CN111544598A - 负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用，以及Survivin双抑制剂联合用药在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述双抑制剂包括小分子抑制剂YM155和蛋白抑制剂TmSm。本发明得到的纳米粒呈纳米笼球形结构，无粘连，粒径小，范围窄，便于静脉注射，靶向效果好；该纳米粒能被癌细胞分泌的MMP‑2有效切割而释放TmSm蛋白，并经由癌细胞表面的TfR1主动靶向癌细胞，并在细胞核中释放YM155。载Survivin双重抑制剂的铁蛋白纳米颗粒可以实现Survivin转录和蛋白水平的协同抑制并取得强大的抗肿瘤功效。

Description

负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，涉及含有Survivin双抑制剂的药物，或者负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒的制备以及其作为肿瘤治疗药物的用途。
背景技术
癌症是世界范围内的主要公共卫生问题，化疗、放疗和手术是当前癌症治疗的关键方法。然而，常规化学疗法由于不能特异性杀死肿瘤细胞而常常在癌症治疗中伴有严重的副作用。此外，癌症的耐药性的发展导致癌症的单药疗法不能取得满意结果。因此，联合疗法已经成为一种新颖的癌症治疗方法，它通过潜在的协同作用来增强抗癌效果。常见的联合治疗策略包括化疗药物、抗癌金属、基因药物和治疗蛋白药物。由于两种抗癌策略对同一靶点或者不同靶点的多重作用具有潜在的协同抗癌作用，治疗蛋白药物和化疗药物的联合应用在近期的实验研究和临床评价中受到了相当的重视。与化疗药物和抗癌金属相比，蛋白药物具有特异性强、低毒性和功能明确。同时，它也不存在基因药物的高免疫原性和遗传风险。尽管通过联合应用蛋白和化疗药物获得了令人鼓舞的实验和临床结果，但常规联用方法存在的缺陷却极大限制了两种抗癌药物的治疗潜力和临床应用。主要的缺陷之一是游离药物的短半衰期和化疗药物的系统毒性。另一个复杂性在于蛋白和化疗药物的不同的体内药代动力学分布，这将导致两种药物不能被大量富集在肿瘤部位并丧失协同抗癌作用。为了获得最佳的协同抗癌作用，需要开发可以解决以上关键问题的新策略。
近年来，各种基于合成材料(凝胶、聚合物、二氧化硅)和天然材料(脂质、寡糖、蛋白质)的药物递送系统已被设计用于共同递送蛋白和化疗药物。尽管这些递送系统可以改变药物的药代动力学并改善治疗效果，但是它们共同递送蛋白和化疗药物的能力仍然不能令人满意。值得注意的是，铁蛋白是包括人在内的真核生物中主要的铁转运和存储蛋白，由铁蛋白重链和轻链的24个亚基组成。不同于天然存在的铁蛋白，铁蛋白重链纳米颗粒(FTH1NPs)是由 24个亚基组装形成球形纳米笼，内径和外径分别约为8nm和12nm。FTH1NPs的化学或基因工程修饰能够有效递送各种治疗蛋白药物和成像剂，包括细胞毒性肽、流感病毒HA和eGFP。同时，FTH1NPs的中空内腔不仅作为金属的天然运输载体，而且可以包裹多种化疗药物，如阿霉素、姜黄素和顺铂。重要的是，Li等发现FTH1NPs能被转铁蛋白受体1(TfR1)特异性识别，该蛋白在肿瘤细胞表面过表达，并促进NPs的细胞摄取。另一项研究表明，FTH1NPs可以将碘化丙啶直接递送至细胞核。因此，FTH1NPs是一种可以有效地共同加载蛋白和化疗药物的递送载体，并具有良好的生物相容性和生物降解性。
Survivin，凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员之一，是肿瘤治疗的重要靶标，它能够抑制细胞凋亡、调节细胞有丝分裂以及与肿瘤细胞多药耐药密切相关。它在大多数正常成人组织中检测不到，而在大多数癌细胞中过表达，例如肺癌和胰腺癌。YM155是一种新型的Survivin小分子抑制剂，能与Survivin启动子 Sp1结合，并阻止癌细胞中Survivin的转录。在最近完成的I/II期临床试验中， YM155在晚期非小细胞肺癌患者中表现出令人鼓舞的抗癌作用，但不幸的是，其临床应用存在两种缺点。一种重要的缺陷是由高剂量YM155的非特异性细胞摄取引起的系统毒性。另一方面，虽然YM155能在Survivin的转录水平进行抑制，但是却不能有效抑制肿瘤细胞中已周转的Survivin蛋白。因此，一种有效的药物被迫切需求与YM155联合应用，它能抑制肿瘤细胞中Survivin的蛋白含量和降低YM155的使用剂量。显性负突变体是一种因结构变化而失去正常的生物学功能的蛋白质，它可竞争性地抑制其相应的野生型蛋白而阻断野生型蛋白的生物学功能。显性负突变Survivin是利用非功能性蛋白质与野生型 Survivin竞争，从而抑制其功能。在我们之前的研究中，细胞可渗透的显性阴性TATm-Survivin(T34A)蛋白(TmSm)可以诱导包括乳腺癌Bcap-37、胰腺癌 SW1990和肝癌SMMC-7721多种癌细胞的细胞凋亡，并能抑制Bcap-37荷瘤裸鼠中肿瘤组织的生长。然而，TmSm蛋白的非特异性细胞渗透抑制了高度表达Survivin的某些生理细胞的增殖，包括T淋巴细胞、造血细胞和血管内皮细胞。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供Survivin双抑制剂联合用药在制备治疗肿瘤药物中的应用，通过蛋白抑制剂TmSm和小分子抑制剂YM155协同作用来增强抗癌效果。
本发明的第二个目的在于提供一种含有Survivin双抑制剂的药物。
本发明的第三个目的在于提供一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒，共同负载TmSm和YM155的多功能铁蛋白纳米颗粒通过主动靶向和核靶向直接靶向癌细胞核，可在细胞核中释放YM155，抑制Survivin的转录水平，实现Survivin转录和蛋白水平的协同抑制并取得强大的抗肿瘤功效。
本发明的第四个目的在于提供一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒的制备方法。本发明制备得到的纳米粒呈纳米笼球形结构，无粘连，粒径小，范围窄，便于静脉注射，靶向效果好，该纳米粒能被癌细胞分泌的MMP-2有效切割而释放TmSm蛋白，并经由癌细胞表面的TfR1主动靶向癌细胞，并在细胞核中释放YM155。
本发明的第五个目的在于提供一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
为实现上述第一个目的，本发明公开以下技术方案：Survivin双抑制剂联合用药在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述双抑制剂包括小分子抑制剂YM155 和蛋白抑制剂TmSm。
作为一个优选方案，所述肿瘤为Survivin过表达的肿瘤，包括肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌以及膀胱癌。这些肿瘤细胞中的Survivin高表达，所以小分子抑制剂YM155和蛋白抑制剂TmSm能够抑制Survivin转录和蛋白水平，以促进肿瘤细胞凋亡。
为实现上述第二个目的，本发明公开以下技术方案：一种含有Survivin双抑制剂的药物，所述药物包括小分子抑制剂YM155、蛋白抑制剂TmSm以及药学上可接受的载体。
作为一个优选方案，所述药学上可接受的载体包括铁蛋白纳米颗粒铁蛋白纳米颗粒、脂质体、PEG-PLGA纳米颗粒、碳纳米管和无机纳米颗粒。这些载体均能用于小分子药物和蛋白药物的包封，纳米级尺寸的载体能够通过肿瘤血管漏洞(100-780nm)实现在肿瘤部位的聚集。
为实现上述第三个目的，本发明公开以下技术方案：一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒，所述双抑制剂包括小分子抑制剂YM155和蛋白抑制剂TmSm，以人铁蛋白重链亚基FTH1作为蛋白载体，TmSm通过基因工程的手段串联融合到FTH1单体的C端，YM155包裹于纳米颗粒的中空内腔。
为实现上述第四个目的，本发明公开以下技术方案：一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)以人铁蛋白重链亚基FTH1作为蛋白载体，选取MMP-2敏感肽作为酶切割识别位点，选取柔性肽(G4S)2作为连接肽，利用重叠延伸PCR的方法融合成重组基因FTH1-Linker-MMP2-TmSm(FTS)；
(2)取适量步骤(1)制备的FTS蛋白包涵体溶解液，将YM155储备液加入蛋白溶液中，FTS纳米颗粒与YM155摩尔比为1：10-1：200，混合物在 2-8℃搅拌30-120min；
(3)将混合液放入预处理的透析袋中，按照1：10的体积逐级放入4mol/L 尿素的透析液A、2mol/L尿素的透析液B、1mol/L尿素的透析液C和0mol/L 尿素的透析液D中；
(4)透析结束后，透析溶液在2-8℃，10,000-14,000rpm离心10-30min，收集上清液，超滤管浓缩，滤膜无菌过滤。
作为一个优选方案，步骤(1)混合物在4℃搅拌60min。
作为一个优选方案，步骤(1)FTS纳米颗粒与YM155摩尔比为1：200。
作为一个优选方案，步骤(4)透析溶液在4℃，12,000rpm离心20min。
为实现上述第五个目的，本发明公开以下技术方案：一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为Survivin 过表达的肿瘤，包括肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌以及膀胱癌。
作为一个优选方案，当肿瘤是肺癌和胰腺癌时，有效剂量为 0.05-0.35μmol/LFTS/YM155NPs。
制备获得的纳米粒粒径为31.0±3.4nm，包封率为19.34±1.21％，载药量为 0.08±0.04％。当荷瘤裸鼠模型是肺癌时，尾静脉注射纳米粒的有效肿瘤富集时间为24h，在10.81mg/kg纳米粒剂量下治疗15天的肿瘤抑制率达到 89.05±5.14％。
FTS/YM155NPs对癌细胞中的Survivin具有协同抑制，从而实现更强的促凋亡作用。其中，TmSm通过遗传修饰与FTH1单体的C端融合。同时，在FTH1和TmSm之间插入MMP-2敏感肽。这一敏感肽可以被肿瘤微环境富含的MMP-2识别切割，并原位释放促进细胞凋亡的TmSm，从而避免TmSm对过表达Survivin的正常细胞的毒副作用。此外，载YM155的FTH1纳米笼通过主动靶向和核靶向直接靶向癌细胞核，可在细胞核中释放YM155，抑制 Survivin的转录水平。
本发明的优点在于，载Survivin双重抑制剂的FTH1纳米颗粒可以实现 Survivin转录和蛋白水平的协同抑制并取得强大的抗肿瘤功效，为基于不同靶点的蛋白和化疗药物共同递送提供了广阔的前景，这对于未来的临床应用具有重要意义。本发明的载Survivin双重抑制剂的FTH1纳米颗粒制备方法简单，适宜大规模连续生产。
附图说明
图1为重组质粒的构建及重组蛋白的表达与纯化。其中，A：重组质粒的构建示意图。B：重组蛋白的三维结构示意图。C：三种纯化蛋白的SDS-PAGE电泳分析。
图2为装载YM155的NPs的制备和理化特性。其中，A：不同蛋白质/YM155 进料摩尔比制备的YM155负载的纳米笼的包封效率(EE)和药物/纳米笼摩尔比。数据表示为Mean±SD(n＝3)。B：通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS) 测量基于FTH1NPs的形态和粒径分布。(比例尺＝50nm)
图3基于FTH1的纳米颗粒的理化表征。数据表示为Mean±SD(n＝3)。aND 表示未测定。
图4为体外稳定性和药物释放研究。其中，A：在37℃下与PBS(pH 7.4)和 50％FBS孵育48h后的装载YM155的NPs的稳定性评估。B：在pH 7.4和5.0 的PBS缓冲液中FTH1和FTSNPs的体外药物释放曲线。数据表示为 Mean±SD(n＝3)。**P<0.01，n.s.表示无显著(P>0.05)。
图5为MMP-2催化的FTS的裂解和动力学特征。其中，A：重组蛋白FTS 和MMP-2介导的切割位点的结构。B：Western blot测定A549和Capan-2细胞中的MMP-2和Survivin表达水平。C：A549和Capan-2细胞的条件培养基中分泌的MMP-2的明胶酶谱分析。D：与A549条件培养基孵育3h和6h的FTS的 MMP-2介导的裂解测试。E：MMP-2催化的FTS裂解的动力学特征。
图6为TfR1对A549和Capan-2细胞介导的FTH1NPs的细胞摄取。其中，A：CLSM观察到的FTS和FTH1NPs的细胞分布。红色和蓝色分别表示DOX 和Hoechst33342。B：通过流式细胞术检测FTS和FTH1NPs的平均荧光强度。 C：在HUVEC的A549和Capan-2细胞和对照细胞上的TfR1表达的Western印迹。D：分别在不存在或存在10倍摩尔过量的抗TfR1mAb的情况下与FTH1/DOX和FTS/DOX NPs孵育的A549和Capan-2细胞的荧光图像。红色和蓝色分别表示DOX和Hoechst33342。E：FTS和FTH1NPs的平均荧光强度。数据表示为Mean±SD(n＝3)。*P<0.05，n.s.表示无显著性(P>0.05)。(比例尺＝50μm)
图7为基于FTH1的NP对A549和Capan-2细胞的细胞毒性测定。其中， A：与FTS和FTS/YM155NPs孵育24和48h的A549和Capan-2细胞的细胞活力。B：24和48h后，A549和Capan-2细胞上FTS和FTS/YM155NPs的IC50值。C：与TmSm、YM155、FTH1、FTS、FTH1/YM155和FTS/YM155NPs孵育24h和48h的A549和Capan-2细胞的细胞活力。FTS和FTS/YM155NPs的浓度保持在0.08μmol/L，TmSm、YM155、FTH1和FTH1/YM155NPs的浓度等于FTS/YM155NPs中装载的药物含量。数据表示为Mean±SD(n＝3)。n.s.表示无显著性(P>0.05),*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
图8为通过流式细胞术分析A549和Capan-2细胞的凋亡。其中，A：与 TmSm、YM155、FTH1、FTS、FTH1/YM155和FTS/YM155NPs孵育48h的 A549和Capan-2细胞的凋亡测定。FTS和FTS/YM155NPs的浓度保持在 0.08μmol/L，TmSm、YM155、FTH1和FTH1/YM155NPs的浓度等于FTS/YM155 NPs中装载的药物含量。B：描述凋亡细胞的总百分比的柱状图。数据表示为Mean±SD(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
图9为基于FTH1的纳米颗粒的生物相容性分析。其中，A：在37℃下用不同浓度的YM155、TmSm、FTH1、FTS、FTH1/YM155、FTS/YM155NPs和FTS NPs与YM155的混合物处理小鼠红细胞悬液3h后的溶血率。超纯水(+)和PBS(-) 分别作为阳性和阴性对照。B：溶血分析的照片以观察上清液中是否存在溶血现象。C：主要器官和肿瘤的组织学检查。数据表示为Mean±SD(n＝3)。(比例尺＝50μm)。
图10为基于FTH1的NPs的体内成像和抗肿瘤活性。其中，A：经皮下注射A549细胞建立A549荷瘤的Balb/c裸鼠模型。尾静脉注射载花青素的 NPs(Gallocyanine，ex/em＝740/830nm)，分别在0.5、4和24h成像。注射后24h，剥离裸鼠的主要器官和A549肿瘤进行离体荧光成像。红色圆圈标记肿瘤位置。从红色到蓝色的色带代表从高到低的荧光强度。B：通过尾静脉注射用不同药物处理的A549荷瘤裸鼠的肿瘤体积。C：治疗过程中小鼠体重的变化。D：治疗结束后的肿瘤大小的测量。E：治疗结束后的肿瘤重量的测量。数据表示为 Mean±SD(n＝5)。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
图11为治疗组之间的肿瘤重量和肿瘤抑制率的比较。数据表示为 Mean±SD(n＝5)。aP<0.05表示与FTS NPs、FTH1/YM155NPs和FTS NPs+YM155 组相比；bP<0.01和dP<0.05表示与TmSm组相比；cP<0.001表示与YM155组相比。
图12为不同药物组处理的肿瘤组织的HE染色和免疫组化分析。其中，A： HE染色观察肿瘤组织形态，免疫组织化学分析细胞凋亡相关蛋白Survivin和 Caspase-3的表达。所有图像均放大400倍拍摄。(比例尺＝50μm)B：通过Image J定量分析Survivin和Caspase-3的相对平均光密度。与生理盐水组相比， *P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所推荐的条件进行实验。
实施例1.重组质粒的构建及重组蛋白的表达纯化
试剂与试剂盒：Premix Taq DNA polymerase，Pyrobest DNA polymerase，限制内切酶(Ned I、Xho I)，蛋白分子量标准品Premixed Protein Marker(Low)，蛋白上样缓冲液4×Protein SDS PAGE Loading Buffer，DNA marker购置于宝生物工程有限公司(大连)。异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素购自 Sigma-Aldrich公司(美国)，SPSepharose FF阳离子交换柱购置于GE公司(美国)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。
菌株和质粒：E.coli DH5α和BL21(DE3)(Invirogen，USA)分别作为质粒克隆和表达菌株，重组质粒pET-24a-TmSm为本实验室所构建，pGEM-FTH1购置北京义翘神州生物技术有限公司，pET-24a(+)购置Invirogen。
试剂配制：
卡那霉素(Kan)母液(50mg/mL)配制：用电子天平准确称量卡那霉素粉剂 0.5g，加入10mL超纯水定容，充分溶解，将溶液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，每1mL分装1支，-20℃保存，备用。培养大肠杆菌时，每1mL LB培养基中加入1μL卡那霉素溶液(1：1000)。终浓度为50μg/mL。
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)母液(1mol/L)配制：用电子天平准确称量2.38g IPTG溶解于10mL超纯水中，配制成238mg/mL的水溶液，用0.22μm 无菌滤膜过滤除菌后，分装1mL/支，-20℃保存，备用。诱导时每1mL LB培养基中加入1μL IPTG母液。终浓度为1mmol。
LB培养基的配制：根据《分子克隆实验指导》配制每升培养基中加入950mL 去离子水，10g蛋白胨，10g NaCl，5g酵母膏，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L。随后121℃高压灭菌20min。
5×蛋白电泳缓冲液(Tris-甘氨酸)：称取Tris碱15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加双蒸水定容至1L。
15％蛋白电泳分离胶：量取ddH2O 2.3mL，30％丙烯酰胺5.0mL，Tris-HCI(pH 6.8)2.5mL，10％SDS 100μL，10％APS 100μL，TEMED 100μL，混合均匀。
5％蛋白电泳浓缩胶：量取ddH2O 3.15mL，30％丙烯酰胺0.75mL，Tris-HCl (pH6.8)0.57mL，10％SDS 45μL，10％APS 45μL，TEMED 4.5μL，混合均匀。
考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝(R-250)2g，量取乙醇200mL，冰醋酸 100mL，去离子水750mL，滤纸过滤，室温保存。
PBS缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4，定容至 1L，用NaOH溶液或浓HCl溶液调pH至7.4。
0.2M pH7.1磷酸盐缓冲母液(PB)：根据《分子克隆第二版》配制，先配制 0.2mol/LNa2HPO4 1L，称取28.392g Na2HPO4(Mw＝141.96)，用超纯水定容至1L。配制0.2mol/LNaH2PO4 1L，称取27.598g NaH2PO4 .H2O(Mw＝137.99)，用超纯水定容至1L。Na2HPO4和NaH2PO4按31.5mL：68.5mL的比例混合。
20mmol/L pH7.1磷酸盐缓冲液(PB)：取100mL 0.2mol/L pH6.5磷酸盐缓冲母液(PB)，用超纯水定容至900mL，通过pH计用NaOH溶液或H3PO4溶液调节 pH至7.1。
包涵体洗涤液：20mmol/L PB，50mmol/L NaCl，2mol/L尿素，pH 7.1。量取500mL20mmol/L PB，称取1.461g NaCl，60.06g尿素溶解。通过pH仪用NaOH 溶液或H3PO4溶液调节pH至6.5。
包涵体洗涤液：20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，0.5％Triton X-100， 0.5mol/L尿素，1mol/L氯化钠，2.5mmol/L EDTA，pH10.0。
包涵体溶解液：20mmol/L PB，8mol/L尿素，pH 7.1。量取500mL 20mmol/L PB，称取240.24g尿素溶解。通过pH计用NaOH溶液或H3PO4溶液调节pH至 7.1。
DEAE Sepharose FF阴离子交换层析缓冲液：
缓冲液A：20mmol/L pH7.1磷酸盐，8mol/L尿素，pH7.1。100mL配制方法：取10mL的0.2mol/L pH7.1的磷酸盐缓冲液，加入双蒸水40mL，加入48g 的尿素充分溶解后，定容至100mL。而后加入微量的磷酸调节pH至7.1，过微滤膜后使用。
缓冲液C：20mmol/L pH7.1磷酸盐，8mol/L尿素，1mol/L NaCl缓冲液， pH6.50。100mL配制方法：取10mL的0.2mol/L pH7.1的磷酸盐缓冲液，加入双蒸水30mL，而后加入5.844g NaCl溶解后，再加入48g尿素溶解，定容至100mL 后用少量的浓NaOH溶液调节pH至7.1，过膜后使用。
透析液A：20mmol/L PB，4mol/L尿素，1mol/L NaCl，5％甘油，pH 7.4。
透析液B：20mmol/L PB，2mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，5％甘油，pH 7.4。
透析液C：20mmol/L PB，1mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，5％甘油，pH7.4。
透析液D：20mmol/L PB，0mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，5％甘油，pH 7.4。
Bradford法测蛋白浓度相关溶液：
BSA蛋白标准液(mg/mL)：将10mg BSA溶解于10mL无菌水中，分装成 1mL每管。
Bradford工作液：准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，加入50mL 95％的乙醇，100mL85％的磷酸，用去离子水定容至1L，棕色瓶避光保存。
重组质粒的构建
引物设计：
表1.1 引物序列与特征(SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.6)
Figure RE-GDA0002548518090000091
PCR反应体系和反应条件：
表1.2 PCR反应体系
Figure RE-GDA0002548518090000101
表1.3 PCR反应条件
Figure RE-GDA0002548518090000102
FTH1片段以F和R为上游和下游引物，扩增携带限制性内切酶Nde I和Xho I酶切位点的目的片段，PCR反应体系和反应条件如表1.2和表1.3所示。 FTH1-Linker-MMP2-TmSm(FTS)片段利用引物F1、R2’和引物F1’、R2扩增 FTH1和TmSm基因，然后以FTH1和TmSm扩增片段为目的基因，利用引物 F1、R2将两段片段重叠拼接起来(图1A)。
利用琼脂糖凝胶电泳分析TmSm的基因扩增情况，并通过琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒从PCR反应液中纯化DNA。将上述回收所得的目的片段和提取的表达载体进行双酶切，双酶切体系见下表1.4。酶切温度为37℃，酶切时间为3-5h。酶切后，PCR产物的酶切反应液按照上述步骤进行回收。将双酶切回收后的目的基因和表达载体按表1.5的连接体系进行连接。连接温度为16℃，连接时间为10h。
表1.4 双酶切体系
Figure RE-GDA0002548518090000103
Figure RE-GDA0002548518090000111
表1.5 酶切产物连接体系
Figure RE-GDA0002548518090000112
待连接反应结束后，瞬时离心PCR反应管并将离心管置于冰上，进行后续的DH5α转化实验。次日，挑取单克隆菌落于5mL的含有Kan的LB液体培养基中培养16h，之后取1mL菌液于无菌的EP管中送上海睿迪生物科技有限公司进行测序。将测序正确的菌株进行质粒提取，将1μL提取的重组质粒转入到 E.coli BL21感受态细胞中。
重组蛋白的表达及纯化
重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达：从-20℃中取出保藏的菌株，取50μL 菌液置于5mL的含5μL 50mg/mL Kan(50μg/mL)LB培养基的LB培养基中， 37℃，200rmp，过夜培养；取过夜培养的菌液1mL于100mL含100μL 50mg/mL Kan(50μg/mL)的LB培养基摇瓶中，37℃，200rmp培养3.5h左右，(取1mL菌液用于SDS-PAGE)至OD600＝0.6左右，加IPTG(75μL)(终浓度为0.75mmol/mL) 后转入30℃，200rmp培养10h；10h后，收集菌液(1mL)，用SDS-PAGE电泳鉴定产物表达情况，证明目的蛋白成功表达。
FTH1蛋白的菌体破碎及热击纯化：将培养液8,000rpm离心10min获得湿菌体，并用10mL PBS重悬菌体，8,000rpm离心10min。湿菌体用10mL PBS重悬，转移至高压均质机中，1,000MPa压力下破碎菌体3次。破碎的菌体置于离心机4℃，12,000rpm离心10min后收集上清液，SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达。上清液分别置于60、70和80℃水浴锅中热击10min后，置于离心机37℃， 12,000rpm离心20min后收集上清液。
FTS蛋白菌体破碎及包涵体洗涤：将培养液4℃，8,000rpm离心10min，获得湿菌体；湿菌体用10mL细胞破碎液重悬，4℃，8,000rpm离心10min；将湿菌体用细胞破碎液重悬，倒入高压均质机中，1000MPa压力下破碎菌体(破碎3 次)；将破碎的菌体4℃，10,000rpm离心15min，弃去上清，收集沉淀，得到的沉淀为粗包涵体(在上清液和沉淀中分别取样，用于SDS-PAGE)；将粗包涵体重悬于10mL包涵体洗涤液中洗涤，冰浴下400rpm搅拌10min。洗涤后于12000rpm， 4℃下离心10min，弃去上清，收集沉淀。重复此步3次，收集沉淀为精制包涵体；将精制包涵体溶解于10mL包涵体溶解液中，冰浴下400rpm搅拌4h，于 12000rpm，4℃下离心20min，去掉少量不溶物，上清即为溶解的包涵体，于4℃保存。
DEAE Sepharose FF柱纯化：利用超纯水清洗1mL DEAE Sepharose FF预装柱中的20％乙醇，随后用缓冲液A冲洗5个柱体积至吸光值回到基线，速率 1mL/min。FTH1蛋白上清液和FTS蛋白包涵体溶解液用0.22μm滤膜过滤，5mL 蛋白溶液上柱，用平衡缓冲液继续冲洗去除未结合的杂蛋白，速率1mL/min。以平衡缓冲液A和洗脱液B组成的线性梯度缓冲液(0％-100％B)洗脱15个柱体积，收集洗脱峰的溶液，SDS-PAGE分析蛋白纯度。
将收集的洗脱液用溶解缓冲液稀释，并放入预处理的透析袋中。按照1：10 的体积逐级放入透析液A(4mol/L尿素)、透析液B(2mol/L尿素)、透析液C(1mol/L 尿素)和透析液D(0mol/L尿素)中，每种透析液透析6h。FTH1蛋白利用PBS作为透析液，透析三次，每次6h。以上都在4℃下进行。随后用50KDa的超滤管 4℃，5,000rpm离心超滤，倒去滤液重复数次浓缩蛋白，随后-20℃保存蛋白。浓缩的蛋白利用Bradford法测蛋白浓度。
SDS-PAGE蛋白电泳：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，准备2个干净的50mL 烧杯。把玻璃板在灌胶支架上固定好。按比例配好15％分离胶，用移液枪快速加入，大约5cm左右，之后加少许20％乙醇，静置30min。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。倒出20％乙醇并用滤纸把剩余的20％乙醇吸干，按比例配好5％浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置30min。拔出样梳后，在上槽内加入1×蛋白缓冲液(用5×蛋白缓冲液稀释)，没过锯齿。样品准备：取蛋白样品30μL与4×上样缓冲液10μL(最终稀释成1×上样缓冲液loadingbuffer)(当需要进行非还原电泳时用非还原的上样缓冲液)混合，煮沸10min，离心。上样根据蛋白浓度可选择5-30μL，蛋白样品上样20μL，蛋白marker上样10μL。接通电源，恒压80V跑30min。接着换电压到120V，待溴酚蓝跑出胶后(40-50min左右)关闭电源。凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板放置于大培养皿内，加入染色液，染色30min。脱色：染色后的凝胶板用水漂洗数次，置于微波炉中高火加热15min进行快速脱色。脱色后，将凝胶板用水漂洗数次，置于生物电泳图像分析系统中进行蛋白电泳图像拍摄(图1B和1C)。
实施例2.载YM155的纳米颗粒的制备及表征
试剂：YM155和阿霉素(DOX)购置于阿拉丁生化科技有限公司，Bradford 法蛋白质浓度测定试剂盒购置于生工生物工程有限公司(上海)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。
试剂配制：相关溶液参照实施例1中的试剂配制。
载YM155的纳米颗粒的制备
紫外可见全波长扫描：在选择对铁蛋白进行酸变性还是碱变性之前，采用 UV-Vis光谱法分析被包埋物质YM155在酸碱介质下的稳定性。将1mL YM155 标准溶液(100μmol/L)用PBS(pH＝2和12)稀释至10mL，并以PBS为空白对照，用紫外可见分光光度计在200-800nm范围内进行全波长扫描。
FTS/YM155纳米颗粒的制备(图2A)：取适量FTS蛋白包涵体溶解液 (2.0μmol/L)于小烧杯中，将不同体积的YM155储备液(1mmol/L)加入蛋白溶液中，使FTS NPs/YM155比率分别为1：10、1：20、1：50、1：100和1：200，混合物在4℃搅拌30min。将混合液放入预处理的透析袋中，按照1：10的体积逐级放入透析液A(4mol/L尿素)、透析液B(2mol/L尿素)、透析液C(1mol/L尿素)和透析液D(0mol/L尿素)中，每种透析液透析6h。以上都在4℃下进行。透析结束后，透析溶液在4℃，12,000rpm离心20min。收集上清液，用50kDa超滤管浓缩，0.22μm滤膜无菌过滤，并在4℃下避光储存以备后用。
FTH1/YM155纳米颗粒的制备(图2A)：取适量FTH1蛋白(2.0μmol/L)于小烧杯中，置于磁力搅拌器中缓慢搅拌(350rpm)，向小烧杯中滴加0.1mol/L HCl 溶液，调节pH至2.0以使FTS纳米颗粒分解成亚单元。将不同体积的YM155 储备液(1mmol/L)加入蛋白溶液中，使FTH1NPs/YM155比率分别为1：10、1： 20、1：50、1：100和1：200，混合物在2-8℃搅拌30-120min，优选在4℃搅拌60min。随后，用0.1mol/L NaOH将溶液pH增加至7.4，继续在4℃搅拌2h。为了除去游离和吸附的YM155分子，将所得溶液装入透析袋(7000Da)中，置于 PBS(pH＝7.4)中透析3次，每次透析间隔为12h。透析结束后，透析溶液在2-8℃， 10,000-14,000rpm离心10-30min，优选透析溶液在4℃，12,000rpm离心20min。收集上清液，用30kDa超滤管浓缩，0.22μm滤膜无菌过滤，并在4℃下避光储存以备后用。
FTS/YM155NPs理化性质的表征
形貌观察：纳米颗粒的形貌通过透射电子显微镜(TEM)进行观察。简要地说，取10μL样品(0.5mg/mL)滴在包被碳膜的铜网上，静置10min后用滤纸片将样品溶液从铜网侧边吸干。然后再滴加负染液(2％磷钨酸，pH＝7.0)，2min后用滤纸片将负染液从铜网侧边吸干，并置于通风处干燥10min。最后，在JEOL 1400 透射电子显微镜下观察样品(加速电压为200kV，放大倍数4-5万倍)(图2B)。
粒径和Zeta电位测定：将纳米颗粒稀释成0.5mg/mL，在室温(25℃)条件下用Zetasizer 3000HS激光粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径分布和zeta电位，至少重复测量三批次的纳米颗粒(图3)。
包封率和载药量的测定：将1mmol/L YM155母液逐级稀释成250、100、50、 10、1、0.1、0.01、0μmol/L，利用紫外可见分光光度法测定YM155在349nm 处的吸光度(OD349nm)。以YM155的浓度为横坐标，吸光度OD349nm为纵坐标，绘制YM155的标准曲线。向含有100μL蛋白样品(1mg/mL)的2mL EP管中加入 900μL PBS(pH＝2.0)，置于恒温摇床中(37℃，200rpm/min)振荡去组装30min。孵育30min后，12000rpm/min离心5min除去药物载体，取上清液。采用紫外可见分光光度法测定YM155的吸光度，代入标准曲线得到YM155的浓度，并按下列公式计算纳米颗粒的包封率(EE)和载药量(LC)：
包封率(EE)＝NPs中YM155质量/总的YM155质量×100％
载药量(LC)＝NPs中YM155质量/NPs的质量×100％
纳米颗粒的全波长扫描：精密量取YM155、FTS及FTS/YM155NPs适量，用超纯水稀释配制成适当浓度的溶液，以超纯水为空白对照，用紫外分光光度计在200-800nm范围内进行全波长扫描。
稳定性分析：将颗粒样品(终浓度1mg/mL)分散在PBS(pH＝7.4)和50％ FBS(v/v)中，在37℃下以100rpm/min振荡孵育。通过动态光散射(DLS)在0和 24h检测NPs的粒径，并评估载YM155NPs的稳定性(图4A)。
体外药物释放测定：采用透析法对纳米颗粒进行体外释放考察，分别选取 pH＝7.4和pH＝5.0的释放介质分别模拟人体的正常体液环境和肿瘤的酸性体液环境，各取3份10mL 1mg/mL FTS/YM155和FTH1/YM155纳米粒溶液，分别置于透析袋(7000Da)中，并将透析袋放入装有50mL PBS(pH＝7.4和5.0)的锥形瓶中，将锥形瓶置于37℃恒温摇床中，振荡速度100rpm。分别在设定时间点(1、 2、4、8、12、18、24、36、48和72h)取样1mL，随后立即补加等量的释放介质。取出的溶液过12000rpm离心5min除去药物载体，采用紫外可见分光光度法测定上清液中YM155的含量(Ct)，测定释放前纳米颗粒中YM155的含量(C0)，计算累计释放百分率Ft：Ft＝(ΣCt/C0)×100％，以Ft对时间t作图，获得药物释放曲线(图4B)。
实施例3.FTS/YM155NPs的体内外抗肿瘤活性检测
试剂与试剂盒：MTT，青链霉素混合液，DMSO购置于北京索来宝公司；RPMI-1640培养基，胎牛血清，胰酶购自Gibco公司(美国)；anti-survivin单克隆抗体(兔源)，anti-MMP2单克隆抗体(兔源)，anti-βactin单克隆抗体(鼠源)，羊抗兔/羊抗鼠IgG-HRP二抗购自Proteintech Group(美国)。其他的生化试剂属于国产常规的分析纯试剂。
细胞株和动物：
人肺腺癌细胞A549和人胰腺癌细胞Capan-2，培养条件为37℃，5％CO2浓度，培养基为RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)。Balb/c-nu雌性裸鼠(4-6 周龄，20±2g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
试剂配制：
RPMI1640/DMEM完全培养基：量取90mL RPMI1640/DMEM培养液(1×)，加入10mL胎牛血清，1mL青霉素(100IU/L)和1mL链霉素(100mg/L)，充分混匀，置于4℃保存。
5mg/mL MTT溶液：称取250mg MTT溶于50mL PBS中，60℃助溶使其充分溶解，用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，-20℃避光保存。
体外活性检测
细胞培养：(a)细胞的复苏：从液氮罐中迅速取出细胞，置于37℃水浴解冻(不断搅拌)。将细胞悬液移入25cm2培养瓶中，加入4mL预热的培养基，用1mL 蓝色长枪头吹打混匀，在37℃，5％CO2的条件下培养4-6h。待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，弃去未贴壁细胞。(b)细胞的换液和传代：A549和Capan-2细胞使用RPMI-1640完全培养基培养，待两种细胞生长的汇合度达到80％以上即可进行传代。弃去原培养基，用PBS洗涤2次。加入0.5mL胰酶，置于37℃培养箱中消化2min。当利用倒置显微镜观察到细胞变圆待脱落时，快速吸去胰酶，加入3mL新鲜培养基终止消化并吹悬分散细胞。细胞悬液按照需求稀释到合适的密度，用于后续的传代和铺板。(c)细胞的冻存：倒置显微镜观察到培养瓶长满细胞后，弃去原培养基，用PBS洗涤2次。加入0.5mL胰酶，置于37℃培养箱中消化2min。当观察到细胞变圆待脱落时，快速吸去胰酶，加入3mL新鲜培养基终止消化并吹悬分散细胞。将其转移至灭菌的离心管中，1,000rpm离心 5min。弃去上清液，加入1mL细胞冻存液吹打混匀并移入冻存管中，标记细胞株名称及时间。将冻存管置于4℃冰箱30min，-20℃冰箱2h，-80℃冰箱过夜，最后置于液氮罐中长期保存。
MMP-2的活性鉴定：(a)明胶酶谱分析：将处于对数生长期的肺癌细胞A549 和胰腺癌细胞Capan-2使用0.25％胰酶消化，按合适的密度接种于24孔板中，置于37℃，5％CO2中培养24h，生长至约70％-80％汇合度，更换为无血清培养基(0.2mL)中生长48h。48h后，收集上清液，4℃，12,000rpm离心10min，取上清分装后-80℃保存备用，利用Bradford法测定蛋白浓度。配制含0.1％明胶的10％SDS-PAGE蛋白胶，在非还原条件下进行电泳。冰浴下4mA进行电泳6 h。电泳结束后，切取包括25-180KDa的凝胶放置于洗脱液中振荡洗脱4次以除去SDS，每次15min。洗脱后，置于漂洗液中振荡漂洗2次以去除Triton X-100，每次20min。加入孵育液，置于37℃恒温培养箱中孵育22h，使pro-MMP-2激活为active-MMP-2。孵育结束后，加入染色液，置于摇床中70-80rpm振荡染色 40min。将凝胶依次置于脱色液A、B、C中，在摇床上分别振荡脱色0.5h，1h， 2h。脱色完成后，在蓝色背景下，可见68kDa处为白色条带，拍照，并用凝胶图像分析系统分析各条带的光密度值(图5C)。(b)条件培养基中MMP-2介导的FTS切割：为了评估A549肺癌细胞条件培养基中基质金属蛋白酶MMP-2对 FTS纳米笼的切割。将不同浓度的FTS(50,100和200μg/mL)与条件培养基在37℃温育6h。通过SDS-PAGE电泳检测裂解的FTS片段(图5D)。(c)MMP-2切割FTS 的动力学分析：将A549细胞接种到密度为2×106个细胞的6孔板中，并孵育24h，然后用0.2mg/mL FTS处理。在不同的时间点(1、2、4、6、12、24和48h)，取出60μL细胞培养基，并加入20μL 4×上样缓冲液以终止反应。温育24h后，将所有样品上样至15％SDS-PAGE电泳。使用凝胶分析仪分析MMP-2催化动力学曲线(图5E)。
细胞摄取研究：(a)共聚焦显微镜观察细胞内荧光强度：将培养瓶中长满的 A549和Capan-2细胞消化，利用血球计数板计数并稀释密度为1×105细胞/孔。接种1mL于共聚焦培养皿中，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。小心吸取弃去原培养基，用PBS洗涤2次，利用FTH1/DOX NPs和FTS/DOX NPs(相当于 0.6μmol/L DOX)分别作用细胞6h和12h。作用结束后，用PBS洗涤细胞三次以除去游离的蛋白质和NPs，加入4％(v/v)多聚甲醛固定细胞10min。固定后，用 PBS洗涤细胞三次，在黑暗中用Hoechst33342染色10min并再次用PBS洗涤三次。最后，在共聚焦培养皿中加入少量PBS覆盖细胞，利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)记录细胞荧光(图6A)。(b)流式细胞术定量细胞摄取效率：将A549 和Capan-2细胞按1×105的密度接种于6孔板中，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。小心吸取弃去原培养基，用PBS洗涤2次，分别利用FTH1/DOX NPs 和FTS/DOX NPs(相当于0.6μmol/L DOX)分别作用细胞6h和12h。随后，利用预热的PBS仔细洗涤细胞2次并用胰酶消化，1,000rpm离心5min。弃去培养基，再用PBS洗涤2次，除去未摄取的NPs。洗净后加入300μL PBS吹打分散均匀制成悬浮液。利用流式细胞仪分析纳米颗粒的细胞摄取。收集、扩大和缩放10,000 个细胞以产生单个参数直方图(图6B)。(c)抗体阻断测定：通过抗体阻断实验来证实TfR1是FTH1NPs主动靶向癌细胞的结合受体，通过在过量的抗TfR1mAb 存在下将A549和Capan-2细胞与FTH1和FTS NPs一起孵育来进行抗体阻断研究。将0.33μmol/L FTH1/DOX NPs和FTS/DOX NPs(相当于0.6μmol/L DOX)加入A549和Capan-2细胞中，并加入抗TfR1mAb(3.3μmol/L)的溶液孵育12h。共聚焦显微镜观察细胞内荧光强度和流式细胞术定量细胞摄取效率，并与在不存在TfR1mAb的情况下孵育的细胞进行比较(图6D-E)。
细胞毒性研究：将A549和Capan-2细胞按1×105的密度接种100μL于96孔板中，并置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。小心吸取弃去原培养基，A549 和Capan-2细胞分别与FTS和FTS/YM155NPs(0.04、0.08、0.17、0.25和 0.33μmol/L)孵育24和48h。以RPMI-1640完全培养基作为空白对照，每个浓度共3个重复孔。孵育结束后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4h 后，用1mL注射器小心吸去孔内上清液。加入150μL DMSO，在振荡仪上充分振荡10min使甲瓒结晶溶解。在酶标仪上测定各孔的OD490nm处吸光值，计算细胞存活率。细胞存活率＝待测组吸光值/空白对照组吸光值×100％。同时，通过 SPSS 22.0计算FTS和FTS/YM155NPs的半抑制浓度IC50。在半抑制浓度IC50的基础上，TmSm、YM155、FTH1、FTS、FTH1/YM155和FTS/YM155NPs与 A549和Capan-2细胞分别孵育24和48h，检测不同药物对癌细胞的细胞毒性。其中，FTS和FTS/YM155NPs的浓度保持在0.08μmol/L，而TmSm、YM155、 FTH1和FTH1/YM155NPs的浓度相当于FTS/YM155NPs中的药物含量(图 7A-C)。
细胞凋亡分析：将A549和Capan-2细胞按2×105的密度接种于6孔板中，并置于37℃，5％CO2培养箱中过夜培养。小心吸取弃去旧培养基，A549和 Capan-2细胞分别与TmSm、YM155、FTH1、FTS、FTH1/YM155和FTS/YM155 NPs孵育48h。其中，FTS和FTS/YM155NPs的浓度保持在0.08μmol/L，而TmSm、 YM155、FTH1和FTH1/YM155NPs的浓度相当于FTS/YM155NPs中的药物含量。以RPMI-1640完全培养基作为空白对照。药物作用48h后，按照细胞凋亡试剂盒说明操作，1,000rpm离心8min收集上清液细胞，胰酶消化后离心收集贴壁细胞，然后用PBS洗涤2次。将细胞重悬于200μL结合缓冲液中，在室温下分别用5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙啶(PI)避光染色15min。随后，将样品置于冰盒避光冰浴10min。利用流式细胞仪检测各组凋亡率，激发波长 Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm，Annexin V-FITC的绿色荧光通过FLl通道检测，PI的红色荧光通过FL3通道检测。最后，采用FlowJo-V10软件分析凋亡结果。流式细胞仪检测的结果是由四个象限组成的细胞直方图，左下格代表正常细胞，右下格代表早期凋亡细胞，左上格代表死亡细胞碎片，右上格代表晚期凋亡细胞。故凋亡数为右上格与右下格细胞之和(图8A-B)。
Western blot检测癌细胞中Survivin和MMP-2的表达量：(a)SDS-PAGE电泳参照上述方法。(b)转膜：将玻璃板的一边揭去，按照预染Marker显示的条带位置将Survivin二聚体分子量大小的部分切割下来并浸泡在转膜缓冲液中。裁剪与蛋白胶大小一致的PVDF膜，在甲醇中活化5min后浸泡于转膜缓冲液中。依次将海绵和3张浸湿的滤纸整齐地铺在阴极板(黑色)上，并用玻璃棒赶走气泡，接着铺上蛋白胶，再铺上PVDF膜，最后再铺上另外3张浸湿的滤纸和海绵，盖上阳极板(白色)。打开电源，在冰浴下以75V的电压转膜2h。电转结束后，将PVDF膜放在TBST缓冲液中漂洗5min。(c)封闭：漂洗的PVDF膜浸于5％脱脂奶粉中，室温封闭2h。封闭结束后，用TBST漂洗PVDF膜三次，每次5min。 (d)抗体孵育：将PVDF膜放入封闭液稀释的一抗(Survivin 1：1000，MMP-2 1： 1000，β-actin 1：3000)，4℃下，轻轻摇晃孵育过夜。孵育结束后，用TBST漂洗PVDF膜三次，每次5min。将PVDF膜转入封闭液稀释的二抗(Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit or Anti-Mouse IgG(H+L)1：6000)，常温水平摇晃1h。取出PVDF膜，放入TBST的缓冲液中漂洗3次，每次10min。(e)ECL显色曝光：取出PVDF膜，用滤纸吸掉多余液体，将含有蛋白的一面朝上，滴加已配制好的ECL试剂，暗处静置2min。将PVDF膜放入凝胶成像仪内，选择合适的曝光时间并拍照。(f)结果分析：利用凝胶定量软件 ImageJ对Western blot的图像结果进行灰度值分析(图5B和6C)。
体内活体成像及抗肿瘤活性研究
荷瘤裸鼠肺癌模型的建立：(a)制备人肺癌细胞株A549单细胞悬液：人癌细胞株A549细胞复苏后，稳定传代2-3次。取处于对数生长期的细胞，胰酶消化制备单细胞悬液。台盼兰染色，活细胞比率大于95％，用PBS重悬细胞，计数调整细胞浓度为1×l08/mL。(b)动物饲养：Balb/c-nu雌性裸鼠，4-6周龄，20±2g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养的条件：室温22-26℃，相对湿度 50％-70％，光照周期12/12d时，动物饲养入室适。控制室温为(25±1℃)，动物自由饮水和摄食。适应性饲养一周后开始实验，所有裸鼠在实验24h禁食，可自由饮水。(c)细胞接种：用1mL胰岛素注射器吸取人肺癌细胞株A549细胞悬液，针头位于裸鼠左侧近后肢皮下注入0.1mL A549细胞悬液，细胞数约为1×107。溶血性分析：裸鼠眼眶采血1mL，在3,000rpm下离心10min以分离红细胞(RBC)，然后用PBS(含25U/mL肝素)洗涤直至上清液无血色为止，最后用10mL PBS稀释。然后将200μL RBC稀释后的溶液与800μL超纯水混合作为阳性对照，与 800μL PBS混合作为阴性对照，与800μL不同浓度的药物溶液(YM155、TmSm、 FTH1、FTS、FTH1/YM155、FTS/YM155NPs和FTS NPs+YM155)混合作为实验组。此后，将上述混合物轻轻涡旋，并置于37℃孵育3h。最后，将样品3,000rpm 离心10min，并通过紫外可见分光光度计测定上清液中释放的血红蛋白的吸光度 (OD541nm)。根据文献报道的方法，计算不同药物组的溶血率(HR，Hemolysis rate)： HR(％)＝(ODt-ODn)/(ODp-ODn)×100％。其中，ODt代表测定样品的吸光度值， ODn和ODp是阴性对照和阳性对照的吸光度值(图9A-B)。
活体靶向荧光成像实验：当裸鼠肿瘤长至200mm3左右，随机平均分为A、 B两组：(A)FTS NPs；(B)FTH1NPs，每组3只。采取尾静脉注射含等量花菁的 FTS和FTH1纳米粒，整个实验过程注射一次，各组动物的饲养条件完全相同，各组动物体重无差异。荷A549肺癌小鼠在活体靶向荧光成像之前，裸鼠腹腔注射10mg/kg苯巴比妥钠，使之处于麻醉状态，分别在0.5h，4h和24h用KODAK 活体动物多光谱成像系统观察其荧光分布。24h观察完毕后，将裸鼠脱颈处死，并立即取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，置于活体成像仪中观察离体脏器的荧光分布。活体成像的条件：活体曝光时间为10s；离体曝光时间：1s；扫描波长为：700-950nm；激发和发射波长：740/850nm(图10A)。
FTS/YM155NPs对荷A549裸鼠的体内抗肿瘤活性：(a)实验分组和给药：裸鼠接种三周后，选择肿瘤平均大小为150mm3左右，肿瘤生长良好，无自发性出血坏死、瘤周无感染病灶的荷瘤裸鼠40只为实验模型。将荷瘤鼠随机分为8组：每组5只，组内编号。如表1.6所示。尾静脉注射，每次0.1mL，1次/3天，连续给药15天。
表1.6 实验分组及处理方法
Figure RE-GDA0002548518090000201
(b)裸鼠体重和肿瘤体积生长变化：尾静脉给药后每3天对裸鼠进行称重，绘制裸鼠的体重-时间曲线。根据裸鼠的体重变化率，作为药物对机体毒副作用程度的衡量指标。当给予药物治疗后，裸鼠的体重较给药前下降超过15％，则表明该药物处方对机体具有较大的毒副作用，不能应用于临床治疗。给药后每3 天用数显游标卡尺对裸鼠的肿瘤体积大小进行测量，并按照公式：肿瘤体积 V＝1/2×肿瘤长径(L)×肿瘤短径(W)2，计算肿瘤体积变化，并绘制肿瘤体积-时间的肿瘤体积生长曲线(图10B-C)。
(c)离体肿瘤的重量及肿瘤抑制率测定：给药15天后，断颈处死裸鼠，剥离各组裸鼠的肿瘤，对不同药物组的肿瘤进行拍照，并称量其重量，依据公式“肿瘤抑制率(IRT％)＝(W实-W对)/W对×100％”来计算各组药物的抗肿瘤效应(图10D-E 和图11)。
(d)病理组织学检测：上述治疗结束后，颈椎脱臼处死裸鼠，并剥离心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织，固定于4％多聚甲醛液中，将裸鼠肿瘤及脏器组织标本制成石蜡切片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色后观察组织形态学情况。具体过程如下：脱蜡复水：石蜡切片脱蜡，水合；经二甲苯I、II脱蜡各5min，然后放入100％、95％、90％、85％、70％各级乙醇溶液中浸泡5min，再放入PBS 中浸洗3min×3次。染色：切片放入苏木精中染色3-5min，水洗约30-60s使切片颜色变蓝。分化：将切片放入1％盐酸乙醇分化液中褪色，约2-20s。见切片变红，颜色较浅即可。随后放入自来水流中水洗约30-60s使其恢复蓝色。脱水：切片放入50％、70％、80％乙醇中浸泡5min。复染：用0.5％伊红乙醇液对比染色2min，再用增色液洗去多余染液，洗两次，滤纸吸干封片镜检。镜检：在 400×倍显微镜下观察组织细胞，拍照(图9C)。
(e)免疫组织化学染色观察肿瘤组织凋亡相关蛋白的表达：肿瘤组织石蜡块切成5μm切片，用免疫组织化学染色(链霉素-过氧化物酶，streptavidin-peroxidase, SP)法检测凋亡相关蛋白Caspase-3和Survivin蛋白的表达。细胞质或细胞核染成棕色表示阳性结果，随机选择五个视野，在×400倍观察下计数每个切片阳性细胞数，具体过程如下：预处理石蜡切片：按常规方法进行脱蜡，水合，切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min，依次放入100％、95％、85％、70％乙醇溶液中浸泡5min，最后PBS浸洗3min×3次；抗原修复：将切片置于抗原修复缓冲液烧杯中，并置于微波炉中保持微沸状态20min。随后浸入流水中自然冷却后，切片用PBS浸洗3次。灭活酶：向切片中滴加2滴3％H2O2-甲醇溶液，室温封闭10min， PBS浸洗3次。封闭：滴加即用型山羊血清50-100μL，室温孵育20min。抗原- 抗体反应：滴加一抗(1：200稀释Survivin和Caspase-3一抗)50-100μL，37℃，湿盒孵育2h，PBS浸洗3次。加增强剂：滴加增强剂50μL，室湿湿盒孵育30min， PBS浸洗3次。一抗二抗反应：滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体50μL，室温/37℃孵育30-60min，PBS浸洗3次。显色：每张切片加2滴新鲜配制的 DAB溶液。终止显色：显微镜下观察染色深浅，染好后立即中止，用自来水轻柔冲洗15min，蒸馏水终止显色反应。复染：将切片放入苏木素染液，染色10min，用蒸馏水冲洗干净。若染色过深，可用0.1％盐酸分化，自来水冲洗后返蓝；脱水封片：切片依次放入70％、85％、95％、100％乙醇中浸泡5min，再置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10min，晾干加中性树胶，加盖玻片。观察：光学显微镜下观察组织细胞中蛋白的表达情况，取高表达区域拍照保存(图12A-B)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用
<130> /
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
ggaattccat atgacgaccg cgtccacctc 30
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<212> DNA
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cgtaaagctc gtcgt 75
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<213> 人工合成(Artificial synthesis)
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ccgctcgaga tccatggcag ccagctgctc 30

Claims (11)

1.Survivin双抑制剂联合用药在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述双抑制剂包括小分子抑制剂YM155和蛋白抑制剂TmSm。
2.根据权利要求1所述的Survivin双抑制剂联合用药在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为Survivin过表达的肿瘤，包括肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌以及膀胱癌。
3.一种含有Survivin双抑制剂的药物，其特征在于，所述药物包括小分子抑制剂YM155、蛋白抑制剂TmSm以及药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的一种含有Survivin双抑制剂的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括铁蛋白纳米颗粒、脂质体、PEG-PLGA纳米颗粒、碳纳米管和无机纳米颗粒。
5.一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述双抑制剂包括小分子抑制剂YM155和蛋白抑制剂TmSm，以人铁蛋白重链亚基FTH1作为蛋白载体，TmSm通过基因工程的手段串联融合到FTH1单体的C端，YM155包裹于纳米颗粒的中空内腔。
6.权利要求5所述一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以人铁蛋白重链亚基FTH1作为蛋白载体，选取MMP-2敏感肽作为酶切割识别位点，选取柔性肽(G4S)2作为连接肽，利用重叠延伸PCR的方法融合成重组基因FTH1-Linker-MMP2-TmSm(FTS)；
(2)取适量步骤(1)制备的FTS蛋白包涵体溶解液，将YM155储备液加入蛋白溶液中，FTS纳米颗粒与YM155摩尔比为1：10-1：200，混合物在2-8℃搅拌30-120min；
(3)将混合液放入预处理的透析袋中，按照1：10的体积逐级放入4mol/L尿素的透析液A、2mol/L尿素的透析液B、1mol/L尿素的透析液C和0mol/L尿素的透析液D中；
(4)透析结束后，透析溶液在2-8℃，10,000-14,000rpm离心10-30min，收集上清液，超滤管浓缩，滤膜无菌过滤。
7.根据权利要求6所述的一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)混合物在4℃搅拌60min。
8.根据权利要求6所述的一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)FTS纳米颗粒与YM155摩尔比为1：200。
9.根据权利要求6所述的一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(4)透析溶液在4℃，12,000rpm离心20min。
10.权利要求5所述一种负载Survivin双抑制剂的铁蛋白纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为Survivin过表达的肿瘤，包括肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌以及膀胱癌。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，当肿瘤是肺癌和胰腺癌时，有效剂量为0.05-0.35μmol/L FTS/YM155NPs。
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