JPH0635977B2 - 固相分析方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は免疫固相法により抗原を検出する固相分析の分
野に関する。

背景技術 免疫固相法を使用してある抗原を測定または検定する場
合、この抗原に対抗する抗体を固相に塗布することがあ
る。この場合、プラスチックプレート内のプラスチック
管または深底容器の内部に抗体の物理的な吸着を発生さ
せることが多い（“塗布”とは技術用語におけるも
の）。抗原を含有する試験溶液を管または深底容器内に
入れると、その抗原は前記吸着した抗体と選択的に結合
する（抗体−抗原応答）。次にその管または深底容器を
空にし完全に洗浄する。このように容器表面の抗体は、
それが存在していた基質（媒質）からより取扱いが容易
な固相へ転移され、そこで検出や定量化が実行される。
これは良く知られているELISA法により、その抗原に対
向する抗体を追加することによって実行される。この抗
体はホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）また
はアルカリ性ホスファターゼなどの酵素によって標識付
けできる。酵素で標識を付けた（酵素結合した）抗体
は、管または深底容器の中に入れられ、その壁面または
表面に存在する抗原と結合する。余分な酵素標識抗体は
洗浄され、残った酵素標識抗体が酵素基質によって検出
された染色生成物に変換される。

前記ELISA技術の変更形態は多数有るが、基本は同じで
ある。理論的には、抗原のみがその元の基質から表面に
取り出され、そこで均一に露出されて分析を可能にす
る。

しかし実際には、試験溶液の中には常に他の成分が存在
し、これらが前記表面において他のメカニズムによっ
て、前記吸着された抗体と結合するかまたは固相と直接
結合する。これら非特異的に結合した成分は、前記方法
において大きな誤差を発生させる。この理由はそれら
が、実施しようとする分析に干渉して偽の陽性の、また
は偽の高い測定結果を与えるからである。従来のELISA
技術においては、試料中にあって固相と結合する非抗原
成分が、酵素結合した抗体を吸収し偽の高い測定結果を
与えることがある。これら非抗原成分が仲介した測定結
果は、非特異的な吸収の結果であると考えられている。

定性分析（例えば、試料中における抗体または抗原の存
在または不存在のみのテスト）において、非特異効果に
よる検定応答の上昇は誤った陽性の結果を与えることに
なる。検定の弁別レベルを上げることによって偽の陽性
結果を減少さようとすると、偽の陰性結果の数が上昇し
てしまう。このため、これら検定における非特異的影響
は、診断における不確実性をもたらす。

従来から非特異的吸収（または結合）を最小にしようと
する試みがなされてきた。例えば、固相の表面を完全に
遮断し、それが追加の成分を吸収できなくすることが行
われた。さらに、捕捉された抗体を酵素的に分割し、抗
原結合部位（(Fab)2フラグメント）を固相上において分
離し固定することが行われた。しかしこれら技術によっ
ても完全な成功は得られなかった。その上、ELISA技術
の使用における多くの問題が最近になって指摘されるよ
うになった。例えば、1984年のGaffney等によるThromb.
Haemostas 52(1)：96-97や1986年のBoscato等によるCli
n. Chem.32(8)：1491-1495が参照できる。

発明の要約 本発明は、試料中の抗原を検出する改良方法を提供す
る。この方法は、抗原特異抗体を第１の固相と第２の固
相とに塗布する段階を備える。次に前記第１の固相を溶
液にさらす。この溶液は、第１および第２の固相の塗布
に使用したものと同じ抗原特異抗体と、抗原とを含有す
る。また第２の固相は、非特異抗体と抗原とを含有する
溶液にさらす。次に第１の固相と第２の固相とに結合し
た抗原の量を、当業者に良く知られた手段によって決定
する。試料中における抗原の量を計量するには、第２の
固相に結合した抗原の量から第１の固相に結合した抗原
の量を差し引く。

本発明の第２実施例は、試料中の特定の抗原特異抗体を
測定する。この実施例では、検査しようとする抗体に対
して特異的な抗原を、第１および第２の固相に塗布す
る。次に第１の固相を溶液にさらす。この溶液は、第１
および第２の固相の塗布に使用したものと同一の抗原
と、抗原特異抗体とを含有する。第２の固相は、非特異
抗原と抗原特異抗体とを含有する溶液にさらす。次に、
第１の固相と第２の固相とに結合した抗体の量を、当業
者に良く知られた手段によって決定する。試料中の抗体
の量を計量するには、第２の固相に結合した抗体の量か
ら第１の固相に結合した抗体の量を差し引く。

本発明に基づく方法は、抗原について分析または検定し
ようとする試料を、その抗原に対抗する抗体を塗布した
固相にさらし、抗原抗体結合を発生させ、その後、当業
者に良く知られた方法によって、その結合した抗原を検
出または測定する。

本発明の新規性は、試料に溶解可能なある特定の抗体を
存在させてこれにさらすことにより、非特異的な吸着の
問題を除去または減少できるという予期せぬ発見に基づ
いている。酵素組織プラスミノーゲン活性化物質（t-P
A）についてELISAを実施する際、結合の非特異的吸着の
問題を解決しようとして、本発明者等は、最初の定温放
置段階、つまり抗体を塗布した固相に試料をさらす際の
可溶性抗体の影響を調査した。そして次のような二つの
重要な観測をした。

１．固相表面の塗布に使用したものと同一の特異性を有
する抗t-PA抗体の濃度が比較的低くても、特異t-PA結果
を妨げるには十分であった。期待した結果は、液相（試
料相）における特異抗体が、二相中における抗体の相対
的な量に基づいて、該二相間にt-PA抗原を分布させるで
あろうことだった。例えば、0.2μｇの抗体が固相に属
しており、２μｇの抗体が液相に属していれば、抗原は
固相と液相との間に１対10で分布すると予測した。とこ
ろが実際には、この場合の分布は１対99であった。この
発見は、可溶性抗体を最初に測定用深底容器（または
管）に入れ、次に試料をその同じ管に加えるという方法
を発見させた。この方法は実際的な見地から非常に魅力
的である。溶解した抗体と共に試料をあらかじめ定温放
置する必要性は、その方法をより困難にしたであろう。

２．非免疫化動物からの抗体（いわゆる正常抗体）を最
初の定温放置に含めると、ELISA技術によって血漿中の
組織プラスミノーゲン活性化物質（t-PA）を決定する場
合、結果は一般に減少した。場合によっては、その減少
は５０％以上であったが、通常は約１０％であった。４
５事例のうち１事例のみにおいてこのような減少を検出
できなかった。事前の予測は、減少は稀にしか発生しな
いということだった。つまり、いわゆるリウマトイド因
子を含有する試料においてのみ減少が予測できた。（そ
のような蛋白質の影響は考えられなかった。なぜなら、
添加された10μｇ／ｍの正常抗体は、血漿試料からの
3000μｇ／ｍの蛋白質によって完全にその影響力が薄
くなってしまうからである。） 本発明は、特にELISA技術などの非競合的免疫固相法に
適用できる。この技術については1980年のEngvallによ
るMethods enzymol 70A,419-439が参照できる。本発明
は、非特異的吸着の問題への実際的で有効な解決策を提
供し、ある分析法における測定または分析結果の信頼性
の確率を著しく向上させる。

従って本発明の目的は、偽の陽性値の数を著しく減少さ
せるかまたは排除する改良検定方法を提供することであ
る。

本発明の他の目的は、偽の高い値を著しく減少させるか
または排除する改良検定方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、試料中の抗原特異抗体の量
を正確に測定できる改良検定方法を提供することであ
る。

本発明の他の目的は、ＡＩＤＳウイルスに特異的な抗体
の量を正確に測定でき、偽の陽性の数を減少できる検定
方法を提供することである。

本発明の他の目的へ、試料中の組織プラスミノーゲン活
性化物質の量を正確に測定できる検定方法を提供するこ
とである。

本発明の他の目的は、偽の陽性の数を最小にする定性的
検定方法を提供することである。

本発明の前記およびその他目的、特徴および利点は、開
示実施例の詳細説明および添付の請求の範囲を読むこと
により明らかとなろう。

図面の簡単な説明 第１図は、ELISA法によって43の血漿試料中のt-PAを決
定した測定結果の比較を示す。測定は各試料につき三つ
の測定用深底容器において行われ、各深底容器にはあら
かじめ、試料の定温放置段階において、PBS-TWeen(0)を
150μ、10mg/の正常IgG(N)を150μ、および10mg/
mの抗t-PAIgG(A)を150μそれぞれ満たした。同一試
料に関する結果は、直線で接続されている。

詳細説明 全ELISA応答Rtotは、三つの部分からなるものと見るこ
とができる。すなわち，(a)抗原特異性部分RAg、この部
分は試料に抗原特異性イムノグロブリンを添加すること
により消光できる、(b)抗原非特異性部分、この部分は
試料に非免疫イムノグロブリンを添加することによって
消光できるのでイムノグロブリン特異応答RIgと呼ぶこ
とができる、(c)非特異性残余部分RUr、この部分はイム
ノグロブリンの存在によって影響を受けずまたそれに関
連しない。従って、 Rtot＝RAg＋RIg＋RUrとなる。

抗原特異抗体を含有する微量試験プレートの深底容器
（プリフィルＡ深底容器）に試料を加えると、RAgとRIg
との両方は応答から除外される。ここではこれをRAと呼
ぶ。従ってRA＝RUrである。非免疫化動物からの抗体を
含有する深底容器（プリフィルＮ深底容器）において試
料を検定すると、RIgのみが応答から除外される。ここ
ではこれをRNと呼ぶ。従って、RN＝RAg+RUrである。従
ってRNとRAとの差は、検定応答の抗原特異性部分であ
る。つまり検定手順の目標は、RN-RA＝RAgである。偽の
陽性結果の可能性は、従来のELISA技術につきものであ
る。本発明に基づく方法により、簡単な方法で非特異的
吸着を基本的に排除することが可能になる。

この問題を解決するにあたり、本発明が従来の試みと異
なる点は、本発明者等が特異的結合を完全に阻止する実
用的な方法を発見したことである。試料は二つの系にお
いて定温放置される。一方においては特異的結合は選択
的に阻止されず、他方においてはそれが選択的に阻止さ
れる。非特異的結合は二つの系において現れ、特異的な
結果は差として得られる。

本発明を実施するに当り、三つの抗体標品が使用され
る。第１の標品は固相を塗布するものであり、第２の標
品は第１の標品と同一の特異性を有し特異的な測定を阻
止するものであり（これは塗布に使用するものと同一の
抗体標品とすることができる）、第３の標品は特異的な
結果を阻止しないものである。後の二つの抗体標品は、
対をなすものであって互いにできるだけ類似でなければ
ならない。これらは一つの特性、つまり抗原との応答に
おいてのみ異なっていることが好ましい。一方は抗原と
応答し（特異的である）、他方は抗原と応答してはなら
ない（非特異的である）。従ってこれら抗体は同一のま
たは類似の起源を有していなければならず（例えば、同
一の動物種から得たものであり、共に同一のサブグルー
プのモノクロナル抗体であるかまたはポリクロナル抗
体）、同一のまたは類似の方法において準備されなけれ
ばならない。

本発明に基づき、偽の高いまたは偽の陽性の測定結果の
問題を解決するため、判定しようとする抗原を含有する
二つの一定量の試料を同一の抗原抗体で塗布した表面を
有する二つの固相にさらす。一方の暴露（暴露１）は、
固相に塗布した抗体と同一の特異性を有する抗体を試料
中に存在させて行われ、第２の暴露（暴露２）は、当の
抗原に対して非特異性を有するがその他の点においては
基本的に暴露１の試料中の抗体と同じである抗体を試料
中に存在させて行われる。そして、暴露１において結合
した抗原と暴露２において結合した抗原との検定応答に
おける差に基づいて抗原を検出する。

本発明に基づく方法は、ELISAタイプの非競合的免疫固
相法に使用されることを基本的に考えている。従って、
参照される抗体はイムノグロブリンであることが好まし
い。本方法は、抗原の定量的決定を基本的に目的として
いるが、検定における不確実性が非常に大きいので定性
的結果が問題にされるような定性分析にも適している。
言い替えれば、本発明における“検出”という語は、抗
原の量の決定と抗原の存在の決定との両方を意味する。
またここで使用する“量”という語は、試料中における
抗原または抗体の定量的測定および定性的測定の両方に
関連する。

当業者には明らかなように、暴露１および暴露２におい
てさらされる二つの一定量の試料は同一であることが好
ましい。この理由は、このようにすることにより、暴露
１において結合された抗原と暴露２において結合された
抗原との必要な差を、他の誤差を介在させずに得ること
ができるからである。しかしこれは、異なる一定量の試
料つまり異なる量または異なる質の試料によって本方法
を実行することを除外するものではない。ただしこの場
合、その一定量の試料の量を正確に知っておく必要があ
る。また、検査しようとする抗原サンプルは、特異抗体
および非特異抗体と共に二つの固相に同時に加えること
ができる。あるいは、抗原試料は、特異抗体および非特
異抗体を加えてから、二つの深底容器に加えることもで
きる。

本発明に基づく分析を最適に信頼性の持てるものにする
ため、二つの固相に対する暴露は、実質的に同一の条件
下で行う必要がある。これは両方の固相が基本的に互い
に同じであることを意味するが、これら固相に基本的に
同一の抗抗原抗体を塗布した表面を与えることで理論的
には十分である。

“試料中に溶解した抗体”という表現またはこれと同様
の表現は、実際の試料暴露中に試料に添加されるまたは
存在する抗体が、分析される検査基質に対して基本的に
可溶性であることを意味する。しかし、これはこれらが
固相上において固定される可能性を除外するものではな
い。ただし、その相が抗原の検出を完遂する際に固相か
ら分離され得ることが条件である。

前記したように、暴露１中に存在する抗体は、固相に塗
布された抗体と同一の特異性を有する。これは原理的に
抗体が、検出されようとする抗原と応答しまたは結合
し、固相上の抗体と応答しようとする抗原の機能を阻止
することを意味する。

これとは逆に、暴露２に存在する抗体は当該抗原に対し
て非特異性を示す。つまり、これらは抗原と応答せず結
合しない。しかし、それらは基本的に暴露１に存在する
抗体と同一でなければならない。これは、それらが同一
の起源（同じ動物種）の抗体であって、基本的に同じ方
法で作られることを意味する。ただし“同じ”という表
現は、この関連において合理的な解釈を与えられるべき
ものである。この理由は、発明概念は抗体が“同じ”で
なくとも失われることはなく、これは本発明とは全く無
関係である。

暴露１中で結合される抗原と暴露２中で結合される抗原
との差によって抗原を検出するが、この検出は当業者に
知られた手順に基づいて行われる。このため、この検出
手順の詳しい説明は省略する。

抗原を検出するための本発明の方法は、生物学的試料中
の抗原t-PA（組織プラスミノーゲン活性化物質）の検出
に対して特に有効である。血漿、関節液、脳脊髄液、精
液、または細胞培養媒質などがそのような生物学的試料
として考えられる。

本発明の方法の特に好適な実施例は、まず例えば試験管
や深底容器を有する試験プレートなど固相を形成する装
置に抗体を置き、可溶性の抗体が試験管や深底容器の内
面上にあらかじめ存在するようにしてから、実際の試料
を加える。このようにして、本発明は実際的で経済的に
有利な方法で利用されると共に、信頼性の高い結果を提
供する。

本発明の説明において参照した固相は、ビーズなどの粒
子でもよい。この粒子の成分は、アガロース、ポリスチ
レン、ラテックス、ポリメタクリレートなどを含むが、
これらに限定されるものではない。

本発明方法の特に好適な実施例において、当該装置の容
積の５〜95％に対応する容積の抗体をまず添加する。好
ましくは、この抗体の量は装置の容積の10〜90％に対応
させる。より好ましくは、抗体の容積は装置の容積の20
〜80％に対応させる。

暴露１または暴露２において存在する抗体の適切な濃度
範囲は、約１〜100mg/である。ただし本発明は、この
範囲に限定されるものではない。好適な範囲は20〜80mg
/である。抗体濃度の範囲は、実施される特定の検定
に依存するものである。ただし約１〜100の範囲は、前
記いた生物学的試料におけるt-PAの決定に対して特に適
している。

抗原の検出に関連して本発明を全般に説明してきたが、
本発明の方法は正反対の応答、つまり抗体の検出に対し
ても適用できる。つまり、抗体の検出もやはり本発明の
範囲に入るものである。

さらに詳細に云えば、本発明の方法は、免疫固相法によ
る抗体の検出にも関する。この場合、抗体について決定
しようとする試料を、この抗体に特異的な抗原を塗布し
た固相にさらし、抗体抗原結合を発生させ、この結合し
た抗体を既知の方法によって決定する。

本発明に基づき偽の高いまたは陽性の結果を排除するた
め、決定しようとする抗体を含有する試料の好ましくは
同量の二つの一定量を、同一の抗原を塗布した表面を有
する二つの固相にさらす。この場合、一方の暴露（暴露
１）は、固相に塗布した抗原と類似の特異性を有する抗
原を一定量の溶液中に存在させて実行し、他方の暴露
（暴露２）は、当の抗体に対して非特異性を有する抗原
を一定量の溶液中に存在させて実施する。暴露２中の抗
原は、その構造が暴露１中の溶液中に溶解した抗原の構
造と類似である。暴露１中において結合した抗体と暴露
２中において結合した抗体との差によって抗体を検出す
る。この方法は、体液中のHTLVIII特異抗体（HIV AIDS
ウイルス特異）を検出する上で使用できる。本発明によ
って測定可能な他の抗原特異抗体は、カルジオリピン、
ホスファチジルコリン、コラーゲン、Ａ型肝炎抗原、Ｂ
型肝炎抗原、およびボレリアなどを含むが、これらに限
定されるものではない。

一般に、本発明の方法は、次の手順に基づいて実施され
る。

微量滴定プレートの深底容器に１〜100mg/の抗体と0.
1〜1.0mol/のNaHCO3とを含有する100〜1000μの溶
液を満たし20〜30℃において２〜３時間にわたって穏や
かに揺り動かしながら定温放置することによって該プレ
ートに抗体を塗布する。塗布処理において使用できる緩
衝液は、Tween 20，Triton X-100，例えば燐酸緩衝塩
（PBS）TweenまたはEDTAを有するPBS TweenなどのPluro
nic界面活性剤などの蛋白質非変性界面活性剤を含む蛋
白質非変性緩衝液を含むが、これらに限定されるもので
はない。

これら深底容器を空にし、内容物をPBS Tweenによって
洗浄する。

各試料につき二つの深底容器を、一方は100〜200μの
正常抗体５〜15mg/mで、他方は100〜200μの特異抗
体５〜15mg/mで満たす。両抗体ともPBS Tweenに溶解
させる。緩衝液は、EDTAを含有するPET緩衝液とするこ
ともできる。PET緩衝液を使用する場合、下記に説明す
る酸性化過程は必要ない。

血液試料は従来の方法において集め、数分間にわたって
1000〜3000ｘｇにおいて遠心分離する。その血漿は、約
１単位容積の血漿に対し１単位容積のpH3.5〜4.5のナト
リウムアセテート緩衝液などの酸性化緩衝液によって20
〜30℃において10〜20分間にわたって定温放置すること
により酸性化する。この酸性化された血漿は、１単位容
積のpH8〜11の燐酸ナトリウムトリスなどのpH調製緩衝
液を添加することによって中性化する。

各血漿試料からの20〜50μの試料は、PBS Tweenに溶
解した５〜15mg/濃度の正常または特異抗体をあらか
じめ満たした深底容器に入れる。この試料は、注意深く
振りながら20〜30℃において４〜５時間にわたって定温
放置する。

次に深底容器の内容物を空にし、PBS Tweenで洗浄す
る。

PBS Tweenに溶かした1-3mg/のHRP結合抗体の100-300
μの量を深底容器内において20-30℃において4-5時間
にわたって定温放置する。

これら深底容器の内容物を空にし、PBS TweenまたはEDT
Aを有するPBS Tweenで洗浄する。

100-300μのpH4-6のクエン酸燐酸緩衝液に溶かしたペ
ルオキシダーザ基質は、次に深底容器内において暗所で
20-40分間にわたり20-30℃において定温放置される。

基質応答は4-5mol/の10-100μのH2SO4を添加するこ
とによって阻止される。

490-495nmにおける吸収を記録する。正常抗体を満たし
た深底容器と特異抗体を満たした深底容器との吸収にお
ける差を各血漿試料について計算する。これは応答の抗
原特異部分を代表するものである。これを、抗原を正常
血漿中に希釈した標準曲線と比較する。

次の特定の例は、特に組織プラスミノーゲン活性化物質
の測定に本発明を適用したものである。他の例も当業者
には明らかであり、本発明はこれら特定の例に限定され
るものではない。

第１例 下記は例において使用した蛋白質成分、低共通化学物質
および緩衝液の説明である。

［ヤギ抗t-PA IgG］ 人の子宮からのt-PAに対抗する抗血清がヤギにおいて生
成される。IgG部分はクロマトグラフィーによってＡセ
ファロース蛋白質上に精製される。この標品は凍結乾燥
され、使用される際は水中において再構成される。

［正常ヤギIgG］ 非免疫化ヤギの血清からのIgG部分はクロマトグラフィ
ーによってＡセファロース蛋白質上に精製される。この
標品は凍結乾燥され、使用の際は水中において再構成さ
れる。

［ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗t-PA
IgG］ ヤギ抗t-PA IgG（前記）はホースラディッシュペルオキ
シダーゼ（HRPシグマタイプIV）にグルタルアルデヒド
法によって結合される。この結合は自由ペルオキシダー
ゼからクロマトグラフィーによってＡセファロース蛋白
質上に精製される。

［組織プラスミノーゲン活性化物質（t-PA）］ ヒトメラノーマ細胞からの単鎖形であり、ウシ血清アル
ブミンを担体として乾燥凍結された標品である。

［１、２フェニレンジアミン（O.P.D）］ ペルオキシダーゼ基質である。New Jersey州RahwayのMe
rck Chemical Co.の合成品である。

［PBS Tween緩衝液］ 20mM1/燐酸ナトリウム緩衝液、100mmol/Nacl、0.1g
/Tween 20、pH7.4 ［PET緩衝液］ 20mmol/燐酸ナトリウム緩衝液、100mmol/Nacl、10m
mol/EDTA、0.1g/Tween 20、pH7.9 ［クエン酸燐酸緩衝液］ 100mM1/燐酸２水素ナトリウムは100mM1/クエン酸に
よってpH5.0に調整される。

［酸性化緩衝液］ 1.0M1/のアセテートナトリウム緩衝液。pH3.9 ［pH調整緩衝液］ 50mM1/燐酸ナトリウム。500mM1/トリス（トリスヒ
ドリキシメチルアミノメタン）pH10.4 例において使用したELISA法は1983年のBergsdorf等によ
るThromb．Haemostas 50(3),740-744に基づく。

血漿中におけるt-PA抗原濃度の決定は次のように行っ
た。

96の深底容器を有する微量試験プレート（デンマークNu
nc社、Nunc immunoplate 1）に抗t-PA IgGを塗布し、そ
のプレートの深底容器に10mg/の抗t-PA IgGと0.1mol/
のNaHCO3とを含有する200μの溶液を満たし25℃に
おいて３時間にわたり注意深く揺り動かしながら定温放
置する。

これら深底容器を空にし、PBS TweenまたはPET緩衝液で
内容物を洗浄する。

各試料につき二つの深底容器を、一方は10mg/mの正常
IgGの150μで満たし、他方は10mg/mの抗t-PA IgGの
150μで満たす。これらは共にPBS Tweenに溶かす。

血液試料は従来の方法（クエン酸ナトリウムまたはEDT
A）で集め、５分間にわたって2000ｘｇにおいて遠心分
離する。この血漿は、単位容積の血漿を単位容積の酸性
化緩衝液によって25℃において15分間にわたって定温放
置することにより酸性化する。酸性化した血漿は、単位
容積のpH調整緩衝液を添加することによって中性化す
る。この手順においてPET緩衝液を使用する場合、血漿
の酸性化は必要でない。

各血漿試料からの20〜50μの量（試料中のt-PA含有量
による、測定結果はこの範囲内において添加容量の影響
を受けない）を深底容器に入れる。この深底容器は、PB
S Tweenに溶解した10mg/の濃度の正常または抗t-PA I
gGであらかじめ満たす。この試料は、３時間にわたって
25℃において注意深く揺り動かしながら定温放置する。

これら深底容器は内容物を空にし、PBS TweenまたはPET
緩衝液で洗浄する。

PBS TweenまたはPET緩衝液に溶かした２mg/のHRP結合
t-PA IgGの200μの一定量を３時間にわたって20℃に
おいて深底容器の中で定温放置する。

これら深底容器は内容物を空にし、PBS Tweenで洗浄す
る。

200μ定量のpH5.0のクエン酸燐酸緩衝液中に溶かした
基質（O.P.D./H202）を深底容器内において25℃の暗所
で30分間にわたって定温放置する。

基質応答は、4.5M1/のH2SO4を50μ加えることによ
って阻止される。

492nmにおける吸収を記録する。正常IgGを満たした深底
容器と抗t-PA IgGを満たした深底容器との吸収の差を各
血漿試料について計算する。これは、応答のt-PA特異部
分を代表する。これを、t-PAを正常ヒト血漿中に希釈し
た標準曲線と比較する。

第２例 次の実験は、ELISA法を使用してt-PA抗原濃度を決定す
る際、非特異結合効果に起因する不正確な結果を修正す
るための方法の必要条件を調査するために実行された。

34人の患者の血漿試料を、ELISAによって分析する。こ
れら試料は、PBS Tween、正常IgGまたは抗t-PA IgGを満
たした深底容器中に入れる。

この結果を第１図に示す。正常IgGを満たした深底容器
の試料は、PBS Tweenを満たした深底容器の試料よりも
低い吸収度を示している。事例の31%(13/34)において、
その差は100ミリ吸収単位以上である。各試料は、抗t-P
A IgGの存在下においてさえも高い吸収度を示してい
る。このため、本発明に基づく方法を正常抗体および抗
t-PA抗体の両方に使用することにより、ELISA技術（ま
たは同様の技術）による抗原濃度決定中の非特異吸収に
よる偽の陽性結果を避ける必要がある。

第３例 高い非特異結合を発生させる血漿試料の頻度をさらに調
査するため、519人からの試料をt-PA濃度について分析
した。血漿試料は前記した抗t-PA IgGを満たした深底容
器に入れた。これら深底容器は“プリフィルＡ深底容
器”と呼ぶ。結果は第１表に示す。

第１表 519血漿試料のt-PA抗原をプリフィルＡ深底容器におい
て本発明により測定した検定応答（A492） A492 ｎ ＞75 454 75-100 46 101-125 10 126-150 ６ ＞150 ３ ｎは試料数である。正常t-PA含有量は約６μg/であ
り、これは本分析法において約200ミリ吸収単位（mA）
の特異測定結果に対応する。第１表は、本発明を使用し
ないと、試料中の約2%の抗原含有量は、少なくとも40%
だけ過大評価されることを示す。医療研究においては、
試料のｍ当りのわずかの重大な測定誤差でも、著しい
不確実性を発生させ、余分の作業を伴うものである。

当然ではあるが、前記説明は、本発明の好適実施例に限
ってなされており、請求の範囲に示される本発明の範囲
を逸脱することなく、多くの変更は改変がなされ得るも
のである。

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料中の抗原を検出する改良方法におい
   て、 ａ．第１の固相と第２の固相とに抗原特異抗体を塗布
   し、 ｂ．前記第１および第２の固相の塗布に使用したものと
   同一の抗原特異抗体と抗原とを含有する溶液に前記第１
   の固相をさらし、 ｃ．非特異抗体と抗原とを含有する溶液に前記第２の固
   相をさらし、 ｄ．前記第１の固相と前記第２の固相とに結合した抗原
   の量を決定し、および ｅ．前記第２の固相に結合した抗原の量から前記第１の
   固相に結合した抗原の量を差し引くことによって試料中
   の抗原の量を計量する各段階を備える前記改良方法。
2. 【請求項２】前記段階ｂにおいて、前記第１の固相が抗
   原特異抗体を含有する溶液にまずさらされ、次に抗原を
   含有する溶液が前記抗原特異抗体を含有する溶液に添加
   される、請求の範囲第１項に記載の抗原を検出する改良
   方法。
3. 【請求項３】前記段階ｃにおいて、前記第２の固相が非
   特異抗体を含有する溶液にまずさらされ、次に抗原を含
   有する溶液が前記非特異抗体を含有する溶液に添加され
   る、請求の範囲第１項に記載の抗原を検出する改良方
   法。
4. 【請求項４】前記抗体がモノクロナル抗体とポリクロナ
   ル抗体とからなるグループから選択される、請求の範囲
   第１項に記載の抗原を検出する改良方法。
5. 【請求項５】前記非特異抗体と前記抗原特異抗体とが同
   一の種から得られる、請求の範囲第１項に記載の抗原を
   検出する改良方法。
6. 【請求項６】前記第１の固相が第１の試験管の内表面で
   あり、前記第２の固相が第２の試験管の内表面である、
   請求の範囲第１項に記載の抗原を検出する改良方法。
7. 【請求項７】前記第１の固相が微量滴定プレートの第１
   の深底容器の内表面であり、前記第２の固相が微量滴定
   プレートの第２の深底容器の内表面である、請求の範囲
   第１項に記載の抗原を検出する改良方法。
8. 【請求項８】前記固相が粒子の表面である、請求の範囲
   第１項に記載の抗原を検出する改良方法。
9. 【請求項９】前記粒子がアガロース、ポリスチレン、ラ
   テックス、およびポリメタクリレートからなるグループ
   から選択される材料からなる、請求の範囲第８項に記載
   の抗原を検出する改良方法。
10. 【請求項１０】前記抗体がイムノグロブリンからなる、
    請求の範囲第１項に記載の抗原を検出する改良方法。
11. 【請求項１１】前記抗原が組織プラスミノーゲン活性化
    物質または尿プラスミノーゲン活性化物質からなる、請
    求の範囲第１項に記載の抗原を検出する改良方法。
12. 【請求項１２】前記方法が定性検定である、請求の範囲
    第１項に記載の抗原を検出する改良方法。
13. 【請求項１３】試料中における抗原特異抗体を検出する
    改良方法において、 ａ．第１の固相と第２の固相とに、検査しようとする抗
    体について特異である抗原を塗布し、 ｂ．前記第１および第２の固相の塗布に使用したものと
    同一の抗原と抗原特異抗体とを含有する溶液に前記第１
    の固相をさらし、 ｃ．非特異抗原と抗原特異抗体とを含有する溶液に前記
    第２の固相をさらし、 ｄ．前記第１の固相と前記第２の固相とに結合した抗原
    特異抗体の量を決定し、および ｅ．前記第２の固相に結合した抗体の量から前記第１の
    固相に結合した抗体の量を差し引くことによって試料中
    の抗原の量を計量する各段階を備える前記改良方法。
14. 【請求項１４】前記段階ｂにおいて、前記第１の固相が
    抗原を含有する溶液にまずさらされ、次に抗原特異抗体
    を含有する溶液が前記抗原を含有する溶液に添加され
    る、請求の範囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検出す
    る改良方法。
15. 【請求項１５】前記段階ｃにおいて、前記第２の固相が
    非特異抗原を含有する溶液にまずさらされ、次に抗原特
    異抗体を含有する溶液が前記抗原を含有する溶液に添加
    される、請求の範囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検
    出する改良方法。
16. 【請求項１６】前記抗体がモノクロナル抗体とポリクロ
    ナル抗体とからなるグループから選択される、請求の範
    囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検出する改良方法。
17. 【請求項１７】前記非特異抗体と前記検出しようとする
    抗体に特異である抗原との構造が類似である、請求の範
    囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検出する改良方法。
18. 【請求項１８】前記第１の固相が第１の試験管の内表面
    であり、前記第２の固相が第２の試験管の内表面であ
    る、請求の範囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検出す
    る改良方法。
19. 【請求項１９】前記第１の固相が微量滴定プレートの第
    １の深底容器の内表面であり、前記第２の固相が微量滴
    定プレートの第２の深底容器の内表面である、請求の範
    囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検出する改良方法。
20. 【請求項２０】前記固相が粒子の表面である、請求の範
    囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検出する改良方法。
21. 【請求項２１】前記粒子がアガロース、ポリスチレン、
    ラテックス、およびポリメタクリレートからなるグルー
    プから選択される材料からなる、請求の範囲第２０項に
    記載の抗原特異抗体を検出する改良方法。
22. 【請求項２２】前記抗体がイムノグロブリンからなる、
    請求の範囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検出する改
    良方法。
23. 【請求項２３】前記抗原特異抗体がHTLVIII特異抗体か
    らなる、請求の範囲第１３項に記載の抗原特異抗体を検
    出する改良方法。
24. 【請求項２４】前記抗原特異抗体がAIDSウイルス特異抗
    体からなる、請求の範囲第１３項に記載の抗原特異抗体
    を検出する改良方法。