CZ16422U1 - Diagnostický test analyzované substance ve vzorku - Google Patents

Description

Diagnostický test analyzované substance ve vzorku

Oblast techniky

Technické řešení se tyká rychlého vizuálního testu s vedlejším průtokem pro detekci analyzovaných substancí ve vzorku.

Dosavadní stav techniky

Testovací zařízení s vedlejším průtokem jsou ze stavu techniky známa a používají se při klinické diagnóze pro určení přítomnosti zkoumané analyzované substance ve vzorku, jako je tělesná tekutina. Takováto zařízení však typicky vyžadují relativně velký objem vzorku a velká množství substance se vzorkem sdružované. Mají také dlouhou čekací dobu do zjištění výsledků.

Podstata technického řešení

Pro detekci zkoumané analyzované substance ve vzorku se používá imunodiagnostický testovací proužek. V některých případech je analyzovanou substancí protilátka, jako je protilátka lidského viru imunodeficience (HIV) nebo protilátka viru hepatitidy C (HCV). V jiných případech je analyzovanou substancí antigen, jako je lidský chorionický gonadotropin (hCG).

Diagnostický testovací proužek s výhodou obsahuje oblast zdroje sdružované substance, která je uspořádána tak, aby se vázala na zkoumanou analyzovanou substanci, přičemž oblast použitého vzorku je umístěna za oblastí zdroje sdružované substance a je uspořádána tak, že je opatřena zmíněným tekutým vzorkem a testovací oblastí. Ta je umístěna za oblastí zdroje sdružované substance a obsahuje imobilizované vazné činidlo, které je uspořádáno pro specifické navázání se ke zkoumané analyzované substanci. Například, je-li zkoumaná analyzovaná substance protilátka, pozitivní testovací oblast s výhodou obsahuje imobilizovaný antigen. Je-li zkoumanou analyzovanou substancí antigen, pozitivní testovací oblast s výhodou obsahuje imobilizovanou protilátku. Sdružovaná substance obsahuje první vaznou složku, která je uspořádána pro navázání se na zkoumanou analyzovanou substanci a druhou složku, která je určena ke zviditelnění výsledku, tzv. složku vizualizační.

Vzorek použitý při testu může být jakákoliv tekutina. Přednostně vzorky obsahují, například, krev, sérum, plazmu, sliny a moč. Vzorek se použije pro pozitivní testovací oblast a následně se způsobí průtok sdružované substance z oblasti zdroje sdružované substance. Ta teče po membráně a přijde do styku s analyzovanou substancí, k níž se naváže za účelem vzniku vizuálního sig30 nálu v kladné testovací oblasti.

U přednostního provedení obsahuje testovací proužek testovací oblast s imobilizovaným antigenem HIV a používá se pro detekci protilátek HIV. V tomto provedení je test účelný pro diagnostické určení infekce HIV u pacienta. V jiném přednostním provedení obsahuje testovací proužek testovací oblast s imobilizovaným antigenem HCV a používá se pro detekci protilátek HCV ve vzorku. V tomto případě se test používá pro diagnózu infekce HCV u pacienta. V dalším provedeni obsahuje testovací proužek testovací oblast s mobilizovanými protilátkami hCG. V tomto provedení se používá test pro určení, je-li osoba těhotná.

Oblast zdroje sdružované substance s výhodou obsahuje tuto substanci v sušeném stavu. Například oblast zdroje sdružované substance může být polštářek, na němž je sdružovaná substance v sušeném stavu. Polštářek se sdruženou substancí je s výhodou v tekutinovém propojení s membránou. V některých provedeních se polštářek se sdružovanou substancí pohybuje do tekutinového propojení s membránou po přidání vzorku do oblasti aplikace vzorku. V jiném provedení je oblast zdroje sdružované substance částí membrány, na níž je sušená sdružovaná substance.

Sušená sdružovaná substance je s výhodou uchycena v určeném místě a tokem se dostane do oblasti zdroje sdružované substance pro kontakt s promývacím pufrem. V jednom provedení obsahuje promývací pufř kolem 0,1 % blokovacího činidla, přednostně blokovacího proteinu

-1 CZ 16422 Ul jako je kasein. Promývací pufř s výhodou také obsahuje kolem 0,1 % detergentu, přednostně neionizovaného detergentu jako je Triton XI00 .V jednom provedení obsahuje promývací pufř kolem 0,025 % HEPES, kolem 0,85 % chloridu sodného, kolem 0,1 % EDTA, kolem 1 % manítolu, kolem 0,1 % kaseinu a kolem 1 % detergentu Triton XI00 .

V dalším provedení je sdružovaná substance obsažena v pufru. Sdružovaná substance se uvede do toku k testovací oblasti přidáním pufru obsahujícího sdružovanou substanci, směrem k oblasti zdroje sdružované substance.

V jednom zvláštním provedení obsahuje sdružovaná substance protein A vázaný na koloidní zlato. V jiných provedeních obsahuje sdružovaná substance protilátku, s výhodou monoklonální, ío navázanou na koloidní zlato. To má s výhodou velikost částeček od zhruba 20 do 80 nanometrů.

V jiném provedení obsahuje testovací proužek přídavnou kontrolní oblast, umístěnou na membráně za testovací oblastí. Kontrolní oblast s výhodou obsahuje kontrolní vazné činidlo schopné vázat sdružovanou substanci. Například, je-li zkoumanou analyzovanou substancí protilátka a sdružovaná substance obsahuje vazné činidlo protilátky, jako je protein A, kontrolní vazné čini15 dlo může být králičí IgG. Je-li zkoumaná analyzovaná substance antigen a sdružovaná substance obsahuje monoklonální protilátku, která je pro tento antigen specifická, kontrolní vazné činidlo může být, například, protein A.

Testovací proužek může obsahovat jednu nebo více přídavných komponent. Pufrovací polštářek může být v tekutinovém propojení se zdrojovou oblastí sdružované substance, takže přidáním promývacího pufru na pufrovací polštářek se vyvolá tok sdružované substance z oblasti jejího zdroje přes membránu do styku s testovací oblastí. Za membránou může být uspořádán absorpční proužek a absorpční polštářek pro absorpci přebytečného pufru, který teče přes membránu. V její blízkosti může být také umístěna desikační tableta pro absorpci přebytečně tekutiny a vlhkosti.

Testovací proužek může být případně uložen v pouzdru, např. z plastu. Pouzdro s výhodou obsa25 huje okénko se vzorkem umístěným nad testovací a kontrolní oblastí a okénko s pufrem, které je umístěno před testovací oblastí.

Byl také vytvořen způsob detekce analyzované substance v tekutém vzorku, který obsahuje aplikaci vzorku na testovací oblast membrány a následně uvedení testovací oblasti do styku se sdružovanou oblastí, která je schopna vázat zkoumanou analyzovanou substanci a vytvořit vizuální signál indikující navázání.

Popis obrázků na výkresech

Na připojených výkresech jsou znázorněny příklady provedení technického řešení, přičemž obr. 1 znázorňuje testovací kartu podle jednoho aspektu předloženého technického řešení, obr. 2 představuje půdorys takové testovací karty, obr. 3 je jejím bokorysem, obr. 4 znázorňuje řez komponentami, které obsahuje testovací proužek podle jednoho provedení technického řešení, obr. 5 představuje testovací kartu s pozitivním výsledkem indikujícím, že zkoumaná analyzovaná substance byla ve vzorku detekována, obr. 6 znázorňuje testovací kartu s negativním výsledkem indikujícím, že zkoumaná analyzovaná substance nebyla ve vzorku detekována a obr. 7 představuje testovací proužek s pohárkem na vzorek podle dalšího aspektu technického řešení.

Příklady provedení technického řešení

Diagnostická zařízení a způsoby jsou určeny pro rychlé určení přítomnosti analyzované substance ve vzorku. I když jsou použity termíny z oblasti imunodiagnostického zařízení pro detekci protilátky nebo antigenu ve vzorku, odborník v této oblasti jistě sezná, že předložené technické řešení může být snadno modifikováno pro detekci jakékoliv zkoumané substance.

V minulosti zahrnovala imunodiagnostická zařízení typicky smíšení sdružované látky se vzorkem za účelem analýzy na přítomnost protilátky. Například byla v některých zařízeních sdružovaná

-2CZ 16422 Ul substance v sušeném stavu směšována s přidaným tekutým vzorkem a po promíchání se rozpouštěla. Protilátka, která měla být v případě její přítomnosti v substanci obsažena, se vázala na sdružovanou substanci a byla v testovací oblasti, umístěné dále a obsahující imobilizovaný antigen, zviditelněna. Tento systém nespecifické interakce sdružované substance s protilátkami nebo jinými složkami ve vzorku způsoboval nevýrazný signál sdružované substance. Bylo proto třeba její značné množství. Vzhledem k tomu si reakce vyžadovala značný čas za účelem dosažení požadovaných výsledků testu. Navíc byla citlivost testu tak malá, že bylo nutné i značné množství antigenu v testovací oblasti pro dosažení viditelného kladného signálu.

Předložené technické řešení řeší problémy dosavadního stavu techniky tím, že uvádí testovací oblast do přímého styku se vzorkem a umožňuje, aby zkoumaná analyzovaná substance se vázala specificky na imobilizované vazné činidlo. Například se může zkoumaná protilátka vázat na imobilizovaný antigen. Následně se do testovací oblasti přidá sdružovaná substance s pufrem. Rozpouštědlo s pufrem vytlačuje nenavázané složky z testovací oblasti a snižuje nespecifické interakce se sdružovanou substancí. Výsledkem je značné snížení potřebného množství sdružo15 váné substance a tak urychlení reakce. Navíc se zvýší citlivost reakce a je možná přítomnost menšího množství antigenu v testovací oblasti. Popsaná zařízení a způsoby se mohou například použít pro diagnózu nemoci pacienta, jako je přítomnost viru HIV nebo viru hepatitidy. Je možné také použití pro určení těhotenství. Odborníkům v oboru budou zřejmá i další možná použití dále popsaného technického řešení.

Není-li definováno jinak, všechny technické a vědecké termíny, použité dále, mají tentýž význam, jak je odborníku v daném oboru, kterému je toto technické řešení určeno, jasné. Při využití tohoto technického řešení je možno použít jakékoliv způsoby, zařízení a materiály, které jsou podobné nebo ekvivalentní těm, které jsou při praktikování technického řešení použity.

„Zkoumaná analyzovaná substance“ je jakákoliv molekula nebo složka, jejíž přítomnost má být ve vzorku identifikována. Analyzované substance mohou zahrnovat, a to bez omezení, virové antigeny, bakteriální antigeny, hormony jako např. inzulín, hormony stimulující folikulaci (FSH), thyrotropin, relaxin, somatotropin a gonadotropin, enzymy, imunoglobuliny, cytokiny, drogy, rakovinné antigeny, antigenické polysacharidy a nukleové kyseliny. Odborníkovi v daném oboru je jasné, že ve vzorcích je možno s použitím uvedených způsobů a zařízení identifikovat i jiné analyzované substance. Zejména zahrnují zkoumané analyzované substance protilátky HIV, HCV a lidský chorionický gonadotropin (hCG).

Termín „sdružovaná substance“ se týká sloučeniny umožňující se vázat na zkoumanou analyzovanou substanci a způsobit detekovatelný signál. Sdružovaná substance typicky obsahuje vaznou složku sdružovanou se značkovačem. Vazná složka umožňuje vazbu na zkoumanou analyzova35 nou substanci a případně na kontrolní složku. Značkovač produkuje detekovatelný signál, přednostně vizuální. U jednoho provedení se vizuální signál vyvolá v závislosti na vazbu sdružované substance se substancí analyzovanou. U jednoho výhodného provedení je zkoumanou analyzovanou substancí protilátka a sdružovaná substance obsahuje vaznou složku schopnou vázat protilátky. Například první vaznou složkou může být protein A, i když mohou být použity i jiné molekuly schopné vázat protilátky. U jiného provedení je zkoumanou analyzovanou substancí antigen a vazná složka sdružované substance obsahuje protilátku schopnou vázat antigen. Přednostně je protilátka monoklonální protilátkou.

Značkovač je jakákoliv molekula nebo složka, která může být navázána nebo sdružena s vaznou složkou a která může vyvolat detekovatelný signál. Přednostně je značkovačem koloidní zlato.

Alternativně však mohou být značkovačem, například, barvené latexové částečky, koloidní stříbro nebo jiné koloidní kovy, koloidní čerň nebo jiné složky známé ze stavu techniky. S výhodou má značkovač takový rozměr svých částic, který neruší schopnost vazné složky vázat zkoumanou analyzovanou substanci. Například, je-li vaznou složkou protein A, má značkovač s výhodou rozměr částeček od zhruba 5 do zhruba 120 nanometrů, výhodněji od zhruba 20 do zhruba 80 nanometrů.

-3CZ 16422 Ul

Sdružovaná substance je s výhodou připravena ve „sdružovacím pufru“, který může sdružovanou složku stabilizovat a udržet. U jednoho provedení bude detailně dále popsána příprava sdružovacího pufru, přičemž sdružovaná složka může být sušena na „sdružovacím polštářku“. Sdružovaná substance, která je sušena na substrátu, je považována za „rozptylně vázanou“. Sdružovaná sub5 stance je „rozptylně vázána“ tehdy, je-li schopna difúze nebo toku, například po kontaktu s pufrem. Například sdružovaná složka, která byla rozptylně vázána na oblast zdroje sdružované složky sušením, může být s pufrem rozpuštěna a takto může byt dosaženo jejího toku po membráně testovacího proužku.

„Kontrolní sdružovaná substance“ je taková sdružovaná substance, u níž je vazná složka speci10 fická pro kontrolní sloučeninu. Kontrolní sdružovaná substance se používá s výhodou tehdy, je-li pravděpodobné, že k analyzované substanci se na testovací lince naváže všechna sdružovaná substance a ta nebude schopna sloužit pro kontrolu. Kontrolní sloučenina je typicky taková, u níž se ví, že je ve vzorku přítomna pro analýzu a je schopna vázat kontrolní vazné činidlo na kontrolním proužku. Případně může být vazná složka kontrolní sloučeniny specifická pro tu slouče15 ninu, která jev kontrolní oblasti testovací membrány přítomna.

Sdružovaná substance je s výhodou přítomna ve „zdrojové oblasti sdružované substance“. Ta typicky obsahuje sdružovanou složku rozptylně vázanou, jako je sušená sdružovaná substance. Alternativně může tato oblast obsahovat sdružovanou složku přítomnou v pufru, jako je promývací pufr nebo sdružovací pufr. U jednoho provedení je zdrojovou oblastí sdružované substance sdružovací polštářek obsahující sušenou sdružovanou složku, která je v tekutinovém propojení s testovací membránou. U jiných provedení je zdrojovou oblastí sdružované substance část testovací membrány, na které byla sdružovaná substance sušena. U dalšího provedení je touto oblastí pufrovací polštářek, k němuž se přidá pufr se sdružovanou substancí, která je v tekutinovém propojení s testovací membránou. Zdrojová oblast sdružované substance je typicky umístěna před testovací oblastí na testovací membráně, takže v závislosti na přidání roztoku obsahujícího sdružovanou substanci nebo po rozpuštění rozptylně vázané sdružované složky, bude sdružovaná složka téci po testovací membráně za účelem dosažení styku s testovací oblastí.

Sdružovaná substance je s výhodou rozpuštěna v „promývacím pufru“, jak je dále detailněji popsáno. Zkrátka, promývací pufr je pufrovaný roztok, který s výhodou obsahuje „blokovací činid30 lo“. Blokovací činidla jsou ze stavu techniky známa a zahrnují jakékoliv molekuly nebo sloučeniny, které snižují nespecifické reakce, jako je nespecifické vázání protilátky. Upřednostněná blokovací činidla jsou proteiny, jako je kasein a kravské sérum albumin (BSA). Jiná blokovací činidla, která mohou být použita, jsou komerčně dostupná ajsou odborníku v oboru známá.

„Vzorkovací pufr“ je pufrovaný roztok, který s výhodou neobsahuje sdružovanou substanci. V některých provedeních obsahuje vzorkovací pufr blokovací činidlo, zatímco v jiných provedeních nikoliv. Vzorkovací pufr může být případně aplikován na membránu před přidáním vzorku, jak je dále detailněji popsáno.

„Testovací membrána“ je pevná podložka obsahující testovací oblast a případně i kontrolní oblast. Vzorek pro analýzu se typicky aplikuje přímo na testovací membránu, takže přijde do styku s testovací oblastí a kontrolní oblastí. Testovací membrána může být jakákoliv pevná podložka, na níž je možno umístit činidlo vázající analyzovanou substanci a kontrolní vazné činidlo. S výhodou je testovací membrána z nitrocelulózy.

Testovací membrána zajišťuje vedlejší průtokovou dráhu pro tekutiny. Testovací membrána a jiné složky testovacího proužku jsou, jak se říká, „v tekutinovém propojení“, jestliže tekutina, jako je tekutý vzorek nebo pufr, může téci z jedné složky na druhou. Jsou-li složky testovacího proužku ve vzájemném kontaktu, jsou v tekutinovém propojení. Jak však je odborníkovi v daném oboru jasné, přímý kontakt dvou zvláštních složek není pro tekutinové propojení nutný.

Pojmy „testovací oblast“, „testovací proužek“ a „testovací linka“ jsou používány vzájemně zaměnitelně a vztahují se na oblast testovací membrány, na níž je umístěno vazné činidlo analyzo50 váné substance.

-4CZ 16422 Ul „Vazné činidlo analyzované substance“, „specifický vazný partner“ nebo „vazná složka“ je jakákoliv molekula nebo sloučenina, která je uspořádána pro specifické navázání se na zkoumanou analyzovanou substanci. Například, a to bez omezení, může vazné činidlo analyzované substance obsahovat antigeny, protilátky, receptory, jiné polypeptidy, peptidy, hapteny, lektiny, nukleovou kyselinu včetně oligonukleotidů nebo malé molekuly. V jednom provedení je vazné činidlo analyzované substance antigen, který je specifický pro některou protilátku, která má být ve vzorku zjištěna. V jiném provedení je vazná sloučenina analyzované substance protilátka, která je pro zkoumaný antigen specifická.

„Kontrolní oblast“, „kontrolní proužek“ a „kontrolní linka“ jsou pojmy používané vzájemně zaměnitelně a vztahují se na oblast membrány, na níž je umístěno kontrolní vazné činidlo.

„Kontrolní vazné činidlo“ je jakákoliv molekula nebo sloučenina, která je schopna navázat se specificky na sdružovanou substanci nebo na kontrolní sdružovanou substanci.

Pojem „testovací proužek“ se vztahuje na kompletní zařízení, které je možno použít pro detekci přítomnosti analyzované substance ve vzorku. Testovací proužek s výhodou obsahuje alespoň testovací membránu s testovací oblastí a kontrolní oblastí. Jak je popsáno dále, testovací proužek může být uspořádán v pouzdru, např. plastovém. Alternativně se může testovací proužek používat i bez pouzdra. Je-li v pouzdru, testovací proužek a pouzdro je možno dohromady nazývat „testovací kartou“.

Pojmy „okénko testovací karty“ a „vzorkové okénko“ se vztahují na otvor v plastovém pouzdru testovací karty, jímž se může aplikovat vzorek. Okénko testovací karty je s výhodou umístěno nad testovací oblastí a kontrolní oblastí. Okénko testovací karty také s výhodou umožňuje shlédnutí výsledků testu.

Výraz „pufrovací okénko“ se vztahuje na otvor v plastovém pouzdru testovací karty, jímž se může aplikovat pufir. V jednom provedení je pufrovací okénko s výhodou umístěno tak, že umožňuje aplikaci pufru na pufrovací polštářek. V jiném provedení je pufrovací okénko umístěno tak, že umožňuje aplikaci pufru přímo na testovací membránu.

Pojem „okénko objemového indikátoru“ se vztahuje na otvor v plastovém pouzdru testovací karty, jímž je možno pozorovat viditelný objemový indikátor vzorku. Okénko objemového indikátoru je umístěno za vzorkovým okénkem. Objemový indikátor vzorku signalizuje, že přijatelný objem vzorku se dostal do styku s testovací oblastí. Objemovým indikátorem vzorku může být, například, mety lenová modř, nebo jiná barevná sloučenina, která se aplikuje na membránu těsně před okénkem objemového indikátoru. Objemový indikátor vzorku je pohybem vzorku nesen přes okénko objemového indikátoru, v němž vznikne vizuální signál. V jiných provedeních je objemový indikátor vzorku sloučenina, která při kontaktu se vzorkem změní barvu, jako je např.

indikátor pH. Typicky se objemový indikátor vzorku používá tehdy, když je nutný velký objem vzorku, jako například když se předpokládá, že zkoumaná analyzovaná substance je ve vzorku přítomna v nízké koncentraci. Například se s výhodou objemový indikátor vzorku požívá při analýze moči na přítomnost hCG.

Výraz „vzorek“ se vztahuje na vztahuje na jakýkoliv materiál, který má být analyzován na pří40 tomnost zkoumané analyzované substance. Přednostně má vzorek tekutou formu. Příkladné vzorky zahrnují, bez omezení, tělesné tekutiny jako je kompletní krev, plazma, sérum, sliny a moč. Jak bude dále detailněji popsáno, vzorek může být i pevná látka. V takovémto případě se však vzorek s výhodou před testováním rozpustí nebo extrahuje.

„Oblast aplikace vzorku“ je místo na membráně, na které se aplikuje vzorek. Oblast aplikace vzorkuje s výhodou umístěna za zdrojovou oblastí sdružované substance a před testovací oblastí. Výhodněji pak oblast aplikace vzorku obsahuje testovací oblast. Vzorek je možno aplikovat na oblast aplikace vzorku přímo, např. pipetou, nebo nepřímo, jako např. knotem, kteiý je ve styku s membránou.

-5 CZ 16422 Ul

Pojem „protilátka“ se používá ve svém nejširším smyslu a zahrnuje, například a bez omezení, úplné protilátky, právě tak jako protilátky s jednoduchým řetězcem, fragmenty protilátek a chimérické protilátky, pokud zachovávají požadovanou vaznou specifícitu.

Pokud se týká testovací karty, obsahují zde popsaná diagnostická zařízení testovací kartu 1, jak je znázorněno na obr. 1 až 3. Obr. 1 představuje testovací kartu J obsahující plastové pouzdro 10 s horní částí 15 a spodní částí 18, které do sebe zapadají. V horní části 15 jsou dvě okénka: vzorkově okénko 20 a pufřovací okénko 30. Vzorkové okénko 20 umožňuje aplikaci vzorku na oblast aplikace vzorku membrány, která jev plastovém pouzdru 10 uspořádána. Oblast aplikace vzorku s výhodou obsahuje testovací oblast 140. Za ní je na membráně s výhodou umístěna kontrolní ío oblast 150. Pufřovací okénko 30 umožňuje aplikaci pufru na zdrojovou oblast 50 sdružované substance. Membrána je součástí testovacího proužku, který je detailněji popsán dále.

Další možné okénko pro objemový indikátor (neznázoměno) je umístěno v některých provedeních za testovací oblastí. Okénko objemového indikátoru, je-li přítomno, umožňuje uživateli pozorovat indikátor, zda došlo ke změně barvy na membráně za testovací oblastí. Indikátor sig15 nalizuje, že se dostatečný objem vzorku dostal do styku s testovací oblastí a že uživatel může pokračovat kontaktem testovací oblasti se sdružovanou substancí pro detekci vázané analyzované substance, jak je popsáno dále, např. aplikací pufru na zdrojovou oblast sdružované substance.

Obr. 2 znázorňuje půdorys testovací karty 1 mající vzorkové okénko 20 a pufřovací okénko 30 v plastovém pouzdru 10. Testovací oblast 140 membrány je přístupná vzorkovým okénkem 20 a zdrojová oblast 50 sdružované substance je přístupná pufřovacím okénkem 30. Za testovací oblastí 140 je umístěna kontrolní oblast 150.1 když je zobrazeno vzorkové okénko 20 pravoúhlého tvaru a pufřovací okénko 30 kruhové, okénka mohou mít jakýkoliv tvar a rozměr. Jsou však s výhodou tvarována a umístěna tak, aby nasměrovala vzorek do oblasti aplikace vzorku na membráně a pufr do zdrojové oblasti 50 sdružované substance. Navíc je vzorkové okénko 20 uspořá25 dáno pro shlédnutí testovací oblasti 140, zda se došlo k pozitivnímu výsledku testu, a kontrolní oblasti 150.

Obr. 3 představuje bokorys příkladné testovací karty L Je znázorněna horní část 15 a spodní část 18 plastového pouzdra JO. Zvětšený konec 60 horní části 15 plastového pouzdra 10, který je umístěn vzdáleně od neznázoměného pufřovacího okénka, umožňuje umístění absorpčního mate30 riálu, jako je absorpční polštářek nebo desikační tableta na testovací kartě J. Rozměr zvětšeného konce 60 může být různý v závislosti na množství použitého absorpčního materiálu, což opět závisí na objemu vzorku a pufřu v testu použitého.

Pokud se týká testovacího proužku, ten obsahuje testovací membránu s alespoň jednou testovací oblastí. Vazné činidlo analyzované substance, které je pro zkoumanou analyzovanou substanci specifické, se v testovací oblasti naváže nebo jinak imobilizuje. Alespoň část testovací oblasti se po ukončení testu zviditelní, přičemž ukáže, zda je zkoumaná analyzovaná substance ve vzorku přítomna. Ve zvláštním provedení obsahuje testovací oblast imobilizovaný antigen a test umožňuje identifikaci zvláštních protilátek ve vzorku, jako je biologická tekutina. V jiném provedení obsahuje testovací oblast vázanou protilátku a test umožňuje identifikaci zvláštního antigenu ve vzorku.

Vzorek se aplikuje na oblast aplikace vzorku, která je umístěna za zdrojovou oblastí sdružované | substance, například za polštářkem se sdružovanou substancí. V upřednostněném provedení obsahuje oblast aplikace vzorku testovací oblast. V jiných provedeních je oblast aplikace vzorku umístěna před testovací oblastí a vzorek teče z oblasti aplikace vzorku do testovací oblasti.

Na obr. 4 je znázorněno výhodně provedení testovacího proužku WO. Ten se používá pro testování vzorku na přítomnost zkoumané analyzované substance, jako je protilátka. S výhodou obsahuje pufřovací polštářek 110, jsoucí ve styku s polštářkem 120 sdružované substance. Ten je opět ve styku s testovací membránou 130 obsahující testovací oblast 140 a kontrolní oblast 150.

Testovací membrána 130 je ve styku s absorpčním polštářkem 160, který může být případně ve I styku s absorpčním papírem 170. Absorpční polštářek 160 a/nebo případný absorpční papír 170

-6CZ 16422 Ul může, resp. mohou být v dalším styku s případným desikantem, jako je např. desikační (vysušovací) tableta 180.

V některých provedeních je k testovacímu proužku 100 uchycen odnímatelný filtrovací držák 190. Ten obsahuje filtrovací papír 200. Je-li k testovacímu proužku 100 upevněn filtrovací držák

190, je filtrovací papír 200 umístěn přímo nad oblastí aplikace vzorku, která s výhodou obsahuje testovací oblast 140 a kontrolní oblast 150.

Do testovací oblasti se musí dostat postačující množství vzorku, aby se zajistila možnost zjištění pozitivního výsledku zrakem po ukončení testu signalizujícího přítomnost analyzované substance ve vzorku. Pro analyzované substance, u nichž se předpokládá jejich nízká koncentrace ve ío vzorku, například jako jsou antigeny takové jako hCG v moči, se požaduje větší objem vzorku.

Testovací proužek 100 může být pro příjem větších objemů vzorku uspořádán. Jedno takové provedení je znázorněno na obr. 7, kde je k testovacímu proužku 100 upevněn vzorkový pohárek 500. Ten obsahuje nádobku pro určitý objem tekutého vzorku. Ve dnu má typicky otvor, který umožňuje výtok vzorku ze vzorkového pohárku 500 za účelem styku s testovací membránou 130.

Vzorkový pohárek 500 je umístěn pro výtok vzorku do oblasti aplikace vzorku testovací membrány 130 a pro kontakt s testovací oblastí 140 a kontrolní oblastí 150. S výhodou oblast aplikace vzorku obsahuje testovací oblast 140 a kontrolní oblast 150 a vzorkový pohárek 500 je umístěn přímo nad testovací oblastí 140 a kontrolní oblastí 150. Vzorkový pohárek 500 může případně obsahovat filtr, kterým vzorek před kontaktem s testovací membránou 130 prochází.

Vzorek může být uložen ve vzorkovém pohárku, který je upevněn k testovací kartě. V jiném provedení se vzorek umístí do testovacího pohárku a ten se následně upevní k testovací kartě a umožní se tok vzorku do oblasti aplikace vzorku.

Je žádoucí zajistit, aby určitý objem vzorku obsahující detekovatelné množství analyzované substance, je-li přítomna, kontaktoval testovací oblast 140 před tím, než se vyvolá tok sdružované substance do testovací oblasti 140. Objemový indikátor vzorku, jako je indikační barvivo, je umístěn za testovací oblastí 140 a kontrolní oblastí 150 a používá se pro stanovení, zda dostaá tečné množství vzorku přišlo do styku s testovací oblastí 140 a kontrolní oblastí 150. Například se může aplikovat indikační barvivo, jako je metylénová modř, na absorpční polštářek 160 nebo absorpční papír 170 za testovací membránou 130. Tok tekutého vzorku po absorpčním polštářku

160 nebo absorpčním papíru 170 způsobí tok barviva a vytvoří vizuální signál, například viditelnou modrou barvu. Signál je možno pozorovat okénkem objemového indikátoru v testovací kartě (neznázoměno).

U některých provedení, zejména u těch, kde má být aplikován velký objem vzorku (větší než asi 50 μΐ), není polštářek 120 sdružované substance v tekutinovém propojení s testovací membránou

1 30. Jedno takové provedení je znázorněno na obr. 7. Tím, že se oddělí od sebe polštářek 120 sdružované substance a testovací membrány 130, zabrání se smísení sdružované substance a vzorku předtím, než se vzorek dostane do styku s testovací oblastí 140. Potě co se vzorek dostane do styku s testovací oblastí 140 a kontrolní oblastí 150, uvede se polštářek 120 sdružované substance do pohybu, aby se dostal do tekutinového propojení s testovací membránou 130. Pak se aplikuje pufr na pufrovací polštářek 110 pro nastartování testu. Pufr se může na pufrovací polštářek 110 aplikovat přímo pufrovacím okénkem nebo rozlomením ampule 300 obsahující pufr, čímž se způsobí výtok pufru na pufrovací polštářek 110. V jednom provedení se pufr aplikuje na pufrovací polštářek 110 dříve než se polštářek 120 sdružované substance uvede do pohybu pro vytvoření tekutinového propojení s membránou 130. U alternativních provedení se pufr aplikuje na polštářek 120 sdružované substance přímo.

Způsob, kdy se polštářek 120 sdružované substance uvede do pohybu pro vytvoření tekutinového propojení s testovací membránou 130, není nijak limitován. V jednom provedení uvede uživatel do kluzného pohybu pohyblivou část pouzdra, ke kterému je připojen polštářek 120 sdružované substance a případně pufrovací polštářek 110, takže se polštářek 120 sdružované substance do50 stane do styku s testovací membránou 130. Mechanizmus pro docílení pohybu polštářku 120 sdružované substance za účelem dosažení tekutinového propojení s testovací membránou 130 s

-7CZ 16422 Ul výhodou také způsobí rozlomení pufrovací ampule 300. Mechanizmus také může způsobit odstranění vzorkového pohárku 500 z testovacího proužku 100.

Desikační tableta 180 je s výhodou v tekutinovém propojení s absorpčním papírem 170. Její velikost je zvolena tak, aby byla schopna absorbovat celý objem vzorku aplikovaného na testovací membránu 130. Desikační tableta 180 a jakýkoliv jiný absorpční materiál je umístěn za oblastí aplikace vzorku a usnadňuje tok vzorku přes testovací oblast.

U jiných provedení je vzorkový pohárek nahrazen knotem, který je ve styku s tekutým vzorkem. Ten teče kolem knotu do oblasti aplikace vzorku testovací membrány a kontaktuje testovací oblast a kontrolní oblast. V jednom zvláštním provedení je knot umístěn v proudu moče za účelem ío její analýzy na přítomnost analyzované substance, jako je hCG. U těchto provedení není polštářek sdružované substance s výhodou v tekutinovém propojení s testovací membránou během doby, kdy se vzorek aplikuje na knot. Poté co vzorek kontaktoval v dostatečném množství testovací oblast, uvede se do pohybu polštářek sdružované substance, aby se dostal do styku s testovací membránou. Mechanizmus pro pohyb polštářku sdružované substance může také sloužit k odstranění knotu. Následně se pufr zavede na pufrovací polštářek nebo také přímo na polštářek sdružované substance pro nastartování testu. Pufr je možno na pufrovací polštářek přivést přímo pufrovacím okénkem, jak je popsáno shora. Alternativně může být pufr obsažen v ampuli testovací karty a způsobí se jeho tok na pufrovací polštářek a/nebo polštářek sdružované substance tím, že se ampule rozlomí nebo jinak otevfe.

Testovací proužek je s výhodou uložen v pouzdru, jak je znázorněno na obr. 2 a shora popsáno.

Obr. 5 znázorňuje pozitivní výsledek testu, který indikuje přítomnost zkoumané analyzované substance ve vzorku. Testovací oblast 140 testovací membrány 130 ie viditelná jako čára napříč vzorkovým okénkem 20. Navíc je viditelná i kontrolní oblast 150 jako další čára napříč vzorkovým okénkem, což indikuje, že sdružovaná substance protekla ze zdrojové oblasti 50 sdružované substance přes testovací oblast 140. Negativní výsledek je naproti tomu znázorněn na obr. 6. V tomto případě je viditelná pouze kontrolní oblast 150 jako čára napříč vzorkovým okénkem 20. Opět kontrola indikuje průtok sdružované substance ze zdrojové oblasti 50 sdružované substance přes testovací oblast 140. Nepřítomnost ěáiy v testovací oblasti 140 je však výsledkem toho, že zkoumaná analyzovaná substance se na sdružovanou substanci nenavázala.

Pokud se týká použití testovacího proužku, aplikuje se vzorek, který má být testován na přítomnost zvláštní zkoumané analyzované substance, na oblast aplikace vzorku testovací membrány tak, že kontaktuje testovací oblast. V upřednostněném provedení se vzorek aplikuje na membránu a umožní se jeho kontakt s testovací oblastí dříve než ji kontaktuje sdružovaná substance. Takto má zkoumaná analyzovaná substance, je-li ve vzorku přítomna, možnost navázat se na vazné činidlo analyzované substance v testovací oblasti dříve než dojde k vazbě sdružované substance.

Je-li testovací proužek v pouzdru, vzorek se s výhodou aplikuje vzorkovým okénkem. V tomto případě obsahuje membrána oblast aplikace vzorku, která je vzorkovým okénkem přístupná. S výhodou obsahuje oblast aplikace vzorku alespoň jednu pozitivní testovací oblast. Výhodněji pak obsahuje oblast aplikace vzorku testovací oblast i kontrolní oblast. Alternativně se může vzorek aplikovat knotem nebo pohárkem, takže teče do oblasti aplikace vzorku membrány a kontaktuje testovací i kontrolní oblast.

Není-li testovací proužek v pouzdru, vzorek se může aplikovat přímo na oblast aplikace vzorku membrány, která s výhodou obsahuje testovací oblast a kontrolní oblast. Alternativně se může vzorek aplikovat na membránu v oblasti aplikace vzorku před testovací oblastí a umožní se jeho průtok po membráně za účelem styku s testovací oblastí. S výhodou však se umožní vzorku kontaktovat testovací oblast dříve, než se na membránu přivede sdružovaná substance.

U jednoho provedení se vzorek nashromáždí nebo umístí ve vzorkovém pohárku. Ten je upevněn k pouzdru a umožňuje průtok vzorku do oblasti aplikace vzorku membrány a kontakt s testovací oblastí a kontrolní oblastí. Vzorkový pohárek se s výhodou použije tehdy, když je objem vzorku

-8CZ 16422 Ul větší než asi 10 μΐ. Vzorkový pohárek může případně obsahovat filtr, kterým vzorek proteče před kontaktem s membránou.

V dalším provedení se vzorek aplikuje na knot, který je ve styku s membránou. Knot umožní tok vzorku do oblasti aplikace vzorku membrány a kontakt s testovací a kontrolní oblastí. Knot s výhodou sestává ze skelného papíru, polyesteru, celulózy nebo jiného materiálu, který umožní pohyb vzorku na membránu obsahující testovací oblast. Je-li testovací karta v pouzdru, knot může z něho vyčnívat a umožnit přístup pro aplikaci vzorku. Například má-li být zvláštní analyzovaná substance, jako je hCG, zjišťována v moči, knot může být umístěn v proudu moče testovaného subjektu. V jiném provedení se může knot uvést do kontaktu s analyzovaným vzorkem, ío například s tělesnými tekutinami jako jsou sliny.

Testovaný vzorek se s výhodou aplikuje na oblast aplikace vzorku membrány v tekuté formě. Příkladné vzorky pro analýzu zahrnují, bez omezení, sérum, plazma, kompletní krev, sliny a moč. Tuhé nebo polotuhé vzorky se mohou rozpustit a aplikovat na membránu nebo před aplikací extrahovat.

U jiných provedení se vzorkovací pufr, který s výhodou neobsahuje sdružovanou substanci, aplikuje na membránu před aplikací vzorku. U některých provedení obsahuje vzorkovací pufr blokovací činidlo. S výhodou se vzorkovací pufr aplikuje na membránu v oblasti aplikace vzorku. Na membránu se s výhodou aplikuje asi 1 až asi 25 μΐ vzorkovacího pufru, výhodněji asi 1 až asi 10 μΐ a ještě výhodněji asi 1 až 5 μΐ. V jednom zvláštním provedení se na oblast aplikace vzorku membrány aplikuje 5 μΐ vzorkovacího pufru, po kterých následuje 5 μΐ séra, plazmy, kompletní krve nebo jiného tekutého vzorku. Přidání vzorkovacího pufru před aplikací promývacího pufru se s výhodou provádí při testování na HCV, jak je popsáno dále, a při používání viskózních vzorků. Použití vzorkovacího pufru zvyšuje citlivost testu a způsobí, že viskózní vzorky snadněji tečou.

Vzorkovací pufr obsahuje s výhodou pufrovací činidlo a ochranný konzervační prostředek. Případně může také obsahovat jeden nebo více detergentů a/nebo cukrů. Může se použít jakékoliv

S pufrovací činidlo, přednostně v takovém množství, že zachová požadovanou pH vzorkovacího pufru. Ta je s výhodou asi 7,2 až 7,6. Například a bez omezení může být pufr vybrán ze skupiny sestávající z HEPES, Tris a fosfátových pufrů. V upřednostněném provedení obsahuje vzorkova30 cí pufr asi 0,01 % až asi 0,5 % HEPES, výhodněji asi 0,02 až asi 0,05 % HEPES. V jiném provedení obsahuje vzorkovací pufr asi 0,01 % až asi 0,5 % fosfátu, výhodněji asi 0,02 až asi 0,05 % fosfátu. Odborník v oboru bude jistě schopen nastavit množství pufrovacího činidla tak, aby byla zachována požadovaná pH.

Vzorkovací pufr také s výhodou obsahuje ochranný konzervační prostředek, jako je azid sodný nebo Proclin. V upřednostněném provedení obsahuje vzorkovací pufr asi 0,1 % až asi 1,0% azidu sodného, výhodněji asi 0,1 % až asi 0,2 % a ještě výhodněji asi 0,2 %.

V závislosti na povaze testovaného vzorku se tento případně aplikuje na membránu skrze filtr. Příkladné materiály vzorku, které se s výhodou filtrují, zahrnují kompletní krev, vzorky fekálií, moč, extrakty potravin a extrakty nečistot. V jednom provedení se aplikuje kompletní krev mem40 hranovým filtrem. Filtr odstraní kontaminující látky a umožní, aby analyzované substance, jako jsou protilátky, prošly filtrem a tím aby se zvýšila citlivost testu. Filtr je s výhodou zapouzdřen v držáku, který může být podle potřeby upevněn k testovací kartě nebo k testovacímu proužku. Jeli upevněn k testovací kartě, je s výhodou umístěn přímo nad vzorkovým okénkem. Filtrovací médium se zvolí podle typu filtrovaného vzorku. Taková volba se provede v rámci znalostí od45 borníka v daném oboru. Například pro vzorky kompletní krve může být, bez omezení, materiál filtru Pall BTS-SP300®.

Jak je uvedeno nahoře, je filtr s výhodou upevněn k testovacímu proužku pomocí odnímatelného držáku filtru, i když pro zvláštní aplikace může být filtr upevněn trvale. Držák filtru je typicky zařízení, které se na pouzdro testovací karty zaklesne. Konstrukce a typ tohoto zařízení se může měnit, ale typicky je vytvořeno z polystyrénu, polyetylénu, polypropylénu nebo jiných plastů.

-9CZ 16422 Ul

Testovací oblast je částí membrány, která je pokryta vazným činidlem, s výhodou proteinem, který je schopen specifické vazby na zkoumanou analyzovanou substanci. Například může být pozitivní testovací oblast pokryta antigenem specifickým pro zkoumanou protilátku. Ve zvláštních provedeních obsahuje testovací oblast vázaný antigen HIV nebo antigen hepatitidy, jak je detailněji popsáno v dále uváděných příkladech. Obsahuje-li testovací oblast antigen, s výhodou se použije asi 0,025 až asi 0,4 pg antigenu.

V jiných provedeních se v testovací oblasti imobilizuje protilátka, která je pro zkoumaný antigen specifická. Protilátka může být polyklonální nebo monoklonální. Obsahuje-li testovací oblast protilátku, s výhodou se aplikuje asi 0,1 až asi 20 pg protilátky, výhodněji asi 0,2 až asi 2 pg a ío ještě výhodněji asi 0,5 až asi 1 pg. V jednom zvláštním provedení obsahuje testovací oblast protilátku k hCG, s výhodou monoklonální protilátku k hCG.

Vazné činidlo je možno aplikovat na membránu v jakémkoliv požadovaném vzoru; v důsledku toho může být viditelný výsledek pozitivního testu jakéhokoliv tvaru. V jednom výhodném provedení je testovací oblast lineární, vytvářející čáru rozprostírající se z jedné strany membrány na druhou, takže přes vzorkové okénko se objeví při pozitivním výsledku vertikální čára, která indikuje přítomnost analyzované substance ve vzorku. U jiných provedení je testovací oblast vytvarována jako symbol, např. jako

Jediným testovacím proužkem je možno testovat více než jeden typ analyzované substance. V tomto případě se na membráně připraví další pozitivní testovací oblasti. Například druhá pozitiv20 ní testovací oblast může obsahovat antigen ke druhému typu protilátky nebo protilátku ke druhému typu antigenu. Není nutné, aby vazné činidlo v přídavné pozitivní testovací oblasti bylo téhož typu jako vazné činidlo v první testovací oblasti. Vazné činidlo v první testovací oblasti může být protilátka, zatímco vazné činidlo ve druhé testovací oblasti může být antigen. Tímto způsobem se může vzorek analyzovat na přítomnost více než jednoho typu analyzované substan25 ce.

Každá přídavná pozitivní testovací oblast může mít ve srovnání s první testovací oblastí rozdílný tvar za účelem umožnit uživateli snadné rozlišení povahy kladného výsledku. V závislosti na typu testovaných přídavných analyzovaných substancí mohou být nutné přídavné sdružované substance pro vazbu s různými analyzovanými substancemi. Například jsou-li zkoumané analy30 zované substance dvě různé protilátky, je možno použít jedinou sdružovanou substanci obsahující protein A. Je-li však jedna analyzovaná substance protilátka a druhá antigen, budou potřeba dvě různé sdružované substance, jedna, která se bude specificky vázat na protilátku a druhá, která se bude specificky vázat na antigen.

Kontrolní oblast s výhodou obsahuje kontrolní vazné činidlo, které se bude vázat na sdružovanou substanci. Umístěním kontrolní oblasti za pozitivní testovací oblastí se dosáhne toho, že reakce v kontrolní oblasti bude indikovat, že sdružovaná substance minula testovací oblast, kde byla schopna provést reakci na přítomnost zkoumané analyzované substance. Je-li sdružovaná substance určena pro rozeznání protilátky, kontrolní oblast s výhodou obsahuje imunoglobulin, jako je králičí IgG. Jestliže sdružovaná substance obsahuje protilátku, pak kontrolní oblast s výhodou obsahuje činidlo vázající protilátku, jako je protein A. Kontrolní oblast může mít libovolný požadovaný tvar, jako je čára nebo symbol, například

U jiných provedení obsahuje kontrolní oblast kontrolní vazné činidlo, které se bude vázat na kontrolní sdružovanou substanci. Například může kontrolní oblast obsahovat β-gal a kontrolní sdružovaná substance může obsahovat β-galaktosidásu navázanou na zlato.

Vazné činidlo a kontrolní vazné činidlo se může aplikovat na testovací membránu jakýmkoliv způsobem známým ze stavu techniky. Typicky se aplikuje kontaktem testovací membrány s vazným činidlem, například postřikem nebo s použitím čerpacího rozdělovacího systému kontaktujícího testovací membránu. Takové systémy jsou obchodně dostupné, například od firmy Kinematic Automation.

-10CZ 16422 Ul

Když vzorek kontaktuje testovací oblast, pak v případě, že zkoumaná analyzovaná substance je ve vzorku přítomna, bude se vázat na vazné činidlo v testovací oblasti. Přebytečná nevázaná analyzovaná substance se smyje z testovací oblasti piyč pohybem pufru po membráně, jak je dále popsáno.

Po aplikaci vzorku na membránu se použije promývací pufr, který se aplikuje na membránu. Z počátku se s výhodou použije k tomuto účelu asi 1 až 20, výhodněji asi 1 až 5 kapek promývacího pufru. Je-li nutné, je možno použít pro vyčistění reakce další promývací pufr.

Promývací pufr s výhodou dopraví sdružovanou substanci do testovací oblasti. Promývací pufr se může aplikovat přímo na testovací membránu. V upřednostněném provedení se vsak promýío vací pufr aplikuje na pufrovací polštářek uspořádaný před testovací membránou, odkud teče na testovací membránu. Pufrovací polštářek může být proveden z jakéhokoliv materiálu, který může pojmout pufr a umožnit jeho tok na membránu v požadovaném množství. Například může pufrovací polštářek sestávat z jednoho nebo více materiálů vybraných ze skupiny tvořené skelným papírem, celulózou a polyesterem. V jednom upřednostněném provedení je pufrovací polštářek skelný papír Whatman GF/DVA. Odborník v daném oboru bude schopen vybrat pro pufrovací polštářek vhodný materiál vzhledem k takovým faktorům, jako je konstrukce pouzdra testovacího proužku pro vedlejší průtok, velikost požadovaného průtoku a množství pufru, které má být pufrovacím polštářkem zadrženo.

Promývací pufr se může aplikovat přímo na pufrovací polštářek, například pipetou nebo kapát20 kem. V jednom provedení je však vhodné množství promývacího pufru přítomno v nádobce vedle pufrovacího polštářku. Například promývací pufr může být obsažen ve skleněné nebo plastové ampulce. Po přidání testovaného vzorku se nádobka s promývacím pufrem rozlomí nebo jinak otevře, v důsledku čehož se promývací pufr dostane do styku s pufrovacím polštářkem.

Složení promývacího pufru se může lišit za účelem zvýšení citlivosti testu. S výhodou obsahuje promývací pufr pufrovací činidlo, konzervant, detergent, cukr a jiné materiály, které redukují pozadí a/nebo nespecifickou vazbu.

Je možno použít jakékoliv pufrovací činidlo, které zachová požadovanou pH pufru, s výhodou od asi 7,2 do asi 7,6. Například a bez omezení může být pufr vybrán ze skupiny sestávající z HEPES, Tris a fosfátového pufru. V jednom výhodném provedení promývací pufr obsahuje asi

0,01 % až asi 0,5 % HEPES, výhodněji asi 0,02 až asi 0,2 % HEPES aještě výhodněji asi 0,02 až asi 0,05 % HEPES. Ve zvlášť upřednostněném provedení obsahuje promývací pufr 0,025 % HEPES.

Promývací pufr může také obsahovat konzervant, jako je azid sodný nebo Proclin. V upřednostněném provedení obsahuje promývací pufr asi 0,1 až asi 0,5 % azidu sodného, výhodněji asi 0,1 až asi 0,2 %.

Je též přítomen chlorid sodný nebo srovnatelná sůl, s výhodou v koncentraci asi 1 %, výhodněji asi 0,85 %. Může být přítomen EDTA, s výhodou v koncentraci asi 0,1 %. Může též být přítomen cukr, např. manitol. Výhodné koncentrace manitolu se pohybují mezi asi 1 % a asi 5 %. V upřednostněném provedení se použije koncentrace manitolu asi 1 %.

V promývacím pufru je též s výhodou přítomno blokovací činidlo. To může být jakékoliv blokovací činidlo známé ze stavu techniky. S výhodou je blokovacím činidlem protein, jako je kasein nebo kravské sérum albumin (BSA). Blokovací činidlo je s výhodou v promývacím pufru obsaženo v koncentraci od asi 0,01 do asi 0,5 %, výhodněji od asi 0,02 do asi 0,2 %. Ve zvlášť výhodném provedení je v promývacím pufru přítomen kasein v koncentraci asi0,l %.

Promývací pufr také typicky obsahuje detergent, s výhodou neionický detergent jako je Triton X100® nebo Tween. S výhodou je přítomen detergent v koncentraci asi 0,05 až asi 1 %, výhodněji asi 0,1 až asi 0,5 %. Ve zvlášť výhodném provedení obsahuje promývací pufr Triton X100 v koncentraci asi 0,1 %.

-11 CZ 16422 Ul

Nastaví se pH promývacího pufru v rozmezí asi 7 a 8, výhodněji mezi asi 7,2 a 7,6. Ve zvlášť výhodném provedení je pH promývacího pufru asi 7,2.

Testovací proužek také obsahuje zdrojovou oblast sdružované substance. Ve výhodném provedení obsahuje testovací proužek polštářek se sdružovanou substancí, která je na něm v sušeném stavu, jak je popsáno dále. Promývací pufr teče z pufrovacího polštářku na polštářek se sdružovanou substancí, s níž se dostane do kontaktu. Polštářek sdružované substance je pak ve styku s testovací membránou. U některých provedení se však polštářek sdružované substance dostane do styku s membránou až po přidání vzorku. Zejména použije-li se velký objem vzorku, s výhodou se uvede polštářek sdružované substance do styku s membránou poté co vzorek kontaktoval tesío tovací oblast.

Na pufrovací polštářek se aplikuje dostatečné množství promývacího pufru, aby rozpustilo sdružovanou substanci rozptylně vázanou na polštářek sdružované substance a způsobilo tok sdružované substance po testovací membráně k testovací čáře a kontrolní čáře. Množství použitého pufru může být stanoveno odborníkem v daném oboru podle takových faktorů, jako je množství sdružované substance vázané na polštářek sdružované substance, rozměr membrány a množství vzorku pro analýzu. S výhodou se na pufrovací polštářek, má-li tento rozměry přibližně 2 cm χ 5 mm, použije 1 až 10 kapek pufrovacího roztoku, výhodněji 2 až 5 kapek a ještě výhodněji 3 až 4 kapky.

V některých alternativních provedeních není polštářek sdružované substance použit. V jednom alternativním provedení je sdružovaná substance obsažena v promývacím pufru v koncentraci od asi 0,2 OD až asi 1,0 OD/ml. Promývací pufr s obsahem sdružované substance se může aplikovat na pufrovací polštářek. Sdružovaná substance takto teče spolu s promývacím pufrem na membránu, kde se dostane do styku s testovací oblastí a kontrolní oblastí. V jiném provedení se promývací pufr s obsahem sdružované substance aplikuje přímo na testovací membránu. Promývací pufr s obsahem sdružované substance může být též přítomen v ampulce a vytéci na membránu po rozlomení nebo jiném otevření ampulky. Promývací pufr s obsahem sdružované substance se s výhodou aplikuje na membránu v bodu před testovací oblastí. V některých provedeních se však promývací pufr s obsahem sdružované substance aplikuje přímo na testovací oblast po aplikaci vzorku.

U jiných provedení je sdružovaná substance vázána rozptylně, např. sušením přímo na membráně, která obsahuje testovací oblast a kontrolní oblast. Pak je možno aplikovat promývací pufr na pufrovací polštářek, který je ve styku s membránou, nebo přímo na testovací membránu. Promývací pufr rozpustí sušenou sdružovanou substanci a dopraví ji na testovací membránu do testovací oblasti a kontrolní oblasti.

Promývací pufr s obsahem sdružované substance se s výhodou dostane do kontaktu s testovací oblastí po aplikaci vzorku, a to poté, co jakákoliv analyzovaná substance, přítomná ve vzorku, měla možnost navázat imobilizované vazné činidlo. Takto se s výhodou aplikuje promývací pufr na testovací proužek po aplikaci vzorku na testovací oblast.

Sdružovaná substance, která byla detailně popsána shora, se připraví pro použití v testu rozpuš40 těním v pufru sdružované substance. S výhodou se připraví pracovní sdružovaná substance rozpuštěním sdružované substance v pufru sdružované substance v koncentraci přibližně 3 OD/ml. Složení pufru sdružované substance se může lišit podle povahy sdružované substance. Příkladně obsahuje pufr sdružované substance takový pufr jako je HEPES, Tris, fosfátový nebo jiný pufr známý ze stavu techniky. Upřednostněný pufr sdružované substance obsahuje asi 0,02 až 0,2 % pufru HEPES, výhodněji asi 0,025 % HEPES. Pufr sdružované substance může též obsahovat sůl, s výhodou chlorid sodný. Ten se přidá v koncentraci asi 0,1 %, výhodněji asi 0,85 %. V pufru sdružované substance může být též obsažen konservant, jako je azid sodný nebo Proclin, v koncentraci asi 0,1 až asi 0,2 %.

Pufr sdružované substance obsahuje s výhodou také EDTA (asi 0,1 %), kasein v koncentraci asi

0,02 až asi 0,2 %, výhodněji asi 0,15 %, kravské sérum albumin (BSA) v koncentraci asi 0,5 až

-12CZ 16422 Ul asi 3 %, výhodněji asi 1 %, manitol v koncentraci asi 1 % až asi 5 %, výhodněji asi 1 %, sacharózu v koncentraci asi 1 % až asi 5 %, výhodněji asi 1 %. V pufru může být obsažen Triton X100, s výhodou v koncentraci asi 0,1 až asi 0,5 %, výhodněji asi 0,1 %.

Pufr sdružované substance má s výhodou nastavenu pH na hodnotu asi 7,2 až asi 7,6, výhodněji asi 7,2.

V jednom provedení se při přípravě pracovní sdružené substance rozpuštěním sdružené substance v pufru suší sdružená substance na polštářku sdružené substance, například vakuově. Polštářek sdružené substance se s výhodou nařeže na vhodné rozměry pro použití v testovacím proužku. V dalších příkladech je polštářek sdružené substance nařezán na proužky 5 mm χ 5 mm.

ío Polštářek sdružené substance sestává s výhodou ze skelných vláken, skelného papíru, polyesteru nebo celulózového papíru. Takové materiály jsou dobře známy ze stavu techniky a je možno je obdržet, například, od firem Millipore, S&S a Whatman. V upřednostněném provedení je polštářek sdružované substance obchodně dosažitelným polštářkem ze skelných vláken typu GFCP203000 (Millipore).

Jak bylo popsáno shora, promývací pufr rozpouští sušenou sdružovanou substanci a uvádí ji do toku z polštářku sdružované substance po testovací membráně do testovací oblasti a kontrolní oblasti.

Testovací membrána může být z jakéhokoliv materiálu, k němuž může být vázán protein nebo jiné vazné činidlo, buď kovalentně nebo nekovalentně, a po níž může sdružená substance spolu s promývacím pufrem téci. Testovací membrána je s výhodou z nitrocelulózy. Pro použití jako testovací membrány mohou být odborníkem v daném oboru vybrány i jiné membrány s vyšší nebo nižší hodnotou průtoku, a to podle takových faktorů jako je požadovaná citlivost, doba trvání testu a náklady.

Jak sdružovaná substance teče s promývacím pufrem po membráně, kontaktuje testovací oblast.

Je-li přítomna zkoumaná analyzovaná substance a naváže se v testovací oblasti na vazné činidlo, naváže se sdružená substance v pufru na analyzovanou substanci.

Promývací pufr s obsahem sdružené substance, u něhož nedošlo v testovací oblasti k vazbě, bude dále téci přes membránu do kontrolní oblasti. Tam se sdružená substance naváže na kontrolní vazné činidlo. Promývací pufr pak odnese nenavázaný vzorek pryč z testovací a kontrolní oblasti.

Promývací pufr s nenavázanou sdružovanou substancí a nenavázaný vzorek pak teče na absorpční polštářek, který je ve styku se spodním koncem membrány. Absorpční polštářek může být proveden z jakéhokoliv absorpčního materiálu známého ze stavu techniky. S výhodou je absorpční polštářek absorpční papír, jako např. papír S&S 900 . Ze stavu techniky jsou známy i jiné absorpční papíry a mohou být v závislosti na konečném uspořádání testovacího proužku vybrány odborníkem v daném oboru.

Promývací pufr může pokračovat v toku absorpčním polštářkem na absorpční papír, který je s absorpčním polštářkem ve styku. Absorpční papír se s výhodou používá tehdy, je-li nutno absorbovat velké množství pufru.

Do testovacího proužku může být také začleněna desikační tableta s molekulárním sítem. V jed40 nom provedení teče pufr s nenavázanou sdružovanou substancí z absorpčního papíru na desikační tabletu, s níž je papír ve styku. Desikační tableta zadrží absorbovanou tekutinu a zabrání jejímu zpětnému toku na testovací proužek.

Desikační tableta může také udržet testovací proužek před použitím suchý. Upřednostněná desikační tableta je tableta Tri-Sorb o hmotnosti 0,395 g od firmy Sud-Chemie (výrobek číslo 43-01).

Odborník v daném oboru může zvolit vhodný rozměr a materiál pro absorpční polštářek, absorpční papír a desikační tabletu v závislosti na konečném uspořádání testovacího proužku při zohlednění celkového použitého objemu vzorku a pufru.

-13CZ 16422 Ul

Celý testovací proužek je s výhodou umístěn v pouzdru, které je např. z plastu. Jak je popsáno shora, v jednom provedení obsahuje pouzdro vzorkové okénko, jímž se přidává vzorek pro membránu obsahující testovací a kontrolní oblast. Pouzdro může též obsahovat pufrovací okénko, jímž se může přidávat na pufrovací polštářek nebo na membránu pufr. Pouzdro může též obsaho5 vat okénko objemového indikátoru, jímž může být pozorován signál indikující, že testovací oblast přišla do styku s dostatečným objemem vzorku. Dostatečný objem vzorku je takový objem vzorku, u něhož se předpokládá dostatek zkoumané analyzované substance, je-li přítomna, přičemž po ukončení testu vznikne v testovací oblasti viditelný signál indikující, zdaje ve vzorku přítomna analyzovaná substance. Například pro test detekce hCG v moči je dostatečným objelo mem vzorku asi 200 μΐ moči.

Výsledky testu je možno s výhodou přečíst asi 1 až asi 5 minut po přidání promývacího pufru na testovací proužek. U jednoho provedení jsou výsledky čitelné asi 2 až 4 minuty po přidání promývacího pufru, výhodněji asi 3 až 4 minuty po přidání promývacího pufru. U jednoho zvláště výhodného provedení jsou výsledky čitelné 1 minutu po přidání promývacího pufru. Jak je zná15 zorněno na obr. 7, pro kladný výsledek se stane viditelnou testovací čára. Viditelná kontrolní čára 400 značí, že test proběhl správně. Jak je znázorněno na obr. 6, je viditelná kontrolní čára 400, avšak testovací čára nikoliv, takže výsledek je negativní.

Příklad 1: Uspořádání testovací karty na HIV

Podle tohoto příkladu byl připraven rychlý vizuální test vedlejšího průtoku pro detekci protilátek lidského viru imunodeficience. Na obr. 1 je znázorněno uspořádání testovacích proužků k tomuto účelu.

Testovací proužky obsahovaly plastovou podložku o rozměru 6 cm χ 5 mm s adhezivem na obou stranách. Plastová podložka měla tloušťku asi 0,0508 mm až asi 0,508 mm.

Testovací čára a kontrolní čára byly připraveny na nitrocelulózové membráně (Millipore

HF09004) postřikem pomocí čerpacího rozdělovacího systému (Kinematic Automation). Testovací čára obsahovala vertikální linku z antigenu HIV. Antigen HIV byl směsí rekombinačního glykoproteinového antigenu HTV-1 (GP120 (asi 0,15 mg/ml) a P24 (asi 0,1 mg/ml)) a rekombinačního glykoproteinového antigenu HIV-2 (GP36 (asi 0,5 mg/ml)), v koncentraci asi 0,5 až asi 1,0 mg/ml, připravené v PBS s obsahem 5 % trehalózy. Na testovací oblast bylo ve vertikální lince aplikováno celkové množství asi 0,1 až asi 0,5 pg antigenu.

Byly připraveny i jiné testovací proužky s obsahem pouze jediného antigenu HTV-1 nebo HIV-2 na testovací čáře.

Pro všechny testovací proužky obsahovala kontrolní oblast vertikální linku z kontrolní protilátky. Tou bylo králičí IgG rozředěné v množství 1 mg/ml v PBS s obsahem 5 % trehalózy. Na kontrol35 ní oblast bylo aplikováno celkové množství kontrolního antigenu, dostatečné pro vznik viditelné kontrolní linky v závislosti na vazbě sdružované substance.

Pro každý testovací proužek byla nařezána vhodná nitrocelulózová membrána v rozměru asi 2,5 cm χ 5 mm a upevněna na plastovou podložku.

Ke koloidnímu zlatu byl přidán protein A, obchodně dosažitelný od firmy Sigma a byl jako sdru40 žená substance použit pro test. Sdružená substance byla rozpuštěna v pufru sdružené substance v koncentraci přibližně 3 OD/ml. Pufr sdružené substance obsahoval 0,25 % HEPES, 0,85 % chloridu sodného, 0,1 % azidu sodného, 0,1 % EDTA, 0,1 % kaseinu, 1 % kravského séra albumin, % manitolu, 5 % sacharózy a 0,1 % Tritonu XI00. Pufr byl nastaven na hodnotu pH 7,2.

Na polštářek sdružované substance ze skelných vláken (Millipore GFCP203000) byla aplikována sdružovaná substance a polštářek byl po usušení nařezán na proužky 5 mm χ 5 mm. Jeden proužek byl upevněn na konec nitrocelulózové membrány těsně u testovací oblasti každého testovacího proužku.

-14CZ 16422 Ul

K suchému polštářku sdružené substance každého testovacího proužku byl pak připevněn pufrovací polštářek ze skelného papíru o rozměru 2 cm χ 5 mm typu Whatman GF/DVA.

Poté byl ke konci nitrocelulózové membrány těsně u kontrolní oblasti upevněn absorpční polštářek (2 cm χ 5 mm) vyrobený z papíru S&S 900 a k absorpčnímu polštářku byl připevněn další absorpční papír (2,5 cm χ 5 mm; S&S 470). Absorpční papír byl uveden do kontaktu s desikační tabletou o hmotnosti 0,395 g (Tri-Sorb, Sud-Chemie).

Testovací proužek byl umístěn do plastového pouzdra, čímž byla vyrobena testovací karta podobná té, která je znázorněna na obr. 1 až 6. Plastové pouzdro 10 obsahovalo testovací okénko 20, kterým byla navenek vystavena testovací oblast 140 a kontrolní oblast 150, přičemž plastové ío pouzdro 10 obsahovalo i pufrovací okénko 30 přímo nad pufrovacím polštářkem. Plastové pouzdro 10 bylo také označeno v místě uspořádané testovací čáry a kontrolní čáry.

Testovací karty byly individuálně zabaleny do fólie.

Příklad 2: Test na HIV

Ze vzorku kompletní krve, získaného od pacienta, který měl být testován na HIV s použitím pří15 slušných technik odběru krve ze žíly, bylo připraveno sérum nebo plazma. Vzorky byly uloženy při teplotě 2 °C až 8 °C po dobu 24 hodin nebo byly zmraženy při teplotě -20 °C po dobu 2 týdnů. Zmražené vzorky byly před použitím rozmraženy.

Z fóliového balení byla vyjmuta testovací karta na HIV, popsaná v příkladu 1, která obsahovala v kontrolní oblasti směs antigenů HIV-1 a HIV-2.

Středem okénka testovací karty bylo na membránu aplikováno přibližně 5 μΐ vzorkovacího pufru s obsahem 0,025 % HEPES a 0,2 % azidu sodného.

Nad testovacím okénkem testovací karty se podržela ve vertikální poloze vzorkovací pipeta, která obsahovala sérum nebo plazmu určenou k testování a 5 μΐ vzorku se umístilo na membránu uprostřed okénka.

Na pufřovací polštářek se přidaly 4 kapky roztoku promývacího pufru (0,025 % HEPES, 0,85 % chloridu sodného, 0,1 % EDTA, 1 % manitolu, 0,1 % kaseinu, 1 % Tritonu X100, pH 7,2). Po třech minutách, jelikož reakce se nevyjasnila, se přidala další 1 kapka pufru na pufrovací polštářek.

Výsledky testu byly čitelné od 1 do 5 minut po přidání prvního pufru.

Jak je znázorněno na obr. 5, kladný výsledek obsahuje dvě viditelné čáry přes vzorkové okénko: testovací čáru 140 a kontrolní čáru 150. Kladny výsledek je takový, kdy se objeví dvě viditelné čáry, i když jedna z nich je tmavší než druhá. Negativní výsledek je znázorněn jedinou kontrolní čarou viditelnou napříč vzorkovým okénkem, jak je znázorněno na obr. 6.

Příklad 3: Testovací karta na HCV

Byl připraven testovací proužek pro diagnózu viru hepatitidy C podobně jako v příkladu 1. Pro vznik testovací čáry byla na membránu stříknuta směs antigenů hepatitidy C obsahující dřeň (0,3 mg/ml), NS3 (0,4 mg/ml) a NS4 (0,lmg/ml), jinak než u antigenů HIV. Na testovací čáru bylo aplikováno celkem asi 0,4 pg směsi antigenů HCV. Na kontrolní čáru byl vstříknut králičí IgG rozředěný na 1 mg/ml.

Příklad 4: Test na HCV

V příkladu 3 byla popsána testovací karta na HCV, která obsahovala antigen HCV v testovací oblasti a která byla vyjmuta z fóliového balení.

Na membránu bylo středem okénka testovací karty aplikováno přibližně 5 μΐ vzorkovacího pufru s obsahem fosfátového pufru a 0,2 % azidu sodného.

-15CZ 16422 Ul

Ze vzorku kompletní krve bylo připraveno sérum nebo plazma. Nad testovacím okénkem se ve vertikální poloze podržela vzorkovací pipeta se sérem nebo plazmou a na membránu bylo doprostřed okénka umístěno 5 μΐ vzorku.

Na pufrovací polštářek byly přidány 4 kapky roztoku promývacího pufru (0,025 % fosfátu,

0,85 % chloridu sodného, 0,1 % EDTA, 1 % manitolu, 0,1 % kaseinu, 1 % Tritonu X100, pH

7,2). Po 3 minutách, jelikož reakce se ještě nevyjasnila, byly přidány další dvě kapky pufru na pufrovací polštářek.

Výsledky testu byly čitelné od 1 do 5 minut po přidání prvního pufru.

Jak je znázorněno na obr. 5, kladný výsledek obsahuje dvě viditelné čáry přes vzorkové okénko: ío testovací čáru 140 a kontrolní čáru 150. Kladný výsledek je takový, kdy se objeví dvě viditelné čáry, i když jedna z nich je tmavší než druhá. Negativní výsledek je znázorněn jedinou kontrolní čarou viditelnou napříč vzorkovým okénkem, jak je znázorněno na obr. 6.

Příklad 5: Těhotenský test

Byly připraveny rychlé vizuální těhotenské testy s vedlejším průtokem. Uspořádání testovacích proužků jev podstatě takové, jak je znázorněno na obr. 7.

Každý testovací proužek obsahuje plastovou podložku (6 cm x 5 mm) s adhezivem na obou stranách. Plastová podložka má tloušťku asi 0,0508 mm až asi 0,508 mm.

Na nitrocelulózové membráně (Millipore HF09004) byla postřikem pomocí čerpacího rozdělovacího systému (Kinematic Automation) připravena testovací čára a kontrolní čára. Testovací čára obsahovala vertikální linii protilátky k lidskému chorionickému gonadotropinu (hCG), s výhodou monoklonální protilátku. Protilátky k hCG jsou široce dostupné obchodně, například od firmy Research Diagnostics lne. (RDI-CBL74; New Jersey, USA), Charles River Labs a z jiných zdrojů nebo mohou být připraveny s použitím standardních procedur. Na testovací oblast bylo v podobě vertikální linie aplikováno celkové množství asi 0,2 až asi 1 pg protilátky.

Kontrolní čára obsahuje vertikální linku z proteinu A. Celkové množství proteinu A, které je dostatečné pro vznik viditelného signálu v závislosti na navázání sdružované substance, aplikované na kontrolní čáru, je typicky asi 0,25 pg.

Pro každý testovací proužek byla nařezána vhodná nitrocelulózová membrána na rozměr asi 2,5 cm x 5 mm a upevněna na plastovou podložku.

Pro vytvoření sdružované substance byla pro provedení testu přidána ke koloidnímu zlatu druhá protilátka k hCG. Sdružené substance protilátek s koloidním zlatém a protilátkou k hCG jsou obchodně dostupné, například od firmy Research Diagnostics lne. Alternativně mohou být protilátky k hCG připraveny s použitím známých způsobů (viz např. US-patent č. 6,485,982). Sdružovaná substance je rozpuštěna v pufru sdružované substance v koncentraci přibližně 3 OD/ml.

Pufr sdružované substance obsahuje s výhodou 0,25 % HEPES, 0,85 % chloridu sodného, 0,1 % azidu sodného, 0,1 % EDTA, 0,1 % kaseinu, 1 % kravského séra albumin, 1 % manitolu, 5 % sacharózy, 0,1 % Tritonu X100. Pufr byl nastaven na hodnotu pH 7,2.

Na polštářek sdružované substance ze skelných vláken (Millipore GFCP203000), který byl nařezán na proužky 5 mm χ 5 mm, byla aplikována sdružovaná substance a polštářek byl vysušen.

K vysušenému polštářku sdružované substance každého testovacího proužku byl upevněn pufrovací polštářek (2 cm χ 5 mm) ze skelného papíru Whatman IF/DVA.

Na konec nitrocelulózové membrány těsně u kontrolní oblastí byl upevněn absorpční polštářek (2 cm χ 5 mm), provedený z papíru S&S 900, načež byl k absorpčnímu polštářku upevněn další absorpční papír (2,5 cm χ 5 mm; S&S 470). Absorpční papír byl uveden do styku s desikační tabletou (např. Tri-Sorb, Sud-Chemie), která je schopna absorbovat významnou část objemu vzorku a vzorek s analyzovanou substancí se nechal protéci přes testovací oblast.

-16CZ 16422 Ul

Buď na absorpčním polštářku nebo na absorpčním papíru byla za testovací oblastí uložena metylénová modř nebo jiný indikátor. Pohyb tohoto objemového indikátoru je signálem, že dostatečné množství vzorku kontaktovalo testovací oblast pro docílení přesného průběhu testu.

Testovací proužek byl umístěn v plastovém pouzdru, čímž byla vyrobena testovací karta. Plasto5 vé pouzdro obsahuje testovací okénko umístěné nad testovací oblastí a kontrolní oblastí pro umožnění shlédnutí výsledků testů. Pouzdro také obsahuje okénko objemového indikátoru, jímž je možno pozorovat pohyb objemového indikátoru.

U některých testovacích karet je nad testovacím okénkem umístěn vzorkový pohárek. Ten obsahuje nádobku pro vzorek s výpustí, která umožní, aby vzorek vtekl na aplikační oblast vzorku testovací membrány vzorkovým okénkem. Vzorkový pohárek může ve výpusti obsahovat filtr. Po výtoku vzorku na membránu se pohárek odstraní, aby bylo možno shlédnout výsledky testu.

U jiných testovacích karet je umístěn v konci nebo po straně pouzdra vyčnívající knot. Ten vytváří dráhu, po níž může vzorek téci do oblasti aplikace vzorku a do testovací oblasti.

Pouzdro má též mechanizmus, který umožní pohyb polštářku sdružované substance do tekutino15 vého propoj ení s membránou.

U některých testovacích karet je v pouzdru před polštářkem sdružované substance umístěna též ampulka s promývacím pufrem. U jiných testovacích karet se pufř přidává na pufrovací polštářek pufrovacím okénkem.

Uvedením mechanizmu pro pohyb polštářku sdružované substance do činnosti a do kontaktu s testovací membránou se rozlomí ampulka a pufr vyteče na polštářek sdružované substance, a to v množství asi 5 kapek promývacího pufru. Uvedením mechanizmu do činnosti se též z pouzdra odstraní vzorkový pohárek nebo knot.

Konečně se označí plastové pouzdro za účelem indikace umístění testovací čáry a kontrolní čáry ve vzorkovém okénku.

25-' Příklad 6: Použití těhotenského testu se vzorkovým pohárkem

Rychlý vizuální těhotenský test s vedlejším průtokem a vzorkovým pohárkem byl připraven podle popisu v příkladu 5.

Shromáždí se moč daného subjektu a přibližně 500 μΐ z ní se uloží do vzorkového pohárku, který je upevněn k testovací kartě nad vzorkovým okénkem. Když se v okénku objemového indikátoru objeví modrá barva, je aktivován mechanizmus, který uvádí polštářek do sdružované substance do tekutinového propojení s membránou. To vyvolá rozlomení ampulky s pufrem a nastartuje test. Vzorkový pohárek je odstraněn a výsledky testu jsou viditelné po 1 až 5 minutách.

Jak je znázorněno na obr. 5, pozitivní výsledek přináší dvě viditelné čáry přes vzorkové okénko představované testovací oblastí 140 a kontrolní oblastí 150. Jsou-li viditelné dvě čáry, i když jedna je tmavší než druhá, je výsledek testu pozitivní. Negativní výsledek je indikován jedinou kontrolní čarou kontrolní oblastí 150, viditelnou napříč vzorkovým okénkem, jak je znázorněno na obr. 6.

Příklad 7: Použití těhotenského testu s knotem

Rychlý vizuální těhotenský test s vedlejším průtokem a knotem byl připraven tak, jak je popsáno v příkladu 5.

Subjekt umístí knot do toku své moči. Modrá barva, která se objeví v okénku objemového indikátoru, znamená, že testovací oblast se dostala do styku s dostatečným objemem vzorku.

Aktivovaný mechanizmus na pouzdru uvede polštářek sdružované substance do tekutinového propojení s membránou. To také rozlomí ampulku s pufrem uvnitř pouzdra a nastartuje test tím, že způsobí výtok pufru na polštářek sdružované substance. Knot je odstraněn a výsledky testu jsou viditelné ve vzorkovém okénku po 1 až 5 minutách.

- 17CZ 16422 Ul

Jak je znázorněno na obr. 5, pozitivní výsledek přináší dvě viditelné čáry přes vzorkové okénko představující testovací čáru a kontrolní čáru. Jsou-li viditelné dvě čáry, i když jedna je tmavší než druhá, je výsledek testu pozitivní. Negativní výsledek je indikován jedinou kontrolní čarou, viditelnou napříč vzorkovým okénkem, jak je znázorněno na obr. 6.

Technické řešení bylo sice popsáno s odkazy na určitá výhodná provedení, avšak odborníkům v oboru je jasné, že je možno provést různé změny a náhrady pomocí ekvivalentů, aniž by se opustil rozsah technického řešení. Navíc je možno provést mnoho modifikací a úprav, aniž by se rovněž opustila podstata technického řešení. Toto proto není omezeno na jakékoliv zvláštní popsané provedení, nýbrž zahrnuje všechna provedení spadající do rozsahu připojených nároků.

Claims (5)

1. Diagnostický testovací proužek (100) pro detekci zkoumané analyzované substance v tekutém vzorku, vyznačující se tím, že testovací proužek (100) obsahuje: zdrojovou oblast (50) sdružované substance obsahující sdružovanou substanci, uspořádanou pro vazbu na zkoumanou analyzovanou substanci;

15 oblast aplikace vzorku, umístěnou za zdrojovou oblastí (50) sdružované substance a uspořádanou pro příjem tekutého vzorku; a testovací oblast (140) umístěnou za zdrojovou oblastí (50) sdružované substance a obsahující imobilizované vazné činidlo, specifické pro zkoumanou analyzovanou substanci.

2. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že oblast aplikace 20 vzorku obsahuje testovací oblast (140).

3. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že zkoumaná analyzovaná substance j e protilátka.

4. Testovací proužek podle nároku 3, vyznačující se tím, že zkoumaná analyzovaná substance je protilátka k lidskému viru imunodeficience (HIV).

25 5. Testovací proužek podle nároku 3, vyznačující se tím, že zkoumaná analyzovaná substance je protilátka k viru hepatitidy C (HCV).

6. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že zkoumaná analyzovaná substance je antigen.

7. Testovací proužek podle nároku 6, vyznačující se tím, že zkoumaná analyzo30 váná substance je lidský chorionický gonadotropin hCG.

8. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že zdrojová oblast (50) sdružované substance obsahuje sušenou sdružovanou substanci.

9. Testovací proužek podle nároku 8, vyznačující se tím, že zdrojová oblast (50) sdružované substance obsahuje polštářek sdružované substance, obsahující sušenou sdružovanou

35 substanci a je v tekutinovém propojení s testovacím proužkem (100).

10. Testovací proužek podle nároku 8, vyznačující se tím, že zdrojová oblast (50) sdružované substance je částí testovacího proužku (100).

11. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že sdružovaná substance je uspořádána pro tok do testovací oblasti (140) kontaktem zdrojové oblasti (50) sdružo40 váné substance s promývacím pufrem.

-18CZ 16422 Ul

12. Testovací proužek podle nároku 11, vyznačující se tím, že promývací pufr obsahuje blokovací činidlo protein a neionický detergent.

13. Testovací proužek podle nároku 12, vyznačující se tím, že promývací pufr obsahuje 0,1 % kaseinu a 1 % Tritonu X100.

5 14. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že sdružovaná substance obsahuje vaznou složku a značkovač.

15. Testovací proužek podle nároku 14, vyznačující se tím, že vazná složka je protein A.

16. Testovací proužek podle nároku 14, vyznačující se tím, že značkovač je vylo brán ze skupiny sestávající z koloidního zlata, koloidního stříbra, koloidní černi a barvených latexových částic.

17. Testovací proužek podle nároku 16, vyznačující se tím, že značkovač je koloidní zlato.

18. Testovací proužek podle nároku 17, vyznačující se tím, že koloidní zlato má 15 rozměr částeček od zhruba 20 do zhruba 80 nanometrů.

19. Testovací proužek podle nároku 3, vyznačující se tím, že sdružovaná substance obsahuje protein A sdružený s koloidním zlatém.

20. Testovací proužek podle nároku 6, vyznačující se tím, že sdružovaná substance obsahuje protilátku sdruženou s koloidním zlatém.

20 21. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že testovací proužek obsahuje nitrocelulózovou testovací membránu (130).

22. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že testovací proužek (100) dodatečně obsahuje kontrolní oblast (150) umístěnou za testovací oblastí (140) a obsahující imobilizované kontrolní vazné činidlo uspořádané pro vazbu na sdružovanou substanci.

25 23. Testovací proužek podle nároku 22, vyznačující se tím, že kontrolní oblast obsahuje imobilizovaný králičí IgG.

24. Testovací proužek podle nároku 22, vyznačující se tím, že kontrolní oblast obsahuje imobilizovaný protein A.

25. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dodatečně obsahuje 30 pufrovací polštářek (110) jsoucí v tekutinovém propojení se zdrojovou oblastí (50) sdružované substance.

26. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dodatečně obsahuje absorpční polštářek (160) jsoucí v tekutinovém propojení s testovací membránou (130) v místě za testovací oblastí (140).

35 27. Testovací proužek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dodatečně obsahuje filtr vzorku umístěný přímo nad oblastí aplikace vzorku.

28. Testovací proužek pro detekci protilátky k HIV ve vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje:

testovací oblast (140) a zdrojovou oblast (50) sdružované substance umístěnou před testovací 40 oblastí (140);

imobilizovaný antigen vázaný na testovací oblast (140), který obsahuje zhruba 0,1 až zhruba 0,5 pg antigenu HIV; a

-19CZ 16422 Ul sdružovanou substanci rozptylně vázanou na zdrojovou oblast (50) sdružované substance, přičemž sdružovaná substance je uspořádána pro vazbu na protilátku.

29. Testovací proužek podle nároku 28, vyznačující se tím, že antigen k HIV obsahuje jeden nebo více antigenů vybraných ze skupiny sestávající z GP120, P24 a GP36.

5 30. Testovací proužek podle nároku 28, vyznačující se tím, že sdružovaná substance obsahuje protein A.

31. Testovací proužek podle nároku 30, vyznačující se tím, že protein A je sdružen s koloidním zlatém.

32. Imunodiagnostický těhotenský testovací proužek, vyznačující se tím, žeobío sáhuje:

oblast aplikace vzorku pro příjem tekutého vzorku;

testovací oblast obsahující imobilizovanou první protilátku k hCG; a zdrojovou oblast sdružované substance, obsahující sdružovanou substanci uspořádanou pro vazbu na hCG, přičemž zdrojová oblast sdružované substance je umístěna před oblastí aplikace

15 vzorku a testovací oblastí.

33. Těhotenský testovací proužek podle nároku 32, vyznačující se tím, že dodatečně obsahuje knot, který je v tekutinovém propojení s oblastí aplikace vzorku.

34. Těhotenský testovací proužek podle nároku 32, vyznačující se tím, že dodatečně obsahuje pohárek (500) pro shromáždění vzorku moči.

20 35. Těhotenský testovací proužek podle nároku 32, vyznačující se tím, že sdružovaná substance obsahuje druhou protilátku k hCG.

36. Těhotenský testovací proužek podle nároku 35, vyznačující se tím, že druhá protilátka k hCG je sdružena s koloidním zlatém.