JP2020201103A - カブトガニ血球凝固カスケードを利用した測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】前処理で不溶物が得られた場合でも、正確な値を得ることができる、新規な測定方法に関する。【解決手段】リムルス反応により生成した凝固酵素によって切断されたペプチドを、切断されたペプチドを特異的に認識するが、切断される前のペプチドは認識しない抗体を用いて、イムノアッセイにより検出して、ペプチドを測定し、その測定値からβ−Ｄ−グルカン又はエンドトキシンの量を求めることを特徴とする、β−Ｄ−グルカンの測定方法。【選択図】図１

Description

本発明は、カブトガニ血球凝固カスケードを利用した、ペプチドの測定方法、およびそれを利用したβ−Ｄ−グルカンとエンドトキシンの測定方法に関する。

カブトガニの血液凝固カスケードはルミルス反応ともいわれ、それを物質の測定に利用する方法はいくつか報告されている。一つ目の例として、血中（１→３）−β−Ｄ−グルカン（以下β−Ｄ−グルカンと省略）の測定が挙げられる。測定原理は、カブトガニの血液凝固カスケードのＧ因子をβ−Ｄ−グルカンが活性化し、最終的に凝固酵素が生成することで測定されており、深在性真菌症診療で使用される検査法である。二つ目の例として、エンドトキシンの測定が行われている。カブトガニの血液凝固カスケードのＣ因子をエンドトキシンが活性化し、最終的に凝固酵素が生成する原理が利用されている。

どちらの測定系も、反応に伴い生成した凝固酵素が、発色合成基質（例えばＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を切断し、生成してくる黄色のｐＮＡ（パラニトロアニリン）の４０５ｎｍでの色の変化を、吸光法で測定されている。

どちらの測定を行うにしろ、吸光法で測定されているため、濁りなどの影響を受けやすいことが問題であった。一例をあげると、一つ目の測定を行うには、まず検体をアルカリでの前処理が必須である。その際に、検体の溶血が発生したり、γグロブリンを大量に含む検体などでは、検体中のタンパク質が不溶化し析出したりする場合があり、吸光度の測定を妨害する場合があった。そのような場合、本来得られる吸光度以上の値が得られるため、偽陽性と判定してしまう場合があった。

従来の技術では、発色合成基質（例えばＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）が切断されて得られるｐＮＡの吸光度を直接測定するため、検体中に発生した濁りなどの影響を受けてしまう。また、不溶物が発生しないように、アルカリ変性条件をマイルドにすることも考えられるが、条件を緩和しすぎると変性不良が発生する可能性があり、最適な濃度設定が難しかった。

本発明は、このような課題を解決することを目的とし、前処理で不溶物が得られた場合でも、正確な値を得ることができる、新規な測定方法に関する。

本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下の通りである。
（１）リムルス反応により生成した凝固酵素によって切断されたペプチドを検出することを特徴とする、ペプチドの測定方法。
（２）上述の（１）に記載の方法において、ペプチドをイムノアッセイにより検出する方法。
（３）上述の（２）に記載の方法において、切断されたペプチドを特異的に認識するが、切断される前のペプチドは認識しない抗体を用いる方法。
（４）上述の（１）〜（３）いずれかに記載の方法を用いてペプチドを測定し、その測定値からβ−Ｄ−グルカンの量を求めることを特徴とする、β−Ｄ−グルカンの測定方法。
（５）上述の（１）〜（３）いずれかに記載の方法を用いてペプチドを測定し、その測定値からエンドトキシンの量を求めることを特徴とする、エンドトキシンの測定方法。
以下でその測定原理について詳細に説明する。

本発明は、リムルス反応により生成した凝固酵素によって切断されたペプチドを検出することを特徴とする、ペプチドの測定方法である。検出方法としてはペプチドを検出できるものであれば特に限定されるものではないが、好ましくはイムノアッセイがあげられる。イムノアッセイとしては、特に限定されるものではないが、例えばペプチドを２種類の抗体で検出するサンドイッチアッセイで検出する方法や、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質にリムルス反応で切断前の基質ペプチドを結合させておき、そのタンパク質をＥＬＩＳＡプレート上に固定化しておき、プレート上でリムルス反応を進めて、反応後に切断したペプチドを認識する抗体で検出する方法があげられるが、切断されたペプチドを抗体で検出する方法で有ればどのような方法でも採用可能である。

イムノアッセイに用いられる抗体は、切断されたペプチドを特異的に認識するものであればよく、特に限定されるものではない。一例として、以下抗体があげられる。即ち、抗体の中には、ペプチドのＮ末端に存在するアミノ基またはペプチドのＣ末端に存在するカルボキシル基を強く認識するものがある。そのような抗体は、ペプチドの末端に別の配列が付加されると反応性を消失する場合がある。例えば、特開２０１４−２８７７０号公報、特開２０１４−９１７１９号公報、特開２０１６−１６９２００号公報に具体例が示されている。特開２０１４−２８７７０号公報にはヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドと反応し、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドとは反応しないことを特徴とする抗体（９−１３Ｐ−３Ｐ−２Ｄ抗体）が開示されている。つまり、プロテアーゼで切断される前のペプチド（ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド）とは反応せず、切断された後のペプチド（ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド）と反応する抗体である。この抗体は、プロテアーゼの切断で生じるＮ末端のセリンのアミノ基をエピトープとして強く認識しているために、このような特異性の変化が起こる。同様な特異性を有する抗体は、特開２０１４−９１７１９号公報、特開２０１６−１６９２００号公報にも開示されている。このような特性を有した抗体を、本発明に使用することができる。

特開２０１４−２８７７０号公報に開示されている抗体（９−１３Ｐ−３Ｐ−２Ｄ抗体）を更に詳細に説明する。本抗体は、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−の配列（配列番号２）をＮ末端に有し、ＳｅｒのＮ末端はフリーのアミノ基を有するペプチドと反応する。本抗体は、例えば上記ペプチドのＮ末端にＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを結合させて得られる、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−の配列（配列番号３）のペプチドには反応しない。しかし上記ペプチドＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−（配列番号３）がリムルス反応で切断されて、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−の配列（配列番号２）が得られれば、そのペプチドには特開２０１４−２８７７０号公報の９−１３Ｐ−３Ｐ−２Ｄ抗体は反応する。Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−の配列は、リムルス反応で生成した凝固酵素が認識する配列であり、当該酵素はＡｒｇのＣ末端を切断する。

これらの現象を利用することにより、リムルス反応により得られた切断ペプチドを例えばイムノアッセイで測定することが可能となる。この方法が構築できれば、アルカリによる検体の前処理工程で不溶物が発生したとしても、イムノアッセイには影響を与えないため正確な値を得ることができる。また本測定系の場合は強い変性条件を採用することが可能となるため、アルカリ変性条件をマイルドにすることによる変性不良の発生も心配することは無い。

上述のリムルス反応で生成した凝固酵素が認識する配列Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−に結合させるペプチドの配列は、使用する抗体が特異的に認識する配列を有するものであればよく、特に限定されるものではない。例えば特開２０１４−２８７７０号公報、特開２０１４−９１７１９号公報、特開２０１６−１６９２００号公報で示される配列を示せば、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−（配列番号２）、Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（配列番号４）、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−（配列番号５）があげられるが、反応の特異性を向上させるため、これらの配列は適宜変更してももちろん構わないし、ここに示す以外のペプチド配列と抗体の組み合わせでも、利用可能である。

上記ペプチドのＮ末端側に付与するペプチドの配列は、リムルス反応で生成した凝固酵素が認識し切断する配列であれば特に限定されない。通常、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ―Ｇｌｙ―Ａｒｇの配列が利用される場合が多いが、反応の特異性などを向上させるために、それ以外の配列を使用しても構わない。

ここまでの説明では、ペプチドのＮ末端にリムルス反応で切断される配列（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇなど）を導入することを説明してきたが、ペプチドのＣ末端に、リムルス反応で切断される配列を付与しておき、リムルス反応で切断された後にＣ末端がフリーになったペプチドを特異的に検出する抗体で検出する方法も採用可能である。

以上説明してきた方法は、リムルス反応で切断される配列を導入しておき、当該配列が除去された後の残りのペプチドを検出する方法を説明してきたが、リムルス反応で切断された方の配列、例えばＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを特異的に検出してもよい。

本発明ではこのようにしてペプチドを測定し、その測定値からβ−Ｄ−グルカン又はエンドトキシンの量を求めることができる。具体的には、既知濃度のβ−Ｄ−グルカン又はエンドトキシンを含有する試料を用いてリムルス反応を行い、本発明の方法によってペプチドを測定し、検量線を作成する。一方、検体を用いて同様にリムルス反応を行い、更に本発明の方法を行いペプチドを測定し、その測定値と前述の検量線を用いて、検体中のβ−Ｄ−グルカン又はエンドトキシンの量を求めることができる。

本発明により、リムルス反応により生成した凝固酵素によって切断されたペプチドを測定することができ、また特異性の高いβ−Ｄ−グルカンおよびエンドトキシンの測定系が構築できる。

実施例３で、β−Ｄ−グルカンの検出を行った結果を示す図である。

［実施例１］ 基質ペプチドを結合させたＢＳＡの合成
配列番号１のペプチドのＮ末端をアセチル化したものは、業者に合成を依頼して得た。そのアセチル化したペプチドの溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）と、マレイミド活性化ＢＳＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）を、体積比１：１で混和し、室温で２時間撹拌して反応させた。その後、反応液をＰＢＳに対して２日間４℃で透析することで未反応のペプチドなどを除去し、基質ペプチドを結合させたＢＳＡを作製した。

［実施例２］ 基質ペプチドを結合させたＢＳＡを固定化したＥＬＩＳＡプレートの作製
実施例１で得た基質ペプチドを結合させたＢＳＡを１μｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温で放置し、基質ペプチドを結合させたＢＳＡをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。当該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳを添加し、１時間室温で放置することで当該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳで一回洗浄した。

［実施例３］
実施例２で得られたＥＬＩＳＡプレートの１番目のウエルにはリムルス試薬（リムルス Ｊ テストワコー、富士フィルム和光純薬株式会社製）を５０μｌ、コントロールスタンダード（β−Ｄ−グルカンを１０００Ｕ／ｍｌ含むもの）を１５μｌ添加した。２番目のウエルにはリムルス試薬（リムルス Ｊ テストワコー、富士フィルム和光純薬株式会社製）を５０μｌ、蒸留水を１５μｌ添加した。３番目のウエルには、ＰＢＳを７５μｌ添加した。３７℃で３０分間反応させたのち、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。

特許文献１に記載されているモノクローナル抗体（９−１３Ｐ−３Ｐ−２Ｄ抗体。ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの１−５位のアミノ酸残基に相当するペプチドを特異的に認識するが、ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチドを認識しないもの）を１μｇ／ｍｌになるように、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した溶液を１００μｌ添加し室温で１時間反応させた。洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、ＡＬＰ標識された抗マウス抗体を添加した。室温で１時間反応させた後、当該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄し、４−メチルウンベリフェリルホスフェイト（４−ＭＵＰ）溶液（１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ４−ＭＵＰ）を添加し、３０分間室温でインキュベートした。当該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した結果を図１に示した。１番目のウエルの結果が（１）に、２番目のウエルの結果が（２）に、３番目のウエルの結果が（３）に示されている。

ここに示す様に、（１）（コントロールスタンダードの結果）と（２）（蒸留水の結果）で明確な差が観察されたことから、本発明の方法でβ−Ｄ−グルカンの値を測定できることが示された。

Claims (5)

1. リムルス反応により生成した凝固酵素によって切断されたペプチドを検出することを特徴とする、ペプチドの測定方法。
2. 請求項１に記載の方法において、ペプチドをイムノアッセイにより検出する方法。
3. 請求項２に記載の方法において、切断されたペプチドを特異的に認識するが、切断される前のペプチドは認識しない抗体を用いる方法。
4. 請求項１〜３いずれかに記載の方法を用いてペプチドを測定し、その測定値からβ−Ｄ−グルカンの量を求めることを特徴とする、β−Ｄ−グルカンの測定方法。
5. 請求項１〜３いずれかに記載の方法を用いてペプチドを測定し、その測定値からエンドトキシンの量を求めることを特徴とする、エンドトキシンの測定方法。