JP6527825B2

JP6527825B2 - 癌を処置するための環形動物のヘモグロビンの使用

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Publication number: JP6527825B2
Application number: JP2015557504A
Authority: JP
Inventors: ザル，フランク
Original assignee: Hemarina SA
Current assignee: Hemarina SA
Priority date: 2013-02-15
Filing date: 2014-02-14
Publication date: 2019-06-05
Anticipated expiration: 2034-02-14
Also published as: WO2014125225A1; ES2851329T3; JP2016506975A; FR3002146B1; US20150374796A1; EP2956161A1; EP2956161B1; FR3002146A1

Description

本発明は、癌を処置するための、詳細には癌細胞における低酸素症を軽減し、それによって放射線療法及び化学療法処置の有効性を高めるための、少なくとも１つの細胞外環形動物ヘモグロビン、グロビン、又はグロビンプロトマーの使用に関する。

癌は、悪性と称される細胞の異常かつ制御不能な増殖と関連する疾患である。

癌は、固形腫瘍と称される腫瘍、すなわち細胞が増殖して塊を形成しているもの、並びに癌細胞が血液中を循環している、すなわち固形の塊を構成していないリンパ腫及び白血病とを包含する。

ヒトにおいては、ほぼすべての固形腫瘍で、酸素分圧の低下（組織低酸素症）が証明されている（Raleigh J, Dewhirst M, Thrall D. Measuring tumor hypoxia. Semin Radiat Oncol 1996; 46: 229-37）。早くも１９５０年代には、腫瘍の構造は、生存可能な組織によって、毛細血管から約１００μmの距離で包囲された中心硝子質壊死であると記載されている（Thomlinson RH, Gray LH. The histological structure of some human lung cancers and possible implications for radiotherapy. Br J Cancer 1955; 9: 539）。腫瘍は、酸素分圧が低い大きい領域を有しており、そこでは細胞は、低酸素状態にある。

ヘテロダイマー転写因子ＨＩＦ−１（低酸素誘導因子−１）は、広範囲なシグナル経路を活性化することにより、癌細胞が低酸素ストレスに対する順応応答を獲得するのを可能とする。ＨＩＦ−１は、特に血管新生、腫瘍の進行と転位性播種の促進、グルコース代謝（Ｇｌｕｔ−１）、細胞の生存、及び化学療法抵抗性（ＭＤＲ）に関与するタンパク質因子をコードする５０を超える一連の遺伝子を活性化する（Lauzier MC, Michaud MD, Dery MA, Richard DE. HIF-1 activation during tumor progression: implications and consequences. Bull Cancer 2006; 93: 349-56）。腫瘍におけるＨＩＦ−１タンパク質の検出は、生存率の低下、及び化学療法に対する感受性の低下と関連している。実際、ＨＩＦ−１αタンパク質を欠損している細胞では、カルボプラチン又はエトポシド等の多くの化学療法剤に対する感受性の増大が証明されている（Unruh A, Ressel A, Mohamed HG, Johnson RS, Nadrowitz R, Richter E, et al. The hypoxia-inducible factor-1 alpha is a negative factor for tumor therapy. Oncogene 2003; 22: 3213-20）。更に、腫瘍の低酸素症は、Ｇ１／Ｓ相における細胞周期を停止させ、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３を不活性化することによりアポトーシスに対する抵抗性を増大させることが証明されている。したがって、ネズミの線維肉腫モデルでは、低酸素細胞は、正常酸素圧細胞よりも２〜６倍、化学療法に対して耐性であることが証明されている（Teicher BA, Holden SA, Al-Achi A, et al. Classification of antineoplastic treatments by their differential toxicity toward putative oxygenated and hypoxic tumor subpopulations in vivo in the FSaIIC murine fibrosarcoma. Cancer Res 1990; 50: 3339-44）。

低酸素症はまた、放射線抵抗性における主要な因子でもある。ヌクレオシド塩基における変化（一本鎖及び二本鎖ＤＮＡの切断）は、エネルギーをＤＮＡ鎖に与えることにより「直接的に」、又はより多くは、水の放射線分解による遊離ラジカルの産生により間接的に起こりえる。酸素は、より長く続く遊離ラジカルの生成を可能とすることにより、このラジカルカスケードに関与する。

低酸素症は、その高い腫瘍特異性を考えると、療法にとって重要な標的であると考えられる（"L'hypoxie tumorale peut-elle devenir un avantage pour la chimiotherapie?" [Could tumoral hypoxia be advantageous to chemotherapy?], Tredan et al, Bulletin du Cancer, 2008, vol. 95, no.5, pp. 528-534）。

したがって、低酸素状態下での細胞を標的とする新しい治療法が開発されつつある。ＨＩＦ−１の発現又は活性を阻害しうる多数の薬剤も、前臨床又は臨床試験段階にある。

有効な治療法を手にするために、低酸素症を阻害する治療法を確認することが適切である。実際、このメカニズムを阻害又は軽減させることにより、癌細胞は、放射線療法及び化学療法処置に再度感受性を有するようになりうる。

したがって、固形腫瘍の場合、癌細胞において低酸素症を軽減する必要がある。

本発明者らは、驚くべきことに、実施例において証明されているように、細胞外環形動物ヘモグロビンが、癌細胞における低酸素症を軽減しうることを発見した。

したがって、本発明は、癌、好ましくは固形腫瘍を処置するための、細胞外環形動物ヘモグロビン、グロビン、又はグロビンプロトマーから選択される少なくとも１つの分子の使用に関する。好ましくは、癌細胞における低酸素症を軽減することにより（これにより癌細胞を放射線療法及び化学療法処置に対してより感受性にする）、癌は処置される。本発明はまた、癌細胞における低酸素症を軽減するために使用するための、少なくとも１つの細胞外環形動物ヘモグロビン、グロビン、又はグロビンプロトマーに関する。

したがって、本発明は、癌を処置するために同時、別々、又は連続して使用するための組み合わせ製剤としての、抗癌剤、及び細胞外環形動物ヘモグロビン、グロビン、又はグロビンプロトマーからなる製品に関する。

抗癌剤は、好ましくは、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、タキソール、タキソテール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア（カルムスチン及びロムスチン等）、白金錯体（シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン等）、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン（procarbizine）、エトポシド、テニポシド、カンパテシン（campathecine）、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、Ｌ−アスパラギナーゼ、エピムビシン（epimbicm）、５−フルオロウラシル、タキサン（ドセタキセル及びパクリタキセル等）、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、エストラムスチン、ムスチン塩酸塩、ＢＣＮＵ、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン、抗ＥＧＦ受容体又は抗ＶＥＧＦ受容体モノクローナル抗体（ベバシズマブ、セツキシマブ及びパニツムマブ等）、イマチニブメシル酸塩（imatimb mesylate）、ヘキサメチルメラミン（hexamethyhnelamine）、トポテカン、ゲニステイン、エルブスタチン、ラベンダスチン、並びにボルテゾミブ（又はＰＳ３４１、Millenium PharmaceuticalsによりVelcadeの名称で販売されている）から選択される。

細胞外環形動物ヘモグロビンは、環形動物の３種類の綱に存在する（多毛綱、貧毛綱、及びヒル綱）。細胞外ヘモグロビンについて説明すると、細胞外ヘモグロビンは、天然では細胞内に含まれておらず、したがってそれを化学的に修飾して安定化又は官能化することなく、血流内を自由に循環することができる。

細胞外環形動物ヘモグロビンは、２０００〜４０００kDaの分子量を有し、一般的には２種類のカテゴリーに分類される４〜１２の異なる型の約２００のポリペプチド鎖から構成される巨大なバイオポリマーである。

１４４〜１９２の構成要素を有する第１のカテゴリーは、ヘム型の活性部位を担い、可逆的に酸素に結合できる「機能的」ポリペプチド鎖を一緒にまとめており；これらは、グロビン型の鎖であり、その重量は、１５〜１８kDaであり、脊椎動物のα−及びβ−型の鎖に非常に似ている。

３６〜４２の構成要素を有する第２のカテゴリーは、活性部位をほとんど、又はまったく有さず、１／１２（one-twelfth）サブユニット又はプロトマーと称されるサブユニットの組み立てを可能とする「構造」又は「リンカー」ポリペプチド鎖を一緒にまとめている。

各ヘモグロビン分子は、六角形の二層と称される２つの重なった六角形からなり、各六角形自体は、水滴の形の６個のサブユニット（ドデカマー又はプロトマー）の組み立てにより形成される。未変性分子は、これらのサブユニット（ドデカマー又はプロトマー）１２個から形成される。各サブユニットは、約２５０kDaの分子量を有し、未変性分子の機能的ユニットを構成する。

細胞外環形動物ヘモグロビンは、好ましくは、多毛類環形動物の細胞外ヘモグロビン及び貧毛類環形動物の細胞外ヘモグロビンから選択される。好ましくは、細胞外環形動物ヘモグロビンは、ツリミミズ科（family Lumbricidae）の細胞外ヘモグロビン、クロムシ科（family Arenicolidae）の細胞外ヘモグロビン、及びゴカイ科（family Nereididae）の細胞外ヘモグロビンから選択される。更により好ましくは、細胞外環形動物ヘモグロビンは、Lumbricus terrestrisの細胞外ヘモグロビン、Arenicola spの細胞外ヘモグロビン、及びNereis spの細胞外ヘモグロビンから選択され、より好ましくは、Arenicola marina又はNereis virensの細胞外ヘモグロビンである。

本発明によると、細胞外環形動物ヘモグロビンのグロビンプロトマーは、上述したように、未変性ヘモグロビンの機能的ユニットを構成する。

最後に、細胞外環形動物ヘモグロビンのグロビン鎖は、特に細胞外環形動物ヘモグロビンのＡｘ及び／又はＢｘ型グロビン鎖から選択することができる。

細胞外環形動物ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及び／又はそのグロビンは、哺乳動物のヘモグロビン、特にヒトヘモグロビンとは反対に、機能するために補因子を必要としない。最後に、細胞外環形動物ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及び／又はそのグロビンは、血液型を有しないため、免疫反応の問題を避けることができる。

細胞外環形動物ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及び／又はそのグロビンは、未変性又は組換えであることができる。

本発明によると、細胞外環形動物ヘモグロビン、グロビン、又はグロビンプロトマーは、好ましくは、緩衝液を含む組成物中に存在する。

該緩衝液は、ヘモグロビン、そのプロトマー、及びそのグロビンにとって適切な塩環境を作り、それによりこの分子の四次構造、したがって機能性が維持されるのを可能とする。緩衝液のため、ヘモグロビン、そのプロトマー、及びそのグロビンは、それらの酸素供給機能を果たすことができる。

本発明に係る緩衝液は、塩、好ましくは塩化物、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びカリウムイオンを含む水溶液であり、本発明に係る組成物をpH６．５〜７．６とし；その処方は、生理学的に注射可能な液体のそれと類似する。これらの条件により、細胞外環形動物ヘモグロビン、そのグロビンプロトマー、及びそのグロビンは、機能的なままである。

本発明の記載では、pHは、別段の指示がない限り、周囲温度（２５℃）でのものと理解される。

緩衝液は、好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、そして更にグルコン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウムを含む水溶液であり、６．５〜７．６、好ましくは７．１±０．５に等しい、好ましくは約７．３５のpHを有する。より好ましくは、緩衝液は、９０mM のＮａＣｌ、２３mM のグルコン酸Ｎａ、２．５mM のＣａＣｌ_２、２７mM の酢酸Ｎａ、１．５mM のＭｇＣｌ_２、５mM のＫＣｌを含み、７．１±０．５のpHを有し、０〜１００mM のアスコルビン酸及び／又は還元型グルタチオンの抗酸化剤を含むことができる水溶液である。

組成物は、好ましくは、被験体へ非経口的に、好ましくは注射又は点滴により投与される。

ヘモグロビン、そのプロトマー、又はそのグロビン、及び緩衝液を含む組成物は、好ましくは、そのまま投与される。実際、この場合、ヘモグロビン、そのプロトマー、又はそのグロビンは、好ましくは塩を含む水溶液であり、組成物を６．５〜７．６のpHにする緩衝液を含む組成物中に存在する。組成物は、好ましくは、ヘモグロビン、そのプロトマー、又はそのグロビン、及び組成物を６．５〜７．６のpHにする塩を含む水溶液からなる緩衝液のみを含む。したがって、投与形態は、まったく単純かつ有効である。

癌は、好ましくは、癌腫、肉腫、メラノーマ、乳癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、肝臓癌、肺癌、及び甲状腺癌から選択される。

本発明を、以下の実施例においてより詳細に説明する。これらの例は、単に非限定的に説明する方法で与えられるものである。

図を、以下の説明文により説明する。

対照群（Ctrl）、及びＭ１０１１２００mg／kgの静脈内（i.v.）注射後１時間及び５時間での腫瘍組織の切片上の抗ＧＬＵＴ−１標識の定量化。パラフィン切片上で観察された陽性シグナルを、腫瘍の総表面積と比較しての標識された腫瘍細胞の面積の比率として表した。値は、試料３体の平均に相当する（平均±ＳＤ）。

実施例
材料
Arenicola marina（Ｍ１０１）：
本研究では、１００mg／ml及び１７８mg／mlの濃度の２つのバッチを用いた。Ｍ１０１を、−８０℃で保存し、研究に際しては４℃で解凍する。

Ｍ１０１を、Ｍ１０１安定緩衝液：４mM ＫＣｌ、１４５mM ＮａＣｌ、０．２mM ＭｇＣｌ_２、１０mM ＨＥＰＥＳ、０．１M ＮａＯＨ；pH７により研究濃度にまで希釈した。

インビボ腫瘍モデル、Ｍ１０１による処理、及び腫瘍の免疫組織化学的分析：
ＨＴ２９ヒト結腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−３８）を、２０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、及び１％抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）を補ったＤＭＥＭ中、３７℃で、水飽和雰囲気下、５％ＣＯ_２／９５％空気中で、増殖させた。

あらかじめ５Gyの線量で放射線照射をしておいた６〜８週齢のヌードマウスの右側腹部の領域に、インビトロで増幅したＨＴ２９細胞（３×１０^６細胞）を皮下注射した。腫瘍の直径が〜５mmに達したら、マウスに異なる３濃度（６０、６００、及び１２００mg／kg）でＭ１０１を静脈内注射した。免疫組織化学（抗ＧＬＵＴ−１抗体、及びストレプトアビジン−ビオチンによる検出）を用いて、ＧＬＵＴ−１の発現を定量化することにより、腫瘍における低酸素症を軽減するＭ１０１の能力を経時的に観察した。この目的のために、Ｍ１０１による処置後異なる時間でマウスを安楽死させ、５分、１５分、そして１、２、３、４、５、６、及び２４時間でＨＴ２９腫瘍から試料を採取した。ＧＬＵＴ−１を、組織における低酸素症の内因性マーカーとして評価した（Gbadamosi JK, Hunter AC, Moghimi SM (2002) PEGylation of microspheres generates a heterogeneous population of particles with differential surface characteristics and biological performance. FEBS Lett 532:338-344; Pionetti JM, Pouyet J (1980) Molecular architecture of annelid erythrocruorins. Extracellular hemoglobin of Arenicola marina (Polychaeta). Eur J Biochem 105:131-138）。

結果
腫瘍組織の酸素供給の動態
ＧＬＵＴ−１マーカーの免疫組織学的定量化により皮下ＨＴ２９腫瘍における低酸素症の程度の軽減を評価することにより、Ｍ１０１の酸素供給能をインビボで決定した（下記表１）。

組織低酸素症の程度は、Ｍ１０１の静脈内注射後、ＧＬＵＴ−１標識を経時的に定量化することにより評価する。
組織低酸素症の程度は、以下のスケールにより決定する。
「＋＋＋」＝非常に強いＧｌｕｔ−１標識、非常に高い組織低酸素症
「＋＋／−」＝強いＧｌｕｔ−１標識、高い組織低酸素症
「＋」、「＋／−」＝中程度のＧｌｕｔ−１標識、軽減された組織低酸素症
「＋／−」＝低いＧｌｕｔ−１標識、低い組織低酸素症

組織学的スライドのデジタル化の後、専用のソフトウェアにより、各状態について低酸素症の程度を測定することができた。処置（Ｍ１０１を６００mg／kg、及び１２００mg／kg注射）後の腫瘍組織試料の検査により、低酸素の領域が、対照と比較して縮小しており、腫瘍を分離し、浸潤する傾向のある線維組織で置き換えられていたことが証明された。Ｍ１０１を１２００mg／kgの投与量で静脈内投与することで、腫瘍の低酸素症の程度は、１時間後で平均２０％（４０％と高い上昇）、５時間後で２３％軽減する（図１を参照）。

これらのデータにより、Ｍ１０１が、腫瘍組織に拡散し、ＧＬＵＴ−１染色の強度を低下させることができることが示唆され、それにより腫瘍の酸素供給に対する効果が証明されている。

Claims

細胞外多毛類環形動物ヘモグロビン、グロビン、又はグロビンプロトマーから選択される分子を含む、放射線療法によって治療される患者における癌を処置するための、医薬組成物。
癌の処置が、癌細胞における低酸素症を軽減するためである、請求項１記載の医薬組成物。
抗癌剤、及び細胞外多毛類環形動物ヘモグロビン、グロビン、又はグロビンプロトマーからなる、癌を処置するために同時、別々、又は連続して使用するための組み合わせ製剤。
細胞外多毛類環形動物ヘモグロビンが、ツリミミズ科（family Lumbricidae）の細胞外ヘモグロビン、クロムシ科（family Arenicolidae）の細胞外ヘモグロビン、及びゴカイ科（family Nereididae）の細胞外ヘモグロビンから選択されることを特徴とする、請求項１又は２記載の医薬組成物。
細胞外多毛類環形動物ヘモグロビンが、Lumbricus terrestrisの細胞外ヘモグロビン、Arenicola spの細胞外ヘモグロビン、及びNereis spの細胞外ヘモグロビンから選択されることを特徴とする、請求項１、２、又は４記載の医薬組成物。
細胞外多毛類環形動物ヘモグロビンが、Arenicola marinaの細胞外ヘモグロビン、及びNereis virensの細胞外ヘモグロビンから選択されることを特徴とする、請求項１、２又は４〜５のいずれか一項記載の医薬組成物。
癌が、固形腫瘍であることを特徴とする、請求項１、２又は４〜６のいずれか一項記載の医薬組成物。
癌が、癌腫、肉腫、メラノーマ、乳癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、肝臓癌、肺癌、及び甲状腺癌から選択されることを特徴とする、請求項１、２又は４〜７のいずれか一項記載の医薬組成物。
ヘモグロビンが、緩衝液を含む組成物中に処方されることを特徴とする、請求項１、２又は４〜８のいずれか一項記載の医薬組成物。
細胞外多毛類環形動物ヘモグロビンが、ツリミミズ科（family Lumbricidae）の細胞外ヘモグロビン、クロムシ科（family Arenicolidae）の細胞外ヘモグロビン、及びゴカイ科（family Nereididae）の細胞外ヘモグロビンから選択されることを特徴とする、請求項３記載の製剤。
細胞外多毛類環形動物ヘモグロビンが、Lumbricus terrestrisの細胞外ヘモグロビン、Arenicola spの細胞外ヘモグロビン、及びNereis spの細胞外ヘモグロビンから選択されることを特徴とする、請求項３又は１０記載の製剤。
細胞外多毛類環形動物ヘモグロビンが、Arenicola marinaの細胞外ヘモグロビン、及びNereis virensの細胞外ヘモグロビンから選択されることを特徴とする、請求項３又は１０〜１１のいずれか一項記載の製剤。
癌が、固形腫瘍であることを特徴とする、請求項３又は１０〜１１のいずれか一項記載の製剤。
癌が、癌腫、肉腫、メラノーマ、乳癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、肝臓癌、肺癌、及び甲状腺癌から選択されることを特徴とする、請求項３又は１０〜１３のいずれか一項記載の製剤。
ヘモグロビンが、緩衝液を含む組成物中に処方されることを特徴とする、請求項３又は１０〜１４のいずれか一項記載の製剤。