NO875198L - Fastfase - analysemetode. - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører området fastfaseanalyse for påvisning av antigener med immunologiske fastfasemetoder.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Når en immunologisk fastfaseraetode brukes for å måle eller bestemme et bestemt antigen, kan en fast fase være dekket med antistoffer mot dette antigenet. Dette foregår ofte ved fysisk adsorpsjon av antistoffene på innsiden av plastrør eller brønner i plastplater ("belegg" i den tekniske litteratur). Når den antigen-holdige prøveløsning plasseres i rørene eller brønnene, bindes antigenet selektivt (antistoff-antigenreaksjon) til det adsorberte antistoff. Røret eller brønnen kan så tømmes og vaskes grundig. På denne måten kan tilstedeværende antistoff på overflaten overføres fra matrissen (mediet), hvori det har foreligget, til en meget lettere håndterbar fast fase hvor påvisning og kvantifisering kan utføres. Med den velkjente ELISA-metode kan denne utføres med et ytterligere antistoff rettet mot antigenet. Dette antistoffet kan merkes med et enzym såsom pepperrot-peroksydase (HRP) eller alkalisk fosfatase. Det enzym-merkede (enzym-konjugerte) antistoff plasseres i røret eller brønnen og bindes til antistoffet som foreligger på veggene eller overflatene. Overskuddet av enzymmerket antistoff vaskes vekk, og det gjenværende enzym-merkede antistoff påvises med et enzymsubstrat som omdannes til et farget produkt.

Variasjonene i den ovenfornevnte ELISA-teknikk er tallrike, men grunnlagene er de samme. Teoretisk fjernes bare antigenet fra sin opprinnelige matrisse til en overflate hvor det blottleg-ges jevnt og er tilgjengelig for analyse.

I praksis er det alltid andre komponenter i prøveløsningen som bindes til denne overflaten, enten til det absorberte antistoff eller direkte til den faste fase ved en annen meka-nisme. Disse ikke-spesifikkbundede komponentene utgjør en betydelig feilkilde i fremgangsmåten, da de kan innvirke på analysen som skal utføres og gi opphav til falske positive eller falske høye måleresultater. I den tradisjonelle ELISA-teknikken kan ikke-antigenkomponenter i prøven som er bundet til den faste fase absorbere enzymkonjugert antistoff og gi et falskt høyt måleresultat. Disse ikke-antigen-forårsakede måleresultater antas å stamme fra ikke-spesifikk absorpsjon.

I kvalitativ analyse (f.eks. bare undersøkelse av om antistoffer eller antigener er tilstede eller mangler i en prøve) vil høyere måleresultater som skyldes ikkespesifikke effekter gi et falskt positivt resultat. Forsøk på å redusere de falske positive effekter ved å heve diskrimineringsnivået for målingen, vil forårsakeøkninger i antallene av falske positive resultater. Således skaper ikkespesifikke effekter i disse målinger usikkerhet i diagnosen.

Tidligere teknikker er forsøkt å redusere ikkespesifikk absorpsjon (eller binding) til et minimum. F.eks. har overflaten av den faste fase blitt grundig "blokkert" for å gjøre den ute av stand til å absorbere ytterligere komponenter. I tillegg har de fangede antistoffer blitt spaltet enzymatisk og den antigen-bindende fraksjon ((Fab)2-fragment) har blitt isolert og immobilisert på den faste fase. Imidlertid, har fullstendig suksess ikke blitt oppnådd med disse teknikker. Videre bør det bemerkes at vanskeligheter ved bruk av ELISA-teknikken nylig er blitt funnet i økende grad; se f.eks. Gaffney et al., 1984, Thromb.Haemostas, 52(l):96-97, Boscato, et al., 1986, Clin. Chem. 32(8):1491-1495.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Ifølge foreliggende oppfinnelse er en forbedret fremgangsmåte for å påvise et antigen i en prøve tilveiebrakt som omfatter trinnene belegging av en første fastfase og en andre fastfase med et antigen-spesifikt antistoff. Den første fastfase utsettes deretter for en løsning som inneholder det samme antigen-spesifikke antistoff som brukes til å belegge den første og andre faste fase og antigenet. Den andre faste fase utsettes for en løsning som inneholder et ikke-spesifikt antistoff og antigenet. Antigenmengden som er bundet til den første faste fase og til den andre faste fase bestemmes deretter ved hjelp av velkjente midler for en fagmann. For å kvantifisere mengden av antigen i prøven blir mengden antigen bundet til den første faste fase subtrahert fra mengden av antigen bundet til den andre faste fase.

Ifølge en andre utførelsesform av foreliggende oppfinnelse hvor man ønsker å måle et bestemt antigen-spesifikt antistoff i en prøve, består oppfinnelsen i å belegge en første fastfase og en andre fastfase med et antigen som er spesifikt for antistoffet som skal prøves. Den første fastfase utsettes så for en løsning som inneholder det samme antigen som brukes til å belegge den første og andre faste fase og det antigen-spesifikke antistoff. Den andre faste fase utsettes så for en løsning som inneholder et ikke-spesifikt antigen og det antigen-spesifikke antistoff. Mengden av antistoff bundet til den første faste fase og til den andre faste fase bestemmes så ved hjelp av velkjente midler for en fagmann på området. For å kvantifisere mengden av antistoff i prøven, blir mengden av antistoff som er bundet til den første faste fase trukket fra mengden av antigen bundet til den andre faste fase.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte hvor man utsetter prøven som skal analyseres eller bestemmes med hensyn til antigen for en fast fase belagt med antistoffer mot antigenet for å fremkalle antigen-antistoffbinding, hvoretter man så påviser eller måler det bundede antigen ved velkjente metoder for en fagmann på området.

Nyheten ved oppfinnelsen bygger på den uventede oppdagelse at ved å utføre denne eksponering i nærvær av visse spesielle antistoffer som er løselige i prøven eliminerer eller reduserer man problemet med ikkespesifikk adsorpsjon. I et forsøk på å løse problemet med ikkespesifikk adsorpsjon for konjugat ved utvikling av ELISA for enzymet vevs-plasminogenaktivator (t-PA) ble virkningen av løselige antistoffer undersøkt i det første inkubasjonstrinnet, d.v.s. når den undersøkte prøve utsettes for en fast fase belagt med antistoff. Man gjorde da to viktige observasjoner, nemlig: 1. Selv relativt lave konsentrasjoner av anti-t-PA-antistoffer med den samme spesifitet som brukes til å belegge overflaten av den faste fase, var tilstrekkelig til å blokkere det spesifikke t-PA-resultat. Det uventede resultat ville ha vært at spesifikke antistoffer i den flytende fase (prøvefase) ville føre til en fordeling av t-PA-antigen mellom de to faser i overensstemmelse med de relative mengder av antistoffer i de to faser. Hvis f.eks. 0,2 pg antistoff var forbundet med den faste fase og 2 pg med den flytende fase, skulle antigenet fordeles 1 til 10 mellom de faste og hhv. flytende faser. I praksis er fordelingen 1 til 99 i slike tilfeller. Denne oppdagelse muliggjør en metode hvor det løselige antistoff først plasseres i målebrønnen (eller røret) og prøven deretter settes til det samme røret, hvilket fra et praktisk standpunkt er en meget attraktiv metode. Behovet for å forinkubere prøven med oppløst antistoff ville gjøre_ metoden vanskeligere.

2. Når antistoffer fra ikkeimmuniserte dyr (så-kalte normale antistoffer) inngår i den første inkubering, reduseres resultatet generelt når vevsplasminogenaktivator (t-PA) i blodplasmaet ble bestemt med ELISA-teknikken. I noen tilfeller var reduksjonen større enn 50%, men normalt ca. 10%. Bare i ett tilfelle av 45 ble en slik reduksjon upåvist. Forut kunne bare en reduksjon forventes i sjeldne tilfeller, nemlig i prøver som inneholder såkalte rheumatoide faktorer. (Ingen virkning av protein som sådan ble forventet fordi de 10 pg/ml av normale antistoffer som ble tilsatt ble fullstendig overskygget av de 3000Mg/ml protein som kom fra blodplasmaprøven.)

Den foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendelig i en ikke-kompetitiv immunologisk fastfasemetode såsom ELISA-teknikken; se Engvall, 1980, Methods Enzymol. 70A, 419-439. Oppfinnelsen representerer en praktisk, anvendelig løsning på problemet ikke-spesifikk adsorpsjon og har blitt vist å forbedre mulighe-tene for pålitelig måling eller analyseresultater i bestemte analysemetoder betydelig.

Følgelig er det et mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret måling, hvori antallet av falske positive verdier reduseres sterkt eller elimineres.

Det er et videre mål for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret målemetode hvor antallet av falske høye verdier sterkt redusrees eller elimineres.

Enda et annet mål for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en forbedret målemetode hvor man kan måle nøyaktig mengden av antigen-spesifikt antistoff i en prøve.

Et annet mål for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en målemetode hvor man nøyaktig kan måle mengden av antistoff som er spesifikke for AIDS-virusen og redusere antallet av falske positiver.

Enda et mål for den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en målemetode hvor man nøyaktig kan måle mengden av vevsplasminogenaktivator i en prøve.

Enda et mål for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en kvalitativ målemetode hvor antallet av falske positiver reduseres til et minimum.

Disse og andre mål, trekk og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil bli åpenbare etter en gjennomgåelse av den følgende detaljerte beskrivelse av den foretrukne utførelsesform og de medfølgende krav.

Kort beskrivelse av tegningen

FIG. 1 er en sammenligning av måleresultater under bestem-melsen av t-PA med ELISA-metoden i 43 blodplasmaprøver. For hver prøve ble målinger foretatt i tre målebrønner med for-innfylling av 150 pL PBS-Tween (0), 150 pL 10 mg/l normal IgG (N) og 150 pL 10 mg/ml anti-t-PA IgG (A) under prøveinkubasjonstrinnet. Resultatene av den samme prøve er forbundet med en ledning.

Detaljert beskrivelse

Den totale ELISA-reaksjon, Rtot , kan ansees som sammensatt av tre deler: (a) en antigen-spesifikk del, RAg, som kan undertrykkes ved å tilsette antigen-spesifikke immunoglobuliner til prøven; (b) en antigen-uspesifikk del som kan undertrykkes ved å tilsette ikke-immune immunoglobuliner til prøven, og følgelig burde kalles immunoglobulin-spesifikk reaksjon, Rig,* og (c) en uspesifikk restdel, Rur, som er upåvirket av og uavhengig av immunoglobulinenes nærvær. Således:

Når prøven settes til mikro-undersøkelsesplatebrønner som inneholder antigen-spesifikke antistoffer ("forfyll A" brønner), blir både RAg og Rig eliminert fra reaksjonen, som her er kalt Ra, følgelig: Ra = Ru r. Når prøven måles i brønner inneholdende antistoffer fra ikke-immuniserte dyr ("forfyll N" brønner). elimineres bare Rig fra reaksjonen, hvilket her er kalt Rn: Rn= Rur. Forskjellen mellom Rn og Ra er derfor den antigen-spesifikke del av målereakjonen, d.v.s. målet for målemetoden: Rn-

Ra = RAg. Muligheten for falske-positive resultater følger med ELISA-teknikker slik de vanligvis utføres. Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse blir det mulig å hovedsakelig eliminere ikke-spesifikk adsorpsjon på en enkel måte.

Den foreliggende oppfinnelse adskiller seg fra tidligere forsøk på å løse dette problem ved at man har funnet en praktisk fremgangsmåte for å fullstendig blokkere spesifikk binding. Prøven inkuberes i to systemer. I én blokkeres spesifikk binding ikke selektivt og i den andre er den. Ikke-spesifikk binding uttrykkes i begge systemer, og det spesifikke resultat oppnås som forskjellen.

Ved gjennomføringen av den foreliggende oppfinnelse anvendes tre antistoffpreparater. Et første for å belegge den faste fase, et andre med den samme spesifitet for blokkering av av de spesifikke måleavlesninger (dette kan være det samme antistoff-preparat som brukes for belegget), og et tredje som ikke blokkerer det spesifikke resultatet. De siste to antistoffpreparater utgjør et par og bør være så like hverandre som mulig. De bør fortrinnsvis bare være forskjellige i én egenskap, nemlig reakjsonen med antigen. Ett bør reagere (være spesifikt) og det andre bør ikke reagere (være uspesifikt) med antigenet. Antistoffene bør derfor ha den samme eller lignende opprinnelse (f.eks. stamme fra den samme dyreart, idet begge er monoklonale fra den samme undergruppe eller begge er polyklonale) og bør fremstilles på den samme eller en lignende måte.

For å overvinne vanskelighetene i forbindelse med falske høye eller falske positive måleresultater eksponerer man ifølge foreliggende oppfinnelse to alikvoter av prøven som inneholder antigenet som skal bestemmes for to faste faser med identiske anti-antigen-antistoff-belagte overflater. En eksponering (eksponering 1) gjennomføres i nærvær av antistoffer i prøven med den samme spesifitet som antistoffene hvormed de faste faser er belagt, og den andre eksponering (eksponering 2) utføres fortrinnsvis i nærvær av antistoffer i prøven med ikke-spesifitet for det aktuelle antigen, men for øvrig hovedsakelig det samme som antistoffene tilstede i prøven i eksponering 1, og man påviser antigenet ved hjelp av forskjellen i målingsreaksjonen mellom det bundede antigen i eksponering 1 og det bundede antigen i eksponering 2.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er primært ment for bruk i en ikke-kompetitiv immunologisk fastfasemetode av ELISA-typen, hvilket også betyr at antistoffet det vises til fortrinnsvis bør være immunoglobulin. Fremgangsmåten er selvføl-gelig primært ment for kvantitativ bestemmelse av antigen, men fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er også egnet for kvalitativ analyse, hvor usikkerheten i målingen kan være så stor at det kvalitative resultat kunne betviles. Med andre ord betyr uttrykket "påviser" i foreliggende oppfinnelse både påvisning av mengden av et antigen og nærværet av et antigen. Det skal være klart at uttrykket "kvantifisere" slik det her brukes betyr både kvantitativ måling og kvalitativ måling av et antigen eller antistoff i en prøve.

Som det skulle være klart for en fagmann på området er de

to alikvoter av prøven som eksponeres i eksponeringene 1 og 2 fortrinnsvis de samme, fordi man på denne måten direkte oppnår denønskede forskjell mellom bundet antigen i eksponering 1 og bundet antigen i eksponering 2 uten noen ytterligere feilkilder. Imidlertid utelukker dette gjennomføring av metoden med forskjellige alikvoter, d.v.s. prøvemengder eller mengder av prøven, forutsatt at man kjenner mengdene av alikvotene nøyaktig. Det skal også bemerkes at antigenprøven som skal undersøkes, kan tilsettes samtidig med det spesifikke og ikke-spesifikke antistoff til de to faste faser eller antigenprøven kan settes til de to brønner etter at de spesifikke og ikke-spesifikke antistoffer har blitt tilsatt.

For at analysen ifølge oppfinnelsen skal være optimalt pålitelig, bør eksponering av de to faste faser gjennomføres under hovedsakelig identiske betingelser. Dette betyr at begge faste faser er hovedsakelig identiske med hverandre, men det er teoretisk tilstrekkelig at de faste faser tilveiebringes med hovedsakelig identiske anti-antigen-antistoff-belagte overflater.

Uttrykket "antistoffer oppløst i prøven" eller lignende uttrykk betyr fortrinnsvis at antistoffene som er tilsatt eller tilstede i prøven under den aktuelle prøve-eksponering er hovedsakelig oppløselige i prøvesubstansen som analyseres. Dette utelukker imidlertid ikke muligheten for at disse også er immobilisert på en fast fase, forutsatt at fasen kan skilles fra den faste fase når påvisningen av antigenet utføres.

Som nevnt ovenfor har de tilstedeværende antistoffer i eksponering 1 den samme spesifitet som antistoffene den faste fase er belagt med. I prinsippet betyr dette at antistoffene reagerer med eller bindes til antigenet som skal påvises og blokkerer antigenets evne til å reagere med antistoff på fast-fasen.

Derimot viser antistoffene som er tilstede i eksponering 2 ikke-spesifitet for det aktuelle antigenet, d.v.s. de reagerer ikke med eller bindes til antigenet. For øvrig bør de imidlertid være hovedsakelig like antistoffene tilstede i eksponering 1, hvilket betyr at de er av samme opprinnelse (samme dyreart) og er fremstilt med hovedsakelig den samme metode. Uttrykket "samme" bør imidlertid tolkes på rimelig måte i denne forbindelse, fordi oppfinnelsesideen ikke vil være forlatt hvis antistoffene ikke er "de samme" på noen måte som er totalt irrelevant for oppfinnelsen.

I tillegg til påvisningen av antigenet ved hjelp av forskjellen mellom det bundede antigen under eksponering 1 og det bundede antigen under eksponering 2 utføres denne påvisningen ifølge en fremgangsmåte som er kjent for en fagmann på området. Således vil en ytterligere beskrivlese av påvisningsprosedyren ikke bli gitt her.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for påvisning av antigen er av spesiell interess for påvisning av antigenet t-PA (vevsplasminogenaktivator) i biologiske prøver. Blodplasma, leddvæske, cerebrospinalvæske, seminalvæske eller cellekulturme-dier kan nevnes som eksempler på slike biologiske prøver.

En spesielt foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er å først plassere antistoffene på anordningen, f.eks. et prøverør eller en plate med brønner, som omfatter den faste fase, slik at de oppløselige antistoffer allerede er på plass på den innvendige flaten av røret eller brønnene når den aktuelle prøven tilsettes. På denne måten benyttes oppfinnelsen på en praktisk og økonomisk fordelaktig måte, mens et pålitelig resultat samtidig oppnås.

Det må være klart at den faste fase som nevnes i beskrivel-sen av den foreliggende oppfinnelse også kan være partikler såsom småkuler. Disse blandinger av partikler innbefatter, men er ikke begrenset til, agarose, polystyren, lateks og polymetakrylat. Partiklene kan ha enhver form.

I denne spesielt foretrukne utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan man først tilsette et volum av antistoffene tilsvarende 5-95 volum-% av den aktuelle anordningens volum. Fortrinnsvis svarer volumet av antistoffene til 10-90%

av anordningens volum. Enda heller tilsvarer antistoffenes volum 20-80% av anordningens volum.

Med hensyn til mengdene av antistoff som er tilstede under eksponering 1 eller hhv. eksponering 2, er et passende konsen-trasjonsområde blitt vist å være mellom ca. 1 og 100 mg/l. Imidlertid, er oppfinnelsen på ingen måte begrenset til dette området. Et foretrukket område er mellom 20 og 80 mg/l. Det skal være klart at antistoffkonsentrasjonsområdet avhenger av den spesielle måling som utføres. Imidlertid, er området mellom ca. 1 og 100 spesielt egnet for den ovenfornevnte bestemmelse av t-PA i biologiske prøver.

Skjønt oppfinnelsen generelt er blitt beskrevet og forklart i forbindelse med påvisning av et antigen, bør fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også være anvendelig for den direkte motsatte reaksjon, d.v.s. for påvisning av antistoffer. Med andre ord er påvisningen av antistoffer også innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Mer spesifikt vedrører fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen påvisningen av antistoffer med en immunologisk fastfasemetode, hvor man eksponerer prøven som skal bestemmes med hensyn til antistoffer for en fast fase belagt med spesifikt antigen for antistoffet, hvilket gir en antistoff-antigen-binding, hvorpå man bestemmer det bundede antistoff på en kjent måte.

For å ifølge foreliggende oppfinnelse overvinne falske høye eller falske positive resultater eksponerer man to alikvoter, fortrinnsvis av den samme størrelse, av prøven som inneholder antistoffet som skal bestemmes for to faste faser med identiske antigen-belagte overflater, idet én eksponering (eksponering 1) utføres i nærvær av antigener oppløst i alikvoten med en lignende spesifitet for det av antigenene hvormed de faste faser er blitt belagt, og den andre eksponering (eksponering 2) utføres i nærvær av antigener oppløst i alikvoten med en ikke-spesifitet for det aktuelle antistoff. Antigenene i eksponering 2 bør for øvrig ha lignende struktur som antigenet oppløst i alikvoten i eksponering 1. Man påviser antistoffet ved hjelp av forskjellen mellom det bundede antistoff i eksponering 1 og det bundede antistoff i eksponering 2. Denne metoden kan brukes ved påvisning av HTLV III-spesifikke antistoffer (HIV AIDS virus-spesifikke) i legems-væsker. Andre antigen-spesifikke antistoffer som kan måles med foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, kardiolipin, fosfatidylkolin, kollagen, hepatititt-A-antigen, hepatitt-B-antigen og Borelea.

Generelt utføres fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse etter den følgende fremgangsmåte: Mikrotiterplater belegges med antistoff ved å inkubere i platenes brønner 100-1000 pl av en løsning inneholdende 1 -

100 mg/l antistoff og 0,1 - 1,0 mol/l NaHCG-3 under forsiktig rysting i to til fire timer ved 20-30°C. Buffere som kan brukes i belegningsprosessen er, men er ikke begrenset til, protein ikke-denaturerende buffer inneholdende et protein-ikke-denaturerende vaskemiddel som "Tween" 20, "Triton"X-100, "Pluronic" overflateaktive midler, f.eks. (fosfatbufret saltvann (PBS) Tween eller PBS Tween med EDTA.

Brønnene tømmes og innholdene vaskes med PBS Tween.

For hver prøve fylles to brønner, én med 100-200 pl normalt antistoff, 5-15 mg/ml, og én med 100-200 pl av et spesifikt antistoff, 5-15 mg/ml, begge oppløst i PBS Tween. Alternativt kan bufferen være PET-buffer som inneholder EDTA. Hvis PET-bufferen brukes, er surgjøringsprosessen som beskrives nedenfor ikke nødvendig.

Blodprøver samles på vanlig måte og sentrifugeres ved 1000 - 3000 x g i flere min.. Plasmaet surgjøres ved å inkubere ca. én volumdel plasma med en volumdel surgjøringsbuffer såsom natriumacetatbuffer, pH 3,5-4,5 i 10-20 min. ved 20-30°C. Det surgjorte plasmaet nøytraliseres ved å tilsette en volumdel pH-justerende buffer, såsom natriumfosfat-Tris, pH 8-11.

En 20 til 50 pl alikvot fra hver plasmaprøve plasseres i brønner forut fylt med normalt eller spesifikt antistoff hhv.,

i en konsentrasjon på 5-15 mg/l oppløst i PBS Tween. Prøven inkuberes i 4-5 timer ved 20-30°C under forsiktig rysting.

Brønnene tømmes for sitt innhold og vaskes med PBS Tween.

En 100-300 pl alikvot av HRP-konjugert antistoff, 1-3 mg/l, oppløst i PBS Tween, inkuberes i 4-5 timer ved 20-30°C i brøn-nene .

Brønnene tømmes for sitt innhold og vaskes med PBS Tween eller PBS Tween med EDTA.

Et 100-300 gl alikvot peroksydasesubstrat oppløst i sitrat-fosfatbuffer, pH 4-6, inkuberes deretter i brønnene ved 20-30°C

i mørket i 20-40 min..

Substratreaksjonen avbrytes ved å tilsette 10-100 |jl 4-5 mol/l H2 SG-4 .

Absorpsjonen ved 490-495 nm registreres. Forskjellen i absorpsjonen mellom brønnene fylt med normalt antistoff og brønnene fylt med spesifikt antistoff beregnes for de respektive plasmaprøvene. Dette representerer den antigen-spesifikke del av reaksjonen; denne sammenlignes med en standardkurve hvor antigen er fortynnet i normalt blodplasma.

De følgende spesifikke eksempler vil illustrere oppfinnelsen da den spesielt vedrører måling av vevsplasminogenaktivator. Det vil være klart at andre eksempler vil være nærliggende for en fagmann på området, og at oppfinnelsen ikke er begrenset til disse spesifikke illustrerende eksempler.

Eksempel 1

Nedenfor følger en beskrivelse av proteinkomponentene, mindre vanlige kjemikalier og buffere som brukes i eksempelet.

Geite- anti- t- PA IgG-antiserum fra t-PA fra menneskelivmor produseres i geit. IgG-fraksjonen renses ved kromatografi på A-Sepharose-protein. Preparatet frysetørkes og rekonstitueres i vann ved bruk.

Normalt geite IgG. IgG-fraksjonen fra serumet til en ikke- immunisert geit renses ved kromatografi på A-Sepharose-protein. Preparatet frysetørkes og rekonstitueres i vann før bruk.

Pepperrot- peroksydase- konjugert geite- anti- tPA IgG. Geite-anti-t-PA IgG (beskrevet ovenfor) konjugeres med pepperrotperok-sydase (HRP Sigma Type VI) ved glutaraldehydmetoden. Konjugatet renses for fri peroksydase ved kromatografi på A-Sepharosepro-tein.

Vevsplasminogenaktivator ( t- PA) i sin enkeltkjedede form fra menneske-melanoma-celler; frysetørket preparat med bovinserumal-bumin som bærer.

1, 2- fenylendiamin ( O. P. D.) peroksydasesubstrat, syntetisk kvalitet fra Merck Chemical Co., Rahway, New Jersey)

PBS- Tween buffer, 20 mMl/1 natriumfosfatbuffer, 100 mmol/1 NaCl, 0,1 g/l Tween 20, pH 7,4.

PET buffer, 20 mmol/1 natriumfosfatbuffer, 100 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 EDTA, 0,1 g/l Tween 20, pH 7,9.

Citratfosfat- buffer, 100 mMl/1 natriumdihydrogenfosfat justeres til pH 5,0 med 100 mMl/1 citronsyre.

Surgjøringsbuffer, 1,0 Ml/l natriumacetatbuffer, pH 3,9.

pH- justeringsbuffer, 50 mMl/1 natriumfosfat, 500 mMl/1 Tris (Tris-hydroksymetylaminometan), pH 10,4.

ELISA-metodikken som brukes i eksempelet bygger på fremgangsmåten til Bergsdorf et al., 1983, Thromb. Haemostas., 50(3), 740-744.

Bestemmelser av t-PA-antigenkonsentrasjonene i plasmaet utføres som følger: Nittiseks-brønners mikrotestplater (Nunc immunoplate 1, Nunc, Danmark) belegges med anti t-PA IgG ved å inkubere 200 pl av en løsning inneholdende 10 mg/l anti t-PA IgG og 0,1 mol/l NaHC03i platenes brønner under forsiktig rysting i tre timer ved 25°C.

Brønnene tømmes og innholdene vaskes med PBS Tween eller PET-buffer.

For hver prøve fylles to brønner, én med 150 pl normalt IgG, 10 mg/ml, og en med 150 pl anti-t-PA IgG, 10 mg/ml, begge oppløst i PBS Tween.

Blodpørver samles på vanlig måte (natriumcitrat eller EDTA) og sentrifugeres innen 5 min. ved 2000 x g i 5 min.. Plasmaet surgjøres ved å inkubere én volumdel plasma med én volumdel surgjøringsbuffer i 15 min. ved 25°C. Det surgjorte plasmaet nøytraliseres ved å tilsette én volumdel pH-justeringsbuffer. Hvis PET-bufferen brukes i denne fremgangsmåten, kreves ikke surgjøringen av plasmaet.

En 20 til 50 pl alikvot (avhengig av t-PA-innholdet i prøven; måleresultat er uavhengig av det tilsatte volum innenfor dette området) fra hver plasmaprøve plasseres i brønner som er forut-fylt med normalt eller hhv. anti-t-PA IgG, i en konsentrasjon på 10 mg/l oppløst i PBS Tween. Prøven inkuberes i 3 timer ved 25° C under forsiktig rys.ting.

Brønnene tømmes for sitt innhold og vaskes med PBS Tween eller PET buffer.

En 200 pl alikvot av HRP-konjugert t-PA IgG, 2 mg/l, oppløst i PBS Tween eller PET buffer inkuberes i 3 timer ved 25°C i brønnene.

Brønnene tømmes for sitt innhold og vaskes med PBS Tween.

En 200 pl alikvot substrat (0.P.D./H2 O2) oppløst i citrat-fosfatbuffer, pH 5,0, inkuberes så i brønnene ved 25°C i mørket i 30 min..

Substratreaksjonen avbrytes ved å tilsette 50 pl 4,5 Ml/l H2SO4.

Absorpsjonen ved 492 nm registreres. Forskjellen i absorpsjon mellom brønnene fylt med normalt IgG og brønnene fylt med anti-t-PA IgG beregnes for de respektive plasmaprøver. Dette representerer den t-PA-spesifikke del av reaksjonen; denne sammenlignes med en standardkurve hvori t-PA er fortynnet i normalt menneskeplasma.

Eksempel 2

Det følgende eksperiment kjøres for å undersøke behovet for en metode til å korrigere et uriktig resultat oppnådd p.g.a. ikke-spesifikke bindingseffekter når ELISA-metodikken brukes til å bestemme t-PA-antigenkonsentrasjoner.

Plasmaprøver fra 34 pasienter analyseres med ELISA. Prøvene plasseres i brønner fylt med PBS Tween, normalt IgG eller anti-t-PA IgG.

Resultatene er vist på fig. 1. Prøvene plassert i brønner fylt med normalt IgG viser meget lavere absorpsjon enn prøvene plassert i brønner med PBS Tween. I 31% av tilfellene (13/34)

er forskjellen større enn 100 milliabsorpsjonsenheter. Enkeltprøver viser høyabsorpsjon selv i nærvær av anti-t-PA

IgG. Således er det nødvendig å bruke metodikken ifølge foreliggende oppfinnelse ved både normale og anti-t-PA antistoffer for å unngå et falskt positivt resultat som skyldes ikke-spesifikk absorpsjon under antigenkonsentrasjonbestemmelser med ELISA-teknikken (eller lignende teknikker).

Eksempel 3

For å undersøke videre frekvensen av plasmaprøver som gir høy ikkespesifikk binding analyseres prøver fra 519 individer med hensyn til t-PA-konsentrasjon. Plasmaprøvene plasseres i brønner fylt med anti-t-PA IgG som beskrevet ovenfor. Disse brønner kalles "Forfylling A Brønner- Dette vil tilsvare. Resultatene er angitt i tabell 1.

"n" er antallet prøver. Det normale t-PA-innhold er ca.

6 ug/l, hvilket i denne analysemetoden tilsvarer et spesifikt måleresultat på ca. 200 milliabsorpsjonsenheter (mA). Tabell 1 viser at uten å bruke foreliggende oppfinnelse vil antigeninnhol-det i ca. 2% av prøvene overvurderes med minst 40%. Man skal her være klar over at i kliniske undersøkelser er alvorlig målefeil på noen få pr. ml av prøvene tilstrekkelig til å gi betydelig usikkerhet og ekstra arbeide.

Det skal selvfølgelig være klart at det foregående bare vedrører en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse og at tallrike modifikasjoner eller forandringer kan utføres deri uten at man fjerner seg fra ideen og omfanget av oppfinnelsen som er presentert i de medfølgende krav.

Claims (24)

1. Forbedret fremgangsmåte ved påvisning av et antigen i en prøve omfattende trinnene: a. belegging av en første fast fase og en andre fast fase med et antigen-spesifikt antistoff; b. den første faste fase utsettes for en løsning inneholdende det samme antigen-spesifikke antistoff som brukes til å belegge den første og andre faste fase og antigenet; c. den andre faste fase utsettes for en løsning inneholdende et ikke-spesifikt antistoff og antigenet; d. mengden av antigen som er bundet til den første faste fase og til den andre faste fase bestemmes; og e. mengden av antigenet i prøven kvantifiseres ved å subtrahere mengden av antigen bundet til den første faste fase fra mengden av antigen bundet til den andre faste fase.

2. Fremgangsmåte for bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at den første faste fase i trinn b først utsettes for en lø sning inneholdende det antigen-spesifikke antistoff og en løsning inneholdende antigenet settes så til lø sningen som inneholder det antigen-spesifikke antistoff.

3. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre faste fase i trinn c utsettes først for en løsning inneholdende det ikke-spesif ikke antistoff, og en løsning inneholdende antigenet settes så til løsningen som inneholder det ikke-spesifikke antistoff.

4. Forbedret fremgangsmåte for bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene velges fra gruppen bestående av monoklonale antistoffer og polyklonale antistoffer.

5. Forbedret fremgangsmåte for bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at det ikke-spesifikke antigen og det antigenspesifikke antigen stammer fra de samme arter.

6. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at den første faste fase er den innvendige flaten til et første prøverør og den andre faste fasen er den innvendige flaten til et andre prø verør.

7. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at den første fase er den innvendige flate av en første brønn i en mikrotiterplate, og den andre faste fase er den innvendige flate av en andre brønn i en mikrotiterplate.

8. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at de faste faser er overflaten til partikler.

9. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 6, karakterisert ved at partiklene omfatter materiale valgt fra gruppen bestående av agarose, polystyren, lateks og polymetakrylat.

10. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene omfatter immunoglobuliner.

11. Forbedret fremgangsmåte ved påvisning av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at antigenet omfatter vevsplasminogenaktivator-antigen eller urin-plasminogen-aktiva-tor.

12. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at fremgangsmåten er en kvalitativ bestemmelse.

13. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen-spesif ikt antistoff i en prøve omfattende trinnene: a. en første fast fase og en andre fast fase belegges med et antigen som er spesifikt for antistoffet som skal undersø kes; b. den første faste fase utsettes for en løsning inneholdende det samme antigen som brukes for å belegge de første og andre faste faser og det antigen-spesifikke antistoff; c. den andre faste fase utsettes for en lø sning som inneholder et ikke-spesifikt antigen og det antigen-spesifikke antistoff; d. mengden av antigen-spesifikt antistoff som er bundet til den første faste fase og til den andre faste fase bestemmes; og e. mengden av antigen i prøven kvantifiseres ved å subtrahere mengden av antistoff bundet til den første faste fase fra mengden av antistoff bundet til den andre faste fase.

14. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen-spesifikt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at den første faste fase i trinn b først utsettes for en løsning inneholdende antigenet, og en lø sning inneholdende det antigen-spesifikke antistoff tilsettes så til løsningen som inneholder antigenet.

15. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen-spesif ikt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at den andre faste fase i trinn c først utsettes for en løsning inneholdende det ikke- spesifikke antigen, og en lø sning inneholdende det antigen-spesifikke antistoff settes så til løsningen som inneholder antigenet.

16. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen-spesif ikt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at antistoffene velges fra gruppen bestående av monoklonale antistoffer og polyklonale antistoffer.

17. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen-spesifikt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at strukturen til det ikke-spesifikke antigen og antigenet som er spesifikt for antistoffet som skal påvises, er lignende.

18. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 13, karakterisert ved at den første faste fase er den innvendige flate av et første prø verør, og den andre faste fase er den innvendige flate av et andre prøverø r.

19. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen ifølge krav 13, karakterisert ved at den første faste fase er den innvendige flate av en første brønn i en mikrotiterpalte, og den andre faste fase er den innvendige flate av en andre brønn i en mikrotiterplate.

20. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen-spesif ikt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at de faste faser er overflaten av partikler.

21. Forbedret fremgangsmåte ved påvisning av et antigen-spesif ikt antistoff ifølge krav 20, karakterisert ved at partiklene omfatter materiale valgt fra gruppen bestående av agarose, polystyren, lateks og polymetakrylat.

22. Forbedret fremgangsmåte ved påvisning av et antigen-spesif ikt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at antistoffene omfatter immunoglobuliner.

23. Forbedret fremgangsmåte ved påvisning av et antigen-spesif ikt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at det antigen-spesifikke antistoff omfatter HTLV III-spesifikt antistoff.

24. Forbedret fremgangsmåte ved bestemmelse av et antigen-spesif ikt antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at det antigen-spesifikke antistoff omfatter et AIDS-virus - spesifikt antistoff.