KR20100076951A - 비특이반응 억제제 - Google Patents

비특이반응 억제제 Download PDF

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Abstract

비특이반응 인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편과 고분자 화합물의 복합체를 포함하는 면ㄴ역학적 특정용 비특이반응 억제제에 관한 것이다. 상기 비특이반응 억제제는 면역측정법에서, 미량물질을 정확하게 검출, 정량할 때에 장해가 되는 비특이반응을 억제할 수 있다.

Description

비특이반응 억제제{Non-Specific Reaction Inhibitor}
본 발명은 면역측정법에 있어서, 미량물질을 정확하게 검출, 정량할 때 장해가 되는 비특이반응을 억제하기 위한 비특이반응 억제제에 관한 것이다.
종래부터 항원·항체 반응을 이용하는 특이성이 높은 면역학적 측정법에서도, 시료에 따라 측정하고자 하는 항원이 존재하지 않는 경우에도, 양성의 측정치를 나타내고, 실체 수치와는 다른 측정치를 나타내는 문제가 있었다. 이는 비특이반응이라고 불리는 현상이다.
측정하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 불용성 담체에 고상화하는 면역학적 측정법으로는, 라텍스 응집 광학적 측정법과 효소면역어세이 법이 있다. 상기 측정법을 사용하여, 시료 중의 항체농도를 측정할 경우, 측정대상 시료에 따라, 항원 이외에도 고상화 항체를 인식하고, 이에 반응하는 인자(비특이반응 인자)가 존재하는 경우가 있다. 이 경우, 측정하고자 하는 항원이 시료 중에 존재하지 않는 경우에도 양성의 측정치를 나타내어, 실제 수치와는 다른 측정치를 나타내는 문제가 발생한다.
시료 중에 존재하는 비특이반응 인자로서는, 측정대상인 항원 이외의, 항체를 고상화한 담체에 반응하는 것이라면, 특별히 한정되지 않으나, 발생빈도가 높은 인자로서는 IgM, IgG, IgA의 자연항체를 들 수 있다. 시료가 사람 체액, 예를 들면, 혈청, 혈장인 경우에는 사람 IgM, 사람 IgG가 비특이반응에 높은 빈도로 관여하고, 라텍스 응집 광학적 측정법에서는 비특이적인 라텍스 담체의 응집을 발생시킨다.
상기 비특이반응 인자에 의한 비특이반응을 억제하는 방법으로는, 항 인간 IgM, 항 인간 IgG 항체 등을 측정시약에 공존시켜, 인간 IgM과 사람 IgG에 의한 영향을 회피하는 방법이 있다. 이 경우, 구체적으로 첨가되는 억제제로서, 사람 이외의 동물종에서 얻어진 혈청성분이 제안되고 있다(특허문헌 1). 또한, 특허문헌 2에는 비특이반응 인자를 어떤 동물에 면역시키는 것에 의하여 얻어진 항체를 측정시약에 공존시키는 방법이 기재되어 있다. 이러한 종류의 항체를 측정시약에 공존시키는 것으로 비특이반응을 저감시키는 것이 가능하다. 그러나, 동물혈청에서 얻어진 IgG와 IgM은 항원을 인식하는 부위를 복수 개 함유한다. 예를 들면, 1 분자의 IgG에는 2개, IgM에서는 적어도 10개의 항원인식부위를 가진다. 여기에 더하여, IgG와 IgM은, 다른 단백질과 비교하여 소수성이 높은 특징이 있다. 이런 이유 때문에, IgG 또는 IgM은 그 표적이 되는 항원을 동일한 반응액 중에 공존시키는 경우, 면역비롱반응이 발생한다. 면역비롱반응은, 복수의 항원이 IgG와 IgM에 의해 가교되어, 거대한 면역복합체를 형성하고, 광학적인 탁도로 검출되는 정도의 탁함이 발생하는 현상이다. 예를 들면, 인간 IgM에 연결된 항체를 함유하는 반응액에 사람 IgM을 첨가하면, 비롱반응이 발생하고, 반응액에 탁함이 발생한다. 이 경우, 광학적으로 탁도를 측정하여 항원량을 측정하는 라텍스 응집광학적 측정법에 있어서는, 면역비롱반응에 의하여 정확한 측정치를 나타낼 수 없는 경우가 있다. 이 때문에, 비특이반응 인자에 의한 비특이반응은 회피가 가능하거나, 상기 회피에 의하여 이차적으로 발생하는 면역비롱반응이 새로이 발생한다는 문제가 남아 있다. 이에 덧붙여, IgG와 IgM 분자는 류마티즘 인자가 시료 중에 존재하는 경우, 항체분자 내의 Fc 영역에 류마티즘 인자가 결합하고, 면역 비롱반응을 더욱 증강시키는 문제점이 있다.
상기 문제점의 대처방안으로, 측정시약에 첨가하는 항체량을 적게하는 것이 가능하다. 그러나, 첨가량이 비특이반응 인자에 따른 영향을 충분히 억제할 정도의 첨가량에 도달하지 않는 경우, 비특이반응의 억제는 불충분하다.
이러한 배경의 기초로, 비특이반응을 억제하는 물질로서,「항체」를 분해하여 얻어지는 「항체 단편」을 이용하는 방법을 검토하였다. 예를 들면, IgG 분자를 단백질분해효소인 펩신으로 분해하여 얻어지는 F(ab')2를 비특이반응 억제제로서 이용하는 방법을 들 수 있다. IgG 분자와 IgM 분자는 소수성이 높은 Fc 영역을 가지는 한편, F(ab')2는 Fc 영역을 포함하지 않는다. 때문에, F(ab')2는 항체 첨가로 일어나는 면역비롱반응이 일어나기 어렵게 되고, 측정시약으로 다량 첨가가 가능하다. 또한, Fc 영역을 가지고 있지 않기 때문에, 상기 류마티즘 인자로부터의 영향도 해소된다. 따라서, IgG의 첨가로 문제가 되는, 면역비롱반응, 류마티즘 인자의 영향은 F(ab')2를 이용하는 것으로 회피가능하다. 또한, F(ab')2의 비특이반응의 억제효과는 IgG와 동일한 정도이다. 이상의 점들로부터 항체 단편인 F(ab')2를 비특이반응 억제제로서 이용하는 방법은 상기 항체를 이용하는 발명과 비교하여, 더욱 실용성이 높은 방법이다.
한편, 상기 억제제를 함유하는 측정시약에 대한 유용성을 평가한 결과, 측정시약의 비특이억제효과의 지속성이 불량하다고 판명되었다.
F(ab')2분자는 힌지 부 영역의 디설파이드 결합을 통하여 2 분자의 Fab'가 결합한 분자이다. F(ab')2의 특징으로서, 산화환원반응에 감수성이 높은 성질을 들 수 있다. F(ab')2는 쉽게 환원되어 2분자의 Fab'로 분해된다. 또한, 혈청성분에는 F(ab')2의 힌지부에서 펩티드 결합을 절단하는, 단백질분해효소가 포함되어 있어, 혈청으로부터 F(ab')2의 정제가 불충분한 경우, 혹은 측정시약에 단백질 분해효소가 오염되어 있는 경우에는 F(ab')2 가 분해된다. 때문에, 측정시약과 F(ab')2를 공존시킬 경우, 측정시약의 보존방법에 따라, F(ab')2의 분해가 발생하기 쉽다. Fab'의 비특이반응 억제효과는, 항체 혹은 F(ab')2에 비하여 아주 약하기 때문에, 측정시약 중에서의 F(ab')2의 분해가 비특이억제 효과의 지속성의 악화 원인으로 예상된다. 실제로, Fab'를 비특이억제의 목적으로 첨가한 측정시약에서는 유의한 비특이억제효과가 나타나지 않았다.
한편, 지금까지 서술한 면역학적 측정에서 비특이반응 억제와는 별개의 기술로서, 화학수식한 Fab'를 항종양제로서 사용한 것이 공지되어 있다. 예를 들면, Delgado C. 등의 문헌(비특허문헌1)에 서는, Fab'에 폴리에틸렌글리콜을 화학수식한, 항종양제의 실시예가 보고되어 있다. 게다가, 특허문헌 3에는 Fab'의 티올기를 통하여 약제 및 폴리머를 결합시킨 항종양제가 개시되어 있다.
특허문헌 1: 특개 2006-38823호 공보
특허문헌 2: 특개평 11-287801호 공보
특허문헌 3: 미국특허 5, 541, 297 명세서
비특허문헌 1[British Journal of Cancer, 영국 1996년 제73권 제2호, P. 175-182
상기 기술한 바와 같이, 비특이반응 억제제로서 항체를 첨가하면 면역비롱반응에 영향이 있었다. F(ab')2를 첨가하면 비특이억제 효과의 지속성에 문제가 있었다. 상기 현상을 감안하여, 본 발명에서는 상기 문제점을 해결하는 동시에 경제효율의 관점에서 보다 소량을 첨가하여 효과를 나타내는 비특이반응 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
IgG와 F(ab')2는 비특이 억제 효과를 보유하는 한편, Fab'는 비특이억제능이 매우 낮았다. 그 원인으로서, (1) Fab'는 항원결합부위를 한 개 밖에 가지고 있지 않는 것과, (2) Fab'는 항원에 결합할 수 있어도, 비특이억제능을 나타내지 않는다, 즉, 어느 정도의 분자 사이즈가 없으면, 비특이반응인자에 결합가능하여도, 비특이반응 인자에 의한 비특이반응을 억제할 수 없는 가능성이 시사된다. 따라서, 본 발명자는, Fab'에 여러 고분자를 결합시켜, 거대화시키고, 비특이억제 효능을 회복하는 지를 검토하였다. 그 결과, 고분자를 수식할 경우의 결합양식을 불문하고, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 소혈청 알부민(BSA), 폴리글루타민산 중 어느 것이든 고분자를 수식하는 것에 의하여, Fab'의 비특이억제효과가 회복되었다. 상기 사실에 의하여, Fab'가 비특이억제 효과를 소실하는 원인은 후자의 가설 (2)가 주요인인 것이 밝혀졌다. 특히, 폴레에틸렌글리콜을 결합시킨 Fab'는 IgG와 F(ab')2에 비하여, 1/5 ~ 1/10 정도의 소량을 첨가하여 비특이억제 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 면역비롱반응을 일으키기 어려운 성질을 나타나내는 것이 밝혀졌다.
종래부터 단백질을 폴리에틸렌글리콜로 수식해왔다. 그 대부분이 단백질의 안정성을 향상시킬 목적이었다. 단백질을 치료약으로서 사람이나 다른 동물에 투여할 경우, 체내의 프로테아제의 영향을 회피할 목적과 혈중 반감기를 증가시킬 목적으로 폴리머 수식이 실시되는 경우가 많다. 그러나, 본 발명에서의 폴리머 수식의 목적은 항체 단편을 거대화시키는 것이고, 안정성 향상을 목적으로 하는 종래의 폴리머 수식물과는 목적이 다른 점에 특징이 있다.
단백질을 폴리머로 화학수식하는 방법은 공지기술이다. Roberts M. J. 등의 총설(Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54, 459-476)과 Francesco M. 등의 총설(Biomaterials 2001, 22, 405-417)에 그 주요한 방법이 기재되어 있다. 예를 들면, 단백질을 구성하는 아미노산의 측쇄의 아미노기, 시스테인 잔기의 티올기, 카르복실기 말단의 카르복실기 또는 아미노기 말단의 아미노기, 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기 등의 하이드록실기를 표적으로 하여, 폴리머를 결합시키는 방법을 들 수 있다. 또한, 항체 또는 항체 단편에 폴리머를 결합시키는 방법도 공지기술이다. 특히, 항체를 화학수식할 경우에는 항체 활성 즉, 항원에 결합하는 능력을 소실시키지 않는 방법으로 화학수식체를 제조하는 것이 유용하다고 생각되어 진다. Andrew P. 등의 총설(Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 531-545)에 기재되어 있는 바와 같이, 아미노기와 카르복실기는 항원인식부위에도 존재하기 때문에, 이들 관능기를 표적으로 하여 화학수식하는 경우, 항원의 인식부위가 폴리머에 의하여 덮여버려, 결과적으로 화학수식에 의하여 항체활성이 저감되는 경우가 많다. 이러한 폴리머 수식에 따른 불이익을 회피할 목적으로, 예를 들면, Fab'의 힌지부의 티올기 또는 환원한 IgG의 티올기를 표적으로 하여 폴리머를 결합시키는 방법이 있다. 실제, Slinkin M.A. 등의 문헌(Bioconjug Chem. 1992, 3(6), 477-483)에서는, 항원 단편의 Fab'의 티올기에 폴리머를 결합시킨 실시예가 보고되어 있다. 또한, Delgado C. 등의 문헌(Br. J. Cancer. 1996, 73(2), 175-182)에서, Fab'에 폴리에틸렌글리콜을 화학수식한 항종양제의 실시예가 보고되어 있다. 또한, 미국특허 5, 541, 297호 명세서에는 , Fab'의 티올기를 통하여 약제 및 폴리머를 결합시킨 항종양제가 개시되어 있다.
진단과 치료는 생체에 투여하는 경우(in vivo)와 시험관 내 등의 체외에서 수행하는 경우(in vitro)로 일반적으로 분류할 수 있다. 폴리머 수식화 항체의 용도는 in vitro 치료와 진단에서 이용하는 경우가 대부분이다. 예를 들면, 항체에 약물 또는 동위원소를 결합시켜, 종양 등의 병변의 치료제 혹은 검출제로서 체내에 투여하는 경우, 폴리머 수식을 실시한다. 한편, in vivo 진단에서는, 폴리머 수식화 항체의 이용용도가 확인되지 않았으며, 이용되지 않았다. in vivo와는 달리 in vitro에서는 생체에 투여되지 않는다. 따라서, 이용을 검토하는 경우, 안정성의 향상 이외에 뛰어난 이점이 필요하다. 따라서, 본 발명은 「비특이반응 억제제」로서의 유용성을 새롭게 발견한 것으로, in vitro 진단의 이용용도를 새롭게 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은 「비특이반응 억제제」로서의 새로운 용도를 제공하는 것이고, 또한, 종래의 비특이반응억제 기술보다 우수한 효과를 나타내는 것이다.
본 발명자는 비특이반응 억제제에 대하여, 예의 노력한 결과, 비특이반응 물질에 대한 항체 또는 그 단편에 폴리머를 화학결합시키는 것으로, 면역비롱반응, 보존에의 지속성의 문제를 해소하며, 소량으로 비특이 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명은 비특이반응 인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 고분자화합물의 복합체를 포함하는, 면역학적 측정용 비특이반응 억제제에 관한 것이다.
본 발명의 비특이반응 억제제의 바람직한 양태에 의하면, 상기 고분자 화합물은 다당류, 단백질 및 유기고분자 중합체로 구성된 군에서 선택되는 화합물이고, 폴리에틸렌글리콜인 것이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명의 비특이반응 억제제의 다른 바람직한 양태에 의하면, 상기 고분자 화합물의 분자량은 200Da ~ 1000kDa이다.
본 발명의 비특이반응 억제제의 또 다른 바람직한 양태에 의하면, 항체 단편은 F(ab')2,Fab', Fab, Fd, L 쇄, H 쇄 또는 환원형 IgG(rIgG)이다.
본 발명의 비특이반응 억제제의 또 다른 바람직한 양태에 의하면, 항체 또는 그 단편과 고분자 화합물과의 결합이, 티올기, 아미노기, 히드록실기 혹은 카르복실기를 이용하는 화학수식 또는 비오틴-아비딘 결합에 의한 것이다.
또한, 본 발명은 비특이반응 인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편과 고분자 화합물과의 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정방법에 관한 것이다.
본 발명의 면역학적 측정방법의 바람직한 양태에 의하면, 면역학적 측정방법은 라텍스 응집광학적 측정법, 효소면역어세이, 면역비롱법, 효소면역측정법, 형광면역측정법 또는 방사면역측정법이다.
본 발명에 따르면, 항비특이반응 인자 항체단편 또는 그 단편에 폴리머를 결합시키면, 비특이 억제효과를 현저히 증강시키고, 종래의 수식을 하지 않은 항체와 비교하여, 1/5 ~ 1/10 정도의 적은 첨가량으로 억제가 가능하다. 동시에, 본 발명에 따르면, 종래 항체 첨가에서 문제가 되었던 면역비롱반응의 발생 문제와 지속성의 문제도 해소할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 제조한 Fab'-Mal 및 티올기 봉쇄 Fab'의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 비특이반응 억제제인, 20kDa의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 F(ab')2Suc, Fab'Suc 및 Fab'Mal의 비특이반응 억제효과(피검시료=시료 A)를 미수식 F(ab')2와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 비특이반응 억제제인, 20kDa의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 F(ab')2Suc, Fab'Suc 및 Fab'Mal의 비특이반응 억제효과(피검시료=시료 B)를 미수식 F(ab')2와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 비특이반응 억제제인 20kDa의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 Fab'Mal의 비특이반응 억제효과를 미수식 IgG 및 F(ab')2와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 비특이반응 억제제인 20kDa의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 Fab'Mal의 면역비롱반응을 흡광도의 변화로 검출하고, 미수식 IgG와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 비특이반응 억제제인 20kDa의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 Fab'Mal의 보존안정성을 미수식 F(ab')2와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 6에서 제조한 Fab'BSA의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 비특이반응 억제제는, 비특이반응 인자에 특이적으로 결합하는 항체(항비특이반응 인자 항체) 또는 그 단편과 고분자 화합물의 복합체(이하, 고분자화 항체로 칭한 것이 있음)를 포함한다.
본 명세서에서 「비특이반응 인자」는 항원항체 반응을 이용하는 면역학적 측정법에서 비특이적인 반응을 야기시키는 물질이다. 구체적인 인자로서는, 사람체액을 시료로 하는 경우, 인간 IgM, 인간 IgG, 인간 IgA, 인간 IgE, 인간 IgD 및 상기 항체에 결합하는 인자, 예를 들면, 보체, 류마티즘인자, Fc 수용체 등을 들수 있고, 사람 이외의 동물의 체액을 시료로 하는 경우는 상기 동물의 IgM, IgG, IgA, IgE 및 상기 항체에 결합하는 인자 등을 들 수 있다. 비특이반응 인자에 대한 항체는 예를 들면, IgM형의 비특이반응 인자의 경우에는, 항인간 IgM 항체이다. 또한 IgA 형의 비특이반응 인자의 경우는 항인간 IgA이다. 본 발명의 비특이반응 억제제를 면역측정시약에 첨가하는 경우에 있어서, 복수의 비특이반응 인자가 비특이반응을 일으킨다고 상정하는 경우, 예를 들면, IgM, IgG, IgA가 비특이반응 인자라고 상정하는 경우는, 항 IgM 항체, 항 IgG 항체, 항 IgA 항체로부터 제조한 본 발명의 비특이반응 억제제를 첨가하는 것이 바람직하다. 따라서, 1종류만의 비특이반응 억제제를 첨가하는 것으로 한정되지 않는다.
상기 면역학적 측정법으로서는 예를 들면, 라텍스 응집광학적 측정법, 엔자임이뮤노어세이, 면역비롱법, 효소면역측정법, 형광면역측정법, 방사선면역측정법 등을 들 수 있다. 모두 항원항체반응을 이용하지만, 표적항원을 검출하는 항체에는, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체가 있다.
비특이반응 인자에 특이적으로 결합하는 항체는 비특이반응 인자를 동물에 면역하여 얻어지는 항혈청 및 혈장, 정상 동물혈청, 비특이반응 인자를 인식하는 모노클로날 항체, 비특이반응 인자를 인식하는 유전자공학적으로 제작된 항체(키메라항체를 포함함) 등을 일반적으로 이용하는 방법으로 정제하여 제조할 수 있다. 항체에는 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체가 있다. 항체의 클래스는 각 동물마다 다르나, IgG, IgM, IgA 등이 있다. 상기 정제방법으로는 예를 들면, 염석방법, 전기영동법, 겔여과법, 소수성 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피법 등을 들 수 있다.
항체단편은 상기 항체를 예를 들면, 효소, 환원제 또는 효소와 환원제를 조합하여 반응시켜 얻어지는 항체의 일부분이고, 비특이 억제인자에 결합할 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 항체단편의 제작은 효소(예를 들면, 파파인, 펩신, 트립신 등)에 의한 소화, 혹은 환원제에 의한 디설파이드 결합의 단편 혹은 이들을 조합한 공지의 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 항체(완전항체)를 파파인으로 소화시키면, Fab와 Fc 단편으로 절단할 수 있다. 펩신으로 소화시키면, F(ab')2가 얻어지고, 또한, 환원제(예를 들면,디티오트레이톨, 2-메틸 멀캅토에탄올, TCEP·HCl[Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride], 2-멀캅토에틸아미드 등)으로 환원하면 Fab' 단편을 얻을 수 있다. 다음으로, SH 시약(예를 들면, 요오드아세트아미드)로 처리하면, L 쇄와 Fd로 절단할 수 있다. 항체(완전항체)를 환원제(예를 들면, 디티오트레이톨, 2-멀캅토에탄올, TCEP·HCl[Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride], 2-멀캅토에틸아민 등)으로 환원한 후, SH 시약(예를 들면, 요오드아세트아미드)로 처리하면 L 쇄, H 쇄 혹은 H 쇄 사이만을 절단한 rIgG를 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용한 항체단편은 비특이 억제인자에 결합할 수 있는 것이면 좋고, 예를 들면, F(ab')2, Fab', Fab, Fd, L 쇄, H 쇄, rIgG 항원결합능을 보유한 항체 단편이다. 실시예에서 구체적으로 기재한 F(ab')2, Fab' 이외의 항체단편인, 예를 들면, Fab', Fd' L 사슬, H사슬, rIgG 라도, 예를 들면, 보유하는 티올 기, 아미노기, 카르복실기를 표적으로 하여 폴리머를 결합시킨 것은 본 발명의 비특이반응 억제제의 유효성분으로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, Fab'에 폴리머를 수식시킨 것을 비특이반응 억제제의 유효성분으로서 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 비특이반응 억제제의 유효성분으로서 이용한 고분자화 항체(즉, 항비특이반응 인자 항체 또는 그 단편과 고분자 화합물과의 복합체)로서는, 예를 들면, 항비특이반응인자 항체 또는 그 단편을 고분자 화합물로 화학수식한 화학수식화 항체, 혹은 비오틴-아비딘 결합으로 결합시킨, 항비특이반응 인자 항체 또는 그 단편과 고분자 화합물의 복합체를 들 수 있다.
상기 화학수식에서는 예를 들면, 티올기, 아미노기, 하이드록시기 혹은 카르복실기를 표적으로 하여, 「반응성 유도체」를 통하여 결합시킬 수 있다.
티올기를 표적으로 하는 수식에서 사용되는 「반응성 유도체」로는, 예를 들면, 말레이미드 류와 비닐술폰류 등의 티올기 선택적인 반응기를 포함한다. 또한, 폴리머에 직접 반응성 유도체가 결합한 것을 이용하여도 좋고, 반응성 유도체를 함유하는 가교제를 이용하여도 좋다.
아미노기를 표적으로 하는 수식에서 사용되는 「반응성 유도체」로는, 예를 들면, N-히드록시숙신이미드(NHS)에스테르와 N-히드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS)에스테르 등을 포함한다. 또한 알데히드기를 함유하는 화합물(예를 들면, 글루탈알데히드)와 폴리머이면서 알데히드기를 함유하는 폴리머 등이 있다.
카르복실기를 표적으로 하는 수식에서는, 예를 들면, 카르복시이미드(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodimidehydrochloride)를 촉매로하여 아미노기와 반응시키는 방법으로 얻어지는 복합체를 포함한다.
하이드록시기를 표적으로 하는 수식에서는 예를 들면, 이소시안산유도체를 함유하는 화합물을 이용하여 제조할 수 있다.
또한, 반응성 유도체가 도입된 폴리머는 시판품(예를 들면, 日油주식회사 )으로 취득하여도 좋으며, 통상의 화학적 수법을 이용하여 제조하여도 좋다.
또한, 비오틴과 아비딘과 같이, 항체와 폴리머의 결합양식이 공유결합에 의한 결합은 아니지만, 높은 친화성을 가지는 결합양식을 이용하는 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 고분자 화합물로서는 예를 들면, 다당류, 단백질, 유기고분자 중합체를 들 수 있다.
상기 다당류에는 예를 들면, 덱스트란, 덱스트린, 아가로즈, 카르복시메틸(CM)-셀룰로오스, 헤파린, 가용성 전분 등을 포함한다. 다당류는 직쇄이거나, 분지쇄이거나 상관없다. 다당류를 이용하여 단백질을 수식하는 것에는 종래 알려져 있는 과요오드산산화법, 브롬화시안법, 카르복시이미드법, 염화시아눌법, 에피크롤히드린법, SPDP(N-Succinmidyle 3-[2-pyridyldithio]propionate)시약법, 활성 에스테르법 등을 사용할 수 있다. 또한, 반응성 유도체가 도입된 다당류는 시판품으로 취득하여도 좋고, 통상의 화학적인 방법을 이용하여 제조하여도 좋다.
상기 단백실은 복수의 아미노산이 펩티드 결합으로 결합된 복합체이고, 동물로부터 정제한 것이어도 좋으며, 유전자공학으로 인공적으로 제조한 것이어도 좋고, 합성 펩티드와 같이 화학합성에 의해 제조된 것이어도 좋다. 단백질에는 예를 들면, 카제인, 밀크카제인, 젤라틴, 재조합 알부민 등이 포함된다. 폴리아미노산으로는 아르기닌, 라이신, 글루타민산 등의 호모 폴리머, 라이신과 글리신, 라이신과 세린 등의 랜덤폴리머를 포함한다. 단백질의 결합방법의 예로서, 단백질의 아미노기, 카르복실기, 설파이드 기 등을 표적으로 하여 가교제를 결합시켜, 상기 가교제를 통하여 항체에 결합시키는 방법이 있다. 또한, 카르복시이미드를 촉매로서 사용하고, 항체와 단백질을 결합시키는 방법도 있다. 본 발명에서는, 단백질의 아미노기에 EMCS[N-(-6-Maleimidocaproyloxy)succinimide; dojin 사]와 SMCC[Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane carbonate;dojin 사] 등의 가교제를 반응시켜, 항체단편의 설파이드기에 상기 가교제를 결합시키는 방법이 바람직하다. 또한, 본 발명품을 제조하는 경우에 사용하는 반응성 유도체가 도입된 단백질은 시판품으로 취득하여도 좋고, 통상의 화학적인 방법을 이용하여 제조하여도 좋다.
상기 유기고분자 중합체의 예로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리메타크릴산메틸, 폴리아크릴산, 폴리아릴아민, 폴리사카라이드를 들 수 있다. 유기고분자 중합체는 직쇄여도 좋고, 분지쇄를 가지고 있어도 좋으며, 복수종류의 랜덤폴리머여도 좋다. 또한, 덴트리머와 같이 구상구조의 합성 고분자여도 좋다. 고분자는 합성품이여도 천연유래여도 좋다.
폴리에틸렌글리콜은 에틸렌글리콜이 중합한 구조를 기본으로하는 고분자 화합물이다. 폴리에틸렌글리콜의 수산기에 다른 관능기를 구입하고, 그 관능기를 이용하여 항체에 결합시킬 수 있다. 폴리에틸렌글리콜과 항체를 결합시킬 경우에 수행되는 활성화에는, 예를 들면, 염화시아눌, 카르복시이미다졸, N-히드록시숙신산이미드, 카르보디이미드 등을 이용하는 방법을 들 수 있다. 관능기가 도입된 폴리에틸렌글리콜로서, 시판품을 이용할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜에 말레이미드 기, 숙시미드기, 아미노기, 설포이드기 등을 도입한 시판품을 이용하면, 좋은 효율로 제조할 수 있다. 말레이미드 기, 숙시미드기를 도입한 폴리에틸렌글리콜은 항체와의 결합효율이 좋아서 보다 바람직하다. 또한, 폴리에틸렌글리콜은 직쇄이어도, 분지쇄를 포함하여도 좋고, 폴리에틸렌글리콜의 일부가 다른 화학구조로 치환된 것과 폴리에틸렌글리콜에 다른 폴리머와 화합물이 수식된 것도 포함한다.
폴리에틸렌글리콜 이외의 유기고분자 중합체에 의한 화학수식 방법으로서, 상기 폴리에틸렌글리콜의 화학수식 방법과 동일하게 유기고분자 중합체에 관능기를 도입하여 항체에 결합시키는 방법이 있다. 또한, 반응성유도체를 함유하는 유기고분자 중합체로는, 제조단계에서 유기고분자 중합체로의 새로운 관능기의 도입을 요구하지 않는 경우도 있다. 본 발명에 있어서는, 말레이미드기, 숙신이미드기, 아미노기, 카르복실기를 도입한 폴리머를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 반응성 유도체가 도입된 유기고분자 중합체는 시판품으로 취득해도 좋고, 통상의 화학적 방법으로 제조하여도 좋다.
상기 고분자 화합물의 분자사이즈는 특별히 제한되는 것은 아니나, 일반적으로 평균 분자량이 약 200Da~1000kDa,예를 들면, 1kDa~ 1000kDa, 바람직하게는 10kDa~100kDa이다. 폴리에틸렌글리콜의 경우는 바람직하게는 20kDa~200kDa이다. 사용한 폴리머의 종류에 따라, 친수성, 입체구조, 비특이 억제효과 등을 고려하여, 분자 사이즈를 적의 선택할 수 있다.
본 발명의 비특이반응 억제제는 그 유효성분인 고분자화 항체(예를 들면, 폴리머 수식 항비특이반응 인자 항체 또는 그 단편)을 면역측정계에 첨가하는 것으로 사용할 수 있다. 구체적으로는 수식된 비특이반응 인자에 대한 항체단편의 용액을 준비하고, 측정하고자 하는 항원에 대한 항체를 항원과 반응시키기 전에, 미리 시료에 상기 용액을 첨가하여, 비특이반응 인자와 그에 대한 항체를 반응시켜, 비특이반응 인자에 의해 비특이반응을 억제시켜도 좋고, 측정하고자 하는 항원에 대한 항체의 용액 중에 수식한 비특이반응 인자에 대한 항체단편을 포함시켜, 그 용액을 시료에 첨가하여 비특이반응 인자와 이에 대한 항체를 반응시켜, 비특이반응 인자에 의해 비특이반응을 억제하여도 좋다.
면역측정시약의 측정항목으로는, 예를 들면, 엘라스타제, 시스타친 C, sEs(가용성 E 셀렉틴), SF(가용성 피브린), PC(프로테인 C), PPI(플라스민플라스민인히비터), cTn(트롬보모듈린), 미오글로빈, CK-MB, BNP(B형 나트륨이뇨펩티드), AFP(α-페토프로테인), β2m(β-2-미크로글로블린), CEA(암태아성항원), 페리틴, CA19-9(당질항원 19-9), PAP( 전립선 산성포스파타아제), PSA(류마티즘 인자), ASO(항스토렙토리딘-O), FDP(피비린 분해생성물), ATIII(항트롬빈 III), α2PI(α-2-프라스민인히비터), D-다이머(피브린분해 생성물 D-프레그먼트 이량체), IgG(면역글로블린 G), IgA(면역글로블린 A), IgM(면역글로블린 M), IgE(면역글로블린 E), C3(보체 제3성분), 뇨 알부민, hCG(사람융모성 성선자극호르몬), hPL(사람 태반성 락토겐), 인슐린, HBs항원(B형 간염표면항원), HBs 항체(B형 간염표면항원항체), HBc 항체(항B형 간염코어항원항체), HCV 항체(항 C형 간염 바이러스 항체), 트렙포네마(항 매독 트레포네마항체), TSH(갑상선자극 호르몬), LH(황체형성 호르몬), FSH(난포자극호르몬), 디곡신, 디기톡신, 키니딘, 프로카인아미드, NAPA(N-아세틸프로카인아미드), 테오피린, 페니토인, 페노발비탈, 칼바마제핀, 발프론산, 에쏘숙시이미드(Ethosuccimide), 겐타마이신, 토브라마이신, 아미카신, 징코마이신, 사이클로스포린 A, B12(비타민 B12), 엽산, T3(트리요오드티로닌), T4(티록신), 에스트로겐이 포함된다.
실시예
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
<실시예 1>
[목적]
항비특이반응인자인 IgG와 F(ab')는 높은 비특이억제 효과를 가지지만, Fab'는 효과가 약하다. 그 원인으로, (1) 비특이억제효과를 나타내는 것은 1분자 중에 복수의 항원인식부위가 필요할 가능성, (2) 비특이반응 억제제의 분자크기가 억제효과에 영향을 줄 가능성으로 생각할 수 있다. 본 실시예는 이들 가설을 검증할 목적으로 실시하였다. Fab'와 같이 항원인식부위가 1개이어도, 비특이억제 효과를 나타낸다면, (1)의 가능성을 부정할 수 있다. 또한, 후자에 경우는 여러 크기의 고분자 수식을 실시하여, 비특이억제 효과를 검토한다면 검증이 가능하다.
[방법]
사람 IgM에 결합하는 IgG 항체의 단편(Fab')를 이용하여, 폴리에틸렌글리콜 수식에 의한 비특이억제효과를 검토할 목적으로, 폴리에틸렌글리콜 수식 Fab'(이하, FabMal이라 함)를 제조하였다. 폴리에틸렌글리콜의 수식양식은 1분자의 Fab에, 힌지부위의 티올기를 통하여 1분자의 폴리에틸렌글리콜을 결합시키는 것으로 하였다. 이는, 폴리에틸렌글리콜이 Fab'의 항원인식부위에 결합하는 상황을 회피하기 위한 것이다. Fab'의 동물종은 토끼를 선택하고, 한쪽 말단만을 말레이미드기를 가지는 폴레에틸렌글리콜을 수식제로 사용하였다. 또한, 수식하는 폴리에틸렌글리콜의 길이(분자량)의 차에 따른 비특이억제 효과의 차이를 조사할 목적으로, 각각 2kDa, 5kDa, 12kDa, 20kDa, 30kDa 길이의 폴리에틸렌글리콜을 수식제로 이용하고, 각각의 분자량의 Fab'Mal을 제조하였다. 음성 대조군으로는 Fab'로부터 F(ab')2로의 가역반응을 저지할 목적으로, 티올기를 N-에틸말레이미드로 봉새한 Fab'(이하 티올기 봉쇄 Fab'이라 함)을 이용하였다. 티올기 봉쇄 Fab', 2kDa의 Fab'Mal, 5kDa의 Fab'Mal, 12kDa의 Fab'Mal, 20kDa의 Fab'Mal, 30kDa의 Fab'Mal, 의 각각에 대하여 비특이억제 효과를 조사하였다.
[Fab'Mal 의 제조]
토끼 항 사람 IgM 폴리클로날 IgG(자가제조)를 펩신으로 분해하여, F(ab')2를 제조하였다. F(ab')2는 150mmol/L NaCl 함유 200mmol/L 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액(pH 8.2)로 5mg/ml 농도로 제조하였다. F(ab')2는 10mmol/L 2-멀캅토에틸아민에 37℃에서 30분간 환원하고, 5mmol/L EDTA 함유 50mmol/L 인산완충액 (pH6.0)을 러닝버퍼로하여 겔여과하고, Fab'분획을 회수하였다. 5mg/ml Fab'용액에 말레이미드기가 결합한 30kDa의 폴리에틸렌글리콜(일유(日油)사, 일본)를 첨가하여, 4℃에서 4시간 교반하면서 반응시켰다. 반응액은 겔여과시, Fab'Mal의 분획을 회수하고, 5mg/mL 정도까지 농축하였다. 동일한 방법으로, 2kDa, 5kDa, 12kDa, 20kDa의 각 분자량의 Fab'Mal을 제조하였다.
[티올기 봉쇄 Fab'의 제조]
토끼 항 사람 IgM 폴리클로날 IgG(자가제조)를 펩신으로 분해하여, F(ab')2를 제조하였다. F(ab')2는 150mmol/L NaCl 함유 200mmol/L 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충액(pH 8.2)로 5mg/ml 농도로 제조하였다. F(ab')2는 10mmol/L 2-멀캅토에틸아민에 37℃에서 30분간 환원하고, 5mmol/L EDTA 함유 50mmol/L 인산완충액 (pH6.0)을 러닝버퍼로하여 겔여과하고, Fab'분획을 회수하였다. 5mg/ml Fab'용액에 5mmol/L N-에틸말레이미드(시그마 알드리치)를 4℃에서 4시간 교반하면서 반응시켰다. 반응 후에 겔 여과하고, 티올기 봉쇄 Fab'의 분획을 회수하여, 5mg/ml 정도까지 농축하였다.
얻어진 Fab'Mal 및 티올기 봉쇄 Fab'Mal의 SDS-PAGE 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 좌측 레인 부터, 머커, 티올기 봉쇄 Fab', 30 kDa Fab'Mal, 20kDa Fab'Mal, 12kDa Fab'Mal, 5kDa Fab'Mal, 2kDa Fab'Mal, 티올기 봉쇄 Fab', 마커를 나타낸다.
[비특이반응 억제제의 효과를 평가하는 어세이 조건]
Fab'Mal 및 티올기 봉쇄 Fab'에 의한 비특이억제 효과를 라텍스 응집광학적 측정법에 의해 검토하였다. 이용한 측정항원은 D 다이머이고, D 다이머-측정시약[에르피아데스 D 다이머-II, 삼릉(三稜)화학 메디엔스]은 상기 비특이반응을 나타내는 사람 혈장이고, 비특이반응물질이 IgM인 것을 특징으로 하는 2종류의 시약(시약 A 및 B)를 피검시료로서 이용하였다. 측정은 자동분석장치의 HITACHI7170(히타치하이테크놀로지 사)에 의한 오토메이션 조작으로 실시하였다. HITACHI7170에 의한 측정은 주로 2개의 조작을 실시하였다. 제1조작에서는 측정대상의 시료를 제1시약(이하, R1이라 함)으로 희석시켰다. 제2조작에서는 D 다이머에 반응하는 항체가 고상화된 라텍스입자를 함유하는 것을 특징으로 하는 제2시약(이하, R2 라 칭함)을 상기 반응액에 첨가시키고, 라텍스의 응집반응을 일으켰다. 상기 응집반응을 광학적으로 모니터링하는 것으로, 피험체 중의 D 다이머 혹은 비특이반응 인자를 정량하였다. 본 실시예에서, R1에 Fab'Mal 또는 티올기 봉쇄 Fab'를 첨가하고, 제1조작 중에 비특이반응 물질을 흡수하도록하였다. R1에는 Fab'Mal 또는 티올기 봉쇄 Fab'가 100mg/L가 되도록 첨가하였다. 또한, 본 실시예에서 사용한 Fab'Mal 및 티올기 봉쇄 Fab'는 어피니티 크로마토그래피에 의해, 피브린 분해산물(D 다이머를 포함)에 반응하는 성분을 제거하는 조작을 실시하였다. 측정시료, R1, R2의 혼합비는 7㎕; 125㎕:125㎕로 하였다. 라텍스 응집은 800nm의 파장에서 검출하였다. 측정치는 농도를 알고 있는 D 다이머를 측정하여 얻은 검량선으로부터 흡광도를 비교하여 측정치를 산출하였다.
[D 다이머 측정용 R2]
삼릉(三稜)화학메디엔스 주식회사가 판매하는 생체진단용시약[에리피아데스 D 다이머 II]의 구성시약의 라텍스 시약을 R2 시약으로 사용하였다. 상기 제품은 D 다이머에 대한 특이적인 결합능을 가지는 모노클로날 항체를 화학결합에 의해 결합시킨 불용성 담체를 구성성분으로 하는 시약이다.
[시험결과]
결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와 같이, 모든 분자량의 FabMal'에서 억제효과를 나타내었다. 또한, Fab'Mal에 따른 효과는 분자량의 크기에 의존하는 결과를 나타내고, 폴리에틸렌글리콜 수식을 한 경우, 고분자의 폴리에틸렌글리콜을 수식시킬수록 비특이억제 효과가 높다는 것이 밝혀졌다.

 티올기
봉쇄 Fab'		 Fab' Mal
미첨가
2kD 5kD 12kD 20kD 30kD
시료 A(㎍/ml) 7.08 2.95 1.18 0.90 1.09 0.85 8.52
tlfy B(㎍/ml) 20.28 18.13 7.79 0.26 0.06 0.04 17.66
<실시예 2>
[목적]
실시예 1의 결과로부터 Fab'와 같은 항원인식부위가 1개라도, 폴리에틸렌글리콜로 수식하면 비특이억제 효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 또한 수식하는 분자량이 클 수록, 효과가 증가하였다. 본 실시예에서는, 고분자를 항체단편으로 수식하면, 수식하지 않은 경우와 비교하여, 비특이억제 효과가 증가하는 지를 검토하는 것을 목적으로 실시하였다.
[방법]
비특이반응 인자에 반응하는 F(ab')2를 사용하여, 숙신이미드기를 한쪽 말단에 함유하는 20kDa의 폴리에틸렌글리콜로 화학수식한, 폴리에틸렌글리콜 수식 F(ab')2[이하,F(ab')2Suc이라 함]을 제조하였다. 같은 방법으로 티올기 봉쇄 Fab'에 동일한 폴리에틸렌글리콜로 수식한 복합물(이하, Fab'Suc이라 함)을 제조하였다. 억제효과의 비교는, 본 발명품인 F(ab')2Suc, Fab'Suc 및 Fab'Mal과 F(ab')2를 비교하여 실시하였다. 또한, 본 실시예에서 사용한 항체단편 혹은 화학수식을 실시한 항체단편은 동일 롯트의 항체로부터 제조하였다.
[F(ab')2Suc 및 Fab'Suc의 제조]
토끼 항 사람 IgM 폴리클로날 IgG(자가제조)를 펩신으로 분해하여,F(ab')2를 제조하였다. 또한, 실시예 1의 방법에 의해, 티올기 봉쇄 Fab'를 제조하였다. F(ab')2 및 티올기 봉쇄 Fab'는 5mmol/L EDTA 함유 50mmol/L 인산완충액(pH 6.0)을 외액으로 하여 투석하였다. 5 mg/mL F(ab')2 또는 티올기 봉쇄 Fab' 용액에 숙신이미드기가 결합된 20kDa의 폴리에틸렌글리콜(일유(日油)사)을 첨가하여, 4℃에서 12시간 교반하면서 반응시켰다. 반응액은 겔여과하고, 목적물인 F(ab')2Suc 및 Fab'Suc 분획을 회수하여, 5mg/mL 정도로 농축하였다.
[비특이반응억제제의 효과를 평가하는 어세이 조건]
실시예 1 기재의 어세이 조건과 동일한 방법으로 폴리에틸렌글리콜 수식을 실시한 항체단편과 실시하지 않은 F(ab')2를 비교한 것으로 비특이억제 효과를 검토하였다. 단, 본 실시예에서는 비특이반응 억제제의 첨가농도가 0mg/L, 20mg/L, 50mg/L, 100mg/L의 R1에 대한 효과를 평가하였다. 또한, 피검체로는 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 시료 A 및 B를 사용하였다.
[시험 결과]
결과를 도 2(시료 A) 및 도 3(시료 B)에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 수식을 실시하지 않은 F(ab')2과 비교하여, 20kDa의 폴리에틸렌글리콜로 수식한 F(ab')2Suc, Fab'Suc, 및 Fab'Mal에서는 현저하게 비특이억제 효과가 증가하는 것이 확인되었다.
<실시예 3>
[목적]
실시예 2의 결과가 나타내는 바와 같이, 항체단편을 폴리에틸렌글리콜로 수식한 경우, 수식하지 않은 경우와 비교하여 현저하게 비특이억제효과가 증강되는 것으로 밝혀졌다. 이에, 본 실시예에서는 종래 기술인 IgG 첨가에 의한 효과와 비교하여, 본 발명의 효과를 명확하게 하는 것을 목적으로 한다.
[방법]
20kDa의 Fab'Mal, IgG, F(ab')2로 억제효과의 비교를 실시하였다. 상기 3종류의 물질은 같은 로트의 IgG로부터 제조하였다.
[비특이반응 억제제의 효과를 평가하는 어세이 조건]
실시예 1 기재의 어세이조건과 동일한 방법으로, 비특이반응 억제효과를 검토하였다. 단, 실시예 3에서는 IgG, F(ab')2, 20kDa의 Fab'Mal을 각각 50mg/L의 농도로 R1에 첨가하여 검토에 이용하였다.
[실험 결과]
결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 고분자를 수식한, Fab'Mal은 IgG와 F(ab')2와 비교하여, 비특이억제 효과가 현저하게 높은 것이 판명되었다. 이로부터, 본 발명품은 적어도 종래기술의 수식하지 않은 IgG 보다 비특이억제 효과능이 높은 것으로 나타났다.
<실시예 4>
[목적]
본 발명의 비특이반응 억제제인 Fab'Mal은 IgG와 F(ab')2보다 비특이억제 효과가 높은 것이 확인되었다. 다음으로, 종래기술에서 문제가 되었던, 면역비롱반응에 대하여 검토는 것을 목적으로 실시하였다.
[방법]
면역비롱반응은 항원과 그 항체가 고농도로 존재하는 경우에 쉽게 발생한다. 본 실시예에서는, 항원으로서 사람 IgM(자가제조)을 사용하고, 항체에 상당하는 것으로 20kDa의 Fab'Mal을 사용하였다. IgG 또는 Fab'Mal을 D 다이머 측정시약의 R1에 200mg/L의 농도로 첨가하였다. 한편, 측정시약은 도 5에 나타난 바와 같이, 사람 IgM을 0.99mg/mL~5.9mg/mL의 범위를 포함하는 시약을 사용하였다. 일반적으로 건강한 사람의 IgM 농도는 1.00mg/mL~1.5mg/mL 이다. 본 실시예에서는 실제로 사람 혈장 혹은 혈청을 측정하는 경우에 상정되는 IgM 농도 영역을 함유한다. 면역비롱반응의 영향은 HITACHI7170으로 800nm의 파장에서 광학적으로 측정하였다.
[면역비롱반응을 평가하는 어세이 조건]
HITACHI7170에서 시료, R1, R2를 각각 10㎕, 180㎕, 180㎕의 배합으로 반응시켜, 800nm의 파장에서 검출하고, 흡광도의 상승을 측정하였다.
[시험결과]
결과를 도 5에 나타내었다. 피험체의 시료는 R1 액의 혼화개시로부터 R2 액이 첨가되기 직전까지의 흡광도 변화를 나타내었다. 본 조건에서는 흡광도의 상승이 나타난 경우에 면역비롱 반응이 발생했다고 판단할 수 있다.
또한, 800mg/L의 고농도의 Fab'Mal에 있어서도 흡광도의 상승이 일어나지 않은 것을 확인하였다.
<실시예 5>
[목적]
실시예 4로부터, Fab'Mal은 면역비롱반응이 발생하기 어렵다는 것이 밝혀졌다. 다음으로, 본 발명의 보존 지속성에 대하여 검토하였다.
1분자의 F(ab')2는 2분자의 Fab'로 분해된다. 특히 F(ab')2을 R1에 첨가하여 보존한 경우, 쉽게 Fab'로 분해되기 때문에 문제가 된다. Fab'는 비특이억제 효과가 약하고, 비특이반응을 일이키는 검체를 측정한 경우, 시간이 지남에 따라 수치의 상승이 나타났기 때문이다. 실시예 5에서는 Fab'Mal의 보존안정성을 밝히는 것이 목적으로, 37℃에서 보존한 경우의 비특이억제 효과를 검토하였다. 일반적으로 면역학적 측정용 시약은 4℃에서 보존하는 것이 적절한 보존방법이다. 프로테아제양 인자 내지 산화환원반응의 영향을 받기 쉽기 때문이다. 본 실시예에서는 F(ab')2의 분해가 특히 현저하고, 실험시약의 열화로 문제가 되는 원인이 되는, 37℃에서의 보존조건을 선택하여, Fab'Mal의 안정성을 검토한 예를 나타내었다.
[방법]
F(ab')2 또는 Fab'Mal을 함유하는 R1 시약을 조제하고, 상기 R1 시약을 37℃에서 보존한 경우의 비특이반응의 억제효과를 검토하였다. 상기 억제효과는 상기 시료 A의 측정치를 측정하는 것으로 평가하였다.
[보존안전성을 평가하는 어세이 조건]
200mg/L의 F(ab')2 또는 Fab'Mal을 함유시킨 R1을 조제하고, 37℃에서 보존한 경우의 차를 검토하였다.
본 실시예에서는 R1 시약을 37℃에서 17일간 보존하고, 0일, 5일, 10일 17일의 보존시점에서 시료 A를 측정하였다. 시료 A의 측정은 HITACHI7170에서, 실시예 1 기재의 조건과 동일하게 실시하였다.
[시험결과]
결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, F(ab')2는 R1에 첨가하고 37℃에서 보존한 경우에는 시료 A의 측정치가 시간이 지남에 따라 상승하였다. 한편, Fab'Mal에 있어서는, 17일까지 측정치의 경시적 상승은 발견되지 않았다. 이로부터, Fab'Mal은 F(ab')2가 문제라도, 보존성에 있어서는 안정하다는 것이 밝혀졌다.
<실시예 6>
[목적]
Fab'Mal 이외의 실시예에 대해 검토할 목적으로, BSA를 Fab'의 힌지부 티올기를 통하여 연결시킨 복합체(이하, Fab'BSA 라 칭함)를 제조하고, 비특이억제 효과를 검토하였다.
[방법]
BSA의 표면 아민기를 통하여, 말레이미드기와 숙시니미드 기를 구조에 포함하는 가교제인 EMCS(DOJIN 사 제)을 반응시켰다. 다음으로, Fab'에 EMCS화를 실시한 BSA를 결합시켰다. 효과 측정은 실시예 1에 기재된 방법을 준용하였다. 단, Fab'BSA는 0mg/L, 33mg/L, 66mg/L, 133mg/L로 첨가한 R1을 사용하였다.
[Fab'BSA의 제조방법]
BSA(Sigma사 제조)를 5mmol/L EDTA 함유 50mmol/L 인산완충액(pH6.0)으로 5mg/mL로 조제하고, 여기에 5mmol/L이 되도록 EMCS(Dojin 사)를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 반응시켜, 겔 여과에 의하여 BSA 분획을 회수하였다. 겔 여과의 런닝버퍼는 200mmol/L Tris, 150mMmol/L NaCl 함유 트리스 완충액(pH8.2)를 사용하였다. 항 사람 IgM 항체로부터의 Fab'의 조제는 실시예 1 기재의 방법에 의해 실시하였다. EMCS 수식한 BSA와 5mg/mL의 Fab'를 혼화하고, 4℃에서 16시간 교반하면서 반응시켰다. 반응액은 겔여과하고, 목적물인 Fab'BSA의 분획을 회수하여, 5mg/mL로 농축하였다. 겔 여과의 러닝버퍼는 5mmol/L EDTA함유 50mmol/L 인산완충액(pH 6.0)으로 제조하였다.
얻어진 Fab'BSA의 SDS-PAGE 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서, 왼쪽 레인으로부터, Fab'BSA, Fab'BSA, F(ab')2, Fab', 마커의 각 밴드를 나타낸다.
[시험의 결과]
결과를 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예의 하나인 Fab'BSA 는 농도의존적으로 비특이억제효과를 나타내었다. 이로부터, Fab'는 폴리에틸렌글리콜 특유의 효과가 아니고, BSA를 결합시킨 경우에서도 같은 효과를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다.
Fab'BSA 0mg/L 33mg/L 66mg/L 133mg/L
시료 A 10.26 4.96 2.16 1.01
<실시예 7>
[목적]
Fab'Mal, Fab'BSA 이외의 실시예에 대하여 검토할 목적으로, 폴리글타민산을 Fab'의 인지부 티올기를 통하여 결합시킨 복합체(이하, Fab'PG라 함)를 제조하고, 비특이억제 효과를 검토하였다.
[방법]
폴리글루타민산의 아미노기 말단의 아민기를 통하여, 말레이미드기와 숙시니미드 기를 구조에 포함하는 가교제인 EMCS(DOJIN 사 제조)를 반응시켰다. 다음으로, Fab'에 EMCS화를 실시한 폴리글루타민산을 결합시켰다. 효과 측정은 실시예 1에 기재된 방법을 준용하였다. 단, Fab'PG는 0mg/L, 5mg/L, 50mg/L, 100mg/L로 첨가한 R1을 사용하였다.
[Fab'PGA의 제조방법]
분자량 15kDa~50kDa의 폴리글루타민산(Sigma사로부터 구입)을 5mg/mL로 5mmol/L EDTA 함유 50mmol/L 인산완충액(pH6.0)으로 용해하고, 여기에 5mmol/L이 되도록 EMCS(Dojin 사)를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 반응시켜, 겔 여과에 의하여 폴리글루타민산 분획을 회수하였다. 겔 여과의 런닝버퍼는 200mmol/L Tris, 150mMmol/L NaCl 함유 트리스 완충액(pH8.2)을 사용하였다. 항 사람 IgM 항체로부터의 Fab'의 제조는 실시예 1의 방법으로 실시하고, 농도가 5mg/mL이 되도록, 5mmol/L EDTA함유 50mmol/L 인산완충액(pH 6.0)으로 제조하였다. EMCS 수식한 폴리글루타민산과 Fab'를 혼화하고, 4℃에서 16시간 교반하면서 반응시켰다. 반응액은 겔여과하고, 목적물인 Fab'PG의 분획을 회수하여, 5mg/mL로 농축하였다. 겔 여과의 러닝버퍼는 5mmol/L EDTA함유 50mmol/L 인산완충액(pH 6.0)을 이용하였다.
[시험의 결과]
결과를 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예의 하나인 Fab'PG는 농도의존적으로 비특이억제 효과를 나타내었다. 이에 따라 비특이억제 효과의 획득은 폴리에틸렌글리콜, BSA 특유의 효과가 아니고, 폴리글루타민산을 결합시킨 경우에도 동일한 효과를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다.
0mg/L 25mg/L 50mg/L 100mg/L
시료 D 16.05 7.74 1.91 1.01
시료 B 19.14 7.79 6.62 3.83
<실시예 8>
[목적]
Fab'Mal, Fab'BSA, Fab'PG 이외의 실시예에 대해 검토할 목적으로, 다당류인 텍스트란을 Fab'의 아미노기를 통하여 결합시킨 복합체(이하, Fab'DX라 함)을 제조하고, 비특이억제 효과를 검토하였다.
[방법]
덱스트란의 관능기의 일부를 알데히드기에 활성화시킨 시판품을 이용하여, 상기 알데시드기와 티올기 봉쇄 Fab'의 아미노기를 결합시켜, Fab'DX를 제조하였다. 효과 측정은 실시예 1에 기재된 방법을 준용하였다. 단, Fab'DX는 0mg/L, 27mg/L, 53mg/L, 80mg/L, 101mg/L, 133mg/L, 195mg/L로 첨가한 R1을 사용하였다.
[Fab'DX의 제조방법]
분자량 40kDa의 덱스트란의 커플링키트(피어스사 제조)를 구입하여, 추천된 프로토콜에 준하여 Fab'와 커플링을 실시하였다. 티올기 봉쇄 Fab'는 실시예 1의 방법으로 제조하였다. 10mg의 활성화 덱스트린(인산완충액으로 5mg/mL로 용해)과 5mg의 티올기 봉쇄 Fab'(인산완충액으로 5mg/mL로 용해)과, 0.4mL의 시아노보로하이드라이드(Cyanoborohydride solution)를 혼화하였다. 37℃에서 24시간 반응시켜, Tris가 최종 농도 200mmol/L가 되도록, 1mol/L Tris 완충액(pH 7.2)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액은 겔 여과하고, 목적물인 Fab'DX의 분획을 수득하고, 5mg/mL 정도로 농축하였다. 겔 여과의 런닝버퍼는 5mmol/L EDTA함유 50mmol/L 인산완충액(pH 6.0)을 이용하였다.
[시험의 결과]
결과를 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타난 D 다이머의 측정치의 단위는 ㎍/mL이다. 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예의 하나인 Fab'DX는 농도의존적으로 비특이억제 효과를 나타내었다. 이에 따라 비특이억제 효과의 획득은 폴리에틸렌글리콜, BSA, 폴리에틸렌글리콜의 특유의 효과가 아니고, 덱스트란을 결합시킨 경우에서도 동일한 효과를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 결합방법에 있어서도, Fab'의 아미노기를 표적으로 하여 폴리머를 결합시킨 경우도 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
0mg/L 27mg/L 53mg/L 80mg/L 101mg/L 133mg/L 195mg/L
시료 D 15.46 11.11 7.26 5.17 3.80 2.87 1.99
시료 B 19.09 14.49 15.81 16.27 16.43 16.51 16.22
<실시예 9>
[목적]
실시예 1~8에서는 IgM에 기인하는 비특이반응에 대한 실시예를 나타내었다. 본 실시예에서는 IgA에 기인하는 비특이 반응에서의 본 발명품의 효과를 검토하였다. 비특이반응 억제에는 사람 L 쇄에 친화성을 나타내는 항체로부터 얻어진 Fab'를 폴리에틸렌글리콜에 수식하여 얻어지는 항체단편복합체[이하, Fab'(L)Mal이라 함]를 이용하였다. 사람 면역글로블린의 L쇄는 IgG,IgM, IgA, IgE 형의 어느 것에도 구성도메인으로 공통유지되고 있기 때문에, 사람 L 쇄로의 결합능을 나타내는 항체는 상기 사람 면역글로블린의 어디에도 결합할 수 있다. 따라서, 항사람 L쇄항체는 IgM, IgG, IgA 등에 기인하는 비특이반응을 모두 저해할 수 있을 것으로 기대된다. 본 실시예에서는 항 IgM항체 이외의 항체를 사용한 경우의 발명의 실시예를 나타내는 것과 함께, 상기 항체단편을 폴리에틸렌글리콜로 수식하는 것으로 상기 항체단편에 의한 저해효과가 향상되는 것을 확인하는 것을 목적으로 하였다.
[방법]
Fab'(L)Mal은 항 사람 L 쇄 항체의 Fab'로부터 실시예 1의 Fab'Mal의 제조방법과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. IgA 형의 비특이검체에서의 Fab'(L)Mal 의 특이효과는 Fab'(L)Mal의 제조에 이용한 항체단편의 F(ab')2에 의한 효과와 비교하여 검토하였다. 측정시약은 D 다이머로하고, 상기 시약의 R1에 50mg/L의 농도로 항체 단백질을 첨가하여 비특이억제 효과를 비교하였다. 측정시약은 IgA에 기인하는 비특이반응을 발생시키는 시약 E를 사용하였다.
[시험 결과]
결과를 표 5에 나타내었다. 표 5에 나타난 D 다이머 측정치의 단위는 ㎍/mL이다. 본 발명의 실시예 1의 하나인 Fab'(L)Mal 은 시료 E에 대하여, 비특이억제 효과를 나타내었다. 또한 이 억제효과는 같은 단백질양의 F(ab')2를 첨가한 경우와 비교하면, 현저히 강한 효과를 나타내는 것이 밝혀졌다. 본 실시예에서, 항 IgM 항체 이외의 항체로부터 얻어진 본 발명품이라도 비특이억제 효과를 나타내는 것이 밝혀졌다. 또한 종래기술보다 강한 억제효과를 나타내는 것이 확인되었다. 시료 E의 D 다이머의 진정치는 시료를 미리 항IgA 항체와 접촉시켜, 비특이반응의 원인인 항체인자를 제거한 다음 D 다이머 수치를 측정하여 얻어진 수치를 나타낸다.
비특이반응 억제제 없음 F(ab')2 50mg/L Fab'(L)Mal 50mg/L 진정치
시료 E 49.49 12.96 1.88 1.90
본 발명의 비특이반응억제제는 면역학적 측정의 용도에 적용할 수 있다.
이상, 본 발명을 특정의 양태에 따라 설명하였으나, 당업자에 자명한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (8)

  1. 비특이반응 인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편과 고분자 화합물의 복합체를 포함하는 면역학적 측정용 비특이반응 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고분자화합물이 다당류, 단백질 및 유기고분자 중합체로 구성된 군에서 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 비특이반응 억제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유기고분자 중합체가 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 비특이반응 억제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자 화합물의 분자량이 200Da~1000kDa인 것을 특징으로 하는 비특이반응 억제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 F(ab')2 ,Fab', Fab, Fd, L쇄, H쇄 또는 rIgG인 것을 특징으로 하는 비특이반응 억제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그 단편과 고분자 화합물과의 결합이 티올기, 아미노기, 히드록시기 혹은 카르복실기를 이용하는 화학수식, 또는 비오틴-아비딘 결합에 의한 것인 것을 특징으로 하는 비특이반응 억제제.
  7. 비특이반응인자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편과 고분자 화합물과의 복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정방법.
  8. 제7항에 있어서, 면역학적 측정방법이 라텍스응집 광학적 측정법, 엔자임이뮤노어세이, 면역비롱법, 효소면역측정법, 형광면역측정법 또는 방사면역측정법인 것을 특징으로 하는 면역학적 측정방법.
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