CN113476588B - 靶向乳腺癌的多功能纳米颗粒、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向乳腺癌的多功能纳米颗粒、其制备方法及其应用。该多功能纳米颗粒包括靶向载体及负载在所述靶向载体上的药物，所述靶向载体由重组铁蛋白制成。通过细胞实验验证了该多功能纳米颗粒不仅对于癌细胞具有优于常规铁蛋白作为载体的药效及药物释放能力。该载药系统还通过装载量子点可实现肿瘤细胞的光学成像，以在癌症诊断和治疗中发挥作用。

Description

靶向乳腺癌的多功能纳米颗粒、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及乳腺癌靶向治疗药物技术领域，尤其涉及靶向乳腺癌的多功能纳米颗粒、其制备方法及其应用。
背景技术
铁蛋白是在生物体中广泛存在的一种铁储存蛋白，负责维持机体铁离子稳态并保护细胞免受氧化损伤。铁蛋白超家族可以根据尺寸分成两个主要类群：大铁蛋白和小铁蛋白。大铁蛋白尺寸在8～12nm之间，由24个亚基自组成形成正八面体对称笼形结构，存在于细菌、古细菌和真核生物中，包括人源铁蛋白(Human ferritin)、人血清白蛋白和细菌铁蛋白。小铁蛋白尺寸在4.5～9nm之间，由12个亚基组装成四面体笼形结构，存在于细菌和古细菌。
铁蛋白不仅生物相容性好、稳定性高，而且具有耐化学变性、耐pH值变化和耐热性能。并且，由于铁蛋白可以形成上述的这两种笼形结构，使其能够作为良好的药物载体和生物矿化的反应容器，在其笼形结构的内腔合成超小无机纳米颗粒Co(O)OH、Co3O4、Fe2O3、CdS、Pt、Au、FeCo等。由此，铁蛋白在靶向治疗、药物递送载体、生物成像、生物检测、生物传感器和纳米疫苗等方面都有广泛的应用，非常有潜力发展为多功能纳米材料。
另外，通过铁蛋白的自组装能力，可促使其具有药物递送与其他功能相结合形成具有纳米结构的功能复合体。例如，已经有研究将铁蛋白荧光Cy5.5分子缀合或包裹磁铁矿纳米颗粒，使斑块组织通过荧光和磁共振成像被成像。由于它们具有可控的自组装，纳米粒子负载能力，易于修饰，具有广阔的潜力，可作为复杂多价结构和生物医学应用的平台。然而，利用铁蛋白进行包裹诊断试剂或治疗药物，以进行乳腺癌的早期诊断和靶向治疗，目前还无这种多功能纳米结构的复合体见诸公开。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在提供一种靶向乳腺癌的多功能纳米颗粒，以期一定程度上解决早期诊断和/或靶向治疗的技术问题之一。
第一方面，本发明实施例公开了一种靶向乳腺癌的多功能纳米颗粒，包括靶向载体及负载在所述靶向载体上的药物，所述靶向载体由重组铁蛋白的制成。
在本发明实施例中，所述重组铁蛋白具有治疗多肽、MMP酶切位点与铁蛋白连接形成的一级结构。
在本发明实施例中，所述治疗性多肽两端均连接有MMP酶切位点。
在本发明实施例中，所述治疗多肽为Wnt/β-catenin信号抑制剂，可阻止β-catenin与人乳腺癌细胞核区的LEF-1结合，促进癌细胞凋亡，并降低癌细胞生长和运动能力。
在本发明实施例中，所述药物包括量子点和阿霉素。
第二方面，本发明实施例公开了第一方面公开的多功能纳米颗粒的制备方法，包括制备重组铁蛋白及装载所述药物的步骤；其中，
所述重组铁蛋白的制备步骤包括：
构建表达所述重组铁蛋白的基因工程菌株；
将所述基因工程菌株经平板培养和液体诱导培养，得到含有所述重组铁蛋白的菌液；
收集所述菌液中的菌体，破碎，纯化，得到所述重组铁蛋白。
在本发明实施例中，所述基因工程菌株的构建过程包括：构建表达载体pET28a-HFn-CP1，将表达载体转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，在kana+平板上划线培养，挑取阳性单克隆菌落，即为所述基因工程菌株；其中，所述表达载体包括分别表达MMP酶切位点、治疗多肽及铁蛋白的的核苷酸序列；表达所述MMP酶切位点的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，表达所述治疗多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明实施例中，装载所述药物的步骤包括：
将量子点和阿霉素溶液添加至重组铁蛋白的尿素溶液混合，在黑暗中孵育后，并于尿素缓冲液中透析处理，得到浓缩物；
对所述浓缩物进行蔗糖密度梯度离心后，得到最终纯化的多功能纳米颗粒。
在本发明实施例中，所述蔗糖溶液的浓度梯度依次为10w/w％、15w/w％、20w/w％、25w/w％、30w/w％、35w/w％、40w/w％、45w/w％和50％。
第三方面，本发明实施例还公开了第一方面公开的多功能纳米颗粒、或第二方面公开的制备方法制得的多功能纳米颗粒在制备抗乳腺癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明实施例通过构建融合了针对癌细胞的治疗多肽的重组铁蛋白，并设计运用此独特的阿霉素重组铁蛋白纳米颗粒作为载药系统，装载量子点和阿霉素，通过细胞实验验证了其优于常规铁蛋白作为载体的药效及药物释放能力。结果表明，重组铁蛋白能够较好地在细胞中释放治疗多肽，其装载的阿霉素也能够精准释放实现靶向治疗。另外，通过装载量子点可实现肿瘤细胞的光学成像，以在癌症诊断和治疗中发挥作用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的HFn-CP1重组蛋白示意图。
图2为本发明实施例提供的HFn-CP1重组蛋白的表达载体结构示意图。
图3为本发明实施例提供的HFn-CP1纯化图；图3A为蛋白初纯-镍柱亲和层析SDS-PAGE图，M泳道为Marker，1～2泳道依次为上清和过柱流出液，3～7泳道均为5mM咪唑洗脱液，8～13泳道均为20mM洗脱液，14～15泳道为100mM咪唑洗脱液；图3B为图3A中6～11泳道经60℃加热10min后SDS-PAGE图；图3C为HFn-CP1的Western Blot结果图。
图4为本发明实施例提供的HFn野生型蛋白的纯化图；图4A为SDS-PAGE结果；图4B为Western Blot结果图。
图5为本发明实施例提供的目的蛋白蔗糖梯度离心结果图；左图位HFn-CP1(QD)的离心条带；右图为HFn-CP1(Adr+QD)的离心条带。
图6为本发明实施例提供的HFn(QD)纳米颗粒的TEM图。
图7为本发明实施例提供的HFn-CP1(QD)纳米颗粒的的TEM图。
图8为本发明实施例提供的DLS表征粒径分布；上图为HFn(QD)的粒径分布图；下图为HFn-CP1(QD)的粒径分布图。
图9为本发明实施例提供的不同药物的细胞活力抑制示意图；图中各组别的药物浓度设置均为0.1mg/mL，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，n＝3。
图10为本发明实施例提供的不同浓度梯度HFn-CP1(Adr+QD)对MDA-MB-468细胞活力抑制图(*表示P<0.05,n＝3)。
图11为本发明实施例提供的不同浓度梯度Adr及其与对MDA-MB-468细胞活力的抑制图(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，n＝3)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为起到早期诊断和靶向治疗人乳腺癌的目的，本发明实施例在铁蛋白药物递送系统的基础上引入基质金属蛋白酶，以提供其作为药物递送系统的靶向性。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一类锌离子和钙离子依赖的蛋白酶家族，几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。本发明实施例利用MMP酶在癌组织的表达水平高于正常组织的特点，设计通过MMP酶切位点连接铁蛋白(HFn)和有癌症治疗作用的小肽，组装成的纳米颗粒在肿瘤组织部位由高表达的MMP酶切下小肽，发挥靶向治疗作用。同时纳米颗粒还可同时装载量子点和抗癌药物阿霉素，起到早期诊断和靶向治疗的作用。
下方将具体介绍此种多功能纳米颗粒的制备及其性能。下方实施例所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
多功能纳米颗粒(简称HFn-CP1(Adr+QD))及其制备
一、材料及方法
1、HFn-CP1重组蛋白的制备
1.1、pET28a-HFn-CP1表达载体的构建
将野生型人源铁蛋白HFn的N端加上一段修饰短肽，此修饰短肽为MMP酶切位点+癌症治疗短肽+MMP酶切位点三部分构成。癌症治疗多肽可对乳腺癌细胞活力产生抑制作用，主要包含三个部分，分别为细胞穿透肽，核定位肽和发挥治疗作用的激活区肽。
其中，MMP酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，MMP酶切位点是指可以被MMPs酶家族识别并降解的多肽序列，即MMP酶的特征性降解底物/对象。
其中，治疗多肽为Wnt/β-catenin信号抑制剂，可阻止β-catenin与人乳腺癌细胞核区的LEF-1结合，促进癌细胞凋亡，并降低癌细胞生长和运动能力。治疗多肽的氨基酸序列为，如SEQ ID NO.4所示。
其中，β-catenin/Lef-1复合体是一种核反应转录因子，在Wnt/Wingless信号通路中发挥重要作用。Wnt/Wingless途径调控许多肿瘤发生过程，包括细胞生长、侵袭、迁移、克隆形成和人类癌症异种移植。当Wnt受体复合物解离后，β-Catenin与腺瘤性息肉组织大肠杆菌(APC)，轴蛋白和糖原合酶激酶3B(GSK3B)形成复合物，然后在细胞质中经历泛素介导的降解。否则，当Wnt与受体复合物结合时，β-catenin转位到细胞核，并与Lef-1/Tcf共转染因子结合。据报道，LeF-1的前76个氨基酸足以与β-catenin相互作用。此外，早期研究发现β-catenin可激活下游靶基因，包括BMP4、MYC和Cyclin D1，这些基因在促进乳腺癌的迁移、侵袭和肿瘤发生中起着重要的作用。因此，抑制β-catenin/Lef-1信号通路是新药开发的一个重要方向。
本发明实施例选择的治疗性多肽包含转录反式激活子(TAT，YGRKKRRQRRR)，核定位信号(NLS，RKRRK)和激活区序列(ATDEMIPF)蛋白的连续短肽。其中，转录反式激活子(TAT)是一种来自人类免疫缺陷病毒的穿透肽，它能在短时间内将蛋白质、脱氧核糖核酸、核糖核酸和纳米颗粒送入细胞质，效率极高。核定位信号(NLS)是由于稳定的β-连环蛋白易位到核中，影响TCF-4/LEF-1与Wnt靶基因的结合，核定位信号可帮助小肽进入细胞核。激活区序列(ATDEMIPF)是一种Wnt/β-catenin信号抑制剂，能够阻断β-catenin和Lef-1之间的相互作用，并能有效地抑制体内外肿瘤的发生。
为使此修饰短肽能够正常发挥效用，本发明实施例，将治疗性多肽两边都设计连接上MMP酶切位点(PLGLWA)，形成CP1结构，再与HFn连接，形成最终的重组HFn融合蛋白。
本发明实施例以质粒pET28a(+)为基础，构建一个能够同时表达CP1和HFn的表达载体，具体的pET28a-HFn-CP1表达载体的结构如图2所示，HFn及CP1的碱基序列如表1所示。选择pET28a质粒进行目的蛋白的表达纯化，将设计好的质粒交由武汉擎科生物科技公司进行基因全合成。
表1表达载体中相关核苷酸序列及表达蛋白中相关氨基酸序列
Figure BDA0003150138770000071
1.2、重组基因工程菌的构建
将上述构建正确的pET-28a-HFn-CP1及pET-28a-HFn(作为对照，其不具有如图1或图2中所示)，分别转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞。分别挑7个单菌落过夜摇菌，菌液按1％转接4h，0.5mM IPTG诱导6h，并将pET-28a空载体作为空白对照和未经诱导表达的重组质粒作阴性对照，SDS-PAGE蛋白电泳检测，挑选出表达量高的菌加入50％甘油-80℃保存，即为重组基因工程菌。
1.3、重组蛋白HFn-CP1及HFn的诱导表达及纯化
将重组基因工程菌经在含有Kana+抗性的平板.上划线培养，挑取单克隆，接入5mL含有50μg/ml的Kana+的LB液体培养基中，37℃180r/min培养12-16h。按1％接种量将菌液转接于500mL LB液体培养基，添加卡那抗生素，37℃180rpm振荡培养至菌液OD600为0.4～0.6之间，加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，20℃继续诱导培养16h后，8000rpm 4℃离心8min收集菌体。用预冷铁蛋白组装buffer清洗一遍菌体，离心弃上清收集菌体。
将收集的菌体用含5mM咪唑Binding buffer重悬，冰浴中用超声波破碎仪破碎40min，10000×g，4℃离心40min去除沉淀。
取上清作为蛋白初始样品，进行镍离子螯合层析梯度洗脱，咪唑浓度梯度为10mM，20mM，50mM，100mM，500mM，得到纯化的重组蛋白悬液HFn-CP1，及对照蛋白HFn。
1.4、重组蛋白Western blotting检测
将纯化的重组蛋白HFn-CP1样品进行SDS-PACE蛋白凝胶电泳；用湿转法将凝胶上的蛋白样品转移到PVDF膜上；将PVDF膜取出用PBST洗液清洗3次，用3％的BSA封闭1.5h；封闭结束后用PBST洗液清洗3次，再用500倍稀释鼠源铁蛋白多抗作为一抗孵育2h，PBST清洗3次后，稀释1000倍用HRP标记的羊抗小鼠IgG孵育2h；PBST清洗3次后用BeyoECL plus AB混合液显色观察。
2、HFn-CP1(Adr+QD)的制备
2.1、量子点、阿霉素的装载
选取目标条带为明显优势蛋白的样品先进行60℃的条件下加热10min，4℃、10000rpm条件下离心，去除不耐热的蛋白，目的蛋白(HFn-CP1及对照蛋白HFn)进一步纯化，接下来进行量子点的包装。
据文献报道，铁蛋白在8M高浓度尿素变性的作用下铁蛋白纳米笼会解聚，在缓慢稀释尿素浓度后铁蛋白纳米笼又会自组装。这一特性可以帮助铁蛋白纳米笼对药物和其他光学粒子的装载。
具体步骤如下，将1mg/mL HFn-CP1溶于8M尿素中，并在室温下轻轻涡旋30min以确保完全解离；接下来将阿霉素(简称Adr)以1mg/mL的最终浓度，量子点(简称QD，苏州影睿光学科技有限公司)以10μg/mL的最终浓度添加到溶液中。在黑暗中孵育10分钟后，将混合物转移至透析袋(截留分子量为3000Da)中，并针对梯度浓度的尿素缓冲液(7、5、3、2、1和0M透析)，每次4h)，在4℃下含有1mg/mL的Adr，以缓慢地重新组装HFn蛋白笼。最后将所得溶液用盐水透析过夜，以除去游离的Adr，即可得到装载后的HFn-CP1(Adr+QD)及HFn(Adr+QD)纳米颗粒，其中，Adr和量子点的浓度通过紫外吸收测定。
2.2、装载后的纳米颗粒的纯化
将透析后的混合物用蔗糖密度梯度离心进一步纯化，步骤如下。
制备蔗糖密度梯度：称50g蔗糖溶解于50mL铁蛋白组装buffer中，配成浓度为50％(W/W)的蔗糖母液,用铁蛋白组装buffer稀释为浓度为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％和50％的蔗糖梯度溶液；将贝克曼SW41转子专用透明离心管分成等体积的10份；将蔗糖梯度溶液按浓度由高至低顺序等体积加入离心管中，加入过程避免扰动不同浓度液体之间的界面。制备好的蔗糖梯度放4℃冰箱过夜以形成连续梯度。
将蛋白样品加入蔗糖密度梯度顶部预留空间，4℃、38000rpm离心4h，离心完毕后，根据量子点的颜色取出目标蛋白溶液。将目的蛋白在铁蛋白组装buffer中透析去除蔗糖，根据需要用超滤管对蛋白进行浓缩，即得到纯化的装载量子点及阿霉素的铁蛋白纳米颗粒。
用BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化的蛋白进行浓度测定。纯化蛋白经分装后冻存于-80℃冰箱，避免反复冻融。
3、HFn-CP1(Adr+QD)的表征
3.1、动态光散射和Zeta电位表征
将样品加入Size微量样品池或Zeta电位样品池，设置纳米粒度及表面电位分析仪参数(测量的温度设置为37℃，测量角度为173°)，测量粒子的粒径分布或Zeta电位。
3.2、透射电镜(TEM)表征
用镊子小心夹住TEM碳支持膜铜网边缘取出，将蛋白样品稀释为浓度约为0.1mg/mL，封口膜放置在冰上预冷；滴10μL样品到封口膜上，将铜网的碳支持面吸附在液滴上约1min；用定性滤纸吸去边缘液滴，将铜网吸附样品面吸附在2％磷钨酸负染液上负染5s；用定性滤纸小心吸去边缘液滴，将铜网吸附样品面朝上放在滤纸片上通风干燥一晚；第二天进行透射电镜镜检、拍照。
4、细胞实验
细胞复苏：取-80℃冻存的MDA-MB-468细胞(购买于Guangzhou Cellcook BiotechCO,Ltd公司，产品编号为CC0309)在37℃恒温水浴中快速复苏，将冻存管中的细胞悬液转移至离心管，加入含有10％FBS的L-15完全培养基2mL后，在1000rpm转速下离心4min，弃上清，用新鲜完全培养基重悬细胞后转移至T-25的细胞培养瓶中。
细胞培养：人乳腺癌细胞MDA-MB-468细胞用含有10％FBS的L-15完全培养基培养，培养环境为37℃恒温培养箱。细胞呈贴壁生长。
细胞传代：培养2-3天后，当MDA-MB-468细胞汇合度达到80％时，且观察细胞形态正常后，细胞可以进行传代。吸弃培养瓶中的培养基后用2mL PBS缓冲液进行清洗，吸弃PBS后加入1mL 0.25％的胰酶对细胞进行消化,在37℃培养箱中放置3分钟,倒置显微镜下观察细胞被完全消化下来后在瓶中加入2mL完全培养基终止消化，吸取细胞悬液至15mL离心管，在1000rpm转速下离心5分钟。弃上清，将细胞团用一定量完全培养基重悬后，按1:2的比例进行传代。
细胞冻存：配制细胞冻存液(10％FBS+10％DMSO)+80％培养基，与传代细胞重悬之前过程相同，不同的是细胞团用冻存液重悬，移入冻存管中。最后将冻存管放入梯度降温冻存盒中，在-80℃中保存。
细胞处理：当MDA-MB-468细胞汇合度达到80％时，将准备好的阿霉素和量子点均配置成1mg/mL的储备液，将HFn(QD)(仅用铁蛋白装载量子点)、HFn-CP1(QD)(仅用重组铁蛋白装载量子点)、HFn(Adr+QD)、HFn-CP1(Adr+QD)均利用超滤管浓缩至0.1mg/mL。用无酚红RPMI 1640培养基稀释。第二组MTT实验为HFn-CP1(Adr+QD)纳米颗粒的梯度浓度抑制实验。在第三组MTT实验中，为了验证癌症治疗多肽和铁蛋白纳米笼的治疗效果，控制Adr变量不变，进行乳腺癌细胞活力测定。
分别取10μL的Adr，一个用PBS稀释成125μg/mL的Adr溶液，一个用HFn-CP1纳米颗粒稀释成125μg/mL的Adr与100μg/mL HFn-CP1溶液，在60℃的条件下保持4h，使得铁蛋白纳米笼的亲水性药物通道打开使Adr进入纳米笼中。经由0.22μm滤膜过滤除菌后，进行MTT实验。
MTT实验测定细胞活力：
细胞处理：用0.25％胰酶消化MDA-MB-468细胞后，用血球计数板进行细胞计数，按96孔板中每孔8000个细胞的量对细胞悬液进行稀释，稀释后的细胞悬液按每孔200μL加入到96孔板中，将96孔板放回37℃，5％CO2培养箱中继续培养过夜，待细胞重新贴壁后进行后续实验。
药物处理：待细胞汇合至80％，将96孔板中的培养基吸出，每孔用PBS缓冲液轻柔清洗一遍，第一组MTT实验中，分别加入0.1mg/mL HFn(QD)、HFn-CP1(QD)、HFn(Adr+QD)、HFn-CP1(Adr+QD)以及对应浓度的QD与Adr，同时设置空白对照组。第二组MTT实验将HFn-CP1(Adr+QD)分别稀释为0.01、0.1、1、10、100μg/mL加入96孔板中。第三组MTT实验中，将加了HFn-CP1的Adr溶液与同一浓度的Adr溶液分别稀释成0.62、1.25、2.5μg/mL的Adr，按每个浓度6个复孔，每孔加入配好的100μL药物溶液，同时设置调零孔(不接种细胞，但后续操作与对照组相同)，给药完毕后放回培养箱继续培养24h。
MTT反应：24h后，小心吸弃96孔板中每孔的培养基，用PBS缓冲液轻柔清洗一遍后，每孔加入新鲜无酚红RPMI 1640培养基和10μL配制好的MTT溶液(5mg/mL，PBS溶解)，37℃，5％CO2条件下培养箱继续培养4h。
4h后，吸弃96孔板中的培养基，每孔加入100μL DMSO，轻柔震荡使结晶完全溶解，整个过程注意避光。将溶解完全的96孔板放入酶标仪上，设置参数测定570nm处每孔的吸光度。
细胞活性计算：细胞活性％＝(实验组吸光度-调零组吸光度)/(对照组吸光度-调零组吸光度)×100％
5、数据统计与分析
实验数据用平均值±标准偏差表示，用T检验对数据进行差异显著性检验。P＞0.05时，表示差异不显著；P＜0.05(*)时，表示有统计学差异；P＜0.01(**)为有显著统计学差异，P＜0.001(***)为有极其显著的统计学差异。
二、结果
1、目的蛋白表达与纯化
HFn-CP1蛋白的纯化：将已超声破碎的蛋白上清加入到已用binding buffer平衡好的镍柱中，循环上样两次后，依此用两个柱体积的wash buffer，elution buffer进行镍柱洗脱，并收集样品，以达到目标蛋白的初步纯化效果。用SDS-PAGE检验所收集到的目的蛋白样品，可看到在45kDa到55kDa之间有明显条带。将目标蛋白洗脱样品60℃加热10min，4℃、10000rpm条件下离心30min，取蛋白上清，得到较纯蛋白样品，并通过Western Blot验证，如图3所示。
HFn蛋白的纯化：方便用镍柱亲和层析进行纯化，实施例将野生型铁蛋白的N端加了一段6×his标签。经由相同的镍柱洗脱过程，及60℃加热并4℃离心过程，得到较纯的野生型铁蛋白，如图4所示，SDS-PAGE及Western Blot结果显示目标蛋白HFn在25kDa到35kDa之间。
2、量子点和阿霉素的装载
8M尿素解聚铁蛋白后，加入量子点和阿霉素轻轻涡旋30min，在对尿素逐步稀释后使铁蛋白逐渐聚合并完成对量子点和阿霉素的包装。为了分离游离的量子点阿霉素以及未包装成功的铁蛋白，实施例利用蔗糖梯度离心进行分离，在离心过后我们得到具有明显颜色提示的蛋白条带，如图5所示。图5中，量子点为黄色、阿霉素为红色；左侧为只包装了量子点的HFn-CP1，右侧为同时包装了量子点和阿霉素的HFn-CP1。结果能清晰可见左图具有一条黄色蛋白条带，右图具有一条深红色条带，即可说明左侧铁蛋白完成了量子点的装载，右侧完成了对于量子点和阿霉素的装载。
3、纳米颗粒的表征
为了对完成了装载的耐米颗粒结构进行验证，实施例利用TEM透射电镜对HFn-CP1蛋白进行表征。将HFn-CP1蛋白吸附在铜网表面，接下来利用负染液进行染色，将多余液体用滤纸吸干后，晾干铜网，制备电镜样。如图6显示HFn(QD)为笼形结构，黑色为量子点，而量子点的周围有一圈白色蛋白，且此纳米颗粒为10nm左右。如图7显示HFn-CP1(QD)与HFn(QD)结构基本相同，表明纳米颗粒HFn-CP1(QD)中添加的修饰多肽并不会对铁蛋白的笼形结构产生影响，并且证明铁蛋白笼已成功包裹量子点。
用动态光散射(DLS)表征纳米粒子的分布，如图8下图显示HFn-CP1(QD)纳米粒子的粒径为13.88±0.69nm，zeta电位为12.63±1.05mV。而如图8上图野生型铁蛋白HFn(QD)粒径为12.26±1.62nm，zeta电位为11.58±1.06mV。由此，结果表明HFn-CP1(QD)纳米粒子比野生铁蛋白HFn(QD)的外径略微偏大，间接证明了HFn-CP1(QD)纳米笼表面进行了修饰。
4、细胞实验结果
为了证实HFn-CP1(Adr+QD)纳米颗粒对乳腺癌细胞有抑制效果，本发明实施例还进行了一系列MTT实验证实HFn-CP1(Adr+QD)纳米颗粒的有效性。实施例分别将QD、ADr、HFn(QD)、HFn-CP1(QD)、HFn(Adr+QD)、HFn-CP1(Adr+QD)以同样条件的情况下加入到铺满MDA-MB-468乳腺癌细胞的96孔板中，处理48小时后，加入MTT再处理四个小时，测得每孔OD值。
结果如图9所示，QD几乎对细胞活力没有影响，HFn(QD)反而促进了癌细胞的生长。HFn(QD)、HFn-CP1(QD)的结果对比显示被铁蛋白包裹的治疗多肽CP1可被释放，并且也有明显的治疗作用。HFn-CP1(Adr+QD)相对于其他组别，具有最强的抑制乳腺癌细胞细胞活力的作用。总体来说，癌症治疗小肽与阿霉素均能发挥药效，对乳腺癌细胞的细胞活力产生抑制作用。
为了进一步证实HFn-CP1(Adr+QD)纳米颗粒对乳腺癌细胞细胞活力有影响，实施例还将加有不同浓度梯度的HFn-CP1(Adr+QD)纳米颗粒的培养基加入到已经铺满MDA-MB-468乳腺癌细胞的96孔板中，处理48小时后，加入MTT再处理四个小时，测得每孔OD值。结果如图10所示，100μg/mL的HFn-CP1(Adr+QD)纳米颗粒具有明显抑制细胞活力的作用，在1到100μg/mL之间细胞活力抑制具有浓度依赖性。
为了验证治疗多肽和铁蛋白纳米笼的治疗效果，本实施例控制Adr变量不变，进行乳腺癌细胞活力测定。取相同体积的Adr母液，一个加入PBS稀释，一个加入100μg/mL HFn-CP1纳米颗粒溶液(未装载Adr和QD)稀释，同样稀释Adr浓度为125μg/mL，60℃加热使Adr进入纳米笼。经由0.22滤膜过滤除菌后，对于这两种样品进行乳腺癌细胞的细胞活力测定。结果如图11所示，在1.25μg/mL相同浓度的Adr条件下，加入HFn-CP1纳米颗粒的样品具有更加明显的细胞抑制作用，这说明了治疗多肽和铁蛋白纳米笼可增强Adr具有的癌症细胞抑制作用。
综上所述，本发明实施例通过构建融合了针对癌细胞的治疗多肽的重组铁蛋白，并设计了独特的装载量子点和阿霉素的重组铁蛋白的纳米颗粒作为载药系统，通过细胞实验验证了其药效。结果表明，重组铁蛋白能够较好地在细胞中释放治疗多肽，其装载的阿霉素也能够精准释放实现靶向治疗。另外，该多功能纳米颗粒作为载药系统还通过装载量子点，可实现肿瘤细胞的光学成像，以在癌症诊断和治疗中发挥作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 靶向乳腺癌的多功能纳米颗粒、其制备方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccgctgggtc tgtgggca 18
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tatggtcgta aaaagcgtcg tcagcgtcgt cgtcgtaaac gtcgtaaagc aaccgatgaa 60
atgattccgt tt 72
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Pro Leu Gly Leu Trp Ala
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Thr Ala Thr Asn Leu Ser Ala Thr Asp Glu Met Ile Pro Phe
1 5 10

Claims (6)

1.一种靶向乳腺癌Wnt /β-catenin信号的多功能纳米颗粒，其特征在于，包括靶向载体及负载在所述靶向载体上的药物，所述靶向载体由重组铁蛋白制成；所述药物包括量子点和阿霉素；
所述重组铁蛋白具有由氮端至碳端依次连接的MMP酶切位点、治疗多肽、MMP酶切位点和铁蛋白形成的一级结构；编码所述铁蛋白的核苷酸序列如Sequence ID: NM_002032.3所示；
其中，所述MMP酶切位点的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述治疗多肽的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述治疗多肽为Wnt /β-catenin信号抑制剂，可阻止β-catenin与人乳腺癌细胞核区的LEF-1结合，促进癌细胞凋亡，并降低癌细胞生长和运动能力。
2.权利要求1所述的多功能纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括制备重组铁蛋白及装载所述药物的步骤；其中，所述重组铁蛋白的制备步骤包括：
构建表达所述重组铁蛋白的基因工程菌株；
将所述基因工程菌株经平板培养和液体诱导培养，得到含有所述重组铁蛋白的菌液；
收集所述菌液中的菌体，破碎，纯化，得到所述重组铁蛋白。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌株的构建过程包括：构建表达载体pET28a-HFn-CP1，将表达载体转化入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，在kana+平板上划线培养，挑取阳性单克隆菌落，即为所述基因工程菌株；
其中，所述表达载体包括分别表达MMP酶切位点、治疗多肽及铁蛋白的核苷酸序列；表达所述MMP酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达所述治疗多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，装载所述药物的步骤包括：
将量子点和阿霉素溶液添加至重组铁蛋白的尿素溶液混合，在黑暗中孵育后，并于尿素缓冲液中透析处理，得到浓缩物；
对所述浓缩物进行蔗糖密度梯度离心后，得到最终纯化的多功能纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述蔗糖溶液的浓度梯度依次为10w/w%、15 w/w%、20 w/w%、25 w/w%、30 w/w%、35 w/w%、40 w/w%、45 w/w%和50%。
6.权利要求1所述的多功能纳米颗粒、或权利要求2-5任一项所述的制备方法制得的多功能纳米颗粒在制备抗乳腺癌药物中的应用。
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