JP2001348341A

JP2001348341A - 低酸素状態の細胞および組織に有効な人工酸素運搬体

Info

Publication number: JP2001348341A
Application number: JP2000168523A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Ogata; 嘉貴緒方; Shinichi Kaneda; 伸一金田; Tetsuhiro Kimura; 哲寛木村
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2000-06-06
Filing date: 2000-06-06
Publication date: 2001-12-18

Abstract

(57)【要約】【課題】血栓、栓塞等で血流が阻害されたため低酸素状
態となった細胞、組織や、ガン細胞、ガン組織のような
極端な低酸素状態の細胞、組織に、選択的に酸素を輸送
することができる人工酸素運搬体の提供。【解決手段】ヘモグロビンを含有するｐＨ７．０〜９．
０の溶液を内部に取り込んだリポソームからなる人工酸
素運搬体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は人工酸素運搬体に関
する。詳しくは、血栓、栓塞等で血流が阻害されて低酸
素状態となった細胞、組織、または低酸素状態のガン細
胞、ガン組織等の低酸素部位に選択的に酸素を輸送し、
供給することが可能な人工酸素運搬体に関する。

【０００２】

【従来の技術】正常な脳は、血流量が約５０ｍｌ／（１
００ｇ・ｍｉｎ）であり、約３ｍｌ／（１００ｇ・ｍｉ
ｎ）の酸素が消費される。正常な脳細胞の酸素分圧は３
０Ｔｏｒｒ以上と高い状態に保たれていることが知られ
ている。しかし、脳血管の血栓、栓塞等に起因する血流
障害により、脳血流が２０ｍｌ／（１００ｇ・ｍｉｎ）
以下、脳細胞の酸素分圧が２０Ｔｏｒｒ前後になった場
合には、脳波の平坦化および誘発電位消失が起こり、こ
の状態が継続すると運動機能障害を呈すること、更に、
脳血流が１０ｍｌ／（１００ｇ・ｍｉｎ）以下となった
場合には、脳細胞膜イオンポンプ障害が発生し、その状
態が継続すると１〜３時間以内に不可逆的変化、即ち、
脳梗塞を起こすことが知られている。その場合、梗塞巣
においては、酸素分圧が１０Ｔｏｒｒ前後になることが
知られている。また、ガン細胞の中心部分においては、
血管系が未発達であるため酸素供給が不十分となり、ガ
ン細胞が低酸素状態（通常、酸素分圧１０Ｔｏｒｒ以
下）にある。したがって、酸素ラジカル発生を治療機序
とする放射線治療において、十分な治療効果が出ないと
いう問題がある。これらの疾患や治療法においては、人
工酸素運搬体の利用が有効であると期待されている。

【０００３】従来、人工酸素運搬体として試みられてい
るものとしては、（１）フルオロカーボン乳化物、
（２）動物、人等の赤血球から赤血球膜を除去すること
により得られるヘモグロビンを化学的に修飾した架橋型
ヘモグロビンまたは重合ヘモグロビン（以下「ヘモグロ
ビン化学修飾体」ともいう。）、（３）リポソームにア
ロステリックエフェクターとともにヘモグロビンをカプ
セル化したリポソーム型ヘモグロビンが挙げられる。

【０００４】しかし、フルオロカーボン乳化物は、酸素
が物理的に溶解している状態であるため、酸素を多量に
運搬するためには高濃度の酸素が必要であり、また、そ
の酸素結合率が酸素分圧に対して直線的に変化するた
め、非常に低酸素となっている細胞や組織まで酸素を運
搬到達させることは極めて困難であった。また、酸素溶
解度が限られているために酸素運搬量が少なく、このよ
うな疾患や治療法に用いられるのには適さない。

【０００５】また、ヘモグロビン化学修飾体は、ヘモグ
ロビンそのものを用いると分解して腎障害の原因となる
ため、分解を防ぐためにｃｒｏｓｓｌｉｎｋ等の化学修
飾を行って用いるものである。しかし、ヘモグロビン化
学修飾体は、ヘモグロビンを化学修飾することにより酸
素親和性が低下するため、低酸素状態の細胞や組織に到
達する前に経由する正常組織において酸素を放出してし
まう。したがって、梗塞巣やガン細胞のような極端な低
酸素状態の細胞や組織に対する酸素運搬には適していな
い。更に、溶液中のヘモグロビン化学修飾体において
は、非常に密にヘモグロビン分子が分散しているために
酸素ホッピング（ヘモグロビン分子からヘモグロビン分
子への酸素移動）が起き、末梢への循環過程において低
酸素状態の細胞や組織に到達する前に、酸素を放出して
しまうという欠点があった。

【０００６】更に、従来のリポソーム型ヘモグロビン
（例えば、特公平４−６６４５６号公報、特公平５−４
６３２７号公報、特開平５−３１０５９３号公報、特公
平８−１１７３４号公報）は、正常な酸素分圧、例え
ば、４０〜１００Ｔｏｒｒにおける酸素運搬の向上を目
的としており、これらは低酸素となっている細胞や組織
に酸素を効率的に運搬到達させることはできない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、血栓、栓塞
等で血流が阻害されたため低酸素状態となった細胞、組
織や、ガン細胞、ガン組織のような極端な低酸素状態の
細胞、組織に、選択的に酸素を輸送することができる人
工酸素運搬体を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく、ヘモグロビンを内部に取り込んだリポソー
ムからなる人工酸素運搬体について鋭意研究した結果、
ヘモグロビンと酸素との結合率が５０％となるときの酸
素分圧Ｐ₅₀を小さくすることにより、低酸素状態の細胞
や組織に選択的に酸素を輸送することができること、お
よび、リポソーム内部のｐＨを所定範囲に調節すること
により、更に必要に応じてヘモグロビンに対し所定量の
アロステリックエフェクターをリポソーム内部に含有さ
せることにより、Ｐ₅₀を調節することができることを見
出し、本発明を完成した。

【０００９】即ち、本発明は、ヘモグロビンを含有する
ｐＨ７．０〜９．０の溶液を内部に取り込んだリポソー
ムからなる人工酸素運搬体を提供する。

【００１０】ヘモグロビンと該ヘモグロビンに対してモ
ル比で０．４以下の量のアロステリックエフェクターと
を含有するｐＨ７．０〜９．０の溶液を内部に取り込ん
だリポソームからなる人工酸素運搬体であるのが好まし
い態様の一つである。

【００１１】ヘモグロビンと酸素との結合率が５０％と
なるときの酸素分圧Ｐ₅₀が、５〜２０Ｔｏｒｒであるの
が好ましい。

【００１２】前記リポソームの外表面に親水性高分子化
合物を有するのが好ましい。

【００１３】前記親水性高分子化合物が、ポリエチレン
グリコール結合リン脂質であるのが好ましい。

【００１４】低酸素状態の細胞および／または組織に酸
素を供給することに用いられるのが好ましい。

【００１５】前記低酸素状態の細胞および／または組織
が、血栓または栓塞で血流が阻害されて低酸素状態とな
った細胞および組織、ならびに、低酸素状態のガン細胞
およびガン組織のいずれか一つ以上であるのが好ましい
態様の一つである。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。初めに、人工酸素運搬体のＰ₅₀と、酸素供給部位の
酸素分圧との関係について本発明者が得た知見について
説明する。

【００１７】細胞への酸素供給量は、一般に下記式
（１）で示される。ＤＯ₂＝Ｑ×（ＣａＯ_x−ＣｖＯ_y）×Ｈｂ×４×（１／６４５００）×２２４００・・・（１）ＤＯ₂：酸素供給量（ｍｌ／ｍｉｎ）Ｑ：血流量（ｄｌ／ｍｉｎ）ＣａＯ_x：細動脈酸素分圧ｘのときの人工酸素運搬体の
酸素結合率ＣｖＯ_y：細静脈酸素分圧ｙのときの人工酸素運搬体の
酸素結合率Ｈｂ：人工酸素運搬体の血中でのヘモグロビン濃度（ｇ
／ｄｌ）式（１）から分かるように、血栓、栓塞等で血流が阻害
された場合は、血流量Ｑが減少し、その結果としてＤＯ
₂が減少するため、血栓より下流の細胞は酸素不足を来
す。

【００１８】本発明者は、組織に流れ込む血流量Ｑおよ
びヘモグロビン濃度Ｈｂが一定であると仮定すると、動
静脈酸素運搬効率較差（ＣａＯ_x−ＣｖＯ_y）のみが酸
素運搬量を決定することになることから、この動静脈酸
素運搬効率較差に注目した。そして、異なるＰ₅₀の酸素
運搬体の低酸素細胞や酸素分圧１０Ｔｏｒｒ以下である
極低酸素細胞に対する酸素供給量について、動静脈酸素
運搬効率較差（ＣａＯ _x−ＣｖＯ_y）を指標にシミュレ
ーションを行った。

【００１９】シミュレーションの結果を図１に示す。図
１には、Ｐ₅₀が、５Ｔｏｒｒ、１５Ｔｏｒｒ、２０Ｔｏ
ｒｒ（以上、人工酸素運搬体）および２６Ｔｏｒｒ（天
然の赤血球）の各酸素運搬体の酸素結合率および動静脈
酸素運搬効率較差を示した。図１から、細胞の酸素分圧
が２０Ｔｏｒｒ以上に保たれている正常細胞に対する酸
素運搬については、Ｐ₅₀が２０Ｔｏｒｒの人工酸素運搬
体および２６Ｔｏｒｒの天然の赤血球が優れていること
が分かり、Ｐ₅₀が５Ｔｏｒｒおよび１５Ｔｏｒｒの人工
酸素運搬体は、ほとんど正常細胞では酸素を放出しない
ことが分かる。一方、細胞の酸素分圧が２０Ｔｏｒｒ以
下の低酸素細胞や１０Ｔｏｒｒ以下の極低酸素細胞への
酸素運搬では、Ｐ₅₀が２０Ｔｏｒｒの人工酸素運搬体お
よび２６Ｔｏｒｒの天然の赤血球は、途中の正常細胞領
域で酸素を放出してしまうため酸素運搬効率が減少して
しまうのに対し、Ｐ₅₀が５Ｔｏｒｒおよび１５Ｔｏｒｒ
の人工酸素運搬体では効率よく、選択的に酸素を輸送で
きる可能性があることが分かった。また、ターゲットと
する低酸素細胞の酸素分圧によりＰ₅₀を１０Ｔｏｒｒ以
下とするのが有効な場合と、１０Ｔｏｒｒ以上２０Ｔｏ
ｒｒ以下とするのが有効な場合とがあることも分かっ
た。

【００２０】本発明者は、血栓、栓塞等で血流が阻害さ
れたため低酸素状態（例えば、酸素分圧２０Ｔｏｒｒ以
下）となった細胞や組織、あるいは低酸素状態のガン細
胞、ガン組織等の低酸素部位に酸素を供給するために
は、Ｐ₅₀を小さくすること、好ましくは５〜２０Ｔｏｒ
ｒとすること、より好ましくは５〜１５Ｔｏｒｒとする
ことが必要であると考えた。

【００２１】本発明者は、上記知見を基に、Ｐ₅₀を小さ
くする手法について研究した結果、ヘモグロビンを内部
に取り込んだリポソームからなる人工酸素運搬体におい
て、リポソーム内部のｐＨを７．０〜９．０に調節する
ことにより、更に必要に応じてヘモグロビンに対してモ
ル比で０．４以下の量のアロステリックエフェクターを
リポソーム内部に含有させることにより、Ｐ₅₀が好適範
囲になり、低酸素状態の細胞や組織に選択的に酸素を供
給することができることを見出し、本発明を完成したの
である。

【００２２】つぎに、本発明の人工酸素運搬体について
説明する。本発明の人工酸素運搬体は、ヘモグロビンを
含有するｐＨ７．０〜９．０の溶液を内部に取り込んだ
リポソームからなる人工酸素運搬体である。ヘモグロビ
ンと該ヘモグロビンに対してモル比で０．４以下の量の
アロステリックエフェクターとを含有するｐＨ７．０〜
９．０の溶液を内部に取り込んだリポソームからなる人
工酸素運搬体は、好ましい態様の一つである。

【００２３】ヘモグロビンは、常法に従って赤血球を溶
血させ、膜成分を除去したストローマフリーヘモグロビ
ンを用いることができる。ただし、ｐＨを調節すること
なく調製されたストローマフリーヘモグロビン溶液は、
通常、ｐＨ７．０未満となるが、後述するようにヘモグ
ロビンを含有する溶液はｐＨ７．０〜９．０であること
を要するので、ｐＨを調節して用いる必要がある。

【００２４】ヘモグロビンを含有する溶液は、ｐＨ７．
０〜９．０であることを要する。ｐＨが上記範囲より小
さいと、Ｐ₅₀が２０Ｔｏｒｒより大きくなる場合が多
い。逆に、ｐＨが上記範囲より大きいと、ヘモグロビン
の変性が起こる場合がある。ｐＨの調整には、例えば、
水酸化ナトリウム水溶液、重炭酸ナトリウム水溶液を用
いることができる。中でも、水酸化ナトリウム水溶液が
好ましい。

【００２５】ヘモグロビンを含有する溶液におけるヘモ
グロビンの濃度は、特に限定されないが、３０〜６０ｇ
／ｄｌであるのが好ましく、４０〜５０ｇ／ｄｌである
のがより好ましい。脳梗塞の治療法として、血液を希釈
することにより血液粘度を低下させ、虚血部位への酸素
供給量を向上させるという血液稀釈療法が試みられてい
るが、本発明の人工酸素運搬体の粘性は低い方がより梗
塞巣の血流量を高められる。ヘモグロビンを含有する溶
液におけるヘモグロビンの濃度を上記範囲にすると、人
工酸素運搬体の粘性を高めることなく、本発明の人工酸
素運搬体を含有させて用いる懸濁液におけるヘモグロビ
ン濃度を高めることができる。

【００２６】ヘモグロビンを含有する溶液は、ヘモグロ
ビンの他に、該ヘモグロビンに対してモル比で０．４以
下の量のアロステリックエフェクターとを含有するのが
好ましい態様の一つである。アロステリックエフェクタ
ーは、例えば、イノシトールへキサホスフェート（ＩＨ
Ｐ）、ピリドキサル−５−ホスフェート（ＰＬＰ）、
２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）が挙げられ
る。アロステリックエフェクターを含有しないでも、ｐ
Ｈの調節によりＰ₅₀を制御することはできるが、アロス
テリックエフェクターを含有させることによって、所望
のＰ₅₀の値をより自由に選択することができるようにな
る。ヘモグロビンを含有する溶液におけるアロステリッ
クエフェクターの量は、該ヘモグロビンに対してモル比
で０．４以下である。上記範囲であると、Ｐ₅₀を５〜２
０Ｔｏｒｒの範囲に調製することが容易となる。

【００２７】リポソームを形成する膜形成成分は、特に
限定されず、その安全性や生体内において安定な人工酸
素運搬体を提供するという観点から、天然または合成の
リン脂質またはその誘導体、リン脂質以外の脂質または
その誘導体、安定化剤、酸化防止剤、荷電物質等が好適
に用いられる。中でも、水素添加リン脂質が好ましい。
なお、水素添加リン脂質は、多少の不飽和結合を有する
ものであってもよい。リン脂質は、例えば、ホスファチ
ジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスフ
ァチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイ
ノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴ
ミエリンが挙げられ、水素添加リン脂質は、例えば、こ
れらを常法に従って水素添加したものが挙げられる。特
に、水素添加率が５０％以上の卵黄または大豆由来の水
素添加リン脂質が好ましい。

【００２８】また、リン脂質としては、修飾されたリン
脂質、例えば、ポリエチレングリコール結合リン脂質を
用いることもできる。このような親水性高分子化合物
は、本発明において、好適に用いられる。親水性高分子
化合物とするための修飾に用いられる化合物は、人工酸
素運搬体の構造安定を損なうものでなければ特に限定さ
れず、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラ
ン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、ス
チレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテ
ル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、
アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シ
クロデキストリン、ペクチン、カラギーナン、およびこ
れらの誘導体が挙げられる。中でも、ポリエチレングリ
コールおよびポリエチレングリコール誘導体が好まし
い。ポリエチレングリコール誘導体は、特に限定されな
いが、ポリエチレングリコール鎖とジアシルグリセロー
ルを１分子内に有する化合物であるのが好ましい。

【００２９】ポリエチレングリコール結合リン脂質は、
リン脂質の親水部（極性頭部）にポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を共有結合した構造の分子であり、一分子
中に１または２以上のＰＥＧ鎖を含有する。本発明の目
的のためには、リポソームが血液中においてタンパク等
と結合し凝集したり、細網内系への取り込みにより血流
中から早期に排除されたりするのは好ましくないため、
ＰＥＧ結合リン脂質のＰＥＧ鎖長は、平均重合度で５〜
１０００モルであるのが好ましく、４０〜２００モルで
あるのがより好ましい。上記範囲より短い場合は、人工
酸素運搬体が血液中で擬集しやすくなり、上記範囲より
長い場合は、ＰＥＧ結合リン脂質の水溶性が高まり、リ
ポソーム膜中に固定されにくくなる。

【００３０】上述したような各種のリン脂質は、２種以
上を併用することもできる。

【００３１】修飾されたリン脂質の配合量は、その分子
量や添加方法にもよるが、全膜形成成分に対して、０．
２〜５モル％であるのが好ましい。

【００３２】安定化剤は、例えば、膜流動性を低下させ
るコレステロール、コレスタノール等のステロール；グ
リセロール、シュクロース等の糖類が挙げられる。酸化
防止剤は、例えば、トコフェロール同族体、即ち、ビタ
ミンＥが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ
およびδの４個の異性体が存在するが、本発明にはいず
れも用いることができる。荷電物質は、例えば、ホスフ
ァチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ジセチルホ
スフェート、脂肪酸が挙げられる。

【００３３】リポソームの膜は、上記膜形成成分の１種
または２種以上から構成される。

【００３４】本発明の人工酸素運搬体は、リポソームの
外表面に親水性高分子化合物を有するものであるのが好
ましい。中でも、リポソームの外表面にポリエチレング
リコール結合リン脂質を有するものであるのが好まし
い。リポソーム表面をＰＥＧ等の化合物により修飾する
には、様々な手法が挙げられ特に限定されないが、ＰＥ
Ｇ等の化合物をリン脂質、長鎖脂肪族アルコール、ステ
ロール、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂
肪酸エステル等の疎水性化合物と結合させて、親水性高
分子化合物とし、その疎水性化合物の部分を担体表面へ
挿入する方式が好ましい。親水性高分子化合物として
は、上述したようなポリエチレングリコール結合リン脂
質を用いるのが好ましい。

【００３５】本発明においては、そのような化合物以外
の表面修飾剤を併用することもできる。例えば、グルク
ロン酸、シアル酸等の水溶性多糖類が挙げられる。

【００３６】リポソームの大きさは、粒子径（外径）が
１００〜３００ｎｍであるのが好ましい。本発明の人工
酸素運搬体を血栓、栓塞等に起因する血流障害により生
じる低酸素状態の細胞や組織に酸素を供給するために用
いる場合には、血栓、栓塞等による狭窄部位を通過する
ことができることが必要である。狭窄部位においては、
赤血球はその大きさから通過することが困難となるた
め、狭窄部位の下流にある脳細胞は酸素不足を来し、こ
れにより乳酸が放出されて酸性が強くなり、これにより
血管狭窄が強まり、赤血球はますます通過しにくくなる
という循環が起こる。したがって、本発明の人工酸素運
搬体は、狭窄部位を多量に通過させる必要があり、その
ためにはリポソームの粒子径は小さいほどよい。しか
し、リポソームの粒子径が１００ｎｍ未満であると、リ
ポソームが含有することができるヘモグロビンの量が少
なくなる。また、リポソームの粒子径が３００ｎｍを超
えると毛細血管を閉塞させる可能性があり、細網内系へ
の取り込み量も多くなる。よって、リポソームの粒子径
は上記範囲であるのが好ましい。また、本発明の人工酸
素運搬体をガン細胞、ガン組織等の治療に用いる場合に
は、ガン組織内血管では内皮細胞間の間隙が正常血管よ
り広く、粒子径が３００ｎｍ以下であると本発明の人工
酸素運搬体が血管外に移行しやすいが、粒子径が１００
ｎｍ未満であると他の正常組織においても血管外への分
布が起きやすくなる。したがって、リポソームの粒子径
を１００〜３００ｎｍに制御することにより、本発明の
人工酸素運搬体のガン組織へのターゲッティングも達成
される。

【００３７】本発明の人工酸素運搬体は、上述した酸素
運搬効率の観点から、ヘモグロビンと酸素との結合率が
５０％となるときの酸素分圧Ｐ₅₀が、５〜２０Ｔｏｒｒ
であるのが好ましく、５〜１５Ｔｏｒｒであるのがより
好ましい。更には、酸素分圧が１０〜２０Ｔｏｒｒであ
る低酸素状態の細胞や組織に酸素を供給するために用い
る場合には、Ｐ₅₀が１０〜２０Ｔｏｒｒであるのが好ま
しく、酸素分圧が１０Ｔｏｒｒ以下である超低酸素状態
の細胞や組織に酸素を供給するために用いる場合には、
Ｐ₅₀が５〜１５Ｔｏｒｒであるのが好ましい。

【００３８】本発明の人工酸素運搬体は、常法によって
容易に得ることができる。その一例を以下に示す。生理
食塩水で洗浄した赤血球に蒸留水を加えて溶血して、ヘ
モグロビン濃度が約５ｇ／ｄｌになるように調製し、遠
心分離により赤血球を除去する。このヘモグロビン溶液
をヘモグロビン濃度が約４５ｇ／ｄｌになるように、ダ
イアライザーによって濃縮する。この濃縮ヘモグロビン
溶液に０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ
７．６になるまで添加し、ｐＨ７．６の約４５ｇ／ｄｌ
ヘモグロビン溶液を得る。このｐＨ調整後のヘモグロビ
ン溶液にイノシトールヘキサホスフェート（ＩＨＰ）を
ヘモグロビンとのモル比で０．１となるように添加す
る。別に、水素添加大豆レシチン、コレステロールおよ
びミリスチン酸の均一混合脂質粉末５０ｇに蒸留水５０
ｇを加えて、８０℃で３０分間、水和処理を行う。ＩＨ
Ｐを含有するヘモグロビン溶液２００ｇを上記で得られ
た水和脂質に添加し、高速かくはん機に投入してかくは
ん処理を行い、リポソームの懸濁液を得る。得られたリ
ポソームの懸濁液を生理食塩水で１０倍に希釈して、高
速遠心機により遠心分離し、リポソームに取り込まれな
かったヘモグロビンおよび微小粒子を除去する。更に、
上澄みにヘモグロビンが検出されなくなるまで生理食塩
水で遠心洗浄を繰り返し行い、その後、０．４５μｍの
フィルターを用いてろ過滅菌および粒子径制御を行う。
最終的に、リポソーム懸濁液全体に対するヘモグロビン
の濃度が６ｇ／ｄｌになるように限外ろ過膜により、リ
ポソーム懸濁液を濃縮する。その後、ポリエチレングリ
コール結合リン脂質を０．２ｇ／ｄｌになるようにリポ
ソーム懸濁液に添加し、３７℃で３０分間、インキュベ
ーションを行って、リポソーム表面をＰＥＧ修飾して、
人工酸素運搬体を得ることができる。

【００３９】本発明の人工酸素運搬体は、その用途を特
に限定されないが、正常細胞および／または正常組織に
対して酸素を放出することなく、低酸素状態の細胞およ
び／または組織に対して選択的に酸素を放出することが
できるので、低酸素状態の細胞および／または組織に酸
素を供給するために用いることができる。特に、血栓ま
たは栓塞で血流が阻害されて低酸素状態となった細胞お
よび組織、ならびに、低酸素状態のガン細胞およびガン
組織のいずれか一つ以上に酸素を供給するために好適に
用いられる。

【００４０】

【実施例】以下に実施例を示して本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限られるものではない。１．各種人工酸素運搬体の調製（実験例１）生理食塩水で洗浄した赤血球に蒸留水を加
えて溶血してヘモグロビン濃度が約５ｇ／ｄｌになるよ
うに調製し、遠心分離にて赤血球膜を除去した。赤血球
膜を除去して得られたヘモグロビン溶液をヘモグロビン
濃度が約４５ｇ／ｄｌになるように、ダイアライザー
（テルモ社製）にて濃縮した。濃縮後のヘモグロビン溶
液のｐＨは６．８であった。濃縮後のヘモグロビン溶液
に０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ７．
６になるまで添加し、ｐＨ７．６の約４５ｇ／ｄｌヘモ
グロビン溶液を得た。ｐＨ調整後のヘモグロビン溶液
に、イノシトールへキサホスフェート（ＩＨＰ）をヘモ
グロビンとのモル比で０（添加せず）、０．１、０．
２、１．０となるように添加した。ＩＨＰの添加による
ｐＨの変動はなかった。

【００４１】別に、水素添加大豆レシチン、コレステロ
ールおよびミリスチン酸の均一混合脂質粉末５０ｇに蒸
留水５０ｇを加えて、８０℃で３０分間、水和処理を行
った。異なる濃度でＩＨＰを含有するヘモグロビン溶液
２００ｇを上記で得られた水和脂質にそれぞれ添加し、
高速かくはん機（ワーリングブレンダー、ワーリング社
製）に投入してかくはん処理を行い、リポソームの懸濁
液を得た。得られたリポソームの懸濁液を生理食塩水で
１０倍に希釈して、高速遠心機により遠心分離し、リポ
ソームに取り込まれなかったヘモグロビンおよび微小粒
子を除去した。更に、上澄みにヘモグロビンが検出され
なくなるまで生理食塩水で遠心洗浄を繰り返し行い、そ
の後、０．４５μｍのフィルターを用いてろ過滅菌およ
び粒子径制御を行った。最終的に、リポソーム懸濁液全
体に対するヘモグロビンの濃度が６ｇ／ｄｌになるよう
に限外ろ過膜により、リポソーム懸濁液を濃縮した。そ
の後、ポリエチレングリコール結合リン脂質（ＰＥＧ鎖
の平均分子量５０００）を０．２ｇ／ｄｌになるように
リポソーム懸濁液に添加し、３７℃で３０分間、インキ
ュベーションを行って、リポソーム表面をＰＥＧ修飾し
て、各人工酸素運搬体を得た。

【００４２】（実験例２）実験例１と同様の方法によ
り、ｐＨ６．８の濃縮後のヘモグロビン溶液を得た。濃
縮後のヘモグロビン溶液に０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナト
リウム水溶液をｐＨ７．０になるまで添加し、ｐＨ７．
０の約４５ｇ／ｄｌヘモグロビン溶液を得た。ｐＨ調整
後のヘモグロビン溶液に、ピリドキサル−５−ホスフェ
ート（ＰＬＰ）をヘモグロビンとのモル比で０（添加せ
ず）、０．２、０．４となるように添加した。ＰＬＰの
添加によるｐＨの変動はなかった。ＩＨＰを含有するヘ
モグロビン溶液２００ｇの代わりに、ＰＬＰを含有する
ヘモグロビン溶液２００ｇを用いた以外は、実験例１と
同様の方法により、各人工酸素運搬体を得た。

【００４３】（実験例３）実験例１と同様の方法によ
り、ｐＨ６．８の濃縮後のヘモグロビン溶液を得た。濃
縮後のヘモグロビン溶液に０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナト
リウム水溶液をｐＨ７．４になるまで添加し、ｐＨ７．
４の約４５ｇ／ｄｌヘモグロビン溶液を得た。ｐＨ調整
後のヘモグロビン溶液に、２，３−ジホスホグリセレー
ト（ＤＰＧ）をヘモグロビンとのモル比で０（添加せ
ず）、０．２、０．４となるように添加した。ＤＰＧの
添加によるｐＨの変動はなかった。ＩＨＰを含有するヘ
モグロビン溶液２００ｇの代わりに、ＤＰＧを含有する
ヘモグロビン溶液２００ｇを用いた以外は、実験例１と
同様の方法により、各人工酸素運搬体を得た。

【００４４】（実験例４）実験例１と同様の方法によ
り、ｐＨ６．８の濃縮後のヘモグロビン溶液を得た。濃
縮後のヘモグロビン溶液に０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナト
リウム水溶液をｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０に
なるまで添加し、ｐＨ６．８（添加せず）、ｐＨ７．
０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０の約４５ｇ／ｄｌヘモグロ
ビン溶液を得た。ＩＨＰを含有するヘモグロビン溶液２
００ｇの代わりに、上記の各ヘモグロビン溶液２００ｇ
を用いた以外は、実験例１と同様の方法により、各人工
酸素運搬体を得た。

【００４５】（実験例５）Ｓ．ｓｙｎｄｅｒ，Ｅ．Ｗｉ
ｌｌｙ，Ｒ．Ｗａｌｄｅｒ，Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，
Ｊ．Ｗａｌｄｅｒ，ＨｂＸＬ９９ α：Ａｈｅｍｏｇ
ｌｏｂｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｔｈａｔｉｓ
ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ α
ｓｕｂｕｎｉｔｓｉｓｕｓｅｆｕｌａｓａ
ｂｌｏｏｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｕ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７２８０−４，
１９８７に準拠して、α−α ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ
ヘモグロビンを合成した。詳細を下記に示す。生理食塩
水で洗浄した赤血球に蒸留水を加えて溶血してヘモグロ
ビン濃度が５ｇ／ｄｌになるよう調製し、遠心分離にて
赤血球膜を除去した。赤血球膜を除去して得られたヘモ
グロビン溶液に、ｐＨ７．２の０．２ｍｏｌ／ｌトリス
バッファーをヘモグロビン濃度が１ｍｍｏｌ／ｌになる
ように加え、窒素ガスをバブリングし、完全に脱酸素化
した。これにｂｉｓ−（３，５−ｄｉｂｒｏｍｏｓａｌ
ｉｃｙｌ）−ｆｕｍａｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を
１．５ｍｍｏｌ／ｌになるように加え、窒素バブリング
しながら３７℃で、２時間反応させた。ここにグリシン
を１ｍｏｌ／ｌとなるように加え、未反応のｂｉｓ−
（３，５−ｄｉｂｒｏｍｏｓａｌｉｃｙｌ）−ｆｕｍａ
ｒａｔｅと反応させた。このヘモグロビン溶液を．ｐＨ
８．０の０．２ｍｏｌ／ｌグリシン溶液にて一昼夜透析
した後、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムにてＨｂ
ＸＬ９９αを分離した。このＨｂＸＬ９９αのｃｒｏｓ
ｓｌｉｎｋ率は９９％以上であった。

【００４６】２．ヘモグロビンと酸素との結合率が５０
％となるときの酸素分圧Ｐ₅₀の測定上記で得られた各種人工酸素運搬体を１５０ｍｍｏｌ／
ｌリン酸バッファー（ｐＨ７．４ａｔ３７℃）によ
り、ヘモグロビン濃度が２０ｍｍｏｌ／ｌとなるように
希釈した後、異なる酸素分圧（それぞれ７１３、２８
５、９３、５７、４７、３８、２９、２１、１５、９．
８、４．９、０Ｔｏｒｒ）のガスを３７℃で一定時間バ
ブリングした後に分光光度計（ＭＰＳ２０００、島津社
製）を用い、波長５７６ｎｍの光の吸光度を測定した。
下記式により、各酸素分圧ｘにおける酸素飽和度Ｙを算
出した。Ｙ＝（Ａｘ−Ａ０）／（Ａ７１３−Ａ０）×１００
（％）Ａｘ：酸素分圧ｘＴｏｒｒにおける吸光度Ａ０：酸素分圧０Ｔｏｒｒにおける吸光度Ａ７１３：酸素分圧７１３Ｔｏｒｒにおける吸光度ここから各酸素分圧ｘをＸ軸、酸素飽和度ＹをＹ軸とし
てプロットし、酸素解離曲線を作成した。各人工酸素運
搬体について、得られた酸素解離曲線から、Ｙ＝５０％
となる酸素分圧（Ｐ₅₀）を求めた。なお、実験例５の人
工酸素運搬体においては、ＨｂＸＬ９９αの他に、ｃｒ
ｏｓｓｌｉｎｋ前のＨｂＡ（赤血球から取り出したＨｂ
＝Ｎａｔｉｖｅ．Ｈｂ）についてもＰ₅₀を求めた。

【００４７】各人工酸素運搬体のＰ₅₀を第１表および第
２表に示す。本発明の人工酸素運搬体（実施例１〜１
２）は、リポソームの内部に、ヘモグロビンと、更に必
要に応じて該ヘモグロビンに対してモル比で０．４以下
の量のアロステリックエフェクターとを含有するｐＨ
７．０〜９．０の溶液を取り込んでいるので、Ｐ₅₀が従
来のリポソーム型ヘモグロビンよりも低く、好ましくは
５〜２０Ｔｏｒｒであり、より好ましくは５〜１５Ｔｏ
ｒｒであることが分かる。これに対し、アロステリック
エフェクターの添加量がヘモグロビンに対してモル比で
０．４よりも多い場合（比較例１）は、Ｐ₅₀が大きくな
りすぎる。また、リポソーム内部の溶液がｐＨ７．０〜
９．０の範囲にない場合は、アロステリックエフェクタ
ーを添加しないときでもＰ₅₀が２１Ｔｏｒｒとなるので
（比較例２）、Ｐ₅₀をこれより小さく制御することはで
きない。

【００４８】また、比較例３は、Ｐ₅₀が１２Ｔｏｒｒで
あるが、この人工酸素運搬体は、生体中で４量体から２
量体への乖離が起こり、腎より速やかに排出され、腎毒
性を引き起こすことが知られており、このような生体投
与する薬剤としては好ましくない。４量体から２量体の
乖離を抑えるために完全にｃｒｏｓｓｌｉｎｋ等を行う
とヘモグロビン分子の構造変化を抑えるために、Ｐ₅₀が
大きくなる（比較例４）。

【００４９】

【表１】

【００５０】

【表２】

【００５１】３．低酸素状態の細胞および／または組織
に対する酸素供給能の評価つぎに、実施例２および１２ならびに比較例１および４
の人工酸素運搬体について、低酸素状態の細胞および／
または組織に対する酸素供給能を動物実験により評価し
た。ＭａｌｅＷｉｓｔｅｒＲａｔ（ｂｏｄｙｗｅ
ｉｇｈｔ２３０〜２６０ｇ）をペントバルビタール麻
酔下で気管切開し、ベンチレーターに接続して呼吸管理
した。大腿動静脈にカニュレーションし、脱送血ライン
を確保した。実施例２（Ｐ₅₀＝１８Ｔｏｒｒ）および実
施例１２（Ｐ₅₀＝５Ｔｏｒｒ）ならびに比較例１（Ｐ₅₀
＝５０Ｔｏｒｒ）および比較例４（Ｐ₅₀＝２９Ｔｏｒ
ｒ）の人工酸素運搬体を用いて、このＲａｔの血液交換
を行い、８５％の血液を各人工酸素運搬体に交換した。
その後、呼吸器の酸素含量を１００％から徐々に下げ０
％になるまで脳のチトクロームオキシダーゼの酸素化率
を近赤外分光法により測定した。

【００５２】チトクロームオキシダーゼの酸素化率は、
Ｙ．Ｈｏｓｈｉ，Ｏ．Ｈａｚｅｋｉ，Ｙ．Ｋａｋｉｈａ
ｒａ，Ｍ．Ｔａｍｕｒａ，Ｒｅｄｏｘｂｅｈａｖｉｏ
ｒｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｏｘｉｄａｓｅｉｎ
ｔｈｅｒａｔｂｒａｉｎｍｅａｓｕｒｅｄｂ
ｙｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｏｒｏｓ
ｃｏｐｙ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８３
（６）：１８４１−８，１９９７の方法に従い、ラット
の口の中の上あごの部分に光ファイバーを入れ、頭頂部
に向かって波長７００ｎｍ、７３０ｎｍ、７５０ｎｍお
よび８０５ｎｍの光をそれぞれ発射し、頭頂部につけた
光電子倍増管により透過光強度を測定し、下記式により
還元型チトクロームオキシダーゼの量から算出した。（チトクロームオキシダーゼの酸素化率）＝１−（還元
型チトクロームオキシダーゼ）ただし、ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｃｙｔ．Ｏｘｉ．（還元型チトクロー
ムオキシダーゼ）＝−１．６７６Ａ₇₀₀＋０．７Ａ₇₃₀
＋１．９７６Ａ₇₅₀−Ａ₈₀₅ Ａ₇₀₀：波長７００ｎｍの光の吸光度Ａ₇₃₀：波長７３０ｎｍの光の吸光度Ａ₇₅₀：波長７５０ｎｍの光の吸光度Ａ₈₀₅：波長８０５ｎｍの光の吸光度である。

【００５３】また、左頚動脈より血液を採取し、ガスオ
キシメーター（ＡＢＬ３０、ラジオメーター社製）によ
り酸素分圧（ＰａＯ₂）を測定した。

【００５４】結果を図２に示す。図２には、呼吸器の酸
素含量を下げていったときのＰａＯ₂に対するチトクロ
ームオキシダーゼの酸素化率をプロットした。ここで、
上述した式（１）を再度示す。ＤＯ₂＝Ｑ×（ＣａＯ_x−ＣｖＯ_y）×Ｈｂ×４×（１／６４５００）×２２４００・・・（１）ＤＯ₂：酸素供給量（ｍｌ／ｍｉｎ）Ｑ：血流量（ｄｌ／ｍｉｎ）ＣａＯ_x：細動脈酸素分圧ｘのときの人工酸素運搬体の
酸素結合率ＣｖＯ_y：細静脈酸素分圧ｙのときの人工酸素運搬体の
酸素結合率Ｈｂ：人工酸素運搬体の血中でのヘモグロビン濃度（ｇ
／ｄｌ）

【００５５】実際の脳の虚血においては、血栓、栓塞等
により血流量Ｑが減少し、結果としてＤＯ₂の減少が起
こり、その血栓、栓塞部位等より下流にある脳細胞は酸
素不足を来す。この評価系は、脳に血栓等の血流障害を
作り脳の虚血を再現するのではなく、血流量Ｑは一定に
保ち、ラットに酸素含量の低い酸素を呼吸させること
で、上記式（１）のＣａＯ_xを減少させ、結果としてＤ
Ｏ₂を減少させたものであり、血流量Ｑを減少させるの
と同様の効果が擬似的に得られる。チトクロームオキシ
ダーゼは呼吸鎖の最終反応の酵素であり、チトクローム
オキシダーゼが還元型になることは細胞が酸素不足であ
ることを表している。図２に示した結果から、本発明実
施例の人工酸素運搬体により８５％の血液を交換したラ
ットにおいては、ＰａＯ₂が２０Ｔｏｒｒ以下の低酸素
状態の細胞および／または組織に対して、チトクローム
オキシダーゼの酸素化率を比較例の人工酸素運搬体より
も明らかに高く保つことが可能であることが分かる。し
たがって、本発明の人工酸素運搬体は、低酸素状態とな
った細胞や組織に選択的に酸素を運搬することが可能で
あることが分かる。

【００５６】

【発明の効果】本発明の人工酸素運搬体は、正常細胞、
正常組織に対して酸素を放出することなく、血栓、栓塞
等で血流が阻害されたため低酸素状態となった細胞、組
織や、ガン細胞、ガン組織のような極端な低酸素状態の
細胞、組織に、選択的に酸素を輸送することができるの
で、極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】異なるＰ₅₀の酸素運搬体の酸素結合率および
動静脈酸素運搬効率較差を示す図である。

【図２】異なるＰ₅₀の人工酸素運搬体の酸素供給能を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/805 Ａ６１Ｋ 37/14 (72)発明者木村哲寛神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地テルモ株式会社内Ｆターム(参考） 4C076 AA19 BB18 CC14 DD15 DD63 EE23 FF63 FF66 4C084 AA02 BA44 CA36 MA38 MA66 NA10 ZA511 4H045 AA30 BA10 CA42 EA20 FA71 GA10 GA15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘモグロビンを含有するｐＨ７．０〜９．
０の溶液を内部に取り込んだリポソームからなる人工酸
素運搬体。
【請求項２】ヘモグロビンと該ヘモグロビンに対してモ
ル比で０．４以下の量のアロステリックエフェクターと
を含有するｐＨ７．０〜９．０の溶液を内部に取り込ん
だリポソームからなる請求項１に記載の人工酸素運搬
体。
【請求項３】ヘモグロビンと酸素との結合率が５０％と
なるときの酸素分圧Ｐ₅₀が、５〜２０Ｔｏｒｒである請
求項１または２に記載の人工酸素運搬体。
【請求項４】前記リポソームの外表面に親水性高分子化
合物を有する請求項１〜３のいずれかに記載の人工酸素
運搬体。
【請求項５】前記親水性高分子化合物が、ポリエチレン
グリコール結合リン脂質である請求項４に記載の人工酸
素運搬体。
【請求項６】低酸素状態の細胞および／または組織に酸
素を供給することを特徴とする請求項１〜５のいずれか
に記載の人工酸素運搬体。
【請求項７】前記低酸素状態の細胞および／または組織
が、血栓または栓塞で血流が阻害されて低酸素状態とな
った細胞および組織、ならびに、低酸素状態のガン細胞
およびガン組織のいずれか一つ以上である請求項６に記
載の人工酸素運搬体。