CN104101715A - 检测dock8蛋白的试剂盒及非诊断目的检测dock8蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白检测领域，特别涉及检测DOCK8蛋白的试剂盒及非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法。该试剂盒包括DOCK8抗体、荧光素标记的第二抗体、同型对照抗体。本发明提供的试剂盒可准确检测DOCK8蛋白；本发明提供的检测DOCK8蛋白的方法可靠，操作简单，重复性好，耗时短，整个检测过程只需5小时。

Description

检测DOCK8蛋白的试剂盒及非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法
技术领域
本发明涉及蛋白检测领域，特别涉及检测DOCK8蛋白的试剂盒及非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法。
背景技术
高IgE综合征(HIES；或Job's综合征)是一类以反复的皮肤和肺部感染、湿疹、血清IgE水平显著升高和嗜酸性粒细胞增多为特征的原发性联合免疫缺陷病。根据遗传方式的不同，HIES分为两类，包括常染色体显性遗传HIES(AD-HIES)和常染色体隐性遗传HIES(AR-HIES)。
AD-HIES患者的临床表现复杂多样，但其临床表现均有以下4个共性：①出生时或生后不久即开始出现顽固性湿疹样皮炎；②血清IgE水平显著增高；③外周血嗜酸性粒细胞增高；④反复发作的皮肤或肺脓肿。HIES的感染主要在皮肤和肺，皮肤脓肿因无通常所见的红、肿、痛，因而又称之为“冷脓肿”，主要致病菌为金黄色葡萄球菌，也可为肺炎球菌、流感嗜血杆菌及假单胞菌等。反复肺部感染可导致肺组织破坏而形成肺膨出、肺囊肿和支气管扩张等病症。肺实质的损害导致患者易患慢性和机会性感染，包括曲霉菌属、绿脓杆菌、卡氏肺囊虫以及非典型分枝杆菌感染等。曲霉菌属与绿脓杆菌反复感染是HIES患者死亡的主要病因，故应引起足够重视。患儿一般无其他过敏表现，如过敏性鼻炎、荨麻疹、哮喘。AD-HIES患者还可有免疫系统外的表现：特殊面容(前额突出、宽鼻梁、面部不对称、眼窝深陷及双侧外眦眼距增宽)、易骨折(微小创伤即可引起)、脊柱侧弯、关节过伸、乳牙脱落延迟及血小板增高等。目前研究认为，AD-HIES多为信号转导与转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription,STAT3)基因突变所致。STAT3是一种转录因子，可被多种细胞因子和生长因子激活，包括IL-6、IL-10、IL-22、IL-23及巨噬细胞集落刺激因子。AD-HIES中STAT3突变干扰以上细胞因子激活的信号转导途径，从而导致免疫反应的改变。
AR-HIES患者可与AD-HIES患者有相似的表现，如严重的特应性皮炎样皮疹，特应性皮炎样皮疹通常为首发表现，几乎所有HIES患者在婴幼儿时期均可发生；反复细菌感染，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等；血嗜酸性粒细胞计数及血清IgE增高。患者通常伴有严重的过敏性疾病，如哮喘以及对食物和环境过敏原过敏等。由于AR-HIES可合并联合免疫缺陷，因此患者可反复发生顽固的病毒感染，并可能早期并发恶性肿瘤。严重慢性皮肤病毒感染是AR-HIES的显著特征，累及约90％AR-HIES患者。较常见的病毒为单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、巨细胞病毒(molluscum contagiosum virus，MCV)及水痘带状疱疹病毒(varicella-zostervirus，VZV)。此外，约半数的患者发生皮肤黏膜念珠菌感染；少数患者因感染或血管病变发生严重的中枢神经系统病变，如偏瘫、缺血性梗死等。此型HIES仅累及免疫系统，而不出现骨骼、牙齿及结缔组织病变。多数AR-HIES患者为胞质分裂专一物8蛋白(dedicator ofcytokinesis8protein，DOCK8)基因突变，AR-HIES患者中DOCK8缺失可引起T淋巴细胞和B淋巴细胞联合免疫缺陷，从而导致患者对病毒感染的抵抗力大大减弱。
DOCK8(Dedicator of cytokinesis8)基因定位于9p24.3，信使RNA(mRNA)有3种异构体，包括46-48个外显子，超过250kb的基因序列，编码1999-2099个氨基酸约239kDa的DOCK8蛋白。DOCK8蛋白表达谱广泛，主要表达在胎盘、肾、肺和胰腺，在免疫系统尤其是淋巴细胞中高度表达。DOCK8属于DOCK180家族成员，包括两个结构域，DHR1和DHR2(DOCK8同源域1和2)。DOCK180家族由11个非典型鸟嘌呤交换因子(guanine exchange factors，GEF)组成，它们可激活Rho-GTP酶包括RAC1、RAC2和CDC42。GTP酶调节很多细胞功能包括肌动蛋白细胞骨架调控、细胞周期连续和基因表达。而DOCK8属于DOCK180家族的DOCK-C亚家族成员，可激活RAC和CDC42，对细胞骨架构成等功能至关重要。研究发现，DOCK8蛋白微量表达或不表达可导致高IgE综合征，因此，对于DOCK8蛋白的检测具有重要的临床意义。目前对于DOCK8基因的表达主要采用Western blotting、Northern blotting和免疫组化等方法进行鉴定。
其中，Western blotting法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该方法操作步骤繁复，导致误差的因素较多，耗时较长，重复性较差，且所用的很多实验用品对人体都有一定的伤害。
Northern blotting是从组织或细胞中提取总RNA，再经过寡聚(dT)纯化柱进行分离纯化得到mRNA。然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小对被分离，随后凝胶上的RNA分子被转移到膜上。被标记的探针与RNA探针杂交，经过信号显示后表明需检测的基因的表达。该方法所需样本为RNA，RNA容易降解，所以northern blotting中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。同时，northern blotting中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等对人体都有一定的伤害。
免疫组化是组织或细胞标本制备切片后利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及半定量的研究。该方法所需样本为组织或细胞标本，取材困难，操作步骤繁复，导致误差的因素较多，耗时较长，且重复性较差。
由于Western blotting、Northern blotting和免疫组化等方法均存在一定的缺陷，因此提供一种重复性好、样品采集简单、操作简单、耗时短的DOCK8蛋白的检测方法，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了检测DOCK8蛋白的试剂盒及非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法。该试剂盒可准确检测DOCK8蛋白；该检测方法准确可靠，操作简单，重复性好，耗时短，整个检测过程只需5小时。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测DOCK8蛋白的试剂盒，包括DOCK8抗体、荧光素标记的第二抗体、同型对照抗体。
第一抗体就是能和非抗体性抗原(特异性抗原)特异性结合的蛋白。在本发明提供的一些实施例中，第一抗体是DOCK8抗体。
第二抗体是第一抗体的抗体，第二抗体能与第一抗体结合，第二抗体的主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。在本发明提供的一些实施例中，第二抗体为羊抗兔IgG抗体。
在本发明提供的一些实施例中，羊抗兔IgG抗体为多克隆抗体。
在本发明提供的一些实施例中，同型对照抗体为兔源IgG单抗。同型对照抗体是指使用与实验抗体(一抗)相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照。设置同型对照抗体的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。其中，抗体非特异性结合主要包括：(1)抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合；(2)抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。
在本发明提供的一些实施例中，荧光素为藻红蛋白。
在本发明提供的一些实施例中，本发明提供的试剂盒还包括抗凝剂。
作为优选，抗凝剂为肝素锂。
在本发明提供的一些实施例中，试剂盒还包括含DOCK8蛋白的血液。
本发明还提供了一种非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法，包括如下步骤：
取待测血液样本，经预处理，与DOCK8抗体孵育，再与荧光素标记的第二抗体孵育，获得待测血液样本复合物；
取待测血液样本，经预处理，与同型对照抗体孵育，再与荧光素标记的第二抗体孵育，获得待测血液样本的同型对照复合物；
采用流式细胞术检测待测血液样本复合物和待测血液样本的同型对照复合物的荧光强度，根据待测血液样本复合物和待测血液样本的同型对照复合物的荧光强度一致性，判断待测血液样本中是否含有DOCK8蛋白；
待测血液样本复合物的荧光强度与待测血液样本的同型对照复合物的荧光强度一致，则待测血液样本不含DOCK8蛋白；
待测血液样本复合物的荧光强度高于待测血液样本的同型对照复合物的荧光强度，则待测血液样本含DOCK8蛋白。
在本发明中，检测DOCK8蛋白的原理为：
待测血液样本含有DOCK8蛋白时，先与DOCK8抗体(第一抗体)结合，再与荧光素标记的第二抗体结合，形成DOCK8蛋白-第一抗体-荧光素标记第二抗体复合物；
同时设置同型对照抗体消除非特异性结合背景。同型对照抗体是指使用与实验抗体(一抗)相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照。设置同型对照抗体的主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。其中，抗体非特异性结合主要包括：(1)抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合；(2)抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色；
采用流式细胞术对DOCK8蛋白-第一抗体-荧光素标记第二抗体复合物进行检测时，相对于同型对照复合物会产生荧光强度的增加，在流式细胞检测图中表现为DOCK8蛋白-第一抗体-荧光素标记第二抗体复合物的检测峰与同型对照复合物的检测峰不重叠，即DOCK8蛋白-第一抗体-荧光素标记第二抗体复合物的荧光强度会高于同型对照复合物的荧光强度；
待测血液样本不含有DOCK8蛋白时，无法形成DOCK8蛋白的抗原抗体复合物，采用流式细胞术进行检测时，其荧光强度不增加，即不含DOCK8的血液样本的荧光强度与同型对照复合物的荧光强度一致。
判断待测血液样本中是否含有DOCK8蛋白的原理如下：
待测血液样本与一抗特异性结合的淋巴细胞的平均荧光强度和待测血液样本的与同型对照抗体非特异性结合的淋巴细胞的平均荧光强度一致，则待测血液样本不含DOCK8蛋白；
待测血液样本与一抗特异性结合的淋巴细胞的平均荧光强度高于待测血液样本与同型对照抗体非特异性结合的淋巴细胞的平均荧光强度，则待测血液样本含DOCK8蛋白。
在本发明提供的一些实施例中，检测DOCK8蛋白的方法还包括：取含DOCK8蛋白的血液作为阳性对照，按照上述方法检测荧光强度。
取含DOCK8蛋白的血液作为阳性对照，按照上述方法进行检测具体为：
取含DOCK8蛋白的血液，经预处理，与DOCK8抗体孵育，再与荧光素标记的第二抗体孵育，获得阳性对照复合物；
取含DOCK8蛋白的血液，经预处理，与同型对照抗体孵育，再与荧光素标记的第二抗体孵育，获得含DOCK8蛋白的血液的同型对照复合物；
采用流式细胞术检测阳性对照复合物和含DOCK8蛋白的血液的同型对照复合物的荧光强度。
设置含DOCK8蛋白的血液作为阳性对照的目的是对整个检测过程进行质控。
在本发明提供的一些实施例中，预处理具体为：加入抗凝剂，分离外周血单个核细胞，固定，打孔。
作为优选，孵育的时间为20～30min。
作为优选，孵育的温度为15～30℃。
在本发明提供的一些实施例中，固定的时间为30～50min。
在本发明提供的一些实施例中，打孔的时间为15～20min。
在本发明提供的一些实施例中，第二抗体为羊抗兔IgG抗体。
在本发明提供的一些实施例中，同型对照抗体为兔源IgG单抗。
在本发明提供的一些实施例中，荧光素为藻红蛋白(PE)。
作为优选，抗凝剂为肝素锂。
在本发明提供的一些实施例中，试剂盒还包括含DOCK8蛋白的血液。
本发明提供了检测DOCK8蛋白的试剂盒及非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法。该试剂盒包括DOCK8抗体、荧光素标记的第二抗体、同型对照抗体。本发明提供的试剂盒可准确检测DOCK8蛋白；本发明提供的检测DOCK8蛋白的方法准确可靠，操作简单，重复性好，耗时短，整个检测过程只需5小时。
附图说明
图1示实施例1中缺失DOCK8蛋白的血液样本的细胞流式检测结果；其中，线1示同型对照的检测峰，线2示缺失DOCK8蛋白的血液样本的检测峰；
图2示实施例2中表达DOCK8蛋白的血液样本的细胞流式检测结果；其中，线1示同型对照的检测峰，线2示表达DOCK8蛋白的血液样本的检测峰。
具体实施方式
本发明公开了检测DOCK8蛋白的试剂盒及非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的检测DOCK8蛋白的试剂盒及非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法中所用抗体、试剂等均可由市场购得。固定剂和打孔剂均购自BD公司；anti-human DOCK8抗体购自abcam，货号ab175208；同型对照抗体rabbit IgG isotype购自abcam，货号ab172730；PE标记的羊抗兔IgG二抗购自abcam，货号ab97070。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 DOCK8蛋白的检测
采用Western Blot法筛选获得缺失DOCK8蛋白的血液样本。Western Blot法的具体操作为：
(一)蛋白样品制备
采集血液样本，分离外周血单个核细胞，倒掉培养液，用预冷的PBS洗1～2次，去尽残液(冰上操作)。按1mL裂解液加10μL0.1M PMSF、3μLAprotining(抑肽酶)和5μL0.1M Na3VO4，(正钒酸钠)备用(PMSF要摇匀至无结晶时才可加入裂解液)。按照100－200μL裂解液/50cm2的比例加入培养瓶，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动或吹打。裂解完后，用移液器轻轻吹打洗涤，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中(整个操作尽量在冰上进行)。于4℃下12000rpm离心15min(提前开离心机预冷)。离心完后，取上清装入新的EP管中，取一部分测浓度，-80℃保存。适量分装。获得细胞总蛋白。
(二)蛋白含量的测定
1、制作标准曲线
从-20℃取出1mg/mL BSA，室温融化后，备用。按以下浓度稀释BSA(mg/mL)：
BSA 0 1 2 4 6 8 10
去离子水 10 9 8 6 4 2 0
每管加100μL BCA工作液(A：B＝50：1)，37℃水浴30min。紫外分光光度仪于562nm波长测定吸光度，电脑自动生成标准曲线，保存标准曲线退出。
2、检测样品蛋白含量
适当比例稀释样本。BCA试剂A:B＝50:1。BCA工作液与稀释样本比例为10：1。37℃水浴30分钟。紫外分光光度仪于562nm波长测定吸光度，保存数据。
(三)SDS-PAGE电泳
1、分离胶制作
目的蛋白分子量偏大，为239KD选用6％的分离胶。浓缩胶制作，浓缩胶的浓度为5％。擦净玻板，玻板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。将分离胶各组分按比例充分混合后灌入玻璃板夹缝。正丁醇封闭。等待20～30min。倒掉正丁醇，用去离子水冲洗两次。参照5％比例灌制浓缩胶，混匀加入后立即插入梳子。等待30min～1h即可取出梳子，组装电泳装置。在电泳装置中加入电泳液，先加一半倾斜去除底部气泡。
取适量蛋白样品(根据检测样品蛋白含量),加适量5×SDS Loading Buffer,沸水中煮3-5min，冷却至室温上样。一般留第一个孔上maker，空余孔加适量1×SDS Loading Buffer压带。电泳：(1)30V先跑五分钟；(2)80V浓缩胶；(3)120V分离胶(可在出现marker后再改成120V)。跑到距离底部约0.5cm时，关闭电源。
将电转液倒入2.5L平底托盘中，将滤纸和海绵垫浸于电转液中。采用PVDF膜，取出后据个人习惯剪掉一角并用铅笔标记，再用无水甲醇浸泡5-10s。取出放于电转液中浸泡5min，根据目的条带大小切取胶条。平放于PVDF膜上，对齐后铺上滤纸。把夹子夹好，注意按正确的顺序(正负极)组装三明治。100v1.5-2h，转膜时可加入冰盒，并可用磁力搅拌器保证体系处于较低的温度状态，以免影响转膜效果。
(四)免疫反应
转膜完以后TBST洗膜一次，倒掉废液加适量5％脱脂奶粉，摇2h。TBST洗膜三次，每次10min。一抗孵育稀释。4℃摇床过夜。转至室温摇置约30min,以恢复室温。TBST洗膜三次，每次10min。根据一抗加二抗，摇床摇2h。TBST洗膜三次，每次10min。化学发光，保存图片。
取上述采用Western Blot法筛选获得的缺失DOCK8蛋白的血液样本3～5mL，肝素锂抗凝，分离外周血单个核细胞(PBMCs)，具体操作为：将血液与1×PBS体积按1:1混合，获得血液溶液；取新离心管，加入等量淋巴细胞分离液；将获得的血液溶液滴入淋巴细胞分离液中，注意分层良好；离心800g，20min，将离心好后的管中白色悬浮细胞全部吸入5mL PBS的离心管中；离心2500rpm，10min；弃上清，管底物质即为PBMCs。
向上述装有PBMCs的离心管中加入固定剂400μL，固定30～50分钟，4000rpm离心5min，弃上清；将PERM/WASH BUFFER稀释成1×，向上述离心管中的加入1mL PERM/WASH BUFFER，混匀后4000rpm离心5分钟，弃上清，加入1mL打孔剂，混匀，静置15～20分钟。加入山羊血清进行封闭20min，以排除非特异性结合。
将上述液体离心4000rpm，5分钟，弃上清后分为实验管和对照管，分别加入anti-human DOCK8抗体(一抗)及rabbit IgG isotype(兔源IgG单抗，即同型对照抗体)，各1μL，15～30℃孵育20-30min。洗涤后各管均加入山羊血清进行封闭20min。
实验管和对照管用打孔剂1×PERM/WASH BUFFER洗涤后，均加入PE标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)各1μL，15～30℃避光孵育20-30min，洗涤后于FACSCalibur流式细胞仪上机检测。
流式细胞仪检测结果如图1所示。
由图1可知，缺失DOCK8蛋白的血液中无DOCK8蛋白表达，与WesternBlot法的检测结果一致。试验结果显示该检测DOCK8蛋白的方法准确可靠，且耗时短，共耗时5小时。
实施例2 重复性检测试验
取确定为缺失DOCK8蛋白的血液样本，将其分为3批样本，分别为第一样本、第二样本、第三样本。按照实施例1提供的检测方法进行抗凝、分离外周血单个核细胞(PBMCs)、固定、打孔、流式检测，结果显示第一样本、第二样本和第三样本的流式细胞仪检测结果与图1相近，表明本发明提供的检测方法重复性好。
取确定为表达DOCK8蛋白的血液样本，将其分为3批样本，分别为第四样本、第五样本、第六样本。按照实施例1提供的检测方法进行抗凝、分离外周血单个核细胞(PBMCs)、固定、打孔、流式检测，第四样本流式细胞仪检测结果见图2，第五样本和第六样本的流式细胞仪检测结果与图2相近，表明本发明提供的检测方法重复性好。
实施例3 临床检测试验
采集疑似高IgE综合征患儿外周静脉血(待测血液样本)及父亲(健康)的外周静脉血各3～5mL，肝素锂抗凝。对患儿及其父的外周静脉血分离外周血单个核细胞(PBMCs)，具体操作为：将血液与1×PBS体积按1:1混合，获得血液溶液；取新离心管，加入等量淋巴细胞分离液；将获得的血液溶液滴入淋巴细胞分离液中，注意分层良好；离心800g，20min，将离心好后的管中白色悬浮细胞全部吸入5mL PBS的离心管中；离心2500rpm，10min；弃上清，管底物质即为PBMCs。
向上述装有PBMCs的离心管中加入固定剂400μL，固定30～50分钟，4000rpm离心5min，弃上清；将PERM/WASH BUFFER稀释成1×，向上述离心管中的加入1mL PERM/WASH BUFFER，混匀后4000rpm离心5分钟，弃上清，加入1mL打孔剂，混匀，静置15～20分钟。加入山羊血清进行封闭20min，以排除非特异性结合。
将上述液体离心4000rpm，5分钟，弃上清后分为实验管和对照管，分别加入anti-human DOCK8抗体(一抗)及rabbit IgG isotype(兔源IgG单抗，即同型对照抗体)，各1μL，15～30℃孵育20-30min。洗涤后各管均加入山羊血清进行封闭20min。
实验管和对照管用打孔剂1×PERM/WASH BUFFER洗涤后，均加入PE标记的羊抗兔IgG二抗各1μL，15～30℃避光孵育20-30min，洗涤后于FACSCalibur流式细胞仪上机检测。其中，疑似高IgE综合征患儿血液的流式细胞仪检测图与实施例1中的图1相似，父亲血液的流式细胞仪检测图与实施例2中的图2相似。
由上述实验结果可知，疑似患儿的血液中无DOCK8蛋白表达，健康父亲的血液有DOCK8蛋白表达，疑似患儿确诊为高IgE综合征患儿(DOCK8缺陷患儿)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种检测DOCK8蛋白的试剂盒，其特征在于，包括DOCK8抗体、荧光素标记的第二抗体、同型对照抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体为羊抗兔IgG抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述同型对照抗体为兔源IgG单抗。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素为藻红蛋白。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗凝剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗凝剂为肝素锂。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含DOCK8蛋白的血液。
8.一种非诊断目的检测DOCK8蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待测血液样本，经预处理，与DOCK8抗体孵育，再与荧光素标记的第二抗体孵育，获得待测血液样本复合物；
取待测血液样本，经预处理，与同型对照抗体孵育，再与荧光素标记的第二抗体孵育，获得待测血液样本的同型对照复合物；
采用流式细胞术检测所述待测血液样本复合物和所述待测血液样本的同型对照复合物的荧光强度，根据所述待测血液样本复合物和所述待测血液样本的同型对照复合物的荧光强度一致性，判断所述待测血液样本中是否含有DOCK8蛋白；
所述待测血液样本复合物的荧光强度与所述待测血液样本的同型对照复合物的荧光强度一致，则待测血液样本不含DOCK8蛋白；
所述待测血液样本复合物的荧光强度高于所述待测血液样本的同型对照复合物的荧光强度，则待测血液样本含DOCK8蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：取含DOCK8蛋白的血液作为阳性对照，按照权利要求8所述的方法检测荧光强度。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述预处理具体为：加入抗凝剂，分离外周血单个核细胞，固定，打孔。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为20～30min。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为15～30℃。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述固定的时间为30～50min。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述打孔的时间为15～20min。
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