JP2005214840A - 全身性炎症反応症候群患者における臓器障害の発症又は予後の予測方法及び予測用試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】 ＳＩＲＳ患者における臓器障害、例えば、重症呼吸不全などの発症又は予後を、迅速且つ正確に予知することのできる予測方法及び予測用試薬を提供する。
【解決手段】 前記予測方法では、可溶性Ｅ−セレクチン（ｓＥＳ）を分析する。前記予測用試薬は、可溶性Ｅ−セレクチンに特異的に結合する抗体又はその断片を含む。
【選択図】 なし

Description

本発明は、全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome：ＳＩＲＳ）における臓器障害（特には急性呼吸不全）の発症予測方法（すなわち、発症の危険性を評価する方法）又は前記臓器障害の予後予測方法及び前記臓器障害の発症又は予後の予測用試薬に関する。本発明においては、ＳＩＲＳ患者の生体試料、例えば、血液中の可溶性Ｅ−セレクチン（soluble E-selectin：ｓＥＳ）を分析することにより、臓器障害（特には急性呼吸不全）の発症の予知、又は予後の状態を類推することができる。

ＳＩＲＳは、特定の抗原に反応してサイトカイン量が上昇し炎症反応を起こすのでなく、具体的なターゲット無しに、生体に対する侵襲に反応して非特異的に免疫反応が活性化し、サイトカイン産生が制御不能になって重篤な多臓器不全（multiple organ failure：ＭＯＦ）を起こす疾患群である（非特許文献１，２）。

ＳＩＲＳの診断基準では、全身性炎症反応を反映する４項目［１．体温＞３８℃又は＜３６℃、２．心拍数＞９０／ｍｉｎ、３．呼吸数＞２０／ｍｉｎ又はＰａＣＯ_２：＜３２Ｔｏｒｒ、４．白血球数＞１２，０００／ｍｍ^３若しくは＜４，０００／ｍｍ^３又は未熟顆粒球＞１０％］のうち、２項目以上に異常のある状態がＳＩＲＳとされる（非特許文献３）。

ＳＩＲＳには、非感染性ＳＩＲＳとセプシス（Sepsis）に分類され、前者はショック、外傷、熱傷、又は急性膵炎などで起こり、後者は種々の病原菌の菌血症やその他の重症感染症で起こる。ＳＩＲＳは、病原体侵入、組織損傷、又はアノキシアなどに対する生体免疫反応そのものであり、侵襲の種類にかかわらず、種々の内因性メディエーターにより惹起される非特異的全身急性炎症反応である。ＳＩＲＳに合併する臓器不全は、早期には組織の虚血や炎症から発生するものもあるが、ＳＩＲＳが遷延して起こる多臓器不全症候群（Multiple organ dysfunction syndrome：ＭＯＤＳ）には、種々のメディエーターを介する過剰の生体反応がその病態の重症化に関与しており、ＳＩＲＳは予後の予測が難しい疾患群である。

多臓器障害の指標としては、ＭＯＤＳスコアやＳＯＦＡ(Sequential organ failure assessment)スコアなどの身体徴候をスコア化して判断している。ＭＯＤＳは、複数の重要臓器又は系の機能障害が同時に発生している状態の症候群と定義され、その診断基準としてのＭＯＤＳスコアは、肺（ＰａＯ_２／ＦｉＯ_２比）、腎（クレアチニン濃度）、肝（ビリルビン濃度）、心・循環（Pressure adjusted heart rate：ＰＡＲ）、血液（血小板数）、及び神経系（Glasgow coma scale）の６項目からなる。ＳＯＦＡスコアは、肺（ＰaＯ_２／ＦｉＯ_２比）、凝固系（血小板数）、肝（ビリルビン濃度）、心・血管系（血圧）、中枢神経系（Glasgow coma scale）、及び腎（クレアチニン濃度、尿量）の臨床現場でルーチンに、かつ反復して評価可能な６項目について、０〜４点の５段階に評価するものである。

重症呼吸不全は、「原因の如何を問わず、動脈血ガス、特にＯ_２、ＣＯ_２分圧が異常な値を示し、そのために生体が正常な機能を営めなくなった状態」と定義されており、一般的には急性呼吸窮迫症候群（Acute respiratory distress syndrome: ARDS）と呼ばれており、ＰaＯ_２／ＦｉＯ_２≦２００で人工呼吸をおこなった患者群である。

また、細胞障害に応答して血管内皮細胞の構造や機能が変化し、動脈硬化に進展するリスク因子として喫煙、糖尿病、高血圧、高脂血症が知られており、血管内皮で産生される可溶性Ｅ−セレクチンの研究が行われている（非特許文献４）。

ボーン・アールシー（Bone RC）, 「クリティカル・ケア・メディシン(Critical Care Medicine)」, (米国), １９９６年, ２４巻, ｐ.１１２５−１１２８ デイビース・エムジー（Davies MG. ）ら, 「ブリティシュ・ジャーナル・オブ・サージェリー(British Journal of Surgery)」（英国），１９９７年, ８４巻, ｐ.９２０−９３５ 相川直樹著，相川直樹及び青木克憲編集，「ＳＩＲＳ・ショック・ＭＯＤＳ」，（日本）, 医学書院，２００１年，ｐ．５４−６１ ヴィ・ロルダン(V. Roldan)ら，「トロンボーシス・アンド・ヘモスターシス(Thrombosis and Haemostasis)」，(米国)，２００３年，９０巻，ｐ.１００７−１０２０

本発明の課題は、ＳＩＲＳ患者における臓器障害、例えば、重症呼吸不全などの発症又は予後を、迅速且つ正確に予知することのできる予測方法及び予測用試薬を提供することにある。

組織が感染や損傷を受けると局所でサイトカイン（ＩＬ−１やＴＮＦ−α）が放出され、血管内皮細胞は、細胞接着分子のＥ−セレクチンをその細胞表面に発現する。白血球は、このＥ−セレクチンと結合するリガンド糖鎖（シアリルＬｅ^ａ糖鎖抗原）を有しており、接着して血管外の組織に遊走し、損傷した組織の破壊や異物の貪食をする。
この血管内皮細胞上に発現した成熟型Ｅ−セレクチン（１０５ｋＤａ；レクチンドメイン、ＥＧＦドメイン、補体相同性ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを持つ）は細胞膜上に存在するプロテアーゼにより切断を受け、可溶性Ｅ−セレクチン（８５ｋＤａ；レクチンドメイン、ＥＧＦドメイン、及び補体相同性ドメイン）［エヌ・ノイマン(N. Newman)ら，「ジャーナル・オブ・イムノロジー(Journal of Immunology)」，(米国)，１９９３年，１５０巻，ｐ.６４４−６５４］が生成される。

本発明者らは、ＳＩＲＳ患者で非特異的な免疫反応の活性化が起き、重症呼吸不全などの臓器障害が発症するほどの著明なサイトカイン産生が亢進すれば、サイトカイン刺激を受けて血管内皮細胞膜上で発現される成熟型Ｅ−セレクチン（１０５ｋＤａ）が細胞膜上で切断を受け、血液中に移行する可溶性Ｅ−セレクチン（８５ｋＤａ）が上昇するのではないかと考えた。
そして、可溶性Ｅ−セレクチンを測定するＥＬＩＳＡ法、ラテックス法、及びイムノクロマト法を確立し、血液中の可溶性Ｅ−セレクチン量がＳＯＦＡスコア、特に呼吸不全スコアの上昇と強く関連することを見出して、本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明は、可溶性Ｅ−セレクチンを分析することを特徴とする、全身性炎症反応症候群患者における臓器障害、特には急性呼吸不全の発症又は予後を予測する方法に関する。
本発明の予測方法の好ましい態様によれば、可溶性Ｅ−セレクチンの分析を免疫化学的方法により実施する。
また、本発明は、可溶性Ｅ−セレクチンに特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、全身性炎症反応症候群患者における臓器障害、特には急性呼吸不全の発症又は予後の予測用試薬に関する。

本発明によれば、可溶性Ｅ−セレクチンの分析（特には測定）により、ＳＩＲＳにおける重症臓器不全（特に、重篤な急性呼吸不全）の発症予測、また、予後の予測を行うことができる。このような予測が可能となることにより、ＳＩＲＳにおける臓器不全患者、特には呼吸不全患者の適切な治療を行うことができる。また、可溶性Ｅ−セレクチンの分析は、免疫化学的方法によれば、簡便で、迅速で、感度・定量性に優れた免疫化学的方法により実施することが好ましい。

［１］本発明の予測方法
本発明の予測方法では、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）患者における可溶性Ｅ−セレクチンの濃度を定量し、健常人の可溶性Ｅ−セレクチン濃度と比較することにより、臓器障害、特には呼吸不全の発症を予測することができ、また、ＳＩＲＳの予後の状態を推定することができる。

本明細書において「可溶性Ｅ−セレクチン（ｓＥＳ）」とは、細胞接着分子の１つであって、血管内皮細胞表面に発現するタンパク質である成熟型Ｅ−セレクチン（１０５ｋＤａ；レクチンドメイン、ＥＧＦドメイン、補体相同性ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを持つ）が、細胞膜上に存在するプロテアーゼで切断されることにより生じる、レクチンドメイン、ＥＧＦドメイン、及び補体相同性ドメインからなる可溶性タンパク質（８５ｋＤａ）を意味する。

可溶性Ｅ−セレクチンの分析に用いる検体としては、可溶性Ｅ−セレクチンが含有される可能性のある生体試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生体より採取された血液、血漿、又は血清等を挙げることができる。

後述する実施例に示すように、ＳＩＲＳ患者の内、入院初日の可溶性Ｅ−セレクチン濃度が健常者よりも高値である患者では、呼吸不全に関するＳＯＦＡスコアが高く（すなわち、重篤性が高い）、重篤な急性呼吸不全を発症した患者の割合も高かった。一方、ＳＩＲＳ患者であっても、可溶性Ｅ−セレクチン濃度が健常者と同じ正常値範囲内にある患者では、呼吸不全に関するＳＯＦＡスコアが低く（すなわち、重篤性が低い）、重症呼吸不全を発症する患者の割合は低かった。

このように、本発明の予測方法では、可溶性Ｅ−セレクチン濃度を定量し、健常者の正常値範囲よりも高値を示す場合（例えば、閾値を超える場合）には、臓器障害（特には呼吸不全）の発症の危険性が高いと判定することができる。一方、可溶性Ｅ−セレクチン濃度が正常値範囲内である場合には、臓器障害（特には呼吸不全）の発症の危険性が低いと判定することができる。

本発明の予測方法では、健常者とＳＩＲＳ患者とから、それぞれ検体を採取し、それぞれの可溶性Ｅ−セレクチン濃度を測定した後、測定値を比較することにより、臓器不全の発症の可能性を予測することもできるが、通常は、健常者から採取した検体を用いて可溶性Ｅ−セレクチン濃度の正常値範囲又は判定用閾値を予め決定しておくことが好ましい。正常値範囲又は判定用閾値が予め決定されている場合には、予測対象であるＳＩＲＳ患者に関して可溶性Ｅ−セレクチンの分析を行うだけで、前記ＳＩＲＳ患者における臓器不全の発症可能性を予測することができる。

前記正常値範囲又は判定用閾値は、種々条件、例えば、基礎疾患、性別、年齢などにより変化することが予想されるが、当業者であれば、被験者に対応する適当な母集団を適宜選択して、その集団から得られたデータを統計学的処理を行うことにより、正常値範囲又は判定用閾値を決定することができる。
例えば、実施例５に示すように、健常者から得られた可溶性Ｅ−セレクチン濃度の平均値及び標準偏差（ＳＤ）から、「平均値＋２×ＳＤ」を判定用閾値として用いることができる。具体的な判定用閾値としては、例えば、３０ｍｇ／ｍＬの値を使用することができる。

検体中の可溶性Ｅ−セレクチンを測定する方法としては、例えば、免疫化学的方法、電気泳動による方法、又はクロマトグラフィーによる方法等を挙げることができる。
免疫化学的方法による方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス法、又はイムノクロマトグラフ法で検出する方法を挙げることができる。
電気泳動による方法としては、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って可溶性Ｅ−セレクチンをバンドとして検出する方法、あるいは、キャピラリー電気泳動でピークとして検出する方法等を挙げることができる。
また、クロマトグラフィーによる方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィーでピークとして検出する方法等を挙げることができる。
可溶性Ｅ−セレクチンを分析可能である限り、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

可溶性Ｅ−セレクチンを測定する方法としては、感度及び簡便性から免疫化学的方法が好ましい。ここで免疫化学的方法とは、可溶性Ｅ−セレクチンに対する抗体を用いて、可溶性Ｅ−セレクチンを、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス法、又はイムノクロマトグラフ法で分析する方法である。免疫化学的方法としては、例えば、可溶性Ｅ−セレクチンを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体をコートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法、あるいは、金コロイドなどの着色粒子に結合した抗体を用いる方法等、様々な方法があるが、可溶性Ｅ−セレクチンに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の好ましい態様に含まれる。抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖを用いることもできる。

例えば、本発明方法で用いるマウスモノクローナル抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体は、それ自体公知の方法で作製することができる。すなわち、前記のモノクローナル抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体を分泌するハイブリドーマ（好ましくはマウスハイブリドーマ）を、培地又は哺乳動物（特にはマウス）の腹腔内で培養することによって製造することができる。前記のハイブリドーマは、一般的には可溶性Ｅ−セレクチンで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、ＫOｈｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法［ケヘラー及びミルスタイン（KOhler and Milistein），「ネイチャー(Nature)」，(英国) ，１９７５年，２５６巻，ｐ．４９５−４９７］により製造することが可能である。

また標識する方法にも、例えば、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識、ストレプトアビジン等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。

イムノクロマトグラフィー法は、固相担体（例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ガラス繊維フィルター等の素材）に結合された前記抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体（モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体）及び着色粒子コンジュゲート（金などの金属コロイド、ポリスチレンなどの非金属コロイド、又はリポゾームなどをストレプトアビジン、又は抗ビオチン抗体に結合したもの）を介して、可溶性Ｅ−セレクチンを検出する方法である。

既知量のヒト成熟型Ｅ−セレクチンの細胞膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠失させたリコンビナント・Ｅ−セレクチン（８６−９０ｋＤａ；R&D Systems, Inc.）から検量線を作成し、検体中に含まれる可溶性Ｅ−セレクチン（ｓＥＳ）量を計算することができる。

［２］本発明の試薬
本発明の試薬（キット）は、抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体又はその断片を少なくとも含む限り、特に限定されるものではなく、異なる２種類以上の抗可溶性Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体又はその断片を含むことが好ましい。本発明の試薬は、本発明方法を実施するのに用いることができる。

本発明の試薬では、第１の抗可溶性Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体又はその断片と、この第１抗体の結合領域とは別の領域で可溶性Ｅ−セレクチンと結合する抗可溶性Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体（すなわち、第２のモノクローナル抗体）又はその断片との組み合わせを用いることがより好ましい。

本発明の試薬は、好ましくは、可溶性Ｅ−セレクチン（ｓＥＳ）に対する抗体を構成成分とする、血液中の可溶性Ｅ−セレクチンを免疫学的な方法により定量する検査試薬である。この態様の検査試薬は、抗体として抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体を用いる以外は、通常のＥＬＩＳＡ法、ラテックス法、及びイムノクロマトグラフ法に用いられる試薬（キット）と同様の構成でよい。その一例としてラテックス凝集法による可溶性Ｅ−セレクチンを測定する検査試薬は、例えば、１）抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体をコートした抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体コート固相担体、２）既知濃度の可溶性Ｅ−セレクチン標準溶液、３）希釈液、４）洗浄液を含有する試薬である。更に、ＥＬＩＳＡ法の酵素標識抗体であれば、５）酵素標識抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体、６）発色基質、７）反応停止液が含まれてもよい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：Ｅ−セレクチンに対するモノクローナル抗体の作製》
細胞膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠失させたリコンビナント・ヒトＥ−セレクチン（Cat. No. ADP1；R & D Systems, Inc.）２ｍｇ／ｍＬをフロイント完全アジュバンド（体積比１：１）に充分に分散させた。なお、前記リコンビナント・ヒトＥ−セレクチンは、ＣＨＯ細胞により産生した分子量８６〜９０ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による。アミノ酸残基数＝５３５）のタンパク質である。この分散液１００μＬをＢａｌｂ／ｃマウスに一回免疫し、４週間後から２週間毎に、生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬの濃度にしたリコンビナントＥ−セレクチン液１００μＬにより４回免疫した。この免疫マウスを屠殺した後、脾臓を摘出し、この脾臓より脾細胞をマウス一匹あたり０．５×１０⁸ 個得た。この脾細胞１．５×１０⁸ 個とマウスミエローマ細胞（ＳＰ ２／ｏ）３．０×１０⁷ 個とを、ＰＥＧ４０００（４５％）存在下で、融合させ培養した。増殖した細胞の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法［ヒトsE-Selectin ELISAキット；MedSystems Diagnostics GmbH (Austria)］により抗Ｅ−セレクチン抗体の有無を調べた。前記抗体が陽性の細胞を限界希釈法によりクローニングし、抗Ｅ−セレクチン抗体を産生している細胞１４種（No.1-1, No.3-1, No.5-3, No.9-2, No.10-2, No.12-1, No.13-1, No15-1, No.16-3, No.17-3, No.19-1, No.22-2, No.24-2, No.25-2）を確立した。
単離した各モノクローナル抗体の培養上清を用いて、免疫グロブリンサブクラスをクローンタイピングシステム（Southern Biotechnology Associate Inc.）によって測定した。結果を表１に示す。

ヒトＥ−セレクチン（１．０μｇ／ｍＬ）、ヒトＰ−セレクチン（１．０μｇ／ｍＬ）、又はヒトＬ−セレクチン（１．０μｇ／ｍＬ）をそれぞれＣａ^＋＋存在下又はＣａ^＋＋非存在下の含有液、各１００μＬずつを９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルに分注し、室温で１時間放置した。このプレートを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１時間ブロッキングした。上清を除去した後、先に作製した各ハイブリドーマ培養上清希釈液（×８００）５０μＬずつを加えて室温で２時間放置し、０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。次に、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗マウスＩｇＧ１抗体（ヤギ）１００μＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加え、室温で２時間放置し、再び０．２％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄した。このプレートの各ウェルにｐ−ニトロフェニルリン酸を含むジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）５０μＬを添加し、室温で３０分間放置した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。この結果を表２に示す。

得られた細胞２種（No.13-1, No.17-3）を抗ｓＥＳマウスモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）として、それぞれ大量に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後に腹水を採取し、モノクローナル抗Ｅ−セレクチン抗体Ｎｏ．１３−１及びＮｏ．１７−３を得た。なお、前記ハイブリドーマ２種の選択は、以下の実施例２で説明するラテックス反応性を指標として行った。

《実施例２：モノクローナル抗体結合ラテックスの調製とそのラテックスの反応性》
（１）モノクローナル抗体結合ラテックスの調製
ポリスチレンラテックス［１０％，直径０．４８９μｍ；セラダイン社製（米国）］０．２ｍＬを、実施例１で作製したモノクローナル抗ヒトＥ−セレクチン抗体それぞれを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．８ｍＬ（それぞれの抗体濃度０．９ｍｇ／ｍＬ）に混合し、マグネチックスターラーで攪拌した。混合液を遠心分離（２０，０００ｇ×１０分間）し、０．０５％ＮａＮ_３を含む蒸留水で４回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬ−ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁（１ｗ／ｖ％）させ、保存した。

（２）モノクローナル抗体結合ラテックスの反応
各モノクローナル抗ｓＥＳ抗体感作ラテックスと種々の濃度のｓＥＳとを混合し、凝集の有無を確認したところ、Ｎｏ．１３−１とＮｏ．１７−３との組み合わせで良好な凝集結果が得られた。

《実施例３：ＥＬＩＳＡ法によるｓＥＳの測定》
（１）ｓＥＳ抗体感作プレートの調製
抗ｓＥＳマウスモノクローナル抗体Ｎｏ．１３−１を５ｎｇ／ｍＬとなるように炭酸緩衝液に溶解し、９６穴平底マイクロプレートに１００μＬを加え、４℃で２４時間インキュベーションした。プレートの中の液をアスピレーションした後、リン酸緩衝液２００μＬを加え、室温で２分間インキュベーションした。この洗浄操作を３回繰り返した。次に１％ＢＳＡ−リン酸緩衝液２００μＬを加え、３７℃で２時間インキュベーションした。プレートの中の液をアスピレーションした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳＴと称する）２００μＬを加え、室温で２分間インキュベーションした。この洗浄操作を３回繰り返し、可溶性Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体（Ａ）感作プレートを調製した。

（２）抗ｓＥＳモノクローナル抗体−ＨＲＰの調製
Ｎａｋａｎｅ，Ｐ．Ｋらの方法［ピー・ケイ・ナカネ(P.K.，Nakane)ら，「ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー(Journal of Histochemistry & Cytochemistry)，(米国),１９７４年，２２巻，１０８４］により、抗可溶性Ｅ−セレクチンマウスモノクローナル抗体Ｎｏ．１７−３とペルオキシターゼ（ＨＲＰ）とのコンジュゲートを調製した。

（３）標準品の調製
抗原のリコンビナント・ヒトＥ−セレクチン（R&D Systems, Inc.）を可溶性Ｅ−セレクチン（ｓＥＳ）の標準品に用いるため、２％ＢＳＡ、０．０１ｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．１％ＮａＮ_３、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で、７５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、及び３００ｎｇ／ｍＬの希釈液を作製した。

（４）ｓＥＳの測定
前記調製法により得られた感作プレートに、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１０倍希釈した検体１００μＬを加え、室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳＴによる洗浄操作を３回行なった。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴを用いて、０．５μｇ／ｍＬとなるよう希釈した抗ｓＥＳ抗体−ＨＲＰ１００μＬを加え、室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳＴによる洗浄操作を３回行なった。０．０００３％過酸化水素を含む０．４ｍｇ／ｍＬ ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベーションした後、２Ｎ硫酸１００μＬを加え、反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて、主波長４９０ｎｍ／副波長６２０ｎｍのＯＤ値を測定した。

検体の代わりにｓＥＳの標準品を用いて前記のとおりに測定して検量線を作成しておき、この検量線から検体のｓＥＳ濃度を測定した。結果を表３に示す。
また、標準抗原曲線の特性各濃度のｓＥＳ及び検体の吸光度値からブランクの吸光度値を引き、横軸に標準抗原濃度、縦軸に標準抗原の吸光度をプロットし、標準曲線を描いた（図１）。その標準抗原曲線を基に、検体中に含まれるｓＥＳ量を計算することができる。

《実施例４：ラテックス凝集法による測定》
（１）ｓＥＳ抗体感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
抗ｓＥＳマウスモノクローナル抗体Ｎｏ．１３−１（３ｍｇ）をリン酸ナトリウム緩衝液９．５ｍＬに溶解し、０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％緩衝液）０．５ｍＬを加え、３７℃で２時間インキュベーションした後、これに１％ＢＳＡ−リン酸緩衝液２ｍＬを加え、３７℃で９０分間インキュベーションすることによりコーティングを行なった。次に遠心分離（１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心）を行ない、上清を捨て、沈澱をＢＳＡ溶液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、０．０５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム、及び０．２％ＢＳＡ）に懸濁させ、ｓＥＳ抗体感作ラテックス（Ａ）を調製した。同様に、抗ｓＥＳマウスモノクローナル抗体Ｎｏ．１７−３を用いて、ｓＥＳ抗体感作ラテックス（Ｂ）を調製した。（Ａ）及び（Ｂ）を１：１で混合して、ｓＥＳ抗体感作ラテックス試薬を調製した。

（２）ｓＥＳ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
１％ＢＳＡ−リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸２ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウム、及び０．１４％ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む）を調製した。

（３）標準品
実施例３で使用したリコンビナントヒトＥ−セレクチン（R&D Systems, Inc.）を用い、同様に３２０．５７ｎｇ／ｍＬ〜３３．４ｎｇ／ｍＬの希釈液を調製した。

（４）ｓＥＳの測定
自動分析装置ＬＰＩＡ−Ｓ５００（三菱化学社製）を用いて行なった。前記調製法によって得られたｓＥＳ抗体感作ラテックス試薬の第一試薬及び第二試薬を用いて以下の条件で測定した。
検体量：１０μＬ、第一試薬：１８０μＬ、第二試薬：４０μＬ
測定波長：８００ｎｍ、測光ポイント：２−５０（Ｖ_ａｌｌ）

検体に第一試薬を添加して約４．５分間インキュベーションを行なった後、第二試薬を添加して約１分後から５分後の吸光度の差を測定し、濁度変化量（Ｖ_ａｌｌ）とした。検体のかわりにｓＥＳの標準品を用いて前記のとおりに測定して検量線を作成しておき、この検量線から検体のｓＥＳ濃度を測定した。結果を表４に示す。
また、標準抗原曲線の特性各濃度のｓＥＳ及び検体の吸光度変化量（Ｖａｌｌ）を求めた。横軸に標準抗原濃度、縦軸に標準抗原の吸光度をプロットし、標準曲線を描いた（図２）。その標準抗原曲線を基に、検体中に含まれるｓＥＳ量を計算することができる。

（４）ラテックス凝集法とＥＬＩＳＡ法の相関
作成したラテックス法とＥＬＩＳＡ法で血漿検体４７例を測定して両測定法の相関を算出した。結果を図３に示す。

《実施例５：健常者及びＳＩＲＳ患者血漿中のｓＥＳの定量》
健常者及び救命センターに搬送された入院時に採血したＳＩＲＳ患者（基礎疾患として糖尿病性ケトアシドーシス、敗血症、重症肺炎、肺挫傷、脳挫傷、脊髄損傷、骨折等）の血漿中に存在するｓＥＳ濃度をＬＰＩＡ−Ｓ５００で測定した。

その結果、健常者９５名の血漿ｓＥＳは７．１８〜３１．５１ｎｇ／ｍＬであり（図４）、健常者の上限値（平均＋２ＳＤ）２９．７４ｍｇ／ｍＬをカットオフ値とした。
一方、ＳＩＲＳ患者３９例の血漿ｓＥＳは８．４７〜１８８．４４ｎｇ／ｍＬであった（図５）。この３９例の内、濃度正常者は２２例（５６．４％）であり（図６）、健常者よりもｓＥＳが高値となる患者は、３９例中１７例（４３．６％）であり、３０．７〜１８８．４４ｎｇ／ｍＬであった（図７）。

《実施例６：ＳＩＲＳ患者のｓＥＳ濃度とＳＯＦＡスコア》
ＳＩＲＳ患者３９例の入院後８日間の臓器不全ＳＯＦＡスコアをＶｉｎｃｅｎｔ，ＪＬらの報告［ジェイ・エル・ビンセント（J.L., Vincent）ら，「クリティカル・ケア・メディシン(Critical Care Medicine)」，(米国)，１９９８年，２６巻，ｐ.１７９３−１８００］に従って算定し、入院初日の血漿中のｓＥＳ濃度との関連性を調べた。
表５に示すように、ＳＩＲＳ患者でｓＥＳが正常で重症呼吸不全を発症しなかった２２例中には死亡例は無く（０％）、また、ｓＥＳ正常者では重症呼吸不全の発症は少なく、２２例中３例（１３．６％）であった。
一方、表６に示すように、血漿中ｓＥＳ濃度が２９．７４ｎｇ／ｍＬ以上の異常値を示したＳＩＲＳ患者１７例で、重症呼吸不全の発症は、ＳＯＦＡ３の１７例中９例（５２．９％）及びＳＯＦＡ４の１７例中３例（１７．６％）を合わせた１２例（７０．６％）であった。

ＳＩＲＳ患者で重篤な呼吸不全を発症し、死亡した患者５例はいずれもｓＥＳが高値（ＳＯＦＡ２：６６．５６ｎｇ／ｍＬ，１８７．１７ｎｇ／ｍＬ；ＳＯＦＡ３：５３．６８ｎｇ／ｍＬ，６３．４１ｎｇ／ｍＬ；ＳＯＦＡ４：７５．９０ｎｇ／ｍＬ）であり、入院初日の血漿中に存在するｓＥＳを測定することにより、ＳＩＲＳ患者の予後の予測に有用であった。
なお、入院初日のｓＥＳが高値となったＳＩＲＳ患者１７例の基礎疾患として外傷性よりも内因性の疾患患者が多く、ＳＯＦＡ３の９例及びＳＯＦＡ４の３例を合わせた１２例（７０．６％）であった。
表６に示すとおり、ｓＥＳ濃度はＳＯＦＡ呼吸不全スコアと深く関連し、ｓＥＳ濃度が呼吸器不全発症予測の客観的な指標として有用であることが示された。

《実施例７：ｓＥＳのイムノクロマトグラフによる測定》
本実施例では、ｓＥＳ捕捉用抗体として薄片状のクロマトグラフィー基材（ニトロセルロース膜）の片方に金コロイド標識したマウスモノクローナル抗体Ｎｏ．１３−１を塗布し、他方に第２の抗マウスモノクローナル抗体Ｎｏ．１７−３を固定し、ｓＥＳのイムノクロマトグラフ法を実施した。

（１）イムノクロマトグラフ用メンブレンの作製
ナイロン６６製メンブレン（Immunodyne ABC，孔径３．０μｍ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに裁断した．メンブレンの上流側の一端から８ｍｍの位置に可用性Ｅ−セレクチンの検出ゾーンとしてモノクローナル抗可溶性Ｅ−セレクチン抗体Ｎｏ．１７−３（０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液，ｐＨ８．５で希釈）を幅１ｍｍの線状に塗布した。

また、メンブレンの上流側の一端から１３ｍｍの位置に陰性コントロールゾーンとしてマウスモノクローナルＩｇＧ溶液又はポリクローナルＩｇＧ（自社製）溶液（各々濃度０．５ｍｇ／ｍｌ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液，ｐＨ８．５で希釈）を、幅１ｍｍの線状に塗布した。室温下で１時間、３７℃下で３０分間静置し、各々の抗体を固相化した。メンブレンを０．５％ＢＳＡを含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し，室温、相対湿度２０％以下の条件下で３０分間緩やかに振とうし、ブロッキングした。メンブレンの過剰のブロッキング液を除き、室温下で一夜静置して乾燥させ、イムノクロマトグラフ法用抗体固相化メンブレンとした。

（２）金コロイド標識モノクローナル抗体懸濁液の作製
マウスモノクローナル抗体Ｎｏ．１３−１（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７緩衝液（ｐＨ６．５）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と称する）３，０００ｍＬ中で４℃下で一夜透析した。モノクローナル抗体溶液は、４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を１００，０００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。金コロイド液（GOLD COLLOID ２０ｎｍ；British BioCell International製）１００ｍＬを０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｋ_２ＣＯ_３溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ_３ＰＯ_４溶液でｐＨ６．５に調整した。金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、希釈したモノクローナル抗体溶液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０；４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを滴下した後、室温下で３０分間撹拌した。１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した金コロイド標識モノクローナル抗体を０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識マウスモノクローナル抗体Ｎｏ．１３−１を０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識モノクローナル抗体を０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（０．４５μｍフィルター濾過）に再懸濁させた後、波長５２０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試験管に移し密栓し、４℃下に保存し、イムノクロマトグラフ法用金コロイド標識モノクローナル抗体懸濁液とした。

金コロイド標識モノクローナル抗体懸濁液は、波長５２０ｎｍにおける吸光度が３．０になるように５．０％ショ糖を含む２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した後、その７μＬを吸収パッドアキュウィックＡＷ１４−２０Ｔ４（Pall Corporation製）を５ｍｍ×５ｍｍのサイズに裁断したものに塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦５０ｍｍＨｇ）乾燥したものをイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識抗体パッドとした。

（３）イムノクロマトグラフ法用吸収パッドの作製
グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｂ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断したものをｓＥＳイムノクロマトグラフ法用試料添加パッドとした。グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｅ；Pall Corporation製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに裁断したものを，イムノクロマトグラフ法用吸収パッドとした。

（４）イムノクロマトグラフ小片
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに裁断したプラスティック粘着シート（BioDot製）に、上流側より、試料添加パッド、金コロイド標識モノクローナル抗体パッド、抗体固相化メンブレン、吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、可用性Ｅ−セレクチン測定用イムノクロマトグラフ小片とした。

（５）イムノクロマトグラフ法による可溶性Ｅ−セレクチンの測定
ＳＩＲＳ患者の血漿検体５０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液５０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ小片の試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
メンブレンのモノクローナル抗ｓＥＳ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、可溶性Ｅ−セレクチン生成物の有無を判定した。結果を表７及び表８に示す。表中、−は陰性、＋は弱陽性、＋＋は中陽性、＋＋＋は強陽性であることを示す。

本発明の予測方法及び予測用試薬は、ＳＩＲＳにおける重症臓器不全（特に重篤な急性呼吸不全）の発症予測及び／又は予後予測の用途に適用することができる。

ＥＬＩＳＡでの標準品（可溶性Ｅ−セレクチン）の測定結果を示すグラフである。 ＬＰＩＡ−Ｓ５００を用いた標準品（可溶性Ｅ−セレクチン）の測定結果を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡとＬＰＩＡ−Ｓ５００の相関を示グラフである。 健常者血漿中の可溶性Ｅ−セレクチン測定値を示すグラフである。 ＳＩＲＳ全患者（ｎ＝３９）における血漿中の可溶性Ｅ−セレクチン測定値を示すグラフである。記号「†」は、死亡した患者のデータであることを示す。 血漿中の可溶性Ｅ−セレクチンが正常範囲のＳＩＲＳ患者（ｎ＝２２）のデータを示すグラフである。 血漿中の可溶性Ｅ−セレクチンが異常値を示したＳＩＲＳ患者（ｎ＝１７）のデータを示すグラフである。記号「†」は、死亡した患者のデータであることを示す。

Claims (3)

1. 可溶性Ｅ−セレクチンを分析することを特徴とする、全身性炎症反応症候群患者における臓器障害の発症又は予後を予測する方法。
2. 可溶性Ｅ−セレクチンの分析を免疫化学的方法により実施する、請求項１に記載の方法。
3. 可溶性Ｅ−セレクチンに特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、全身性炎症反応症候群患者における臓器障害発症又は予後の予測用試薬。

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