CN113332261A - 铁蛋白包载药物及其制备方法 - Google Patents

铁蛋白包载药物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113332261A
CN113332261A CN202110543102.8A CN202110543102A CN113332261A CN 113332261 A CN113332261 A CN 113332261A CN 202110543102 A CN202110543102 A CN 202110543102A CN 113332261 A CN113332261 A CN 113332261A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ferritin
leu
glu
drug
asp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110543102.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113332261B (zh
Inventor
丁会
姚德惠
柯天一
张西东
檀琳
劳芳
李彦良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Science Xinyun Biotechnology Beijing Co ltd
Original Assignee
China Science Xinyun Biotechnology Beijing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Science Xinyun Biotechnology Beijing Co ltd filed Critical China Science Xinyun Biotechnology Beijing Co ltd
Priority to CN202110543102.8A priority Critical patent/CN113332261B/zh
Publication of CN113332261A publication Critical patent/CN113332261A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113332261B publication Critical patent/CN113332261B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本公开涉及一种铁蛋白包载药物及其制备方法。所述铁蛋白包载药物由铁蛋白包载药物反应体系孵育制成，其中所述铁蛋白包载药物反应体系包括：药物、铁蛋白和缓冲液，其中，所述缓冲液为Tris‑HCl缓冲液。本公开的包药方法为生理条件，不会导致笼状蛋白变性，颗粒均一，不会引起笼状蛋白缺损；本公开的包药方法经过多次优化，包载量大，纯度高。本公开包载获得的药物均一性好，稳定性强。

Description

铁蛋白包载药物及其制备方法
技术领域
本公开涉及生物医药领域，特别涉及一种纳米载药系统包载药物及其制备方法。
背景技术
铁蛋白是一类广泛存在于动物、植物及微生物中的天然铁贮存蛋白。铁蛋白分子量500KD，外壳由24个亚基自组装形成蛋白质外壳，不同脏器组织中的铁蛋白由不同比例H亚基和L亚基构成，每两个亚基反向平行形成一组，构成一个近似正八面体，成4-3-2重轴对称中空的球状分子，每个铁蛋白分子形成12个二重轴通道、8个三重轴通道和6个四重轴通道。内包铁内核。蛋白外壳外径12nm，内径8nm，铁内核的主要成分为水铁矿(5Fe2O3·9H2O)。
由于铁蛋白自身独特的球形空壳结构、小尺寸和可逆自组装特性，且铁蛋白的H亚基具备与转铁蛋白受体(Tfr-1)结合的主动靶向能力，因此现有技术中通过基因重组方法制备重组铁蛋白用于作为多种药物的载体。其中，将药物包载于重组铁蛋白内腔中是铁蛋白作为纳米药物载体的一种重要方式。
相较于其它蛋白，铁蛋白非常稳定，pH3.4-10范围内笼状结构稳定，且可耐高温(70℃)，耐受多种变性剂(细菌生产人铁蛋白的新功能及应用，范克龙等，微生物学通报，Mar.20，2014，41(3)：520-538)。因此，目前文献报道的铁蛋白包载药物方式多是利用强变性剂(高浓度脲、盐酸胍)或在极端pH条件下(pH为2.0左右)将铁蛋白亚基解聚，而后再恢复温和生理条件使得解聚的亚基重组装成笼状蛋白，以达到包载药物的目的(CN111150063A)。
上述的包载药物方法条件变化剧烈，加入变性剂或者从极端酸性/碱性到中性阶段的pH变化可能会影响药物分子的理化性质、改变其结构，从而影响其生物活性，不适用于那些对极端环境不耐受的药物类型，从而限制了包载药物的种类。与此同时，依赖于解聚和重组装的极端包载条件也可能造成部分铁蛋白不能够完成重组装，从而产生变性蛋白杂质；或因重组装不完全导致蛋白笼缺损，药物无法有效包载，使得载药量低，杂质难以控制，产物不均一且不稳定，影响药物的安全性和有效性。
因此，需要寻求一种新的铁蛋白包载方法，其能够以温和的方式实现药物包载，提高包载效率，减少包载后的杂质和缺损蛋白，以达到成药应用的目的。
发明内容
本公开要解决的技术问题是为了克服现有铁蛋白包载方法存在的包载方法剧烈、包载后缺损蛋白多、包载后药物活性改变等问题。
本发明人为解决上述技术问题，采用一种生理条件下的包药方法，将以铁蛋白为代表的笼状蛋白与待包载药物孵育于包含特定组分的包载溶液中，孵育一段时间，此时，药物进入笼状蛋白内腔，从而实现铁蛋白包载药物。
该包载方式与现有技术中笼状蛋白使用的变性-复性方式、笼状蛋白亚基解聚-重聚合方式、以及让药物分子在溶液中自由扩散方式全然不同，其不涉及笼状蛋白亚基的解聚或破坏笼状蛋白的天然结构，而是以一种温和的方式进行包载。且对影响包药的多个因素进行了反复的多次优化，包括尝试不同的添加剂和辅料，以及比较优化包载温度、原料配比、缓冲体系等各种参数具体条件，经过大量的比较实验，确定了优化的包载条件，通过本公开的包载方式获得的铁蛋白纳米药物与其他包载方式相比，包载量大幅度提高，药物单体比例更高，更稳定。
具体来说，本公开提出了如下技术方案：
在一方面，本公开提供了一种铁蛋白包载药物反应体系，其包括：药物、铁蛋白和缓冲液，其中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
在一方面，本公开提供了由所述铁蛋白包载药物反应体系孵育制成的铁蛋白包载药物。
在一方面，本公开提供了一种制备所述铁蛋白包载药物的方法。
本公开的有益效果包括：
(1)本公开的包药方法为生理条件，不会导致笼状蛋白变性，颗粒均一，不会引起笼状蛋白缺损；
(2)本公开的包药方法经过多次优化，包载量大，纯度高。
(3)本公开包载获得的药物均一性好，稳定性强。
附图说明
图1为HFn-DOX弱酸工艺包载后DOX纯度UPLC-RP检测结果。
图2为表6中样品5包载后DOX纯度UPLC-RP检测结果。
图3为pH 8.0 20min样品包载后DOX纯度UPLC-RP检测结果。
图4为Glu为辅料时HFn-DOX的UPLC-RP图谱。
图5为非Glu为辅料时HFn-DOX的UPLC-RP图谱。
图6示出了铁蛋白包载药物的抗肿瘤活性。
具体实施方式
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
术语“铁蛋白包载药物反应体系”是指在缓冲液中，通过孵育使铁蛋白包载药物的体系，所述体系包含铁蛋白、药物和缓冲液。在本公开的一个实施方案中，所述药物为多柔比星(DOX)。
术语“铁蛋白”是指由蛋白外壳和铁内核两部分构成的储铁结构。天然情况下，铁蛋白的蛋白外壳是通常由24个亚基自组装形成的笼状蛋白结构(外径约12nm，内径约8nm)，而铁内核的主要成分为水铁矿。不含铁内核的铁蛋白的蛋白外壳也称为“去铁蛋白”。本文所述“铁蛋白”包括真核生物铁蛋白和原核生物铁蛋白，优选真核生物铁蛋白，更优选哺乳动物铁蛋白，例如人铁蛋白。真核生物铁蛋白通常包括重链铁蛋白单体亚基(H，21kDa)和轻链铁蛋白单体亚基(L，19kDa)。H亚基负责Fe(II)氧化成Fe(III)并包括催化性铁氧化酶位点，而L亚基在铁成核中发挥作用。H和L亚基共同组装成24聚体的杂聚体铁蛋白。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。然而，通过重组方式，也可以获得仅由H亚基组装成的“重链铁蛋白”或“H铁蛋白”(下文缩写为“HFn”)或仅由L亚基组装成的“轻链铁蛋白”或“L铁蛋白”(下文缩写为“LFn”)。
此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖不包含该甲硫氨酸的序列。
此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖不包含该甲硫氨酸的序列。
术语“人重链铁蛋白”(下文缩写为“人HFn”)是指仅由人铁蛋白的重链单体亚基组装成的铁蛋白。“人轻链铁蛋白”(下文缩写为“人LFn”)是指仅由人铁蛋白的轻链单体亚基组装成的铁蛋白。
在一方面，本公开提供了一种铁蛋白包载药物反应体系，其包括：药物、铁蛋白和缓冲液，其中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
在一些实施方案中，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含辅料。
在一些实施方案中，所述辅料选自葡萄糖、蔗糖、甘油、海藻糖或山梨醇。
在一些实施方案中，所述辅料选自蔗糖、甘油、海藻糖或山梨醇。
在一些实施方案中，所述辅料为蔗糖。
在一些实施方案中，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含添加剂。
在一些实施方案中，所述添加剂选自氯化铵、甲醇、乙醇、丝氨酸、酪氨酸和苯甲酸中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述添加剂选自氯化铵、甲醇、乙醇、丝氨酸和苯甲酸中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂选自硫代硫酸钠、DTT、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和硼氢化钠。
在一些实施方案中，所述铁蛋白是野生型铁蛋白或突变型铁蛋白。
在一些实施方案中，所述铁蛋白由铁蛋白单体亚基组装而成。
在一些实施方案中，所述铁蛋白单体亚基选自重链铁蛋白单体亚基和/或轻链铁蛋白单体亚基。
在一些实施方案中，所述铁蛋白单体亚基是来源于哺乳动物来源的铁蛋白、两栖类动物来源的铁蛋白、细菌来源的铁蛋白或植物来源的铁蛋白中的任意一种或至少两种组合的铁蛋白单体亚基，优选为哺乳动物来源或细菌来源的铁蛋白单体亚基。
在一些实施方案中，所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
在一些实施方案中，所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白、大肠杆菌铁蛋白或激烈火球菌铁蛋白。
在一些实施方案中，所述铁蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合。
在一些实施方案中，所述铁蛋白选自野生型铁蛋白或突变型铁蛋白。在一些实施方案中，突变型铁蛋白包括相对于野生型铁蛋白H亚基，包含在对应于SEQ ID NO：1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸取代获得的突变体。在对应于SEQ ID NO：1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸取代将会增加铁蛋白的亲水性，减少其聚集，有利于铁蛋白载带药物。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO：1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸例如带羧基侧链的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述带羧基侧链的氨基酸包括谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，也称作N98D取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代，也称作K108E取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被组氨酸(H)取代，也称作R156H取代。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，且在对应于SEQ ID NO：1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，在对应于SEQ ID NO：1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代，且在对应于SEQ ID NO：1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被组氨酸(H)取代。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽包含在对应于SEQ ID NO：1的第27位、第61位、第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代。不受任何理论限制，根据之前的研究结果，据认为在对应于SEQ ID NO：1的第27位、第61位、第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代可以降低所形成的铁蛋白的储铁能力，从而使得所述铁蛋白在用作药物载体时具有更高的安全性。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第27位的位置处的谷氨酸(E)被取代为苯丙氨酸(F)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ IDNO：1的第61位的位置处的谷氨酸(E)被取代为色氨酸(W)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(E)被取代为赖氨酸(K)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(H)被取代为甘氨酸(G)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQID NO：1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(E)被取代为赖氨酸(K)，且在对应于SEQID NO：1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(H)被取代为甘氨酸(G)。
野生型人铁蛋白H亚基上有3个巯基，分别位于第2-3段α螺旋之间的Loop区(野生型人铁蛋白H亚基第90位半胱氨酸的巯基)，第3段α螺旋上(野生型人铁蛋白H亚基第102位半胱氨酸的巯基)，第4段α螺旋近三重对称轴区(野生型人铁蛋白H亚基第130位半胱氨酸的巯基)。然而，在缀合过程中，若存在多个反应位点，则无法控制缀合的具体位置、以及功能性分子与HFn的反应比例。
因此，在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽包含减少的半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第90位、第102位、和第130位的位置处的半胱氨酸的至少一个被取代。在一些实施方案中，所述半胱氨酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、甘氨酸，优选被丝氨酸或被野生型铁蛋白轻链(L)亚基多肽相应位置处的氨基酸取代。
例如，所述铁蛋白H亚基突变体多肽包含在对应于SEQ ID NO：1的第27位、第61位、第62位、和/或第65位的位置处的氨基酸取代，且在对应于SEQ ID NO：1的第90位、第102位、和第130位的位置处包含除半胱氨酸之外的氨基酸残基；优选其中在对应于SEQ ID NO：1的第27位的位置处的氨基酸被取代为苯丙氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第61位的位置处的氨基酸被取代为色氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第62位的位置处的氨基酸被取代为赖氨酸，和/或在对应于SEQ ID NO：1的第65位的位置处的氨基酸被取代为甘氨酸；在对应于SEQID NO：1的第90位、第102位和第130位的位置处包含除半胱氨酸之外的亲水氨基酸，优选丝氨酸。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ IDNO：1的第90位的位置处包含半胱氨酸，和
在对应于SEQ ID NO：1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代，
任选地，在对应于SEQ ID NO：1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ IDNO：1的第102位的位置处包含半胱氨酸，和
在对应于SEQ ID NO：1的第90位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或谷氨酸取代，
任选地，在对应于SEQ ID NO：1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
此外，还可以通过仅在铁蛋白H亚基的loop区(对应于SEQ ID NO：1的第79-91位氨基酸)包含一个半胱氨酸，同时去除其它表面巯基，也可以使得每个铁蛋白亚基仅保留一个供化学缀合的位点。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在loop区中包含一个半胱氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，以及任选地，在对应于SEQ ID NO：1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代。在一些实施方案中，除了loop区中的一个半胱氨酸和任选的在对应于SEQ ID NO：1的第130位的位置处的半胱氨酸，所述突变体多肽不包含另外的半胱氨酸。在一些优选实施方案中，所述突变体多肽在loop区外不包含半胱氨酸。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ IDNO：1的第90和102的位置处的半胱氨酸被取代，任选地，在对应于SEQ ID NO：1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第90、102和130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第79位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被半胱氨酸(C)取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第80位的位置处的氨基酸例如异亮氨酸(I)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第81位的位置处的氨基酸例如苯丙氨酸(F)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第82位的位置处的氨基酸例如亮氨酸(L)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第83位的位置处的氨基酸例如谷氨酰胺(Q)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第84位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(D)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第85位的位置处的氨基酸例如异亮氨酸(I)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第86位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第87位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第88位的位置处的氨基酸例如脯氨酸(P)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第89位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(D)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO：1的第91位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(D)被半胱氨酸取代。
在一些具体实施方案中，所述突变体多肽包含SEQ ID NO：2-5中任一所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，所述突变体多肽包含SEQ ID NO：6-10中任一所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，所述突变体多肽包含SEQ ID NO：11-23中任一所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述突变体多肽能够组装成笼状蛋白和/或能够在组装成笼状蛋白后赋予所述笼状蛋白特异性结合转铁蛋白受体(Transferrin Receptor 1，Tfr1)的能力。
在一些实施方案中，所述药物为多柔比星(DOX)。
在一些实施方案中，所述药物与铁蛋白的浓度比为1∶20-1∶50，优选1∶5-1∶10，更优选1∶6-1∶8；
在一些实施方案中，所述药物浓度为0.4-1.2mg/ml，更优选0.6-1.0mg/ml；
在一些实施方案中，所述铁蛋白浓度为2-10mg/ml，优选4-8mg/ml，更优选5.5-8mg/ml。
在一些实施方案中，所述Tris-HCl缓冲液浓度为5-100mM，更优选10-50mM，更优选15-25mM。在一些实施方案中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值大于7.0，优选7.1-9.5、7.2-9.0、7.3-8.5或7.5-8.0之间。
在一些实施方案中，所述辅料浓度为2％-30％(w/w)，优选3％-10％(w/w)，更优选3-6％(w/w)。
在一些实施方案中，所述添加剂浓度为5％-20％(v/v)，更优选8-12％(v/v)。在一些实施方案中，所述添加剂浓度为0.01-1M。在一些实施方案中，所述氯化铵的浓度范围是0.1-1M。在一些实施方案中，所述苯丙氨酸苯甲酸或丝氨酸的浓度范围是0.01-0.1M。
在一些实施方案中，所述铁蛋白包载药物反应体系包含药物、铁蛋白、缓冲液、辅料和添加剂。在一些具体实施方案中，所述缓冲液为20mM pH 8.0的Tris-HCl，所述辅料为5％蔗糖，所述添加剂为10％甲醇，所述铁蛋白为6.0mg/ml重链铁蛋白，所述药物为0.75-0.85mg/ml多柔比星(DOX)。在一些具体实施方案中，所述缓冲液为25mM pH 8.0的Tris-HCl，所述辅料为10％蔗糖，所述添加剂为15％甲醇，所述铁蛋白为8.0mg/ml重链铁蛋白，所述药物为0.6-0.7mg/ml多柔比星(DOX)。在一些具体实施方案中，所述缓冲液为15mM pH8.0的Tris-HCl，所述辅料为10％蔗糖，所述添加剂为20％甲醇，所述铁蛋白为5.0mg/ml重链铁蛋白，所述药物为0.8-1mg/ml多柔比星(DOX)。
在一方面，本公开提供了由所述铁蛋白包载药物反应体系孵育制成的铁蛋白包载药物。
在一方面，本公开提供了制备所述的铁蛋白包载药物的方法，所述方法包括孵育所述的铁蛋白包载药物反应体系，孵育结束后获得所述铁蛋白包载药物。
在一些实施方案中，所述铁蛋白包载药物反应体系通过选自以下任一项所述的方法制备：
(1)将药物、铁蛋白和缓冲液混合，制得所述铁蛋白包载药物反应体系；
(2)将药物、铁蛋白、缓冲液和添加剂混合，制得所述铁蛋白包载药物反应体系；
(3)将药物、铁蛋白、缓冲液、添加剂和辅料混合，制得所述铁蛋白包载药物反应体系。
在一些实施方案中，在避光的条件下进行孵育。
在一些实施方案中，所述方法还包括在孵育过程中补加药物。
在一些实施方案中，所述孵育的时间至少为5min，优选8min-3h、10min-2h、12min-1.5h、15min-1h或20min-0.5h；优选20min。
在一些实施方案中，所述孵育的温度为10-75℃；优选30-70℃、40-65℃、50-60℃；更优选60℃。
在一些实施方案中，所述药物与铁蛋白的摩尔比为30-70∶1；优选40-65∶1；更优选50-60∶1。
在一些实施方案中，所述铁蛋白包载药物的包载系数为2.0-4.0，；优选2.5-3.0，更优选2.2-2.4。
在一些具体实施方案中，所述缓冲液为20mMpH 8.0的Tris-HCl，所述辅料为5％蔗糖，所述添加剂为10％甲醇，所述铁蛋白为6.0mg/ml重链铁蛋白，所述药物为0.75-0.85mg/ml多柔比星(DOX)；孵育的调键位。孵育温度为60℃，孵育时间为20min，避光。孵育工艺结果为：包载系数为2.2-2.4；DOX主峰占89.0-91.5％；DOX的利用率为50-55％；DOX/HFn摩尔比为50-60。
通过本公开的优化工艺，HFn包载DOX后，DOX主峰纯度提高，由35-45％提高至89.0-91.5％；同时DOX的利用率由30-35％提高至50-55％；但是DOX/HFn的摩尔比由70-80降低至50-60，包载获得的药物均一性好，稳定性强。
实施例
下面通过具体实施例来说明本公开的铵盐-铁蛋白及其制备方法。通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本公开的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本公开，其无意于对本公开的范围做出任何限制。显然，可以对本公开作出多种改动和变化而不脱离本公开的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
野生型HFn通过如下制备方法制备得到：
根据人HFn的野生型氨基酸序列((SEQ ID NO：1；参考PDB：3AJO_A)设计H亚基突变体的氨基酸序列，在上述核苷酸序列前加Nde1酶切位点，在该序列之后加终止密码子和BamH1酶切位点序列，通过全基因合成，测序正确后，连接至pET22b表达质粒载体中。以BL21(DE3)大肠杆菌为表达宿主菌，用LB培养基，37℃，220rpm摇菌培养13h。而后用1mMIPTG，30℃，200rpm，诱导8h，收集菌体。用20mMTris(pH 8.0)缓冲液重悬菌体，超声裂解破碎菌体，离心去除大肠杆菌碎片，上清液72℃加热15分钟，沉淀杂蛋白，离心去除沉淀后，上清液用Superdex 200pg(GE Healthcare)柱子分离纯化，电泳测定纯度为99％，紫外吸收法测定蛋白浓度。纯化后的HFn可冻干保存，也可储存在pH 8.0，50mM Tris-HCl溶液中。
铁蛋白突变体Mut-HFn-240～Mut-HFn-243的具体设计见表1。通过如下制备方法制备得到：根据SEQ ID NO：1设计H亚基突变体的氨基酸序列，对H亚基中可能涉及铁装载的位点进行了突变，涉及第62位的谷氨酸(E62)和第65位的组氨酸(H65)的铁氧中心位点。同时为增加铁蛋白的亲水性，减少聚集，将第108位的带氨基侧链的赖氨酸(K108)用带羧基侧链的氨基酸取代；将第98位的天冬酰胺(N98)用带羧基侧链的氨基酸取代；和/或将第156位的带氨基侧链的精氨酸(R156)用带羧基侧链的氨基酸取代。所有的氨基酸位置均参考SEQID NO：1。同时，为增加铁蛋白偶联药物的均一性，将H亚基的三个活性巯基位点中的两个(第90位和第130位)突变成为其它氨基酸，仅保留第102位的半胱氨酸作为偶联位点。
表1、HFn突变体的设计
Figure BDA0003072262290000051
所得亚基突变体分别命名为Mut-HFn-240(SEQ ID NO：2)、Mut-HFn-241(SEQ IDNO：3)、Mut-HFn-242(SEQ ID NO：4)和Mut-HFn-243(SEQ ID NO：5)。
根据氨基酸序列设计核苷酸序列，选择大肠杆菌表达外源蛋白的常用载体pET-28a(+)，卡那霉素抗性(Kan+)，选择Nco I和Xho I酶切位点嵌入目的基因。经酶切图谱和基因测序确证表达载体构建成功。
上述表达载体构建成功后，后续的表达，纯化操作同野生型铁蛋白。
以下对比例和实施例为获得高包载量的HFn-Dox制品的包载优化方法。
对比例1：采用弱酸法包戴药物
为探索不同溶液体系对包载效果的影响，首先尝试了用乙酸-乙酸钠的弱酸包载方法包载铁蛋白，比较其与本申请的温和包载方式的效果。
1、实验方法：
HFn：野生型
多柔比星(DOX)：海正药业(HZ)
(1)首先将HFn使用G75填料脱盐换液处理，脱盐缓冲液为超纯水，然后使用超滤离心管将换液后的HFn超滤浓缩，浓缩至35～45mg/mL备用。
(2)然后使用超纯水配制10mg/mL的DOX母液备用。
(3)使用0.5mol/LpH值为5.0的乙酸-乙酸钠(缓冲液)配制40℃孵育样品，样品中的HFn浓度为4.0mg/mL；DOX浓度为0.75mg/mL；乙酸-乙酸钠浓度为50mM的溶液1.0mL。样品配制时先将缓冲液和DOX混合均匀后置于40℃水浴10min，再将水浴10min后的HFn加入DOX中，混合均匀后置于40℃避光水浴。
2、结果：
本公开中的样品杂质分析是根据2016年最新版本美国药典-UsP39中记载的分析方法进行。
仪器UPLC-UV编号：005-006
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10μL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B：0.1％甲醇/乙腈(1/4)配制的TFA溶液
表2洗脱条件
序号 时间(min) 流速(mL) A(％) B(％)
1 0.0 0.5 90 10
2 40.0 0.5 15 85
3 41.0 0.5 15 85
4 41.5 0.5 90 10
5 45.0 0.5 90 10
结果表明：HFn-DOX弱酸包载工艺包载获得的DOX的纯度较低，杂质种类多且杂质比例大，如图1所示，DOX的峰仅占比38.69％，即DOX的纯度仅为38.69％。
实施例1：铁蛋白包载药物缓冲体系筛选
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-240
DOX：海正药业(HZ)
表3缓冲液母液配制表
序号 缓冲液名称 pH值 缓冲液浓度
1 NaAC-HAC缓冲液 6.0 0.5mol/L
2 NH<sub>4</sub>AC-HAC缓冲液 6.0 0.5mol/L
3 NH<sub>4</sub>AC-HAC缓冲液 6.5 0.5mol/L
4 NH<sub>4</sub>AC-HAC缓冲液 7.0 0.5mol/L
5 Tris-HCl缓冲液 7.0 0.5mol/L
6 Tris-HAC缓冲液 6.0 0.5mol/L
7 Tris-HAC缓冲液 6.5 0.5mol/L
8 Tris-HAC缓冲液 7.0 0.5mol/L
注：每种缓冲溶液制备100mL备用。
表4 DOX样品制备表
Figure BDA0003072262290000061
Figure BDA0003072262290000071
表5 HFn-DOX样品制备表
序号 溶液体系 pH 葡萄糖 DOX mg/mL HFn mg/mL 样品体系mL
1 100mM NaAC-HAC 6.0 15％ 0.9 3.0 2.5
2 100mM NH<sub>4</sub>AC-HAC 6.0 15％ 0.9 3.0 2.5
3 100mM NH<sub>4</sub>AC-HAC 6.5 15％ 0.9 3.0 2.5
4 100mM NH<sub>4</sub>AC-HAC 7.0 15％ 0.9 3.0 2.5
5 50mM Tris-HCl 7.0 15％ 0.9 3.0 2.5
6 50mM Tris-HAC 6.0 15％ 0.9 3.0 2.5
7 50mM Tris-HAC 6.5 15％ 0.9 3.0 2.5
8 50mM Tris-HAC 7.0 15％ 0.9 3.0 2.5
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、使用ddH2O配制50％葡萄糖母液。
4、表4样品的制备：首先将缓冲液母液、葡萄糖母液、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
5、表5样品制备：首先将缓冲液母液、葡萄糖母液、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
1.2样品孵育
分别将表4和表5样品置于60℃避光水浴孵育，水浴时间4h。
1.3孵育后样品处理
表4的DOX样品水浴结束冷却至室温，然后置于4℃冰箱，获得DOX孵育后处理样品。
表5的HFn-DOX样品孵育结束后冷却至室温，在
Figure BDA0003072262290000072
150系统(005-009)上使用Superdex 75pg填料自装柱(XK26/20，～11cm)对样品进行脱盐换液处理，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4 HFn-DOX脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity II(005-005)
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10μL；
波长260、280、485nm；时间40min
1.5 DOX孵育后处理样品和HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器：UPLC-UV编号：005-006
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10μL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B：0.1％甲醇/乙腈(1/4)配制的TFA
表6洗脱条件
Figure BDA0003072262290000073
Figure BDA0003072262290000081
2.结果
表7 DOX在每个缓冲液孵育的杂质分析
Figure BDA0003072262290000082
Figure BDA0003072262290000091
结果分析：
结合表7、表8和图2的结果，可知与弱酸包载体系(NH4AC-HAC或NaAC-HAC)相比，本公开采用的反应体系能够更好的提高DOX产物的纯度，特别是能够降低RT19和RT21.3这两种杂质的比例，其中50mM Tris-HCl pH7.0为结果优选的缓冲液条件，此时HFn包载DOX后DOX的纯度(主峰比例)能够达到60％，相对于对比例中DOX纯度为35～45％，优化后DOX纯度较优化前提高了约50％。
实施例2：铁蛋白包载药物反应体系中添加剂对包载效果的影响
实施例1通过优化缓冲液体系将DOX的纯度提高到60％，为了进一步提高DOX主峰比例，本实施例通过加入不同的添加剂，考察添加剂在不影响HFn包载DOX的量的同时，对提高DOX比例的影响。所述添加剂为三乙醇胺、氯化锂、脲、氯化铵、甲醇、乙醇、2，6-二叔丁基对甲酚、尼泊金甲酯、葡萄糖胺、Ser(丝氨酸)、Arg(精氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、苯甲酸或EDTA四铵。
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-241
DOX：海正药业
样品缓冲液：50mM Tris-HCl pH 7.0
表9添加剂为三乙醇胺或氯化锂的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.010M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 0.025M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 0.050M 2.5
4 3.0 0.9 15％ 0.100M 2.5
表10添加剂为脲或氯化铵的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.10M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 0.25M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 0.50M 2.5
4 3.0 0.9 15％ 1.00M 2.5
表11添加剂为甲醇或乙醇的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 5.0％ 2.5
2 3.0 0.9 15％ 10.0％ 2.5
3 3.0 0.9 15％ 15.0％ 2.5
4 3.0 0.9 15％ 20.0％ 2.5
表12添加剂为2，6-二叔丁基对甲酚或尼泊金甲酯的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 乙醇 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 5％ 0.005M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 5％ 0.010M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 5％ 0.025M 2.5
4 3.0 0.9 15％ 5％ 0.050M 2.5
注：1、由于添加剂水不溶解，所以需要先使用纯乙醇配制成1M母液，所以导致添加添加剂时导致样品终体系有5％的乙醇。
表13添加剂为葡萄糖胺的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.50％ 2.5
2 3.0 0.9 15％ 1.00％ 2.5
3 3.0 0.9 15％ 2.50％ 2.5
4 3.0 0.9 15％ 5.00％ 2.5
表14添加剂为Ser(丝氨酸)或Arg(精氨酸)的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.010M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 0.025M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 0.050M 2.5
4 3.0 0.9 15％ 0.100M 2.5
表15添加剂为Tyr(酪氨酸)和Phe(苯丙氨酸)的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.005M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 0.010M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 0.025M 2.5
表16添加剂为Tyr(酪氨酸)的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.00005M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 0.00010M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 0.00050M 2.5
表17添加剂为Phe(苯丙氨酸)的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.005M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 0.010M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 0.025M 2.5
表18添加剂为苯甲酸的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.0005M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 0.0010M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 0.0025M 2.5
表19添加剂为EDTA四铵的HFn-DOX样品制备表
序号 HFn mg/mL DOX mg/mL 葡萄糖 添加剂 样品体系mL
1 3.0 0.9 15％ 0.001M 2.5
2 3.0 0.9 15％ 0.002M 2.5
3 3.0 0.9 15％ 0.005M 2.5
4 3.0 0.9 15％ 0.010M 2.5
5 3.0 0.9 15％ 0.025M 2.5
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、配制1.0M Tris-HCl pH 7.0母液
4、使用ddH2O配制50％葡萄糖母液。
5、首先将缓冲液母液、葡萄糖母液、添加剂、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于40℃水浴锅孵育60min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
1.2样品孵育
分别将表9-19的HFn-DOX样品置于60℃避光水浴孵育，孵育4h。
1.3孵育后样品处理
将表9-19的HFn-DOX样品孵育结束后冷却至室温，在
Figure BDA0003072262290000121
avant 150系统(005-009)上使用Superdex 75pg填料自装柱(XK26/20，～11cm)对样品进行脱盐换液处理，上样量2mL，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4 HFn-DOX脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity II(005-005)
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10μL；
波长260、280、485nm；时间40min
1.5 HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器：UPLC-UV编号：005-006
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10μL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B：0.1％甲醇/乙腈(1/4)配制的TFA
表20洗脱条件
序号 时间(min) 流速(mL) A(％) B(％)
1 0.0 0.5 90 10
2 40.0 0.5 15 85
3 41.0 0.5 15 85
4 41.5 0.5 90 10
5 45.0 0.5 90 10
2.结果
表21三乙醇胺样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000122
表22氯化锂样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000123
Figure BDA0003072262290000131
表23脲样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000132
RT10.7 RT11.0 RT11.6 RT12.1 RT12.2
2.57％ 1.85％ 1.40％ 1.00％ 0.85％
7.44％ 7.44％ 1.71％ 3.01％ 1.93％
13.35％ 10.85％ 1.88％ 5.87％ 2.85％
19.94％ 16.31％ 3.20％ 9.81％ 3.06％
表24氯化铵样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000133
表25甲醇样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000134
表26乙醇样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000135
表27 2、6-二叔丁基对甲酚样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000136
Figure BDA0003072262290000141
注：体系里面有5％乙醇；2、2、6-二叔丁基对甲酚在该体系析出。
表28尼泊金甲酯样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000142
注：体系里面有5％乙醇。
表29葡萄糖胺样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000143
表30 Ser(丝氨酸)HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000144
表31 Arg(精氨酸)HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000145
表32 Tyr(酪氨酸)HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000146
Figure BDA0003072262290000151
表33 Phe(苯丙氨酸)HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000152
表34苯甲酸HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000153
表35 EDTA四铵HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000154
结果分析：
HFn包载DOX后包载系数≤2.6，同时DOX纯度≥60％的添加剂为：氯化铵、甲醇、乙醇、丝氨酸、酪氨酸、苯甲酸。与实施例1相比，添加乙醇能够大幅度提高铁蛋白单体的比例，防止聚集，同时能收获大于60％的DOX主峰比例。虽然不同类型、浓度的添加剂能够一定程度提高DOX的纯度，但并不能获得更好包载系数，有些添加剂甚至会降低包载系数。本实施例结果表明，可以向体系中优选添加氯化铵、甲醇、乙醇、丝氨酸、酪氨酸、苯甲酸，更优选甲醇、乙醇、苯甲酸、氯化铵或丝氨酸。
实施例3：铁蛋白包载药物反应体系中混合添加剂对包载效果的影响
从实施例2的结果来看，添加剂的添加促进了HFn包载DOX后的DOX主峰的提高，但是对其包载量有一定的影响。本实施例通过加入混合添加剂，考察混合添加剂在控制HFn包载DOX的量的同时，对提高包载后的DOX比例(DOX纯度)的影响。
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-242
DOX：海正药业(HZ)
样品缓冲液：50mM Tris-HCl pH 7.0
表36 HFn-DOX样品制备表
Figure BDA0003072262290000155
Figure BDA0003072262290000161
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、配制1.0M Tris-HCl pH 7.0母液。
4、使用ddH2O配制50％葡萄糖母液。
5、首先将缓冲液母液、葡萄糖母液、添加剂、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
1.2样品孵育
样品置于60℃避光水浴孵育，水浴时间4h。
1.3孵育后样品处理
HFn-DOX样品孵育结束后冷却至室温，在
Figure BDA0003072262290000162
系统上使用Superdex 75pg填料自装柱(XK26/20，～11cm)对样品进行脱盐换液处理，上样量2mL，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4 HFn-DOX脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity II(005-005)
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；上样量10μL；
波长260、280、485nm；时间40min
1.5 HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器：UPLC-UV编号：005-006
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10μL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B：0.1％甲醇/乙腈(1/4)配制的TFA
表37洗脱条件
序号 时间(min) 流速(mL) A(％) B(％)
1 0.0 0.5 90 10
2 40.0 0.5 15 85
3 41.0 0.5 15 85
4 41.5 0.5 90 10
5 45.0 0.5 90 10
2结果
表38 0.05M三乙醇胺、5％乙醇HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000163
表39 0.05M三乙醇胺、0.1M丝氨酸HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000164
Figure BDA0003072262290000171
表40 0.05M三乙醇胺、0.0005M酪氨酸HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000172
表41 0.05M三乙醇胺、0.005M苯甲酸HFn-DOX样品的数据汇总
Figure BDA0003072262290000173
小结：
本实施例原设计意图是想通过添加三乙醇胺来促进铁蛋白包载药物的量，而通过添加氨基酸抑制DOX的降解。但从实验结果看看，发现添加三乙醇胺并未增加药物包载量，效果不佳，且DOX的纯度为61～64％，也未达到优化的预计比例，因此，向体系中同时添加三乙醇胺和氨基酸作为包载添加剂不作为优化选择的条件。
实施例4：铁蛋白包载药物反应体系中pH对包载效果的影响
由于DOX在碱性条件趋于不稳定状态，但是在偏碱性条件下HFn包载DOX的量明显提升，所以本实施例通过提高孵育pH同时缩短孵育时间观察HFn包载DOX后的DOX的纯度是否有提高。
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-243
DOX：海正药业(HZ)
样品缓冲液：50mM Tris-HCl
表42 HFn-DOX样品制备表
序号 pH 孵育时间 葡萄糖 HFn mg/mL DOX mg/mL 样品体系mL
1 7.5 0.5、1.0、1.5、2.0h 15％ 3.0 0.9 2.5
2 8.0 0.5、1.0、1.5、2.0h 15％ 3.0 0.9 2.5
3 8.5 0.5、1.0、1.5、2.0h 15％ 3.0 0.9 2.5
4 9.0 0.5、1.0、1.5、2.0h 15％ 3.0 0.9 2.5
表43 HFn-DOX样品制备表
序号 pH 孵育时间 葡萄糖 HFn mg/mL DOX mg/mL 样品体系mL
1 8.0 10、20、30min 15％ 3.0 0.9 2.5
2 8.5 10、20、30min 15％ 3.0 0.9 2.5
3 9.0 10、20、30min 15％ 3.0 0.9 2.5
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、配制1.0M Tris-HCl pH 7.5、8.0、8.5、9.0母液
4、使用ddH2O配制50％葡萄糖母液。
5、首先将缓冲液母液、葡萄糖母液、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
1.2样品孵育
样品置于60℃避光水浴孵育，每个样品的孵育时间为表42、表43设定时间。
1.3孵育后样品处理
HFn-DOX样品孵育结束后冷却至室温，在
Figure BDA0003072262290000181
avant 150系统上使用Superdex75pg填料自装柱对样品进行脱盐换液处理，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4 HFn-DOX脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10μL；
波长260、280、485nm；时间40min
1.5 HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器：UPLC-UV编号：005-006
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10μL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B：0.1％甲醇/乙腈(1/4)配制的TFA
表44洗脱条件
序号 时间(min) 流速(mL) A(％) B(％)
1 0.0 0.5 90 10
2 40.0 0.5 15 85
3 41.0 0.5 15 85
4 41.5 0.5 90 10
5 45.0 0.5 90 10
2.结果
表45 pH为7.5包载数据汇总表
Figure BDA0003072262290000182
表46 pH为8.0包载数据汇总表
Figure BDA0003072262290000183
注：出现负值是指包载后聚体含量反而减少。
表47 pH为8.5包载数据汇总表
Figure BDA0003072262290000191
表48 pH为9.0包载数据汇总表
Figure BDA0003072262290000192
小结：
由表45-48可见，采用pH值大于7.0的偏碱性的Tris-HCl作为缓冲液，通过孵育后所获的铁蛋白包载DOX产物中，DOX的主峰比例均在40％以上，高于弱酸法的38.69％。并且，由表46和图3可见，对于pH为8.0，孵育时间为20min的样品，通过该次优化包载系数为2.3左右的情况下，DOX的主峰比例为88.05％，DOX的主峰比例比对比例的DOX主峰比例提高了约100％。以孵育pH为8.0，孵育时间15-30min为优化点，进行下一步优化。
实施例5：铁蛋白包载药物反应体系中缓冲液浓度、辅料浓度和DOX浓度优化与包截验证
根据实施例4缓冲体系的浓度和辅料的浓度优化与包载验证结果分析，产生浑浊的原因是配方各成分没有充分优化，所以对实施例5的配方进一步优化。
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-241
DOX：海正药业(HZ)
样品缓冲液：Tris-HCl pH 8.0
表49样品体系探索信息表1(孵育后加入500μL 15％Glu 100mM Tris-HCLpH 7.0)
Figure BDA0003072262290000193
Figure BDA0003072262290000201
注：样品体系1.5mL
表50样品体系探索信息表2(孵育后加入500μL 15％Glu 100mM Tris-HCLpH 7.0)
Figure BDA0003072262290000202
注：样品体系1.5mL
表51样品体系探索信息表3(孵育后加入500μL 15％Glu 100mM Tris-HCLpH 7.0)
Figure BDA0003072262290000203
Figure BDA0003072262290000211
注：样品体系1.5mL
根据表49、50、51筛选结果，以缓冲液浓度为20mM、孵育离心后澄清样品为模板进行包载验证。
表52包载验证样品制备表
序号 葡萄糖 HFn mg/mL DOX mg/mL 样品体系mL
1 10％ 4.0、6.0、8.0 0.75 4.0
2 12.5％ 4.0、6.0、8.0 0.75 4.0
3 15％ 4.0、6.0、8.0 0.80 4.0
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、配制1.0M Tris-HCl pH 8.0母液。
4、使用ddH2O配制50％葡萄糖母液。
5、首先将缓冲液母液、葡萄糖母液、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
1.2样品孵育
样品置于60℃避光水浴孵育，孵育时间20min。
1.3孵育后样品处理
表49、50、51样品不进行脱盐处理，表52样品需要进行脱盐处理。
HFn-DOX样品孵育结束后冷却至室温，在
Figure BDA0003072262290000212
avant 150系统上使用Superdex75pg填料自装柱对样品进行脱盐换液处理，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4 HFn-DOX脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10μL；
波长260、280、485nm；时间40min
1.5 HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器：UPLC-UV编号：005-006
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C181.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10uL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B：0.1％甲醇/乙腈(1/4)配制的TFA
表53洗脱条件
序号 时间(min) 流速(mL) A(％) B(％)
1 0.0 0.5 90 10
2 40.0 0.5 15 85
3 41.0 0.5 15 85
4 41.5 0.5 90 10
5 45.0 0.5 90 10
2.结果
Figure BDA0003072262290000221
小结：
由上述结果来看，在反应体系中添加10-15％的葡萄糖，同时将HFn的比例控制在4-8mg/ml，DOX的浓度在0.75-0.8mg/m1时，产物的纯度能够达到87％以上，单体比例能够达到要求。其中，HFn浓度在6mg/ml，DOX浓度为0.75mg/ml，葡萄糖浓度为10％的时候结果更理想，包载系数最佳为2.3，其DOX主峰比例为89.03％，DOX利用率为48.08％，DOX和HFn的摩尔比约为52。
实施例6：孵育过程中补加药物对包载效果的影响
为了进一步提高HFn包载DOX的量，所以对实施例6的包载验证样品2、3进行孵育优化，即，在HFn包载DOX过程中补加DOX。
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-242
DOX：海正药业(HZ)
样品缓冲液：20mM Tris-HClpH 8.0
表55样品制备表
Figure BDA0003072262290000231
注：样品1、2、4和5补加后总DOX浓度为0.85mg/ml，样品3和6补加后总DOX浓度为0.95mg/ml。
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、配制1.0M Tris-HCl pH 8.0母液。
4、使用ddH2O配制50％葡萄糖母液。
5、首先将缓冲液母液、葡萄糖母液、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
5、在补加DOX的时间点补加DOX母液，混合均匀后再放入60℃水浴锅水浴。
1.2样品孵育
样品置于60℃避光水浴孵育，孵育时间20min。
1.3孵育后样品处理
HFn-DOX样品孵育结束后冷却至室温，在
Figure BDA0003072262290000232
avant 150系统上使用Superdex75pg填料自装柱对样品进行脱盐换液处理，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4 HFn-DOX脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10μL；
波长260、280、485nm；时间40min
1.5 HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器：UPLC-UV编号：005-006
色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10μL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B：0.1％甲醇/乙腈(1/4)配制的TFA
表56洗脱条件
序号 时间(min) 流速(mL) A(％) B(％)
1 0.0 0.5 90 10
2 40.0 0.5 15 85
3 41.0 0.5 15 85
4 41.5 0.5 90 10
5 45.0 0.5 90 10
2结果
表57 HFn包载DOX尝试2实验数据汇总
Figure BDA0003072262290000241
Figure BDA0003072262290000242
小结：
通过孵育后补加DOX，HFn包载DOX的量略有提高，包载系数和DOX主峰均变化不大。这说明孵育后补加DOX对包载系数和DOX主峰影响不大。
实施例7：补加药物孵育工艺中添加剂对包载效果的影响
实施例1证明甲醇、乙醇、丝氨酸、酪氨酸等一些添加剂，可以提高HFn包载DOX后DOX的主峰比例，所以在补加DOX工艺里加入添加剂观察DOX主峰变化情况。添加剂为DMSO、甲醇(MOH)、乙醇(EtOH)、NH4Cl、精氨酸或氟化钠。
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-243
DOX：HZ
样品缓冲液：20mM Tris-HClpH 8.0
表58添加剂为DMSO、MOH、EtOH的HFn-DOX样品制备表
Figure BDA0003072262290000243
表59添加剂为NH4Cl、精氨酸、氟化钠的HFn-DOX样品制备表
Figure BDA0003072262290000251
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、配制1.0M Tris-HCl pH 8.0母液
4、使用ddH2O配制50％葡萄糖母液。
5、首先将缓冲液母液、葡萄糖母液、添加剂、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
6、在补加DOX的时间点补加DOX母液，混合均匀后再放入60℃水浴锅水浴。
1.2样品孵育
样品置于60℃避光水浴孵育，孵育时间4h。
1.3孵育后样品处理
HFn-DOX样品孵育结束后冷却至室温，在
Figure BDA0003072262290000252
avant 150系统上使用Superdex75pg填料自装柱对样品进行脱盐换液处理，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4 HFn-DOX脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10μL；
波长260、280、485nm；时间40min
1.5 HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器：UPLC-UV编号：005-006
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10uL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B：0.1％甲醇/乙腈(1/4)配制的TFA
表60洗脱条件
序号 时间(min) 流速(mL) A(％) B(％)
1 0.0 0.5 90 10
2 40.0 0.5 15 85
3 41.0 0.5 15 85
4 41.5 0.5 90 10
5 45.0 0.5 90 10
2.结果
Figure BDA0003072262290000261
Figure BDA0003072262290000271
小结：
添加不同的添加剂能够减少各杂质的比例，尤其是RT19杂质的比例，从而提高DOX产物的纯度。其中甲醇(MOH)的效果最佳，在控制HFn包载DOX的量的前提下，同时对RT19杂质有抑制作用。
实施例8：铁蛋白包载药物反应体系中辅料筛选和替换
如图4所示，在DOX主峰附近有葡萄糖和DOX在孵育过程中会形成的葡萄糖&DOX席夫碱(Glu&DOX)杂质。
为了避免该葡萄糖&DOX席夫碱杂质的产生，需要将葡萄糖用其它物质来进行替换，如用甘油、蔗糖、海藻糖或山梨醇替换葡萄糖。
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-243
DOX：海正药业(HZ)
样品缓冲液：20mM Tris-HClpH 8.0
表67辅料为甘油、蔗糖、海藻糖、山梨醇的HFn-DOX样品制备表
Figure BDA0003072262290000281
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、配制1.0M Tris-HCl pH 8.0母液
4、使用ddH2O配制50％甘油、蔗糖、海藻糖、山梨醇母液。
5、首先将缓冲液母液、辅料母液、添加剂、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
6、在补加DOX的时间点补加DOX母液，混合均匀后再放入60℃水浴锅水浴。
1.2样品孵育
样品置于60℃避光水浴孵育，孵育时间20min。
1.3孵育后样品处理
HFn-DOX样品孵育结束后置于室温的ddH2O中冷却，当包药溶液的温度冷却至室温时，在
Figure BDA0003072262290000282
avant 150系统上使用Superdex 75pg填料自装柱对样品进行脱盐换液处理，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4 HFn-DOX脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10μL；
波长260、280、485nin；时间40min
1.5 HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器UPLC-UV编号：005-006
色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10μL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.5％TFA水溶液
流动相B：100％ACN
流动相C：：100％MOH
表68洗脱条件
Figure BDA0003072262290000283
Figure BDA0003072262290000291
2结果
如图5所示，在非Glu为辅料时的HFn-DOX的UPLC-RP图谱中，不存在对应于葡萄糖&DOX席夫碱(Glu&DOX)杂质的峰。
表69中：
Tris&D表示Tris和DOX形成的席夫碱
Glu&D表示葡萄糖和DOX形成的席夫碱
H&D表示HFn-DOX没有完全分离的物质
Figure BDA0003072262290000301
小结：
1、甘油、蔗糖、海藻糖、山梨醇作为辅料均能避免Glu-DOX席夫碱的产生。
2、结合包载系数、DOX主峰比例、DOX利用率分析，以5％蔗糖为辅料的结果最佳合适，所以选用5％蔗糖为辅料。
3、高浓度的辅料(15％)会导致DOX利用率降低，包载率降低，这一点在用甘油、海藻糖做辅料时尤为明显。且
4、实验结果还显示，甘油、海藻糖、山梨醇包载的产物保存1个月后发生聚集从而沉淀，而采用蔗糖包载的产物则保持澄清，即用蔗糖包载的产物稳定性更好。
实施例9：铁蛋白包载药物反应体系中还原剂对包载效果的影响
通过核磁和质谱鉴定分子量为RT19和RT21.3的两个杂质为DOX自身形成的席夫碱(即RT19)，推测形成原因是DOX在孵育过程中自身氧化导致的，所以通过在孵育过程中加入还原剂，从而抑制DOX的氧化，达到降低包载后DOX杂质的目的。
1.实验方法
1.1样品制备
HFn：Mut-HFn-243
DOX：海正药业(HZ)
样品缓冲液：20mM Tris-HClpH 8.0
表73还原剂为硫代硫酸钠、DTT、三(2-羧乙基)膦(TCEP)的HFn-DOX样品制备表
Figure BDA0003072262290000311
表74还原剂为硼氢化钠的HFn-DOX样品制备表
Figure BDA0003072262290000312
样品制备流程：
1、首先将HFn使用100kDa超滤离心管超滤换液至ddH2O中，同时将HFn浓缩至35～40mg/mL。
2、使用ddH2O配制10mg/mL DOX母液。
3、配制1.0M Tris-HCl pH 8.0母液
4、使用ddH2O配制50％蔗糖母液。
5、首先将缓冲液母液、辅料母液、添加剂、还原剂、需要补加的ddH2O混合均匀，获得缓冲液混合液，然后置于60℃水浴锅孵育20min；同时将HFn母液置于60℃水浴锅孵育20min。待缓冲液混合液孵育结束后加入DOX母液，样品混合均匀后加入HFn母液，将最终样品混合均匀后放入60℃水浴锅水浴，开始孵育计时。
6、在补加DOX的时间点补加DOX母液，混合均匀后再放入60℃水浴锅水浴。
1.2样品孵育
样品置于60℃避光水浴孵育，孵育时间20min。
1.3孵育后样品处理
HFn-DOX样品孵育结束后冷却至室温，在
Figure BDA0003072262290000313
avant 150系统上使用Superdex75pg填料自装柱对样品进行脱盐换液处理，收集样品，获得HFn-DOX脱盐后样品，4℃避光保存。脱盐过程中每个样品所使用的缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.0。
1.4脱盐后样品HPLC-SEC分析
仪器：安捷伦1260Infinity
色谱柱：TSKgel G4000SWXL(8)7.8*300
色谱条件：流动相Tris-HCl pH 7.0；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10μL；
波长260、280、485nm；时间40min
1.5 HFn-DOX脱盐后样品UPLC-RP分析
仪器UPLC-UV编号：005-0027
色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1*100mm编号：ARD-C002
色谱条件：进样量10μL；检测波长280nm、254nm、485nm；柱温35℃
洗脱梯度：
流动相A：0.5％TFA水溶液
流动相B：100％ACN
流动相C：100％MOH
表75洗脱条件
序号 时间(min) 流速(mL) A(％) B(％) C(％)
1 0.0 0.4 65 14 21
2 5.0 0.4 60 16 24
3 7.0 0.4 65 35
4 12.0 0.5 61 39
5 17.0 0.5 45 55
6 18.0 0.4 5 95
7 18.1 0.4 65 14 21
8 20.0 0.4 65 14 21
2.结果
Figure BDA0003072262290000331
Figure BDA0003072262290000341
小结：
还原剂的添加并不能很好的抑制RT19和RT21.3的杂质产生，同时还会产生一些其他的杂质。
实施例10：铁蛋白包载药物的抗肿瘤活性
将Mut-HFn-243按照Tris-HCl 20mM pH 8.0，蔗糖5％，MOH 10％，HFn 6.0mg/mL，DOX 0.80mg/mL的配方进行孵育，孵育温度为60℃，孵育温度为20℃，避光孵育，其它条件参照实施例9。
获得的产品包载系数2.2，DOX利用率55％，DOX纯度91.5％。该产物用于体外肿瘤细胞活性抑制实验。
将RPMI-1640(Gibco，22400089)培养基与FBS(四季青，13011-8611)按9∶1比例混合，配置成完全培养基。当人原位胰腺腺癌BXPC-3(
Figure BDA0003072262290000351
CRL-168TM)细胞覆盖整个培养皿底面积的80％以上时，对细胞进行传代并计数，将细胞浓度调整到0.8×105个/mL，取100μL加入到96孔板中继续培养。在37℃，CO2细胞培养箱中继续培养24h后取出。弃去原培养液后，改用含有1％FBS的培养液继续培养30min。
配置不同浓度的Mut-HFn-243-DOX受试品，另外配制不同浓度的Mut-HFn-243-(不包药)和Dox作为对照。配置的浓度以盐酸阿霉素药物含量的浓度计算。样品作用浓度以DOX浓度计，作用时间：72h。各样本浓度如下：
HFn-Dox：10，3.33，1.11，0.37，0.12，0.04μM
Dox：10，3.33，1.11，0.37，0.12，0.04μM
HFn：与HFn-Dox同稀释倍数
用1％FBS的培养液稀释受试品到计划浓度。弃去96孔板中的原培养液，将上述配制好的不同浓度的受试品加入96孔板中，每孔100μl，每孔三个复孔，放入到CO2培养箱中继续培养72h。向每孔中加入10μL CCK8试剂(碧云天生物技术Beyotime Biotechnology，C0040)，放入到C02细胞培养箱中进行孵育2h。然后经SpectraMax M5多功能酶标仪，在450nm波长进行读数，通过检测线粒体内的脱氢酶活性而指试对细胞增殖的抑制作用。
实验结果如图6所示，其中，纵坐标具体而言，其为细胞给药后，细胞量减少后，吸光值也会降低，然后用检测的值和空白对照的比值作图。
结果显示，相较于对照组，受试品Mut-HFn-243-DOX对BXPC-3活性具有抑制作用，并随着受试品的浓度升高，细胞活性明显降低，即呈剂量依赖性。说明铁蛋白包载药物Mut-HFn-243-DOX能够发挥抗肿瘤的活性。另外的结果还观察到Mut-HFn-243-DOX杀伤癌细胞的起效时间比DOX要长，且作用时间也更长，具有缓释的效果。
序列表
<110> 昆山新蕴达生物科技有限公司
<120> 铁蛋白包载药物及其制备方法
<130> MTI21118
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 野生型H亚基(Homo sapiens)
<400> 1
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 2
<211> 182
<212> PRT
<213> Mut-HFn-240(Homo sapiens)
<400> 2
Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr
20 25 30
Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu
35 40 45
Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Lys Arg Glu
50 55 60
Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile
65 70 75 80
Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Glu Asp Asp Trp Glu Ser Gly
85 90 95
Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Glu Asn Val Asn Gln
100 105 110
Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His
115 120 125
Leu Ala Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala
130 135 140
Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala
145 150 155 160
Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly
165 170 175
Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 3
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn-241(Homo sapiens)
<400> 3
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Lys Arg
50 55 60
Glu Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Glu Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asp Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Glu Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ala Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 4
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn-242(Homo sapiens)
<400> 4
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Lys Arg
50 55 60
Glu Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Glu Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asp Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Glu Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ala Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu His Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 5
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn-243(Homo sapiens)
<400> 5
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Lys Arg
50 55 60
Glu Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asp Ala Met Glu Ala Ala Leu His Leu Glu Glu Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ala Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu His Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 6
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn 包药突变1(Homo sapiens)
<400> 6
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Lys Arg
50 55 60
Glu Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 7
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn 包药突变2(Homo sapiens)
<400> 7
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Phe Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Lys Arg
50 55 60
Glu Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 8
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn 包药突变3(Homo sapiens)
<400> 8
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Phe Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Trp Lys Arg
50 55 60
Glu Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Met Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Met Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Met Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 9
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn 包药突变4(Homo sapiens)
<400> 9
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Phe Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Trp Lys Arg
50 55 60
Glu Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Met Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 10
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn 包药突变5(Homo sapiens)
<400> 10
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Lys Arg
50 55 60
Glu Gly Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Met Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 11
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变1(Homo sapiens)
<400> 11
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Cys
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 12
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变2(Homo sapiens)
<400> 12
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Cys Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 13
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变3(Homo sapiens)
<400> 13
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Cys Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 14
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变4(Homo sapiens)
<400> 14
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Cys Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 15
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变5(Homo sapiens)
<400> 15
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Cys Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 16
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变6(Homo sapiens)
<400> 16
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Cys Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 17
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变7(Homo sapiens)
<400> 17
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Cys Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 18
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变8(Homo sapiens)
<400> 18
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Cys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 19
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变9(Homo sapiens)
<400> 19
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Cys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 20
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变10(Homo sapiens)
<400> 20
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Cys Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 21
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变11(Homo sapiens)
<400> 21
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Cys Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 22
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变12(Homo sapiens)
<400> 22
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 23
<211> 183
<212> PRT
<213> Mut-HFn loop区突变13(Homo sapiens)
<400> 23
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Cys Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180

Claims (10)

1.一种铁蛋白包载药物反应体系，其包括：药物、铁蛋白和缓冲液，其中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
2.权利要求1所述的铁蛋白包载药物反应体系，其中，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含辅料，
优选地，所述辅料选自葡萄糖、蔗糖、甘油、海藻糖或山梨醇；
优选地，所述辅料选自蔗糖、甘油、海藻糖或山梨醇；
更优选地，所述辅料为蔗糖。
3.权利要求1或2所述的铁蛋白包载药物反应体系，其中，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含添加剂，
优选地，所述添加剂选自氯化铵、甲醇、乙醇、丝氨酸、酪氨酸和苯甲酸中的一种或多种；
优选地，所述添加剂选自氯化铵、甲醇、乙醇、丝氨酸和苯甲酸中的一种或多种；
任选地，所述铁蛋白包载药物反应体系还包含还原剂；优选地，所述还原剂选自硫代硫酸钠、DTT、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和硼氢化钠。
4.权利要求1-3任一项所述的铁蛋白包载药物反应体系，其中，所述铁蛋白是野生型铁蛋白或突变型铁蛋白；
优选地，所述铁蛋白由铁蛋白单体亚基组装而成；
优选地，所述铁蛋白单体亚基选自重链铁蛋白单体亚基和/或轻链铁蛋白单体亚基；
优选地，所述铁蛋白单体亚基是来源于哺乳动物来源的铁蛋白、两栖类动物来源的铁蛋白、细菌来源的铁蛋白或植物来源的铁蛋白中的任意一种或至少两种组合的铁蛋白单体亚基，优选为哺乳动物来源或细菌来源的铁蛋白单体亚基；
优选地，所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白、大肠杆菌铁蛋白或激烈火球菌铁蛋白；
优选地，所述铁蛋白的来源包括天然提取产物、人工合成产物或基因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述药物为多柔比星(DOX)；
优选地，所述药物与铁蛋白的浓度比为1∶20-1∶50，优选1∶5-1∶10，更优选1∶6-1∶8；
优选地，所述药物浓度为0.4-1.2mg/ml，更优选0.6-1.0mg/ml；
优选地，所述铁蛋白浓度为2-10mg/ml，优选4-8mg/ml，更优选5.5-8mg/ml；
优选地，所述Tris-HCl缓冲液浓度为5-100mM，更优选10-50mM，更优选15-25mM；优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH值大于7.0，优选7.1-9.5、7.2-9.0、7.3-8.5或7.5—8.0之间；
优选地，所述辅料浓度为2％-30％(w/w)，优选3％-10％(w/w)，更优选3-6％(w/w)；
优选地，所述添加剂浓度为5％-20％(v/v)，更优选8-12％(v/v)；优选地，所述添加剂浓度为0.01-1M；优选地，所述氯化铵的浓度范围是0.1-1M；优选地，所述苯甲酸或丝氨酸的浓度范围是0.01-0.1M；
优选地，所述铁蛋白包载药物反应体系包含药物、铁蛋白、缓冲液、辅料和添加剂；优选地，所述缓冲液为20mM pH 8.0的Tris-HCl，所述辅料为5％蔗糖，所述添加剂为10％甲醇，所述铁蛋白为6.0mg/ml重链铁蛋白，所述药物为0.75—0.85mg/ml多柔比星(DOX)；优选地，所述缓冲液为25mM pH8.0的Tris-HCl，所述辅料为10％蔗糖，所述添加剂为15％甲醇，所述铁蛋白为8.0mg/ml重链铁蛋白，所述药物为0.6-0.7mg/ml多柔比星(DOX)；优选地，所述缓冲液为15mM pH 8.0的Tris-HCl，所述辅料为10％蔗糖，所述添加剂为20％甲醇，所述铁蛋白为5.0mg/ml重链铁蛋白，所述药物为0.8-1mg/ml多柔比星(DOX)。
5.由权利要求1-4中任一项所述的铁蛋白包载药物反应体系孵育制成的铁蛋白包载药物。
6.制备权利要求5所述的铁蛋白包载药物的方法，所述方法包括孵育所述的铁蛋白包载药物反应体系，孵育结束后获得所述铁蛋白包载药物；
优选地，所述铁蛋白包载药物反应体系通过选自以下任一项所述的方法制备：
(1)将药物、铁蛋白和缓冲液混合，制得所述铁蛋白包载药物反应体系；
(2)将药物、铁蛋白、缓冲液和添加剂混合，制得所述铁蛋白包载药物反应体系；
(3)将药物、铁蛋白、缓冲液、添加剂和辅料混合，制得所述铁蛋白包载药物反应体系；
优选地，在避光的条件下进行孵育。
7.权利要求6所述的方法，其中，所述方法还包括在孵育过程中补加药物。
8.权利要求6或7所述的方法，其中，所述孵育的时间至少为5min，优选8min-3h、10min-2h、12min-1.5h、15min-1h或20min-0.5h；优选20min。
9.权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，所述孵育的温度为10-75℃：优选30-70℃、40-65℃、50-60℃；更优选60℃。
10.权利要求6-9中任一项所述的方法，其中，所述药物与铁蛋白的摩尔比为30-70：1；优选40-65：1；更优选50—60∶1。
CN202110543102.8A 2021-05-18 2021-05-18 铁蛋白包载药物及其制备方法 Active CN113332261B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110543102.8A CN113332261B (zh) 2021-05-18 2021-05-18 铁蛋白包载药物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110543102.8A CN113332261B (zh) 2021-05-18 2021-05-18 铁蛋白包载药物及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113332261A true CN113332261A (zh) 2021-09-03
CN113332261B CN113332261B (zh) 2022-11-15

Family

ID=77469282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110543102.8A Active CN113332261B (zh) 2021-05-18 2021-05-18 铁蛋白包载药物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113332261B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022179536A1 (zh) * 2021-02-25 2022-09-01 昆山新蕴达生物科技有限公司 铁蛋白重链亚基突变体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110237047A (zh) * 2018-03-07 2019-09-17 昆山新蕴达生物科技有限公司 铁蛋白包载药物的方法及其产物
WO2020090708A1 (ja) * 2018-10-29 2020-05-07 味の素株式会社 有機化合物封入フェリチンの製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110237047A (zh) * 2018-03-07 2019-09-17 昆山新蕴达生物科技有限公司 铁蛋白包载药物的方法及其产物
WO2020090708A1 (ja) * 2018-10-29 2020-05-07 味の素株式会社 有機化合物封入フェリチンの製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022179536A1 (zh) * 2021-02-25 2022-09-01 昆山新蕴达生物科技有限公司 铁蛋白重链亚基突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113332261B (zh) 2022-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2371853B1 (en) Insulin derivatives or its pharmaceutically acceptable salt, pharmaceutical composition, use of insulin derivative or its pharmaceutically acceptable salt and method of treatment
Zieliński et al. Expression and purification of recombinant human insulin from E. coli 20 strain
CN109498815B (zh) 重组人激肽释放酶的化学修饰物及其应用
EP3039139B1 (en) Engineered primate l-methioninase for therapeutic purposes
WO2022100741A1 (zh) 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
US8663967B2 (en) Arginine deiminase mutant and preparation and application thereof
WO2021008454A1 (zh) 基于铁蛋白重链亚基的药物载体
CN113332261B (zh) 铁蛋白包载药物及其制备方法
KR20130094337A (ko) 개량형 이듀로네이트-2-설파타제 및 이의 용도
EP3059243B1 (en) Yap protein inhibiting polypeptide and application thereof
DK2270138T3 (en) Purification and isolation of recombinant oxalate-degrading enzymes
CN117547618A (zh) 内腔装载小核酸药物的铁蛋白纳米笼载体及应用
CN111040021A (zh) 一种改善生物活性蛋白性质的载体蛋白
CN114796525A (zh) 细胞周期调控蛋白抑制剂在肿瘤治疗中的应用
US10287342B2 (en) Polypeptide for binding to complement protein C5A, and use of same
CN106913863B (zh) NUP188蛋白的多肽与热休克蛋白gp96的复合物在制备治疗与预防癌症药物中的应用
CN110714036A (zh) 苯乳酸尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的应用
CN115089733B (zh) 用于治疗高赖氨酸血症的组合物及应用
CN116836233B (zh) 抗炎活性多肽及其应用
WO2018039081A1 (en) Bovine fibroblast growth factor 21 and ketosis in dairy cattle
CN112794892B (zh) 一种抗真菌肽突变体及其制备方法和应用
WO2022179536A1 (zh) 铁蛋白重链亚基突变体及其应用
CN113827739B (zh) 肾靶向性的dna纳米筏-il-33及其制备方法、应用
WO2023246938A1 (zh) 用于实体肿瘤的治疗性mRNA及其应用
CN112442496B (zh) 精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant