한 단백질은 146 개(또는 위치 49 의 글루타민이 없을 경우에는 145, 서열 번호 : 6 참조)의 잔기로 이루어진다.

OB 단백질은 정상인 야생형 마우스는 물론 ob/ob 돌연변이 마우스(OB 유전자 산물 제조시에 결함으로 인해 비만해진 마우스)에서도 생체내 활성을 갖는다. 생물학적 활성은 무엇보다도 체중 감량으로 나타난다[Barinaga, "obese" Protein Slims Mice, Science 269 : 475 - 476 (1995) 및 Friedman, "The Alphabet of Weight Control," Nature 385 : 119 - 120 (1997) 개괄 참조]. 예를 들어, ob/ob 돌연변이 마우스에 있어서 OB 단백질 투여로 인해 혈청 인슐린 수준과 혈청 글루코스 수준이 감소하는 것으로 알려져 있다. 또한 OB 단백질을 투여하면 체지방이 감소하는 것으로도 알려져 있다. 이러한 현상은 비만이 아닌 정상 마우스 뿐만 아니라 ob/ob 돌연변이 마우스에서도 관찰되었다[Pelleymounter 등의 Science 269 : 540 - 543 (1995) ; Halaas 등의 Science 269 : 543 - 546 (1995) 참조]. 또한 Campfield 등의 Science 269 : 546 - 549 (1995) 문헌도 참조하라(OB 단백질의 마이크로그램 투여량을 말초 및 중추 투여하면 ob/ob 및 음식물에 의해 유래된 비만이지만 db/db 비만은 아닌 마우스의 체중 및 음식물 섭취가 감소된다). 그러나 이러한 보고서 중 어느 것에도 최고치의 투여량에서조차 독성에 관하여 관찰한 것은 없었다.

인체 주사용 약학적 조성물을 제조할 경우에, 인체 아미노산 서열은 약 2 mg 활성 단백질/ml 이상처럼 상대적으로 높은 농도로는 생리학적 pH 에서 불용성인 것으로 나타났다. 사람과 같은 고등 포유동물 내로 치료학적 유효량을 주사하기에는 .5 mg/kg/일 또는 1.0 mg/kg/일이나 그 이하의 범위와 같은 킬로그램 체중 당 밀리그램 단백질 투여량이 바람직하다. 주사량이 많아지는 것을 피하기 위해 단백질 농도를 증가시키는 것이 필수적인데, 이것이 환자에게 불쾌함이나 고통을 줄 수도 있다.

재조합 DNA 기술의 발달과 더불어, 치료학적 용도의 재조합 단백질의 이용성에서도 단백질 제제형이 발달되었다. 단백질 변이 및 융합 단백질에 관하여 기술하고 있는 논문에는 Francis, Focus on Growth Factors 3 : 4 - 10 (1992) 가 있다.

이러한 변이 중 하나는 면역글로불린의 Fc 부위를 이용하는 것이다. 항체는 두 개의 기능상 독립적인 부분을 포함하는데, 그 중 하나는 항원에 결합하는 가변 도메인으로서 "Fab" 로 알려져 있으며 다른 하나는 보체와 같은 효과 작용기나 식세포에 결합하는 불변 도메인으로서 "Fc" 로 알려져 있다. 면역글로불린의 Fc 부분은 긴 세포질 반감기를 갖는 반면에, Fab 의 반감기는 짧다[Capon 등의 Nature 337 : 525 - 531 (1989) 참조].

치료학적 단백질은 긴 반감기를 부여하거나 면역글로불린의 Fc 단백질에 모두 존재하는 Fc 수용체 결합 기능, 단백질 A 결합 기능, 보체 결합 기능 및 태반 전달 기능 등을 갖도록 Fc 도메인을 사용하여 구성하였다. 동일문헌을 참조하라. 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 부위를 호지킨병 종양 세포, 퇴행성 림프종 세포, T-세포 백혈병 세포 및 그외의 악성 세포 형태에서 발현되는 CD30 수용체에 결합하는 분자인 CD30-L 의 N-말단 단부에 융합시켰다[미국 특허 번호 제 5,480,981 호 참조]. 사이토카인의 짧은 혈행 반감기를 늘리기 위해 항-염증제이자 항-거부반응제인 IL-10 을 마우스의 Fcγ2a 와 융합시켰다 [Zheng, X. 등의 The Journal of Immunology, 154 : 5590 - 5600 (1995) 참조]. 인체 IgG1 의 Fc 단백질과 결합시킨 종양 괴사 인자 수용체를 패혈쇽 환자 치료에 이용하는 것에 관하여도 연구되었다[Fisher, C. 등의 N. Engl. J. Med., 334 : 1697 - 1702 (1996) ; Van Zee, K. 등의 The Journal of Immunology, 156 : 2221 - 2230 (1996) 참조]. 또한 Fc 를 CD4 수용체와 융합시켜 AIDS 치료용 치료 단백질을 생산하기도 하였다[Capon 등의 Nature, 337 : 525 - 531 (1989) 참조]. 그 외에도, 인터루킨 2 의 짧은 반감기를 극복하고 그것의 전신 독성을 완화시키기 위해 인터루킨 2 의 N-말단을 IgG1 또는 IgG3 의 Fc 부분과 융합시켰다 [Harvill 등의 Immunotechnology, 1 : 95 - 105 (1995) 참조].

인슐린의 경우, 현탁액 제제에 관하여 보고되어 있다. 그러나 인슐린에 적용할 수 있는 조건이 OB 단백질을 포함하는 다른 모든 단백질에 적용되는 것은 아니다. 인슐린은 특별한 물리학적·화학적 특성을 갖는 상당히 작은 단백질로서, 이러한 특성은 제제화 조건을 결정하는 데 있어 중요하다. Brange, Galenics of Insulin, Springer-Verlag 1987 문헌은 인슐린 현탁액에 관하여 기술하고 있다(p. 36) ; Schlichtkrull 등의 문헌 또한 참조하라. 지속적인 효과를 갖는 인슐린 제제에 관하여는 Hassellblatt 등의 Handbook of Experimental Pharmacology New Series, Vol. XXXII-1/2 Springer-Verlag Berlin, Heidelburg, New York (1975) 문헌의 pp. 729 - 777 에 기술되어 있다.

현재까지, 생리학적 pH 및 적어도 약 2 mg/ml 농도에서 안정한 인체 OB 단백질 제제에 관하여 보고된 것은 없으며, 더욱이 적어도 약 50 mg/ml 또는 그 이상의 농도에서 안정한 활성 인체 OB 단백질에 관하여 보고된 것은 없었다. 동결형이나 동결건조형은 보관시 보다 안정하지만, 본원에서 기술한 바와 같이 즉석에서 제조하여 사용하는 현탁액 형태보다는 덜 바람직하다. 동결형은 일정한 동결 온도에서 보관해야 하는데, 일반 소비자들이 사용하는 냉장고와 냉동기로는 그것의 해동 주기 때문에 일정한 온도를 유지하는 것이 불가능하다. 또한, 동결건조형은 희석 및 혼합 단계가 필요하므로 불편하고, 환자의 순응도를 떨어뜨릴 수 있다. 생산자의 입장에서 볼 때, 동결 액체를 제조, 보관 및 운송하는 비용이 비쌀 뿐 아니라 즉석에서 제조하여 사용하는 제제형보다 훨씬 복잡한 관리가 필요하다. 또한, 동결건조 제제형에 사용할 수 있는 적당한 희석액을 제조하는 것은 이러한 희석 단계를 필요로 하지 않는 것에 비해 비용도 많이 들 뿐 아니라 비효율적이다. 적은 부피로 주사할 수 있는 활성 OB 단백질을 함유하는 인체 약학적 조성물의 농축형의 필요성이 요구된다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 특정한 현탁액 제제형이 생리학적 pH 와 적어도 약 2 mg/ml 의 농도에서 안정한 OB 단백질의 제제라고 생각하는 관찰에서 유래한다. 본원에서 사용한 '생리학적 pH' 라는 용어는 약 6.0 내지 8.0 의 pH 를 나타낸다. 그러한 조성물을 사용하여 치료용 OB 단백질의 상대적 저용량을 적출하였다. 본원에서 상세하게 설명한 바와 같이, 침전제를 사용하여 다음과 같은 특징을 갖는 인체 OB 단백질의 현탁액을 제조하였다 :

1. 용액 형태의 인체 OB 단백질에 비해 향상된 생리학적 pH 에서의 안정성.

10 mg/ml 또는 그보다 높은 농도와 약 pH 7 에서의 인체 OB 단백질 현탁액은 하기 실시예에 설명되어 있다. 이 인체 OB 단백질 현탁액은 용해가능한 가장 높은 pH (생리학적 pH 가 아닌 천연형에서 인체 OB 단백질에 대한 pH 4)에서 동일한 농도의 용액과 비교했을 때 더 나은 HPLC 프로필을 갖는다. 또한 하기에 설명한, 5 mg/ml 의 농도와 약 pH 7 에서의 Fc-OB 융합 단백질 현탁액은 저장시에 비교되는 Fc-OB 융합 단백질 용액에서 보다 적은 분해산물을 나타낸다.

2. 용액 형태의 인체 OB 단백질과 비교한 인체 OB 단백질 현탁액의 주사 시기에 따른 서방성 프로필.

하기의 실시예에 본 발명의 고도로 농축된 인체 OB 단백질 현탁액을 사용한 서방성 효과를 기술하였다. 그러한 서방성 효과는 물질의 활성도가 상대적으로 오랜 기간동안 유지되며 용액 형태의 인체 OB 단백질에 비해 상대적으로 높은 효력을 나타내고 소량을 주사해도 된다는 점에서 유리하다.

따라서 본 발명의 목적은 적어도 약 2 mg 단백질/ml 농도를 나타내며 생리학적 pH 에서 안정한 활성 인체 OB 단백질 제제에 관한 것이다. 예를 들어, 적어도 2.0 mg/ml 의 농도와 pH 7.0 에서 활성 인체 OB 단백질의 안정한 제제가 제공된다. 상기 제한 농도는 인체에 투여가 유효한 현탁액 형태이며, 하기에 기술한 바와 같이, 실시예에서는 생리학적 pH(예를 들어, pH 6.0 내지 pH 8.0)에서 100 mg/ml 만큼 높은 농도를 제공한다.

다른 면에서, 본 발명은 적어도 약 10 mg/ml 농도를 나타내는 pH 범위가 약 6.0 내지 8.0 인 활성 인체 OB 단백질의 안정한 제제에 관한 것이다.

여전히 다른 면에서, 본 발명은 약 6.0 내지 8.0 의 pH 와 적어도 약 0.5 mg/ml 의 농도에서 면역글로불린의 Fc 부위를 부착하여 유도된 활성 인체 OB 단백질의 안정한 제제에 관한 것이다. 특히, 약 pH 7.5 와 5 mg/ml 내지 50 mg/ml 의 농도에서 활성 Fc-OB 융합 단백질의 안정한 제제를 제공한다.

또 다른 면에서, 본 발명은 2 mg 단백질/ml 또는 그보다 높은 농도와 pH 6.5 내지 7.5 에서 안정한 활성 인체 OB 단백질의 제제형을 제공한다. 특별히, 20 mg/ml 내지 100 mg/ml 의 농도와 pH 7.0 에서 안정한 활성 인체 OB 단백질의 제제형을 제공한다.

다른 면에서, 본 발명은 10 mg/ml 또는 그보다 높은 농도와 pH 5.0 내지 8.0 에서 안정한 활성 인체 OB 단백질의 제제형을 제공한다.

여전히 다른 면에서, 본 발명은 0.5 mg/ml 또는 그보다 높은 농도와 pH 6.0 내지 8.0 에서 면역글로불린의 Fc 부위를 부착하여 유도된 안정한 활성 인체 OB 단백질의 제제형을 제공한다. 특별히, 5 mg/ml 내지 50 mg/ml 의 농도와 약 pH 7.5 에서 안정한 활성 Fc-OB 융합 단백질의 제제형을 제공한다.

본 발명의 또다른 양상은 상기의 약학적 조성물, 그러한 조성물의 제조방법, 본 발명의 조성물을 사용한 치료방법 및 그러한 치료를 위한 본 발명의 조성물을 포함한 약제 제조방법을 포함한다.

도 1A 및 1B 는 실시예 1 의 본 발명의 인체 OB 현탁액(1A)과 실시예 1 에 기술한 바와 같은 대조 인체 OB 단백질 용액(1B)에 대한 마우스에서의 투여량 반응곡선을 나타낸 것이다.

도 2 는 본 발명의 OB 단백질 현탁액과 실시예 1 에 기술한 바와 같은 대조 인체 OB 단백질 용액에 대한 개에서의 OB 혈청 수준을 설명하는 그래프이다.

도 3 은 7 주 동안 37 ℃ 에서 인체 OB 단백질 제제형의 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 기록을 나타낸 것이다 : 실시예 1 의 인체 OB 단백질 아연 현탁액은 중간에 표시되어 있고, 실시예 1 의 대조 인체 OB 단백질 용액은 가장 위의 라인이며 -80 ℃ 에서 56 일 동안 보관한 인체 0B 단백질 현탁액은 가장 밑의 라인이다.

도 4 는 19 ℃ 에서 56 일 동안 보관한 인체 OB 단백질 제제형의 RP-HPLC 기록을 나타낸 것이다 : 실시예 1 의 인체 OB 용액은 제일 위의 라인이고, 실시예 2 의 결정형 인체 OB 현탁액은 중간 라인이며, -80 ℃ 에서 56 일 동안 보관한 실시예 2 의 결정형 인체 OB 현탁액은 제일 밑의 라인이다.

도 5A - 5C 는 인체 met Fc-OB 단백질의 DNA 서열(서열 번호 : 1)과 아미노산 서열(서열 번호 : 2)을 나타낸 것이다.

도 6A - 6C 는 인체 met Fc-OB 단백질 변이체의 DNA 서열(서열 번호 : 3)과 아미노산 서열(서열 번호 : 4)을 나타낸 것이다.

도 7 은 재조합 메티오닌 인체 Fc-OB 단백질에 대한 역상 HPLC 에 의해 결정된 바와 같이, asp 108 에서 이소 asp(서열 번호 : 4 의 번호 체계를 사용하는 asp 335) 형성 비율을 도시한 그래프이다.

단백질 성분이 액상 성분에서 침전되고 현탁되는 점에서, 본 발명의 안정한 활성 OB 단백질 조성물은 일반적으로 현탁액으로 분류된다. 조성물에는 활성 OB 단백질 성분, 침전제, pH 조절제 및 액상 담체가 포함된다. 본 발명의 OB 단백질은 비결정형이거나 결정형이다.

인체내 치료학적 또는 미용학적 조성물로 사용할 경우, 천연의 인체 OB 단백질(Zhang 등의, Nature, 상기문헌 참조)의 아미노산 서열과 선택적으로 박테리아 발현에 발생하는 N-말단 메티오닌 잔기를 함유한 OB 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용한 OB 단백질을 제조하기 위해 재조합 DNA 방법을 사용할 경우에 본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 출원 번호 제 WO 96/05309 호를 참조하라. 그러한 변화가 단백질의 전체적 접힘 또는 단백질의 활성도를 보존하는 한 선택한 아미노산에서 변화가 일어날 수 있다. 하기에 설명한 표 1 의 보존적 아미노산 치환은 특별한 특성[염기, 산, 극성, 소수성, 방향족, 크기 (소형)]으로 사용될 수 있다. 일반적으로 본원에서 참고문헌으로 인용한 Ford 등의 Protein Expression and Purification 2 : 95 - 107, 1991 을 참조하라. 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 - 25 개의 잔기를 갖는 소형 링커 펩티드 또는 폴리-히스티딘계, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인과 같이 정제를 촉진하는 소형 신장과 같은 소형 아미노 말단 신장은 본 발명에 사용될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 현탁액에서 향상된 안정성을 나타내는 인체 OB 단백질은 생리학적 pH 에 노출시, 용액에서 소수성 부위를 노출시킨다. 부가적으로, OB 단백질 성분에 면역글로불린의 Fc 부위를 접촉시켜 유도된 인체 OB 단백질은 본 발명의 현탁액에서 향상된 안정성을 나타낸다.

일반적으로, 면역글로불린의 Fc 부위를 유전학적 또는 화학적으로 인체 OB 단백질에 융합하였다. Fc 부위를 OB 단백질의 N-말단에 융합시키는 것이 바람직하다. 바람직한 Fc-OB 융합 단백질의 경우, 본원에서 참고문헌으로 인용한 계류 중인 1996 년 12 월 20 일자 미국 출원 번호 제 08/770,973 호를 참조하라.
바람직하게, 인체 면역글로불린 IgG-1 중쇄[Ellison, J.W. 등의 Nucleic Acids Res. 10 : 4071 - 7079 (1982) 참조]의 아미노산 서열을 갖는 Fc 부위를 사용하였다. 바람직한 Fc 부위는 서열 번호 : 2(도 5 참조)에서 설명하고 있다. 서열 번호 : 2 의 재조합 Fc-OB 서열은 378 개의 아미노산 Fc-OB 단백질(메티오닌 잔기를 포함하지 않음)이다. 도 5 에서 Fc-OB 단백질의 첫번째 아미노산 잔기인 글루탐산은 -1 위치에서 메티오닌을 갖는 +1 로서 언급된다. Fc 부분의 변이체 또는 유사체는, 예를 들어, 아미노산 잔기 또는 염기쌍의 다양한 치환으로 인해 생성될 수 있다.

Fc 서열의 이황화 교차 결합의 형성을 방지하기 위해, 시스테인 잔기를 삭제하거나 다른 아미노산으로 치환할 수 있다. 특히, 서열 번호 : 2 의 위치 5 에서 아미노산은 시스테인 잔기이다. 위치 5 에서 시스테인 잔기를 삭제하거나 하나 또는 그 이상의 아미노산으로 치환할 수 있다. 예를 들어, 위치 5 에서 시스테인 잔기 대신에 알라닌 잔기로 치환하여 변이체 아미노산 서열을 수득하였다. 마찬가지로, 서열 번호 : 2 의 위치 5 에서 시스테인은 세린 또는 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 삭제할 수 있다.

위치 1, 2, 3, 4 및 5 에서 아미노산의 삭제에 의해 제조된 변이체 또는 유사체는 373 개의 아미노산 Fc-OB 단백질(메티오닌 잔기를 포함하지 않음)을 생성하였다. 이러한 서열은 서열 번호 : 4(도 6 참조)에 나타나 있다. 이러한 위치에서 치환하는 것은 또한 가능하며 본 발명의 범주 내에 포함된다.

Fc 수용체 결합 부위와 보체(C1q) 결합 부위를 제거하도록 4 개의 아미노산 치환기를 도입하여 변형시켰다. 이러한 변이체 변형은 위치 15 에서 루이신이 글루탐산으로 치환되고, 위치 98 에서 글루탐산이 알라닌으로 치환되며, 위치 100 및 102 에서 리신이 알라닌으로 치환되는 것을 포함한다(서열 번호 : 4 의 번호 체계에 따름).

마찬가지로, 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기는 페닐알라닌 잔기로도 대체할 수 있다. 상기에 서술한 바와 같이, 그러한 변화가 융합 단백질의 전체 접힘 또는 활성도를 보존 하는 한 선택한 아미노산 에서 변화가 일어날 수 있다.

더욱이, Fc 부위는 또한 화학적이거나 다양한 길이의 아미노산인 "링커" 성분에 의해 Fc-OB 융합 단백질의 인체 OB 단백질에 연결될 수 있다. 그러한 화학적 링커는 본 분야에 잘 알려져 있다. 아미노산 링커 서열은 다음과 같은 것을 포함하지만 이에 국한된 것은 아니다 :

삭제

(a) ala, ala, ala ;

(b) ala, ala, ala, ala ;

(c) ala, ala, ala, ala, ala ;

(d) gly, gly ;

(e) gly, gly, gly ;

(f) gly, gly, gly, gly, gly ;

(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly ;

(h) gly-pro-gly ;

(i) gly, gly. pro, gly, gly ; 및

(j) (a) 항에서 (i) 항 까지의 조합.

본 발명의 침전제는 양이온 성분을 갖는 염일 수 있으며, 칼슘, 마그네슘, 아연, 나트륨, 철, 코발트, 망간, 칼륨 및 니켈 중에서 선택할 수 있다. 바람직하게, 염은 약학적 조성물에 사용할 경우 양립가능할 것이다.

침전제는 폴리에틸렌 글리콜 또는 다음 단락에서 설명한 것 같이 다른 수용성 중합체 같은 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 약학적으로 용인가능한 약물 중에서 대안적으로 선택할 수 있다. 유용한 침전제는 중성 pH 에서 OB 단백질의 침전을 유도하지만 생리학적으로 양립가능한 용매로 희석할 경우에는 가역적이거나 재용해된다. 적절한 침전제 없이, OB 단백질을 중성 pH 에서 생리학적으로 양립가능한 용매로 희석할 경우 가역적이지 않은 형태로 침전되었다.

바람직한 pH 범위는 약 pH 4.0 내지 8.0 이며, 더 바람직한 범위는 약 pH 6.5 내지 7.5 이다. 약학적 조성물에 대한 가장 바람직한 pH 는 본원에서 사용한 OB 단백질이 선택된 단백질 농도에서 최대의 생물학적 활성도를 보유할 수 있는 pH 를 말한다. 비-생리학적 pH 에서, 본 발명의 OB 단백질 현탁액은 또한 장점을 갖고 있다. 5.0 보다 낮은 pH 에서, 본 발명의 OB 단백질 현탁액은 동일 pH 용액에서 OB 단백질의 동일 농도보다 더 안정하다(보존기간의 관점에서). 예를 들어, pH 4.0 과 50 mg/ml 의 농도에서, 본 발명의 현탁액은 생체내 투여시 당량 용액에서보다 높은 생물학적 활성도를 나타낸다.

완충용액은 조성물을 침전시키는 특징을 변화시키지 않는 바람직한 pH 를 보유한 완충용액 중에서 선택할 수 있다. 바람직하게, 약학적 제제형에 대하여 완충용액을 사용한다. 트리스, MES 및 PIPES 는 비결정형과 결정형 둘 다에 사용할 수 있다. 인산염은 결정형에 대한 바람직한 완충용액이다.

용이한 치료학적 투여에 있어, 최종 현탁액의 농도는 5 mg/ml 내지 100 mg/ml 가 바람직하다.

이용방법

치료학. 치료학적 용도는 체중 조절, 당뇨병 치료 또는 예방, 혈지질 감소(및 관련 증상 치료), 제지방질량 증가 및 인슐린 감수성 증가를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 증상의 치료나 경감을 위한 하나 또는 그 이상의 약제 조제에 사용할 수 있다. 다른 방법도 있지만, 투여방법은 전형적으로 폐 수송으로 사용될 수 있는 주사를 이용한다. 예를 들어, 참고문헌으로 인용한 PCT 제 WO 96/05309 호, 페이지 83 et seq. 를 참조하라. 본 발명의 현탁액은 10 마이크론 또는 바람직하게 0.5 내지 5 마이크론보다 작은 평균 크기를 갖는 입자로 분무-건조 시킬 수 있다.

체중 조절. 본 발명의 조성물 및 방법은 체중 감소를 위해 사용할 수 있다. 다른 방법을 조사해 보면, 본 발명의 조성물은 바람직한 체중 또는 비만 수치를 유지하는데 사용할 수 있다. 마우스 모델에서 입증한 바와 같이(상기문헌 참조), 본 발명의 OB 단백질을 투여하면 체중이 감소한다. 체중 감소는 하기 부수적인 증상을 치료하는 것과 관계가 있으므로 치료학적으로 적용할 수 있다. 부가적으로, 본원의 미용학적 용도는 체중 조절로 외관을 좋게 하는 데에만 적합하다.

당뇨병 치료. 본 발명의 조성물 및 방법은 제 11 형 당뇨병 치료나 예방에 사용할 수 있다. 제 11 형 당뇨병은 비만과 상관관계가 있을 수 있으므로, 체중을 감소(또는 바람직한 체중을 유지 또는 비만 수치를 감소시키거나 유지)시키는 본 발명의 용도는 또한 당뇨병을 완화시키거나 당뇨병의 발생을 막을 수 있다. 더욱이, 체중을 감소시키기에 충분한 투여량이 아닐 경우 조차도, 본 발명의 조성물은 당뇨병을 예방하거나 완화시키는데 시용할 수 있다.

혈지질 조절. 본 발명의 조성물 및 방법은 혈지질 수준 조절에 이용할 수 있다. 관념적으로, 혈지질 수준이 감소하는 것만이 바람직하거나 혈지질 수준을 유지시키는 것이 바람직한 상황에서의 투여량은 체중을 감소시키기에는 불충분할 것이다. 따라서 비만 환자 치료의 초기 단계에서 체중을 감소시키는 투여량을 투여하면 부수적으로 혈지질 수준이 감소될 것이다. 일단 체중이 충분히 감소되면, 체중이 늘어나는 것은 막되 원하는 혈지질 수준을 유지시키기에 충분한 투여량을 투여하거나, 본원에서 설명한 바와 같이 다른 상태로 투여할 수 있다. 이들 투여량은 OB 단백질의 효과가 가역적이므로 실험에 근거하여 결정할 수 있다. 예를 들어, Campfield 등의 Science 269 : 546 - 549 (1995), 547 을 참조하라. 따라서, 체중 감소를 원하지 않을 때 체중 감소를 야기시키는 투여량이 관찰되면, 원하는 혈지질 수준은 이루되 바람직한 체중을 유지시키기 위해 보다 적은 양을 투여해야 한다. 예를 들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 공개 제 WO 97/06816 호를 참조하라.

제지방질량 증가 또는 인슐린 감수성 증가. 관념적으로, 제지방질량 증가만을 원하는 경우에, 투여량은 체중을 감소시키기에는 불충분할 것이다. 따라서 비반 환자 치료의 초기 단계에서 체중을 감소시키는 투여량을 투여하면 부수적으로 지방 조직이 감소되고 제지방질량이 증가할 것이다. 일단 체중이 충분히 감소되면, 체중이 다시 늘어나는 것은 막되 원하는 제지방질량을 증가(또는 제지방질량이 감소하는 것을 막음)시키기에는 충분한 투여량을 투여할 수 있다. 각 개체의 인슐린 감수성을 증가시키기 위해, 유사한 투여량 조건이 고려될 것이다. 체중은 감소하지 않으면서 제지방질량이 증가되면, 당뇨병 치료를 위해 각 개체에 투여하는 인슐린(또는 잠재적으로 아밀린 및 아밀린 길항물질 또는 작용물질 혹은 티아졸리딘디온류나 그 외의 가능한 당뇨병 치료 약물)의 양을 충분히 감소시킬 수 있다. 전반적인 효력을 증가시키기 위해, 유사한 투여량 조건이 고려될 것이다. 전반적으로 효력 증가와 함께 부수적으로 제지방질량을 증가시키려면 체중 감소를 야기시키기에 불충분한 투여량을 사용하면 될 것이다. 적혈구 증가(및 혈액 내 산소첨가) 및 골흡수 감소 또는 골다공증과 같은 그 외의 효과 또한 체중을 감소시키지 않고 얻을 수 있다. 본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 공개 제 WO 97/18833 호를 참고하라.

조합 치료. 본 발명의 조성물 및 방법은 식이 변화 및 운동과 같은 다른 치료와 연합하여 사용할 수 있다. 당뇨병 치료에 유용한 약제[예를 들어, 인슐린 및 이용가능한 아밀린과 아밀린 길항물질 또는 작동물질 혹은 티아졸리딘디온류(본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 공개 제 WO 98/08512 를 참조하라)나 그 외의 가능한 당뇨병 치료 약물], 콜레스테롤 및 혈압강하제(예를 들어, 혈지질 수준을 감소시키는 약제 또는 그 외의 심혈관 약제), 활성을 증가시키는 약제(예를 들어, 암페타민), 이뇨제(액상의 배설물을 위한 것) 및 식욕 억제제(신경펩타이드 γ 수용체에 작용하는 약제나 세로토닌 재흡수 억제제 같은 것)과 같은 약제이 있다. 이러한 약제의 투여는 동시에 또는 순차적으로 실시할 수 있다. 게다가 본 발명의 방법은 신체의 종합적인 외관을 변화시키기 위해 계획된 미용외과수술(예를 들어, 체중 감소를 위해 계획된 지방흡입이나 레이저 수술 또는 체중의 외관을 증가시키기 위해 계획된 이식 수술)과 같은 외과수술 과정과 연합하여 사용할 수 있다. 동맥반과 같은 지방 침착물에 의해 혈관이 차단됨으로써 야기되는 유독 상태를 완화시키기 위해 계획된 바이패스외과수술 또는 그 외의 외과수술과 같은 심장외과수술의 건강상의 이점은 본 발명의 조성물 및 방법의 부수적인 이용을 증가시킬 것이다. 초음파나 레이저같이 담석을 제거하는 방법 또한 본 발명의 치료방법을 사용하기 전이나 사용중에 또는 그 후에 사용할 수 있다. 더욱이 본 발명의 방법은 골절, 근육 손상 치료나 외과수술 또는 제지방 조직 질량을 증가시킴으로서 개선되는 다른 치료법에 대해 보조적으로 사용할 수 있다.

다음의 실시예들은 본 발명을 좀 더 충분히 설명하고자 하는 것이지, 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 실시예 1 은 pH 7.0 에서 100 mg/ml 의 농도인 비 결정형(다음 실시예에 나오는 결정형에 대조되는 것) 인체 OB 단백질 현탁액의 제조를 설명하는 것이다. 실시예 2 는 결정형 OB 단백질 현탁액의 제조를 설명하는 것이다. 실시예 3 은 OB 단백질 용액에 비해 개선된 OB 단백질 현탁액의 투여량 반응을 입증한 것이다. 실시예 4 는 개를 모델로 본 발명 현탁액의 시간 지연에 따른 작용 프로필을 입증하는 것이다. 실시예 5 는 비 결정형 Fc-OB 단백질 현탁액의 제조를 설명하는 것이다. 실시예 6 및 7 은 본 발명 현탁액의 향상된 안정성을 입증하는 것이다.

실시예 1 : 비 결정형 OB 단백질 현탁액의 제조.

이 실시예는 본 발명의 인체 OB 단백질 현탁액중 하나의 제조를 설명하는 것이다. 비 결정형 인체 OB 단백질 현탁액은 아연염과의 침전반응에 의해 제조되었다. 6.0 에서 8.0 의 최종 pH 에서 액체의 농도가 100 mg 단백질/ml 가 되게 하였다. pH 4.0 인 인체 OB 단백질 용액을 대조 조성물로서 사용하였다.

조성물 :

단백질 성분 : 아미노산 번호 22(Val)에서 시작하여 아미노산 번호 167 에서 끝나며 N-말단에 메티오닌 잔기를 갖는, PCT 공개 제 WO 96/05309 의 서열 번호 : 4 에 기술되어 있는 재조합 메티오닌 인체 OB 단백질("rmetHu-렙틴") :

침전제 : 염화아연

완충액 : 트리스, MES 및 PIPES

최종 pH : 6.0 - 8.0

제조 프로토콜 : 재조합 메티오닌 인체 OB 단백질("rmetHu-렙틴") 용액을 주사하기 위해 물에 넣어 약 40 mg/ml 로 농도를 조정하고, HCl 로 pH 3.0 이 되도록 산성화 하였다. 염화아연을 첨가하고, 생성한 현탁액은 적절한 완충액을 첨가하여 거의 중성 pH(대략 pH 7.0)로 조정하였다. 트리스, MES 및 PIPES 완충액이 잘 사용된다. 완충액 10 - 15 mM, 아연 20 - 1000 μM, pH 6.0 - 8.0 및 rmetHu-렙틴 10 mg/ml 가 전형적인 최종 조건이다. 4 ℃ 에서 여러시간 놓아두어 작은 분자들을 침전시키고 상층액을 제거하여 현탁액을 농축시킨다. 이 과정은 최대 농도가 얻어질때까지 여러차례 반복해야 하고, 이 과정을 통해 약 100 mg/ml 의 현탁액을 수득하였다.

대조 조성물 : 대조 조성물로서는 10 mM 아세테이트 및 5 % w/v 소르비톨을 포함하는 pH 4.0 의 20 mg/ml 재조합 메티오닌 인체 OB 단백질(상기한 것과 같은) 용액을 사용한다.

실시예 2 : 결정형 OB 단백질 현탁액의 제조.

이 실시예는 본 발명의 결정형 OB 단백질 현탁액의 제조를 설명하는 것이다.

단백질 성분 : 상기의 실시예 1 에서 사용한 재조합 메티오닌 인체 OB 단백질.

과정 : 4 ℃ 에서, 1 mM HCl 에 용해되어 있는 15 mg/ml 농도의 rmetHu-렙틴과 4 M NaCl, 100 mM 트리스, pH 8.5, 2 % v/v 에탄올을 1 : 1 비율로 혼합한다. 온도를 몇 시간에 걸쳐 서서히 14 ℃ 내지 25 ℃ 로 조정하고, 최종 온도에서 가온 기간을 적어도 2 시간 동안 유지함으로써 자연스럽게 결정을 형성한다. 결정형을 안정화시키는 적절한 용매에서 원심분리 및 재현탁에 의해 얻어진 결정을 주사하기 위해 "모액"(즉, 결정형을 얻어낸 액체)을 좀더 안정한 용매로 바꾸어 준다. 적절한 대체 용매에는 20 - 25 % 폴리에틸렌 글리콜(대략 4,000 달톤에서 20,000 달톤의 분자량을 갖는 것으로, "대략" 이라는 말은 공업용 PEG 제제의 평균 분자량을 의미한다), 바람직하게 pH 6.0 내지 pH 8.0 의 적절한 중성 pH 완충제 및 pH 6.0 내지 pH 7.5 의 10 mM 인산염 완충액, 2 % 에탄올 v/v 가 있다. 제조시에 일반적으로, 대개 0.25 M 이하의 잔류 염이 남을 수 있다.

실시예 3 : OB 단백질 용액에 비해 개선된 OB 단백질 현탁액의 투여량 반응.

이 실시예는 OB 단백질 현탁액이 용액상의 OB 단백질보다 좀 더 효능이 있다는 것을 입증하는 것이다. 정상인 제지방 마우스에게 본 발명의 현탁액과 OB 단백질 용액을 체중의 kg 당 단백질 1, 10 및 50 mg 씩 같은 양을 5 일간 매일 주사하였다. 주사한 OB 단백질의 질량 단위 당 체중은 동량의 용액상의 제제형을 주사한 마우스보다 현탁액을 주사한 마우스에서 더 많이 감소했다. 이것은 도 1A 및 도 1B 에 나타나 있다. 도 1A 는 실시예 1 의 현탁액을 주사했을 때의 체중 변화율을 보여준다. 도 1B 는 실시예 1 의 대조용액을 주사했을 때의 체중 변화율을 보여준다.

이것은 같은 양을 투여시 본 발명의 현탁액이 용액 형태로 주사한 것보다 좀 더 효능이 있다는 것을 설명한다. 특정의 이론과 결부시키려는 것은 아니지만, 현탁액과 용액을 비교하였을때 현탁액의 흡수율이 더 느리기 때문일 것이다. 현탁액은 혈액으로 들어가기 전에 용해 되는데, 이러한 서방성 효과는 더 높은 효능을 야기한다. 질량을 기준으로 했을때, 현탁액은 용액보다 더 적은 양의 단백질을 투여할 수 있다. 게다가, 5 일째의 용액투여시(투여 마지막 날) 10 에서 50 mg/kg 의 투여량 사이에서 차이점이 없었다(아래의 표 2 참조). 현탁액이 용액상의 제제형보다 보다 더 명확한 반응 곡선을 보여준다.

방법 :

동물 : 정상인 CD-1 마우스를 사용.

표준체중 : 약 20 그램.

투약 : 5일간 같은 장소에서 SC 를 각각 주사하였다.

취급 : 동물은 무리지어 수용하고, 임의로 먹이를 주었다.

조성물 :

용액 : 실시예 1 에서 사용된, 20 mg/ml 농도의 rmetHu-렙틴 용액

현탁액 : 실시예 1 에서 사용된, pH 7.0, 10 mM MES 완충액, 500 mM 아연, 20 mg/ml 조건의 rmetHu-렙틴 현탁액.

PBS : 인산염완충식염수가 위약으로 사용되었다(단백질이 없이 PBS 와 유사한 현탁액상 또는 용액상만을 대조군으로 사용한 반응, 데이터는 나타내지 않음).

실시예 4 : 개에서의 OB 단백질 혈청 수치.

이 실시예는 본 발명 현탁액의 시간 지연에 따른 작용 프로필을 입증하는 것이다.

방법 : 비글(사냥개 종류)에게 rmetHu-렙틴 현탁액 또는 용액을 투여한다. 혈청을 뽑아서 도 2 에 나타낸 것처럼 시간마다 OB 단백질 수치를 잰다.

사용된 조성물 :

용액 : 실시예 1 에서 사용된 용액, 5 mg/kg/일.

현탁액 : 실시예 2 에서 사용된 현탁액을 사용. 표 참조.

동물 : 표 3 에 나타난 데이터는 3 마리의 평균치이다.

동물은 정상인 비글이다.

취급 : 동물들을 각각 개별 수용하고, 임의로 먹이를 주었다.

효과적인 동물 취급 경험을 따른 것이다.

분석 : Hotta 등의 J. Biol. chem 271 : 255327 - 25331 (1996)에서 처럼 항체 분석법을 사용하였다.

결과 : 도 2 에서 보는 바와 같이, 용액의 농도는 단백질 투여 후 1 - 2 시간 지점에서 피크에 도달했으나, 현탁액의 농도는 훨씬 뒤늦은 10 - 12 시간 후에 피크에 도달한다. 이것은 현탁액이 더 장기간 동안 최소의 효과량을 지속한다는 것을 입증하는 것이다.

실시예 5 : 비 결정형 Fc-OB 단백질 현탁액의 제조.

이 실시예는 본 발명의 인체 Fc-OB 단백질 현탁액 중 하나의 제조를 설명하는 것이다. 비 결정형 인체 Fc-OB 단백질 현탁액은 아연염과의 침전반응에 의해 제조되었다. pH 7.5 인 인체 Fc-OB 단백질 용액을 대조 조성물로서 사용하였다.

조성물 :

단백질 성분 : 아미노산 1 - 227 을 가지는 단백질의 Fc 부분과 아미노산 228 - 373 을 가지는 단백질의 인체 OB 단백질 부분을 포함하는 373 개의 아미노산 융합 단백질이며 N-말단에 메티오닌 잔기를 가지는, 서열 번호 : 4 에 기술되어 있는 재조합 메티오닌 인체 Fc-OB 단백질("rmetHu-Fc-렙틴") :

침전제 : 염화아연

완충액 : 100 mM 트리스

최종 pH : 7.5

제조 프로토콜 : rmetHu-Fc-렙틴 용액은 100 mM 트리스 완충액으로 약 5 mg/ml 로 농도를 조정하고, pH 7.5 로 맞춘다. 현탁액을 형성하기 위해 염화아연을 첨가하였다.

대조 조성물 : 대조 조성물로서는 100 mM 트리스를 포함하는 pH 7.5 의 5 mg/ml rmetHu-Fc-렙틴 용액을(상기한 것과 같은) 사용한다.

실시예 6 : 본 발명의 인체 OB 단백질 현탁액의 안정성.

이 실시예는 본 발명의 비 결정형 및 결정형의 현탁액이 좀 더 향상된 안정성 분석 조건하에서 용액상의 물질보다 더 안정하다는 것을 입증하는 것이다.

도 3 은 7 주간 37 ℃ 에서, 본 발명 현탁액의 아연 비 결정형과 (실시예 1 에 기술한 것) 용액형(실시예 1 에 기술한 것)을 비교한 RP-HPLC 기록을 나타내는 것이다. 보는 바와같이, 본 발명 현탁액은(가운데 라인) 용액형(제일 위의 라인) 보다는 낮은 피크를(분석 결과 낮게 나타남) 보인다. 제일 아래의 라인은 대조군으로서, 7 주간 -80 ℃ 에서 보관한 아연 비 결정형의 분석을 나타낸다.

도 4 는 실시예 2 의 결정형 현탁액과 용액형(실시예 1 의 것)을 비교한 RP-HPLC 기록을 나타내는 것이다. 시료는 19 ℃ 에서 56 일간 보관되었다(결정형은 37 ℃ 에서 자신의 결정 구조를 잃어버리므로, 37 ℃ 에 보관하는 것은 적당한 조건이 아니다). 도 4 는 현탁액형 (주 피크 = 94 %)보다 용액형(주 피크 = 86 %)에서 더 분해된 형태의 피크를 보인다. 제일 아래의 라인은 대조군으로서 -80 ℃ 에서 56 일간 보관된 결정형의 분석을 나타낸다. 분해가 더 천천히 일어난다 하더라도, 4 ℃ 에서 관찰되는 결과는 유사하다.

주요 분해 산물은 아미노산 108 번에 위치하는 염 형태의 아스파르트산으로 여겨진다(PCT 출원 제 WO 96/05309 에 기술된 서열 번호 : 4 에 따르면, "Val" 잔기를 위치 번호 1 로 사용한다). 분자의 안정성을 향상시키는 다른 아미노산처럼, 이 위치에서 좀 더 안정한 화학 성분을 실험적으로 선별할 수 있다. 종합하면, 본 발명의 현탁액은 용액상의 OB 단백질보다 더 안정하다.

실시예 7 : 본 발명의 인체 Fc-OB 단백질 현탁액의 안정성.

이 실시예는 본 발명의 Fc-OB 단백질 현탁액이 좀 더 향상된 안정성 분석 조건하에서 용액상의 물질보다 더 안정하다는 것을 입증하는 것이다.

본 발명 현탁액의 아연 비 결정형(실시예 5 에 기술된 것)과 용액형 (실시예 5 에 기술된 것)을 4 ℃, 29 ℃ 및 37 ℃ 에서 2 주간 보관하여 안정성 연구를 실시하였다. 도 7 에서 보는 바와 같이, 29 ℃ 및 37 ℃ 에서 보관된 Fc-렙틴 현탁액이 각각 같은 온도에서 보관된 Fc-렙틴 용액형보다 OB 단백질의 아미노산 108 번에 위치하는 염 형태의 아스파르트산과 관련있는 분해 산물의 비율이 더 낮게 나타났다.

* * *

본 발명은 상기에 기술되어 있으나, 본 분야의 숙련된 기술자들에 의한 변형 및 수정이 일어날 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 범주내에 속하는 모든 등가의 변형물을 첨부한 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> Stable, Active, Human OB Protein Compositions and Methods <130> A-448A <140> 09/059,467 <141> 1998-04-14 <150> 08/843,971 <151> 1997-04-17 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1150 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (4)..(1140) <220> <221> mat_peptide <222> (7)..(1140) <220> <221> sig_peptide <222> (4)..(6) <400> 1 cat atg gaa ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 48 Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys -1 1 5 10 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 96 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 15 20 25 30 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 144 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 192 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 240 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 288 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 80 85 90 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 336 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 95 100 105 110 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 384 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 432 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 480 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 528 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 160 165 170 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc 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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 80 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 160 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln 225 230 235 Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp 240 245 250 255 Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu 260 265 270 Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp 275 280 285 Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg 290 295 300 Asn Val Ile Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu 305 310 315 His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly 320 325 330 335 Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr 340 345 350 Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp 355 360 365 Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 375 <210> 3 <211> 1135 <212> DNA <213> Human <220> <221> CDS <222> (4)..(1125) <220> <221> mat_peptide <222> (7)..(1125) <220> <221> sig_peptide <222> (4)..(6) <400> 3 cat atg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc 48 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu -1 1 5 10 ctg ggg ggt cct tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 96 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 15 20 25 30 ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 144 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 192 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 240 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 65 70 75 acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 288 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 80 85 90 aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 336 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 95 100 105 110 ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 384 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag 432 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 130 135 140 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 480 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg 528 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 160 165 170 cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 576 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 175 180 185 190 acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 624 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 672 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 ctg tct ccg ggt aaa gta ccg atc cag aaa gtt cag gac gac acc aaa 720 Leu Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 225 230 235 acc tta att aaa acg atc gtt acg cgt atc aac gac atc agt cac acc 768 Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 240 245 250 cag tcg gtg agc tct aaa cag aaa gtt aca ggc ctg gac ttc atc ccg 816 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 255 260 265 270 ggt ctg cac ccg atc ctg acc ttg tcc aaa atg gac cag acc ctg gct 864 Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 275 280 285 gta tac cag cag atc tta acc tcc atg ccg tcc cgt aac gtt atc cag 912 Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln 290 295 300 atc tct aac gac ctc gag aac ctt cgc gac ctg ctg cac gtg ctg gca 960 Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 305 310 315 ttc tcc aaa tcc tgc cac ctg cca tgg gct tca ggt ctt gag act ctg 1008 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 320 325 330 gac tct ctg ggc ggg gtc ctg gaa gca tcc ggt tac agc acc gaa gtt 1056 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 335 340 345 350 gtt gct ctg tcc cgt ctg cag ggt tcc ctt cag gac atg ctt tgg cag 1104 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 355 360 365 ctg gac ctg tct ccg ggt tgt taatggatcc 1135 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 <210> 4 <211> 374 <212> PRT <213> Human <400> 4 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu -1 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 80 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 160 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr 225 230 235 Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln 240 245 250 255 Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly 260 265 270 Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val 275 280 285 Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile 290 295 300 Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe 305 310 315 Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp 320 325 330 335 Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 340 345 350 Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu 355 360 365 Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370

Claims (14)

1. 6.0 내지 8.0 의 pH 및 적어도 0.5 mg/ml 의 농도를 갖는, OB 단백질 성분의 N-말단에 면역글로불린의 Fc 부위를 결합시켜서 유도한 인체 OB 단백질 현탁액.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 인체 Fc-OB 단백질의 Fc 부분은 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액 :

   (a) 서열 번호 : 2 및 4 에 나타나 있는 Fc 아미노산 서열 ;

   (b) 다음 위치 중 하나 또는 그 이상을 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환시킨 (a) 항의 아미노산 서열(서열 번호 : 2 의 번호 체계 사용) :

   (ⅰ) 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 알라닌 또는 세린 잔기로 치환 ;

   (ⅱ) 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환 ;

   (ⅲ) 위치 5 의 아미노산을 알라닌으로 치환 ;

   (ⅳ) 위치 20 의 아미노산을 글루탐산으로 치환 ;

   (ⅴ) 위치 103 의 아미노산을 알라닌으로 치환 ;

   (ⅵ) 위치 105 의 아미노산을 알라닌으로 치환 :

   (ⅶ) 위치 107 의 아미노산을 알라닌으로 치환 ;

   (ⅷ) 위치 1, 2, 3, 4 및 5 의 아미노산을 결실 ;

   (ⅸ) Fc 수용체 결합 부위를 제거하기 위해 하나 또는 그 이상의 잔기를 치환하거나 결실 ;

   (ⅹ) 보체(C1q) 결합 부위를 제거하기 위해 하나 또는 그 이상의 잔기를 치환하거나 결실 ; 및

   (xi) ⅰ - ⅹ 항의 조합 ; 및

   (c) N-말단에 메티오닌 잔기를 갖는 (a)항 또는 (b)항의 아미노산 서열.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 농도는 적어도 5 mg/ml 임을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 농도는 5 mg/ml 내지 50 mg/ml 임을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 pH 는 7.0 임을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
6. 제 2 항에 있어서, 상기 인체 OB 단백질은 rmetHu-Fc-렙틴임을 특 징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
7. 제 1 항에 있어서, 현탁액은 약학적으로 용인가능한 침전제를 함유함을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
8. 제 1 항에 있어서, 현탁액은 염 및 수용성 중합체 중에서 선택한 침전제를 함유함을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
9. 제 1 항에 있어서, 현탁액은 칼슘, 마그네슘, 아연, 나트륨, 철, 코발트, 망간, 칼륨 및 니켈 중에서 선택한 침전제를 함유함을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
10. 삭제
11. 다음 단계를 포함하는 인체 OB 단백질 현탁액의 제조방법 :

    (ⅰ) OB 단백질 성분의 N-말단에 면역글로불린의 Fc 부위를 결합시킴으로써 유도한 용액내 인체 OB 단백질 및 침전제를 화합시키는 단계 ;

    (ⅱ) 상기 인체 OB 단백질을 침전시키는 단계 ;

    (ⅲ) 침전된 인체 OB 단백질을 모으는 단계 : 및

    (ⅳ) 상기 인체 OB 단백질을 희석액 내로 재현탁시키는 단계.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 인체 OB 단백질을 pH 가 6.0 내지 8.0 인 희석액 내로 재현탁시킴을 특징으로 하는 제조방법.
13. 제 11 항에 있어서, 상기 인체 OB 단백질은 rmetHu-Fc-렙틴임을 특징으로 하는 제조방법.
14. 제 1 항의 인체 OB 현탁액의 유효량 및 약학적으로 용인가능한 담체를 포함하는, 다음 중에서 선택한 증상을 갖는 개체를 치료하기 위한 약학적 조성물 :

    (a) 체중 조절,

    (b) 비만 조절,

    (c) 당뇨병,

    (d) 혈액내 지질 수준 조절,

    (e) 제지방질량 증가 및

    (f) 인슐린 감수성 증가.

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